CZ20013380A3 - Vakcína - Google Patents

Vakcína Download PDF

Info

Publication number
CZ20013380A3
CZ20013380A3 CZ20013380A CZ20013380A CZ20013380A3 CZ 20013380 A3 CZ20013380 A3 CZ 20013380A3 CZ 20013380 A CZ20013380 A CZ 20013380A CZ 20013380 A CZ20013380 A CZ 20013380A CZ 20013380 A3 CZ20013380 A3 CZ 20013380A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
protein
polysaccharide
polysaccharides
mpl
vaccine
Prior art date
Application number
CZ20013380A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ303653B6 (cs
Inventor
Carine Capiau
Marguerite Deschamps
Pierre Michel Desmons
Craig Antony Joseph Laferriere
Jan Poolman
Jean-Paul Prieels
Original Assignee
Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9906437.0A external-priority patent/GB9906437D0/en
Priority claimed from GBGB9909077.1A external-priority patent/GB9909077D0/en
Priority claimed from GBGB9909466.6A external-priority patent/GB9909466D0/en
Priority claimed from GBGB9916677.9A external-priority patent/GB9916677D0/en
Application filed by Smithkline Beecham Biologicals S. A. filed Critical Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Publication of CZ20013380A3 publication Critical patent/CZ20013380A3/cs
Publication of CZ303653B6 publication Critical patent/CZ303653B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6075—Viral proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/831—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving capsular polysaccharide of bacterium, e.g. polyribosyl ribitol phosphate

Description

Streptococcus obsahovat indukční adjuvans Thl.
Specifické, výhodné pneumokokové konjugáty doplněné s adjuvans Thl a Bakteriální polysacharídové konjugáty v obecném případě konjugované s proteinem D z mikroorganizmu H. influenzae.
pólysacharidové
Dosavadní stav techniky
Mikroorganizmus Streptococcus pneumoniae je gram-pozitivní bakterie odpovědná za značnou nemocnost a úmrtnost (zvláště u malých dětí a přestárlých lidí), která způsobuje invazivní onemocnění, jako je zápal plic, bakteriémie a meningitida a onemocněni spojené s kolonizací, jako je akutní zánět středního ucha. Četnost pneumokokového zápalu plic v USA se u lidí ve stáří 60 let odhaduje na 3 až 8 osob ze 100 000. Ve 20 % případů vede k bakteriémii a k jiným projevům meningitidy s úmrtností 30 % a to dokonce i v případech léčby antibiotiky.
Mikroorganizmus Pneumococcus obsahuje kapsuli s chemicky vázaným polysacharidem, který odpovídá za serotypovou specifitu. Existuje 90 známých serotypů pneumokoků a kapsule • · · · • ·
představuje u pneumokoků hlavní determinantu virulence, protože kapsule nejenom chrání vnitřní povrch bakterie před * komplementem, ale je také sama slabě imunogenní. Polysacharidy jsou antigeny nezávislé na T-buňkách a mohou se zpracovat a ' prezentovat na molekulách MHC, aby mohly interagovat s Tbuňkami. Tyto antigeny mohou stimulovat imunitní systém pomocí alternativního mechanizmu, který zahrnuje zesítění povrchových receptorů na buňkách typu B.
V několika experimentech se ukázalo, že ochrana proti invazivnímu pneumokokovému onemocnění nej silněji koreluje s protilátkami specifickými pro kapsuli a ochrana je serotypově specifická.
Vakcíny založené na polysacharidovém antigenu jsou dobře známy v oboru. Čtyři z nich je možné použít při aplikaci lidem a zahrnují polysacharid Ví mikroorganizmu Salmonella typhi, polysacharid PRP z mikroorganizmu Haemophilus influenzae, tetravalentní meningokokovou vakcínu složenou ze sérotypů A, C, W135 a Y a 23-valentní pneumokokovou vakcínu složenou z polysacharidu odpovídajícím sérotypů 1, 2, 3, 4, 5. 6B, 7F,
8, 9a, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F a 33 (započítává se alespoň 90 % krevních izolátů pneumokoků).
Tři vakcíny jsou schopny zaručit ochranu proti bakteriím, které způsobují respirační infekce, které vedou k vážnému onemocnění a k úmrtí kojenců. Tyto vakcíny však nejsou zatím určeny pro děti mladší dvou let, protože pro děti v tomto věku nejsou adekvátně imunogenní (popisuje se v publikaci Peltota et al., (1984), N. Engl. J. Med. 310: 1561-1566).
Mikroorganizmus Streptococcus pneumoniae běžně způsobuje invazivní bakteriální onemocnění a zánět středního ucha kojenců a malých dětí. Podobně staří lidé velmi slabě odpovídají na pneumokokové vakcíny (popisuje se v publikaci
• ·
Roghmann et al., (1987), J. Gerontol. 42: 265-270), protože u této populace dochází ke zvýšenému výskytu bakteriálního zánětu plic (Verghese and Berk, (1983) Medicíně (Baltimore)
62: 271-285).
Strategie, které se navrhly, aby se překonala imunitní nedostatečnost u kojenců, zahrnují navázání polysacharidu na velké imunogenní proteiny, které pomáhají T-buňkám a které vyvolávají imunologickou paměť proti polysacharidovému antigenů, na který je vázán. U pneumokokových glykoproteinových konjugačních vakcín se v současné době hodnotí bezpečnost, imunogennost a účinnost u různých věkových skupin.
A) Pneumokokové polysacharidové vakciny
23-valentní nekonjugovaná pneumokokové vakcína ukazuje široké rozmezí klinické účinnosti. Je to od 0 % do 81 % (popisuje se v publikaci Fedson et al., (1994) Arch Intern Med. 154: 2531-2535). Ukazuje se, že účinnost se vztahuje na skupinu, která se imunizuje, jako jsou přestárlí lidé, lidé trpící Hodgkinovou nemoci, onemocněním srpkovitých buněk a gammaglobulinemií a lidí po splenektomii (popisuje se v publikaci Fine et
2677) , a také je al. , (1994), Arch.
spojena s projevy vakcína nedemonstruje ochranu proti pneumokoky (v jistých velmi přestárlí) a zánětu středního
Existuje proto potřeba
Intern. Med.
onemocnění.
zápalu plic rizikových skupinách, ucha.
zlepšit pneumokokové
154: 266623-valentní způsobeným jako jsou vakcinační kompozice, zvláště ty, které budou účinnější při prevenci nebo zlepšení pneumokokového onemocnění (zvláště při zápalu plic) u přestárlých lidí a malých dětí.
Vynález popisuje takovou optimalizovanou vakcinu.
• · · · • · · · · · • · · ···· · • · · · · 9 9 9 9 ·· ·· 9999999 9 9 9 9 9
B) Vybraný pneumokokový polysacharidový konjugát + kompozice 3D-MPL
Obecně se přijímá, že účinnost ochrany běžné nekonjugované pneumokokové vakcíny se více či méně vztahuje ke koncentraci protilátek indukovaných po vakcinaci. Skutečně 23 polysacharidům se udělila licence pro aplikaci lidem (popisuje se v publikaci Ed. Williams et al., New York Academy of Sciences 1995 pp. 241-249). Proto další zesílení protilátkové odezvy na pneumokokové polysacharidy by mohlo zvýšit procento kojenců a přestárlých lidí, kteří odpovídají ochrannou hladinou protilátek na první injekci s polysacharidem nebo polysacharidovým konjugátem a mohla by se snížit dávka a počet injekcí požadovaných k indukci ochranné imunity na infekci způsobenou mikroorganizmem Streptococcus pneumoniae.
Od začátku dvacátých let tohoto století se provedli experimenty s velkým počtem sloučenin, které se mohou přidat k antigenům, aby zlepšily jejich imunigenitu ve vakcinačních prostředcích (popisuje se v publikaci M. F. Powell and M. J. Newman, Plenům Press, NY, „Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approuch (1995), Chapter 7, „A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients) . Řada z nich je velmi účinná, ale způsobují podstatné lokální a systémové nežádoucí reakce, které brání jejich použití j Adjuvans založené na hliníku nebo fosforečnan hlinitý) , zůstávají pouze imunologické vakcínách, které získaly licenci ako lidské vakcinační prostředky, (jako je alum, hydroxid hlinitý poprvé popsané v roce 1926, adjuvans používané v lidských v USA.
Adjuvans založené na hliníku nosičových adjuvans, která pracuje jsou příklady třídy na základě depotního účinku. Antigen se absorbuje na jeho povrch a když se kompozice zavede injekcí, adjuvans a antigen se ihned rozptýlí do krevního proudu, místo aby kompozice zůstala v místě zavedení injekce a tak se zesílí imunitní odezva. Takové
• «
adjuvans vykazuje další známou výhodu. Je vhodné jako stabilizující činidlo pro látky náchylné k rozkladu, jako jsou například některé polysacharidové antigeny.
3D-MPL je příklad nenosičového adjuvans. Jeho celý název je 3-0-deacylovaný monofosforyllipid A (nebo 3-de-0-acylovaný monofosforyllipid A nebo 3-O-desacyl-4'-monofosforyllipid A).
Zkratka 3D-MPL glukosaminu je v dokumentu GB indikuje, že de-O-acylována.
220 211 A.
poloha 3 redukčního konce Jeho příprava je
Chemicky se popisuje to směs 3deacylovaného monofosforyllipidu řetězci. Původně se vytvořil začátkem 1990, deacylátem 4'-monofosforylderivátu lipidu nebo kdy acylovanými metoda s 3-0A (MPL) vedla ke vzniku molekuly s dále utlumenou toxicitou, aniž došlo ke změnám její imunostimulační aktivity.
Sloučenina 3D-MPL se použije samotná jako adjuvans nebo, což je výhodné, v kombinaci s nosičovým adjuvans depotního typu, jako je hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý nebo emulze olej ve vodě. Antigen a 3D-MPL jsou v takových kompozicích obsaženy ve stejné určité struktuře, která umožňuje zavedení vyšší účinnosti antigenních a imunostimulačních signálů. Studie ukázaly, že 3D-MPL je schopný dále zesílit imunogennost antigenu absorbovaného na alum (popisuje se v publikaci Thoelen et al., Vaccine (1998) 16: 708-14, EP 689454-B1). Takové kombinace se také preferují v dosavadním stavu techniky v případě antigenu, které jsou náchylné k adsorpci (například bakteriální polysacharidové konjugáty), kde adsorpce na alum má tendenci stabilizovat antigen. Většinou se používají precipitovaná adjuvans založená na hliníku. Jsou to jediná adjuvans, která se používají v současné době v USA jako lidské vakciny. Vakciny obsahující 3D-MPL v kombinaci s adjuvans založenými na hliníku jsou v oboru nejvýznamnější, protože se jednoduše vyvíjí a rychle se zavádí na trh.
• · · · · * • · · ·
MPL (který nemá acylovanou polohu 3) se vyvinul jako adjuvans s několika monovalentnimi pólysacharidovými konjugačními vakcinačními antigeny. Současná injekce MPL ve fyziologickém roztoku zesiluje odezvu sérových protilátek v případě čtyř monovalentních polysacharidových konjugátů: pneumokokální PS-βΒ toxoid tetanu, pneumokokální PS 12-toxoid diftérie a S. aureus typ 5 a S. aureus typ 8 konjugovaný s exotoxinem A organizmu Pseudomonas aeruginosa (Schneerson et al., J. Immunology (1991) 147: 2136-2140). Uvažuje se, že zesílené odezvy jsou antigenně specifické. MPL v emulzi olej ve vodě (nosičový typ adjuvans) konzistentně zesiluje účinek MPL ve fyziologickém roztoku, což je způsobeno přítomnosti MPL a antigenu ve stejné určité struktuře a považuje se za adjuvanční systém první volby pro optimální zavedení jiných polysacharidových konjugačních vakcín.
V publikaci Devi et al., Infect. Immun. (1991) 59: 3700-7 hodnotí účinek adjuvans MPL (který nemá acylovanou polohu 3) ve fyziologickém roztoku na myší protilátkovou odezvu na konjugát TT kapsulárního monosacharidu organizmu Cryptococcus neoformans. Když se MPL použil souběžně s konjugátem, objevil se pouze nevýznamný nárůst odezvy specifické pro IgM a IgG na PS. MPL však měl daleko větší účinek, když se aplikoval 2 dny po konjugátu. Diskutuje se praktičnost použití imunizačního schématu, které vyžaduje oddálení aplikace MPL relativně k antigenu zvláště u novorozenců. Adjuvanční účinek MPL s polysacharidy a konjugáty polysacharid-protein se jeví být závislý na kompozici. Začlenění MPL do vhodných zaváděcích systémů s pomalým uvolňováním (například použití nosičového adjuvans) poskytuje trvalý adjuvanční účinek a lze tak obejít problémy načasování a oddálení aplikace.
V obecném případě platí, že v případě určitého polysacharidu nebo konjugátu polysacharidu a antigenu, kde se jako adjuvans používá MPL nebo 3D-MPL, je výhodné použít
• · • · · ·
spojeni s nosičovým adjuvans (například adjuvans založené na hliníku) za účelem maximalizovat jeho imunostimulační účinek.
Překvapivě se zjistilo, že v případě jistých pneumokokových polysacharidových konjugátů, imunnogennost vakcinační kompozice je podstatně vyšší, když se antigen spojí se samotným 3D-MPL spíše, než s 3D-MPL ve spojení s nosičovým adjuvans (jako je adjuvans založené na hliníku). Pozorované zlepšení závisí na koncentraci použitého 3D-MPL a zda konjugáty jsou v monovalentní kompozici nebo zda se kombinuji za vzniku polyvalentní kompozice.
C) konjugáty bakteriálního polysacharidu - proteinu D
Jak se zmiňuje shora v textu, vakcíny založené na polysacharidovém antigenů jsou dobře známy v oboru.
Polysacharidové vakcíny s udělenou licencí uvedené shora v textu demonstrují odlišnou klinickou účinnost.
Účinnost
Vi polysacharidové vakcíny se stanovila mezi 55 % a 77 % při prevenci břišního tyfu (popisuje se v publikaci
Plotkin and
Cam, (1995) Arch. Intern. Med. 155: 2293-99). Ukázalo se, že vakcina obsahující meningokokový polysacharid C vykazuje účinnost 79 % za podmínek epidemie (popisuje se v publikaci De Wals P, et al., (1996) Bull World Health Organ. 74: 407-411). 23-valentní pneumokoková vakcina vykazuje široké rozmezí klinické účinnosti od 0 % do 81 % (popisuje se v publikaci Fedson et al. , (1994) Arch. Intern. Med. 154: 2531-2535) . Jak se uvádí shora v textu, účinnost ochrany u pneumokokové vakcíny více nebo méně souvisí s koncentrací protilátek indukovaných po vakcinaci.
Mezi problémy spojené s vakcinaci polysacharidu patří skutečnost, že polysacharidy jsou slabě imunogenní. Strategie, která se navrhla, aby se obešla tato nedostatečnost imunogennosti zahrnuje navázání polysacharidu na velké vysoce imunogenní proteinové nosiče, které pomáhají T-buňkám.
Příklady těchto uvedených vysoce imunogennich nosičů, které se v současnosti běžně užívají při produkci polysacharidových imunogenů zahrnují toxoid diftérie (DT nebo mutant CRM197), toxoid tetanu (TT), hemocyanin přílipkovitých plžů (KLH) a čištěný proteinový derivát tuberkulinu (PPD).
Problémy spojené s běžně používanými nosiči
S každým z běžně používaných nosičů je spojena řada problémů, které zahrnují problémy při produkci konjugátů GMP a také imunologické charakteristiky konjugátů.
Navzdory běžnému použití těchto nosičů a jejich úspěch.při indukci protilátkové odezvy proti polysacharidu jsou spojeny s několika nedostatky. Například je známo, že antigenní specifické imunitní odezvy se mohou potlačit (potlačení, epitopu) přítomností předem existujících protilátek řízených proti nosiči, v tomto případě toxinu tetanu (popisuje se v publikaci Di John et al., (1989) Lancet, 2: 1415-8).
V populaci velmi vysoké procento lidí bude vykazovat předem existující imunitu jak proti DT tak proti TT, protože se lidé rutinně vakcinují těmito antigeny. V Anglii se například 95 % dětí vakcinovalo DTP vakcínou, která obsahuje DT a TT.
V publikaci Sad et al., Immunology, 1991, 74: 223-227, Schutze et al., J. Immunol. 135: 4, 1985, 2319-2322 se popisuje problém potlačení epitopu v peptidových vakcínách aplikovaných zvířecím modelům.
Navíc v případě vakcín, které vyžadují pravidelné zesilující dávky, je pravděpodobné, že použití vysoce imunogenních nosičů, jako je DT a TT, potlačuje po několika injekcích protilátkovou odezvu na polysacharid.
Tyto vícenásobné vakcinace mohou být doprovázeny nežádoucí reakcí, jako je oddálený typ hyperodezvy (DTH).
• · · · · φ φ φ φ · φ ······· · · ···
KLH je znám jako potentni imunogen a už se používá jako nosič v případě peptidů IgE v lidských klinických studiích. Pozorovaly se však určité nežádoucí reakce (reakce podobné DTH nebo IgE přecitlivělost) stejně jako se pozorovaly protilátkové odezvy proti protilátkám)
Výběr nosičového proteinu v případě vakcíny založené na polysacharidu vyžaduje rovnováhu mezi nezbytností použít nosič fungující u všech pacientů (široké rozeznání molekul MHC) , indukcí silné protilátkové odezvy proti polysacharidům a slabé protilátkové odezvy proti nosiči.
Nosiče, které se dříve používaly v případě vakcín založených na polysacharidu, mají řadu nevýhod. To je zvláště v kombinovaných vakcínách, kde potlačení epítopu je zvláště problematické, jestliže se použije stejný nosič pro různé polysacharidové antigeny. V dokumentu WO 98/51 339, se použilo v kombinovaných vakcínách více nosičů, aby se obešel tento účinek.
Vynález popisuje nový nosič vhodný pro použití imunogenních konjugátů založených na polysacharidu a polypeptidů, přičemž uvedené konjugáty se nepotýkají se shora uvedenými problémy.
Vynález dále popisuje protein D (EP 0 594 610 Bl) pocházející z organizmu Haemophilus influenzae nebo jeho fragmenty jako nosiče vhodné pro imunogenní kompozice založené na polysacharidu, které zahrnují vakcíny. Použití tohoto nosiče je zvláště výhodné v kombinačních vakcínách.
Podstata vynálezu
A) Pneumokokové polysacharidové vakcíny
Vynález popisuje vakcinační prostředek obsahující alespoň polysacharidový antigen mikroorganizmu Streptococcus
pneumoniae (výhodný je konjugovaný) a proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jeho imunologicky funkční ekvivalent a je možné, aby obsahoval adjuvans Thl (adjuvans vyvolávající imunitní odezvu). Je výhodné, aby byly zahrnuty jak pneumokokový protein tak i adjuvans Thl. Prostředky podle vynálezu jsou zvláště vhodné při léčbě zápalu plic u přestárlých lidí.
Pneumokokové polysacharidové vakcíny (konjugované nebo nekonjugované) nejsou schopny chránit přestárlou populaci proti pneumonii. V této populaci výskyt této nemoci je velmi vysoký. Klíčový obranný mechanizmus proti pneumokokům je opsonofagocytóza (humorální B buňka/neutrofily zprostředkovaný jev způsobený produkcí protilátek proti pneumokokovému polysacharidu, přičemž bakterie podléhá fagocytóze), avšak části, které se podílejí na opsonizačních mechanizmech jsou u přestárlých lidí porušeny, to znamená produkce superoxidu pomocí PMN (polymorfní jaderné buňky), produkce jiných jiného druhu reaktivního kyslíku, mobilizace PMN, apoptóza PMN, deformabilita PMN. U přestárlých lidí může být také porušena protilátkové odezva.
Na rozdíl od normálně přijatého dogma normální množství antikapsulárních polysacharidových protilátek nemusí být účinné při kompletním odstranění bakterií. Pneumokoci mohou vstupovat do hostitelských buněk a obcházejí tuto část imunitního systému.
Je překvapivé, že současnou stimulací části imunitního systému zprostředkovaného buňkami (například imunita zprostředkovaná T buňkou) vedle humorální části imunitního systému (zprostředkovaná B buňkou) vede k lepšímu odstranění pneumokoků z hostitele. To je objev, který povede obecně k prevenci (nebo léčbě) pneumokokové infekce, ale bude zvláště
důležitý při prevenci (nebo léčbu) zápalu plic u přestárlých lidí, kde vakcíny založené na polysacharidech nejsou účinné.
Zjistilo se, tímto že obě části imunitního navzájem s pneumokokovým exprimovaný uvolňovaný, na podporovat, (upřednostňuj e povrchu pneumokoků který se může zpracovat nebo způsobem proteinem se v kontextu systému se mohou jestliže se protein nebo vylučovaný nebo se prezentuje třídy II a MHC třídy I na povrchu infikovaných savčích buněk) aplikuje pneumokokový polysacharid (výhodně konjugovaný). Ačkoli pneumokokový protein může samotný způsobit imunitu zprostředkovanou buňkami, také se zjistilo, že přítomnost adjuvans indukující odezvu Thl ve vakcinačním prostředku podporuje tuto část imunitního systému a překvapivě dále zesiluje synergii mezi oběma částmi imunitního systému.
B) Vybraný pneumokokový polysacharidový konjugát + kompozice 3D-MPL
Vynález dále také popisuje antigenní prostředek obsahující jeden nebo více pneumokokových polysacharidových konjugátů, kde se jako adjuvans použije 3D-MPL a následně neobsahuje adjuvans založené na hliníku, kde alespoň jeden z pneumokokových polysacharidových konjugátů je podstatně více imunogenní v prostředcích, které obsahují 3D-MPL v porovnání s prostředky, které obsahují 3D-MPL ve spojení s adjuvans založeným na hliníku.
Preferovaná provedení vynálezu popisují antigenní prostředky obsahující konjugáty jednoho nebo více následujících pneumokokových kapsulárních polysacharidů: sérotyp 4, 6B, 18C, 19F a 23F. V takových prostředcích je každý z polysacharidů překvapivě více imunogenní, jestliže prostředek obsahuje samotný 3D-MPL, ve srovnání s prostředky, které obsahují 3D-MPL a adjuvans založené na hliníku.
♦ · · · · · • · ·
Pak jedno provedení vynálezu popisuje antigenní prostředek obsahující kapsulární polysacharid mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae sérotyp 4, 6B, 18C, 19F nebo 23F konjugovaný s imunogenním proteinem a adjuvans 3D-MPL, kde prostředek v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku.
Další provedení vynálezu popisuje kombinaci antigenního prostředku, který v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku a obsahuje adjuvans 3D-MPL a dva nebo více pneumokokových polysacharidových konjugátů vybraných ze skupiny zahrnující sérotyp 4, 6B, 18C, 19F a 23F.
C) Konjugáty bakteriálního polysacharidu a proteinu D
Vynález popisuje polysacharidový konjugační antigen obsahující polysacharidový antigen získaný z patogenní bakterie konjugovaný z proteinem z mikroorganizmu Haemophilus influenzae nebo jeho fragment. Navíc vynález popisuje polyvalentní vakcinační kompozici, kde jeden nebo více polysacharidových antigenů je konjugováno s proteinem D.
A) Pneumokokové polysacharidové vakciny
Vynález popisuje zdokonalenou vakcínu zvláště vhodnou při prevenci nebo zlepšení pneumokokové infekce přestárlých lidí (a/nebo kojenců a nemluvňat).
V souladu s vynálezem se pacient považuje za starého člověka, jestliže dosáhne 55 let a více. V typickém případě je starší 60 let, preferuje se starší 65 let.
V jednom provedení prostředek vhodný pro kojencům a nemluvňatům), polysacharidový antigen pneumoniae a alespoň jeden Streptococcus pneumoniae.
se popisuje vakcinační lidem (a/nebo přestárlým obsahuj e alespoň jeden vynálezu aplikaci který mikroorganizmu proteinový antigen
Streptococcus mikroorganizmu • φ φ φ φ φ
V jiném preferovaném provedení vynálezu se popisuje vakcína (vhodná při prevenci zápalu plic u starých lidí), která obsahuje alespoň jeden polysacharidový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae a alespoň jeden proteinový antigen mikrooragnizmu Streptococcus pneumoniae a adjuvans Thl.
Předpokládá se, že taková vakcína se může také použít při léčbě pneumokokové infekce (například zánětu středního ucha) v jiných vysoce rizikových skupinách populace, jako jsou kojenci nebo nemluvňata.
V dalším provedení vynálezu se popisuje vakcinační prostředek obsahující pneumokokový polysacharidový antigen a adjuvans Thl.
Polysacharidové antigeny mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae podle vynálezu
V typickém případě vakcína mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae obsahuje polysacharidové antigeny (výhodné jsou konjugované), kde se polysacharidy získaly z alespoň čtyř sérotypů mikroorganizmus Pneumococcus. Výhodné jsou čtyři sérotypy zahrnující 6B, 14, 19F a 23F. Výhodnější je, když prostředek zahrnuje alespoň 7 sérotypů. Jsou to například ty získané ze sérotypů 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F a 23F. Více se upřednostňuje, když prostředek zahrnuje alespoň 11 sérotypů. Například prostředek v jednom provedení vynálezu zahrnuje kapsulární polysacharidy získané ze sérotypů 1, 3, 4, 5, 6B,
7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F (výhodné jsou konjugované). V preferovaném provedení vynálezu je zahrnuto alespoň 13 polysacharidových antigenů (výhodné jsou konjugované antigeny), ačkoli dále zahrnuje další polysacharidové antigeny, například 23 valentní (takové jako je sérotyp 1, 2,
3, 4, 5, 6Β, 7F, 8, 9a, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C,
19A, 19F, 20, 22F, 23F a 33F) .
Jedenácti valentní antigenní kompozice popsaná shora v textu a vhodná pro vakcinaci přestárlých lidí (například pro prevenci zápalu plic) s výhodou zahrnuje sérotyp 8 a 12F (nejvíce se upřednostňuje sérotyp 15 a 22), přičemž tvoří 15ti valentní vakcínu, zatímco v případě kojenců a nemluvňat (kde připadá v úvahu zánět středního ucha) je výhodné, aby vakcina zahrnovala sérotyp 6A a 19A, přičemž tvoří 13-ti valentní vakcínu.
Při prevenci/zlepšení zápalu plic u populace přestárlých lidé (ve věku nad 55 let) a zánětu středního ucha u kojenců (do 18-tého měsíce) a nemluvňat (v typickém případě odpovídá věku 18 měsíců až 5 let), vynález popisuje kombinaci multivalentního polysacharidu mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae s proteinem mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo s jeho imunologicky funkčním ekvivalentem.
Pneumokokové proteiny podle vynálezu
Termín „imunologicky funkční ekvivalent je peptid
proteinu, který obsahuje alespoň j eden ochranný epitop
z proteinů podle vynálezu. Takové epitopy jsou
v charakteristickém případě povrchově exponované, vysoce konzervativní a mohou v hostiteli vyvolávat baktericidní protilátkovou odezvu nebo předcházejí toxickým účinkům. Je výhodné, aby funkční ekvivalent měl alespoň 15 a upřednostňuje se 30 nebo více nepřerušovaných aminokyselin z proteinu podle vynálezu. Nejvíce se upřednostňuje, aby se použily fragmenty, deleční proteiny, jako jsou jejich transmembránové deleční varianty (to znamená použití extrabuněčné oblasti proteinů), fúze, chemicky nebo geneticky detoxifikované deriváty a • 9
podobně s podmínkou, že jsou schopny vyvolat v podstatě stejnou imunitní odezvu jako přirozený protein.
Preferované proteiny podle vynálezu jsou takové pneumokokové proteiny, které se exponují na vnějším povrchu pneumokoků (jsou schopny být rozeznány hostitelským imunitním systémem během poslední části životního cyklu pneumokoků) nebo jsou to proteiny, které pneumokoci vylučují nebo uvolňují. Nejvýhodnější je, když protein je toxin, adhezin, 2-komponent přenašeče signálu nebo lipoprotein mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jejich imunologicky funkční ekvivalenti.
Zvláště preferované proteiny, které jsou obsaženy v takové kombinační vakcíně, zahrnují: pneumolyzín (s výhodou je detoxifikován chemickou cestou nebo mutací) (popisuje se v publikaci Mitchell et al., Nucleic. Acids Res. 1990 Jul 11, 18(13): 4010 „Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae type 1 and 2. Mitchell et al., Biochim. Biophys. Acta 1989 Jan. 23, 1007(1): 67-72 „Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties., WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al.,), WO 99/03884 (NAVA)), PspA a jeho transmembránové deleční varianty (US 5804193 Briles et al.), PspC a jeho transmembránové deleční varianty (WO 97/09994 - Briles et al.,), PsaA a jeho transmembránové deleční varianty (popisuje se v publikaci Berry and Paton, Infect. Immun. 1996 Dec., 64(12): 5255-62 „Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae), pneumokokové proteiny vázající cholin a jeho deleční varianty, (WO 97/41151, WO transmembránové fosfátu (popisuje
3544), HSP70 (WO
CbpA a jeho transmembránové
99/51226), dehydrogenáza se v publikaci Infect.
96/40928), PcpA (popisuje se v publikaci deleční varianty glyceraldehyd-3Immun. 1996 64:
• ·· ti·
• · ti ti • ti ·
• • • ti
• ti • « ti
• ti • ti
• «ti ti·· • ·« ti
Sanchez-Beato et al., FEMS Microbiol. Lett. 1998, 164: 207
14), protein podobný proteinu M (popisuje se v dokumentu SB patentová přihláška č. EP 0837130) a adhezin 18627 (popisuje se v dokumentu SB patentová přihláška č. EP 0834568.
Proteiny používané podle vynálezu se s výhodou vybraly ze skupiny zahrnující pneumolyzin, PsaA, PspA, PspC, CbpA nebo kombinaci dvou nebo více takových proteinů. Vynález dále popisuje imunologicky funkční ekvivalenty takových proteinů (jak se definuje shora v textu).
V kompozici protein může pomáhat indukovat odezvu proti pneumokokovému onemocnění zprostředkovanou T buňkami, zvláště požadovanou ochranu proti zápalu plic, což spolupracuje s humorálni částí imunitního systému, přičemž dochází k inhibici invaze pneumokoky a ke stimulaci opsonofagocytózy.
Další výhoda použiti proteinových antigenů je přítomnost dalších antigenů v procesu opsonofagocytózy a inhibice bakteriální adheze (jestliže se použije adhezin) nebo neutralizace toxinu (jestliže se použije toxin).
Vynález popisuje vakcínu organizmu Streptococcus pneumoniae, která obsahuje pneumokokový polysacharidový konjugát obsahující polysacharidové antigeny získané z alespoň ze čtyř sérotypů, přičemž se upřednostňuje alespoň sedm sérotypů, více se upřednostňuje alespoň jedenáct sérotypů, a alespoň jeden, ale s výhodou dva proteiny mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae. S výhodou je jeden z proteinů pneumolyzin nebo PsaA nebo PspA nebo CbpA (nej výhodně j ší je detoxifikovaný pneumolyzin). Preferovaná kombinace obsahuje alespoň pneumolyzin nebo jeho derivát a PspA.
Jak se uvádí shora v textu, problém spojený s vakcinaci vakcínou obsahující polysacharidy, je skutečnost, že polysacharidy jsou slabé imunogeny. Aby se obešel tento
φφ φφφφ • ·· φ φ φ . φ · ·· • φ φ· φφ φφ • φ· »φ φ ·· > · φ φ φφ φ φφφφ • φφφφ φ • Φ φφφ
ΦΦΦ ΦΦΦΦ φφ φφφ problém, polysacharidy se mohou konjugovat s proteinovými nosiči, které poskytují pomoc T-buňkám. Proto, když vynález používá polysacharidy, jsou spojeny s proteinovým nosičem. Příklady takových nosičů, které se v současné době běžně používají při produkci polysacharidových imunogenů zahrnuji toxoidy diftérie a tetanu (DT, DT CRM197 a TT), hemocyanin přílipkovitých mlžů (KLH), OMPC pocházející z mikroorganizmu N. meningitidis a čištěné proteinové deriváty tuberkulinu (PPD) .
S každým z těchto běžně používaných nosičů je však spojena řada problémů (popisuje se v sekci „Problems Associated with Commonly-Used carriers uvedené shora v textu).
Vynález popisuje nový nosič vhodný pro použití konstrukcí imunogenu založených na polysacharidu, které nevykazují tyto nevýhody. Preferovaný nosič v případě imunogenních prostředků (nebo vakcín) založených na pneumokokovém polysacharidu je protein D z mikroorganizmu Haemophilus influenzae (popisuje se v dokumentu EP 594610-B) nebo jeho fragmenty. Fragmenty vhodné pro použiti zahrnují fragmenty obsahující epitopu pomocných buněk T. Zvláště fragment proteinu D bude přednostně obsahovat N-terminální 1/3 proteinu.
Dále preferovaným nosičem pneumokokového polysacharidu je samotný pneumokokový protein (jak se definuje shora v textu v sekci „Pneumokokové proteiny podle vynálezu).
Vakciny podle vynálezu přednostně obsahují adjuvans. Vhodné adjuvans zahrnuje hlinité sole, jako je gel hydroxidu hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý, ale musí také zahrnovat sole vápníku, želez nebo zinku nebo mohou zahrnovat nerozpustné suspenze acylovaného tyrozinu nebo acylované cukry, kationicky nebo anionicky derivatizované polysacharidy nebo polyfosfazeny.
Je výhodné adjuvans vybrat tak, aby tvořilo preferenční indukční činidlo odezvy typu TH1, což podporuje část imunitního systému zprostředkovaného buňkou.
Adjuvans TH1 podle vynálezu
Velké množství cytokinů typu Thl vyvolává imunitní odezvy zprostředkované buňkou na daný antigen, zatímco velké množství cytokinů typu Th2 má tendenci vyvolat humorálni imunitní odezvy na antigen.
Je důležité si pamatovat, že rozdíl imunitní odezvy typu Thl a Th2 není absolutní. Jedinec bude podporovat imunitní odezvu, která se popisuje jako převážně Thl nebo převážně Th2. Často je vhodné zvažovat rodiny cytokinů tak, jak je popsáno pro myši CD4 + v klonech T-buněk (jak se popisuje v publikaci Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead do different functional properties. Annual Rewiew of Immunology, 7, pl45
173). Tradičně odezvy typu Thl jsou spojeny s produkcí INF-γ a cytokinů IL-2 T-lymfocyty. T buňky neprodukují jiné cytokiny, které jsou spojeny s indukcí imunitní odezvy typu Thl, jako jsou například IL-12. Naopak odezva typu Th2 je spojena se sekrecí 11-4, 11-5, IL-6, IL-10. Vhodné adjuvantní systémy, které podporují převážně odezvu Thl zahrnují monofosforylový deriváty, zvláště 3-de-O-acylovaný A a kombinace monofosforyllipidu A, (3D-MPL) j eho lipid A nebo monofosfory11ipid upřednostňuje se spolu se solí hliníku, monofosforyllipidu A a QS21 a 3D-MPL, jak se
3-de-O-acylovaný monofosforyllipid
Zesilovací systém zahrnuje kombinaci derivát kombinaci popisuj e méně reaktogenní prostředek, cholesterolem, jak se popisuje v saponinu, zvláště v v dokumentu WO 94/00153 nebo kde QS21 je zakalený dokumentu WO 96/33739.
• · · · · • · · • · · · • · · • · · · · · · ·
V dokumentu WO 95/17210 se popisuje zvláště silné adjuvans zahrnující QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi olej ve vodě, což se považuje za preferovanou formulaci.
Vynález také popisuje způsob produkce vakcinační formulace farmaceuticky obsahující směs proteinu podle vynálezu spolu s přijatelným ekcipientem, jako je 3D-MPL.
*
Nemethylované oligonukleotidy obsahující CpG jsou také výhodnými indukčními činidly odezvy vhodné pro použití podle vynálezu.
(WO 96/02555)
TH1 a jsou preferované prostředky podle vynálezu obsahují více konjugačních pneumo kokových polysacharidů, více pneumokokových proteinů a adjuvans Thl.
Zvláště jeden nebo jeden nebo
Indukce odezvy zprostředkované buňkou pneumokokovým proteinem (jak se popisuje shora v textu) a kooperace mezi oběma rameny imunitního systému se mohou podporovat za použití takového adjuvans Th-1, přičemž výsledek je zvláště účinná vakcína proti pneumokokovému onemocnění, zvláště proti pneumokokovému zápalu plic u přestárlých lidí.
Vynález dále popisuje v případě popisuje imunogen nebo vakcínu, jak se použití v medicíně.
Vynález dále polysacharidový MPL), který je protilátkovou v populaci lidí, popisuje prostředek obsahující pneumokokový (upřednostňuje se 3Dsérum nebo indukovat humorální konjugát a adjuvans Thl schopný odezvu kteří přeměnit proti nereaguj i polysacharidovému antigenů odezvou.
Je známo, že 10 až 30 pólysacharidovou sérotypů ve na o, Ό et % populace neodpovídá imunizaci (neodpovídá na vice než 50 vakcíně) (popisuje se v publikaci Konradsen al., Scand. J. Immun. 40: 251 (1994), Rodriguez et al·., JID,
173: 1347 (1996). To může také být případ konjugačních vakcín
9 9 9 al., Clin. Inf. Dis. 27:
(popisuje se v publikaci Musher et
1487 (1998) ) . To může být zvláště oblast populace (kojence, nemluvňata • · · · • ·· í · • ·· • · · · • 99
9 999 99· vážné pro silně rizikovou a přestárlé).
Zjistilo se, polysacharidů (který je populaci) s adjuvans Thl podle vynálezu shora skutečnost, že nedochází adjuvans 3D-MPL založeném na použilo adj uvans odezvu).
že kombinace konjugovaného pneumokokového náchylný k malé odezvě v určité (popisuje se v kapitole „Adjuvans Thl v textu) může překvapivě překonat k odezvě. Upřednostňuje se, aby se a nejvíce se upřednostňuje 3D-MPL bez hliníku (které stále poskytuje lepší popisuje takové prostředky a dále kteří neodpovídají na pneumokokové takových prostředků. Dále vynález při výrobě léčiva, které polysacharidové antigeny, pneumokokovému onemocnění systém
Vynález tak popisuje metodu léčby lidí, polysacharidy, aplikací popisuje použití adjuvans Thl obsahuje konjugované pneumokokové při léčbě (nebo ochraně proti) jednotlivců, jejichž imunitní polysacharidový antigen.
neodpovídá na způsob prevence který zahrnuje popisuje zde mikroorganizmu
V jednom provedeni vynálezu se popisuj e nebo zlepšení zápalu plic u přestárlých lidí, bezpečné a účinné množství vakcíny, jak se v textu, obsahující polysacharidový antigen
Streptococcus pneumoniae a buď adjuvans Thl nebo pneumokokový protein (výhodné je, když obsahuje obě složky).
V dalším provedení vynálezu se popisuje způsob prevence nebo zlepšení zánětu středního ucha u kojenců nebo nemluvňat, který zahrnuje aplikaci bezpečného a účinného množství vakcíny obsahující polysacharidový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneuminiae a buď proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo adjuvans Thl (výhodné je, když obsahuje oboji).
• · • · · · ♦··· ♦ · · · · ·· ·· ·····«· ·· ···
Upřednostňuje se, aby se v metodách podle vynálezu popsaných shora v textu použil polysacharidový antigen přítomný jako polysacharidový proteinový konjugát.
Vakcinační prostředky podle vynálezu
Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou použít k ochraně nebo k léčbě savců, kteří jsou náchylní k infekci tak, že se aplikuje uvedená vakcína systémovou nebo mukozální cestou. Tyto aplikace mohou zahrnovat intramuskulární, intraperitoneální, intradermální nebo podkožní injekci nebo mukozální aplikaci do orálního/zažívacího, respiračního, močopohlavního traktu. Preferuje se intranasální aplikace vakcín za účelem léčby zápalu plic nebo zánětu středního ucha (nasofaryngeální zavedení pneumokoků může působit jako velmi účinná prevence nebo může odstranit utlumenou infekci v jejím velmi časném stádiu).
Množství konjugačního antigenu v každé vakcinační dávce se vybralo jako množství, které vyvolává imunoochrannou reakci bez podstatného nežádoucího vedlejšího účinku. Takové množství kolísá v závislosti na použitém imunogenu a jak se prezentuje. V obecném případě se očekává, že každá dávka bude obsahovat 0,1 až 100 pg polysacharidů, upřednostňuje se 0,1 až 50 pg, dále se upřednostňuje 0,1 až 10 pg, z čehož se nejvíce upřednostňuje rozmezí 1 až 5 pg.
Obsah proteinových antigenů ve vakcíně je v typickém případě v rozmezí 1 až 100 pg, upřednostňuje se 5 až 50 pg, nejvíce se upřednostňuje rozmezí 5 až 25 pg.
Optimální množství komponent v určité vakcíně se může zjistit ve standardních studiích, které zahrnují pozorování vhodných imunitních odezev u subjektů. Pak následuje počáteční • · · ♦ · · vakcinace, kdy subjektu se aplikuje jedna nebo několik provokačnich dávek v adekvátních časových úsecích.
Vakcinační prostředek se obecně popisuje v publikaci Vaccine Design („The subunit and adjuvant approuch, eds. Powell M.F. and Newman M. J., (1995) Plenům Press New York). Kapsulazice do lipozómů se popisuje v publikaci Fullerton, US Patent 4 235 877.
B) Prostředek obsahující vybraný pneumokokový polysacharidový konjugát + 3D-MPL
Termín „pneumokokové polysacharidové konjugáty podle vynálezu popisují ty konjugáty kapsulárních polysacharidu mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae, které jsou více imunogenní v kompozicích obsahujících 3D-MPL v porovnání s prostředky, které obsahují 3D-MPL ve spojení s adjuvans založeném na hliníku (například konjugáty sérotypů 4, 6B, 18C, 19F nebo 23F).
Termín „v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku popisuje prostředek, který v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku (například hydroxid hlinitý a zvláště pak fosforečnan hlinitý) a způsobuje libovolné snížení imunogennosti pneumokokového polysacharidového konjugátu podle vynálezu ve srovnání s ekvivalentní kompozicí, která obsahuje 3D-MPL, aniž se přidá adjuvans založené na hliníku. Upřednostňuje se, aby antigenní prostředek obsahoval adjuvans, které obsahuje podstatné množství 3D-MPL. Množství adjuvans přidaného do dávky by mělo přednostně obsahovat méně než 50 gg, více se upřednostňuje méně než 30 μρ, stále výhodnější je méně než 10 μς a nejvíce se preferuje, když se do antigenního prostředku podle vynálezu nepřidá žádné adjuvans založené na hliníku.
• · • ·
Stanovení, zda pneumokokový polysacharidový konjugát je podstatně více imunogenní ve srovnání s prostředkem, který obsahuje 3D-MPL, ve srovnání s prostředkem, který obsahuje 3DMPL ve spojeni s adjuvans založeným na hliníku, se může provést způsobem popsaným v příkladu 2. Jako indikace, zda prostředek je podstatně více imunogenní, když obsahuje samotný 3D-MPL, poměr koncentrace GMC IgG (jak se stanovilo v příkladu 2) mezi prostředky, které obsahují samotný 3D-MPL versus ekvivalentní prostředek obsahující 3D-MPL ve spojení s fosforečnanem hlinitým by mělo být víc jak 2, upřednostňuje se více jak 5, více se upřednostňuje víc než 7, stále více se upřednostňuje více jak 9 a nejvíce se upřednostňuje více než 14.
Mezi problémy spojenými s polysacharidovou vakcínou patří skutečnost, že polysacharidy jsou málo imunogenní. Strategie, která se navrhla, aby se obešla nedostatečnost imunogennosti, zahrnuje vazbu (spojení) polysacharidu s velkými proteinovými nosiči, které pomáhají T buňkám. Preferuje se, . aby pneumokokové polysacharidy podle vynálezu se vázaly na proteinový nosič, který pomáhá T-buňkám. Příklady takových nosičů, které se mohou použít zahrnuji diftérie, mutant diftérie a toxoidy tetanu (DT, CRM197 a TT), hemocyanin přílipkovitých plžů (KLH), čištěný proteinový derivát tuberkulinu (PPD) a OMPC mikroorganizmu Neisseria meningitidis.
Protein D z mikroorganizmy Haemophilus influenzae (EP 0 594 610-B) nebo jeho fragmenty (sekce C) se používá jako imunogenní proteinový nosič pro pneumokokové polysacharidy podle vynálezu.
V jednom provedení antigenního prostředku podle vynálezu se popisuje pneumokokový polysacharid sérotyp (PS) 4 konjugovaný s imunogennim proteinem a s”pojený s adjuvans 3DMPL, kde prostředek v podstatě neobsahuje adjuvans založené na
Φ φ a « «
hliníku. V dalších provedeních vynálezu antigenní prostředek obsahuje PS 6B, 18C, 19F nebo 23F konjugované s imunogenním proteinem a je formulován s adjuvans 3D-MPL, kde prostředek v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku.
V dalším provedeni vynálezu se popisuje kombinace antigenního prostředku obsahující dva nebo více pneumokokových polysacharidových konjugátu ze skupiny PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F a PS 23F formulované s adjuvans 3D-MPL, kde prostředek v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku.
Imunogennost pneumokokových polysacharidových konjugátů podle vynálezu není v podstatě ovlivněna kombinací s jinými pneumokokovými polysacharidovými konjugáty (příklad 3). Vynález popisuje kombinaci antigenního prostředku, který obsahuje jeden nebo více pneumokokových polysacharidových konjugátů podle vynálezu v kombinaci s jedním nebo více pneumokokovými polysacharidovými konjugáty, kde prostředek obsahuje adjuvans 3D-MPL, ale v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku.
V dalších provedeních vynálezu se popisuje kombinace antigenních prostředků, které obsahuji alespoň jeden a přednostně 2, 3, 4 nebo všech pět pneumokokových polysacharidových konjugátů PS 4, 6B, 18C, 19F nebo 23F a navíc libovolnou kombinaci jiných pneumokokových polysacharidových konjugátů, které jsou tvořeny s adjuvans 3DMPL, ale v podstatě neobsahují adjuvans založené na hliníku.
V typickém případě kombinace antigenního prostředku mikrorganizmu Streptococcus pneumoniae podle vynálezu obsahuje polysacharidové konjugační antigeny, kde polysacharidy se získaly z alespoň čtyř, sedmi, dvanácti, třinácti, patnácti nebo dvacetitří sérotypů (preforované kombinace sérotypů závisí na léčeném onemocnění a popisují se v sekci • · · · „Streptococcus pneumoniae Polosaccharide Antigens of the
Invention).
Antigenné prostředky podle jako vakcinační prostředky pneumokokových infekcí zvláště nemluvňat.
vynálezu se s výhodou používají pro prevenci (nebo léčbu) u přestárlých lidí a kojenců a
Další popsaných provedení vynálezu zahrnuje zajištění shora antigenních kompozic vhodných pro použití v medicíně, způsob zahrnuj ící imunitní odezvu na kapsulární polysacharidový pneumoniae, který účinného množství konjugát zahrnuj e jednoho mikroorganizmu kroky aplikace
Streptococcus bezpečného a shora uvedených antigenních prostředků, a použití jednoho shora uvedených antigenních prostředků při výrobě léčiva vhodného pro prevenci (nebo léčbu) pneumokokového onemocnění.
Při prevenci/zlepšení zápalu plic u populace přestárlých lidí (nad 55 let) a zánětu středního ucha u kojenců (až do 18 měsíců) a nemluvňat (v typickém případě 18 měsíců až 5 let) se v dalším preferovaném provedení podle vynálezu popisuje kombinace multivalentního polysacharidového konjugátu formulovaného stejným způsobem jako se popisuje v případě proteinu mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jeho imunologicky funkčního ekvivalentu. Preferovaný protein nebo proteinové kombinace se popisují ve shora v textu uvedené sekci Pneumokokové proteiny podle vynálezu.
Upřednostňuje se, aby popsané antigenní prostředky (a vakcíny) se lyofilizovaly a tak se udržovaly do toho okamžiku, kdy se mají použít, což znamená, že se rekonstituují rozpouštědlem. Více se upřednostňuje, aby se prostředky lyofilizovaly v přítomnosti 3D-MPL a rekonstituovaly se fyziologickým roztokem.
• ·
Lyofilizované prostředky jsou stabilnější (například se předchází rozkladu polysacharidových antigenů). Způsob je také překvapivě odpovědný za vyšší titr protilátek proti pneumokokovým polysacharidům. To se ukazuje zvláště podstatné v případě konjugátů PS 6B. V jiném ohledu podle vynálezu se tak lyofilizovaný antigenní prostředek obsahující konjugát PS 6B adjuvoval s 3D-MPL a v podstatě neobsahuje adjuvans založené na hliníku.
Příprava vakcín se popisuje „Příprava vakcín podle vynálezu.
shora v textu v sekci
C) Konjugáty bakteriální polysacharid - protein D
Kombinační vakciny jsou výhodné v tom, že redukují potíže recipienta, umožňují plánování a dokončení režimu, vykazují také průvodní jev, kterým je snížení účinnosti vakciny (shora v textu se popisuje potlačení epitopu pomoci použití nosičových proteinů). Je proto výhodné vytvořit vakcinační kombinaci, která spojuje potřeby populace a která navíc vykazuje imunogenní interferenci mezi jejími komponenty. Tyto výhody zahrnují imunogenní prostředky (nebo vakciny) podle vynálezu, které jsou zvláště výhodné pro aplikaci kombinačních vakcín vysoce rizikovým skupinám, jako jsou kojenci, nemluvňata nebo přestárlí lidé.
Vynález
Haemophilus imunogenního popisuje protein D pocházející z mikroorganizmu influenzae nebo jeho fragmenty, jako nosič polysacharidu, které vhodné pro použiti prostředku založeného na jsou obsaženy ve vakcínách.
Fragmenty zahrnují fragmenty obsahující Zvláště fragment proteinu D terminální 1/3 proteinu.
pomocných buněk bude s výhodou obsahovat epitopy
T.
N-
• · *
• · • 9 • · • ♦ · · · · * • · · · 9 • · · < ♦ · 9 • 9 9 9 • · ···«···
Protein D je protein vázající z mikroorganizmu Haemophilus influenzae (EP potencionálním imunogenem.
pocházej ící
IgD
594 610 Bl) a je
Polysacharidy, aby se konjugovaly s vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny antigen proti mikroorganizmu Salmonella (zahrnující typ A, polysacharid a upravené polysacharidy meningokoků , polysacharidy polysacharidy polysacharidy polysacharidy Mycobacterium kyselina mykoliová, kapsule vytvořené z těchto látek z mikroorganizmu netypovatelného polysacharid na proteinem D podle pólysacharidový meningokokální
Vi typhí, sacharidy upravený
C,
W135 polysacharid a skupiny aureus,
B) z mikroorganizmu z mikroorganizmu
Staphylococcus
Streptococcus agalactae, pneumoniae, například trehalóz, z mikroorganizmu z mikroorganizmu
Streptococcus mykobacterium, tuberculosis (mannofosfoinisitidy polysacharid
Cryptococcus neoformans, lipopolysacharidy
Haemophilus z mikroorganizmu arabinogalaktany), influenzae, kapsulární mikroorganizmu mikroorganizmu lipopolysacharidy lipopolysacharidy Shigella sonnei, lipopeptidofosfoglykan (LPPG) spojené se nádorovým
Haemophilus influenzae b,
Moraxella catharralis, mikroorganizmu zhoubným bujením, onemocněním, zvláště
Trypanosoma
GD3,
T-F polysacharid spojený s antígenem T-F.
cruzi, gangliosidy
GD2, mucíny spojené antigen a sialyl T-F který je strukturálně
IV, antigen a spoj ený být spoj en
Polysacharid může libovolnou známou metodou (popisuje se s nosičovým například v proteinem publikaci
Likhite, U.S. Patent 4
372 94 5 a Armor provedlo spojení patent 4 s CDAP (WO 95/08348).
et al., U.S.
V CDAP kyanylační činidlo 1-kyanodimethylaminopyridinterafluoroborát (CDAP) se přednostně použil při syntéze konjugátů polysacharid-protein. Kyanilační reakce se může uskutečnit za relativně mírných hydrolýze polysacharidů citlivých syntéza umožňuje přímé spojování s • ♦ ·· · • 9«· • · 9 99
c.; í •· · podmínek, které bráni na alkalické činidlo. Tato nosičovým proteinem.
vodě nebo ve fyziologickém
CDAP se rozpustil v acetonitrilu a přidal se okamžitě k polysacharidovému roztoku. CDAP reaguje s hydroxylovými skupinami polysacharidu ve formě esteru kyanátu. Po aktivaci se přidal nosičový protein, s aktivovaným polysacharidem kovalentní vazby.
Polysacharid se rozpustil ve roztoku.
Aminoskupiny za vzniku lyzinu reaguji i zomočovínové a potlačí se gelem, aby se činidla.
Po reakci se přidá velký nadbytek glycinu zbytkové aktivované funkce. Produkt pak prochází odstranil nezreagovaný nosičový protein a zbytková
Vynález popisuje způsob produkce konjugátů polysacharidu a proteinu D, který zahrnuje kroky aktivace polysacharidu a spojení polysacharidu s proteinem D.
V preferovaném provedení vynálezu se popisuje imunogenní prostředek (nebo vakcína) vhodná pro prevenci infekcí Streptococcus pneumoniae.
Mechanizmy rozšíření pneumokoků do tekutiny a krve nejsou zcela jasné. Růst plicních sklípcích se inhibuje jejich fagocytární aktivitou alveolárních anatomické nebo fyziologické změny této tendenci zvyšovat citlivost plic pneumoniae má ve sklípcích (1997), I and plic, cerebrospinální bakterií v normálních relativní suchostí a makrofágů. Libovolné koordinované obrany má k infekci. Buněčná stěna mikroorganizmu Streptococcus vytvoření zánětlivé odezvy v publikaci Gillespie et al.
důležitou úlohu při plic (popisuje se 65: 3936) .
V typickém případě Streptococcus pneumoniae konjugáty polysacharidu a vakcína proti podle vynálezu proteinu D, kde mikroorganizmu bude obsahovat polysacharid se
získal z alespoň čtyř, sedmi, jedenácti, třinácti, patnácti nebo 23 sérotypů. V sekci „Polysacharidové antigeny mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae se podle vynálezu popisují preferované kombinace sérotypů závisející na léčeném onemocnění.
V dalším provedení vynálezu se popisuje vakcína proti mikroorganizmu Neisseria meningitidis, zvláště sérotypy A, B, C W-135 a Y. Mikroorganizmus Neisseria meningitidis je jeden z nejdůležitějších případů bakteriální meningitidy. Sacharidová kapsule těchto organizmů může působit jako determinanta virulence a cíl ochranných protilátek. V oboru je známo, že polysacharidy jsou u malých dětí slabými imunogeny. Vynález popisuje zvláště vhodný proteinový nosič vhodný pro tyto polysacharidy, protein D, který popisuje epitopy buňky T, které se mohou aktivovat odezvou buňky-T, přičemž dochází k proliferaci, protože polysacharidový antigen specifický pro buňku B napomáhá jejich pomnožení a zrání, stejně jako indukci imunologické odpovědi.
V jiném provedení podle vynálezu se popisuje konjugát kapsulárního polysacharidu mikrorganizmu Haemophilus influenzae b (PRP) - protein D.
Vynález dále popisuje kombinační vakcíny, které poskytují ochranu proti řadě rozdílných patogenů. Nosič proteinu D je překvapivě použitelný jako nosič v kombinačních vakcínách, kde je konjugováno více polysacharidových antigenů. Jak se popisuje shora v textu potlačení epitopu se pravděpodobně objevuje, jestliže se pro každý polysacharid může použít stejný nosič. Dokument WO 98/51339 popisuje prostředky, které minimalizují svůj vliv konjugací části polysacharidů v prostředku s DT a zbytek s TT.
Překvapivě se zjistilo, že protein D je zvláště vhodný pro minimalizaci takových účinků potlačení epitopu v kombinačních »»>·*
9 9 · 99
9· •· • ·· ·
9· •
•9
9· ·«
99 •9 •9 vakcinách.
Jeden nebo více polysacharidu v kombinaci může konjugovat s proteinem D a přednostně v takových s výhodou kombinačních vakcinách všechny antigeny konjugují s proteinem
D.
Preferované kombinace zahrnují vakcínu, která umožňuje ochranu proti infekci mikroorganizmu Neisseria meningitidis C a Y (a s výhodou A) , kde polysacharidový antigen z jednoho nebo více sérotypu Y a C (a nej výhodněj ší je A) je spojen s proteinem D.
Vakcína založená na polysacharidu mikroorganizmu Heamophilus influenzae (PRP konjugovaný přednostně s TT, DT nebo CRM197 nebo výhodně s proteinem D) se může vytvořit stejně jako shora v textu popsané kombinační vakcíny.
Řada vakcín použitelných v pediatrii se vyskytuje jako kombinační vakcína, aby se snížil počet injekcí, které se musí dítěti aplikovat. Tak pediatrické vakcíny podle vynálezu obsahují více antigenů. Vakcíny podle vynálezu se mohou spojovat nebo se mohou aplikovat jednotlivě, ale je známa trivalentní kombinační vakcína obsahující toxoid diftérie (DT), toxoid tetanu (TT) a komponenty černého kašle (v typickém případě jde o detoxifikovaný toxoid černého kašle (PT) a filamentózní hemaglutinin (FHA) s pertaktinem (PRN) a/nebo aglutinin 1+2), která se označuje jako INFANRIX-DTPa™ (od firmy SmithKlineBeecham Biologicals) , která obsahuje antigeny DT, TT, PT, FHA a PRN. Dále je známa vakcína obsahující celé buňky černého kašle, která je od firmy SmithKlineBeecham Biologicals s.a. a je označena jako Tritanrix™. Kombinovaná vakcína může také obsahovat jiný antigen, jako je povrchový antigen hepatitidy B (HbsAg), antigeny Polioviru (například deaktivovaný trivalentní poliovirus-IPV), proteiny vnější membrány mikroorganizmu Moraxella catarhalis, proteiny netypovatelného Haemophilus
• · · · · · ·
influenzae, proteiny vnější membrány mikroorganizmu N.
meningitidis B.
Příklady preferovaných proteinových antigenů mikrorganizmu Moraxella catarrhalis zahrnuté v kombinační vakcíně (zvláště pro prevenci zánětu středního ucha) jsou: OMP106[WO 97/41731] (Antex) a WO 96/34960 (PMC)], OMP 21, LbpA a LbpB [WO 98/55606 (PMC)], TbpA a TbpB [WO 97/13785 a WO 97/32980 (PMC) ], CopB [Helminen ME, et al., (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010],
UspAl/2 [WO 93/03761 (University 0f Texas)] a OmpCD. Příklady netypovatelných antigenů mikroorganizmu Haemophilus influenzae, které jsou zahrnuty v kombinační vakcíně (zvláště vhodné pro prevenci zánětu středního ucha) zahrnují: protein fimbrin [US 5766608 - Ohio Statě research Foundation] a fúze obsahující jeho peptidy [například fúze peptidů LBl(f), US 5843464 (OSU) nebo WO 99/64067], OMP26 [WO 97/01638 (Cortecs)], P6 [EP 281673 (Statě University of New York], TbpA a TbpB, Hia, Hmwl,2, Hap a D15.
Preferované pediatrické vakciny podle vynálezu jsou:
a) Konjugát polysacharidů C mikroorganizmu N. meningitidis a konjugát polysacharidů Haemophilus influenzae b, které mohou být spojeny s konjugátem polysacharidů A a/nebo Y M.meningitidis, přičemž se poskytuje. alespoň jeden polysacharidový antigen a upřednostňuje se, aby všechny polysacharidy byly spojené s proteinem D.
b) Vakcína a) doplněná DT, TT, komponenty černého kašle (upřednostňuje se PT, HFA a PRN) , povrchový antigen hepatitidy B a IPV (deaktivovaná trivalentní vakcína polioviru).
c) Polysacharidové antigeny mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae spojené s proteinem 0.
·· · · • · · ti · · · « · ♦ ··· ·· · · «· ♦* ·····«· · ti
d) Vakcina c) s jedním nebo více antigeny, které pocházejí z mikroorganizmu Moraxella catarrhalis a/nebo z netypovatelného Haemophilus inflůenzae.
Pro všechny shora uvedené kombinované vakcíny je výhodné použití proteinu D, jako nosiče. Je zřejmé, že čím více nosičů, které se zahrnou do kombinační vakcíny (například, aby se překonalo potlačení epitopu), tím je dražší a komplexnější konečná vakcina. Podstatně výhodné je, když všechny nebo většina polysacharidových antigenů v kombinační vakcíně se konjuguje s proteinem D.
Při prevenci zápalu plic u populace přestárlých lidí (nad 55 let) a zánětu středního ucha u kojenců nebo nemluvňat se preferuje provedení vynálezu, kdy se kombinuje multivalentní polysacharid mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae a protein D, což se zde nazývá protein mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jeho imunologicky funkční ekvivalent. Ve shora uvedené sekci „Pneumokokové proteiny podle vynálezu se popisují preferované proteiny (proteinové kombinace, které mohou být obsaženy v takových kombinacích.
Vynález dále popisuje imuunogenní prostředek obsahující konjugát polysacharid Streptococcus pneumoniae - protein D a proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae.
Antigeny polysacharid - protein D podle vynálezu jsou ve vakcinačním prostředku podle vynálezu s výhodou konjugované. Vhodná adjuvans zahrnují hlinité sole, jako je gel hydroxidu hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý, ale mohou to také být sole vápníku, železa nebo zinku nebo to mohou být nerozpustné suspenze acylovaného tyrozinu nebo acylované cukry, kationicky nebo anionicky derivatizované polysacharidy nebo polyfosfazeny.
········»♦· • · ·· · · · « · « * .* * * · · ·» · »· ·· ··· ·»»· »· ·*·
U vakcín pro přestárlé lidi se preferuje, že adjuvans se vybralo tak, aby vyvolávalo odezvu typu TH1.
Určité adjuvans Thl se popisuje shora v textu v sekci „Adjuvans Thl podle vynálezu.
Vynález dále popisuje imunogen nebo vakcínu, kterou je možné použit v medicíně.
Příprava/aplikace konjugátu se popisuje v sekci „Příprava vakcíny podle vynálezu shora v textu.
Protein D se také s výhodou použije ve vakcíně proti zánětu středního ucha. Sám působí jako imunogen schopný produkovat ochranu zprostředkovanou B-buňkou proti netypovatelnému H. influenzae (ntHi). ntHi může vstoupit do hostitele a umožní pomocí proteinového antigenu indukci účinků zprostředkovaných buňkou B. Překvapivě se zjistil způsob zvýšení účinnosti působení proteinu D (buď se samotného nebo jako nosiče pro polysacharid) jako antigenu ve vakcíně proti zánětu středního ucha. To je možné provést adjuvancí proteinu D tak, že se v subjektu indukuje silná odezva Thl proti proteinu D tak, že část imunitního systému zprostředkovaná buňkou se optimalizuje. Toho se překvapivě dosáhne použitím lyofilizovaného prostředku, který obsahuje protein D a adjuvans Thl (upřednostňuje se 3D-MPL), který se rekonstituoval krátce před aplikací. Vynález tak popisuje takové prostředky, způsob pro přípravu takových kompozic (lyofilizací směsi, která obsahuje protein D a adjuvans Thl) a použití takového prostředku při léčbě zánětu středního ucha.
Ukázalo se, že lyofilizace imunogenu v přítomnosti adjuvans Thl (popisuje se v sekci „adjuvans Thl podle vynálezu), přednostně 3D-MPL, v obecném případě vyvolá imunitní odezvu Thl proti imunogenu. Vynález je možné aplikovat na libovolný imunogen, v případě, že je nutné, aby • 9 · ··* •9 •·
9· •9 • 9 imunitní systém reagoval silnější imunitní odezvou imunogeny obsahují bakteriální, virové a nádorové proteinové antigeny, stejně jako samotné proteiny a peptidy.
• *9 999 ♦· · · 9 999 • 9 9 99 • 9 9 9 99 « 9 9 99 ·♦· 9999 9«999
Thl. Takové
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Kapsulární polysacharid mikrorganizmu S.pneumoniae
11-valentní vakcína zahrnuje kapsulární polysacharidy sérotypů 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F se připravily v podstatě stejným způsobem, jak se popisuje v dokumentu EP 72513. Každý polysacharid se aktivuje a derivatizuje za použití chemie CDAP (popisuje se v dokumentu
95/08348) a konjugoval se s proteinovým nosičem. Všechny polysacharidy se konjugovaly ve své přirozené formě s výjimkou sérotypů 3 (jehož velikost se redukovala, aby se snížila viskozita) .
Proteinový nosič:
Vybraný proteinový nosič je rekombinantní portein D (PD) z netypovatelného Haemophilus influenzae, který se exprímuje v E. coli.
Exprese proteinu D
Protein D mikroorganizmu Haemophilus influenzae Genetická konstrukce vhodná pro expresi proteinu D Počáteční materiál
DNA kódující protein D
Protein D je mezi H. influenzae všech typů a netypovatelnými kmeny vysoce konzervativní. Vektor pHIC348 obsahující sekvenci DNA kódující celý gen proteinu D se získal od Dr. A. Forsgrena, z instituce Department of Medical
35 • · • · • · • 9 · · Φ 9 · ·
• ♦ • · • 9 9 ·
• · • * ··>····
Microbiology, University of Lund, Malmo Generál Hospital,
Malmo, Sweden. Sekvence DNA proteinu D se popisuje v publikaci
Janson et al., (1991) Infect. Immun. 59: 119-125.
» Exprese vektoru pMGl
Expresivní vektor pMGl je derivát pBR322 (popisuje se v publikaci Gross et al., 1985), kde bakteriofág λ nese řídící elementy pro transkripci a translaci cizorodých začleněných v
genů (popisuje se v publikaci Shatzmanet et al., 1983). Navíc gen nesoucí rezistenci na ampicilin se zaměnil za gen nesoucí rezistenci na kanamycin.
Kmen AR58 mikroorganizmu E.coli
Kmen AR58 mikroorganizmu E. coli se vytvořil transdukcí N99 se zásobním roztokem fágu Pl, který se kultivoval na derivátu SA500 (galE::TN10, lambdaKilcI857 ΔΗ1).
Kmeny N99 a SA500 jsou kmeny K12 mikroorganizmu E.coli získané od Dr. Martina Rosenbergra z instituce National Institute of Health.
Expresivní vektor pMGl
Při produkci proteinu D DNA kódující protein se klonovala do expresívního vektoru pMGl. Tento plazmid využívá signály z DNA fágu lambda, aby řídil transkripci a translaci začleněných cizorodých genů. Vektor obsahuje promotor PL, operátor OL a dvě utilizační místa (NutL a NutR) , aby se uvolnily transkripční polarizační účinky, když se připravuje protein A (popisuje se v publikaci Gross et al., 1985). Vektory obsahující promotor PL se zavedou do mikroorganizmu lysogenního kmene E. coli, aby se stabilizovala plazmidová DNA. Lisogenní hostitelské kmeny obsahují DNA fágu lambda, který se nereplikuje, integrovanou do genomu (popisuje se • · ··· · • · · ·
·♦ v publikaci Shatzman et al., 1983). Chromozomální DNA fága lambda řídí syntézu proteinu represoru cl, který se váže na represor OL vektoru a předchází navázání RNA polymerázy na promotor PL a tím předchází transkripci začleněného genu. Kmen AR58 exprimující gen cl obsahuje mutant citlivý na teplotu tak, že transkripce řízená PL může regulovat posunem teploty . To znamená, že zvýšením teploty kultivace se deaktivuje represor a inicijuje se syntéza cizorodého proteinu. Tento expresívní systém umožňuje řízenou syntézu cizorodých proteinů zvláště těch, které mohou být pro buňku toxické (popisuje se v publikaci Shimataka and Rosenberg, 1981).
Kmen AR58 mikroorganizmu E. coli
Lysogenní kmen mikroorganizmu E. coli AR58 používaný při produkci nosiče proteinu D je derivát standardního kmene NIH E. coli K12 kmen N99 (F“su“galK2, lacZ' thr“) . Tento kmen obsahuje detektivní lysogenní tág lambda (galE::TN10, lambdaKil~cI857ÁHl). Fenotyp Kil“ brání vypnutí syntézy makromolekul v hostiteli. Mutace cl857 udílí lézi citlivou na teplotu represoru cl. Delece ΔΗ1 odstraňuje pravý operon fágu lambda a hostitelské loci bio, uvr3 a chlA. Kmen AR58 se vytvořil transdukcí N99 se zásobním roztokem fága Pl, který se dříve kultivoval na derivátu SA500 (galE::TN10, lambdaKil“ cl857AHl). Zavedení defektního lyzogenu do N99 se zjistilo na základě selekce s tetracyklinem a základě přítomnosti transpozonu TN10, který kóduje rezistenci na tetracyklin v přilehlém genu galE.
Konstrukce vektoru pMGMDPPrD
Vektor pMG, který obsahuje gen kódující nestrukturový protein S1 viru Influenzae (pMGNSI), se použil při konstrukci • 9 9999 • · · 99 9 · 9 φ99
J · · · · 9 99 ·· · · · 99999 •999 99 9 99 ·♦ ♦· 99 9 9999 φ» φφφ pMGMDPPrD. Gen proteinu D se amplifikoval pomoci PCR z vektoru pHIC (popisuje se v publikaci Janson et al., 1991) s primery
PCR, které obsahují restrikční místa Ncol a Xbal na 5'a 3 'konci. Fragment Ncol/Xbal se pak zavedl do pMGNSl mezi restrikční místa Ncol a Xbal a tak vznikl fúzní protein obsahující 81 N-terminálních aminokyselin proteinu NS1, po nichž následuje protein PD. Tento vektor se označil jako pMGNSlPrD.
Na základě konstrukce popsané shora v textu se vytvořila konečná konstrukce pro expresi proteinu D. Z pMGNSlPrD se odstranil fragment Baml/BamHI. Hydrolýza této DNA odstranila oblast kódující NS1, mimo prvních tří zbytků N-konce. Po opětné ligaci vektoru se vytvořil gen kódující fúzní protein s následující N-terminální aminokyselinovou sekvencí.
-MDP SSHSSNMANTNS1 protein D
Protein D neobsahuje vedoucí peptid ani N-terminální cystein, na který se v normálním případě připojí lipidový řetězec. Protein se proto nevylučuje do periplazmy a zůstává v cytoplazmě v nerozpustné formě.
Konečná konstrukce pMG-MDPPrD se zavedla do hostitelského kmene AR58 teplotním šokem při teplotě 37 °C. Bakterie obsahující plazmid se vybraly v přítomnosti kanamycinu. Přítomnost proteinu D obsahující inzert DNA se demonstrovala štěpením izolované plazmidové DNA s vybranými endonukleázami. Rekombinantní kmen E. coli se označil jako ECD4.
Exprese proteinu D je řízena promotorem lambda PL/operátorem 0L. Hostitelský kmen AR58 obsahuje v genomu gen cl citlivý na teplotu, přičemž tento gen blokuje expresi lambda PL při nízké teplotě pomocí navázání 0L. Když se zvýší • · ♦·· · • · teplota z 0L se uvolni cl a exprimuje se protein D. Nakonec fermentace se zvýší koncentrace buněk a buňky se zamrazí.
Extrakce ze sebraných buněk a čištění proteinu D se provedla následujícím způsobem. Pelet kultury zamražených buněk se rozpustil a resuspendoval se v roztoku, který porušuje buňky (citrátový pufr pH 6,0) na konečnou hodnotu OD650= 60. Suspenze dvakrát prošla homogenizérem za vysokého tlaku při P= 1000 barů. Homogenát buněčné kultury se vyčeřil centrifugací a buněčný odpad se odstranil filtrací. V prvním čistícím kroku chromatografickou s malým průtokem).
se filtrovaný kolonu s výměnou se váže na lyzát aplikoval na kationtů (SP sefaróza
PD gelovou matrici iontovou interakcí a vymyl se postupným zvyšováním iontové síly elučního pufru.
Při druhém kroku čištění se nečistoty odstranily na matrici s se neváže výměnou aniontů (Q sefaróza s rychlým na gel a může se hromadit ve výtokové fázi.
průtokem) .
PD
Oba kroky hromadění frakcí na chromatografické koloně se monitorují pomocí hodnoty OD. Frakce vytékající z kolony s výměnou aniontů obsahující čištěný protein D se koncentrovaly ultrafiltrací.
Protein D obsažený ve frakci po ultrafiltrací nakonec prošel membránou o velikosti pórů 0,2 pm.
Chemie:
Aktivace a konjugace
Podmínky aktivace a párování jsou specifické pro každý polysacharid. Tyto podmínky jsou popsány v tabulce č. 1. Přirozený polysacharid (s výjimkou PS3) se rozpustil v 2M roztoku NaCl nebo ve vodě a roztok je vhodný pro zavedení • · 4*4 4 ·♦ 4 ·9 4 * 4944
4*4 · · 9 ·9 • · 4 · 4 94*4* •••4 >9449 ·♦ ·· 94* 9944 9*44* injekcí. Optimální koncentrace polysacharidů se stanovila v případě všech typů polysacharidů.
Do poiysacharidového roztoku se přidal CDAP (CDAP/PS =
0,75 mg/mg PS) ze zásobního roztoku v nitrilu o koncentraci 100 mg/ml. Po 1,5 minutě se přidal 0,2 M triethylamin, aby došlo ke specifické aktivaci pH. Aktivace polysacharidů se provedla při uvedeném pH během 2 minut při teplotě 25 °C.
Protein D (množství závisí na počátečním poměru PS/PD) se přidal do aktivovaného polysacharidů a provedla se konjugace při specifickém pH po dobu 1 hodiny. Reakce se zastavila glycinem po dobu 30 minut při teplotě 25 C a nechala se stát přes noc při teplotě 4 °C.
Konjugáty se čistily gelovou filtrací na gelové filtrační koloně Sephacryl 500HR, která se uvedla do rovnováhy 0,2 M roztokem NaCl.
Stanovil se obsah sacharidů a proteinů eluovaných frakcích. Konjugáty se slily a sterilně se filtrovaly na sterilizační membráně o velikosti pórů 0,22 μιη. V konjugátu se stanovil poměr PS/protein.
Charakterizace:
Každý konjugát se charakterizoval a specifikace se uvedly v tabulce 2. Obsah polysacharidů (μρ/ml) se měřil Resorcinolovým testem a obsah proteinu (vyjádřený v μρ/ml) se stanovil Lowryho testem. Konečný poměr PS/PD (hmotn./hmotn.) se stanovil poměrem koncentrací.
Zbytkový obsah DMAP (ng/μρ PS):
Aktivace polysacharidů s CDAP zavádí do polysacharidů kyanátovou skupinu a uvolňuje se DMAP (4·· ·*··
DMAP se stanovil dimethylaminopyridin). Zbytkový obsah specifickým testem vyvinutým při SB.
Obsah volných polysacharidů (vyjádřeno v %) :
Obsah konjugátů volných polysacharidů při teplotě 4 °C nebo skladovaných 7 dní při teplotě 37 °C se stanovil na supernatantu získaném po inkubaci s protilátkami α-PD a saturovaným sulfátem amonným, pak následuje centrifugace.
Test ELISA a-PS/oc-PS se použila při kvantifikaci volného polysacharidu v supernatantu. Absence konjugátu se také kontrolovala testem ELISA α-PD/a-PS. Snížení množství polysacharidu vede ke zlepšení konjugační vakcíny.
Antigenicita:
Antigenicita stejných konjugátů se analyzovala testem
ELISA sendvičového typu, kde zachycení a detekce protilátek byly cc-PS a a-PD.
Obsah volného proteinu (vyjádřeno v %)
Množství volného zbytkového proteinu D se stanovilo použitím způsobu, kdy se vzorek ošetřil SDS. Konjugát se zahříval při teplotě 100 °C po dobu 10 minut v přítomnosti 0,1 % a nanesl se injekcí na gelovou filtrační kolonu SEC-HPLC (TSK 3000-PWXL). V případě, že protein D je dimér, existuje nebezpečí nadhodnocení množství volného proteinu D disociací struktury s SDS.
Molekulová velikost (Kav) :
Molekulová velikost se stanovila použitím gelové filtrační kolony SEC-HPLC (TSK 5000-PWXL).
* «
• · •9 •·
Stabilita :
Stabilita se měřila na gelové filtrační HPLC-SEC (TSK 6000-PWXL) v případě konjugátů udržovaných při teplotě 4 °C a skladovaných po dobu 7 dní při teplotě 37 °C.
11-valentni charakterizace je dána v tabulce č. 2.
Proteinové konjugáty se mohou adsorbovat na fosforečnan hlinitý a spojit se za vzniku konečné vakciny.
Závěr
Připravily se imunogenní konjugáty, které jsou komponenty slibné vakciny. V případě každé z jedenácti valencí se zjišťovaly optimální podmínky CDAP, aby vznikl konečný konjugovaný pneumokokový polysacharidový produkt. Konjugáty těchto pneumokokových polysacharidu, které je možné získat shora uvedeným způsobem (optimalizovaným) CDAP (s ohledem na
9999
nosičový aspektem protein, vynálezu. ale přednostně protein D) je tak dalším
Příklad 2: Studie účinku výhodného adjuvans na imunogennost
11-valentni pneumokokové konj ugační vakciny PS-PD. u
krys.
Právě narozené krysy se imunizovaly 11 valentní pneumokokovou konjugační vakcínou PS-PD, která obsahuje 0,1 μg každého polysacharidu (vyrobeno způsobem popsaném v příkladu 1) a použití následující adjuvančního činidla: žádný, A1PO4, 3D-MPL, 3D-MPL na A1PO4.
Prostředek obsahující pouze 3D-MPL je statisticky (a překvapivě více imunogenní) (nevíce GMC IgG) ve srovnání s jinými prostředky v případě pěti z 11-ti antigenů. To platí, jak pro vysoké tak nízké koncentrace 3D-MPL.
·· · ti • ti · · • ti ·· ·· • · ·· • ···· • ·ti •· • ·· •· ·· «.
Opsonofágocytóza potvrdila výsledky GMC.
Materiály a metody
Imunizační protokol
Právě narozené krysy se vybraly od různých náhodných matek a při první imunizaci byly 7 dní staré. Pak se provedly 2 další imunizace o 14 dní a 28 dni později. Vykrvácení se provedlo v den 56 (to je 28 dní po III. imunizaci). Všechny vakcíny se zavedly podkožní injekcí a ve skupině pro jednu vakcínu bylo 10 krys.
Krysy se imunizovaly 11-valentní pneumokokovou konjugační vakcínou, která obsahuje následující polysacharidové sérotypy konjugované s porteinem D: 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C,
19F, 23F.
Příprava
Za účelem testování účinku různých výhodných adjuvans, dávka konjugátu se udržovala konstantní 0,1 μg každého polysacharidu a připravilo se adjuvans
A1PO4 a 3D-MPL v různých dávkách a kombinacích, které nezahrnují žádné adjuvans. Ty jsou uvedeny podle čísel v tabulce č. 3.
Adsorpce na A1PO4
Koncentrované, adsorbované monovalenty se připravily podle následujícího postupu. 50 μς A1PO4 (pH 5,1) se míchalo s 5 μς konjugovaných polysacharidů po dobu 2 hodin. pH se upravilo na hodnotu pH 5,1 a směs se nechala stát dalších 16 hodin. Přidal se 1 500 mM roztok NaCl, koncentrace sole je 150 mM. Po 5 minutách se přidal 2-fenoxyethanol v koncentraci 5 mg/ml. Po dalších 30 minutách se pH upravilo na hodnotu 6,1 a směs se nechala stát po dobu 3 dní při teplotě 4 °C.
• · ♦ · • · • ·
Příprava ředidla
Tři ředidla se připravila v roztoku NaCl při koncentraci
150 mM/5 mg/ml fenoxyethanolu
A: AIPO4 při koncentraci 1 mg/ml.
B: 3D-MPL na AIPO4 při koncentraci 250 a 1 000 μς/ml, poměr
hmotností 3D-MPL/A1PO4 = 5/20
C: 3D-MPL na A1PO4 při koncentraci 561 a 1 000 μς/ιηΐ, poměr
hmotností 3D-MPL/A1PO4 = 50/89
Příprava adsorbovaného undekavelentu
Dvanáct koncentrovaných adsorbovaných PS-PD monovalentů se smíchalo při správném poměru. Jako ředidlo A se přidal doplněk AIPO4. Když je to nutné, přidal se 3D-MPL buď ve formě vodného roztoku (neadsorbovaného, způsob 1 popsaný dále v textu) nebo jako ředidlo B nebo C (3D-MPL adsorbovaný na A1PO4 ve dvou dávkách, způsob 2 popsaný dále v texu).
Způsob 1:
3D-MPL se přidal ke kombinovaným adsorbovaným konjugátům ve formě vodné suspenze. Směs se míchala s undekavalentem po dobu 10 minut při teplotě .místnosti a před aplikací se uchovával při teplotě 4 °C.
Způsob 2:
Před přidáním k adsorbovanému konjugátu se 3D-MP předem adsorboval na A1PO4 (ředidlo B a C) . Aby se připravil 1 ml ředidla, vodná suspenze 3D-MPL (250 nebo 561 ^g) se míchala s 1 mg AIPO4 ve 150 mM NaCl s hodnotou pH 5,6 po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Roztok se ředil v NaCl s hodnotou pH 6,1/fenoxy a inkuboval se přes noc při teplotě 4 °C.
Příprava neadsorbovaného undekavalentu jedenáct konjugátů PS-PD a ve správném poměru roztok NaCl pH 6,1, fenoxy. Když je to nutné formě roztoku (neadsorbovaný).
··· ····
Smíchalo se se přidal 150 mM přidal se 3D-MPL ve
Přípravky pro první aplikací.
všechny injekce se připravily 18 dní před
Test ELISA
Test ELISA se uskutečnil za účelem měření krysího IgG za získaného z WHO workshopu zabývajícím se ELISA při kvantifikaci protilátek IgG proti V podstatě čištěný se potáhl přímo na mikrotitrační předem inkubovaly s polysacharidem je běžný pro všechny pneumokoky přítomen v pneumokokových v dokumentu EP 72513 použití protokolu postupy testů kapsulárním polysacharidům v lidském séru.
polysacharid sér se kapsulární
Vzorky z buněčné stěny, (substance
C) který a který je čištěných podle koncentraci 0,5 popisu
%. Aby získaná se detekovaly vázané v instituci
Jackson pólysacharidech
Bl) v přibližné myší IgG, použily se činidla
ImmunoLaboratories lne.. Titrační křivky odpovídaly standardům (monoklonální protilátky) modelovaným logaritmickou rovnicí. Výpočet se provedl Pro softwaru. Očekávalo se, že maximální za použití vnitřním logickou
SoftMax těchto výsledků bude faktor dvou. Relativní chyba u chyba je menší než absolutní %
Opsonofágocytóza
Opsonizační titry se stanovily pro sérotypy 3, 6B, 7F, 14, 19F a 23F za použití protokolu CDC (Streptococcus pneumoniae Opsonophagocytosis using Differentiated HL60 cells, version 1.1) s čištěnými lidskými PMN a s králičím komplementem.
• · · · • ·
Úprava zahrnovala použití pneumokokových kmenů a fágocytické buňky HL60 se nahradily čištěnými lidskými neutrofily PMN (kde existuje vysoký stupeň korelace mezi uvedenými fagocytickými buňkami). Navíc se do mikrotitračních prohlubní přidaly skleněné kuličky o velikosti 3 mm za účelem intenzivnějšího míchání a to umožňuje redukovat poměr fagocyty : bakterie, jehož doporučená hodnota je 400.
Výsledky:
Koncentrace IgG
Geometrický průměr koncentrací IgG se stanovil pro každý sérotyp a PD se zobrazilo v tabulkách č. 4 až 10. V případě sérotypů 6B, 14, 19F a 23F jsou zahrnuty pro porovnání předchozí výsledky získané za použití tetravalentní formulace.
Nejvyšší koncentrace IgG jsou v tabulkách 4 až 10 označeny tučným písmem. Porovnání statistických hodnot p v případě kompozic 3D-MPL versus 3D-MPL/A1PO4 je v tabulce č. 11. Adjuvanntí formulace č. 4 (neadsorbované konjugáty s vysokou dávkou 3D-MPL), které umožňují nejvyšší GMC pro 9 z jedenácti případů. V pěti z jedenácti případů je MPL v nízké dávce druhým nejvíce imunogenním adjuvans. Přísady umožní vyšší GMC ve srovnání s dávkou pro všechny sérotypy (data nejsou uvedena) a to je statisticky podstatné v případě sérotypů 4, 6B, 7F, 18C a 23F (p je menší než 0,05 od 95 % Cl).
Opsonofágocytóza
Výsledky opsonofagocytózy na shromážděném séru jsou zobrazeny pro sérotyp 3, 6B, 7F, 14, 19F a 23F v tabulce 4 až 8. Ve většině případů tyto opsonizační titry potvrdily přítomnost GMC IgG. Korelace s koncentrací IgG je vyšší než 85 % v případě sérotypů 6B, 19F, 23F (data nejsou uvedena). V případě sérotypů 3, je důležité poznamenat, že pouze skupina 3D-MPL vyvolala opsonizační aktivitu nad hodnotu pozadí.
• · * ·
Závěr
V tomto experimentu se neočekávalo, že použití samotného
3D-MPL bude indukovat nejvyšší koncentrace IgG.
Maximální GMC IgG získané modifikací pomocí adjuvans se porovnávalo s maximální získanou GMC modifikací dávky PS a zjistilo se, že 3D-MPL by mohlo vyvolat vyšší odezvy u 5-ti z jedenácti sérotypů.
Tabulka č. 11 ukazuje, že když se porovnávají kompozice 3D-MPL a 3D-MPL/A1PO4 (porovnání způsobu formulace a dávka 3DMPL) , podstatně se zlepšila imunogennost 5-ti polysacharidových konjugátů, když se přidá jen 3D-MPL než 3DMPL plus A1PO4 , PS 4, PS 6B, PS 18C, PS 19F a PS 23F.
Příklad 3: Studium účinku kombinací na imunogennost konjugátů PS4, PS 6B, PS 18C, PS 19F a PS 23F dospělých krys
Dospělé krysy se imunizovaly konjugační vakcinou obsahující pneumokokový polysacharid a protein D, buď jednotlivě nebo kombinovaně multivalentní kompozicí (buď tetra-, penta-, hepta- nebo dekavalent). Skupiny deseti krys se imunizovaly dvakrát v časovém intervalu 28 dní a testovací krev se získala v den 28 a v den 42 (14 dní po druhé dávce)..
V sérech se testem ELTSA testovala přítomnost protilátek IgG proti pneumokokovým polysacharidům. Testem ELISA se zjistilo, že všechny konjugáty vyvolaly specifické protilátky IgG. Tabulka č. 12 ukazuje účinek konjugátů proteinu D v kombinaci monovalentu PS 6B, PS 18C, PS 19F a PS 23F na jejich imunogennost u dospělých krys, jak se měřila koncentrace IgG po 14-ti dnech po druhé dávce.
U všech vzorků se provedla statistická analýza, aby se stanovilo, zda rozdíly v koncentraci protilátek po kombinaci byli podstatné. Kombinace libovolných sérotypů PS 6B, PS 18C, PS 19F a PS 23F konjugátů proteinu D v multivalentní vakcíně podstatně nemění jejich imunogennost.
• · · · · ·
Tabulka č. 1: Specifická aktivace/konjugace/podminky ukončeni
PS konjugátů S. pneumoniae - protein D
serotyp 1 3 (mikroka palina) 4 5 6B 7F
PS konc. (mg/ml) 2,0 3,0 2,0 7,5 5,4 3,0
PS rozpust. NaCl 2M NaCl 2M h2o H2O 2M NaCl 2M NaCl
PD konc.(mg /ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5, 0
počáteč. poměr PS/PD (hmotn./ hmotn.) 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1
CDAP konc. (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
pHa=pHc= 9,0/9,0/ 9,0/9,0/ 9,0/9,0/ 9,0/9,0/ 9,0/9,0/ 9,0/9,0/
pHq 9,0 9,0 9, 0 9,0 9, 0 9,0
serotyp 9V 14 18C 19F 23F
PS konc. (mg/ml) 2,5 2,5 2,0 4,0 3,3
PS rozpust. 2M NaCl 2M NaCl h2o 2M NaCl 2M NaCl
PD konc.(mg/ ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
počáteč. poměr PS/PD (hmotn./h motn.) 1/0,75 1/0,75 1/1 1/0,5 1/1
CDAP konc. (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
pHa=pHc=pH 8,5/8,5/9 9,0/9,0/9 9,0/9,0/9 10/9,5/9, 9,0/9,0/9
q ,0 ,0 ,0 0 ,0
Tabulka č. 2: Specifikace 11-valentní pneumokokové vakcíny PS-PD (první čísla kódu dávky indikují sérotyp)
D6PDJ209 1/0,69 O σ> 0,3 0,13 není posun
c
□
ir> o
CO 0
cg co Cl
CO
Q r-H Ή
Οι o cg vH C
LD r--1 X χ O
Q 5—1 oc cg x—1 O c
c
3
CO co
cg 0
co CL
co
a X cg Ή
Oi o í—1 c
σ> X X 0
Q 5—1 o r-1 o o c
c
CO 3
CO co
cg 0
σι CL
Q o
Oj co Ή
CO 1------1 co t—1 α
O i—1 X X (U
Q i—1 t—1 v o o c
c
Γ o
C\] co
C\1 o
co CL
O
Cu co gp
!—1 o cg i—1 c
O X X o
Q Γ-Ι r*H co o o c
p 0 2 0 ω
o P Ό p cl OJ
o LD -H Ό o\° p
Qj C M C — cu —, tn Ό
g i—i co 1---------1 < ω =L > fO
Z ω —. 0 O 0 S cu x 0 4-1 4-4
CL · > o > c Q tn r—1 CO •H
Cl c rri •H P C 3 0 i—1
Ό M p P ω o\° P 0 o\0 P Zt P P •H
-P ><D O nJ > fú P tÚ \ LD O -H P
έ £ Ϊ1 H - O « O O co tn » i—1 i—1 rd
o p P 0 o\° r-l P M rL P C o 0 (D 44
P CL — O CL — V O CL V o — V S > co
D23PDJ212 1/0,74 O
co
O
c\]
fD LO
u sr
CL X
0Ί o
i—1
Q 1—1
c—1
cg
cg
^0 cg
Q co
CL X
co o
i—1
Q Γ—1 ’χΓ
cg
o
cg
co
Q co
Cl X
o
τ—1 \ ϊ—1
Q i—1 v
cg
0X1
cg
H) o
Q co
Pj X
Gá o
o 1—1
Q ϊ—1 v
U0
cg
cg
•0 co
Q uo
CL X
r- o
o
Q ΐ—1 <—1
P C O 0
O P P P
M O >(D -H
CL £ tí S-l
\ P <—1 (Ú
ω \ O P
CL · > o
C (Ú
P P P CO o\°
><1) O tú >
£ £ CO r-l — o
OP — P O o\o r-l
cl -- · 0 CL — V
• · v ·
12 0,9 CN i—1 O není posun
posun
10 Ϊ— o C\1 \—1 o neni
posun
21 CN O o i—1 o neni
c b co o íf
co CO o 0,17 neni
posun
0,3 0, 6 0,14 není
posun
00 0,1 0,14 není
obsah volného proteinu (%) <15 % obsah DMAP ω Oj Cn zl tP 0 U} Pj Cn i θ' 0 LO O V velikost > <ΰ 1—1 0 P4 O r—I 0 g stabilita
Tabulka č. 3: Shrnutí adjuvančních formulací testovaných 11valentní pneumokokové PS-PD u novorozených krys
skupina A1PO4 MPL způsob popis
1 žádný
2 100 A1PO4
3 5 nízká konc. MPL
4 50 vysoká konc. MPL
5 100 5 způsob 1 způsob 1 nízká konc.
6 100 50 způsob 1 způsob 1 vysoká konc.
7 100 5 způsob 2 způsob 2 nízk. konc.
8 100 50 způsob 2 způsob 2 vysok. konc.
Tabulka č. 4: Geometrický průměr koncentrace IgG serotyp 6B, serokonverze a průměr opsonizačniho titru 28 dní po III. imunizaci novorozených krys s 11valentní PS-PD za použití různých adjuvans (a porovnání s tetravalentní imunizací)
skupí na AIPO4 μς MPL μρ způso b 6B GMC IgG ^g/ml) 6B serok onver ze 6B opson titr* 6B GMC IgG ^g/ml) 6B serok onver ze 6B opson titr*
tetravalent undekavalent
1 0, 047 2/10 12,5 0, 004 1/10 <6, 25
2 100 0, 048 4/10 65 0,019 4/10 <6,25
3 5 1,345 10/10 43
4 50 4,927 10/10 192
5 100 5 1 0,042 7/10 <6,25
6 100 50 1 0,255 10/10 <6,25
• · · ·
7 100 5 2 0, 033 3/10 <6,25 0,048 8/10 <6,25
8 100 50 2 0,057 8/10 <6, 25
Tabulka č. 6: Geometrický průměr koncentrace IgG serotyp 14, serokonverze a průměr opsonizačniho titru 28 dni po III. imunizaci novorozených krys s 11valentni PS-PD za použití různých adjuvans (a porovnáni s tetravalentni imunizací)
skupí na A1PO4 μς MPL μυ způso b 14 GMC IgG (μς/ιηΐ) 14 serok onver ze 14 opson titr* 14 GMC IgG 14 serok onver ze 14 opson titr*
tetravalent undekavalent
1 0,046 3/10 64 0,022 3/10 <6,25
2 100 0,99 10/10 CO co 0,237 8/10 27
3 5 0,233 10/10 41
4 50 0, 676 10/10 81
5 100 5 1 0, 460 9/10 67
6 100 50 1 0,477 10/10 98
7 100 5 2 0,81 10/10 49 0,165 8/10 81
8 100 50 2 1,611 10/10 133
Tabulka č. 6: Geometrický průměr koncentrace IgG serotyp 19F, serokonverze a průměr opsonizačniho titru 28 dní po III. imunizaci novorozených krys s 11valentní PS-PD za použití různých adjuvans (a porovnání s tetravalentni imunizací)
skupí na AIPO4 μυ MPL μς způso b 19F GMC IgG (pg/ml) 19F serok onver ze 19F opson titr* 19F GMC IgG ^g/ml) 19F serok onver ze 19F opson titr*
tetravalent undekavalent
1 0,047 2/10 12,5 0, 004 1/10 <6,25
» · · · ·· · • · · · · • · · · · ·
2 100 0,048 4/10 65 0,019 4/10 <6,25
3 5 1,345 10/10 43
4 50 4,927 10/10 192
5 100 5 1 0,042 7/10 <6,25
6 100 50 1 0,255 10/10 <6,25
7 100 5 2 0, 033 3/10 <6,25 0,048 8/10 <6,25
8 100 50 2 0, 057 8/10 <6, 25
Tabulka č. 6: Geometrický průměr koncentrace IgG serotyp 19F, serokonverze a průměr opsonizačního titru 28 dni po III. imunizaci novorozených krys s 11valentní PS-PD za použití různých adjuvans (a porovnání s tetravalentní imunizací)
skup i na A1PO4 μς MPL μς způso b 19F GMC IgG ^g/ml) 19F serok onver ze 19F opson titr* 19F GMC IgG (gg/ml) 19F serok onver ze 19F opson titr*
tetravalent undekavalent
1 0,04 2/10 64 0,021 2/10 <6,25
2 100 1,07 9/10 367 0,222 7/10 79
3 5 4,028 10/10 296
4 50 21,41 1 10/10 1276
5 100 5 1 1, 649 10/10 172
6 100 50 1 2,818 10/10 208
7 100 5 2 1,09 10/10 193 0, 766 10/10 323
8 100 50 2 3,539 10/10 241
Tabulka č. 7: Geometrický průměr koncentrace IgG serotyp 23F, serokonverze a průměr opsonizačního titru 28 dní po III. imunizaci novorozených krys s 11valentní PS-PD za použití různých adjuvans (a porovnání s tetravalentní imunizací)
skupí na A1PO4 F9 MPL μς způso b 23F GMC IgG ^g/ml) 23F serok onver ze 23F opson titr* 23F GMC IgG ^g/ml) 23F serok onver ze 23F opson titr*
tetravalent undekavalent
1 0, 06 2/10 <6,25 0,152 3/10 <6, 25
2 100 0,29 10/10 70 0,56 8/10 <6,25
3 5 2,296 9/10 389
4 50 4,969 10/10 >1600
5 100 5 1 0, 462 5/10 17
β 100 50 1 0, 635 8/10 54
7 100 5 2 0,38 10/10 <6, 25 0, 203 3/10 18
8 100 50 2 0,501 7/10 43
Tabulka č. 8: Geometrický průměr koncentrace IgG serotyp 3 a 7F, serokonverze a průměr opsonizačniho titru 28 dní po III. imunizaci novorozených krys s 11-valentní PS-PD za použití různých adjuvans (a porovnání s tetravalentní imunizací)
skup i na A1PO4 μ9 MPL μς způso b 3 GMC IgG (μς/πιΐ) 3 serok onver ze 3 opson titr* 7F GMC IgG (pg/itil) 7F serok onver ze 7F opson titr*
1 0,003 1/10 <6,25 0,040 7/10 <6, 25
2 100 0,008 6/10 <6,25 0,25 9/10 43
3 5 0,070 10/10 <6,25 2,435 10/10 477
4 50 0,108 10/10 18 2,569 10/10 332
5 100 5 1 0,015 10/10 <6,25 0,579 10/10 54
6 100 50 1 0,027 10/10 <6,25 0, 611 9/10 59
7 100 5 2 0,006 10/10 <6,25 0, 154 8/10 30
8 100 50 2 0,034 10/10 <6,25 0,638 9/10 140
♦ ·
9 ·· · · · · · ·
9··· 99 999
99 ··· 99·· 99 ···
Tabulka č. 9: Geometrický průměr koncentrace IgG serotyp 1, 4 a 5, serokonverze 28 dní po III. imunizaci novorozených krys s 11-valentni PS-PD za použiti různých adjuvans
skupí na A1PO4 gg MPL μυ způso b 1 GMC IgG (μς/ιηΐ) 1 serok onver ze 4 GMC IgG ^g/ml) 4 serok onver ze 5 GMC IgG (pg/itil 5 serok onver ze
1 0,026 4/10 0,005 1/10 0,040 3/10
2 100 0,282 8/10 0,052 5/10 0,774 9/10
3 5 1, 614 10/10 3,452 10/10 7,927 10/10
4 50 2,261 10/10 7,102 10/10 13, 97 4 10/10
5 100 5 1 0, 568 10/10 0,676 10/10 3,015 10/10
6 100 50 1 1,430 10/10 0,419 9/10 5, 755 10/10
7 100 5 2 0, 478 10/10 0,267 9/10 2,062 10/10
8 100 50 2 1,458 10/10 0,423 10/10 5,009 10/10
Tabulka č. 10: Geometrický průměr koncentrace IgG serotyp 9V,
18C a PD, serokonverze 28 dni po III. imunizaci novorozených krys s 11-valentni PS-PD za použití různých adjuvans
skupi na AIPO4 μρ MPL μς způso b 9V GMC IgG ^g/ml) 9V serok onver ze 18C GMC IgG ^g/ml) 18C serok onver ze PD GMC IgG (pg/ml PD serok onver ze
1 0,018 0/10 0,013 1/10 0,003 0/10
2 100 0,489 6/10 0,092 5/10 0,993 10/10
3 5 0,482 7/10 6,560 10/10 3,349 10/10
4 50 11,42 1 10/10 14,02 3 10/10 5,446 10/10
5 100 5 1 2,133 9/10 0,690 10/10 11,40 7 10/10
ΦΦ φφφφ φφ φ
6 100 50 1 2,558 10/10 1,771 10/10 1,258 10/10
7 100 5 2 1,536 10/10 0,528 10/10 1, 665 8/10
8 100 50 2 2,448 9/10 0,980 10/10 5, 665 10/10
Tabulka č. 11: Statistická významnost (hodnota p) , zda jisté pneumokokové polysacharidové konjugáty zlepšily imunogennost, když se spojily se samotným 3DMPL ve srovnání s 3D-MPL/A1PO4. Hodnota p nižší než 0,01 se považuje za vysoce podstatnou. Způsob 1 a 2 indikuje způsob formulace.
serotyp 50 μρ 3D-MPL vs 3D- MPL/A1PO4 5 μς 3D-MPL vs 3D- MPL/A1PO4
1 Způsob 1 Způsob 2 Způsob 1 Způsob 2
3 0,3 0,05 0, 079 0,11
4 0,075 0,01 0,27 0,008
5 0,002 0,0003 0,02 0,003
6B 0,001 0,0001 0, 001 0,0006
7F 0,13 0,15 0, 01 0,005
9V 0,02 0, 02 0,1 0,04
14 0,65 0,21 0,3 0,66
18G 0,0008 0,0002 0,006 0,004
19F 0,0009 0,006 0,21 0,04
23F 0,002 0,0004 0,01 0,0004
Tabulka č. 12: Geometrický průměr koncentrace IgG (μρ/ml) v den 14 po druhé dávce po imunizaci dospělých krys 1,0 μρ samotného konjugátu polysacharid-protein nebo kombinovaného do tetravelentní, pentavalentní, heptavelentní nebo dekavelentní vakcíny. Tato data se μρ kombinují z pěti nezávislých experimentů.
Serotypy 4 6B 18C 19F 23F
ΦΦ ·♦·· φφ · * · ·· φ · φ · · • · · · φφ · φ ·♦ ·· φφφ Φ*Φ· φφ φ
vakcíny H T H T T
samotný 9,3 0,11 15 5,2 2,5
kombinova ný 4 0,23 3,7 3,7 2,8
T: kombinovaný v tetravalentní (T) (PS 6B, 14, 1 pentavalentní (T plus PS3), heptavalentní (Η) (T pli a 18C) a dekavalentní (H plus PS 1, 5 a 7F) vakcíny. H: kombinovaný do heptavalentní (Η) (T plu 18C) a dekavelentní (H plus PS 1, 5 a 7F) ko vakcínu. _9F, 23F) , as PS4, 9V kombinační s 4, 9V a mbinovanou
Přiklad 4: Výhody přidání pneumolyzinu a 3D-PML na účinnost ochrany PD-konjugované 11-valentní polysacharidové vakcíny proti pneumokokové kolonizaci plic u myší
Odečítání imunologických hodnot
Dávka sérového IgG specifických pro pneumolyzin určených testem ELISA
Imunodestičky Maxisorp Nunc se potáhly po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C 100 μΐ/prohlubeň rekombinantního nativního pneumolyzinu (PLY) v koncentraci 2 pg/ml ředěného PBS. Destičky se promyly 3 krát NaCl 0,9 % v 0,05% pufru Tween-20. Standardní křivka se vytvořila za použití dvojnásobného ředění (v PBS/Tween-20 0,05 %, 100 μΐ v jedné prohlubni) anti-PLY séra (počáteční koncentrace je 670 ng/ml IgG) a vzorky séra (počáteční ředění je 1/10) se inkubovaly po dobu 30 minut při teplotě 20 °C za stálého míchání. Po promytí, jak se popisuje shora v textu, se kozí anti-myší IgG konjugované s peroxidázou (Jackson) ředěné 5 000 x v PBS/Tween-20 0,05 % inkubovaly (100 μΐ na jednu prohlubeň) se inkubovaly po dobu 30 minut při teplotě 20 °C za stálého míchání. Po promytí se destičky inkubovaly po dobu 15 minut při teplotě místnosti se 100 μΐ vyvíjejícího pufru na jednu prohlubeň (OPDA 0,4 mg/ml a H2O2
0,05 % ve 100 mM pH 4,5 citrátového pufru) . Vyvíjení se zastavilo přidáním 50 μΐ roztoku IN HC1 na jednu prohluběň. Optická hustota se odečítala při 490 a 620 nm za použití zařízení Emax (od firmy Molecular Device) . Titr protilátek se vypočítal matematickou metodou pro čtyři parametry za použití software SoftMaxPro.
Inhibice hemolýzy
Tento test se provedl za účelem měření schopnosti sérových protilátek inhibovat hemolytickou aktivitu pneumolyzinu (PLY). Za účelem eliminovat cholesterol (který je náchylný k reakci s PLY), vzorky séra se ošetřily 2X následujícím způsobem: vzorky se smíchaly s jedním ekvivalentním objemem chloroformu a pak se inkubovaly po dobu 45 minut za stálého míchání. Supernatanty se sebraly po centrifugaci po dobu 10 minut při 1 000 ot./min.. Séra zbavená cholesterolu se ředila (provedlo se dvojnásobné sériové ředění v 1 mM dithiothreitolu, 0,01% BSA, 15 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,5) na mikrodestičkách s 96 prohlubněmi (Nunc). Do každé prohlubně se přidalo 50 μΐ roztoku, který obsahuje 4 HO (jednotek hemolyzinu) PLY a destičky se inkubovaly po dobu 15 minut při teplotě 37 °C. Pak se přidalo 100 μΐ ovčí červené krevní destičky (1% roztok) a vše se inkubovalo po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Po centrifugaci po dobu 10 minut při 1 000 ot./min. se shromáždil supernatant (150 μΐ) a přenesl se do další mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi, přičemž je možné číst optickou hustotu při vlnové délce 405 nm. Výsledky se exprimovaly jako střední bod ředění titrů.
Chemická detoxifikace pneumolyzinu
Rekombinantní přirozený pneumolyzin (PLY) se dialyzoval proti 50 mM fosfátovému pufru s NaCl o koncentraci 500 mM pH • · φφ φ ·
• ·· φφ φ φ • φ
7,6 . Všechny následující kroky se provedly při teplotě 39,5 °C za episodického míchání. V den 1 se přidal k roztoku PLY roztok obsahující 10% Tween-80 (1/25 objem/objem), 57,4 mM Nacetyl-tryptofan pH 7,6 pH7,6 (3/100 Objem/objem), 2,2 M glycin ve fosfátovém pufru (1/100 objem/objem) a 10% formaldehyd ve fosfátovém pufru (3/100 objem/objem). V den 2 a 3 se opět přidal 10% formaldehyd v poměru 3/100 a 2/100 (objem/objem). Kultivace proběhla při teplotě 39,5 °C do sedmého dne za stálého míchání. Nakonec se roztok PLY dialyzoval proti 50 mM fosfátovému pufru s 500 mM NaCl pH 7,6. V hemolytickém testu se demonstrovala úplná deaktivace PLY.
Pneumokoková intranasální čelendž u myší 0F1
Sedm týdnů staré samice myší se intranasálně ínokulovaly při anestezi s 5 x 105 jednotek tvořící kolonie mukroorganizrnem S.pneumoniae adaptovaný pro myši serotyp 6B. Plíce se vnaly 6 hodin po čelendži a homogenizovaly se (zařízením Ultramax, při 24 000 ot./min a teplotě 4 °C) v kultivačním médiu Todd Hewth Broth (THB, Gibco). Sériové desetinásobné ředění . plicního homogenátu se naneslo na Petriho misky, které obsahují agar THB doplněný kvasinkovým extraktem, a ty se inkubovaly přes noc při teplotě 37 °C. Pneumokoková plicní infekce se stanovila jako počet jednotek tvořící kolonie/myš a vyjádřila se jako logaritmicky vážený průměr. Limit detekce je 2,14 log jednotek tvořící kolonie/myš.
Příklad 4A: Adjuvanční účinek 3D-MPL na imunitní odezvu na pneumolyzin
V tomto příkladu se hodnotí vliv adjuvace s 3D-MPL na imunitní odezvu na přirozený rekombinantní pneumolyzin (PLY, poskytl J. Panton, Children's Hospital, North Adelaide, Australia) a na jeho chemicky detoxifikovanou část (DPLY).
»··· • · · · · · ·· ·· *·· ····
Chemická detoxifikace se provedla, jak se popisuje shora v textu.
Skupina deseti samic šesti týdnů starých samic myší Balb/c se intramuskulárně imunizovaly v den 0, 14 a 21 s 1 μς PLY nebo DPLY, který je obsažen buď v A: A1PO4 100 μς nebo B: A1PO4 100 μς + 5 μρ 3D-MPL (3 de-O-acylovaný monofosforyllipid A od firmy Ribi Immunochem) . Obrázky č. 1A a 1B zobrazují hodnoty IgG získané testem ELISA a hemolyzinové inhibiční titry (HLI) měřené v seru po III imunizaci.
V případě kteréhokoli antigenu se nej silnější imunitní odezva vyvolala u zvířat vakcinovaných formulacemi doplněnými 3D-MPL. Je zajímavé, že DPLY je stejně imunogenní jako PLY v případě, že se aplikoval s A1PO4 + 3D-MPL, zatímco je slabší imunogen ve formulaci s A1PO4. To ukazuje výhodnou schopnost 3D-MPL zlepšit protilátkovou odezvu na detoxifikovaný pneumolyzin.
V prostředku, který obsahuje pneumolyzin, se může s výhodou použít chemicky detoxifikovaný pneumolyzin spíše než mutačně detoxifikovaný pneumolyzin. To proto, že detoxifikovaní mutanti získáni do této doby stále obsahují zbytkovou aktivitu toxinu, přičemž chemicky detoxifikovaný pneumolyzin tuto aktivitu nemá. Uvažuje se proto další aspekt vynálezu, prostředek obsahující pneumolyzin (nebo pneumolyzinové mutanty) , které se chemicky detoxifikovaly, aby se mohly použít ve vakcíně. Mohou se smíchat s Thl adjuvans, přičemž se upřednostňuje 3D-MPL. Tyto prostředky jsou obsahem vynálezu. Také se předpokládá způsob zvyšující imunitní odezvu chemicky detoxifikovaného pneumolyzinu v imunogenním prostředku obsahující kroky přidání Thl adjuvans (upřednostňuje se 3D-MPL) k prostředku.
• ti ti···
• · •· •· •· ·· ·
Příklad 4B: Výhody přidání utlumeného mutantu pneumolyzinu a adjuvans 3D-MPL na 11-valentní polysacharidové vakcíny proti pneumokokové plicní kolonizaci u myši 0F1, kterým se provedla intranasální čelendž se serotypem 6B.
V tomto přikladu se hodnotila účinnost profylaxe vakcíny obsahující 11-valentní konjugát polysacharid-protein D, utlumený mutantní pneumolyzinový antigen (PdB, popisuje se v dokumentu WO 90/06951) a adjuvans A1PO4 + 3D-MPL ve srovnání s klasickým 11-ti valentním konjugačním prostředkem obsahující konjugát polysacharid-protein D s adsorbovaným A1PO4.
Skupiny 12-ti samic čtyři týdny starých myší OF1 se podkožně imunizovaly v den 0 a 14 prostředkem obsahujícím A: 50 μρ A1PO4, B: 0,1 μρ PS/serotyp PD-konjugované 11-valentní polysacharidové vakcíny + 50 μρ A1PO4 nebo C: 0,1 μρ PS/serotyp PD-konjugované 11-valentní polysacharidové vakcíny + 10 μρ PdB (poskytl Dr. J. Palton, Children's Hospital, North Adelaide, Australia) + 50 μρ A1PO4 + 5 μς 3D-MPL (od firmy Ribi Immunochem) . Čelendž se provedla v den 21, jak se popisuje shora v textu.
Jak je -zobrazeno na obrázku č. IC, 11-valentní polysacharidové konjugační vakcina doplněná PdB a adjuvans AIPO4 + MPL (černé sloupce reprezentují aritmetický průměr) vykazuje velmi podstatnou ochranu (hodnota p je menší než 0,007). Naopak nepodstatná ochrana se pozorovala u zvířat imunizovaných 11-valentním polysacharidovým konjugátem a A1PO4. Tento výsledek ukazuje, že přidání antigenů pneumolyzinu (dokonce utlumeného) a adjuvans 3D-MPL zesiluje účinnost 11valentní polysacharidové konjugační vakcíny proti zápalu plic.
Příklad 4C: Imunní koreláty ochrany popsané v přikladu 4B »· ·*·»
Za účelem zavést imunitní koreláty ochrany popsané v příkladu 4B pomocí 11-valentní polysacharidové konjugační vakcíny doplněné atenuovaným mutantním pneumolyzinem (PdB) a 3D-MPL, se měřila serologícká protilátková odezva na polysacharid 6B a PdB před čelendží, jak se popisuje shora v textu.
Titry protilátek se pak porovnaly s počtem bakteriálních kolonií určených v plicích odpovídajících zvířat odebraných 6 hodin po. čelendži. Hodnota R2 se vypočítala log/log lineární regrese.
Vypočtená hodnota R2 se rovná 0,18 a 0,02 jako v případě anti-PdD a anti-6B protilátkové odezvy. To ukazuje na nepřítomnost korelace mezi humorální imunitní odezvou a ochrannou proti oběma antigenům. Titry protilátek proti 6B se ve skupinách imunizovaných 11-ti valentní konjugační vakcínou podstatně neliší (GMT je 0,318 ng/ml) a to také v případě stejné vakcíny doplněné PdD a 3D-MPL (GMT = 0,458 ng/ml).
Proto zdokonalení ochrany pomoci prostředku C není zřejmě způsobené silnější protilátkovou ochranou proti polysacharidů 6B.
Výsledky naznačují, že ochrana není zprostředkována samotnou humorální imunitní odezvou, ale spíše imunitou zprostředkovanou buňkou, která se vyvolala antigenem PdB v přítomnosti 3D-MPL. To podporuje myšlenku aplikace proteinového antigenu(ů) a potentních adjuvans v pneumokokové polysacharidové konjugační vakcíně tak, že dochází ke koordinaci obou části imunitního systému pro optimální ochranu.
Příklad 5: Spolupráce obou části imunitního systému u myší aktivně imunizovaných pneumolyzinem a pasivně imunizovaných protilátkami proti pneumokokovému PS • · ··*· • · · • · «
• ··»· • r •· • ·· •· ··
Přiklad 5A: Zjištění koncentrace pasivně aplikovaných anti-6Bpolysacharidových protilátek, které chrání před zápalem plic
Metoda:
Vakcinační skupiny: Čtyři skupiny 16-ti myší se pasivně imunizaovaly (ip.) v den -1 se 100 μΐ neředěného krysího antipolysacharidového antiséra v souladu se skupinami popsanými dále v textu (celkem 64 myší).
skupina specifita koncentrace IgG v antiséru
G1 a-PS-6B 5 μρ/ml
G2 a-PS-6B 2 μς/πιΐ
G3 CC-PS-6B 0,75 μς/πιΐ
G4 kontrola 0 μς/πιΐ
Zvířata: 64 samic myši CD-1 z Charles River, Canada, které váži přibližně 35 g (jsou přibližně 10 týdnů staré).
Anesteze: K anestezi myší se použil isofluran (3 %) plus C>2 (1 1/min) .
Organizmus: S.pneumoniae N1387 (serotyp 6) se sklidily tryptikázových sojových agarových ploten (TSA) doplněných 5% koňskou krví a suspendovaných v 6 ml PBS. Bezprostředně před infekcí 1 ml bakteriální suspenze se ředil na 9 ml tekutého nutričního agaru (BBL) a vše se uchovávalo při teplotě 41 °C. Myším se aplikovalo 6,0 logio jednotek tvořící kolonie/myš v objemu 50 μΐ.
Infekce: V den 0 se provedla anesteze u myší, jak se popisuje shora v textu, a infikovaly se mikroorganizmem ·· ·· • · · · chlazené bakteriální inkubací.
• · · · e
• · • ·
S .pneumoniae N1387 (50 μΐ intrabronchiální instilací Tato metoda se popisuje Antimicrob. Ag. Chemotherap.
Vzorky: 3 dni po infekci se usmrtilo 8 myší ve skupině nadměrnou dávkou CO2, odebraly se plíce a homogenizovaly se v 1 ml PBS. Aby se určil živý počet bakterií, připravilo se desetinásobné ředění v PBS. Vzorky se inokulovaly (objem 20 μΐ) ve třech provedeních na plotny TSA doplněné 5% koňskou krví μς/ιηΐ a vše se inkubovalo přes noc při teplotě 37 °C a pak se provedlo hodnocení. Další sady myší se usmrtily v den 7 a připravily se vzorky způsobem popsaným shora v textu.
pomocí intratracheální v publikaci Woodnut and Berry,
43: 29(1999((.
Výsledky:
koncentrace IgG v krysím seru (gg/ml) počet bakterií (logjo cfu/plíce) v dny po infekci
3 8
5 6,7 ± 0,7 (1/7) 7,2 ± 0,7 (5/8)
2 6,5 ± 0,7 (1/7) 6,9 ± 1,8 (4/7)
0,75 7,7 ± 0,5 (5/8) 4,8 + 1,4 (2/8)
0 6,7 ± 1,5 (3/6) 6,3 ± 1,5 (3/9)
čísla v závorce jsou zvířata, která zemřela před přípravou vzorků
Závěr: Obecně nedošlo k podstatnému rozdílu v počtu izolovaných bakterií z libovolných ošetřovaných skupin. To ukazuje, že nedošlo k žádné měřitelné ochraně antipolysacharidem v koncentracích až 5 μς/πιΐ.
To je podobné tomu, co se pozorovalo v některých klinických studiích na lidech, to znamená, že antipolysacharidová část není schopna některé populace chránit proti pneumokokovému zápalu plic.
Příklad 5B: Stanovení ochrany před zápalem plic dosažené aktivní aplikací Ply (pneumolyzín) s adjuvans nebo bez a synergie s suboptimálními protilátkami proti
skupina obj em injekce aktivní vakcína aplikovaná v den -22, -14 (dávka μς) in j e.kční objem pasivní pasivní IgG (den -1)
1-1 100 μΐ podkožně PdB/AlPO4 (10/50) žádné
1-2 100 μΐ podkožně PdB/MPL/AlP O4 (10/5/50) žádné
1-3 100 μΐ podkožně PdB/AlPO4 (10/50) 100 μΐ i.p. a-PS
1-4 100 μΐ podkožně PdB/MPL/AlP O4 (10/5/50) 100 μΐ i.p. a-PS
1-5 100 μΐ podkožně PdB/AlPO4 (5/50) 100 μΐ i.p. a-PS
1-6 100 μΐ podkožně PdB/AlPO4 (5/50) žádné
Infekce: V den 0 se provedla ,u myší anesteze (3% isofluran plus 11/min 02). Bakteriální inokulum se připravilo sklizením kultury mikroorganizmu S.pneumoniae N1387 (serotyp 6) z ploten s tryptikázovým sojovým agarem (TSA) doplněným 5 % koňskou krví a buňky se suspnedovaly v 6 ml PBS. Těsně před infekcí se v chlazeném kapalném nutričním agaru (udržovaném při teplotě 41 °C) připravilo desetinásobné ředění (1 ml plus 9 ml) . Myši se infikovaly intrabronchiální instilací prostřednictvím intratracheální inkubace a aplikovalo se jim přibližně 6,0
···· · ·· ·· • ···· ·»· • · · φ φ • · · · φ φ φ • · · ♦ · · • · ······· · · · logio jednotek tvořící kolonie na jednu myš v objemu 50 μΐ.
Tato metoda se popisuje v publikaci Woodnut and Berry (Antimicrob. Ag. chemotherap. 43: 29 (1999)).
Vzorky: 72 dní po infekci se usmrtilo 8 myši ve skupině nadměrnou dávkou C02, odebraly se plíce a homogenizovaly se v 1 ml PBS. Aby se určil živý počet bakterií, připravilo se desetinásobné ředění v PBS. Vzorky se inokulovaly (objem 20 μΐ) ve třech provedeních na plotny TSA doplněné 5% koňskou krví μg/ml a vše se inkubovalo přes noc při teplotě 37 °C a pak se provedlo hodnocení. Další sady myší se usmrtily v den 8 a připravily se vzorky způsobem popsaným shora v textu.
Analýza dat
Výstupní hodnota vhodná pro porovnání aplikace je počet bakterií v plicích v den 3 a 7 po infekci. Výsledky se prezentovaly jako skupinový průměr se standardní odchylkou. Statistická analýza se uskutečnila za použití Studentova ttestu, kde se považuje za podstatnou hodnotu hodnota P, když je menší než 0,05.
Výsledky hodin po infekci
Počet bakterií ze skupiny 1-4 je podstatně nižší (p<0,05) než v ve skupině 1-3.
Počet bakterií ze skupiny 1-4 je podstatně nižší (p<0,05) než v ve skupině 1-5.
168 hodin po infekci
Počet bakterií ve všech skupinách je přibližně o 2 log nižší v den 8 než v den 3, což indikuje, že infekce se lepší.
Počet bakterií ze skupiny 1-2 je podstatně nižší (p<0,05) než ve skupině 1-5.
skupina den 3 den 8
log cfu/plice stand. odchylka log cfu/plíce stand. odchylka
1-1 6, 93 0,61 5,23 1,28
1-2 6, 59 1,25 4,08 1,34
1-3 7,09 0, 8 5,32 1,26
1-4 6, 09 1,43 4,46 2,32
1-5 7,19 0,89 5, 42 1,05
1-6 6, 68 1,14 5,01 1,48
Jak se ukázalo shora v textu samotné anti-polysacharidové protilátky (skupina 1-5) nevykazují ochranu proti pneumokokům v plicích. PdB s adjuvans A1PO4 také nezaručuje ochranu, ale v den 8 je zde zjevný trend ochrany, když se PdB kombinuje s 3D-MPL (skupina 1-2).
V den 3 skupina, která vyjadřuje nejvíce podstatnou ochranu, což je skupina 1-4, vykazuje všechny tři elementy, PdB, 3D-MPL a pasivně aplikované anti-polysacharidové protilátky. Tento závěr je podpořen četností úmrtí. Skupina 14 vykazuje pouze 2 úmrtí z 8 samic ve srovnáni se skupinou 1-5 a 1-3, kde je 5 úmrtí z 10 myší.
Závěr:
V případě, že se provedl experiment s pasivně imunizovanými zvířaty, synergický účinek aktivní imunizace pneumolyzinem a MPL nemůže být způsoben zvýšením množství protilátek proti polysacharidovému antigenu.
« · • · • · 9 9 • · « « • · · ·
V případě, že zvířata byla imunizována pneumokokovému polysacharidu pouze pasivně, v den množství takových protilátek v hostiteli rychle ztrácí.
Podstatnou ochranu proti pneumokokovému zápalu plic je možné spatřit ve skupinách imunizovaných pneumolyzinem plus 3D-MPL a zvláště ve skupinách imunizovaných pneumolyzinem plus 3D-MPL, kde se pasivně přidávají anti-polysacharidové protilátky, což indikuje synergii této kombinace.
Jestliže se anti-polysacharidová imunizace provede aktivně (upřednostňuje se s konjugovaným polysacharidem), účinek bude více znatelný jako účinek paměti B-buněk a konstantní množství protilátek proti PS se bude podílet na kooperaci imunitní odpovědi (popisuje se například na obrázku č. 1C, kde řada zvířat aktivně imunizovaných polysacharidem a proteinem nevykazuje v plicích po čelendži žádné bakterie).
proti se
Příklad 6: Imunogennost u jednoletých myší Balb/C 11-valentní konjugační vakcíny obsahující pneumokokový polysacharid a protein D a adjuvans 3D-MPL
Úvod a cíle
Ochrana proti pneumokoková infekci je zprostředkována protilátkami specifickými pro serotyp prostřednictvím opsonofágocytozy. Je možné se domnívat, že zvýšení koncentrace protilátek povede k silnější ochraně a proto se velké úsilí věnuje nalezení způsobu jak zesílit humorální odezvu. Jedna strategie, která se s úspěchem aplikuje, je použití konjugační vakcíny v preklinické studii spolu s imunostimulačním adjuvans (popisuje se v publikaci Poolman et al., 1998, CarbohydrateBased Bacterial Vaccines. In: Handbook of Experimental
Pharmacology eds. P. Perlmann and H. Wigsell, Springer-Verlag, Heidelberg, D).
Data uvedená v této sekci ukazují výsledky posledního experimetnu za použití klinických sérií v protokolu navrženém tak, aby napodobil klinickou studii.
Protokol:
Jednoleté myši balb/c se imunizovaly jednou desetinou lidské dávky konjugační vakcíny zahrnující pneumokokový polysacharid a protein D nebo 23-valentní vakcíny obsahující pouze polysacharid. Používané vakcíny byly klinické série DSP009, DSP013 nebo DSP014 odpovídající 1 μς dávky sérotypů 6B a 23F a 5 μρ zbývajících sérotypů 11-valentní konjugační vakcíny, 0,1 μρ dávky 11-valentní konjugační vakcíny nebo 0,1 μρ dávky 11-valentní konjugační vakcíny s 5 μρ adjuvans 3D-MPL. Všechny 11-valentní konjugované vakcíny obsahují také 50 μg A1PO4.
Skupiny 20 myší se imunizovaly do svalu. Injekce skupin uvedených v následující tabulce se zavedly v den 0 a 21. Testovaná krev se získala v den 35 (14 dní po druhé dávce).
Tabulka: Imunizační rozvrh v případě jednoletých myší Balb/c imunizovaných klinickou sérií konjugační vakcíny obsahující pneumokokový polysacharid a protein D
Skupina den 0 vakcína dávka den 21 vakcína dávka počet myší
1 pneumovax-23 2,5 μρ pufr 20
2a 11-valent. Pn-PD 0,1 μρ pufr 20
2b 11-valent. Pn-PD 0,1 μρ 11-valent. Pn-PD 0,1 μς 20
ΊΟ «· · · · · · · · ·· ·· · ···· ·*· • · · φ φ φ φ
3a 11-valent. Pn-PD +MPL puf r 20
0,1 pg + 5 pg
3b 11-valent. Pn-PD +MPL 11-valent. Pn-PD +MPL 20
0,1 μg + 5 μg 0,1 μρ + 5 μρ
4a 11-valent. Pn-PD puf r 20
1 μg + 0,5 μg
4b 11-valent. Pn-PD 11-valent. Pn-PD 20
1 μg + 0,5 μg 1 μς + 0,5 μg
kontrola puf r puf r 20
V seru se testem ELISA testovala přítomnost protilátek IgG proti pneumokokovému polysacharidů podle protokolu CDC/WHO, což znamená, že po neutralizaci séra se použije polysacharid z buněčné stěny. Test ELISA se kalibroval tak, že koncentrace protilátek se vyjadřuje v μρ/ιηΐ za použití serotypově specifických monoklonálních protilátek IgGl.
Statistické analýzy porovnání se provedly za použití programu UNISTAT verze 5,0 beta. Test ANOVA pomocí metody Tukey-HSD se provedl na logaritmicky tramsformovaných koncentracích IgG. Porovnání rychlosti přeměny sera se uskutečnilo použitím Fisherova exaktního testu.
Výsledky:
V následující tabulce jsou zobrazeny GMC IgG a 95% interval spolehlivosti proti 11 serotypům a protein D indukovaný 14 dní po druhé imunizaci (dávka 2) . Rychlosti serokonverze jsou zobrazeny tam, kde není možné vypočítat 95% interval spolehlivosti.
Skupina jedna vykazuje účinek imunizace se samotným polysacharidem, který normálně indukuje u zvířat pouze IgM. Většina množství IgG se drží pod mezí detekce, nicméně myši balb/c jsou schopny vytvořit IgG na několik pneumokokových polysacharidů, přičemž je možné zmínit sérotypy 3, 19F a 14.
Imunizace s konjugačnimi vakcínami vyvolala protilátky IgG s vysokou rychlosti serokonverze proti všem serotypům s výjimkou 23F.
Pouze v případě sérotypů 7F a 19F se pozorovala odezva závislá na dávce (skupina 4 vs skupina 2), ale tyto pozorování nebyli statisticky podstatná. Silnější odezva se pozorovala po dvou dávkách (skupiny b vs skupiny a) v případě sérotypů 3, 6B, 7F a 19F a PD a tato pozorování jsou v mnoha případech se všemi třemi prostředky statisticky podstatná.
Nejvíce zajímavý je účinek 3D-MPL. Dvě dávky 3D-MPL vytvořené vakcíny (skupina 3b) indukovala nejvyšší GMC specifického IgG a to je statisticky podstatné pro všechny
sérotypy s výjimkou 23F. V tomto případě je podstatně vyšší
rychlost serokonverze (p = 0,02 skupina 3b vs 2b, Fisherův
extrakt).
Tabulka: Geometrický průměr (IgG) a 95% intervaly
spolehlivosti pro vybrané pneumokokové sérotypy a protein D u jednoletých myší Balb/c 14 dní po II imunizaci s 11-valentní konjugační vakcínou PS-PD
skupina 1 2a 2b 3a 3b 4a 4b
Serotyp GM [IgG] pg/ml (95% Cl) GM [IgG] pg/ml (95% Cl) GM [IgG] pg/ml (95% Cl) GM [IgG] pg/ml (95% Cl) GM [IgG] pg/ml (95% Cl) GM [IgG] pg/ml (95% Cl) GM [IgG] pg/ml (95% Cl)
3 0.24 (0.16-0.6) 0.18 (0.11-0.27) 0.84 (0.47-1.5) 0.72 (0.51-1.0) 4.84 (3.0-7.9) 0.22 (0.14-0.35) 0.95 (0.19-1.8)
6B 0.02 0/20* 0.04 8/19 0.19 (0.09-0.41) 0.14 (0.07-0.27) 0.74 (0.29-1.9) 0.09 (0.05-0.16) 0.11 (0.05-0.23)
7F 0.04 0/20* 0.07 (0.04-0.12) 0.19 (0.10-0.39) 0.15 (0.10-0.22) 0.97 (0.49-2.0) 0.09 (0.06-0.14) 0.45 (0.20-1.02)
14 0.15 3/20* 4.5 (2.5-8.1) 6.2 (3.6-10.5) 12.9 (7.8-21.2) 13.6 (9.4-19.7) 4.0 (2.0-8.0) 6.9 (4.6-10.6)
19F 1.2 (0.56-2.6) 6.7 (3.6-12.5) 12.1 (7.6-19.3) 10.1 (5.5-18.5) 58.5 (42-81) 5.9 (3.5-9.9) 22.0 (16.0-30.2)
23F 0.07 1/20’ 0.08 3/20* 0.08 2/19* 0.07 2/10* 0.17 9/20* 0.06 1/18’ 0.10 4/20’
PD* 0.25 1/20’ 5.2 (3.3-8.3) 11.9 (6.9-20.7) 13.5 (9.5-19.0) 98.0 (49.1-195.) 10.9 (6.4-18.4) 38.7 (21.3-70.3)
• · · · ·* · · ·· »« ··· ···· ·· 4» *vyjádřeno v EU/ml, # rychlost serokonverze se definuje jako 2 standardní odchylky nad průměr negativní kontroly.
V předchozí tabulce jsou definovány skupiny.
Závěr:
Zde uvedená data demonstrují, že přidání 3D-MPL k 11valentní konjugační vakcíně obsahující pneumokokový polysacharid a protein D zvýší imunitní odpověď u starých myší balb/c v případě všech testovaných serotypů.
U většiny případů dvě dávky vakcíny indukovaly vyšší geometrickým průměr koncentrací IgG ve srovnání s jednou dávkou. To se nepozorovalo za použití samotné polysacharidové vakcíny. Tato skutečnost se považuje za indikaci imunitní odezvy závislé na T-buňkách a imunitní paměti.
Tato data podporují vakcinační aplikační schéma za použití konjugovaných pneumokokových polysacharidů, kde se jako adjuvans používá Thl (upřednostňuje se 3D-MPL), přičemž se aplikují alespoň dvě dávky vakcíny obsahující adjuvans, přičemž se preferuje časový interval mezi dávkami 1 až 12 týdnů a nejvýhodnější je interval tří týdnů. Takové aplikační schéma je obsahem vynálezu.
Myši používané v experimentu nevykazují odezvu na PS 23 (samotný nebo konjugovaný). Je zajímavé, že ačkoli množství protilátek proti polysacharidů zůstává nízké s ohledem na použitý vakcinační prostředek, o mnoho více myší odpovídá na PS 23, v případě, že se jako adjuvans použije 3D-MPL (serokonverze je podstatně vyšší) . Použití adjuvans Thl, zvláště pak 3D-MPL ve vakcinačnich prostředcích obsahujících konjugované pneumokokové polysacharidy za účelem odstranit neschopnost odezvy nat pneumokokový polysacharid ve vakcíně je také dalším aspektem vynálezu. Dalším způsobem jak odstranit neschopnost odpovídat na dříve uvedený prostředek je použití dvou dávkového aplikačního schématu popsaného shora v textu.
Příklad 7: Konjugát polysacharidu C mikroorganizmu Neisseria meningitidis - protein D
A: Exprese proteinu D
Probíhá jako v příkladu 1.
B: Výroba polysacharidu C
Zdroj polysacharidu skupiny C je mikroorganizmu N. meningitidis kmen Cil. Tento kmen se fermentuje za použití klasické fermentační techniky (popisuje se v dokumentu EP 72513). Suché práškové polysacharidy užívané v konjugačním procesu jsou shodné s Mencevax (SB Biologicals s.a.).
Alikvot kmene Cil se roztavil a 0,1 ml suspenze se naneslo na petriho misku s médiem Mueller Hinton doplněném dialyzátem kvasinkového extraktu (10 % objem/objem) a kuktura se inkubivala po dobu 23 až 25 hodin při teplotě 36 °C v inkubátoru v atmosféře vzduchu saturovaného vodou.
Povrchová kultura se resuspendovala ve sterilním fermentačním médiu a s touto suspenzí se inokulovala Rouxova láhev obsahující médium Mueller Hinton doplněné dialyzátem kvasinkového extraktu (10 %, objem/objem) a sterilní skleněné kuličky. Po inkubaci Rouxovy nádoby po dobu 23 až 25 hodin při teplotě 36 °C v inkubátoru v atmosféře vzduchu saturovaného vodou se povrchová kultura resuspendovala v 10 ml sterilního fermentačního média a 0,2 až 0,3 ml této suspenze se inokulovalo do 12 jiných Rouxových lahcí s médiem Mueller Hinton.
• 9 9 9 · 9
Po inkubaci během 23 až 25 hodin při teplotě 36 °C v inkubátoru v atmosféře vzduchu saturovaného vodou se povrchová kultura resuspendovala v 10 ml sterilního fermentačního média. Bakteriální suspenze se slila do konické lahve.
Tato suspenze se pak sterilně přenesla do fermentoru za použití sterilní stříkačky.
Fermentace meningokoků se provedla ve fermentoru, které se nacházejí v čisté místnosti při negativním tlaku. Fermentace se v obecném případě ukončila po 10 až 12 hodinách. Koncentrace bakterií je 1010 bakterií v jednom mililitru (to je časná stacionární fáze) a ukončení fermantace se detekuje zvýšením pH.
V tomto stádiu se celá půda před centrifugací deaktivovala zahřátím (12 min. při teplotě 56 °C ) . Před aktivací a po ní se odebral vzorek půdy a rozetřel se na petriho misky na médium Mueller Hinton.
C. Čištění PS
Proces čištění je postup zahrnující více korků a provedl se s celým obsahem fermentace.
V prvním stádiu čištění se deaktivovaná kultura čiřila centrifugací a získal se supernatant.
Čištění polysacharidu je založeno na srážení s kvartérní amonnou solí (bromid cetyltrimethylamonný/CTAB, Cetavlon R) .
CTAB tvoří nerozpustné komplexy s polyantionty, jako jsou polysacharidy, nukleové kysleiny a proteiny závisející na jejich pl. Tato metoda se může použít při srážení nečistot (nízká konduktivita) nebo polysacharidu (vysoká konduktivita).
Polysacharidy obsažené v čistém supernatantu se srážely za použití diatomitu (CELÍTE® 545) jako matrice, aby se zabránilo tvorbě nerozpustné inertní hmoty během srážení/čištění.
Schéma čištění polysacharidu C mikroorganizmu N.meningitidis
Krok 1: Fixace komplexu PSC-CTAB na CELÍTE® 545 a odstranění buněčného odpadu, nukleových kyselin a proteinů promytim 0,05 % CTAB.
Krok 2: Eluce PS 50% EtOH. První frakce, která je turbidní a obsahuje nečistoty a LPS se vylila. Přítomnost PS v dalších frakcích se ověřila flokulačním testem.
Krok 3: Opětná fixace komplexu PS-CTAB na CELÍTE® 545 a odstranění menších nukleových kyselin a proteinů promytim 0,05 % CTAB.
Krok 4: Eluce PS 50% EtOH. První turbidní frakce se vylije. Přítomnost PS v následujících frakcích se ověří flokulačním testem.
Eluát se filtroval a sbíral se filtrát obsahující surový extrakt. Polysacharid se srážel z filtrátu přidáním ethanolu na konečnou koncentraci 80 %. Polysacharid se pak odstranil jako bílý prášek, sušil se ve vakuu a skladoval se při teplotě -20 °C.
D. Konjugace CDAP
Konjugace PSC a PD
V případě konjugace PSC a PD se preferuje technologie CDAP konjugace o proti klasické aktivaci CNBr a provedlo se párování přes mezerník na nosičovy protein. Polysacharid se nejdříve aktivoval kyanylací s l-kyano-4dimethylaminopyridiniumtetrafluoroborátem (CDAP). CDAP je ve • · vodě rospustné cyanylační činidlo, ve kterém se elektrofilita kyanoskupiny zvyšuje nad hodnotu pro CNBr, což umožňuje,a by cyanylační reakce se provedla za poměrně jemných podmínek. Po aktivaci se může polysacharid přímo spojit s nosičovým proteinem přes jeho aminoskupiny, aniž je nutné zavést distanční molekuly. Nezreagované esterkyanátové skupiny se uhasí extenzivní reakcí s glycinem. Celkový počet kroků zahrnutých v přípravě konjugačních vakcín se omezil a v konečném produktu nejsou přítomny nejdulěžitější potencionálně imunogenní distanční molekuly.
Aktivace polysacharidu s CDAP zavádí kyanoskupinu do polysacharidu a uvolňuje se dimethylaminopyridin (DMAP). Během následující postupu párování kyanátová skupina reaguje se skupinami NH2 v proteinu a je přetvořena na karbamát.
Aktivace PSC a párování PSC-PD
Aktivace a párování se provedlo při teplotě 25 °C.
120 mg PS se rozpouštělo alespoň po dobu 4 hodin v WFI.
Roztok CDAP (100 mg/ml čerstvě připraveného acetonitrilu) se přidalo v množství, aby se dosáhlo poměru CDAP/PS (hmotn./hmotn.) 0,75.
Po 1 minutě a 30 vteřinách se zvýšila hodnota pH až na hodnotu aktivace (pH 10) přidáním triethylamoinu a pak se tato hodnota stabilizuje až do přidání PD.
V čase 3 minuty 30 vteřin se přidalo NaCl tak, aby konečná koncentrace byla 2M.
V čase 4 minuty se přidal PD tak, aby poměr PD/PS byl 1,5/1. Hodnota pH je bezprostředně upravena na hodnotu při párování (pH 10) . Roztok se nechal stát po dodbu jedné hodiny při regulované hodnotě pH.
Zastavení reakce
Ke směsi PS/PD/CDAP se přidalo 6 ml 2M glycinu. Hodnota pH se upravila na pH, při kterém dochází k zastavení reakce (pH 8,8). Roztok se míchal po dobu 30 minut při pracovní teplotě a pak se pomalu míchal přes noc při teplotě 2 až 8 °C.
Čištění PS-PD
Po filtraci (velikost pórů membrány je 5 pm)se konjugát PS-PD čistil v lednici gelovou permeační chromatografií na gelu Sephacryl S400HR, aby se odstranily malé molekuly (zahrnující DMAP) a konjugovaný PD: Eluce se provedla pomocí NaCl 150 mM při hotnotě pH 6,5 a monitorování se provedlo při UV 200 nm a dále se sledovalo pH a konduktivita.
Na základě různých molekulových velikostí reakčních komponentů, konjugáty se nejdříve eluovaly konjugáty PS-PD a pak následují volný PD a nakonec DMAP. Frakce obsahující konjugát, jak se detekovalo pomocí DMAB (PS) a pBCA (protein) se slily. Slité frakce se sterilizovaly filtrací (velikost pórů je 0,2 pm) .
E. Tvorba adsorbované konjugační vakcíny PSC-PD
Promytí AIPO4
Za účelem optimalizovat adsorpci konjugátu PSC-PD na AIPO4 se AIPO4 promylo, aby se redukovala koncentrace PO43-:
-AIPO4 se promylo 150 mM NaCl a centrifugovalo se (4x),
-pelet se pak resuspendoval ve 150 mM NaCl a pak se filtroval (velikost pórů je 100 pm) a
-filtrát se sterilizoval zahřátím.
·♦ »···
Takto promytý A1PO4 se nazývá WAP (promytý autoklávovaný fosforečnan).
Postup přípravy:
Před vytvořením konečného produktu se konjugát PSC-PD adsorboval na A1PO4 WAP. A1PO4 WAP se míchal s PSC-PD po dobu 5 minut při teplotě místnosti. pH se upravilo na hodnotu 5,1 a směs se míchala po dalších 18 hodin při teplotě místnosti. Pak se přidal roztok NaCl, aby koncentrace byla 150 mM a směs se míchala po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Ke směsi se přidal 2-fenoxyethanol, aby koncentrace byla 5 mg/ml a směs se míchala po dobu 15 minut pri upravilo na hodnotu 6,1.
Konečné složení/dávka:
- PSC-PD
- A1PO4 WAP:
- NaCl
- 2-fenoxyethanol:
- voda vhodná pro injekcí:
- pH:
teplotě místnosti, pak se pH μς PS
0,25 mg Al3+
150 mM
2,5 mg až 0,5 ml
6,1
F. Preklinické informace
Imuogenicita polysacharidového konjugátu u myší
Imunogennost konjugátu PC-PD se stanovila v případě 6 až 8 týdnů starých myší Balb/C. Samotný konjugát (neadsrobovaný) nebo konjugát adsorbovaný na A1PO4 se zavedl injekci jako monovalentní vakcína. Vyvolané protilátky proti PSC se stanovily testem ELISA, zatímco funkční protilátky se analyzovaly za použití baktericidního testu. Obě metody jsou založeny na protokolech CDC (Centers for Disease Contorl and Prevention, Atlanta, USA). Na základě výsledků ze dvou různých φφφφ ♦
ΦΦ
ΦΦ
Φ·
Φ Φ Φ · ·· ΦΦ
ΦΦ Φ· w • · φφφφ φφφφ φφφφ φ φ φφφ φ ···· φφ φφφ provedených experimentů se odhaduje odezva versus dávka a účinek adjuvans (AIPO4) .
Rozsah dávky vhodný pro experiment
V tomto experimentu se myším Balb/C dvakrát (v intervalu jednoho týdne) injekcí zavedla vakcina PSC-PD. Použily se čtyři různé dávky konjugátu vytvořené na A1PO4: 0,1, 0,5, 2,5 a 9,6 μς na jedno zvíře. Myši (10 myší v jedné skupině)se nechaly vykrvácet v den 14 (14 post I), 28 (14 post II) a42 (28 post II). Geometrický průměr koncentrací (GMC) protilátek specifických pro polysacharidstanovený testem ELISAse vyjádřil v μς IgG v jednom mililitru za použití čištěného IgG.
V séru se měřily baktericidní protilátky a titry se vyjádřily jako převrácená hodnota ředění, které je schopné usmrtit 50 % bakterií, přičemž se používá mikroorganizmus N. meningitidis kmen Cil v přítomnosti komplementu mláďat králíků.
Získaná odezva na dávku je znázorněna rovinou už od dávky 2,5 μς. Výsledky indikuji, že existuje dobrá odezva na zesilovací dávku mezi 14 post I a 14 post II. Množství protilátek v 28 post II je alespoň stejný jako v době 14 post II. Titry baktericidních protilátek souhlasí s koncntracemi určenými v testu ELISA a potvrzují imunogennost konjugátu PSCPD.
Účinek adjuvans
V tomto experimentu se vytvořila jedna sada konjugátu PSC-
PD vytvořená na A1PO4, pro případ porovnání se zavedl injekcí samotný konjugát (bez adjuvans). 10-ti myším ve skupině se dvakrát injekci zavedlo ve dvou týdenních intervalech podkožní cestou 2 μς konjugátu. Myši se nechaly vykrvácet v den 14 (14 post I), 28 (14 post II) a 42 (28 post II). Stanovily se testy ELISA a titry funkčních protilátek (v případě baktericidního • · «· φφφφ φ *4 φφ
ΦΦ Φ ·· ♦ · 4 ♦ · · Φ ΦΦΦ· ♦ · · Φ · · φ Φ φ « ♦ φ · · ·· ··· ·· »· ··» ΦΦΦΦ ·Φ ··· testu pouze 14 post II a 28 post II) . Formulace A1PO4 vyvolává až 10 krát vyšší titry protilátek ve srovnání s formulacemi, které nezahrnují adjuvans.
Závěry:
Následující obecné závěry se vytvořily na základě výsledků shora popsaného experimentu:
konjugát PSC-PD vyvolává anamnestickou odezvu demonstrující, že PSC, když je konjugován, se stává antigenem závislým na T buňce, koncentrace protilátek proti PSC měřené testem ELISA dobře korelují s titry baktericidních protilátek, což ukazuje, že protilátky vyvolané konjugátem PSC-PD jsou funkční proti mikroorganizmu N.meningitidis seroskupina C, přibližně 2,5 μρ konjugátu adsorbovaného na AIPO4 se jeví, že vyvolává u myší optimální protilátkovou odezvu, chemie CDAP je vhodnou metodou pro přípravu imunogenních konjugátů PSC-PD.
Příklad 8: Příprava konjugátu polysacharidu z mikroorganizmu
N.meningitidis seroskupina A - PD
Suchý prášek polysacharidu A (PSA) se rozpustil po dobu jedné hodiny v 0,2 M roztoku NaCl, aby konečná koncentrace byla 8 mg/ml. pH se pak fixovalo na hodnotě 6 pomocí HC1 nebo NaOH a roztok se temperoval při teplotě 25 °C. K roztoku PSA se přidalo 0,75 mg CDAP/mg PSA. Po 1,5 min. bez regulace pH se přidal 0,2 M NaOH a získal se hodnota pH 10. Po 2,5 minutách se přidal v souladu s poměrem PD/PSA přibližně 1 protein D (jeho koncentrace je 5 mg/ml^ . Během párování po dobu jedné hodiny se udržuje pH na hodnotě 10. Pak se přidalo 10 mg glycinu (2 M, pH 9) na jeden miligram PSA (hodnota pH je 9, čas 30 minut a teplota 25 °C) . Před čištěním na kolonové chromatografií s exkluzí (Sephacryl S400HR od firmy Pharmacia) se směs konzervovala přes noc při teplotě 4 ’C. Jako první eluuje konjugát, pak následuje PD a vedlejší produkty (DMAP, glycin, sole). Konjugát se shromáždila a sterilizoval se filtrací na membráně Sartopore (od firmy Sartorius) s velikostí pórů 0,2 μιη.
Příklad 9: Charakterizace produktů popsaných v příkladu 7 a 8 in vitro
Hlavní charakteristiky se uvádějí v tabulce dále v textu:
č. popis konjugátu protein a obsah PS (μς/ιηΐ) poměr PS/protein (hmotn.) volný protein (%) volný PS (%)
1 PS C-PD pH se reguluje NaOH PD : 210 PS : 308 1/0,68 < 2 8-9
2 PS C -PD pH se reguluje TEA PD : 230 PS : 351 1/0,65 < 2 5-6
3 PS A - PD pH se reguluje NaOH PD : 159 PS : 149 1/1,07 5 5-9
Výsledky in vivo
Jako zvířecí model pro testování imunogennosti konjugátů se použily myši Balb/C. Konjugáty se adsorbovaly buď na AIPO4 nebo A1(OH)3 (10 μg PS na 500 μg Al3+) nebo se neadsorbovaly. Myším se zavedly následující injekce: 2 injekce ve dvoutýdenních intervalech (2 μg PS/injekci).
Na základě těchto výsledků vyplývá, že volný PS velmi ovlivňuje imunitní odezvu. Lepší výsledky je možné získat • · · · • · · · ·· ·· ·· ·· ····«·· ·· · s konjugátem, který obsahuje méně než 10 % volného PS. Vynález tedy popisuje optimalizaci postupu CDAP.
Příprava je také důležitá. V tomto modelu se A1PO4 jeví jako nejvhodnější adjuvans. Konjugáty vyvolávají zesilovací účinek, ke kterému nedochází, když se injekcí zavádějí samotné polysacharidy.
Závěry:
Konjugáty mikroorganizmu N.menigitidis A a C se získaly z konečným poměrem PS/protein 1 a 0,6 až 0,7 (hmotn.). Volný PS a volný nosičový protein byl pod 10 % respektive 15 %.
Výtěžek polysacharidu je vyšší než 70 %. Konjugáty PSA a PSC získatelné shora popsaným optimalizovaným postupem CDAP (bez ohledu na nosičový protein, ale přednostně s proteinem D) je pak dalším aspektem vynálezu.
Příklad 10: Příprava konjugátu polysacharidu z mikroorganizmu
H.influenzae b - PD hlavních agens,
Mikroorganizmus H. influenzae b je jeden z dětí mladších dvou let. V oboru které způsobuje meningitidu u kapsulární je dobře znám tvořící polysacharid mikroorganizmu s toxoidem tetanu konjugát metodou vyvinutou J.
(konjugace probíhá zdokonalená chemická metoda. Následuje
Robbins). CDAP je výčet optimálních podmínek pro CDAP zjištěných pro případ konjugace PRP přednostně PD.
Parametry ovlivňující reakci konjugace jsou následující:
- počáteční koncentrace polysacharidu (může mít vliv na konečné množství volného polysacharidu a na krok sterilizace filtrací), počáteční koncentrace nosičového proteinu, • ·· · • · • ·
- počáteční poměr polysacharidu a proteinu (může mít vliv na konečné množství volného polysacharidu a sterilizaci filtrací), používané množství CDAP (obvykle se používá velký nadbytek), teplota reakce (která může ovlivnit rozpad polysacharidu, kinetiku reakce a rozpad reaktivních skupin), hodnota pH aktivace a konjugace, hodnota pH ukončení reakce (ovlivňuje množství zbytkového DMAP), doba aktivace, konjugace a ukončení reakce.
Zjistilo se, že 3 nejvíce kritické parametry pro optimalizaci kvality konečného produktu jsou počáteční poměr polysacharidu a proteinu, počáteční koncentrace polysacharidu a hodnota pH konjugace.
Reakční kostka se tak znázornila se třemi shora uvedenými podmínkami, jako tři osy. Centrální body (a rozmezí experimentálních hodnot) v případě těchto os jsou: poměr PS/protein = 1/1 (±0,3/1), [PS] = 5 mg/ml (± 2 mg/ml) a pH při párování je 8,0 (± 1,0 jednotek pH).
Méně podstatné parametry se zafixovaly následovně: použilo se 30 mg polysacharidu, teplota je 25 °C, (CDAP) = 0,75 mg/mg PS, pH se titruje 0,2 M NaOH, pH aktivace je 9,5, teplota aktivace se udržuje po dobu 1,5 minut, teplota konjugace se udržuje po dobu jedné hodiny, koncentrace proteinu je 10 mg/ml, pH pro ukončení reakce je 9,0, teplota pro ukončení reakce se udržuje po dobu jedné hodiny, teplota pro rozpuštěni PS v rozpouštědle se udržuje po dobu jedné hodiny a rozpouštědlo je 2M NaCl, Sephacryl S-400HR se eluuje 150 mM NaCl při rychlosti 12 cm/hodinu a sterilizace filtrací se provádí na SARTOLAB P20 při rychlosti 5 ml/min.
♦ · · · ♦ · a *
Vyhledávaná data při optimalizaci podmínek jsou: data zpracování - maximální výtěžek po filtraci, maximální množství začleněného proteinu a kvalita produktu - konečný poměr PS/protein, množství volného PS, množství volného proteinu, minimální množství zbytkového DMAP (rozklad produkce CDAP).
Výstup z filtrace
Faktor, který ovlivňuje výstup po filtraci je interakce mezi počáteční hodnotou pH (PS) a hodnotou pH při spojování a počáteční poměr PS/protein. Při nízké koncentraci PS dochází k malé interakci s pozdějšími dvěma faktory a a rozhoduje dobra schopnost se filtrovat (přibližně 95 % v případě všech produktů). Při vysoké koncentraci se však filtrovatelnost snižuje, jestliže hodnota pH a počáteční poměr roste (vysoká koncentrace PS, nejnižší poměr, nejnižší pH = 99 % filtrace, ale vysoká koncentrace PS, nejvyšší poměr a pH = 19 % filtrace).
Množství začleněného proteinu
Poměr konečného poměru PS/protein s ohledem na počáteční poměr je mírou účinnosti spojování. Při vysoké koncentraci PS, hodnota pH neovlivňuje poměr poměrů. Avšak počáteční poměr ovlivňuje hodnotu poměrů (1,75 při nízkém počátečním poměru, 1,26 při vysokém počátečním poměru). Při nízké koncentraci PS je poměr poměrů ve většině případů nižší, avšak pH vykazuje více účinků (nízké pH, nízký poměr = 0,96, nízké pH, vysoký poměr = 0,8, vysoké pH, nízký poměr = 1,4 a vysoké pH, vysoký poměr = 0,92).
Konečný poměr PS/protein
Konečný poměr závisí na počátečním poměru a koncentraci PS. Konečný poměr, který je nejlépe rozdělitelný podle • · · · · · · • · · . . . . . .
···· ·· · · ·· ·· .........
velikosti, se získal kombinací vysokých počátečních poměrů a vysoké koncentrace PS. Účinek pH na konečný poměr není podstatný pokud je nízká koncentrace PS.
Množství volného proteinu D
Nejmenší množství volného proteinu D se pozorovalo při vysokém pH a při vysoké koncentraci PS (množdtví dosahuje hodnoty 0,0). Účinek vysoké koncentrace PS se stává zvláště znatelný při nízkém pH. Zvýšení počátečního poměru trochu přispívá ke zvýšení množství volného proteinu D.
Zbytkový DMAP
Počáteční poměr nemá podstatný účinek, Naopak množství DMAP roste s koncentrací PS a klesá s roztoucím pH.
Závěry
Nejvýhodnější konjugační podmínky jsou následující: pH konjugace je 9,0, koncentrace PS je 3 mg/ml a počáteční poměr je 1/1. Při takových podmínkách charakteristiky konečného produktu jsou následující:
konečný poměr PS/protein výstup PS z filtrace (%) poměr poměrů volný protein D (%) množství DMAP (ng/10 μρ PS)
hodnota rozmezí hodnota rozmezí hodnota rozmezí hodnota rozmezí hodnota rozmezí
1,10 0, 91- 1,30 92, 6 50- 138 1, 16 1,03- 1,29 0,71 0- 10,40 4.95 2,60- 7,80
Vynález dále popisuje konjugáty PRP, které je možné získat shora v textu popsaným (optimalizovaným) způsobem CDAP (bez ohledu na nosičový protein, ale přednostně se použije protein D) .
• · · · • · · • · · • · ·
Příklad 11:
Protein D jako antigen - jak je možné zvýšit jeho účinnost ochrany proti netypovatelnému H.influenzae připojením 3D-MPL
Samice poprvé ve konj ugační myší Balb/c (10 myší stáří 20-ti týdnů vakcínou obsahující ve skupině) se imunizovaly (DO) (do svalu) 11-valentní pneumokokový polysacharid a provedla o dva týdny později druhé imunizaci se shromáždila krev. Titry se měřily jako množství protilátek
Druhá imunizace se (D14) . 7 dní po protilátek proti typu IgGl, IgG2a proteinu D a IgG2b.
Připravily se za mrazu sušené undekavelentní vakcíny (bez A1PO4) kombinací konjugátů s 15,75 % laktózou, míchaly se po dobu 15 minut při teplotě místnosti a pH se upravilo na hodnotu 6,1 ± 0,1 a lyofilizovaly se (cyklus obvykle začíná při teplotě -69 °C, postupně během 3 hodin se teplota zvyšuje na 24 °C a pak se tato teplota udržuje po dobu 18 hodin. Teplota se dále zvedá na -16 °C po dobu jedné hodiny a udržuje se po dobu 6 hodin a pak dosáhne během 3 hodin 34 °C a tato teplota se udržuje po dobu 9 hodin) .
Složení kompozic vhodných pro lyofilizaci se uvádí v tabulce č. 13.
Je známo, že nejvýznamnější chrakteristika, zda se objeví imunitní odezva zprostředkovaná buňkami typu Thl, koreluje s množstvím protilátek IgG2a. Jak je možné vidět na základě dat, dojde k překvapivě velkému zvýšení množství protilátek IgG2a, jestliže protein D se lyofilizoval s adjuvans Thl (v tomto případě 3D-MPL).
lyof. ·< 0 hh lyof. lyof. lyof . lyof. | -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------1 kapal. X 0) Ό DJ kapal. 1 kapal. fyzikální stav
cn P uq i μο cn •p kQ 1—» p uq cn *P uq Η» •p kQ cn •p kQ *P kQ cn •p kQ )-» •p tQ — nj ω cn o o p w
o •p kQ O p uq o p o p uq O p uq o •p O •p íQ O •p 500 pg 5 0 0 pg | o > P H H O 'x. cn O
žádný žádný žádný žádný žádný žádný žádný žádný žádný žádný imunostim ulant
laktóza 3,15 % laktóza 3,15 % laktóza 3,15 % 1_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CO l·* QJ h~* X Cn rr 0' 0\o N ŮJ laktóza 3,15% laktóza 3, 15 % žádný žádný žádný žádný zpevňuj ic i činidlo
žádné žádné žádné i žádné N< fy. a P Φ' žádné 2-PE 2-PE i NJ ) nj PÍ N> J Pí konzervač ni činidlo i ! i
2 IP Cn 2 O Ό p tr< cn > O Η1 O p O kQ^ cn > O H O Ό •p O % 3 Z 2 o H W cn o NaCl 150 mM1 žádné žádné žádné žádné rekonstit uent
135 cn I-4 kb Cn >—1 R 5,2 5, 2 9 '9 0) σ> 76 •p iQ \ 3 H hH uq 0 (-»
25 2,6 0,077 H* CO 0) o, li | I O t—* 4S. 0,169 1 1 LOZ '0 0,284 0,425 H uq O (\>
cn 3,5 0, 119 0, 075 0, 168 0,046 o o uZ. ω 0,036 0,176 O n <0 0 CO to
81,8 88,1 i 1 | i 0'66 ; i 95,9 1 kb -J cn fr'96 kb 0Ϊ kb 0) 4^ 99, 3 kb kb I-1 o\o H kQ O h->
15,1 5,09 o its, o >—* Ol kb o 0,967 2,73 3,12 3,02 0,427 0,554 H kQ CD CO a>
3,089 6,849 0, 620 0,160 Η» 43> -J 0, 853 0,795 0,526 0,265 0,313 M kQ 0 K> σ
Tabulka č. 13: Složení prostředků (pro aplikaci lidem) a titry protilátek proti proteinu D u myší (s dávkou 1/10)

Claims (18)

1. Imunogenní prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje velké množství polysacharidových konjugačních antigenů, které zahrnují polysacharidový antigen získaný z patogenní bakterie konjugované s proteinem D mikroorganizmu Haemophilus influenzae nebo jeho fragment s proteinem D.
2. Imunogenní prostředek podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že polysacharidové antigeny se vybraly ze skupiny zahrnující polysacharidy Vi z mikroorganizmu Salmonella typhi, meningokokové polysacharidy, polysacharidy a upravené polysacharidy meningokoků skupiny
B, polysacharidy z mikroorganizmu Staphylococcus aureus, agalactiae, pneumoniae, polysacharidy polysacharidy polysacharidy mikroorganizmu
Streptococcus neoformans,
Streptococcus polysacharid z netypovatelného mikroorganizmu
Cryptococcus
Heamophilus influenzae,
Haemophilus kapsulární influenzae b,
Moraxella catharralis, mikroorganizmu mykobakterie, lípopolysacharidy polysacharid z lipopolysacharidy lipopolysacharidy mikroorganizmu mikroorganizmu
Shigella sonnei lipopeptidofosfoglykan (LPPG) mikroorganizmu Trypanosoma cruzi.
3. Imunogenní prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že obsahuje polysacharidové antigeny pocházející alespoň ze čtyř serotypů mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae.
4. Imunogenní protředek podle nároku 2 vyznačuj ící se tím, ž e navíc obsahuje Λ ♦· ···· ♦ ·· ··
QCi ·········· · · · ···· •9 9 9 · 9 9 9 ·
9 9 9 9 9 9 9 9 •9 99 999 9999 99 9 alespoň jeden proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae.
5. Imunogenní prostředek podle nároku 4, vyznačující se tím, že proteinový antigen je vnější povrchový protein nebo vylučovaný protein mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jeho imunologicky funkční ekvivalenty.
6. Imunogenní prostředek podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím, že proteinový antigen je toxin, adhesin nebo lipoprotein mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae nebo jeho imunologicky funkční ekvivalenty.
7. Imunogenní prostředek podle nároku 4 až 6, vyznačující se tím, že proteinový antigen nebo jeho imunologicky funkční ekvivalent se vybral ze skupiny zahrnující pneumolyzin,
PspA nebo jeho transmembránové deleční varianty,
PspC nebo jeho transmembránové deleční varianty,
PsaA nebo jeho transmembránové deleční varianty, glyceraldehyd-3fosfátovou dehydrogenázu a CbpA nebo jeho transmembránové deleční varianty.
8. Imunogenní prostředek podle nároku 2, vyznačující setím, že polysacharidové antigeny konjugované s proteinem D se získaly z kombinace mikroorganizmu * N.meningitidis sérotypy A, C nebo Y.
9. Imunogenní prostředek obsahující konjugované kapsulární
polysacharidy mikroorganizmu Haemophilus influenzae b, meningococcus C a meningococcus Y, vyznačující se tím, ž e kapsulární polysacharidové antigeny se
konjugovaly s proteinem D z mikroorganizmu H. influenzae
10.
11.
12.
13.
14 .
♦ 0 · · · 0 • ··
0 0 0 0 00 • 0 00 ♦ 0 0« « · * • · · · • · · •♦ ·«· *· · s podmínkou,
Haemophilus že kapsulární polysacharid z mikroorganizmu influenzae b se konjugoval s toxoidem tetanu.
prostředek obsahující konjugované mikroorganizmu Streptococcus meningococcus C
A' τ'
15.
16.
se tím, se konjugovaly
Imunogenní polysacharidy
Heamophilius influenzae b,
Y, vyznačující polysacharidové antigeny z mikroorganizmu H. influenzae s podmínkou, polysacharid z mikroorganizmu Haemophilus konjugoval s toxoidem
Imunogenní prostředek ící vyznač adj uvans.
tetanu.
podle libovolného tím, kapsulární pneumoniae, meningococcus ; e kapsulární s proteinem D že kapsulární influenzae b se nároků 1 až 10, navíc obsahuje prostředek ící
Imunogenní vyznač antigeny polysacharid fosforečnanu hlinitém.
podle tím, protein D se nároku
11, ž e konjugované adsorbovaly na prostředek
Imunogenní vyznačuj ící s výhodou činidlo vyvolávající podle tím, odezvu TH1.
nároku
11, e adjuvans je
Imunogenní vyznačuj alespoň jedno saponinový oligonukleotid prostředek ící se činidlo z podle nároku
13, í m, že následuj ící imunostimulant nebo
GpG.
Imunogenní prostředek podle vyznačuj ící použití jako léčivo.
obsahuj e adjuvans skupiny:
imunostimulační
3D-MPL, libovolného tím, nároků 1 až
14, je vhodný pro
Vakcinační prostředek, ž e obsahuje imunogenní v y prostředek podle nároků značuj ící se t i m,
1 až 14.
• * · * · · • · · ♦ 9 9
9 9999
17. Způsob přípravy imunogenniho prostředku proti velkému množství patogenních bakterií, vyznačuj ící setím, že zahrnuje:
izolaci velkého množství polysacharidových antigenů z uvedených patogenních bakterií, aktivaci polysacharidů, konjugaci polysacharidů s proteinem D z mikroorganizmu H. influenzae a smíchání konjugovaných polysacharidů.
18. Způsob léčby pacienta, který trpí nebo je náchylný k infekci patogenní bakterií, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje aplikaci účinného' množství imunogenniho prostředku podle libovolného z nároků 1 až 17.
•· •· ··
4··· • ·
* r· ·» ·♦ » ♦ • • 9 9 • 4 • 9 • • · • ♦ 9 9 • · • 9 • ··· ···♦ 99 ···
Obrázek č. 1A
Obrázek č. IB titry inhibice hemolýzy u myší bj imunizovaných pneumolyzinem cu
4D •H -P
I>1
-P
O
G — b fú O M Λ Φ tf) Ή
C 'fú b p OJ -H >P r-4 P V] (0 —
400
Obrázek č. 1C pneumokokové kolonizace plic u myši OF1 6 hodin po intranasálni čelendži se serotypem 6B
CZ20013380A 1999-03-19 2000-03-17 Imunogenní prostredek CZ303653B6 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9906437.0A GB9906437D0 (en) 1999-03-19 1999-03-19 Vaccine
GBGB9909077.1A GB9909077D0 (en) 1999-04-20 1999-04-20 Novel compositions
GBGB9909466.6A GB9909466D0 (en) 1999-04-23 1999-04-23 Vaccines
GBGB9916677.9A GB9916677D0 (en) 1999-07-15 1999-07-15 Vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20013380A3 true CZ20013380A3 (cs) 2002-03-13
CZ303653B6 CZ303653B6 (cs) 2013-01-30

Family

ID=27451884

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20013378A CZ20013378A3 (cs) 1999-03-19 2000-03-17 Vakcína
CZ20013379A CZ301445B6 (cs) 1999-03-19 2000-03-17 Imunogenní prostredek, obsahující alespon jeden polysacharidový a alespon jeden proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae a adjuvans
CZ20013380A CZ303653B6 (cs) 1999-03-19 2000-03-17 Imunogenní prostredek

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20013378A CZ20013378A3 (cs) 1999-03-19 2000-03-17 Vakcína
CZ20013379A CZ301445B6 (cs) 1999-03-19 2000-03-17 Imunogenní prostredek, obsahující alespon jeden polysacharidový a alespon jeden proteinový antigen mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae a adjuvans

Country Status (32)

Country Link
US (8) US20030147922A1 (cs)
EP (6) EP1163000B1 (cs)
JP (4) JP2002540074A (cs)
KR (3) KR100642044B1 (cs)
CN (3) CN1191852C (cs)
AR (3) AR022965A1 (cs)
AT (3) ATE459373T1 (cs)
AU (3) AU750762B2 (cs)
BE (1) BE1025464I2 (cs)
BR (4) BRPI0009163B8 (cs)
CA (3) CA2365296A1 (cs)
CY (3) CY1107561T1 (cs)
CZ (3) CZ20013378A3 (cs)
DE (4) DE60032120T2 (cs)
DK (2) DK1163000T3 (cs)
ES (3) ES2300255T3 (cs)
FR (1) FR10C0008I2 (cs)
HK (3) HK1043728B (cs)
HU (4) HUP0200664A2 (cs)
IL (5) IL145045A0 (cs)
LU (1) LU91652I2 (cs)
MX (1) MXPA01009452A (cs)
MY (2) MY125202A (cs)
NL (1) NL300415I1 (cs)
NO (4) NO20014322L (cs)
NZ (3) NZ513840A (cs)
PL (3) PL355178A1 (cs)
PT (2) PT1162999E (cs)
SI (2) SI1163000T1 (cs)
TR (3) TR200102739T2 (cs)
TW (3) TWI281403B (cs)
WO (3) WO2000056359A2 (cs)

Families Citing this family (268)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030157129A1 (en) * 1995-06-23 2003-08-21 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine comprising a polysaccharide antigen - carrier protein conjugate and free carrier protein
US7078042B2 (en) * 1995-09-15 2006-07-18 Uab Research Foundation Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
ATE355375T1 (de) 1996-01-04 2006-03-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Bakterioferritin aus helicobacter pylori
FR2763244B1 (fr) 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
US20010016200A1 (en) * 1998-04-23 2001-08-23 Briles David E. Pneumococcal surface protein C (PspC), epitopic regions and strain selection thereof, and uses therefor
WO1999061056A2 (en) 1998-05-22 1999-12-02 Loeb Health Research Institute At The Ottawa Hospital Methods and products for inducing mucosal immunity
US6797275B1 (en) * 1998-12-04 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of immunizing humans against Salmonella typhi using a Vi-rEPA conjugate vaccine
DE60032120T2 (de) 1999-03-19 2007-09-20 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Impstoff gegen Streptococcus pneumoniae
GB9925559D0 (en) * 1999-10-28 1999-12-29 Smithkline Beecham Biolog Novel method
GB0108364D0 (en) * 2001-04-03 2001-05-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine composition
GB0022742D0 (en) * 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP2284181A1 (en) 2000-10-27 2011-02-16 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A and B
GB2370770B (en) * 2001-01-03 2005-06-01 Simon Connolly Uses of Streptococcus Vaccines
US7082569B2 (en) 2001-01-17 2006-07-25 Outlooksoft Corporation Systems and methods providing dynamic spreadsheet functionality
ES2544979T3 (es) 2001-01-23 2015-09-07 Sanofi Pasteur Inc. Vacuna de conjugado de polisacárido-CRM197 meningocócica tri- o tetravalente
DK1361890T3 (da) 2001-02-23 2011-06-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Influenzavaccineformuleringer til intradermal indgift
GB0107661D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Staphylococcus aureus
GB0107658D0 (en) 2001-03-27 2001-05-16 Chiron Spa Streptococcus pneumoniae
GB0109297D0 (en) * 2001-04-12 2001-05-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
US8481043B2 (en) 2001-06-22 2013-07-09 Cpex Pharmaceuticals, Inc. Nasal immunization
GB0118249D0 (en) 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
ES2312649T3 (es) 2001-12-12 2009-03-01 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Inmunizacion frente a chlamydia trachomatis.
GB0130215D0 (en) * 2001-12-18 2002-02-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US7501134B2 (en) 2002-02-20 2009-03-10 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules
GB0302218D0 (en) 2003-01-30 2003-03-05 Chiron Sri Vaccine formulation & Mucosal delivery
DE60328481D1 (de) * 2002-05-14 2009-09-03 Novartis Vaccines & Diagnostic Schleimhautapplizierter impfstoff, der das adjuvanz chitosan und menigokokkenantigene enthält
RU2378008C2 (ru) * 2002-05-14 2010-01-10 Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс С.Р.Л. Комбинированные вакцины против бактериального менингита для введения через слизистую оболочку
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
EP2353608B1 (en) 2002-10-11 2019-12-18 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Polypeptide-vaccines for broad protection against hypervirulent meningococcal lineages
EP2314604A3 (en) * 2002-10-15 2011-05-25 Intercell AG Nucleic acids coding for adhesion factors of group B streptococcus, adhesion factors of group B streptococcus and further uses thereof
AR041881A1 (es) 2002-11-01 2005-06-01 Glaxosmithkline Biolog Sa Procedimiento de secado para la obtencion de un liquido altamente viscoso que conserva la antigenicidad o actividad de una agente activo y vacuna obtenida a partir de el
BRPI0316018B8 (pt) 2002-11-12 2021-05-25 Brigham & Womens Hospital Inc vacina polissacarídica para infecções estafilocócicas
ATE466875T1 (de) 2002-11-15 2010-05-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Unerwartete oberflächenproteine in neisseria meningitidis
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
WO2004053104A2 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5’ cpg nucleic acids and methods of use
JP2006520746A (ja) 2002-12-27 2006-09-14 カイロン コーポレイション リン脂質を含む免疫原性組成物
FR2850106B1 (fr) * 2003-01-17 2005-02-25 Aventis Pasteur Conjugues obtenus par amination reductrice du polysaccharide capsulaire du pneumocoque de serotype 5
PT1587537E (pt) * 2003-01-30 2012-05-30 Novartis Ag Vacinas injetáveis contra múltiplos serogrupos meningocócicos
AU2004220590B2 (en) 2003-03-07 2010-02-18 Inhibitex, Inc. Polysaccharide - Staphylococcal surface adhesin carrier protein conjugates for immunization against nosocomial infections
NZ541969A (en) * 2003-03-13 2008-01-31 Glaxosmithkline Biolog Sa Purifying pneumolysin from Streptococcus pneumoniae in a single chromatographic step by binding it to a hydrophobic interaction column in the presence of detergent and high salt
ES2423800T3 (es) 2003-03-28 2013-09-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Uso de compuestos orgánicos para la inmunopotenciación
US9107831B2 (en) 2003-06-02 2015-08-18 Novartis Vaccines And Diagonstics, Inc. Immunogenic compositions containing microparticles comprising adsorbed toxoid and polysaccharide-containing antigens
EP2277538A1 (en) 2003-10-02 2011-01-26 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Combined meningitis vaccines
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
GB0406013D0 (en) 2004-03-17 2004-04-21 Chiron Srl Analysis of saccharide vaccines without interference
JP5718545B2 (ja) 2004-04-30 2015-05-13 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル 髄膜炎菌結合体ワクチン接種
GB0500787D0 (en) 2005-01-14 2005-02-23 Chiron Srl Integration of meningococcal conjugate vaccination
GB0409745D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Chiron Srl Compositions including unconjugated carrier proteins
US7444197B2 (en) * 2004-05-06 2008-10-28 Smp Logic Systems Llc Methods, systems, and software program for validation and monitoring of pharmaceutical manufacturing processes
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
GB0411387D0 (en) 2004-05-21 2004-06-23 Chiron Srl Analysis of saccharide length
GB0413868D0 (en) 2004-06-21 2004-07-21 Chiron Srl Dimensional anlaysis of saccharide conjugates
CA2571710A1 (en) 2004-06-24 2006-11-02 Nicholas Valiante Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
EP1765313A2 (en) 2004-06-24 2007-03-28 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Compounds for immunopotentiation
US20090317420A1 (en) 2004-07-29 2009-12-24 Chiron Corporation Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
GB0424092D0 (en) 2004-10-29 2004-12-01 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
HUE033196T2 (en) 2005-01-27 2017-11-28 Children's Hospital & Res Center At Oakland GNA1870-based vesicle vaccines for broad-spectrum protection against diseases caused by Neisseria meningitidis
GB0502095D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Conjugation of streptococcal capsular saccharides
US8062644B2 (en) 2005-02-18 2011-11-22 Novartis Vaccines & Diagnostics Srl. Immunogens from uropathogenic Escherichia coli
DK2351772T3 (en) 2005-02-18 2016-09-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Proteins and nucleic acids from meningitis / sepsis-associated Escherichia coli
GB0505518D0 (en) 2005-03-17 2005-04-27 Chiron Srl Combination vaccines with whole cell pertussis antigen
US20070184072A1 (en) * 2005-04-08 2007-08-09 Wyeth Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7955605B2 (en) 2005-04-08 2011-06-07 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
US7709001B2 (en) * 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
CN113198012A (zh) 2005-04-08 2021-08-03 惠氏有限责任公司 多价肺炎球菌多糖－蛋白质缀合物组合物
JP2008536515A (ja) 2005-04-18 2008-09-11 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド ワクチンの調製のためのｂ型肝炎ウイルス表面抗原の発現
EP2201961B1 (en) 2005-06-27 2018-01-24 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
JP5135220B2 (ja) 2005-09-01 2013-02-06 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス ゲーエムベーハー アンド カンパニー カーゲー 血清群ｃ髄膜炎菌を含む複数ワクチン接種
GB0522765D0 (en) 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
CA2630220C (en) 2005-11-22 2020-10-13 Doris Coit Norovirus and sapovirus antigens
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
TWI457133B (zh) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa 新穎組合物
NZ569076A (en) * 2005-12-22 2011-08-26 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine comprising capsular polysaccharides conjugates from Streptococcus pneumoniae serotypes 19A and 19F
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
MY150105A (en) * 2006-01-17 2013-11-29 Forsgren Arne A novel surface exposed haemophilus influenzae protein (protein e; pe)
CN101024079B (zh) * 2006-02-17 2012-02-01 福州昌晖生物工程有限公司 肺炎链球菌多糖-外膜蛋白结合疫苗及制备方法
KR101411425B1 (ko) * 2006-03-17 2014-06-24 더 거버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 에즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 오브 더 디파트먼트 오브 헬스 앤드 휴먼 서비시즈 복합 다가 면역원성 콘쥬게이트의 제조 방법
US10828361B2 (en) 2006-03-22 2020-11-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Regimens for immunisation with meningococcal conjugates
GB0605757D0 (en) 2006-03-22 2006-05-03 Chiron Srl Separation of conjugated and unconjugated components
ES2383209T3 (es) 2006-03-22 2012-06-19 Novartis Ag Regímenes para la inmunización con conjugados meningococicos
CA2646539A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
TWI494124B (zh) * 2006-03-30 2015-08-01 Glaxosmithkline Biolog Sa 免疫原組合物
MY148405A (en) * 2006-03-30 2013-04-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
US8808707B1 (en) 2006-05-08 2014-08-19 Wyeth Llc Pneumococcal dosing regimen
WO2009030978A2 (en) * 2006-06-09 2009-03-12 Novartis Ag Conformers of bacterial adhesins
GB0612854D0 (en) 2006-06-28 2006-08-09 Novartis Ag Saccharide analysis
CA2659552A1 (en) 2006-08-16 2008-02-21 Novartis Ag Immunogens from uropathogenic escherichia coli
KR101467002B1 (ko) * 2006-10-10 2014-12-01 와이어쓰 엘엘씨 스트렙토코쿠스 뉴모니애 제3형 다당류의 정제 방법
GB0700136D0 (en) 2007-01-04 2007-02-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Process for manufacturing vaccines
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
DK2167121T3 (en) * 2007-06-26 2015-11-23 Glaxosmithkline Biolog Sa A vaccine comprising Streptococcus pneumoniae kapselpolysaccharidkonjugater
GB0713880D0 (en) 2007-07-17 2007-08-29 Novartis Ag Conjugate purification
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
CN101969992B (zh) 2007-09-12 2014-10-01 诺华股份有限公司 Gas57突变型抗原和gas57抗体
PL2200642T3 (pl) 2007-10-19 2012-09-28 Novartis Ag Preparaty szczepionek meningokokowych
JP2011503104A (ja) 2007-11-09 2011-01-27 カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー 免疫調節化合物ならびに関連組成物および方法
US8815253B2 (en) 2007-12-07 2014-08-26 Novartis Ag Compositions for inducing immune responses
GB0818453D0 (en) 2008-10-08 2008-11-12 Novartis Ag Fermentation processes for cultivating streptococci and purification processes for obtaining cps therefrom
CA2709927C (en) 2007-12-21 2017-05-16 Novartis Ag Mutant forms of streptolysin o
WO2009094730A1 (en) * 2008-02-01 2009-08-06 Newcastle Innovation Limited Vaccine compositions
AU2009215364B2 (en) 2008-02-21 2014-09-18 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Meningococcal fHBP polypeptides
EP2265640B1 (en) 2008-03-10 2015-11-04 Children's Hospital & Research Center at Oakland Chimeric factor h binding proteins (fhbp) containing a heterologous b domain and methods of use
EP3312158A1 (en) 2008-07-21 2018-04-25 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Methods and compositions relating to synthetic beta-1,6 glucosamine oligosaccharides
DK2349520T3 (en) 2008-10-27 2016-08-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Purification Procedure for Group A Streptococcus Carbohydrate
DK2376108T3 (en) 2008-12-09 2017-04-24 Pfizer Vaccines Llc IgE CH3 peptide vaccine
GB0822633D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Formulation
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
WO2010070453A2 (en) 2008-12-17 2010-06-24 Novartis Ag Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
BRPI1005670A8 (pt) 2009-01-05 2017-12-26 Epitogenesis Inc composições adjuvantes e processos de uso.
MX2011007456A (es) 2009-01-12 2011-08-03 Novartis Ag Antigenos del dominio de proteina de superficie de union a colageno tipo b (can_b) en vacunas contra bacteria gram positiva.
RU2555757C2 (ru) 2009-03-24 2015-07-10 Новартис Аг Комбинации менингококкового фактор н-связывающего белка и пневмококковых сахаридных конъюгатов
EP2411048B1 (en) 2009-03-24 2020-05-06 GlaxoSmithKline Biologicals SA Adjuvanting meningococcal factor h binding protein
ES2565377T3 (es) 2009-04-14 2016-04-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composiciones para inmunización contra Staphylococcus aureus
WO2010132833A1 (en) 2009-05-14 2010-11-18 The Regents Of The University Of Michigan Streptococcus vaccine compositions and methods of using the same
EP3461496B1 (en) 2009-06-22 2023-08-23 Wyeth LLC Compositions and methods for preparing staphylococcus aureus serotype 5 and 8 capsular polysaccharide conjugate immunogenic compositions
SG10201707084SA (en) 2009-06-22 2017-10-30 Wyeth Llc Immunogenic compositions of staphylococcus aureus antigens
WO2011017101A2 (en) * 2009-07-27 2011-02-10 Fina Biosolutions, Llc Method for producing protein-carbohydrate vaccines reduced in free carbohydrate
WO2011013034A1 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Pfizer Vaccines Llc Antigenic tau peptides and uses thereof
CA2772104A1 (en) 2009-08-27 2011-03-03 Novartis Ag Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences
RU2538162C2 (ru) 2009-09-03 2015-01-10 Пфайзер Вэксинс ЭлЭлСи Вакцина против pcsk9
KR20120081587A (ko) 2009-09-10 2012-07-19 노파르티스 아게 기도 질병에 대한 조합 백신
JP5960055B2 (ja) 2009-10-27 2016-08-02 ノバルティス アーゲー 改変髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチド
CN102971009A (zh) 2009-10-30 2013-03-13 诺华有限公司 金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的纯化
GB0919690D0 (en) 2009-11-10 2009-12-23 Guy S And St Thomas S Nhs Foun compositions for immunising against staphylococcus aureus
KR101427862B1 (ko) 2009-12-17 2014-08-07 피나 바이오솔루션스, 엘엘씨 접합 백신 제조시 다당류를 활성화시키기 위한 화학 시약
JP6007105B2 (ja) 2009-12-22 2016-10-12 セルデックス・セラピューティクス・インコーポレイテッド ワクチン組成物
GB201003333D0 (en) 2010-02-26 2010-04-14 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
GB201003922D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
TR201802933T4 (tr) 2010-03-30 2018-03-21 Childrens Hospital & Res Center At Oakland Özellikleri değiştirilmiş faktör h bağlama proteinleri (fhbp) ve bunların kullanım yöntemi.
GB201005625D0 (en) 2010-04-01 2010-05-19 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
WO2011127302A2 (en) 2010-04-07 2011-10-13 Yue Shen Vehicle for delivering a compound to a mucous membrane and related compositions, methods and systems
EP2571982A4 (en) * 2010-05-20 2014-01-01 California Inst Of Techn ANTIGEN-SPECIFIC TREGS AND CORRESPONDING COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS
KR20130121699A (ko) 2010-05-28 2013-11-06 테트리스 온라인, 인코포레이티드 상호작용 혼성 비동기 컴퓨터 게임 기반구조
PT3170508T (pt) * 2010-06-04 2020-01-16 Wyeth Llc Formulações de vacinas
CA2800774A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Vaccines Llc Ige ch3 peptide vaccine
EP2576613A1 (en) 2010-06-07 2013-04-10 Pfizer Inc. Her-2 peptides and vaccines
US10478483B2 (en) 2010-06-25 2019-11-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Combinations of meningococcal factor H binding proteins
GB201101665D0 (en) 2011-01-31 2011-03-16 Novartis Ag Immunogenic compositions
WO2012085668A2 (en) 2010-12-24 2012-06-28 Novartis Ag Compounds
EP2667852B1 (en) 2011-01-27 2016-11-09 GlaxoSmithKline Biologicals SA Adjuvant nanoemulsions with crystallisation inhibitors
AU2012222883A1 (en) 2011-03-02 2013-10-17 Novartis Ag Combination vaccines with lower doses of antigen and/or adjuvant
GB201103836D0 (en) 2011-03-07 2011-04-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
ES2785108T3 (es) 2011-03-24 2020-10-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nanoemulsiones adyuvantes con fosfolípidos
EP2511295A1 (en) 2011-04-15 2012-10-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Compositions for preventing and/or treating an infection by an HIV-1 virus
US20130203980A1 (en) 2011-05-06 2013-08-08 Petr Gennadievich Aparin Exopolysaccharide of shigella sonnei bacteria, method for producing same, vaccine and pharmaceutical composition containing same
EP2723378A4 (en) 2011-06-24 2015-01-28 Epitogenesis Inc PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS COMPRISING A COMBINATION OF VECTORS, VITAMINS, TANNINS AND FLAVONOIDS SELECTED AS ANTIGEN-SPECIFIC IMMUNOMODULATORS
JP6088507B2 (ja) 2011-07-08 2017-03-01 ノバルティス アーゲー チロシンライゲーションの方法
GB201114923D0 (en) 2011-08-30 2011-10-12 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
ES2732708T3 (es) 2011-09-14 2019-11-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos de fabricación de glucoconjugados de sacárido-proteína
WO2013043518A1 (en) 2011-09-22 2013-03-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Imidazopyridyl compounds as aldosterone synthase inhibitors
CA2854934A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Novartis Ag Carrier molecule comprising a spr0096 and a spr2021 antigen
EP2592137A1 (en) 2011-11-11 2013-05-15 Novartis AG Fermentation media free of animal-derived components for production of diphtheria toxoids suitable for human vaccine use
DE102011122891B4 (de) 2011-11-11 2014-12-24 Novartis Ag Fermentationsmedium, das frei von tierischen Bestandteilen ist, zur Herstellung von Diphtherie-Toxoiden zur Verwendung bei der Impfung von Menschen
GB2495341B (en) 2011-11-11 2013-09-18 Novartis Ag Fermentation methods and their products
DE102011118371B4 (de) 2011-11-11 2014-02-13 Novartis Ag Zur Impfung von Menschen geeignete Zusammensetzung, die ein Diphtherie-Toxoid umfasst, sowie Verfahren zu deren Herstellung
BR112014013876A2 (pt) 2011-12-08 2019-09-24 Novartis Ag vacina à base de toxina de clostridium difficile
GB201121301D0 (en) 2011-12-12 2012-01-25 Novartis Ag Method
AU2011384634A1 (en) 2011-12-29 2014-06-19 Novartis Ag Adjuvanted combinations of meningococcal factor H binding proteins
WO2013124473A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Novartis Ag Pilus proteins and compositions
US20150132339A1 (en) 2012-03-07 2015-05-14 Novartis Ag Adjuvanted formulations of streptococcus pneumoniae antigens
US20150125486A1 (en) 2012-03-08 2015-05-07 Novartis Ag Adjuvanted formulations of pediatric antigens
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
US10279026B2 (en) 2012-04-26 2019-05-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigens and antigen combinations
EP3804749A3 (en) 2012-04-26 2021-07-28 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Antigens and antigen combinations
CN104284674A (zh) 2012-05-04 2015-01-14 辉瑞公司 前列腺相关抗原及基于疫苗的免疫治疗疗法
US10124051B2 (en) 2012-05-22 2018-11-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Meningococcus serogroup X conjugate
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
WO2014037472A1 (en) 2012-09-06 2014-03-13 Novartis Ag Combination vaccines with serogroup b meningococcus and d/t/p
AR092896A1 (es) 2012-10-03 2015-05-06 Novartis Ag Composiciones inmunogenicas
BR112015008040A2 (pt) 2012-10-12 2017-07-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa composição de vacina, vacina de combinação, e, processos para preparar um componente ap e para a fabricação de uma composição de vacina
CA2888300A1 (en) * 2012-10-17 2014-04-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
US20140193451A1 (en) * 2012-10-17 2014-07-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic composition
KR20140075196A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075201A (ko) * 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
BR112015018014A2 (pt) 2013-02-01 2017-07-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa liberação intradérmica de composições imunológicas compreendendo agonistas do receptor do tipo toll
EP2994161B1 (en) 2013-05-10 2020-10-28 California Institute of Technology Probiotic prevention and treatment of colon cancer
EP3689375A1 (en) 2013-05-15 2020-08-05 The Governors Of The University Of Alberta E1e2 hcv vaccines and methods of use
CN103386126B (zh) * 2013-06-25 2015-06-17 北京科兴生物制品有限公司 一种含肠道病毒抗原的多价免疫原性组合物
KR20180099912A (ko) 2013-09-08 2018-09-05 화이자 인코포레이티드 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
US11708411B2 (en) 2013-12-20 2023-07-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
PT3096783T (pt) * 2014-01-21 2021-08-16 Pfizer Polissacáridos capsulares de streptococcus pneumoniae e conjugados dos mesmos
ES2820824T3 (es) 2014-01-21 2021-04-22 Pfizer Composiciones inmunogénicas que comprenden antígenos sacáridos capsulares conjugados y usos de las mismas
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP3104877B1 (en) 2014-02-11 2020-01-22 The USA, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Pcsk9 vaccine and methods of using the same
EA034954B1 (ru) 2014-02-28 2020-04-10 Глаксосмитклайн Байолоджикалс Са МОДИФИЦИРОВАННЫЕ МЕНИНГОКОККОВЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ fHbp
EP2921856B1 (en) * 2014-03-18 2016-09-14 Serum Institute Of India Private Limited A quantitative assay for 4-pyrrolidinopyridine (4-ppy) in polysaccharide-protein conjugate vaccines
CN104829711B (zh) * 2014-04-08 2018-04-03 北京天成新脉生物技术有限公司 脑膜炎球菌荚膜多糖单克隆抗体及其应用
NZ729206A (en) 2014-07-23 2022-07-01 Children’S Hospital & Res Center At Oakland Factor h binding protein variants and methods of use thereof
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
EP3034516A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Novartis AG Purification of streptococcal capsular polysaccharide
US10653764B2 (en) 2015-01-15 2020-05-19 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
CN104548090B (zh) * 2015-01-27 2016-11-30 中国科学院过程工程研究所 一种β-葡聚糖修饰的脑膜炎多糖结合疫苗及其制备方法
WO2016184963A1 (en) 2015-05-19 2016-11-24 Innavirvax Treatment of hiv-infected individuals
US11331335B2 (en) 2015-06-10 2022-05-17 California Institute Of Technology Sepsis treatment and related compositions methods and systems
EP3109255A1 (en) 2015-06-26 2016-12-28 Institut National De La Recherche Agronomique Immunogenic composition
CN107849119A (zh) 2015-07-07 2018-03-27 阿费里斯股份公司 用于治疗和预防IgE介导的疾病的疫苗
MX2018000867A (es) 2015-07-21 2018-05-15 Pfizer Composiciones inmunogenas que comprenden antigenos de sacarido capsular conjugados, kits que las comprenden y sus usos.
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
JP6884145B2 (ja) 2015-11-20 2021-06-09 ファイザー・インク 肺炎連鎖球菌ワクチンにおいて用いるための免疫原性組成物
CU20210061A7 (es) 2015-12-04 2022-02-04 Dana Farber Cancer Inst Inc Composición vacunal que comprende el dominio alfa 3 de mica/b para el tratamiento del cáncer
RU2718663C2 (ru) 2016-01-19 2020-04-13 Пфайзер Инк. Противораковые вакцины
US11612664B2 (en) 2016-04-05 2023-03-28 Gsk Vaccines S.R.L. Immunogenic compositions
WO2017220753A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
JP7001686B2 (ja) 2016-08-05 2022-02-04 サノフィ パスツール インコーポレイティッド 多価肺炎球菌多糖体－タンパク質コンジュゲート組成物
JP7001687B2 (ja) 2016-08-05 2022-02-04 サノフィ パスツール インコーポレイティッド 多価肺炎球菌多糖体－タンパク質コンジュゲート組成物
AU2017321039B2 (en) 2016-09-02 2021-03-18 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccines for Neisseria gonorrhoeae
WO2018065625A2 (en) 2016-10-07 2018-04-12 Enterome Immunogenic compounds for cancer therapy
JP7116278B2 (ja) 2016-10-07 2022-08-10 エンテローム エスエー 癌治療のための免疫原性化合物
BE1025162B9 (fr) 2016-12-06 2019-01-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procede de purification pour les polysaccharides capsulaires
EP3570879B1 (en) 2017-01-20 2022-03-30 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
AU2018215585B2 (en) 2017-01-31 2022-03-17 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection
CN110520154B (zh) * 2017-03-15 2023-08-04 株式会社Lg化学 多价肺炎链球菌疫苗组合物
BR112019020209A2 (pt) 2017-03-31 2020-06-02 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Composição imunogênica, uso de uma composição imunogênica, método de tratamento ou prevenção de uma recorrência de uma exacerbação aguda de doença pulmonar obstrutiva crônica, e, terapia de combinação.
WO2018178265A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Immunogenic composition, use and method of treatment
US10729763B2 (en) 2017-06-10 2020-08-04 Inventprise, Llc Mixtures of polysaccharide-protein pegylated compounds
AU2018280272C1 (en) 2017-06-10 2021-05-06 Inventprise, Inc. Multivalent conjugate vaccines with bivalent or multivalent conjugate polysaccharides that provide improved immunogenicity and avidity
BR112020001768A2 (pt) 2017-08-14 2020-09-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. método de reforçar uma resposta imune pré-existente contra haemophilus influenzae e moraxella catarrhalis não tipáveis em um indivíduo, e, protocolo de vacinação.
BR122021023687A8 (pt) 2017-12-06 2023-02-07 Merck Sharp & Dohme Usos de composições imunogênicas multivalentes compreendendo conjugados de proteína carreadora e polissacarídeo de s. pneumoniae
IL276230B2 (en) 2018-02-05 2024-01-01 Sanofi Pasteur Inc A multivalent pneumococcal protein-polysaccharide conjugate preparation
WO2019152921A1 (en) 2018-02-05 2019-08-08 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
WO2019173438A1 (en) 2018-03-06 2019-09-12 Stc. Unm Compositions and methods for reducing serum triglycerides
CN112118863A (zh) 2018-04-11 2020-12-22 恩特罗姆公司 用于预防和治疗癌症的抗原肽
US20210106652A1 (en) 2018-04-11 2021-04-15 Enterome S.A. Immunogenic Compounds For Treatment Of Fibrosis, Autoimmune Diseases And Inflammation
TW202011985A (zh) 2018-04-18 2020-04-01 韓商Ｓｋ生物科學股份有限公司 肺炎鏈球菌的莢膜多醣類以及其免疫原性接合體
MX2021000548A (es) 2018-07-19 2021-07-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procesos para preparar polisacáridos en seco.
CA3107077A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Processes and vaccines
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CA3120922A1 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Pfizer Inc. Immunogenic multiple hetero-antigen polysaccharide-protein conjugates and uses thereof
JP2022513458A (ja) 2018-12-12 2022-02-08 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｏ－結合型グリコシル化のための修飾キャリアタンパク質
US20220296695A1 (en) 2018-12-19 2022-09-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Compositions comprising streptococcus pneumoniae polysaccharide-protein conjugates and methods of use thereof
CA3129425A1 (en) 2019-02-11 2020-08-20 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
JP7239509B6 (ja) 2019-02-22 2023-03-28 ファイザー・インク 細菌多糖類を精製するための方法
US20220184199A1 (en) 2019-04-10 2022-06-16 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
US20220221455A1 (en) 2019-04-18 2022-07-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigen binding proteins and assays
MX2021013736A (es) 2019-05-10 2021-12-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Produccion de conjugados.
WO2021023692A1 (en) 2019-08-05 2021-02-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Process for preparing a composition comprising a protein d polypeptide
JP2022543281A (ja) 2019-08-05 2022-10-11 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組成物
EP4034157A1 (en) 2019-09-27 2022-08-03 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
WO2021074389A1 (en) 2019-10-16 2021-04-22 Enterome S.A. Immunogenic compounds for treatment of adrenal cancer
IL292494A (en) 2019-11-01 2022-06-01 Pfizer Preparations of Escherichia coli and their methods
FI4021487T3 (fi) 2019-11-15 2024-02-06 Enterome S A Antigeenisiä peptidejä b-solun pahanlaatuisuuden ehkäisyyn ja hoitoon
EP4061412A1 (en) 2019-11-22 2022-09-28 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Dosage and administration of a bacterial saccharide glycoconjugate vaccine
US20220409539A1 (en) * 2019-12-30 2022-12-29 Fraunhofer Usa Inc. Particles for multi-dose delivery
WO2021165847A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pfizer Inc. Purification of saccharides
CA3173729A1 (en) 2020-02-23 2021-08-26 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CN111588847B (zh) * 2020-05-18 2023-05-26 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种含有单磷酸化的脂质a与糖抗原的缀合物及其制备方法和应用
EP4165064A2 (en) 2020-06-12 2023-04-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Dock tag system
PE20231934A1 (es) 2020-10-27 2023-12-01 Pfizer Composiciones de escherichia coli y metodos de las mismas
MX2023005221A (es) 2020-11-04 2023-05-16 Pfizer Composiciones inmunogenicas para uso en vacunas neumococicas.
EP4243863A2 (en) 2020-11-10 2023-09-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US20220202923A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. E. coli fimh mutants and uses thereof
US20220265805A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Sanofi Pasteur Inc. Meningococcal b recombinant vaccine
JP2024510717A (ja) 2021-02-22 2024-03-11 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組成物、使用及び方法
EP4070814A1 (en) 2021-04-07 2022-10-12 Lama France Sars-cov-2 polypeptides and uses thereof
US20220387613A1 (en) 2021-05-28 2022-12-08 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
EP4346893A2 (en) 2021-05-28 2024-04-10 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2023092090A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Matrivax, Inc. Immunogenic fusion protein compositions and methods of use thereof
WO2023135515A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
KR20230116601A (ko) 2022-01-28 2023-08-04 이동민 머신 좌표계와 영상 좌표계의 정합 방법 및 장치
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
WO2023187127A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Enterome S.A. Antigenic peptides for prevention and treatment of cancer
WO2023218322A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. Process for producing of vaccine formulations with preservatives

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4372945A (en) 1979-11-13 1983-02-08 Likhite Vilas V Antigen compounds
IL61904A (en) 1981-01-13 1985-07-31 Yeda Res & Dev Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same
BE889979A (fr) 1981-08-14 1982-02-15 Smith Kline Rit Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation
US5360897A (en) * 1981-08-31 1994-11-01 The University Of Rochester Immunogenic conjugates of streptococcus pneumonial capsular polymer and toxin or in toxiad
US4761283A (en) * 1983-07-05 1988-08-02 The University Of Rochester Immunogenic conjugates
US4882317A (en) * 1984-05-10 1989-11-21 Merck & Co., Inc. Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency
US5173294A (en) 1986-11-18 1992-12-22 Research Foundation Of State University Of New York Dna probe for the identification of haemophilus influenzae
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
WO1990006951A1 (en) * 1988-12-16 1990-06-28 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
NZ239643A (en) * 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
CA2059692C (en) * 1991-01-28 2004-11-16 Peter J. Kniskern Pneumoccoccal polysaccharide conjugate vaccine
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
US5552146A (en) 1991-08-15 1996-09-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions relating to useful antigens of Moraxella catarrhalis
RU2118164C1 (ru) 1992-06-25 1998-08-27 Смитклайн Бичам Байолоджикалс, С.А. Вакцинная композиция, обладающая свойством вызывать цитолитический т-клеточный ответ у млекопитающих, способ получения цитолитического т-клеточного ответа in vivo, способ получения вакцины
ATE211654T1 (de) * 1992-09-16 2002-01-15 Univ Tennessee Res Corp Antigene des hybriden m-proteins und träger für gruppe a streptokokkenimpfstoff
AU685443B2 (en) 1993-03-23 1998-01-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccine compositions containing 3-O deacylated monophosphoryl lipid A
EP0699076B1 (en) 1993-05-18 2002-10-30 The Ohio State University Research Foundation Otitis media vaccine
ES2210262T3 (es) 1993-09-22 2004-07-01 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Procedimiento que permite activar un glucido soluble con la ayuda de nuevos reactivos cianilantes para producir estructuras inmunogenas.
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5866135A (en) * 1994-04-21 1999-02-02 North American Vaccine, Inc. Group A streptococcal polysaccharide immunogenic compositions and methods
ES2366201T3 (es) 1994-07-15 2011-10-18 University Of Iowa Research Foundation Oligonucleótidos inmunmoduladores.
US5565204A (en) * 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
US5681570A (en) * 1995-01-12 1997-10-28 Connaught Laboratories Limited Immunogenic conjugate molecules
KR19990007858A (ko) * 1995-04-17 1999-01-25 존 더블유.로우 박테리아의 리포프로테인으로 폴리사카라이드에 대한 면역반응의 유도및 강화
UA56132C2 (uk) * 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5736533A (en) * 1995-06-07 1998-04-07 Neose Technologies, Inc. Bacterial inhibition with an oligosaccharide compound
DE69637597D1 (de) 1995-06-07 2008-08-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vakzine mit einem Polysaccharide Antigen-Trägerprotein Konjugat und freiem Trägerprotein
AP9701163A0 (en) 1995-06-07 1998-01-31 Biochem Vaccines Inc Streptococcal heat shock proteins members of the HSP70 family.
GB9513074D0 (en) 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
US6290970B1 (en) 1995-10-11 2001-09-18 Aventis Pasteur Limited Transferrin receptor protein of Moraxella
US6090576A (en) 1996-03-08 2000-07-18 Connaught Laboratories Limited DNA encoding a transferrin receptor of Moraxella
SE9601158D0 (sv) 1996-03-26 1996-03-26 Stefan Svenson Method of producing immunogenic products and vaccines
US6245335B1 (en) * 1996-05-01 2001-06-12 The Rockefeller University Choline binding proteins for anti-pneumococcal vaccines
JP2000511411A (ja) 1996-05-01 2000-09-05 ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ 抗―肺炎球菌ワクチン用のコリン結合タンパク質
US7341727B1 (en) 1996-05-03 2008-03-11 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. M. catarrhalis outer membrane protein-106 polypeptide, methods of eliciting an immune response comprising same
JPH102001A (ja) * 1996-06-15 1998-01-06 Okajima Kogyo Kk グレーチング
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
FR2763244B1 (fr) * 1997-05-14 2003-08-01 Pasteur Merieux Serums Vacc Composition vaccinale multivalente a porteur mixte
ATE380867T1 (de) 1997-06-03 2007-12-15 Sanofi Pasteur Ltd Lactoferrinrezeptorgen von moraxella
WO1999003884A2 (en) 1997-07-21 1999-01-28 North American Vaccine, Inc. Modified immunogenic pneumolysin, compositions and their use as vaccines
US6224880B1 (en) * 1997-09-24 2001-05-01 Merck & Co., Inc. Immunization against Streptococcus pneumoniae using conjugated and unconjugated pneumoccocal polysaccharide vaccines
US20050031638A1 (en) * 1997-12-24 2005-02-10 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine
GB9727262D0 (en) * 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6709658B1 (en) * 1998-02-12 2004-03-23 Wyeth Holdings Corporation Pneumococcal vaccines formulated with interleukin-12
WO1999051266A2 (en) 1998-04-07 1999-10-14 Medimmune, Inc. Derivatives of pneumococcal choline binding proteins for vaccines
GB9812613D0 (en) 1998-06-11 1998-08-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
NZ509986A (en) 1998-08-19 2003-10-31 Baxter Healthcare S Immunogenic beta-propionamido-linked polysaccharide and oligosaccharide protein conjugates as vaccines
EP2050464B1 (en) * 1998-12-21 2019-08-07 Medimmune, Inc. Streptococcus pneumoniae proteins and immunogenic fragments for vaccines
DE60032120T2 (de) * 1999-03-19 2007-09-20 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Impstoff gegen Streptococcus pneumoniae
GB9909077D0 (en) * 1999-04-20 1999-06-16 Smithkline Beecham Biolog Novel compositions
GB0022742D0 (en) * 2000-09-15 2000-11-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
CN201252175Y (zh) * 2008-08-04 2009-06-03 富士康(昆山)电脑接插件有限公司 线缆连接器组件

Also Published As

Publication number Publication date
NL300415I1 (nl) 2009-12-01
NO330532B1 (no) 2011-05-09
AU750762B2 (en) 2002-07-25
NO20014322D0 (no) 2001-09-05
ES2275499T3 (es) 2007-06-16
EP1163000A2 (en) 2001-12-19
CY1107390T1 (el) 2010-07-28
EP1880735A3 (en) 2008-03-12
MY125387A (en) 2006-07-31
JP2002540075A (ja) 2002-11-26
CY1107561T1 (el) 2013-03-13
WO2000056359A2 (en) 2000-09-28
JP2002539273A (ja) 2002-11-19
HU228499B1 (en) 2013-03-28
KR20020000785A (ko) 2002-01-05
PL355178A1 (en) 2004-04-05
CA2365296A1 (en) 2000-09-28
IL145045A0 (en) 2002-06-30
AU750913B2 (en) 2002-08-01
HUS1500040I1 (hu) 2018-05-28
CY2009014I2 (el) 2010-07-28
PL204890B1 (pl) 2010-02-26
PT1163000E (pt) 2008-03-20
US20100291138A1 (en) 2010-11-18
HK1043728B (zh) 2007-06-22
AR022963A1 (es) 2002-09-04
MY125202A (en) 2006-07-31
PL355264A1 (en) 2004-04-05
CN1391481A (zh) 2003-01-15
JP2002540074A (ja) 2002-11-26
ATE387214T1 (de) 2008-03-15
TWI235064B (en) 2005-07-01
TWI286938B (en) 2007-09-21
DE60038166T2 (de) 2009-03-12
CZ301445B6 (cs) 2010-03-03
AU750788B2 (en) 2002-07-25
US20100119544A1 (en) 2010-05-13
WO2000056360A3 (en) 2001-01-25
TR200102736T2 (tr) 2002-04-22
NO20014325D0 (no) 2001-09-05
HUP0200373A2 (en) 2002-06-29
HU229968B1 (hu) 2015-03-30
IL145044A (en) 2007-03-08
US8926985B2 (en) 2015-01-06
CY2009014I1 (el) 2010-07-28
PT1162999E (pt) 2007-02-28
US20060002961A1 (en) 2006-01-05
WO2000056360A2 (en) 2000-09-28
EP1776962A1 (en) 2007-04-25
AU3430700A (en) 2000-10-09
IL145043A (en) 2007-06-17
US20060093626A1 (en) 2006-05-04
BR0009163A (pt) 2001-12-26
CZ303653B6 (cs) 2013-01-30
EP1162998A2 (en) 2001-12-19
EP2277535A2 (en) 2011-01-26
CA2366152A1 (en) 2000-09-28
CN100339130C (zh) 2007-09-26
ATE459373T1 (de) 2010-03-15
PL203917B1 (pl) 2009-11-30
CA2366314C (en) 2012-01-10
US20050031646A1 (en) 2005-02-10
JP2011057713A (ja) 2011-03-24
DE60038166D1 (de) 2008-04-10
CN1351503A (zh) 2002-05-29
DE60043930D1 (de) 2010-04-15
US9168313B2 (en) 2015-10-27
NZ513841A (en) 2001-09-28
CA2366314A1 (en) 2000-09-28
AU3813600A (en) 2000-10-09
EP1880735A2 (en) 2008-01-23
NO20014322L (no) 2001-11-14
HK1043728A1 (en) 2002-09-27
NO20014323D0 (no) 2001-09-05
DE122009000054I1 (de) 2009-12-31
LU91652I2 (fr) 2010-10-13
HK1043731A1 (en) 2002-09-27
AR022964A1 (es) 2002-09-04
US20030147922A1 (en) 2003-08-07
CN1192798C (zh) 2005-03-16
TR200102739T2 (tr) 2001-12-21
NO2011014I2 (no) 2011-08-30
ATE346608T1 (de) 2006-12-15
SI1162999T1 (sl) 2007-04-30
US20110217329A1 (en) 2011-09-08
DK1162999T3 (da) 2007-03-26
EP1162998B1 (en) 2010-03-03
ES2300255T3 (es) 2008-06-16
BRPI0009163B8 (pt) 2021-05-25
JP5551579B2 (ja) 2014-07-16
WO2000056358A3 (en) 2001-01-04
NZ513842A (en) 2004-05-28
KR100642044B1 (ko) 2006-11-10
DE60032120T2 (de) 2007-09-20
WO2000056358A2 (en) 2000-09-28
DK1163000T3 (da) 2008-04-28
TWI281403B (en) 2007-05-21
BRPI0009163B1 (pt) 2019-04-09
AR022965A1 (es) 2002-09-04
NO2011014I1 (no) 2011-09-19
EP2277535A3 (en) 2011-03-09
NO330736B1 (no) 2011-06-27
SI1163000T1 (sl) 2008-06-30
IL145043A0 (en) 2002-06-30
EP1162999B1 (en) 2006-11-29
MXPA01009452A (es) 2002-08-06
CN1351501A (zh) 2002-05-29
NL300415I2 (cs) 2016-12-13
KR100798212B1 (ko) 2008-01-24
LU91652I9 (cs) 2019-01-03
BR0009166A (pt) 2001-12-26
WO2000056359A3 (en) 2001-02-01
TR200102735T2 (tr) 2002-04-22
KR20020000549A (ko) 2002-01-05
JP4846906B2 (ja) 2011-12-28
CZ20013378A3 (cs) 2002-03-13
NO20014325L (no) 2001-11-14
HK1043730A1 (zh) 2002-09-27
HK1043731B (zh) 2009-01-23
FR10C0008I2 (fr) 2012-10-26
EP1162999A2 (en) 2001-12-19
IL145044A0 (en) 2002-06-30
AU3291900A (en) 2000-10-09
FR10C0008I1 (fr) 2010-03-26
CZ20013379A3 (cs) 2002-03-13
CN1191852C (zh) 2005-03-09
HUP0200367A2 (en) 2002-05-29
PL355180A1 (en) 2004-04-05
NO20014323L (no) 2001-11-14
US20150079125A1 (en) 2015-03-19
NZ513840A (en) 2004-02-27
DE60032120D1 (de) 2007-01-11
ES2339737T3 (es) 2010-05-25
EP1163000B1 (en) 2008-02-27
BE1025464I2 (cs) 2019-03-06
BR0009154A (pt) 2001-12-26
KR20020001785A (ko) 2002-01-09
HUP0200664A2 (en) 2002-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9168313B2 (en) Vaccine
ZA200107638B (en) Vaccine.
US20150079129A1 (en) Vaccine
MXPA01009459A (es) Vacuna
MXPA01009455A (en) Vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20200317