CN101024079B - 肺炎链球菌多糖-外膜蛋白结合疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

肺炎链球菌多糖-外膜蛋白结合疫苗及制备方法，属于肺炎链球菌疫苗领域。本疫苗的主要抗原成分是由肺炎链球菌产生的荚膜多糖与其外膜蛋白经共价连接而得到的肺炎链球菌荚膜多糖—外膜蛋白结合物。荚膜多糖是一种或多种肺炎链球菌的荚膜多糖，其分子量约为200—500KDa，每个多糖分子约有大约300-700个重复单位。外膜蛋白是一种或多种肺炎链球菌的外膜蛋白，其分子量约为30—100Kda。该疫苗用以预防或治疗肺炎链球菌诱发的疾病。

Description

肺炎链球菌多糖-外膜蛋白结合疫苗及制备方法

技术领域

本发明属于肺炎链球菌疫苗，尤其涉及一种新型的肺炎链球菌荚膜多糖-外膜蛋白结合物及其制备方法。 

背景技术

肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)又名肺炎双球菌，属链球菌属。肺炎链球菌可引起多种疾病，流行范围广，主要引起大叶性肺炎，还可引起脑膜炎、中耳炎、胸膜炎、心内膜炎、败血症等多种疾病。在正常人的口腔和鼻咽腔内，此菌经常存在，形成带菌状态，在机体抵抗力下降时引起疾病，尤其是老年人、免疫缺陷或免疫力低下的人群。 

在我国的获得性肺炎患者中，肺炎链球菌导致的肺炎可达46％-76％，学龄前儿童，特别是2岁以下的婴幼儿，由肺炎球菌导致的菌血症和脑膜炎发病率高。我国肺炎球菌引起感染的疾病中，肺炎占37.8％，脑膜炎占33.2％，中耳炎占29.0％。 

目前已发现的肺炎链球菌有84个血清型，仅部分型别与人类疾病有关。WHO曾组织全球性的肺炎链球菌型别鉴别。常见的肺炎链球菌型为1、2、3、4、5、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F等23种，但具有一定的地区分布特点。美国流行菌型按检出率排列为14、4、1、6B、3、8、7F、23F、18C、19F、9V、12F、19A、9N、5、22F、20、33F、15B、1OA、11A、17F、2。日本流行菌株以3型居多，其次19F、23F、6B、14、11A、19A、9V、22F、18C、4、15B等。中国台湾14型居多，其次为19F、23F、6B、3、4、9V、11A、19A等。中国大陆菌株以5型最多，其次为6B、1、19F、 23F、14、2、3型。 

肺炎链球菌最主要的表面抗原是其特异型荚膜多糖。各亚型肺炎链球菌荚膜多糖的分子结构均不相同。以某种肺炎链球菌的荚膜多糖作为抗原，所产生的抗体对其他型的肺炎链球菌的交叉反应很小，或可忽略。因此为了获得较好的、对23种肺炎链球菌导致的疾病的预防效果，以多糖为抗原的肺炎链球菌疫苗必须是23种亚型肺炎链球菌的荚膜多糖的混合物。1983年美国FDA批准使用的肺炎链球菌23价多糖疫苗就是由23种肺炎链球菌的荚膜多糖的混合物，每种多糖含量为25ug，总抗原量为575ug，注射剂量0.5ml。23价多糖疫苗所涉及的23种菌型，其临床发病率在美国和欧洲覆盖率为88.2％，在中国为79.9％。 

23价多糖疫苗对于成年人能够有效地产生保护性免疫应答，但对于老年人、2岁以下的婴幼儿及B细胞免疫缺陷的人群，多糖疫苗的免疫作用很差。多糖是T细胞不依赖性抗原，对于小于2岁的婴幼儿，因其细胞发育不完全，对非T细胞依赖性的多糖抗原只能产生有限的抗体应答，因而多糖疫苗对于2岁以下的婴幼儿诱导的免疫保护作用很低，且没有免疫记忆反应。因此，研发新型的具有蛋白载体的肺炎链球菌疫苗是十分必要的。 

美国Wyeth-Lederle公司研制出肺炎链球菌结合疫苗，其接种对象为两岁以下的婴幼儿。国外MSD、WLVP、PMC和DNC四大制药公司对肺炎链球菌结合疫苗也进行了大量研究。 

目前国内外的大量研究是用肺炎链球菌荚膜多糖(Pneumococcal Polysa-ccharide，Pn-Ps)与白喉类毒素、破伤风类毒素、或脑膜炎球菌外膜蛋白等免疫蛋白交联制备成多糖-蛋白结合物。当采用上述免疫蛋白作为蛋白载体时，针对结合物中蛋白载体的抗体对于预防肺炎链球菌是无效的，只有针对结合物中肺炎链球菌荚膜多糖的特异性抗体才是希望得到的有效抗体。已有报道，上述免疫蛋白作为蛋白载体时，对结合物中肺炎链球菌荚膜多糖的特异性抗体的诱导作用表现不一(Vaccine2001，19：1159-1166；Infection And Immunity1999，67(9)：4862-4869)。 

肺炎链球菌外膜蛋白(Pneumococcal Outer Membrance Protein complex，Pn-OMPC)是分布于细菌外膜中的蛋白质，具有免疫原性。将肺炎链球菌外膜蛋白作为结合物的蛋白载体，不仅可增强体液免疫，而且对细胞免疫亦有刺激作用。作为蛋白载体的外膜蛋白也是抗原的组成成分，因肺炎链球菌的外膜蛋白具有保守的组成结构，可获得较为广泛的交叉反应效果。 

本发明利用化学手段将肺炎链球菌荚膜多糖与其外膜蛋白交联成为多糖-蛋白结合疫苗。该多糖-蛋白结合疫苗的优势在于：①激发机体的细胞免疫作用；②增强2岁以下儿童和老人的体液免疫效果；③增强抗体的交叉反应作用，简化疫苗的制备过程。 

发明内容

本发明提供一种新型的肺炎链球菌结合疫苗。该疫苗的主要抗原成分是肺炎链球菌荚膜多糖与其外膜蛋白经共价连接而得到的肺炎链球菌荚膜多糖—外膜蛋白结合物。该疫苗可以用于预防或治疗肺炎链球菌诱发的肺炎、脑膜炎、中耳炎、菌血症等各种疾病。 

本发明提供一种新型的肺炎链球菌荚膜多糖-外膜蛋白结合物的制备方法，其中包括：肺炎链球菌荚膜多糖(Pn-Ps)的制备方法、肺炎链球菌外膜蛋白(Pn-OMPC)的制备方法、肺炎链球菌荚膜多糖-外膜蛋白结合物的制备方法。 

本发明采用离子交换树脂分离、膜分离和有机溶剂分步沉淀等组合技术从肺炎链球菌培养物中提取和纯化肺炎链球菌荚膜多糖。所获得的Pn-Ps的化学组成符合欧洲药典(1997年版)(中国生物制品学杂，2000，13(3)：154-158)，Pn-Ps 的分子量约为100-500KDa，多糖的每个分子具有大约140-700个重复单位。 

本发明从沉淀菌体和上清液中提取和纯化Pn-OMPC。采用膜分离、DEAE纤维素离子交换和凝胶色谱等组合技术纯化外膜蛋白。Pn-OMPC由多种外膜蛋白组成，两种主要的外膜蛋白的分子量分别约为37KDa 和84KDa (ClinicalMicrobiology Reviews，1998，11(4):645-657；Clinical and diagnostic laboratoryimmunology，1996，3(2)：227-229)。 

本发明采用双功能团交联试剂1，4—丁二醇缩水二甘油醚，将所制备的荚膜多糖或其混合物与Pn-OMPC或其混合物通过共价键交联，形成多糖—蛋白结合物。多糖—蛋白结合物中，多糖与蛋白的摩尔比例处于合适的范围。 

制备疫苗时，需要将上述所制备的多糖—蛋白结合物与惰性载体及适量的助剂混合。所述的多糖—蛋白结合物为Pn1-Ps-OMPA(5)，Pn5-Ps-OMPA(5)，Pn6B-Ps-OMPA(5)，Pn19F-Ps-OMPA(5)，Pn23F-Ps-OMPA(5)，Pn1-Ps-OMPA(6B)，Pn5-Ps-OMPA(6B)，Pn6B-Ps-OMPA(6B)，Pn19F-OMPA(6B)，Pn23F-Ps—OMPA(6B)中的一种或任意几种的混合物。所述的惰性载体为氢氧化铝、磷酸铝或明矾。 

具体实施方式

实施例1：肺炎链球菌6B的培养及荚膜多糖Pn6B-PS的提取和纯化 

1.肺炎链球菌6B的培养 

培养肺炎球菌的方法已为本领域所共知(Methods of immunology andlmmunochemistry1967，1：52—56)。 

将装有冰冻干燥的肺炎链球菌6B培养物的安培管打开，加入生理盐水0.5ml，接种在含10％去纤维绵羊血的肺炎链球菌培养基的琼脂平板上，在37℃和5％CO₂条件下培育24小时。通过镜检及通过由丹麦国家血液研究所提供的特异 性抗血清(6B)的凝集反应证明培养物未被污染。 

将上述培养物接种到数个1升三角瓶(含蛋白胨、葡萄糖、无机盐的肺炎链球菌培养基0.8升)中，在37±0.5℃条件下培养约12—18小时。用1Mol/L的碳酸钠溶液调节培养液的pH值，使其保持在6.7±0.1。监测菌体密度(660nm)，培养终点时，光密度为1.5—2.0。采集培养物的样品，用光学显微镜检查菌体形态，并进行血清凝集反应检查培养物纯度。 

将5升上述培养物接种到装有300升肺炎球菌发酵培养基的发酵罐(500升)中，该培养基由胰蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、无机盐等组成。37±0.5℃条件下培养，用2mol/L碳酸钠溶液调pH，使其维持在6.7±0.1，发酵液的光密度为2.0-4.0时，培养终止。采集培养物样品，镜检观察菌体形态，并用血清凝集反应检查培养物的纯度。 

在培养终止后，加入苯酚，苯酚终浓度约0.5％，在室温下2—12小时可直接将培养物杀死。将灭活的培养物进行低温离心(4℃，15000g)，获得上清液，用于提取粗多糖，菌体沉淀物另行保存，用于提取外膜蛋白。 

2、Pn6B-Ps粗多糖的制备 

将离心所得的上清液进行超滤处理。选用截留分子量50KDa的超滤膜，去除培养基中分子量较小的蛋白质、糖类及无机盐等杂质，并进行浓缩，浓缩至原体积的1/10，约30升。 

称取乙酸钠800克，加入上述浓缩液中，充分溶解后，再在强力搅拌条件下，逐滴加入冷乙醇至乙醇终浓度20％，沉淀出的蛋白质和核酸通过离心除去。然后加入更多的冷乙醇至乙醇终浓度65％，从上清液中沉淀出多糖粗制品。离心收集多糖粗制品(粗多糖)。 

3、Pn6B-Ps的纯化

将粗多糖配制成浓度为5mg/ml、pH8.0-8.5的上柱液，流经DEAE纤维素阴离子交换柱。蛋白质带负电荷，吸附在DEAE纤维素阴离子交换柱上，而Pn6B-Ps为中性多糖，过柱流出，达到与蛋白质分离的目的。收集过柱的糖液，采用苯酚-硫酸法测定糖的含量，Folin-酚法测定蛋白质的含量。分析数据表明，离子交换处理具有蛋白质去除效率高的优点，离子交换过程糖d的损失率约10％。 

分离蛋白质后的糖液含多糖4.5mg/ml，用6mol/L HCl调pH至6.0。在冰浴中，以每份10ml样品进行异丙醇沉淀分离示范研究。逐级提高糖液中异丙醇浓度，离心分离分级沉淀产生的多糖沉淀物。多糖沉淀物的血清学测定结果表明：Pn6B-Ps在20-40％异丙醇浓度时沉淀。因此，在大批量的制备过程中，采用同样工艺操作条件，在20-40％异丙醇浓度时沉淀多糖Pn6B-Ps，离心，收集Pn6B-Ps沉淀物。沉淀物用无水异丙醇洗涤3次，真空干燥，得到Pn6B-Ps粉末。每升Pn6B的培养物可获得约30mg Pn6B-Ps粉末。 

将最终产物Pn6B-Ps粉末进行分析，蛋白质含量小于2％，核酸含量小于1.5％，糖纯度达97％以上，其化学组成符合欧洲药典(1997年版)，经HPLC检测多糖分子量约400-500KDa。 

实施例2肺炎链球菌Pn1的培养及荚膜多糖Pn1-Ps的提取和纯化 

1、肺炎链球菌Pn1的培养 

将装有冰冻干燥的肺炎链球菌Pn1培养物的安培管打开，加入生理盐水0.5ml，接种在含10％去纤维绵羊血的肺炎链球菌培养基的琼脂平板上，在37℃和5％CO₂条件下培育24小时。通过镜检及通过由丹麦国家血液研究所提供的特异性抗血清(Pn1)的凝集反应证明培养物未被污染。 

将上述培养物接种到数个1升三角瓶(含蛋白胨、葡萄糖、无机盐的肺炎球菌培养基0.8升)中，在37℃±0.5℃条件下进行培养。用1Mol/L的碳酸钠溶 液调节培养液的pH值，使其保持在6.5±0.1。定期采样，监测菌体密度(660nm)。培养终点时，光密度为1.0—1.5。采集培养物的样品，用光学显微镜检查菌体形态，进行血清凝集反应检查培养物纯度。 

将5升上述培养物转移到装有300升肺炎球菌发酵培养基的发酵罐中，该培养基由酪蛋白、酵母膏、葡萄糖和无机盐组成。37℃±0.5℃，用2mol/L的碳酸钠溶液调节培养液的pH值，使其保持在6.5±0.1。培养终点时，发酵液的光密度为2.0—4.0。采集培养物的样品，用光学显微镜检查菌体形态，进行血清凝集反应，并进行溶血实验，检查培养物纯度。 

在培养终止后，加入苯酚，苯酚终浓度约0.5％，室温下搅拌2—12小时。将灭活的培养物进行低温连续离心(4℃，15000g)，获得上清液，用于提取粗多糖。菌体沉淀物另行保存，用于提取外膜蛋白。 

2.Pn1-Ps粗糖的制备 

收集离心操作所得的上清液，采用截留分子量50KDa的超滤膜，连续进行膜分离，去除培养基中的较小分子量的残留组分，同时进行浓缩，浓缩至原体积的1/10，(约30升)。 

称取乙酸钠800克，加入上述浓缩液中，充分溶解后，再在强力搅拌条件下，采用蠕动泵，逐滴加入冷乙醇至乙醇终浓度20％，沉淀出的蛋白质和核酸通过离心除去。然后加入更多的冷乙醇至乙醇终浓度55％，从上清液中沉淀出多糖粗制品。离心收集多糖粗制品(粗多糖)，约12g。 

3、Pn1-Ps的纯化 

将粗多糖配制成浓度为5mg/ml、pH2.0的上柱液，流经732型阳离子交换树脂柱。在pH2.0时，蛋白质带正电荷，吸附在阳离子交换树脂柱上，而Pn1-PS为酸性多糖，过柱流出，达到与蛋白质分离的目的。收集过柱的糖液，采用苯 酚-硫酸法测定糖的含量，Folin-酚法测定蛋白质的含量。分析数据表明，离子交换处理具有蛋白质去除效率高的优点，离子交换过程糖损失率约10％。 

分离蛋白质后的糖液含多糖4.5mg/ml，用10mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.0。在冰浴中，以每份10ml样品进行异丙醇沉淀分离示范研究。逐级提高糖液中异丙醇浓度，离心分离分级沉淀产生的多糖沉淀物。多糖沉淀物的血清学测定结果表明：Pn1-Ps在25-40％异丙醇浓度时沉淀。因此，在大批量的制备过程中，采用同样工艺操作条件，在25—40％异丙醇浓度时沉淀多糖Pn1-Ps，离心，收集Pn1-Ps沉淀物。沉淀物用无水异丙醇洗涤3次，真空干燥，得到Pn1-Ps粉末。每升Pn1的培养物可获得约36mgPn1-PS粉末。 

将最终产物Pn1-Ps粉末进行分析，蛋白质小于2％，核酸含量小于1.5％，糖纯度达97％以上，其化学组成符合欧洲药典(1997年版)，经HPLC检测多糖分子量约250-300KDa。 

实施例3：肺炎链球菌Pn6B外膜蛋白(Pn6B—OMPC)的提取纯化和免疫原性 

将经苯酚处理的肺炎链球菌Pn6B培养物进行低温连续离心，分别得到上清液和细胞沉淀物。300升的培养物经离心可得约9000g的细胞沉淀物。 

采用以下步骤进行外膜蛋白的提取和纯化： 

步骤1：外膜蛋白的提取 

取100g湿细胞沉淀物，用50mM的pH7.4PBS缓冲液清洗3次，4℃，8000g离心15min。将菌体沉淀物悬浮于含0.1％去氧胆酸钠的pH7.4PBS缓冲液中，4℃条件下强力搅拌5小时。用0.2um中空纤维漏斗过滤，收集菌体沉淀物，重复抽提蛋白，共抽提3次。离心收集上清液，共900mL，其中蛋白质含量约529mg。 

步骤2：粗蛋白的制备 

离心后的蛋白抽提液依次用30KD和100KD的膜包超滤，收集分子量为30 —100KD的组分，得到的粗蛋白约156mg，4℃保存。 

步骤3：DEAE-Sepharose层析柱分离纯化Pn6B-OMPC 

将粗蛋白用pH8.0缓冲液配制成浓度为10mg/ml的上柱液，采用DEAE-Sepharose层析柱进行分离纯化，洗脱液为：0-0.5mol/L NaCl，pH8.0，梯度洗脱，分部收集洗脱液。采用SDS-PAGE分析蛋白质的分子量，分别收集分子量为37KD和84KD的外膜蛋白。 

步骤4：OMPC的透析和冻干 

收集到的OMPC在4℃下透析后冻干保存。每100g湿细胞沉淀物可得到60mg纯度为90％以上的外膜蛋白样品。 

免疫原性实验：用Pn6B-OMPC对小鼠进行免疫，制备抗血清。采用ELISA方法检测抗体与五种肺炎链球菌的反应滴度。分别以6B、1、5、19F、23F五种肺炎链球菌菌液作为抗原包被，菌体浓度10⁶个/mL，检测外膜蛋白Pn6B-OMPC的特异性抗体与五种肺炎链球菌的反应滴度(表1)。Pn6B-OMPC的特异性抗体与肺炎链球菌6B的反应滴度为10210，表明所制备的外膜蛋白Pn6B-OMPC具有良好的免疫原性。Pn6B-OMPC的特异性抗体对其它四种肺炎链球菌也具有较高的反应滴度，表明外膜蛋白作为抗原免疫后诱生的抗体具有良好的交叉反应效果。 

表1：Pn6B-OMPC的特异性抗体与肺炎链球菌的反应滴度 

实施例4：肺炎链球菌Pn1外膜蛋白的提取纯化 

将经苯酚处理的肺炎链球菌Pn1培养物进行低温连续离心分别得到上清液 和细胞沉淀物。300升的培养物经离心可得约10000g的细胞沉淀物。 

采用以下步骤进行外膜蛋白的分离提取： 

步骤1：外膜蛋白的提取 

取收集到的湿细胞沉淀物100g，用50mM的pH7.4PBS缓冲液清洗3次，4℃，8000g离心15min。收集菌体沉淀物，悬浮于含0.1％去氧胆酸钠的pH7.4PBS缓冲液中，4℃条件下强力搅拌5小时。0.2um中空纤维漏斗过滤，收集菌体沉淀物，重复抽提外膜蛋白，共抽提3次，离心收集上清液，共900mL，其中蛋白质含量720mg。 

步骤2：粗蛋白的制备 

离心后的蛋白抽提液依次用30KD和100KD的超滤膜包过滤，收集分子量为30—100KD的组分，得到粗蛋白210mg，4℃保存。 

步骤3：DEAE-Sepharose层析柱分离纯化Pn1-OMPC 

将制得的粗蛋白配制成浓度为10mg/ml，pH3.5的上柱液，采用DEAE-Sepharose层析柱进行分离纯化，洗脱液为pH3.5的醋酸缓冲液，分部收集洗脱液。采用SDS-PAGE分析蛋白质的分子量，分别收集分子量为37KD和84KD的外膜蛋白(Pn1-OMPC)。 

步骤4：Pn1-OMPC干粉的制备 

收集到的Pn1-OMPC在4℃条件下用50mM PBS缓冲溶液透析过夜后冻干保存。每100g湿细胞沉淀物可得到纯度为90％以上的外膜蛋白样品55mg。 

实施例5：Pn6B—Ps—OMPC(6B)的制备 

(1)多糖活化 

称取100mg Pn6B—Ps，溶于10ml0.6mol/L氢氧化钠溶液中，加入终浓度为4mg/ml的硼氢化钠，混合均匀后加入2ml双环氧试剂(1，4-二丁醇2-缩水甘油 醚)和200mg表面活性剂Triton-100，先用超声波剧烈震荡20min，放入55℃恒温震荡培养箱，活化20小时。活化后的多糖溶液放入截留分子量为10KDa的透析袋中，用蒸馏水4℃透析48小时，去除游离的交联试剂。 

(2)多糖-蛋白交联 

称取外膜蛋白OMPC(6B)100mg，用5mol/L碳酸钠缓冲液(pH9.0)配制成40mg/ml的溶液。将活化的多糖溶液和外膜蛋白溶液混合，进行交联反应，于55℃交联24小时。加入1.0g甘氨酸，继续反应24小时，封闭残留的活性基团。交联反应后的混合物经过离子交换和G-150凝胶层析柱处理，去除游离的多糖、蛋白质和甘氨酸，最终获得Pn6B-Ps-OMPC(6B)交联物的纯品约140mg。 

实施例6：Pn1—Ps—OMP(6B)的制备 

(1)多糖活化 

称取100mg Pn1—Ps于10ml0.6mol/L氢氧化钠溶液中，加入2ml0.3％醋酸钠溶液中，充分搅拌使之溶解，再加入3mgNaBH4，溶解后用NaOH溶液调节pH至10.0，用0.2u膜过滤。然后依次加入1.5ml1，4-二丁醇2-缩水甘油醚和1.0g表面活性剂SDS，强力搅拌，再放入50℃恒温震荡箱内进行多糖活化，反应20小时。活化后的多糖溶液放入截留分子量为10KDa的透析袋中透析48小时，去除游离的交联试剂。 

(2)多糖-蛋白交联 

称取60mg分子量为84KDa的6B外膜蛋白OMP(6B)，用5mol/L碳酸钠缓冲液(pH9.0)配制成60mg/ml溶液。将经活化的多糖和外膜蛋白溶液混合，置于55℃恒温振荡箱内反应20小时。反应完毕后，加入400mg甘氨酸，于55℃下继续振摇24小时，以封闭活化多糖分子中残留的环氧键活性基团。 

交联后混合物经离子交换和G-150凝胶柱层析处理，分离去除游离的多糖、 蛋白质和甘氨酸，最终可获得Pn1—Ps—OMP(6B)交联物的纯品108mg。 

对所制备的Pn1—Ps—OMP(6B)交联物纯品，采用苯酚硫酸法测定多糖含量，采用福林酚法测蛋白含量。所制备的多糖—BSA交联物中，多糖/蛋白的摩尔比约为1/2.1。 

采用聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对OMP(6B)、Pn1—Ps和所制备的Pn1—Ps—OMP(6B)交联物样品进行检测，并分别进行糖染色(schiff法)和蛋白染色(银染)。银染检测结果显示：Pn1—Ps—OMP(6B)交联物样品在OMP(6B)位置未观察到电泳带，在OMP(6B)位置以上(大于分子量84000Da)的区域存在片装的电泳带，表明所制备的交联物纯度较高，残留的OMP(6B)没有或很少。糖染检测结果显示：纯多糖样品在电泳胶上无法染出颜色，Pn1—Ps—OMP(6B)交联物样品在OMP(6B)位置以上的区域有片装的电泳带，其显色位置与银染显色位置对应，表明存在与蛋白交联的糖类物质，即所制备的Pn1—Ps—OMP(6B)交联物。 

采用高效液相色谱(G—5000凝胶柱)，并分别采用紫外或示差检测器对所制备的纯品进行检测。实验结果显示：OMP(6B)约在23.5分钟出峰(紫外检测器)，Pn1-Ps约在18.5分钟出峰(示差检测器)，而Pn1—Ps—OMP(6B)交联物的出峰时间在16.2-17.2分种(紫外和示差检测器)。交联物出峰时间提前，这是由于交联物分子量更大的缘故；交联物的峰形较为尖锐，表明交联物的分子量分布较为集中。 

实施例7：五种肺炎链球菌多糖混合物与OMPC(6B)结合物的制备 

(1)多糖活化 

按实施例1方法纯化的Pn5—Ps、Pn6B—Ps、Pn19F—Ps、Pn23F—Ps和实施例2方法纯化的Pn1—Ps，以质量比为1:1:1:1:1混合。称取这五种肺炎链球菌 多糖混合物50mg，溶于8ml0.3％醋酸钠溶液中，加入10mg硼氢化钠混合后，用10mol/L NaOH调节pH至10.0，然后用0.2u膜过滤，过滤液中加入1.0ml交联剂(1，4-二丁醇2-缩水甘油醚)和50mg表面活性剂SDS，超声波剧烈震荡20min后，于55℃活化12小时，活化后的多糖放入截留分子量为10KDa透析袋中透析48小析，去除游离的交联试剂。 

(2)多糖-蛋白交联 

称取外膜蛋白OMPC(6B)35mg，用5mol/L碳酸钠缓冲液(pH9.0)配制成60mg/ml溶液。活化的多糖与外膜蛋白混合均匀后，用饱和碳酸钠调节pH至10.0，于55℃恒温箱中交联24反应小时。反应后，加入1.0g丙氨酸，继续反应24小时，封闭残留的活性基团。4℃下用蒸馏水透析48小时，去除游离的丙氨酸。此交联混合物经G-150凝胶柱分离纯化，得到五价多糖-蛋白交联物纯品58mg。 

实施例8：Pn6B—Ps—OMPC(6B)的免疫原性 

实施例5中制备的Pn6B—Ps—OMPC(6B)结合物配以弗氏佐剂，免疫小鼠。采用腹腔注射方式，以多糖用量计，2.5ug/只小鼠/次，10天后加强免疫一次。免疫20天后取血制备抗血清研究其免疫原性。以单纯Pn6B-Ps免疫作为对照组(2.5ug/只小鼠/次)。 

采用ELISA法检测多糖特异性抗体浓度。与单纯多糖免疫相比，多糖—蛋白结合物免疫后，小鼠抗血清中的IgM，IgG，IgG2a浓度均有明显提高，IgM提高4倍，IgG总浓度提高115倍，其中IgG2a浓度提高10倍左右。多糖与蛋白载体偶联后，多糖由初始的T细胞非依赖性抗原转变成T细胞依赖性抗原，抗原免疫原性明显增强。 

实施例9：Pn1—Ps—OMPC(6B)的免疫原性

实施例6中制备的Pn1—Ps—OMPC(6B)结合物配以弗氏佐剂，免疫小鼠。采用腹腔注射方式，以多糖用量计，2.5ug/只小鼠/次，10天后加强免疫一次。免疫20天后取血制备抗血清研究其免疫原性。 

采用ELISA法检测Pn1—Ps特异性抗体浓度(IgG、IgG2a、IgM抗体浓度)。加强免疫后，多糖-蛋白结合物的总抗体水平比多糖抗体提高150倍。多糖蛋白偶联物疫苗与多糖疫苗相比，免疫原性明显增强，IgM、IgG和IgG2a浓度均有明显提高，IgM提高3.2倍，IgG总浓度提高163倍，其中IgG2a浓度提高8倍左右。 

实施例10：五种肺炎链球菌多糖混合物与OMPC(6B)结合物的免疫原性 

实施例7中制备的5价肺炎链球菌荚膜多糖—OMPC(6B)结合物配以弗氏佐剂，免疫小鼠，采用腹腔注射方式，以多糖用量计，2.5ug/只小鼠/次，10天后加强免疫一次，免疫20天后取血制备抗血清研究其免疫原性。 

采用ELISA法检测总抗体浓度，比较结合疫苗与多糖疫苗总的抗体水平。多糖与蛋白载体偶联后，多糖由初始的T细胞非依赖性抗原转变成T细胞依赖性抗原，抗原免疫原性明显增强。经加强免疫后，多糖-蛋白结合物的总抗体水平比多糖抗体提高100倍以上。 

多糖蛋白结合物疫苗与多糖疫苗相比，免疫原性明显增强，IgM，IgG，IgG2a浓度均有明显提高，IgM提高6倍，IgG总浓度提高114倍，其中IgG2a浓度提高10倍以上。IgG2a是Th1介导细胞免疫应答有关的抗体，可促进细胞毒性T细胞的细胞杀伤作用，激活巨噬细胞杀伤细胞内的病原体。 

实施例11：五价肺炎链球菌多糖—OMPC(6B)结合物对小鼠的保护作用 

(1)小鼠免疫 

小鼠分成四组，每组8-10只小鼠，每组均以实施例7制备的5价肺炎链球 菌多糖-OMPC结合物免疫小鼠。抗原剂量：以多糖用量计，2.5ug/只小鼠/次，免疫时配以弗氏佐剂，采用腹腔注射方式，10天后加强免疫一次。 

(2)肺炎链球菌攻击 

按实施例1方法培养四种肺炎链球菌：5、6B、1和14，并分别配制成109个细菌/ml菌悬液。 

小鼠免疫20天后，将活菌液分别攻击四组小鼠，采用腹腔注射方式，注射剂量为0.5ml/只小鼠。从小鼠注射时开始计时，分别于3h、7h、13h、23h时，在无菌条件下进行眼眶取血，采血量20ul。 

(3)小鼠血液中活菌计数 

腹腔注射活菌后，对每组小鼠分别定期进行眼眶取血，用无菌生理盐水稀释成0.2ml菌悬液，将菌悬液涂布于琼脂血平板上，37℃，5％CO₂培养24h，进行菌落计数，检测不同取样时间的血液中的菌落数。实验结果证实了5价肺炎链球菌多糖-蛋白结合疫苗在小鼠体内诱生的抗体对所实验的4种肺炎链球菌的抑菌效果良好，抑菌率达60％以上。实验说明：该疫苗能有效地预防这4种肺炎链球菌的侵袭，免疫效果良好；对14型肺炎链球菌的攻击具有有效的保护作用，进一步表明多糖—蛋白结合疫苗具有良好的交叉反应效果。

Claims (4)

1.一种肺炎链球菌多糖-外膜蛋白结合疫苗，包括抗原成分、惰性载体及适量的助剂，其特征在于：该疫苗的抗原成分是由肺炎链球菌产生的荚膜多糖与其外膜蛋白经共价连接而得到的肺炎链球菌荚膜多糖-外膜蛋白结合物；所述的荚膜多糖-外膜蛋白结合物为Pn1-Ps-OMP5、Pn5-Ps-OMP5、Pn6B-Ps-OMP5、Pn19F-Ps-OMP5、Pn23F-Ps-OMP5、Pn1-Ps-OMP6B、Pn5-Ps-OMP6B、Pn6B-Ps-OMP6B、Pn19F-Ps-OMP6B、Pn23F-Ps-OMP6B中的一种或任意几种的混合物，其中Pn1-Ps、Pn5-Ps、Pn6B-Ps、Pn19F-Ps、Pn23F-Ps分别代表肺炎链球菌1、5、6B、19F、23F型的荚膜多糖，OMP5、OMP6B分别代表肺炎链球菌5、6B型的外膜蛋白。

2.权利要求1的疫苗，其特征在于：所述的一种或多种肺炎链球菌的荚膜多糖，其分子量为200-500KDa，每个多糖分子为300-700个重复单位。

3.权利要求1的疫苗，其特征在于：所述的一种或多种肺炎链球菌的外膜蛋白，其分子量为30-100KDa。

4.一种权利要求1的肺炎链球菌多糖-外膜蛋白结合疫苗的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

(a)采用离子交换树脂分离、膜分离和有机溶剂分步沉淀组合技术从肺炎链球菌培养物中提取和纯化荚膜多糖：在酸性条件下用阳离子交换树脂纯化酸性多糖；用阴离子交换树脂纯化中性多糖；

(b)从沉淀菌体或发酵液中提取外膜蛋白：采用膜分离、DEAE-纤维素离子交换和凝胶色谱组合技术纯化外膜蛋白；肺炎链球菌的外膜蛋白主要由2种外膜蛋白组成，分子量分别为37KDa和84KDa；

(c)采用双功能团交联试剂1，4-丁二醇二缩水甘油醚，将荚膜多糖或其混合物与外膜蛋白或其混合物交联，形成多糖-蛋白结合物，反应时多糖与蛋白的摩尔比例范围为1∶30-10∶1；交联后的混合物经G-150凝胶柱层析分离去除游离的多糖和蛋白质，最终可获得目标产物多糖-蛋白结合物；

(d)制备疫苗时，将多糖-蛋白结合物与合适的惰性载体混合，并混合适量的助剂；惰性载体采用氢氧化铝、磷酸铝或明矾。