CN102861326A - 流脑多糖-蛋白质缀合疫苗及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种流脑多糖-蛋白质缀合疫苗及制备方法，所述疫苗是用[S-C]n-[N-P]m表示，其中S表示一种流脑多糖分子，C表示该流脑多糖分子中引入醛基的C原子，P表示CRM197蛋白分子，N表示该蛋白分子中赖氨酸侧链氨基的N原子；所述流脑多糖为W-135型和Y型流脑多糖中的至少一种，本发明的疫苗，Y型和W-135型流脑多糖未经解聚工艺过程，并且和蛋白质之间的连接不通过连接头。因此本发明的工艺流程简单，收率高，生产成本低，且多糖蛋白比相对稳定，并可在这一水平范围内进行相对的人为控制，大大提高了疫苗的质量稳定性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种流脑多糖-蛋白质缀合疫苗及制备方法。
背景技术
奈瑟氏脑膜炎球菌（Neisserza meningitides）是全球细菌性脑膜炎的主要原因。在最近的30年中，地方性脑膜炎球菌疾病的发病率在发展中国家为每100，000人中10到25人（Reido，F.X.等人，1995）。病例致死率在10到20%之间。
病原脑膜炎球菌被多糖荚膜所包被，附着在生物体外膜表面。基于荚膜多糖的免疫学特异性，已经鉴定出13种不同的脑膜炎球菌血清型。这13个血清型中的5个引起了大部分脑膜炎球菌疾病；它们包括血清型A、B、C、W-135和Y。血清型A引超大部分流行性疾病。血清型B、C和Y引起大多数地方性疾病和疾病的区域性爆发。
人类是唯一已知的脑膜炎奈瑟氏球菌的天然携带者。脑膜炎球菌可被持续携带几个月，脑膜炎球菌通过直接接触或通过空气飞沫传播。对入侵的脑膜炎球菌的宿主防御依赖于补体介导的溶菌作用，而在其中发挥作用的血清抗体大部分是针对荚膜多糖的。
基于脑膜炎球菌多糖的疫苗已经被描述，其引起针对荚膜多糖的免疫应答。这些抗体可以对血清型特异性脑膜炎球菌引起补体介导的溶菌作用。脑膜炎球菌多糖疫苗显示对儿童和成人有效，但对于婴儿和幼儿其效能有限。对年幼群体，此多糖的后继给药产生弱加强应答或无加强应答。脑膜炎球菌多糖疫苗的保护期不能持续很长，并且据估计对成人和大于4岁的儿童而言为3到5年。对1至4岁的儿童而言保护期少于3年。
多糖能与主要组织相容性复合体分子结合，而这是抗原呈递和刺激T-辅助淋巴细胞的前提条件，也即它们是非T。细胞依赖性抗原。多糖能够不需T-辅助淋巴细胞的辅助而刺激B淋巴细胞产生抗体。由于对B淋巴细胞的非T-细胞依赖性刺激，这些抗原免疫后缺乏记忆诱导。在成人体内，多糖抗原可以产生非常有效的非T-细胞依赖性应答，但在婴儿和幼儿的不成熟免疫系统中这些非T-细胞依赖性应答却很弱。
非T-细胞依赖性多糖抗原可以通过将多糖共价连接至蛋白质分子（“载体”或“载体蛋白质”）上而转变为T-细胞依赖性抗原。与缀合疫苗的多糖组分结合的B细胞可以被肽特异的T辅助细胞激活，所述肽为缀合的载体蛋白质的一部分。对载体蛋白质的T-辅助细胞应答可以增加针对多糖的抗体的产生。
目前国外已经上市的流脑结合疫苗中，W-135型及Y型流脑多糖均在片段化后采用连接接头与载体蛋白进行连接（如：中国专利CN100556459C描述的以TT为载体和W性或Y型寡糖结合的疫苗，中国专利CN1889975A描述的以CRM197为载体和W型或Y型寡糖结合的疫苗）。由于载体蛋白和天然多糖并没有活性基团可以反应，连接接头上是一种有机分子， 一端具有和蛋白反应的化学活性，另一端具体和多糖连接的化学活性。已经被采用的接头有：己二酸二酰肼，1,4-丁二胺，N-乙酰高半胱氨酸硫内酯等,有些接头和蛋白或多糖连接反应之前，必须对蛋白和多糖进行衍生。这些接头一般是惰性的，也就是不会与人体蛋白质或其他大分子在生理条件下产生化学反应，而且在结合疫苗的制备工艺中也会被尽量的去除，但是这些接头存在于结合产物中，可引起人体免疫系统来针对这些接头产生免疫反应，会产生相应的无效抗体。目前用于流脑多糖结合疫苗不但采用接头的工艺，而且需要对多糖进行解聚以降低其分子量，但是在这个过程中，多糖会有损失，从而增加了产品的总体生产成本。
中国专利CN1889975A描述的以CRM197为载体和W型或Y型寡糖结合的疫苗的分子量一般在200KD以下。一般认为大分子量的免疫原会产生更强的免疫反应。因此有必要开发出分子量较大的免疫缀合物。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种流脑多糖-蛋白质缀合疫苗。
本发明的第二个目的是提供一种流脑多糖-蛋白质缀合疫苗的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种多价流脑多糖-蛋白质缀合疫苗。
本发明的技术方案概述如下：
流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，其特征是用[S-C]n-[N-P]m表示，其中S表示一种流脑多糖分子，C表示该流脑多糖分子中引入醛基的C原子，P表示CRM197蛋白分子，N表示该蛋白分子中赖氨酸侧链氨基的N原子；n和m大于1且小于10；所述S的分子量>100KD；所述[S-C]n-[N-P]m的平均分子量在200KD到2000KD之间，所述流脑多糖为W-135型和Y型流脑多糖中的至少一种，所述流脑多糖为奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖的简称。
所述[S-C]n-[N-P]m的分子量优选为200KD到700KD之间。
多价流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，包括上述流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，还包括A型流脑多糖与载体蛋白结合的缀合物和C型流脑多糖与载体蛋白结合的缀合物。
流脑多糖-蛋白质缀合疫苗的制备方法，包括如下步骤：
（1）将纯化的流脑多糖溶解于水或乙酸钠缓冲液中，按照流脑多糖与高碘酸盐质量比为1：0.02-0.2的比例加入高碘酸盐，活化反应后，超滤或透析去除未反应的高碘酸盐，使流脑多糖上相邻的双羟基被氧化成醛基，得到引入醛基的活化流脑多糖；
（2）按质量比为0.5-3：1的比例将步骤（1）获得的活化流脑多糖和纯化的载体蛋白CRM197溶解于磷酸盐缓冲液中，调节pH到6.5和8.5之间，以氰基硼氢化钠:醛基摩尔比5-10的比例加入氰基硼氢化钠，进行还原胺反应18-48小时，使活化流脑多糖的醛基和CRM197表面赖氨酸上的氨基产生联接；
（3）加入硼氢化钠封闭活化流脑多糖上未反应的醛基；通过硫铵沉淀或者疏水柱层析的方法去除未与载体蛋白CRM197产生反应的游离流脑多糖，得到纯化的流脑多糖-蛋白质缀合疫苗；所述流脑多糖血清型为W-135和Y至少一种，所述流脑多糖为奈瑟氏脑膜炎球菌荚 膜多糖的简称。
上述疫苗还可以包括佐剂。佐剂选自铝佐剂、弗氏佐剂、单磷酰脂A、CpG、QS-21、霍乱毒素或甲酰甲硫氨酰肽。铝佐剂为磷酸铝或氢氧化铝。
上述疫苗还可以包含药学可接受的防腐剂。防腐剂选自苄醇、对羟苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯铵。
本发明的流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，Y型和W-135型流脑多糖未经解聚工艺过程，并且和蛋白质之间的连接不通过连接头。因此本发明的工艺流程简单，收率高，生产成本低，且多糖蛋白比相对稳定，并可在这一水平范围内进行相对的人为控制，大大提高了疫苗的质量稳定性。
附图说明
图1为抗血清5倍稀释时，针对流脑Y型多糖的免疫酶联反应OD值。
图2为抗血清5倍稀释时，针对流脑W-135型多糖的免疫酶联反应OD值。
图3为抗血清3125倍稀释后与各型多糖的免疫酶联反应OD值。
具体实施方式
荚膜多糖可以通过本领域技术人员公知的标准技术制备。在本发明中荚膜多糖制备自奈瑟氏脑膜炎球菌血清型A、C、W-135和Y。
在相关的实施方案中，这些脑膜炎球菌血清型缀合物分别制备然后配制成单一剂量形式。例如，从奈瑟氏脑膜炎球菌血清型A、C、W-135和Y分别纯化荚膜多糖，而后分别与载体蛋白进行连接。
在本发明的优选实施方案中利用温和氧化条件将来源于奈瑟氏脑膜炎球菌血清型A和C荚膜多糖部分解聚并活化，对奈瑟氏脑膜炎球菌血清型W-135和Y直接进行活化而不进行解聚工艺。
由于反应参数决定了产品的分子特性，如多糖和蛋白的比例及分子量。因此，我们研究了不同参数条件下结合反应获得的产品的免疫原性，而确定合适的工艺条件和最终的反应物。
流脑Y型多糖的活化反应以及产生的产物由下列的反应式所表示。
其中R表示H原子或者O-乙酰基。
其中一种活化的流脑Y多糖分子和CRM197结合的反应过程由下列的反应式表示。
本申请建立的方法确定了在奈瑟氏脑膜炎球菌血清型W-135或Y与载体蛋白CRM197结合反应中的投料比、反应时间、温度和pH值，以控制结合产物的分子量和流脑多糖与蛋白的比例。而且我们发现了流脑多糖：蛋白结合比在0.5-1.5:1之间，分子量在200KD以上的缀合物可以引起很强的免疫反应，结合比过高或者过低，分子量较低的缀合物不能引起合适的免疫反应。
流脑多糖与载体蛋白质缀合后，可以利用多种技术对多糖-蛋白质缀合物进行纯化（富集，就多糖-蛋白质缀合物的量而言）。纯化步骤的一个目的是从多糖-蛋白质缀合物中去除未结合的多糖。美国专利6146902上描述了一种涉及在硫酸铵存在下进行超滤的纯化方法。或者，可以通过任意数目的标准技术从未反应的蛋白质和多糖中将缀合物纯化出来，所述标准技术包括大小排阻层析、密度梯度离心、疏水相互作用层析或硫酸铵分级分离等。参见，例如P．W.Anderson等人(1986)，免疫学杂志(J.Immunol.)137:1181-1186。也见于H.J.Jennings和C．Lugowski(1981)免疫学杂志(J.Immunol.)127:1011-1018。
本发明多价流脑多糖-蛋白质缀合疫苗可以通过混合多种流脑多糖-蛋白质缀合物而制成。
本发明的疫苗可以以单一剂量或以系列（即以“加强”或“几次加强）形式施用。例如，就象目前针对预防儿童疾病的其它疫苗所推荐的那样，儿童可以在生命早期比如6个月龄前接受单一剂量或三针剂量。
本发明将通过参考下列举例说明性但非限制性实施例进一步描述，所述实施例详细阐明本发明的几个优选实施方案。本发明的其它实施例在不背离本发明精神的前提下为本领域技术人员所显见。
实施例1
奈瑟氏脑膜炎球菌血清型W-135和Y的纯化流脑多糖粉末的制备
对奈瑟氏脑膜炎球菌血清型W-135和Y分别进行发酵培养。
将分别获得的30L发酵液离心后取得上清并置于一不锈钢罐中，使用100KD膜包超滤浓缩至3L，向浓缩液中加入300ml质量浓度为10%的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）水溶液，搅拌均匀后于4℃静止2小时。将静止后的溶液离心以获得沉淀，向沉淀中加无菌1M氯化钠水溶液至1L，在40℃下实现沉淀的溶解。向溶解液中加入无水乙醇至最终体积浓度为25%，搅拌均匀后于-20℃静止2小时后，离心获得上清；向离心上清中补加无水乙醇至最终体积浓度为80%，搅拌均匀后于-20℃静止2小时后，离心获得沉淀。将沉淀复溶于2L纯化水中，加入来源于林伯氏白色念球菌（Tritirachiumalbum limber）的蛋白酶K至反 应浓度为3U/ml，在37℃下反应2小时后，使用100KD膜包超滤15倍体积后最终得到2L超滤液。将超滤液通过0.22um过滤后进行冰冻干燥处理以得到纯化的流脑多糖粉末，将粉末保存于带有干燥剂的器皿中。
Y，W-135型流脑多糖由唾液酸来确定含量。流脑多糖的分子大小的确定利用凝胶过滤层析柱及利用多角度激光光散射来进行，利用葡聚糖分子大小标准来校准。流脑多糖的结构完整性由质子1H和13C NMR确定。
实施例2
载体蛋白质的制备
将冻干的表达白喉CRM197蛋白的种子培养物进行重构并孵育16小时。取一份培养物转移至含有生长培养基的0.5升摇瓶中，并将培养瓶在旋转摇床上34.5-36.5℃孵育8小时，从培养瓶取一份培养物转移至含有生长培养基的4升摇瓶中，并将培养瓶在旋转摇床上34.5-36.5℃孵育18小时。用此4升摇瓶的培养物接种含有30L生长培养基的发酵罐。将发酵罐在30-36.5℃，pH 7.4下培养28小时。发酵罐内容物通过离心和深层滤器过滤至收集器中。
将获得的30L发酵液用30KD膜包浓缩至2L，向浓缩液中加入500mM磷酸缓冲液（钠盐）至最终浓度为10mM。将DEAE层析柱使用10mM磷酸缓冲液平衡后，将浓缩液上样后，使用0.1N氯化钠溶液洗脱得到目的蛋白。
利用10，000 NIWCO再生纤维素滤柱，将蛋白质溶液浓缩至5克／升并用10倍体积5%蔗糖溶液超滤透析。浓缩的蛋白质溶液通过0.2微米滤膜过滤。在冻干机中冻干蛋白。
蛋白质浓度通过Lowrv，O.H.等人(1951)生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)193，265-275页的方法确定。蛋白质纯度通过测定无菌度、LAL（内毒素）含量和电泳方法确定。
实施例3
奈瑟氏脑膜炎球菌血清型Y型多糖的活化
将纯化的5g流脑Y型多糖溶解于1L乙酸钠缓冲液(50mM pH5.0)中，在室温下，用带有磁子的磁力搅拌器搅拌20分钟，以使纯化流脑多糖充分的溶解，按表1中的比例加入NaIO4，并按表1各个反应所示的温度、时间分别进行反应，使流脑多糖上相邻的双羟基被氧化成醛基。
表1.不同反应条件下得到的不同醛基引入比例的活化流脑多糖
准备装有30K MWCO的滤膜的超滤系统,将反应液放在这个系统的回流容器中，用纯化水进行10次等体积超滤换液，将反应中剩余的NaIO4及反应过程中所生成的小分子物质滤除，得到引入了不同程度的醛基的活化流脑多糖的水溶液；并且可将活化好的流脑多糖浓缩，经过超滤将活化流脑多糖浓缩至30g/L的浓度，放置于4℃冰箱备用；
活化流脑多糖的分子大小的确定利用凝胶过滤层析柱及利用多角度激光光散射来进行,利用葡聚糖分子大小标准来校准。经过测量，在活化过程中流脑多糖的分子量没有显著变化，均大于100KDa。流脑多糖的含量通过唾液酸法确定，引入的醛基含量利用Park，J．T．和Johnson，M．J．(1949)生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)，181，149-151页所述方法确定。测量得到的数据见表1。活化流脑多糖的结构完整性由质子1H和13C NMR确定。活化流脑多糖的纯度通过测量LAL（内毒素）含量来确定。
实验证明，用水或其他的缓冲液替代本实施例的乙酸钠缓冲液也可以得到类似结果，如柠檬酸缓冲液和磷酸缓冲液。用含高碘酸根的其他盐如高碘酸钾等也可以得到类似结果。
实验证明，在活化完成后，延长反应时间不能引入更多的醛基，而且会造成醛基的丢失和流脑多糖的降解。
实施例4
制备脑膜炎奈瑟氏球菌血清型Y流脑多糖与CRM197蛋白质的单价缀合物
将表1得到的各个活化Y型流脑多糖分别放入三角瓶中，用纯化水稀释流脑多糖至表2所示浓度，再加入1/9体积的无菌的磷酸缓冲液（500mM），按表2所示质量比加入CRM197粉末，并用带有磁子的磁力搅拌进行搅拌。在蛋白充分溶解于磷酸盐缓冲液后，按照表2调节pH值，然后按照表2所示比例加入氰基硼氢化钠，搅拌溶解，按照表2条件进行反应。
在控制流脑多糖的活化程度（醛基含量）和流脑多糖：CRM197投料这两个条件，可以获得结合质量比不同，分子量不同的各种免疫缀合物。待反应结束后在反应混合物中加入与氰基硼氢化钠等质量的硼氢化钠，混合3小时后加入硫酸铵至1mol/L，用1M硫酸铵溶液+50mM磷酸缓冲液（pH7.5）平衡疏水层析柱（填料为Fractogel Propyl(S)，Merck），上样后，再用上述缓冲液洗5个柱体积，最终用50mM磷酸缓冲液洗脱并收集流脑多糖-蛋白质缀合物。在装备50KDa滤膜的超滤系统中用生理盐水对流脑多糖-蛋白质缀合物溶液 进行15次等体积超滤，收集回流并用囊式滤器过滤除菌，保存于4℃。
表2.制备Y型结合流脑多糖的不同反应条件
反应得到的Y型流脑多糖-CRM197缀合物的理化指标包括，游离多糖，游离蛋白，流脑多糖：蛋白比例和平均分子量见表3.
表3.不同反应条件下得到的免疫缀合物的特征
流脑多糖的量和O-乙酰基含量利用与在活化流脑多糖中所用相同的方法测定。蛋白质的量通过Lowry方法确定。缀合物的分子大小利用凝胶过滤层析柱来确定。缀合物的抗原特性利用双夹心ELISA方法，通过与抗多糖血清型特异性抗体的结合来测定。缀合物纯度通过测定未结合（未缀合）多糖的量（通过在疏水相互作用层析柱上洗脱）、未缀合蛋白质的量（利用毛细管电泳）、无菌度、LAL（内毒素）含量及残余铵离子含量来确定。
实施例5
Y型流脑多糖-蛋白质缀合疫苗的免疫原性研究
选取实施例4表2条件制备的表3所示的流脑多糖蛋白比分别为0.21、1.5、0.9、0.5、3.1的单价脑膜炎球菌Y型多糖-CRM197缀合疫苗进行小鼠免疫试验，每只小鼠皮下注射1.25μg。进行2-3次免疫，其间间隔为2周，并在接种后2周采集其血液样本。通过小鼠免疫应答反应高低确定最优的单价脑膜炎球菌Y型多糖-CRM197缀合疫苗的多糖蛋白比。
利用ELISA方法测定每一血清型多糖的抗体。利用牛血清白蛋白将每一血清型多糖连接 至滴定孔上。血清样本与结合在ELISA微量滴定板孔上的过量的每一种流脑多糖孵育。孵育后，用缓冲液洗涤滴定孔，并将能够结合抗脑膜炎球菌多糖抗体的二级抗体一酶缀合物加至抗体一多糖复合体中进行孵育。孵育后，用缓冲液洗涤滴定孔，并将化学底物加至多糖一脑膜炎球菌抗体一二级抗体一酶缀合物中。经酶水解化学底物的一部分后导致颜色形成。颜色形成的量与结合在滴定孔中的多糖一脑膜炎球菌抗体一二级抗体一酶缀合物的量成正比。
对于每种血清型抗体，在一定抗体稀释度下，对各实验动物组中10只小鼠的OD值分别求平均值和方差。以实验动物组做横坐标，其对应的OD平均值做纵坐标，方差做误差线进行作图。
图1显示为抗血清5倍稀释时的免疫酶联反应OD值的比较，图中数据结果表明不同的流脑多糖蛋白比其免疫应答强弱不同。免疫应答强弱顺序为：（1）单价脑膜炎球菌Y型多糖CRM197缀合疫苗结合比0.9＞0.5＞1.5＞3.1＞0.21。由此可以确定单价脑膜炎球菌Y多糖CRM197缀合疫苗的最优多糖蛋白比为0.5-1.5,其分子量大小最小为200KD，最大约2000KD（表3）。免疫效果最优时分子量为230-690KD。由于活化流脑多糖分子量一般>100KD,结合蛋白分子量为60KD，因此可以推断[S-C]n-[N-P]m分子式中，n和m均大于1且小于10。
实施例6
奈瑟氏脑膜炎球菌血清型W-135型多糖的活化
将纯化的4g流脑W-135型多糖溶解于1L乙酸钠缓冲液(50mM pH5.0)中，在室温下，用带有磁子的磁力搅拌器搅拌20分钟，以使纯化流脑多糖充分的溶解，按表4中的比例加入NaIO4，并按表4各个反应所示的温度、时间分别进行反应，使流脑多糖上相邻的双羟基被氧化成醛基。
表4.不同反应条件下得到的不同醛基引入比例的活化多糖
准备装有30KD MWCO的滤膜的超滤系统,将反应液放在这个系统的回流容器中，用纯化水进行10次等体积超滤换液，将反应中剩余的NaIO4及反应过程中所生成的小分子物质滤除，得到引入了不同程度的醛基的活化流脑多糖的水溶液；并且可将活化好的多糖浓缩，经过超滤将活化流脑多糖浓缩至20g/L的浓度，放置于4℃冰箱备用；
活化流脑多糖的分子大小的确定利用凝胶过滤层析柱及利用多角度激光光散射来进行, 利用葡聚糖分子大小标准来校准。经过测量，在活化过程中多糖的分子量没有显著变化，均大于100KDa。流脑多糖的含量通过唾液酸法确定，引入的醛基含量利用Park，J．T．和Johnson，M．J．(1949)生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)，181，149-151页所述方法确定。测量得到的数据见表4。活化多糖的结构完整性由质子1H和13C NMR确定。活化多糖的纯度通过测量LAL（内毒素）含量来确定。
实验证明，用水或其他的缓冲液替代本实施例的乙酸钠缓冲液也可以得到类似结果，如柠檬酸缓冲液和磷酸缓冲液。用含高碘酸根的其他盐如高碘酸钾等也可以得到类似结果。
实施例7
制备脑膜炎奈瑟氏球菌血清型W-135流脑多糖与CRM197蛋白质的单价缀合物
将表4得到的各个活化W-135型多糖分别放入不同的三角瓶中，用纯化水稀释多糖至表5所示浓度，再加入1/9体积的无菌的磷酸缓冲液（500mM），按表5所示质量比加入CRM197粉末，并用带有磁子的磁力搅拌进行搅拌。在蛋白充分溶解于磷酸盐缓冲液后，按照表5调节pH值，然后按照表5所示比例加入氰基硼氢化钠，搅拌溶解，按照表5条件进行反应。
在控制流脑多糖的活化程度（醛基含量）和流脑多糖：CRM197投料这两个条件，可以获得结合质量比不同，分子量不同的各种免疫缀合物。待反应结束后在反应混合物中加入与氰基硼氢化钠等质量的硼氢化钠，混合4小时后加入硫酸铵至1mol/L，用1M硫酸铵溶液+50mM磷酸缓冲液（pH7.5）平衡疏水层析柱（填料为Fractogel Propyl(S)，Merck），上样后，再用上述缓冲液洗5个柱体积，最终用50mM磷酸缓冲液洗脱并收集流脑多糖-蛋白质缀合物。在装备50KDa滤膜的超滤系统中用生理盐水对流脑多糖-蛋白质缀合物溶液进行15次等体积超滤，收集回流过滤除菌，保存于4℃。
表5.制备W-135型结合流脑多糖的不同反应条件
反应得到的W-135型流脑多糖-CRM197缀合物的理化指标包括，游离多糖，游离蛋白，多糖：蛋白比例和平均分子量见表6.
表6.不同反应条件下得到的免疫缀合物的特征
流脑多糖的量和O-乙酰基含量利用与在活化流脑多糖中所用相同的方法测定。蛋白质的量通过Lowry方法确定。缀合物的分子大小利用凝胶过滤层析柱来确定。缀合物的抗原特性利用双夹心ELISA方法，通过与抗多糖血清型特异性抗体的结合来测定。缀合物纯度通过测定未结合（未缀合）多糖的量（通过在疏水相互作用层析柱上洗脱）、未缀合蛋白质的量（利用毛细管电泳）、无菌度、LAL（内毒素）含量及残余铵离子含量来确定。
实施例8
W-135型流脑多糖-蛋白质缀合疫苗的免疫原性研究
选取实施例4表5条件制备的表6所示的流脑多糖蛋白比分别为0.23、1.4、0.7、0.5、2.7的单价脑膜炎球菌W-135型多糖-CRM197缀合疫苗进行小鼠免疫试验，每只小鼠皮下注射1.25μg。进行2-3次免疫，其间间隔为2周，并在接种后2周采集其血液样本。通过小鼠免疫应答反应高低确定最优的单价脑膜炎球菌W-135型多糖-CRM197缀合疫苗的多糖蛋白比。
利用ELISA方法测定每一血清型多糖的抗体。利用牛血清白蛋白将每一血清型多糖连接至滴定孔上。血清样本与结合在ELISA微量滴定板孔上的过量的每一种流脑多糖孵育。孵育后，用缓冲液洗涤滴定孔，并将能够结合抗脑膜炎球菌多糖抗体的二级抗体一酶缀合物加至抗体一多糖复合体中进行孵育。孵育后，用缓冲液洗涤滴定孔，并将化学底物加至多糖一脑膜炎球菌抗体一二级抗体一酶缀合物中。经酶水解化学底物的一部分后导致颜色形成。颜色形成的量与结合在滴定孔中的多糖一脑膜炎球菌抗体一二级抗体一酶缀合物的量成正比。
对于每种血清型抗体，在一定抗体稀释度下，对各实验动物组中10只小鼠的OD值分别求平均值和方差。以实验动物组做横坐标，其对应的OD平均值做纵坐标，方差做误差线进行作图。
图2显示为抗血清5倍稀释时的免疫酶联反应OD值的比较，图中数据结果表明不同的流脑多糖蛋白比其免疫应答强弱不同。免疫应答强弱顺序为：（1）单价脑膜炎球菌W-135型多糖CRM197缀合疫苗结合比0.7＞0.5＞1.4＞2.7＞0.23。由此可以确定单价脑膜炎球菌W-135多糖CRM197缀合疫苗的最优多糖蛋白比为0.5-1.5,其分子量大小最小为200KD，最大约2000KD（表6）。免疫效果最优时分子量为260-700KD。由于活化流脑多糖分子量一 般>100KD,结合蛋白分子量为60KD，因此可以推断[S-C]n-[N-P]m分子式中，n和m均大于1且小于10。
实施例9
多价脑膜炎球菌A、C、W-135、Y多糖CRM197缀合疫苗的配制
向三角瓶中的生理盐水(0.85%)中加入无菌500mM磷酸钠缓冲的生理盐水。再按照表7加入4种单价脑膜炎球菌多糖一CRM197缀合物，每毫升缓冲液中含有每种血清型多糖终浓度如表7。其中W-135单价缀合物为实施例7中的W-135-结合-3批号，Y单价缀合物为实施例4中的Y-结合-3批号，补加生理盐水使最终的磷酸缓冲液的浓度为10mM。0.22um过滤保存后分装到2mL容量的西林瓶中，每个瓶子的装量为0.7mL。
表7. 3种不同的4价流脑疫苗的配方（不含铝佐剂）
多价制剂中蛋白质的量通过Lowry方法测定。多价缀合疫苗的抗原含量利用双夹心ELISA方法，通过结合抗多糖血清型特异性抗体来测定。多价缀合疫苗的免疫原性通过测定在动物模型中疫苗的每一缀合物引起IgG免疫应答的能力来确定。
实施例10
氢氧化铝佐剂辅助的多价脑膜炎球菌多糖CRM197缀合物的制备
向三角瓶中的生理盐水(0.85%)中加入无菌500mM磷酸钠缓冲的生理盐水。再按照表7加入4种无菌单价脑膜炎球菌多糖一CRM197缀合物，每毫升缓冲液中含有每种血清型多糖终浓度如表8。其中W-135单价缀合物为实施例7中的W-135-结合-3批号，Y单价缀合物为实施例4中的Y-结合-3批号，加入溶于生理盐水（0.85%氯化钠）的氢氧化铝，每毫升疫苗中含有0.44mg铝离子,补加生理盐水，最终磷酸缓冲液的浓度为10mM。分装到2mL容量的西林瓶中，每个瓶子的装量为0.7mL。
表8.含铝佐剂的3种不同的4价流脑疫苗的配方
多价制剂中蛋白质的量通过Lowry方法测定。多价缀合疫苗的抗原含量利用双夹心ELISA方法，通过结合抗多糖血清型特异性抗体来测定。多价缀合疫苗的免疫原性通过测定在动物模型中疫苗的每一缀合物引起IgG免疫应答的能力来确定。
实施例11
四价缀合疫苗的免疫原性
在临床评价之前，研究了四价缀合疫苗在小鼠上引起免疫应答的能力。利用小鼠进行四价脑膜炎球菌多糖-CRM197缀合疫苗（表7中配方1和表8中配方4）与市售厂家1的四价脑膜炎球菌多糖-DT缀合疫苗的免疫原性对比研究，同时进行与市售厂家2的A，C二价脑膜炎球菌多糖-TT缀合疫苗的免疫原性对比研究。由于小鼠动物模型能够通过免疫应答反应对比其免疫原性，因此该研究是有意义的。
在小鼠免疫原性研究中，共进行了五组实验，这五组分别为阴性对照组即生理盐水（0.85%氯化钠）、四价脑膜炎球菌多糖-CRM197缀合疫苗（实施例9，配方1）、四价脑膜炎球菌多糖-CRM197缀合疫苗（实施例10，配方4）、厂家1四价脑膜炎球菌多糖-DT缀合疫苗、厂家2的A，C二价脑膜炎球菌多糖-TT缀合疫苗，分别按人用剂量的1/4施用，即每只小鼠皮下注射125ul。进行3次免疫，并在接种后2周采集其血液样本。
利用ELISA方法测定每一血清型多糖的抗体。利用牛血清白蛋白将每一血清型多糖连接至滴定孔上。血清样本与结合在ELISA微量滴定板孔上的过量的每一种荚膜多糖孵育。孵育后，用缓冲液洗涤滴定孔，并将能够结合抗脑膜炎球菌多糖抗体的二级抗体一酶缀合物加至抗体一多糖复合体中进行孵育。孵育后，用缓冲液洗涤滴定孔，并将化学底物加至多糖一脑膜炎球菌抗体一二级抗体一酶缀合物中。经酶水解化学底物的一部分后导致颜色形成。颜色形成的量与结合在滴定孔中的多糖一脑膜炎球菌抗体一二级抗体一酶缀合物的量成正比。
对于每种血清型抗体，在一定抗体稀释度下，对各实验动物组中10只小鼠的OD值分别求平均值和方差。以实验动物组做横坐标，其对应的OD平均值做纵坐标，进行作图。
表4不同实验动物组缀合疫苗免疫后的各血清型脑膜炎球菌荚膜多糖抗体免疫原性（T检验）
图3所示为各实验动物组小鼠血清中各血清型脑膜炎球菌荚膜多糖抗体在3125倍稀释下免疫原性的对比结果。由图3我们可以得出，本发明中的四价缀合疫苗对A型、C型、W型脑膜炎球菌荚膜多糖的免疫原性均优于厂家1四价缀合疫苗及厂家2的二价缀合疫苗；Y型脑膜炎球菌荚膜多糖的免疫原性与厂家1四价缀合疫苗的免疫原性相同。利用双样本的T检验对四组疫苗组实验动物免疫后的免疫原性进行数据分析（表4所示），将P值＜0.05判定为差异显著，可以得出，本研究中的四价缀合疫苗添加或不加铝佐剂对A型、C型、W型、Y型脑膜炎球菌荚膜多糖的免疫原性差异不显著，可以选择不添加或添加；本研究利用不添加佐剂的四价缀合疫苗对小鼠的免疫原性分别与不含佐剂的厂家1四价缀合疫苗及厂家2的二价缀合疫苗免疫后的免疫原性进行对比，数据分析显示对A型、C型、W型脑膜炎球菌荚膜多糖的免疫原性差异显著，对Y型脑膜炎球菌荚膜多糖的免疫原性差异不显著，即对A型、C型脑膜炎球菌荚膜多糖抗体的免疫原性优于厂家1四价缀合疫苗及厂家2的二价缀合疫苗；对W型、Y型脑膜炎球菌荚膜多糖抗体的免疫原性优于厂家1四价缀合疫苗。
以上数据结果表明，本发明四价脑膜炎球菌多糖一CRM197缀合疫苗在小鼠免疫原性研究中对A，C型脑膜炎球菌荚膜多糖的免疫原性要优于厂家1四价缀合CRM197疫苗和厂家2二价（A+C）缀合TT疫苗；对W型脑膜炎球菌荚膜多糖的免疫原性也优于厂家1四价缀合CRM197疫苗；但是对Y型脑膜炎球菌荚膜多糖的免疫原性与厂家1四价缀合CRM197疫苗相同。说明本发明四价脑膜炎球菌多糖一CRM197缀合疫苗在小鼠实验中表现出良好的免疫应答反应。
表9不同实验动物组缀合疫苗免疫后各血清型抗体滴度
| A | C | W-135 | Y | |
| 阴性对照 | 321 | 265 | 166 | 123 |
| A+C+Y+W-135(无Al佐剂) | 161425 | 243894 | 132255 | 66337 |
| A+C+Y+W-135(有铝佐剂) | 187296 | 332033 | 172202 | 88782 |
| A+C+Y+W-135（厂家1） | 94457 | 126582 | 46036 | 65713 |
| A+C(厂家2） | 17435 | 117281 | 未测 | 未测 |
表9数据为不同实验组缀合疫苗免疫后各血清型抗体滴度水平，从数据结果可以得出，对A，C型脑膜炎球菌荚膜多糖抗体滴度水平做比较时，本发明四价缀合疫苗（有佐剂）＞本发明四价缀合疫苗（无佐剂）＞厂家1四价缀合疫苗＞厂家2二价缀合TT疫苗；对W型脑膜炎球菌荚膜多糖抗体滴度水平做比较时，本发明四价缀合疫苗（有佐剂）＞本发明四价缀合疫苗（无佐剂）＞厂家1四价缀合疫苗；对Y型脑膜炎球菌荚膜多糖抗体滴度水平做比较时，本发明四价缀合疫苗（有佐剂）＞本发明四价缀合疫苗（无佐剂）=厂家1四价缀合疫苗。这一结果与图3数据结果相同。
实验证明采用配方2，3，5，6也可以产生与配方1和4的相似效果。
实验证明用磷酸铝、弗氏佐剂、单磷酰脂A、CpG、QS-21、霍乱毒素或甲酰甲硫氨酰肽为佐剂也可以产生相似的结果。
实验证明苄醇、对羟苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯铵作为防腐剂作为流脑多糖-蛋白质缀合疫苗的组成成分。
参考文献
中国专利CN100556459.
中国专利CN1889975A
美国专利US20090311285.
美国专利US6146902,
美国专利US4356170
Reido，F.X.，Plikaytis,B.D.和Broome,C.V.(1995)儿科传染性疾病杂志（Pediatric Infectious Diseases Journal）14,643-657页
P．W.Anderson，M.E.Pichichero,R.A.Insel,R.Betts,R.Eby,和D.H.Smith.（1986），免疫学杂志(J．Immunol.)137，1181–1186页
H.J.Jennings,和C．Lugowski,（1981）,免疫学杂志(J.Immunol.)127,1011–1018页
Bartlet，G．R．J,（1959）,生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)，234，466-468
Hesterin，S．(1949)生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)，180,249页
Park，J．T．和Johnson，M．J．1949.生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)，181，149-151
Oliver H.Lowry,Nira J.Rosebrough,A.Lewis Farr,和Rose J.Randall,（1951）.生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)193，265-275页 。
Claims (9)
1.流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，其特征是用[S-C]n-[N-P]m表示，其中S表示一种流脑多糖分子，C表示该流脑多糖分子中引入醛基的C原子，P表示CRM197蛋白分子，N表示该蛋白分子中赖氨酸侧链氨基的N原子；n和m大于1且小于10；所述S的分子量>100KD；所述[S-C]n-[N-P]m的平均分子量在200KD到2000KD之间，所述流脑多糖为W-135型和Y型流脑多糖中的至少一种，所述流脑多糖为奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖的简称。
2.根据权利要求1所述的流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，其特征是所述[S-C]n-[N-P]m的平均分子量在200KD到700KD之间。
3.多价流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，其特征是包括权利要求1或2流脑多糖-蛋白质缀合疫苗，还包括A型流脑多糖与载体蛋白结合的缀合物和C型流脑多糖与载体蛋白结合的缀合物。
4.流脑多糖-蛋白质缀合疫苗的制备方法，其特征是包括如下步骤：
（1）将纯化的流脑多糖溶解于水或乙酸钠缓冲液中，按照流脑多糖与高碘酸盐质量比为1：0.02-0.2的比例加入高碘酸盐，活化反应后，超滤或透析去除未反应的高碘酸盐，使流脑多糖上相邻的双羟基被氧化成醛基，得到引入醛基的活化流脑多糖；
（2）按质量比为0.5-3：1的比例将步骤（1）获得的所述活化流脑多糖和纯化的载体蛋白CRM197溶解于磷酸盐缓冲液中，调节pH到6.5和8.5之间，以氰基硼氢化钠:醛基摩尔比5-10的比例加入氰基硼氢化钠进行还原胺反应18-48小时，使活化流脑多糖的醛基和CRM197表面赖氨酸上的氨基产生联接；
（3）加入硼氢化钠封闭活化流脑多糖上未反应的醛基；通过硫铵沉淀或者疏水柱层析的方法去除未与载体蛋白CRM197产生反应的游离流脑多糖，得到纯化的流脑多糖-蛋白质缀合疫苗；所述流脑多糖血清型为W-135和Y至少一种，所述流脑多糖为奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖的简称。
5.根据权利要求1，2或3所述的疫苗，其特征是还包括佐剂。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征是所述佐剂选自铝佐剂、弗氏佐剂、单磷酰脂A、CpG、QS-21、霍乱毒素或甲酰甲硫氨酰肽。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征是所述铝佐剂为磷酸铝或氢氧化铝。
8.根据权利要求1，2或3所述的疫苗，其特征是还包含药学可接受的防腐剂。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征是所述防腐剂选自苄醇、对羟苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯铵。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN113274489A (zh) * | 2021-04-30 | 2021-08-20 | 山东省药学科学院 | 一种预防真菌感染的几丁质寡糖疫苗及其制备方法 |
| US11951165B2 (en) * | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
| US11998599B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-06-04 | Vaxcyte, Inc. | Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1610560A (zh) * | 2001-01-23 | 2005-04-27 | 安万特巴斯德公司 | 多价脑膜炎球菌多糖－蛋白质缀合疫苗 |
| CN1688343A (zh) * | 2002-08-30 | 2005-10-26 | 启龙有限公司 | 修饰糖、其缀合物及其制备方法 |
| CN1852733A (zh) * | 2003-05-07 | 2006-10-25 | 安万特巴斯德公司 | 多价脑膜炎球菌衍生的多糖－蛋白质缀合物及疫苗 |
| CN1889975A (zh) * | 2003-10-02 | 2007-01-03 | 启龙有限公司 | 多种脑膜炎球菌血清群的液体疫苗 |
| CN101460193A (zh) * | 2006-04-07 | 2009-06-17 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 缀合疫苗 |
-
2012
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1610560A (zh) * | 2001-01-23 | 2005-04-27 | 安万特巴斯德公司 | 多价脑膜炎球菌多糖－蛋白质缀合疫苗 |
| CN1688343A (zh) * | 2002-08-30 | 2005-10-26 | 启龙有限公司 | 修饰糖、其缀合物及其制备方法 |
| CN1852733A (zh) * | 2003-05-07 | 2006-10-25 | 安万特巴斯德公司 | 多价脑膜炎球菌衍生的多糖－蛋白质缀合物及疫苗 |
| CN1889975A (zh) * | 2003-10-02 | 2007-01-03 | 启龙有限公司 | 多种脑膜炎球菌血清群的液体疫苗 |
| CN101460193A (zh) * | 2006-04-07 | 2009-06-17 | 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 | 缀合疫苗 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11951165B2 (en) * | 2016-12-30 | 2024-04-09 | Vaxcyte, Inc. | Conjugated vaccine carrier proteins |
| US11998599B2 (en) | 2016-12-30 | 2024-06-04 | Vaxcyte, Inc. | Polypeptide-antigen conjugates with non-natural amino acids |
| CN113274489A (zh) * | 2021-04-30 | 2021-08-20 | 山东省药学科学院 | 一种预防真菌感染的几丁质寡糖疫苗及其制备方法 |
| CN113274489B (zh) * | 2021-04-30 | 2023-08-29 | 山东省药学科学院 | 一种预防真菌感染的几丁质寡糖疫苗及其制备方法 |
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