CN101934077A

CN101934077A - 多价的脑膜炎球菌产生的多糖-蛋白质偶联物和疫苗

Info

Publication number: CN101934077A
Application number: CN2010102067830A
Authority: CN
Inventors: R·P·赖亚尔
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 2004-08-30
Filing date: 2005-08-29
Publication date: 2011-01-05
Also published as: ZA200701675B; IL181551A0; KR20070101207A; WO2006026689A3; EP1784214A2; JP2012140456A; AU2005279821A1; CN101048177A; EP1784214A4; BRPI0515125A; US20060088554A1; JP2008517876A; EP2351582A1; CA2577920A1; WO2006026689A2

Abstract

本发明描述衍生化多糖-蛋白质偶联物，含有一种或几种这样的衍生化多糖-蛋白质偶联物的组合物和用它们对人患者免疫的方法。所述衍生化多糖-蛋白质偶联物是来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A，C，W-135，和Y的纯化荚膜多糖，经化学活化衍生化，并且通过共价化学键选择性地与载体蛋白质连接，形成能对各种脑膜炎奈瑟氏球菌菌株激发长期免疫性的多糖-蛋白质偶联物。

Description

多价的脑膜炎球菌产生的多糖-蛋白质偶联物和疫苗

本申请是申请日为2005年8月29日，申请号为200580037092.X的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。

相关申请交叉参考

本申请要求2004年8月30日递交的美国临时申请号60/605,579的优先权。

发明背景

1.发明领域

本发明总的来说涉及医药领域，更具体地涉及微生物学，免疫学，疫苗以及通过免疫学方法预防细菌病原体感染。

2.相关领域概述

脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是遍及世界的细菌性脑膜炎和脓毒症的主要原因。最近30年，地方性脑膜炎球菌病发生率在发达国家范围是每100,000人1至5例，在发展中国家范围是每100,000人10至25例(Reido，F.X.，等，(1995)Ped.Infect.Dis.J.14，pp.643-657)。传染病流行期间，脑膜炎球菌病发生率达到每1000,000人1000例。在美国每年有大约2,600例细菌性脑膜炎，而在发展中国家平均是330,000例。病例死亡率范围在10和20％之间。

病原性脑膜炎球菌被多糖膜包被，多糖膜与生物体外膜表面连接。在荚膜多糖免疫特异性基础上已经鉴定了13种不同的血清组(Frasch，C.E.，等，(1985)Rev.Infect.Dis.7，pp.504-510)。这13种血清组中，五种引起大多数脑膜炎球菌病；这些包括血清组A，B，C，Wl35，和Y。血清组A是大多数传染病的原因。血清组B，C，和Y引起大多数传染病和局部爆发。

人鼻-口咽粘摸是唯一已知的脑膜炎奈瑟氏球菌天然贮存库。菌落化即在粘膜细胞的外表面也在鼻咽的上皮下组织发生。脑膜炎球菌的输移能持续数月。脑膜炎球菌的传播通过直接接触或者通过空气液滴发生。作为胞吞作用的结果，脑膜炎球菌经吞噬细胞空泡通过粘膜上皮途径而入侵。宿主对入侵脑膜炎球菌的抵御依赖于补体介导的溶菌作用。负责补体介导的溶菌作用的血清抗体大部分定向抗外荚膜多糖。

有人描述过以脑膜炎球菌多糖为基础的疫苗，其激发抗荚膜多糖的免疫应答。这些抗体能进行血清组特异性脑膜炎球菌的补体介导的溶菌作用。脑膜炎球菌多糖疫苗被证明对孩子和成人是有效的(Peltola，H.，等，(1997)New Engl.J.Med 297，pp.686-691和Artenstein，M.S.，等，(1970)New Engl.J.Med.282，pp.417-420)，但是效力对婴儿和儿童是有限的(Reingold，A.L.，等，(1985)Lancet 2，pp.114-118)。对低龄人群的后续剂量多糖激发弱的应答或者没有加强应答(Goldschneider，L，等，(1973)J.Infect.Diseases 128.pp.769-776和Gold，R.，等，(1977)J.Infect.Diseases.136，S31-S35)。脑膜炎球菌多糖疫苗激发的保护作用的时间持续不长，估计对成人和四岁以上的孩子是3-5年之间(Brandt，B.L.和Artenstein，M.S.(1975)J.Infect.Diseases.131，pp.S69-S72，Kyhty，H.，等，(1980)J Infect.Diseases.142，pp.861-868，和Cessey，S.J.，等，(1993)J.Infect.Diseases.167，pp 1212-1216)。对于1-4岁儿童保护期短于三年(Reingold，A.L.，等，(1985)Lancet 2，pp.114-118)。

多糖不能与主要组织相容性复合分子结合，后者是抗体呈递和刺激T-辅助淋巴细胞的先决条件，即，它们是T-细胞不依赖性抗原。没有T-辅助淋巴细胞的帮助，多糖也能刺激B淋巴细胞产生抗体。作为B淋巴细胞T-不依赖性刺激作用的结果，接种这些抗原之后没有没有记忆诱导。多糖抗原对成人能激发非常有效的T-不依赖性应答，但是这些T-不依赖性应答在婴儿和儿童不成熟免疫系统中是弱的。

通过多糖与蛋白质分子(″载体″或″载体蛋白″)的共价连接，T-不依赖性多糖抗原能被转化为T-依赖性抗原。对作为偶联的载体蛋白的一部分的肽特异性辅助T细胞能激活结合偶联疫苗的多糖成分的B细胞。T-辅助细胞对载体蛋白的应答用来增加对多糖的抗体产生。

已经证明血清组B多糖对人类没有免疫原性(Wyle，F.A.，等，(1972)J.Infect.Diseases.126，pp.514-522)。这种血清组多糖与蛋白质的化学连接没有显著改变实验室动物的免疫应答(Jennings，H.J.和Lugowski，C.(1981)J.Immunol.127，pp.1011-1018)。对这种血清组多糖没有免疫应答的原因想必是由血清组B多糖和多唾液酸化宿主糖蛋白例如天然细胞附着分子之间的结构相似性而来。

有人描述过以血清组C多糖为基础的脑膜炎球菌偶联物疫苗。这种一价疫苗激发对相应于血清组C脑膜炎奈瑟氏球菌菌株上存在的荚膜多糖的强功能抗体应答。这样的疫苗只能保护预防血清组C细菌引起的疾病。

现有的以脑膜炎球菌多糖为基础的疫苗对儿童的应用有局限性并且对成人没有提供长期的保护作用。已经证明对有脑膜炎球菌感染风险的所有人群包括儿童能激发长期保护作用的唯一脑膜炎球菌疫苗是以来自脑膜炎奈瑟氏球菌单一血清组的多糖为基础并且不提供抗其他血清组感染的保护作用。因此，对于能对有脑膜炎球菌感染风险的儿童和成人提供抗脑膜炎球菌疾病的广泛长期的保护作用的脑膜炎球菌偶联疫苗是存在需求的。本发明的多价脑膜炎球菌多糖通过提供一种疫苗制剂而满足这种需求，这种疫苗制剂中来自脑膜炎奈瑟氏球菌主要病原性血清组的免疫原多糖通过与载体蛋白偶联已经被转化为T-依赖性抗原。

FDA对脑膜炎球菌多糖疫苗的许可以使用兔崽补体(SBA-BR)进行的细菌实验为基础，实验是对接种了许可疫苗的那些兔崽的血样进行的。政府和专家组的数据公开了目前以这样的实验为基础评价脑膜炎球菌多糖疫苗的要求和建议，例如，证明接种抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A和C的健康成人受试者体内细菌抗体产生的诱导的WHO专家委员会生物学标准(WHO 1976)；确定分析标准参数的国际比较研究中的CDC SBA-BR使用相同的标准参考血清，CDC供体R21654-3430107，那是比较研究中的质量控制血清样品中的一种(Maslanka SE，等，1997.Clin.Diagn.Lab.Immunol.4：156-167)；和标准化CDC方法，这是WHO专家委员会疫苗和生物制品部要求的最佳方法(WHO 1999)。

因为已经证明对脑膜炎球菌疾病的人免疫性与通过血清杀菌试验(SBA)检测的补体介导的杀菌抗体的水平很好关联而得以许可(Goldschneider，I，等，1969，J.Exp.Med.129：1307-1326和Goldschneider，I，等.，1969，J.Exp.Med.129：1327-1348)。在试验(SBA-H)中使用人补体确定了抗血清组C的1∶4 SBA效价的替代水平。然而，对脑膜炎球菌多糖疫苗的许可必要条件的基础是使用兔崽补体(SBA-BR)作为试验中的补体源的血清杀菌应答的诱导作用(世界健康组织，1976，脑膜炎球菌多糖疫苗的必要条件。世界健康组织技术报告系列，no.594。世界健康组织，日内瓦，瑞士(WHO 1976)。根据这个必要条件，当试验抵抗下面靶菌株或等价菌株时接种2-4周之后，接种了脑膜炎球菌多糖疫苗的至少90％的受试者血清的抗体效价应该显示高四倍或更多：对于血清组A是A1，对于血清组C是C11，对于血清组Y是S-1975，和对于血清组W-135是S-4383(WHO 1976，WHO1981，Bureau of Biologies，Food and Drug Administration，1985年7月17日)。The Bureau of Biologies采用WHO建议，根据这个必要条件，美国许可了脑膜炎球菌多糖疫苗，联合A和C组，联合A，C，Y，和W-135组。为了有利于脑膜炎球菌疫苗诱导的杀细菌活性的试验间比较，通过多试验研究确定了使用兔崽补体(SBA-BR)的标准SBA(MaslankaSE，等，1997.Clin.Diagn.Lab.Immunol.4：156-167)。

随着开始可获得脑膜炎球菌偶联C疫苗的数据，人们开始关心在试验中使用兔补体可以导致假高SBA效价。澄清并解决与用于人血清脑膜炎球菌血清组A和C特异性抗体的实验室分析相关问题的1999年3月会议之后，WHO专家委员会对生物学标准建议，使用兔崽补体的SBA用于测定对血清组C的抗体应答(世界健康组织，1999，对脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A/C疫苗的免疫应答评价的血清学测定的标准和验证。日内瓦，WHO/V&B/99，19(WHO 1999))。

在避免使用兔崽补体的过度刺激保护作用的努力中，WHO建议进行一项研究来校正使用兔崽补体的SBA试验测定的效价相对于使用人补体测定的SBA效价的阈值。随后举行了会议并且给出结果支持一个一般性结论，即使用兔崽补体的＜1∶8的SBA效价与抗血清组C的保护作用的不存在相关联，并且使用兔崽补体的＞＝1∶128的SBA效价与使用人补体的1∶4的保护性SBA效价很好地相关联。没有提供有关其它脑膜炎球菌血清组，例如A，Y或W-135，或者多糖偶联物的校正SBA-BR效价的信息。

使用兔崽补体的1∶8和1∶64之间的SBA效价不必需与使用人补体的1∶4的保护性SBA效价很好地相关联(Jodar L，等，Biologicals 2002；30：323-329)。WHO专家委员会推荐使用人补体再评价1∶8，1∶16，1∶32和1∶64的接种后SBA-BR效价。解决1∶8，1∶16，1∶32和1∶64的SBA-BR效价的不确定性的其他方法包括接种之前和接种之后之间的抗体SBA效价的四倍提高的评价。也提供保护作用关联性的记忆证明，然而专家委员会认识到对于这些替代可得到的数据或者不恰当或者是有限的。

高于1∶8的SBA-BR效价是人对于脑膜炎球菌疾病免疫性的一个较好的标记，例如免疫之前至接种之后大约15至大约45天之后SBA-BR效价提高四倍或更高。

在一个实施方案中，本发明提供了一种使用多价脑膜炎球菌多糖偶联物组合物对人患者接种的方法，其中人患者有1∶16或更高的血清SBA-BR效价，优选地，1∶32或更高，更优选地，1∶64或更高，更优选地，1∶128或更高。在其它实施方案中，本发明提供了一种使用脑膜炎球菌多糖偶联物组合物对人患者接种的方法，其中人患者免疫之前至接种之后抗体SBA效价提高四倍或更高。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种给人患者提供抗多血清组脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫性的方法，即使用多价脑膜炎球菌多糖偶联物组合物对人患者接种，其中所述组合物含有选自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A和W-135；Y和W-135；C和Y；C和W-135；A，C和Y；A，C和W-135；C，Y和W-135；A，Y和W-135；以及A，C，Y和W-135的两种或多种多糖。

在另外的实施方案中，本发明提供了一种给人患者提供抗多血清组脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫性的方法，即使用多价脑膜炎球菌(纯化)多糖偶联物组合物对人患者接种，其中所述多糖经衍生化作用而小于100,000道尔顿。在本发明的一个实施方案中，将纯化的多糖解聚使得多糖平均大小是大约5,000至大约75,000道尔顿；优选地，使得多糖平均大小是大约7,000至大约50,000道尔顿；更优选地，使得多糖平均大小是大约8,000至大约35,000道尔顿；更优选地，使得多糖平均大小是大约12,000至大约25,000道尔顿。在本发明的一个实施方案中，使组合物中多糖平均大小是大约15,000至大约22,000道尔顿。

发明概述

本发明提供一种通过施用脑膜炎球菌多糖-蛋白质偶联物的免疫组合物而为人提供抗病原性脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜炎球菌疾病的免疫性的方法。

在本发明的一个实施方案中，免疫组合物含有两种或多种蛋白质-多糖偶联物，其中每种偶联物含有与载体蛋白偶联的来自脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖。在优选的实施方案中，免疫组合物含有两种或多种不同的蛋白质-多糖偶联物，其中每种偶联物含有与载体蛋白偶联的来自不同血清组脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖。

本发明提供一种为人提供抗病原性脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜炎球菌疾病的免疫性的方法。包括施用含有两种或多种不同的蛋白质-多糖偶联物的免疫组合物，其中每种偶联物含有与载体蛋白偶联的来自不同血清组脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖。

本发明提供一种为人提供抗病原性脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜炎球菌疾病的免疫性的方法。包括施用脑膜炎球菌多糖-蛋白质偶联物。本发明提供由免疫有效量的两种至四种不同蛋白质-多糖偶联物组成的多价脑膜炎球菌疫苗，其中每一种偶联物含有与载体蛋白偶联的不同荚膜多糖，其中每种荚膜多糖选自来自血清组A，C，W-135和Y的荚膜多糖。本发明进一步提供诱导对脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖的免疫应答的方法，包括对人施用免疫有效量的本发明的免疫组合物。在一个实施方案中，多价脑膜炎球菌疫苗含有免疫有效量的两种不同的蛋白质-多糖偶联物，其中每种偶联物含有与载体蛋白偶联的不同荚膜多糖，并且其中每种荚膜多糖选自来自血清组A，C，W-135和Y的荚膜多糖，更优选地，含有荚膜多糖A和W-135，A和Y，C和W-135，C和Y，以及W-135和Y的荚膜多糖。在一个实施方案中，多价脑膜炎球菌疫苗含有免疫有效量的三种不同的蛋白质-多糖偶联物，其中每种偶联物含有与载体蛋白偶联的不同荚膜多糖，并且其中每种荚膜多糖选自来自血清组A，C，W-135和Y，更优选地，含有荚膜多糖A，C和W-135，A，C和Y，C，Y和W-135，C，W-135和Y，以及A，W-135和Y。在另一个实施方案中，多价脑膜炎球菌疫苗含有免疫有效量的四种不同的蛋白质-多糖偶联物，其中每种偶联物含有与载体蛋白偶联的不同荚膜多糖，并且其中每种荚膜多糖选自来自血清组A，C，W-135和Y的荚膜多糖。

本发明还提供了诱导对脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖的免疫应答的方法，包括对人或动物施用免疫有效量的本发明的免疫组合物。

本发明提供了由免疫有效量的2-4种不同的蛋白质-多糖偶联物组成的多价脑膜炎球菌疫苗，其中每种偶联物含有与载体蛋白偶联的不同荚膜多糖，并且其中每种荚膜多糖选自来自血清组A，C，W-135和Y的荚膜多糖。

本发明提供保护易感脑膜炎奈瑟氏球菌的人或动物的方法，包括对人或动物施用免疫有效量的本发明疫苗。

在其它实施方案中，本发明提供加强第一、第二、第三等剂量脑膜炎球菌疫苗或免疫原组合物之后激发的应答的方法。在一些实施方案中，第一(或更多)剂量的脑膜炎球菌疫苗或免疫原组合物含有来自一种或几种血清组脑膜炎奈瑟氏球菌(血清组A，B，C，Y，W-135，等)的荚膜多糖。在其它一些实施方案中，第一(或更多)剂量的脑膜炎球菌疫苗或免疫原组合物含有与一种或几种载体(例如载体蛋白)偶联的来自一种或几种血清组脑膜炎奈瑟氏球菌(例如，血清组A，B，C，Y，W-135，等)的荚膜多糖。在优选实施方案中，载体蛋白是免疫原性的和/或提供另外的治疗或其它利益。在一些优选实施方案中，通过一次或几次后来剂量的含有来自1，2，3，4，或多种不同血清组脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖的疫苗或免疫原性组合物来加强一次或几次剂量脑膜炎球菌疫苗或免疫原组合物之后激发的受试者(例如人)的第一次应答。但是本发明不限于施用一次或几次致敏剂量的含有非偶联荚膜多糖的疫苗或免疫原组合物，本发明也不是要受限于施用一次或几次含有偶联荚膜多糖-载体蛋白的疫苗或免疫原性组合物的加强剂量。同样，本发明也不是要受限于致敏剂量和加强剂量的时间间隔。

这里引用的所有专利文献，专利申请，和其它公开物在此全文引作参考。

附图说明

图1-15B说明本发明一些优选的实施方案。

本发明的详细描述

本发明包括两种或几种不同蛋白质-多糖偶联物的免疫组合物，其中每种偶联物包括与载体蛋白偶联的荚膜多糖。因此，本发明包括含有与一种或几种不同载体蛋白偶联的两种或几种不同的衍生化荚膜多糖的组合物。

通过本领域技术人员公知的标准方法能制备荚膜多糖。在本发明中，从脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A，C，W-135和Y制备的荚膜多糖是优选的。

在优选实施方案中，通过分开的过程制备这些脑膜炎球菌血清组偶联物，并且配制成单一剂量制剂。例如，分别纯化脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A，C，W-135和Y的荚膜多糖。

在本发明优选实施方案中，在与载体蛋白偶联之前将纯化的多糖解聚并激活。在本发明优选实施方案中，使用温和氧化条件将来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A，C，W-135和Y的荚膜多糖部分解聚。

天然脑膜炎球菌多糖是大约500,000至1,500,000道尔顿。本发明涉及较小大小的脑膜炎球菌多糖。当纯化天然多糖时，一定百分比的多糖是较小大小。然而，为了获得更好的产率，一般优选将天然脑膜炎球菌多糖解聚，或者衍生化为优选大小范围，优选地小于100,000道尔顿。在本发明的一个实施方案中，纯化的多糖被解聚成大约5,000至大约75,000道尔顿平均多糖大小；优选地，解聚成大约7,000至大约50,000道尔顿平均多糖大小；更优选地，解聚成大约8,000至大约35,000道尔顿平均多糖大小；甚至更优选地，解聚成大约12,000至大约25,000道尔顿平均多糖大小。在本发明的一个实施方案中，组合物中平均多糖大小是大约15,000至大约22,000道尔顿。

然后接着进行活化步骤可以将多糖解聚或部分解聚。所谓″活化″意思是对多糖进行化学处理，得到能与载体蛋白反应的化学基团。优选的活化方法涉及在用pH 5.0.+-.0.1的生理盐水中在15至30℃下用己二酸二酰肼处理大约2小时。美国专利No.5,965,714中描述了一种活化方法。

一旦活化，荚膜多糖然后就可以偶联一种或几种载体蛋白。在本发明优选的实施方案中，各个荚膜多糖分别与一种载体蛋白物质偶联。在优选的实施方案中，来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A，C，W-135和Y的荚膜多糖分别与相同载体蛋白物质偶联。

载体蛋白可以包括细菌毒素，例如白喉毒素，灭活细菌毒素，例如白喉类毒素，CRM₁₉₇，破伤风类毒素，百日咳类毒素，大肠杆菌LT，大肠杆菌ST，和来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa.)外毒素A。也可以使用细菌外膜蛋白，例如，外膜复合体c(OMPC)，膜孔蛋白，转铁蛋白结合蛋白，pneumolysis，肺炎球菌表面蛋白A(PspA)，或者肺炎球菌黏附素蛋白(PsaA)。其它蛋白质，例如卵白蛋白，匙孔血蓝蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)或者结核菌素(PPD)的纯化的蛋白质衍生物也可以用作载体蛋白。载体蛋白优选无毒的不是反应原性的并且能以足够量和纯度获得的蛋白质。载体蛋白应该可进行标准偶联程序。在本发明优选实施方案中，从白喉棒状杆菌培养物纯化的并且使用甲醛化学解毒的白喉毒素被用作载体蛋白。另一种可供选择的载体蛋白是蛋白质D，它是流感嗜血杆菌(H.influenza)外膜表面暴露蛋白。

在本发明一个实施方案中，各种衍生化多糖与载体蛋白的平均比例是大约1∶1至大约1∶20(w/w)。在本发明一个优选实施方案中，总的衍生化多糖与载体蛋白的平均比例是大约1∶2至大约1∶10(w/w)，各种衍生化多糖与载体蛋白的更优选的平均比例是大约1∶2至大约1∶6(w/w)。在本发明更优选实施方案中，总的衍生化多糖与载体蛋白的平均比例是大约1∶(4±1)；更优选地，1∶(4±0.5)，更优选地，1∶(4±0.25)(w/w)。

荚膜多糖与载体蛋白偶联之后，可以利用多种多样的技术纯化多糖-蛋白质偶联物(富集多糖-蛋白质偶联物的量)。纯化步骤的一个目的是从多糖-蛋白质偶联物去除没有结合的多糖。纯化的一种方法涉及在硫酸铵存在下超滤，描述于美国专利No.6,146,902。或者，通过多种技术能从没有反应的蛋白质和多糖纯化出偶联物，其中包括，大小排阻色谱法，密度梯度离心法，疏水作用色谱法或者分级分离法。参见，例如，P.W.Anderson，等(1986)。J.Immunol.137：1181-1186.还可参见H.J.Jennings和C.Lugowski(1981)J.Immunol.127：1011-1018。

多糖和载体蛋白偶联之后，通过将各种衍生化多糖-蛋白质偶联物混合来制备本发明的免疫组合物。本发明的免疫组合物含有与一种或几种载体蛋白偶联的两种或几种不同荚膜多糖。本发明优选的实施方案是含有分别与白喉毒素或类毒素偶联的来自脑膜炎奈瑟氏球菌的血清组A和C的衍生化荚膜多糖的二价免疫组合物。更优选地，本发明是含有分别与白喉毒素或类毒素偶联的来自脑膜炎奈瑟氏球菌的血清组A，C，W-135和Y的荚膜多糖的四价免疫组合物。

本发明部分涉及多成分衍生化多糖偶联物，其中各种衍生化多糖在每剂量中存在大约0.5至大约15微克。因此，组合物可以含有1微克至60微克的总的衍生化多糖微克。在优选实施方案中，组合物中各种衍生化多糖的相对量在±50％之内；更优选地，±30％之内；更优选地，±20％之内，大约相等。

载体蛋白的制备和使用，和各种有效的偶联方法，是本领域技术人员公知的。本领域技术人员利用本发明的教导以及一般文献中容易获得的信息能制备本发明的偶联物。从下面的一个专利或所有专利也能得到指导，这些专利的教导全文在此引作参考：美国专利Nos.4,356,170；4,619,828；5,153,312；5,422,427和5,445,817。

或者，通过将两种或几种脑膜炎奈瑟氏球菌血清组一起培养并共纯化，解聚，活化并与多糖偶联，或者通过分别培养纯化脑膜炎奈瑟氏球菌血清组，并在解聚，活化并与多糖偶联步骤之前或之后混合两种或几种纯化多糖，可以制备免疫组合物。

从不同脑膜炎球菌血清组分别制备多糖-蛋白质偶联物，然后混合偶联物，来制备本发明的免疫组合物。本发明的免疫组合物可以用作疫苗。应用本领域公知的方法能制备本发明的疫苗制剂。本发明的疫苗组合物还可以含有一种或几种辅助剂。辅助剂包括，例如但不限于，铝辅助剂(例如，铝盐，例如氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝或者其混合物)，弗氏佐剂(完全或不完全)，BAY，DC-chol，pcpp，单磷酸脂质A，CpG，QS-21，霍乱毒素和甲酰基甲硫氨酰肽。参见，例如，Vaccine Design，the Subunitand Adjuvant Approach，1995(M.F.Powell和M.J.Newman，编著，Plenum Press，N.Y.)。辅助剂优选是铝辅助剂，例如氢氧化铝或磷酸铝。

可选择的辅助剂包括水包油乳状液制剂，例如PCT公开.No.WO90/14837中公开的MF59，SAF，含有10％角鲨烷，0.4％Tween 80，5％pluronic-保护聚合物L121，和thr-MDP，RibiTM辅助剂体系(RAS)，(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)含有2％角鲨烯，0.2％Tween 80，和一种或几种选自单磷酸脂A(MPL)，海藻糖二霉菌酸(TDM)的细菌细胞壁成分，和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；皂甙辅助剂，例如可以使用StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，Mass.)或者从其得到的颗粒，例如ISCOMs(免疫刺激复合体)；细胞因子，例如白细胞介素(例如，IL-I，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12，等)，干扰素(例如，γ干扰素)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)。在本发明一个实施方案中，蛋白质-多糖有大约0.05至大约2的平均糖基化比例(多糖与蛋白质之比)；更优选地，大约0.08至大约1.25的平均比例；更优选地，大约0.1至大约0.9的平均比例。在一个优选实施方案中，蛋白质-多糖偶联物有大约0.2至大约0.8的平均糖基化比例多糖与蛋白质之比；更优选地，大约0.2至大约0.6的平均比例，在更优选的实施方案中，大约0.3至大约0.5的平均比例。

如下所证明的，根据本发明的疫苗和免疫组合物对各种不同动物模型激发T-依赖-样免疫应答，而多糖疫苗激发T-不依赖-样免疫应答。因此，本发明的组合物还是研究对脑膜炎奈瑟氏球菌抗原的T-依赖-样免疫应答中涉及的生物学途径和过程的研究工具。

根据药学和兽医领域技术人员公知的标准技术能确定对人或动物施用的本发明疫苗的量和给药方案，考虑的因素如特定抗原，辅助剂(如果存在)具体动物或患者的年龄，性别，体重，物种和症状，和给药途径。在本发明中，提供抗脑膜炎奈瑟氏球菌接种有效剂量的多糖-蛋白质载体的量可以在每千克体重大约0.02微克至大约5微克之间。本发明优选的组合物和方法中，剂量在每千克体重大约0.1微克至大约3微克之间。例如，如果感染后历时较短，则因为细菌增殖所用时间较短而使得有效剂量要求较少抗体。在类似方法中，有效剂量取决于诊断时细菌负载量。治疗性应用应该考虑经一段时间施用多次注射。

本发明的多价偶联物可以给药一次或者一系列给药(即，用″加强剂量″或″几次加强剂量″)。例如，一名儿童可能在生命早期接受一次剂量，然后10年之后给予一次加强剂量，这是目前要求的预防儿童期疾病的其它疫苗。

加强剂量会从致敏的B-细胞产生抗体，即记忆性应答。也就是说，与许可的多糖疫苗相比，多价偶联物疫苗对相对年轻人群激发高的第一次(即，一次施用疫苗之后)功能抗体应答，并且能激发记忆性应答(即，加强剂量之后)，证明本发明的多价偶联物疫苗激发的保护性免疫应答有效期长。

本发明的组合物包括孔口用液体制剂，例如，口服，鼻用，肛门，阴道，经口，胃内，粘膜(例如，经舌，牙槽，齿龈，嗅觉或呼吸膜)等。给药，例如混悬剂，糖浆或酏剂；和用于肠胃外，皮下，真皮内，肌内，腹膜内或静脉内给药(例如，注射给药)的制剂，例如无菌混悬剂或乳状液。静脉内和肠胃外给药是优选的。这样的组合物可以与合适的载体，稀释剂，或赋形剂混合，例如无菌水，生理盐水，葡萄糖等。也可以冻干组合物。组合物可以含有辅助物质，例如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂，凝胶化或黏度增强添加剂，防腐剂，矫味剂，颜料，等，取决于期望的给药途径和制剂。可以查阅标准教科书，例如″REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCE″，17增刊，1985，这里引作参考，不用特殊实验就可以来制备合适的制剂。

在本发明的一个实施方案中，优选给药途径是肌内或皮下，肌内途径是优选的。通过注射或者通过送递装置可以给药。

方便地将本发明的组合物制成液体制剂，例如，等渗水溶液，混悬剂，乳状液或可以缓冲至选择的pH的粘组合物。如果消化道吸收是优选的，本发明的组合物可以是″固体″形式的药丸，片剂，胶囊等，包括缓释的或者装填有液体的″固体″制剂，装填有液体的″固体″制剂例如明胶覆盖的液体，从而明胶溶解于胃中送递给肠。如果期望鼻或呼吸(黏膜)给药，组合物可以是挤出型喷雾分配器，泵出分配器或气溶胶分配器形式并通过它们分配。气溶胶通常利用碳氢化合物来加压。泵出分配器优选分配计量的剂量或者有特定颗粒大小的剂量。

液体制剂一般比凝胶，其它粘稠组合物，和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在某种程度上更方便给药，特别是通过注射或口服，对动物，儿童，特别是小孩，以及对吞咽药丸，片剂，胶囊等困难，或者多次给药困难的情况下。另一方面，粘稠组合物能在合适的粘度范围内配制，以提供与黏膜的更长时间的接触，例如在胃黏膜或鼻黏膜内层。

在本发明优选实施方案中，疫苗组合物配制成无菌液体，无热原，磷酸盐缓冲生理盐水，有或没有防腐剂。在一个优选实施方案中，每剂量组合物含有大约0.3至大约1.0毫克磷酸钠和大约3.5至大约6.0毫克氯化钠和多至1.5毫升水。在一个优选实施方案中，每剂量组合物含有大约0.6±0.2毫克磷酸钠和4.4±0.2毫克氯化钠和多至0.5±0.2毫升水。

显然，对合适的载体和其它添加剂的选择取决于精确的给药途径和特定剂型的性质，例如，液体剂型(例如，无论组合物配制成溶液，混悬液，凝胶或另一种液体形式)，或固体剂型(例如，无论组合物配制成药丸，片剂，胶囊，香囊剂(caplet)，随时间释放的剂型或装填液体的剂型)。

溶液，混悬液和凝胶除了活性成分外一般含有主要量的水(优选纯化水)。也可以存在少量的其它成分，例如pH调节剂(例如，碱，例如NaOH)，乳化剂或分散剂，缓冲剂，防腐剂，湿润剂，凝胶剂(例如甲基纤维素)，颜料和/或调味剂。组合物可以是等渗的，即其可以有和血液和泪液相同的渗透压。

使用酒石酸钠，聚乙二醇或其它无机或有机溶质可以实现期望的本发明组合物的等渗性。在一个实施方案中，从磷酸钠或氯化钠，或者它们的混合物获得优选的组合物的等渗性。对于含有钠离子的缓冲剂，氯化钠是特别优选的。

使用药学可接受增稠剂可以将组合物粘度保持在选择水平。甲基纤维素是优选的，因为它容易获得并且经济并且容易操作。其它合适的增稠剂包括，例如，黄耆胶，羧甲基纤维素，羟丙基纤维素，木炭等。增稠剂优选的浓度取决于选择的试剂。重点是使用实现选择的粘度的量。一般通过加入这样的增稠剂从溶液制备粘稠组合物。

为了提高组合物货架保存期，可以使用药学可接受防腐剂。苄醇是合适的，但是也可以使用各种各样的防腐剂，包括，例如，对羟基苯甲酸酯，乙基汞硫代水杨酸钠，氯丁醇，或也可以使用benzalkoniumchloride。防腐剂合适的浓度是以总重量为基础0.02％至2％，但是也可以根据选择的试剂而变化。

本领域技术人员认识到必须选择与脑膜炎奈瑟氏球菌多糖-蛋白质载体偶联物是化学惰性的组合物成分。

参照下面本发明概念几个详细优选实施方案中给出的下面的详细描述的非限制性实施例进一步描述本发明。

下面的缩写和商标是：ACIP，免疫实施咨询委员会；AE，副作用；Cetavalon^TM，溴化十六烷基三甲铵，CTAB；CFR，联邦规则代码；CRF，报告表例；DTP，白喉破伤风百日咳；ELISA，酶联免疫吸收测定；FDA，食品和药物管理部(Food and Drug Administration)；GCP，好的临床实践；GMC，几何平均浓度；GMT，几何平均效价；IgG，免疫球蛋白G；IgG1，免疫球蛋白G亚类1；IgG2，免疫球蛋白G亚类2；IgM，免疫球蛋白M；ICH，国际协调会议；IND，调查新药；IRB，InstitutionalReview Board；MenA/C-Dt二价(A和C)脑膜炎球菌多糖白喉偶联物疫苗；MenPS，脑膜炎球菌组特异性多糖；mL，毫升；Menomune^TM，许可的脑膜炎球菌A，C Y和W-135多糖疫苗；OD，光密度；PBS，磷酸盐缓冲盐水；SAE，严重副作用；SBA，血清杀菌活性；SBA-BR，使用兔崽补体进行的血清杀菌活性测定；SBA-HC，使用人补体进行的血清杀菌活性测定；SIDS，新生儿突然死亡综合征；TetraMenD，四价(A，C，Y，和W-135)脑膜炎球菌多糖白喉偶联物疫苗；Td，破伤风和白喉疫苗；UAE，意外的副作用；URI，后期呼吸感染；μg，微克。

实施例

实施例1脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A，C，W-135，和Y纯化荚膜多糖粉末的制备

粗糊状物制备

分别地，将脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A，C，W-135，和Y湿冷冻种子培养物解冻并且借助液体Watson Scherp培养基回收并且接种在含有Mueller Hinton琼脂培养基的Blake瓶中。Blake瓶在35至37℃下CO₂中温育15-19小时。温育期之后，移开从Blake瓶中生长的培养物并加给含有Watson Scherp培养基的4L烧瓶。烧瓶在平板摇动器上在35至37℃下温育3-7小时。将4L烧瓶中的内含物转移给含有Watson Scherp培养基的发酵器。发酵器在35至37℃下温育7-12小时，用补充原料和止泡剂来控制溶解的氧内含物和pH。温育期之后，将发酵器中的内含物转移给500L罐，加入Cetavlon^TM，将原料混合1小时。将Cetavlon处理的培养物以，每小时大约30-70升的流速以大约15,000-17,000xg离心。利用第二次Cetavlon^TM沉淀法从上清液沉淀出粗多糖。将Cetavlon^TM加给上清液，原料在室温下混合至少1小时。将材料在1至5℃下贮藏8-12小时。以每分钟300至400ml的流速以大约45,000-50,000xg离心收集沉淀的多糖。将收集的糊状物在-60℃或更低温度下贮藏，直到进一步处理。

纯化的多糖粉末制剂

将灭活的糊状物解冻并且转移给混合器。糊状物与0.9M氯化钙混合得到均匀的悬浮液。该悬浮液以大约10,000xg离心15分钟。第一次萃取时将上清液倾析通过一个没有皮棉的垫倒入容器。将第二容积的0.9M氯化钙加给糊状物并混合，得到均匀悬浮液。如上将悬浮液离心，上清液与第一次萃取的上清液混合。共进行四次萃取，合并上清液。使用10-30kDa MWCO螺旋超滤设备将合并的萃取液超滤浓缩。

向浓缩液中加入氯化镁，使用氢氧化钠将pH调至7.2-7.5。向浓缩液中加入DNA酶和RNA酶，混合下在25-28℃下温育4小时。加入乙醇达到浓度30-50％。以10,000xg离心2小时去除沉淀的核酸和蛋白质。回收上清液，通过加入乙醇达到80％并在1-5℃下静置过夜而沉淀出多糖。将醇虹吸出，沉淀出的多糖以10,000xg离心5分钟。用醇洗涤沉淀出的多糖。多糖用丙酮洗涤，以10,000xg离心15-20分钟。真空干燥多糖。将最初的多糖粉末溶解于乙酸钠溶液。加入氯化镁，使用氢氧化钠溶液将pH调至7.2-7.5。向溶液中加入DNA酶和RNA酶，混合下在25-28℃下温育4小时去除残余核酸。与这些酶温育之后，想多糖-酶混合物加入等体积的乙酸钠-苯酚溶液，并且置于1-5℃下平摇动器上大约30分钟。混合物以10,000xg离心15-20分钟。回收上面的含水层并保存。向含水层加入等体积的乙酸钠-苯酚溶液，并且如上萃取。共进行四次萃取从多糖溶液去除蛋白质和内毒素。用注射用水将合并的含水萃取液稀释至10倍，并且用10倍体积的注射用水渗滤。向渗滤的多糖加入氯化钙。通过加入乙醇达80％在1-5℃下沉淀过夜沉淀出多糖。回收醇上清液，以10,000xg离心15分钟收集多糖。纯化的多糖用乙醇洗涤两次，用丙酮洗涤一次。真空下在干燥器中干燥洗涤过的粉末。干燥过的粉末在-30℃或更低温度下贮存直到加工成偶联物。

实施例2脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A，C，W135，和Y纯化的荚膜多糖粉末的解聚作用

这项制备中使用的材料包括来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A，C，W135，和Y(根据实施例1制备的)的纯化的荚膜多糖粉末，无菌50mM乙酸钠缓冲液，pH 6.0，无菌1N盐酸，无菌1N氢氧化钠，30％过氧化氢，无菌生理盐水(0.85％氯化钠)。

在分开的反应中将各血清组多糖解聚。将不锈钢罐装满最多60g纯化的荚膜多糖粉末。向多糖加入无菌50mM乙酸钠缓冲液，pH 6.0，使得浓度是每升2.5g多糖。让多糖溶液在1-5℃下混合12-24小时形成溶液。反应罐与热交换器装置连接。加入另外的50mM乙酸钠缓冲液，pH 6.0，将多糖稀释至每升1.25g的反应浓度。将多糖溶液加热至55℃±0.1。向反应混合物加入等份的30％过氧化氢，得到1％过氧化氢的反应浓度。

根据多糖分子大小随时间的变化监测反应过程。每15-20分钟，从反应混合物取出等份并且注入HPSEC柱，测定多糖的分子大小。当多糖的分子大小达到目标分子大小时，关掉加热装置，通过冰水浴循环将多糖溶液快速冷却至5℃。通过将反应罐与装有3000MWCO再生纤维素柱的超滤装置连接，将解聚多糖溶液浓缩至每升15克。用10体积的无菌生理盐水(0.85％氯化钠)将浓缩解聚多糖溶液渗滤。在下一步过程之前将解聚多糖在1-5℃下保存。

通过以商品名″Ultahydrogel.TM.250″出售的用葡聚糖分子大小标准校正并多角激光散射的凝胶过滤色谱柱过柱测定解聚多糖的分子大小。应用Bartlet，G.R.J.(1959)Journal of Biological Chemistry，234，pp-466-468的方法，通过血清组A的磷含量，或者应用Svennerholm，L.(1955)Biochimica Biophysica Acta 24，pp604-611的方法，通过血清组C，W135和Y的唾液酸含量，来测定多糖的量。通过Hesterin，S.(1949)Journal of Biological Chemistry 180，p249的方法测定O-乙酰基含量。通过Park，J.T.和Johnson，M.J.(1949Journal of BiologicalChemistry 181，ppl49-151的方法测定还原性。通过蛋白质.sup.¹H和.sup.¹³C NMR测定解聚多糖的结构完整性。通过测定LAL(内毒素)含量和残存过氧化氢含量来测定解聚多糖的纯度。

实施例3脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A，C，W135，和Y解聚多糖的衍生化作用

这项制备中使用的材料包括来自脑膜炎奈瑟氏球菌的过氧化氢解聚荚膜多糖血清组A，C，W-135，和Y(根据实施例2制备的)，己二酸二酰肼，l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)只适用于血清组A，氰基硼氢化钠，无菌1N盐酸，无菌1N氢氧化钠，无菌1M氯化钠，和无菌生理盐水(0.85％氯化钠)。

各种血清组多糖在分开的反应中衍生化。向不锈钢罐加入纯化的解聚多糖，用无菌0.85％生理盐水稀释，达到每升6g多糖的最终反应浓度。为了实现每升1g的反应浓度，向该溶液加入一份溶解于无菌0.85％生理盐水的浓缩己二酸二酰肼。为了实现每升1g的反应浓度，仅对血清组A，加入一份作为溶解于无菌0.85％生理盐水的浓缩EDAC。室温下(15-30℃)使用无菌1N盐酸，无菌1N氢氧化钠将pH调节至5.0±0.1，并且将这个pH保持2小时。2小时之后，向该反应混合物加入一份溶解于0.85％生理盐水的浓缩氰基硼氢化钠，实现反应浓度每升2g。保持pH 5.5±0.5下室温下(15-30℃)将反应搅拌44小时±4小时。这个反应期后，将pH调节至6.0±0.1，并且通过将反应罐与装有3000MWCO再生纤维素柱的超滤装置连接，将衍生化多糖浓缩至每升12克多糖。浓缩的衍生化多糖用30体积的1M氯化钠渗滤后用10体积的0.15氯化钠渗滤。将罐从超滤装置上解下来并且在1-5℃下保存7天。将罐从装有3000MWCO再生纤维素柱的超滤装置上解下来，用30体积的1M氯化钠渗滤后用10体积的0.15氯化钠渗滤。

利用和对解聚多糖使用的相同的方法测定衍生化多糖的分子大小，多糖的量，和O-乙酰基含量.通过Snyder，S.L.和Sobocinski，P.Z.(1975)Analytical Biochemistry 64，pp282-288的2，4，6-三硝基苯磺酸方法测定酰肼含量。通过质子¹H和¹³C NMR测定衍生化多糖的结构完整性。通过测定没有结合的酰肼含量，LAL(内毒素)含量，和残留的氰基硼氢化物含量来测定衍生化多糖的纯度。

实施例4载体蛋白的制备

粗白喉类毒素蛋白质的制备

重新组成冻干的菌种培养物并且温育16-18小时。将一份培养物转移给含有生长培养基的0.5-升烧瓶，培养瓶在旋转摇动器上在34.5-36.5℃下培养7-9小时。将一份培养瓶中的培养物转移给含有生长培养基的4-升烧瓶，培养瓶在旋转摇动器上在34.5-36.5℃下培养14-22小时。使用4-升烧瓶中的培养物接种含有生长培养基的发酵罐。发酵罐在34.5-36.5℃下培养70-144小时。发酵罐中的内含物通过深过滤器过滤到收集容器中。加入一等份37％甲醛溶液，达到0.2％的浓度。将pH调节至7.4-7.6。收集物通过0.2微米过滤芯过滤到灭菌20升瓶中。瓶子在34.5-36.5℃下保温7天。向各个20升瓶中加入一等份37％甲醛溶液，达到0.4％的浓度。将混合物pH调节至7.4-7.6。瓶子在在摇动器上34.5-36.5℃下保温7天。向各个20升瓶中加入一等份37％甲醛溶液，达到0.5％的浓度。将混合物pH调节至7.4-7.6。瓶子在34.5-36.5℃下保温8周。对粗类毒素测定解毒作用。在试验期间瓶子在1-5℃下保存。

粗白喉类毒素蛋白质的纯化

让粗类毒素温热至室温，并且将20升瓶中的内含物合并到纯化罐中。将类毒素的pH调节至7.2-7.4，并且向粗类毒素加入木炭并混合2分钟。让木炭类毒素混合物静置1小时，然后通过深过滤芯过滤到第二纯化罐中。向滤液中加入固体硫酸铵实现70％饱和。将pH调节至6.8-7.2，让溶液静置16小时。过滤收集沉淀的蛋白质并用70％的饱和硫酸铵溶液，pH 7.0洗涤。将沉淀物溶解于无菌蒸馏水，并将蛋白质溶液过滤到不锈钢收集容器中。将pH调节至6.8-7.2，加入硫酸铵至40％饱和。将溶液pH调节至7.0-7.2，让溶液静置16小时。过滤去除沉淀物并弃除。向滤液中加入硫酸铵至60％饱和，将pH调节至7.0-7.2，让混合物静置16小时，过滤收集沉淀的蛋白质。将沉淀物溶解于无菌蒸馏水，过滤去除没有溶解的蛋白质，用0.85％生理盐水渗滤。

纯化的白喉类毒素蛋白质的浓缩和灭菌过滤

使用10,000MWCO再生纤维素过滤柱将蛋白质溶液浓缩至每升15g并用10体积的0.85％生理盐水渗滤。通过0.2微米膜过滤将浓缩蛋白质溶液灭菌。在加工成偶联物之前将蛋白质溶液在1-5℃下贮存。

通过Lowry，O.H.等(1951)Journal of Biological Chemistry 193，p265-275的方法测定蛋白质浓度。通过无菌，LAL(内毒素)含量，和残留的甲醛含量来测定蛋白质的纯度。

实施例5脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A，C，W-135，和Y多糖与白喉类毒素蛋白质的一价偶联物的制备

该项制备中使用的材料包括来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A，C，W-135，和Y的己二酸衍生化多糖(根据实施例3制备)，无菌白喉类毒素蛋白质(根据实施例4制备)，EDAC，硫酸铵，无菌1N盐酸，无菌1N氢氧化钠，和无菌生理盐水(0.85％)。

在分开的反应中制备各种血清组多糖偶联物。所有四种偶联物都根据下面的方法制备。以每升700-1000微摩尔反应酰肼的反应浓度向不锈钢罐中加入纯化己二酸衍生化多糖和以每升3.8-4.0克蛋白质的反应浓度加入纯化白喉类毒素蛋白质。使用生理盐水0.85％将起始物稀释至目标反应浓度并将pH调节至5.0±0.1。向多糖蛋白质混合物加入一份EDAC，使反应浓度达到每升2.28-2.4克。15-30℃下将反应pH保持在5.0±0.1反应2小时。2小时之后，使用无菌1N氢氧化钠将pH调节至7.0±0.1，反应在1-5℃下保存16-20小时。

让反应混合物温热至15-30℃，并且将反应容器与装备有30,000MWCO再生纤维素芯的超滤装置连接。加入固体硫酸铵至60％饱和(对于血清组A，W-135和Y)和50％饱和(对于血清组C)。偶联反应混合物用20体积的60％饱和硫酸铵溶液(对于血清组A，W-135和Y)和50％饱和硫酸铵溶液(对于血清组C)渗滤，接着用20体积的0.85％生理盐水渗滤。将经渗滤的偶联物首先通过含有1.2微米和0.45微米过滤器的过滤囊过滤，然后提高含有0.22微米过滤器的第二过滤囊过滤。

根据对解聚和衍生化多糖使用的相同的方法测定多糖和O-乙酰基内含物的量。通过Lowry方法测定蛋白质的量。通过以商标″TSK6000PW″出售的使用DNA作为空白体积标记，ATP用作总体积标记，和牛甲状腺球蛋白用作参照标记的凝胶过滤色谱柱，测定偶联物的分子大小。另外，通过多角激光散射测定TKS6000PW柱洗脱出来的偶联物的分子大小。应用双-夹层ELISA方法通过与抗-多糖血清组特异性抗体结合测定偶联物的抗原特征。通过疏水性相互作用色谱柱洗脱测定没有结合的(没有偶联的)多糖的量，用毛细电泳法测定没有偶联的蛋白质，测定无菌性，LAL(内毒素)含量，残留EDAC含量，和残留的铵离子含量，来测定偶联物的纯度。

实施例6多价脑膜炎球菌A，C，W-135，和Y多糖白喉类毒素偶联物疫苗制剂

该项制备中使用的材料包括根据实施例5制备的血清组A，C，W-135，和Y多糖-白喉类毒素偶联物，无菌100mM磷酸钠缓冲生理盐水(0.85％氯化钠)。

向不锈钢批量生产罐中的生理盐水(0.85％)加入一份无菌100-500mM磷酸钠缓冲生理盐水，得到10mM磷酸钠最终疫苗浓度。向含有10mM无菌磷酸钠缓冲生理盐水的批量生产罐加入两种至四种无菌一价脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素偶联物各一份，得到每毫升缓冲液8微克各种血清组多糖的最终浓度。将配制的四价偶联物混合并通过0.2微米过滤器过滤到第二个批量生产罐中。

应用高pH阴离子-交换色谱法用脉冲电流测定，通过糖成分分析测定多价制剂中存在的各种血清组多糖的量。用Lowry的方法测定蛋白质的量。利用与pH计量器连接的组合电极测定疫苗的pH.利用双-夹层ELISA方法通过与抗-多糖血清组特异性抗体来测定多价偶联物疫苗的抗原性特征。对多价偶联物疫苗的免疫原性测定疫苗中存在的各种偶联物对动物模型激发原发的和加强的抗-多糖IgG免疫应答的能力。通过使用高pH阴离子-交换色谱法用脉冲电流测定没有结合的(没有偶联的)多糖的量，无菌性，LAL(内毒素)含量，热源量，和一般安全性，来测定多价偶联物疫苗的纯度。

实施例7氢氧化铝辅助的多价脑膜炎球菌多糖白喉类毒素偶联物的制备

吸附到氢氧化铝上的偶联物的制备

该项制备中使用的材料包括根据实施例5制备的血清组A，C，W-135，和Y多糖-白喉类毒素偶联物，无菌100mM磷酸钠缓冲生理盐水(0.85％氯化钠)，和生理盐水(0.85％氯化钠)中的无菌氢氧化铝。

向含有生理盐水的批量生产罐中的加入一份各无菌一价脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素偶联物，得到每毫升缓冲液8微克各血清组多糖的最终浓度。向多价偶联物疫苗加入一份生理盐水(0.85％氯化钠)中的无菌氢氧化铝，达到每毫升疫苗0.44mg铝离子的最终浓度。

实施例8磷酸铝-辅助的偶联物的制备

该项制备中使用的材料包括根据实施例5制备的血清组A，C，W-135，和Y多糖-白喉类毒素偶联物，无菌生理盐水(0.85％氯化钠)，和生理盐水(0.85％氯化钠)中的磷酸铝。

向含有生理盐水的批量生产罐中的加入一份无菌一价脑膜炎球菌多糖-白喉类毒素偶联物的一种，得到每毫升缓冲液8微克血清组多糖的最终浓度。向多价偶联物疫苗加入一份生理盐水(0.85％氯化钠)中的无菌氢氧化铝，达到每毫升疫苗0.44mg铝离子的最终浓度。

实施例9人临床研究中使用的材料和方法的一般性描述

四价衍生偶联物疫苗的免疫原性

在多种不同临床程序中对偶联物疫苗研究它对人激发免疫应答的能力。下面的研究总结了结果。除非另有说明，在下面各项研究中使用的材料和方法是：

TetraMenD

TetraMenD疫苗含有血清组A，C，Y，和W-135的四种脑膜炎球菌荚膜多糖，它们与48微克白喉类毒素蛋白。在无菌无热源磷酸盐缓冲生理盐水中配制疫苗制剂，没有防腐剂。制剂含有0.6mg磷酸钠，4.4mg氯化钠和至多0.5mL水。

在美国和其他地方得到授权对两岁和更大的人群使用。

是冻干制剂，每剂量疫苗含有各种A，C，Y和W-135多糖50微克作为抗原，用硫汞撒防腐的等渗氯化钠稀释剂重新构成，并且以0.5mL剂量皮下给药。每0.5mL剂量疫苗含有2.5mg至5mg乳糖作为稳定剂。皮下使用的

A/C/Y/W-135，脑膜炎球菌多糖疫苗，混合A，C，Y，和W-135，是来自脑膜炎奈瑟氏球菌组-特异性多糖抗原A组，C组，Y组，和W-135组的冻干制剂。稀释剂是无菌无热源蒸馏水。根据标签指示用稀释剂重新构成冻干产品之后，每0.5mL剂量在等渗氯化钠溶液中配制成含有50微克来自各种血清组A，C，Y，和W-135的″分离产物″。

Tetanus and Diphtheria Toxoids Adsorbed for Adult(后来被指定为Td)是含有调控pH的磷酸钠缓冲液的等渗氯化钠溶液中明矾沉淀类毒素无菌悬浮液。该疫苗用于肌内注射。经化验，每0.5mL剂量配制成含有5Lf破伤风类毒素，2Lf白喉类毒素和不多于0.28mg的铝。在豚鼠效能试验中破伤风和白喉类毒素分别诱导每毫升至少2单位和0.5单位的抗毒素。第一次试验中，使用一英寸25标准度量针头通过肌内注射对所有参与者施用Td，注射到左臂三角肌。每0.5mL剂量含有5Lf的破伤风类毒素和2Lf的白喉类毒素。

血清样品

在基线后指定的天数取血样。例如，如果方案指定三个时间点，D0，D28和6个月，则在接种前第0天(基线)，接种后第28天(评价初期免疫应答)，和接种后第6个月(评价免疫应答的长期性)取血样。在每个时间点对每个受试者采集大约5毫升的全血。在采集的4小时内将全血离心。取出血清并保存在-20℃。‘28天′血样在第0天注射之后至少28天但不到57天时获取。″6个月″血样在第0天注射之后6个月加或减28天时获取。这样，第28天血清代表D0后第28天至第56天之间取出的血清；6个月血清代表D0后第149天至第217天之间取出的血清。

分析技术

本项研究使用多种标准免疫试验。下面的描述总结了这里使用的方法。然而，其它相似方法，包括这里给出的那些方法的变化形式，是本领域公知的并且可以使用。

使用兔崽补体(SBA-BR)通过血清杀细菌试验的抗-脑膜炎球菌抗体测定

应用血清杀细菌试验测定抗-脑膜炎球菌抗体抗血清组A，C，Y，和W-135的功能抗体活性。在无菌96-孔微升板中制备两倍稀释的试验血清。向血清稀释液中加入血清组特异性脑膜炎球菌和兔崽补体并温育。温育期过后，向血清/补体/细菌混合物加入琼脂覆盖培养基，使变硬，然后在37℃5％CO₂下温育过夜。计数孔中存在的细菌菌落。通过与补体对照孔平均值相比得到＞50％杀伤的血清稀释度倒数测定终点效价。使用兔补体的该项试验测定的限度是效价8。

IgG抗-脑膜炎球菌抗体测定

利用间接ELISA测定抗-脑膜炎球菌抗体抗血清组A，C，Y，和W-135的IgG抗体活性。这道程序包括使血清中的抗体与通过甲基化人血清白蛋白与塑料微量滴定孔吸附的过量脑膜炎球菌组特异性多糖(MenPs)抗原反应。通过与过氧化物酶-标记的小鼠抗-人IgG特异性单克隆抗体反应测定结合的抗体的量。接着的使用过氧化物酶底物的反应产生可分光光度法测定的产色产物。得到的光密度(OD)相应于血清中与微量滴定板上脑膜炎球菌多糖结合的IgG抗体的量。然后，应用4-参数逻辑曲线方法，用分配值，通过与参考值(Lot CDC 1992或等价物)的比较，计算IgG抗体的量。

IgM抗-脑膜炎球菌抗体测定

利用间接ELISA测定抗-脑膜炎球菌抗体抗血清组A，C，Y，和W-135的IgG抗体活性。这道程序包括使血清中的抗体与通过甲基化人血清白蛋白与塑料微量滴定孔吸附的过量MenPs抗原反应。通过与过氧化物酶-标记的小鼠抗-人IgM特异性单克隆抗体反应测定结合的抗体的量。接着的使用过氧化物酶底物的反应产生可分光光度法测定的产色产物。得到的光密度(OD)相应于血清中与微量滴定板上脑膜炎球菌多糖结合的IgM抗体的量。然后，应用4-参数逻辑曲线，用分配值，通过与参考值(Lot CDC 1992或等价物)的比较，计算IgM抗体的量。

高抗体亲抗原性抗-脑膜炎球菌IgG抗体测定

利用改进的ELISA，在Aventis Pasteur Inc.测定抗-脑膜炎球菌抗体抗血清组A，C，Y，和W-135的高抗体亲抗原性IgG抗体活性。该项试验目前在Aventis Pasteur Inc.的开发下，并且在临床抽样分析之前定性分析。简要地说，96孔微量滴定板包被MenPs抗原。抽吸并清洗包被板之后，使用含有75mM硫代氰酸铵的磷酸缓冲盐水(PBS)血清稀释缓冲液，在平板中直接制备临床血清系列稀释液，并温育过夜。通过与过氧化物酶-标记的小鼠抗-人IgG特异性单克隆抗体反应来测定结合的抗体的量。接着的使用过氧化物酶底物的反应产生可分光光度法测定的产色产物。得到的OD相应于血清中与微量滴定板上脑膜炎球菌多糖结合的高抗体亲抗原性IgG抗体的量。然后，应用4-参数逻辑曲线，通过与参考值(Lot CDC 1992或等价物)的比较，计算高抗体亲抗原性IgG抗体的量。

IgG1和IgG2亚组脑膜炎球菌抗体测定

利用ELISA测定抗-脑膜炎球菌抗体抗血清组A，C，Y，和W-135的IgG1和IgG2亚组抗体分布。血清系列稀释液中存在的抗体与吸附于微量滴定板孔的MenPs抗原反应。使用抗-人IgG1 Fc或IgG2 Fc特异性试剂测定结合的抗体的量。接着的使用酶底物的反应产生可分光光度法测定的产色产物。得到的OD相应于血清中与微量滴定板上脑膜炎球菌多糖结合的IgG1和IgG2抗体的量。以血清样品中IgG1∶IgG2之比，或者，如果可获得合适的参考物，则以样品中IgG1或IgG2的浓度，报道抗体的量。

通过VERO细胞的代谢抑制的抗-白喉抗体测定

通过试验血清保护VERO细胞不受白喉毒素攻击的能力测定抗-白喉抗体应答。使用无菌96-孔微量滴定板，用白喉毒素攻击开始是1∶4稀释度后来是两倍稀释度的试验血清并温育。然后加入VERO细胞，用无菌矿物油密封各孔并温育6-8天。通过观察从细胞代谢副产品得到的培养基的pH指示剂的颜色变化来测定抗体水平。通过与校正的WHO参考血清相比较以国际单位/毫升为单位报道结果，并通过攻击剂量白喉毒素存在下让细胞代谢的最高血清稀释度来测定。通过参考血清的最小可检测抗毒素水平，和试验血清的起始稀释度，来测定检测的低限，并且一般是0.005IU/mL。

通过Elisa的抗-破伤风抗体的测定

通过间接酶联免疫吸附测定(ELISA)测定抗-破伤风抗体水平。该方法包括使试验血清中的抗体和与塑料微量滴定孔吸附的破伤风类毒素反应。通过与碱性磷酸酶偶联的山羊抗-人IgG-特异性抗体反应测定结合的抗体的量。接着的使用碱性磷酸酶底物的反应产生可分光光度法测定的产色产物。得到的OD(光密度)相应于血清稀释液中与抗原包被微量滴定板结合的抗体的量。应用平行线分析方法，用指定单位量，通过与国际人参照值(WHO Lot TE-3)的比较，计算抗体浓度。以每毫升国际单位(IU/mL)报道结果。抗-破伤风IgG ELISA定量测定的最小水平是0.01IU/mL，对该值低于该水平的样品报道为＜0.01IU/mL。

如这里使用的，″副作用″，″严重副作用″，和″意想不到的副作用″是疫苗工业常规理解的术语。根据标准临床实践总结和分析了安全性数据，包括对临床研究期间接受疫苗的所有受试者进行评价。一般情况下，理解各术语具有下面的意义。

副作用(AE)定义为″使用了药物产物的患者或临床研究受试者出现的任何有麻烦的医疗事件，其不必然与这种治疗有因果相关性。因此，副作用可以是任何不利的和非故意的征兆(包括异常实验室发现)，症状，或与药产品(研究对象)使用暂时相关的疾病，不管是否涉及药产品(研究对象)″(ICH指南，GCP(E6)§1.2)。

严重副作用(SAE)是″导致下面任何结果的任何剂量下发生的任何不利药物体验：死亡，威胁生命的不利药物体验，住院病人住院或者住院期延长，持久的或明显残疾/机能不全，或者先天畸形/出生缺陷。当以适当的医学鉴定为基础时，可能不导致死亡，威胁生命，或者要求住院的重要医疗事件可以被认为是严重药物副作用，它们可能危害患者或受试者并且可能要求医疗或手术干预来防止该定义中列出的事件中的一项。这样的医疗事件的例子包括要求在急诊室或者在家中加强治疗的过敏性支气管痉挛，不导致住院的血液恶液质或惊厥，或者产生药物依赖性或药物滥用″(21CFR Ch.I，§312.32(a))。

意料之外的副作用(UAE)是″任何不利药物体验，其特殊性和严重性与当前审查手册不相一致；或者，如果审查手册不是必须的或者可得的，其特殊性和严重性与一般研究计划中或者在当前申请中描述的风险信息不相吻合，如修改的″(21CFR Ch.I，§312.32(a))。

根据标准临床实践进行的研究，以及研究中患者登记或排除的标准是：

患者包含标准：

1.根据医疗史和身体检查确定参加者是健康的。

2.在接种时参加者至少11岁但是还不到19岁。

3.父母/监护人或参与者签署了相关Institutional Review Board(IRB)核准资料内容表。

4.参加者签署了相关Institutional Review Board(IRB)核准协议。

患者排除标准：

1.严重慢性疾病(即心脏病，肾病，神经病，代谢病，风湿病，等)。

2.已知或怀疑免疫功能损伤。

3.在参与期间在最后72小时内没有发烧或者口腔温度≥38℃(100.4°F)的急性内科病。

4.有记载的入侵式脑膜炎球菌病史或者先前脑膜炎球菌接种。

5.在后三个月施用免疫球蛋白，其他血产品，或者在研究疫苗六周内口服或注射皮质类固醇或施用其他免疫调节疗法。只要在登记之前两周内没有接受多于一个疗程，则正在接受持续时间少于7天的口服类固醇治疗方案的个体就可以在试验中登记。

6.在接种之前72小时内抗生素治疗。

7.登记之前28天内接受任何疫苗，或者在登记之后28天内预定接受任何疫苗，除了研究记录另外的接种情况。

8.对任何疫苗成分有怀疑的或已知过敏症。

9.不能完成整个研究期或者不能参加预定访问或者不能遵守研究程序。

10.在另一个临床实验中登记了。

11.在研究人员看来会给参加者带来健康风险或者干扰疫苗评价的任何症状。

12.在接种时有阳性或不明确妊娠试验的女性。

实施例10研究A-剂量研究

研究A是对三个年龄组的参加者施用三个剂量水平的TetraMenD疫苗的不盲开放标记的剂量调整试验。在I阶段登记了90名健康成人(年龄在18至55岁)并且接受一次注射TetraMenD疫苗。在II阶段登记了30名孩子(年龄在12至22个月)并且接受单一剂量水平的TetraMenD疫苗注射两次。在III阶段登记了90名婴儿(年龄在6至12周)并且接受单一剂量水平的TetraMenD疫苗注射三次。

I阶段对18至55岁成人的剂量研究

该项临床试验是对三个年龄组的参加者施用三个剂量水平的TetraMenD疫苗的不盲开放标记的剂量调整试验。在I阶段90名健康成人(年龄在18至55岁)接受了一次注射的TetraMenD疫苗。

对于成人参加者，在施用TetraMenD之前在基线(第0天)和在施用TetraMenD之后28天获得血清学分析用血清样品。对所有获得的样品分析抗脑膜炎球菌多糖血清组A，C，Y，和W-135的SBA，并且通过ELISA分析抗这些相同血清组的IgG抗体。下面总结对于所有血清组的SBA和IgG ELISA观察结果。

一个关键的免疫原性终点是自基线增长4倍的参加者的比例。为了测定基线SBA效价对SBA增长4倍的比例有什么样的影响，对对各特定抗原的基线效价小于1∶64的成人，和对各特定抗原的基线效价至少1∶64的成人进行小组分析。

TetraMenD的安全曲线可与

的相比较。下表总结了该项研究的结果。

表A-3：I阶段(成人)-在基线和注射后第28天实现的SBA阈值随TetraMenD剂量水平的比例(每份记录总数)

N：每个时间点可评价参加者的人数(第0天；第28天)

表A-4：I阶段(成人)-在基线和注射后第28天的SBA和IgG ELISA结果随TetraMenD剂量水平的变化(每份记录总数)

第0天：接种之前获取的基线血样.

第28天：接种之后28天获取的血样.

升高％≥4-倍：与第0天相比，第28天GMT升高≥4-倍的成人的百分比.

N：可评价的参加者的人数.

^＊对SBA数据计算GMTs；对IgG ELISA数据计算GMCs.

表A-5代表GMT随剂量，患者年龄和血清组的变化。

II阶段对12至22个月龄幼儿的剂量研究

该项临床试验是对三个年龄组的参加者施用三个剂量水平的TetraMenD疫苗的不盲开放标记的剂量调整试验。在II阶段，30名健康孩子(年龄在12至22个月)接受了单一剂量的TetraMenD疫苗注射两次。

对于幼儿参加者，在三个时间点获取血清分析用血清样品：TetraMenD注射#1之前基线时(第0天)，登记之后第60天(注射#1之后60天以及注射#2之前立即)，和登记之后第90天(注射#2之后30天)。对所有获得的样品分析抗脑膜炎球菌多糖血清组A，C，Y，和W-135的SBA，并且通过ELISA分析抗这些相同血清组的IgG抗体。下面总结对于所有血清组的SBA和IgG ELISA观察结果。下表中总结了结果。

表A-10：II阶段(幼儿)-基线时，注射#1之后60天，和注射#2之后30天时幼儿SBA和IgG ELISA结果随TetraMenD剂量水平的变化(每份记录总数)

表A-10：II阶段(幼儿)-基线时，注射#1之后60天，和注射#2之后30天时幼儿SBA和IgGELISA结果随TetraMenD剂量水平的变化(每份记录总数)

第0天：注射#1之前获取的基线血样.

第60天：注射#1之后60天和注射#2之前获取的血样.

第90天：注射#2之后30天获取的血样.

升高％≥4-倍：注射#1之后，与第0天相比，第60天GMT升高≥4-倍的幼儿的百分比；

注射#2之后，与第0天相比，第90天GMT升高≥4-倍的幼儿的百分比.

N：可评价的参加者的人数.

^＊对SBA数据计算GMTs；对IgG ELISA数据计算GMCs.

表A-11总结GMT随剂量，患者年龄和血清组的变化。

III阶段对婴儿的剂量研究

该项临床试验是对三个年龄组的参加者施用三个剂量水平的TetraMenD疫苗的不盲开放标记的剂量调整试验。在III阶段，30名健康婴儿(年龄在6至12周)接受了单一剂量的TetraMenD疫苗注射三次。

婴儿参加者在2月龄(注射#1)，4月龄(注射#2)，和6月龄(注射#3)时接受TetraMenD注射。对所有获得的样品分析抗脑膜炎球菌多糖血清组A，C，Y，和W-135的SBA，并且通过ELISA分析抗这些相同血清组的IgG抗体。下面总结对于所有血清组的SBA和IgG ELISA观察结果。下表中总结了结果。

表A-14：III阶段(婴儿)-6月龄(第三次给药之前)和7月龄(第三次给药之后)获得的SBA阈值随TetraMenD剂量水平的比例(每份记录总数)

N：各时间点(6月龄；7月龄)可评价的参加者数目

表A-15：III阶段(婴儿)-6月龄(第三次给药之前)和7月龄(第三次给药之后)婴儿SBA和IgG ELISA结果随TetraMenD剂量水平的变化(每份记录总数)

N：可评价参加者数

^＊对SBA数据计算GMTs；

对IgG ELISA数据计算GMCs.

表A-16代表GMT随患者年龄和血清组的总结。

对婴儿和TetraMenD伴随施用的儿科疫苗

就每次当前ACIP推荐和现场实际情况，现在婴儿接受日常儿科疫苗。在该项研究中，婴儿接受TetraMenD和儿科疫苗。在2，4，和6月龄给与DTacP

和Hib

可以给与IPV或OPV；第一次和第二次注射TetraMenD(2和4月龄)时施用IPV。每次现场实施中给与乙肝疫苗；给一些2月龄参加者施用乙肝疫苗，但是对4月龄或6月龄的参加者不施用。在进行该项试验的婴儿期期间，被许可并且获得ACIP推荐用于常规使用。在该项试验期间，一名参加者在4月龄和6月龄接受了

在6月龄和7月龄评价对常规施用的儿科疫苗抗原的抗体应答。在不同的表中总结了结果。

参加该项试验的婴儿在2，4，和6月龄接受了DTacP和PRP疫苗；第三次注射疫苗之后一个月取7-月龄血样。对于这些疫苗抗原的每一种(白喉，破伤风，百日咳FHA，百日咳PT，和PRP)，观察到的抗体水平证明3个TetraMenD剂量组之间没有统计学显著差异(所有p-值＞0.05)。(参见表A-17)。

在该项试验中，在2月和4月龄给与IPV。第二次注射IPV之后一个月取7-月龄血样。对于1型脊髓灰质炎和2型脊髓灰质炎，观察的GMTs，比例为NA≥1∶4，和比例为NA≥1∶8，证明3个TetraMenD剂量组之间没有统计学显著差异(所有p-值＞0.05)。证明所有3个TetraMenD剂量组的至少95.0％有抗1型脊髓灰质炎和2型脊髓灰质炎的保护作用，比例为NA≥1∶8。对于3型脊髓灰质炎，1微克，4微克，和10微克组中的GMTs分别是562.7，164.0，和113.3。三个类型GMTs各组之间的差异是统计学意义上的(p＝0.001，ANOVA)。然而，所有三个TetraMenD剂量组证明有抗脊髓灰质炎的保护作用，比例为NA≥1∶8(分别是100.0％[22/22]，100.0％[21/21]，和94.1％[16/17])。这些比例没有统计学差异(p＝0.283，Fisher′s精确试验)。此外，对于三个脊髓灰质炎血清型观察到的GMTs很好地落在该项试验中使用的IPV接种方案2和4月龄两个IPV剂量的公布范围内。

最近一次乙肝疫苗接种之后至少5个月取7月龄血。通过GMT和比例≥10mIU/mL观察到的乙肝表面抗体的水平不证明三个TetraMenD剂量组之间统计学显著差异(两者p-值≥0.649)。特别地，该项试验中没有婴儿在6个月回访时接受乙肝疫苗，6个月是这种疫苗第三剂量最早建议年龄。这可以解释为什么乙肝表面抗体效价≥10mIU/mL的7月龄婴儿比例与初始剂量疫苗之后可检测抗体的公开范围相一致，但是低于预示的完成三个接种系之后的保护性抗体水平。该项研究的结果总结在下面的表中。

表A-17：III阶段(婴儿)-7月龄伴随疫苗的免疫原性随TetraMenD剂量水平的变化(每份记录总数)

^＊利用F-试验进行GMT比较.利用Fisher′s精确试验进行百分比比较.

p-值＜0.05

实施例11研究B对2至10龄孩子进行1-6个月研究

这是对2和10龄之间的健康孩子的随机的活动受到控制的研究，将单剂量的TetraMenD与单剂量的Menomune相比较。在D0，接种之前，D28和D0之后6个月采取血样。TetraMenD的总的安全性与Menomune相比是可比较的。该项研究的结果总结在下面的表中。

SBA-BR抗体效价的分布

表B-1给出每个血清组的基线，D28和6个月SBA-BR抗体效价的频率分布。

表B-2对于TetraMenD的几何平均效价(GMT)随受试者年龄和血清组的变化的总结。

表B-3显示对于血清组A，C，Y，和W-135自基线至D28SBA-BR效价提高≥4倍的参加者的数目和比例。对于每个血清组，TetraMenD组中的这些百分比高于

组。比例差别：对于血清组A，C，Y，和W-135分别是-0.0397，-0.0452，-0.1092和-0.0562。

表B-3：对于每份记录总数的初级假设试验总结

n：自基线效价提高≥4倍的参加者人数.

N：使用过的人数中的参加者数目

Pl和Pm：分别对于TetraMenD和

SBA接种之后效价提高≥4倍的参加者比例.

接种之后D28SBA抗体效价≥32的参加者比例总结在表B-3中。

^＊％：n/N.

n：接种之后D28效价≥32的参加者的数目.

N：该组D28时有有效血样的参加者的总数目.

接种之后D28SBA抗体效价≥128的参加者比例总结在表B-4中。

表B-4：接种之后第28天SBA-BR抗体效价≥128的参加者的百分比和数目(每份记录总数)

表B-4接种之后第28天SBA-BR抗体效价≥128的参加者的百分比和数目(每份记录总数)

^＊％：n/N.

n：接种之后D28效价≥32的参加者的数目.

N：该组D28时有有效血样的参加者的总数目.

SBA-BR抗体效价提高至少四倍的参加者比例

表B-5显示D28和第6个月SBA-BR抗体效价自基线提高≥4倍的参加者比例。接受TetraMenD之后第28天至56天，大多数参加者表现出对疫苗中包含的各个血清组SBA-BR抗体效价提高≥4倍。

表B-5：D28和6个月中SBA-BR抗体效价自基线提高≥4倍的参加者的百分比和数目(每份记录总数)

^＊％：n/N.

n：接种之后D28效价≥4的参加者的数目.

N：使用过的人数中的参加者总数目.

D0时效价检测不到(＜8)而在D28天中SBA-BR抗体效价实现提高≥4倍的参加者的比例

在两个治疗组和所有疫苗血清组，在基线时检测不到(＜8)SBA-BR效价的大多数患者在D28天中实现SBA效价提高≥4倍。(表B-6)D0时SBA效价＜8但是到D28时自基线提高≥4倍的参加者比例范围在TetraMenD组中是86.21％至98.57％；在

组中是75.00％至94.64％。

表B-6：D0时效价检测不到(＜8)而在D28天中SBA-BR抗体效价实现提高≥4倍的参加者的数目和比例

^＊n＝各血清组中D0时效价＜8而D28时效价≥32的参加者数目

N＝各血清组中D0时效价＜8的参加者数目

对于百分比是精确95％置信区间

SBA-BR抗体GMTs和平均提高倍数

表B-7显示基线时，接种之后D28和6个月时的SBA GMTs以及SBA GMTs提高倍数。

表B-7：基线时，接种之后D28和6个月时的SBA-BR血清学结果(每份记录总数)

^＊效价或提高倍数，其中提高倍数＝D28时效价/D0时效价

N：计算中使用的参加者的总数目.

血清组A，C，W-135，和Y的ELISA IgG

表B-8给出基线时，接种之后D28和6个月时的IgG GMCs以及IgG GMCs的提高倍数。

表B-8：基线时，接种之后D28和6个月时的IgG血清学结果(每份记录总数)

^＊效价或提高倍数，其中提高倍数＝D28时效价/D0时效价

N：计算中使用的参加者的总数目。

接受所研究的疫苗TetraMenD之后第28天至56天，大多数参加者表现出对疫苗中包含的各个血清组SBA-BR抗体效价提高≥4倍。总的来说，77％的TetraMenD受试者对所有血清组抗体效价提高四倍。与对于血清组C或W-135相比，对于血清组Y观察到更高的接种前的抗体水平。这可能与这样的事实相关，即在该年龄段自然接触血清组Y可能比先前想象的更常见。更高的循环抗体水平反映近期天然接触，并且可能减小表现出4倍或更高抗体应答的疫苗受体的比例。这清楚地表明是当与其他血清组相比血清组Y应答的情况。与对于血清组C是73.4％，对于血清组A是87.7％，对于血清组W-135是91.0％相比，血清组Y提高四倍是56.6％。对于血清组A也观察到高的接种前抗体水平。这可能是间歇性地与几种天然存在的交叉反应抗原接触过长时间引起的结果。

为了进一步评价预先存在的效价的影响和研究血清转化的比例(由当对于任何血清组的接种之前效价＜1∶8时实现抗体效价提高4倍的疫苗接受者的比例确定)，对对疫苗中含有的4种血清组中的任一种有＜1∶8的接种之前抗体效价的参加者进行另一项分析。使用兔崽为补体来源通过SBA分析测得的＜1∶8的效价被认为代表不可检测水平的循环抗体。当使用这项标准评价参加者时，发现用TetraMenD接种之后，对于血清组A血清转化比例是98.6％，对于血清组C是87.9％，对于血清组W-135是96.0％，和对于血清组Y是86.2％。

以对新兵的观察为基础，Goldschneider提出使用人补体来源进行SBA分析得到的≥1∶4的最小效价与抵抗血清组C入侵疾病的保护作用相关。然而，由于该项实验需要标准化以及没有可靠人补体来源，建议将兔崽补体当作可替代来源。脑膜炎球菌显示对兔崽补体比对人补体更灵敏，产生更高的测定的抗体效价。有几个人曾提出使用兔崽补体测定的效价≥1∶128，预示有保护作用，而效价＜1∶8则预示至少对于血清组C灵敏。虽然当评价多糖疫苗时这个水平是适当的，但是它不适用于偶联物疫苗。Borrow提出，在证明接种之后SBA效价在8和64之间的接受一价C偶联物疫苗的受试者中，施用减小剂量(10微克)的脑膜炎球菌多糖疫苗几个月后证明有记忆性应答表明，这些个体也是受到保护的，实现抗体水平≥1∶128.表中给出了接受对于每一种血清组SBA-BR效价≥1∶128的TetraMenD疫苗的受试者的结果。当对疫苗中包含的各种血清组适用这些标准时，总的来说，接受TetraMenD的参加者的96.2％实现了接种后SBA-BR效价≥1∶32，并且90.5％实现效价≥1∶128。也使用一小组来自该项临床研究的血清来评价利用兔崽补体和人补体的SBA试验之间的关系，并且在接下来的研究中提供了结果。

与接受TetraMenD的组相比，

组对于血清组C，Y，和W-135有高得多的总的IgG应答。然而，对于血清组A，C，Y，和W-135，接种之后的SBA GMT水平要比TetraMenD组高得多。

表B-9提供了不同血清组GMC对GMT效价的比较。

偶联物产生的较低水平的IgG产生比多糖疫苗更高水平的杀细菌活性的发现强烈提示，对偶联物疫苗的抗体应答的品质和亲和性都优于没有偶联的多糖疫苗产生的。高亲和性抗体与功能活性和记忆性应答有关。在几项公开的研究中也观察到了这种效果。这些数据证明，TetraMenD在2至10岁龄孩子中是高免疫原性的，对四种血清组中的每一个，对TetraMenD观察到的GMTs优于对

观察到的，实现的效价预示有保护作用。最后，发现TetraMenD对疫苗中包含的每一种血清组产生较高亲和性抗体响应。

在试验期间的四个时间点监测安全性：报道了立即反应(接种的30分钟内)，接种之后头7天内激发的局部和全身反应，接种之后和持续AEs(自D0至D28)间28天内所有的副作用，和D0至接种之后6个月间严重的副作用。

对于所有参加者，两个处理组都报道大多数局部激发反应是轻度的并且在接种三天内消散。各个处理组的局部反应的频率相近。在接受TetraMenD的组中，据报道58.8％至少有一个局部反应，而接受

的组，报道58.3％是相同的。另外，对青少年肌内施用的一价C CRM₁₉₇偶联物疫苗的经验表明，该项研究中，局部反应比例与对于TetraMenD观察到的非常类似。

大多数报道的Aes不是严重的，可逆的，和与接种不相关的。在这项研究中没有新开始的支气管哮喘，糖尿病或自身免疫疾病的报道。

实施例12研究C对11-18龄孩子的一个月研究

研究C是对11-18龄健康孩子的随机的活动受控的研究，是DO的单剂量TetraMenD对单剂量

在DO，在接种之前和D28取血清并分析，并且根据结论中描述的对来自患者的一小组血清进一步评价。

对于所有参加者，据报道两个处理组的大多数局部激发反应是轻度的并且在接种2天内消散。各个处理组的局部反应的频率相近。与接受

的组(34.7％)相比，接受TetraMenD的组中局部反应频率更常见(72.4％)。这个结果可能是由于偶联物疫苗的性质(白喉载体蛋白质)而不是给药途径(肌内)。该项研究的结果总结在下面的表中。

表C-1说明基线和D28对于各血清组SBA-BR抗体效价频率分布。

表C-2总结了使用TetraMenD的受试者年龄和血清组的GMT水平。

表C-3显示对于血清组A，C，Y，和W-135，自基线至D28SBA-BR效价提高≥4倍的参加者的数目和百分比。对于每个血清组，TetraMenD组的这些百分比比组的高。

表C-3：自基线至D28SBA-BR效价提高≥4倍的参加者的数目和百分比

SBA-BR抗体效价≥32的频率

表4总结了接种之后D28时SBA抗体效价≥32的参加者的比例。

表C-4：接种之后D28时SBA抗体效价≥32的参加者的百分比和数目(每份记录总数)

^＊％：n/N.

n：接种之后D28效价≥4的参加者的数目.

N：该组D28时有效血样的参加者总数目.

SBA-BR抗体效价≥128的频率

表5总结了接种之后D28时SBA抗体效价≥128的参加者的比例。

表C-5：接种之后D28时SBA抗体效价≥128的参加者的百分比和数目(每份记录总数)

^＊％：n/N表示为百分比.

n：接种之后D28效价≥128的参加者的数目.

N：该组D28时有效血样的参加者总数目.

SBA抗体效价提高≥4倍的参加者百分比

表C-6显示D28SBA抗体效价自基线提高≥4倍的参加者的比例。

表C-6：D28SBA抗体效价自基线提高≥4倍的参加者的百分比和数目

^＊％：n/N表示为百分比.

n：自基线效价提高≥4倍的参加者的数目.

N：使用的人数中参加者的总数目.

D0时检测不到效价(＜8)而在D28中SBA-BR抗体效价实现提高≥4倍的参加者百分比

在两个处理组中并且对于所有疫苗血清组，基线时检测不到SBA效价(＜8)的大多数参加者在D28天中实现SBA效价实现提高≥4倍。D0时SBA效价＜8而自基线至D28提高≥4倍的参加者的比例范围是98.17％至100.0％(表C-7).

表C-7：D0时检测不到效价(＜8)而在D28中SBA-BR抗体效价实现提高≥4倍的参加者的数目和百分比

^＊n＝各血清组中D0时效价＜8而D28时效价≥32的参加者的数目

N＝各血清组中D0时效价＜8的参加者的数目

百分比是精确95％置信区间

SBA-BR抗体GMTs和平均倍数提高

表C-8显示基线时和接种之后D28天的SBA GMTs以及SBAGMTs提高倍数。

表C-8：基线时和接种之后D28天的SBA血清学结果(每份记录总数)

^＊效价或提高倍数，其中提高倍数＝D28效价/D0效价

N：计算中使用的参加者的总数目.

血清组A，C，W-135，和Y的ELISA IgG

表C-9显示基线时和接种之后D28天的IgG GMCs(微克/毫升)和IgG GMCs提高倍数。

表C-9：基线时和接种之后D28天的IgG血清学结果(每份记录总数)

^＊效价或提高倍数，其中提高倍数＝D28效价/D0效价

N：计算中使用的参加者的总数目.

血清组A，C，W-135，和Y的ELISA IgM

表C-10显示基线时和接种之后D28天的IgM GMCs和IgM GMCs提高倍数.

表C-10：基线时和接种之后D28天的IgM血清学结果(每份记录总数)IgM

表C-10显示基线时和接种之后D28天的IgM GMCs和IgM GMCs提高倍数.

^＊效价或提高倍数，其中提高倍数＝D28效价/D0效价

N：计算中使用的参加者的总数目.

接受所研究的疫苗TetraMenD之后第28天至56天，大多数参加者表现出对疫苗中包含的各个血清组SBA-BR抗体效价提高≥4倍。总的来说，90.7％的TetraMenD受试者对所有血清组抗体效价提高四倍。与对于血清组C或W-135相比，对于血清组Y观察到更高的接种前的抗体水平。这可能与这样的事实相关，即目前血清组Y是在美国该年龄段与入侵性脑膜炎球菌相关的最常见的血清组，并且与该血清组自然接触可能更常见。更高的循环抗体水平反映近期天然接触，并且可能减小表现出4倍或更高抗体应答的疫苗受体的比例。这清楚地表明是当与其他血清组相比血清组Y应答的情况。与对于血清组C是91.7％，对于血清组W-135是96.7％相比，血清组Y提高四倍是81.8％。对于血清组A也观察到高的接种前抗体水平。这可能是间歇性地与几种天然存在的交叉反应抗原接触过长时间引起的结果。

为了进一步评价预先存在的效价的影响和研究血清转化的比例(由当对于任何血清组的接种之前效价＜1∶8时实现抗体效价提高4倍的疫苗接受者的比例确定)，对对疫苗中含有的4种血清组中的任一种有＜1∶8的接种之前抗体效价的参加者进行另一项分析。使用兔崽为补体来源通过SBA分析测得的＜1∶8的效价被认为代表不可检测水平的循环抗体。当使用这项标准评价参加者时，发现用TetraMenD接种之后，对于血清组A血清转化比例是100％，对于血清组C是98.1％，对于血清组W-135是98.1％，和对于血清组Y是98.3％。

如前面另一项研究中讨论的，以对新兵的观察为基础，Goldschneider提出使用人补体来源进行SBA分析得到的≥1∶4的最小效价与抵抗血清组C入侵疾病的保护作用相关。然而，由于该项实验需要标准化以及没有可靠人补体来源，建议将兔崽补体当作可替代来源。脑膜炎球菌显示对兔崽补体比对人补体更灵敏，产生更高的测定的抗体效价。有几个人曾提出使用兔补体测定的效价≥1∶128，预示有保护作用，而效价＜1∶8则预示至少对于血清组C灵敏。虽然当评价多糖疫苗时这个水平是适当的，但是它不适用于偶联物疫苗。Borrow提出，在证明接种之后SBA效价在8和64之间的接受一价C偶联物疫苗的受试者中，施用减小剂量(10微克)的脑膜炎球菌多糖疫苗几个月后证明有记忆性应答表明，这些个体也是受到保护的，实现抗体水平≥1∶128。表中给出了接受TetraMenD疫苗对于每一种血清组SBA-BR效价≥1∶128的受试者的结果。当对疫苗中包含的各种血清组适用这些标准时，总的来说，接受TetraMenD的参加者的99.2％实现了接种后SBA-BR效价≥1∶128。

利用标准ELISA分析，在小组参加者中评价IgG和IgM应答。TetraMenD受试者中，接种之后对于各个血清组IgG抗体的平均水平＞2微克。在两个处理组中，对于各个血清组的IgM应答非常类似。与接受TetraMenD的组相比，接受

组中，对于血清组C，Y，和W-135，IgG应答一般更高。但是对于血清组C，Y，和W-135，接种之后SBA GMT水平在各个处理组是非常类似的，表C-11。

表C-11：对总的杀细菌活性的IgG和IgM的相对分布

^＊GMC单位是微克/毫升

偶联物产生的较低水平的IgG产生和多糖疫苗相似水平的杀细菌活性的发现强烈提示，对偶联物疫苗的抗体应答的品质和亲和性都优于多糖产生的。高亲和性抗体与功能活性和记忆性应答有关。在几项公开的研究中也观察到了这种效果。

这些数据证明，TetraMenD在青少年人群中是高免疫原性的。对于两种疫苗，对于四种血清组中的每一个，GMTs本质上相等，实现的效价预示保护作用，表明TetraMenD对于疫苗中含有的各种血清组产生更高的亲和性抗体应答。

研究D

研究D是对年龄18-55岁健康成人的随机的活动受控的研究，是DO的单剂量TetraMenD对单剂量

在DO，在接种之前和D28取血清并分析。

一般来说，TetraMenD的安全性曲线与Menomune可相比，具体地，对于激发的局部反应(D0-7)，激发的全身反应(D 0-)，没有激发的副作用(D 0-28)，没有激发的显著副作用和SAEs(D29-6个月)，严重副作用(D0-6个月)报道的百分比全都在对于Menomune报道的百分比的2-3％内。下面的表中提供了研究的结果。

SBA-BR抗体效价的分布

表D-1给出基线和D28时对于各个血清组的SBA-BR效价的频率分布。

表D-2提供了使用TetraMenD的受试者年龄和血清组的几何平均效价(GMT)的总结。

表D-3说明对于血清组A，C，Y，和W-135，SBA-BR效价自基线至D28提高≥4倍的参加者的数目和百分比。TetraMenD组中，对于血清组A的数目和百分比，1028/1278(80.4％)；C，1131/1278(88.5％)；Y，941/1278(73.6％)；和W-135，1142/1278(89.4％)，可与组相比，对于血清组A，929/1099(84.5％)；C，985/1099(89.6％)；Y，872/1099(79.3％)；和W-135，1036/1099(94.3％)。

表D-3：对于血清组^＊SBA-BR效价自基线提高≥4倍的参加者的数目和百分比

^＊试验无效假设H₀：

-P_TetraMenD≥0.10对Ha：

-P_TetraMenD＜0.10

n/N：n＝自基线效价提高≥4倍的参加者数目/N＝每份记录总数中参加者的总数目.

P_TetraMenD：TetraMenD组SBA-BR接种后效价自基线提高≥4倍的参加者百分比

§

组SBA-BR接种后效价自基线提高≥4倍的参加者百分比.

SBA-BR抗体效价≥32的频率

表D-4中总结了接种后D28 SBA-BR抗体效价≥32的参加者比例。

表D-4：接种后D28 SBA-BR抗体效价≥32的参加者的百分比和数目(每份记录总数)

^＊％：＝n/N

n＝接种后D28效价≥32的参加者数目/N＝该组中D28时有效血样的参加者的总数目.

SBA-BR抗体效价≥128的频率

表D-5中总结了接种后D28SBA-BR抗体效价≥128的参加者比例。

表D-5：接种后D28SBA抗体效价≥128的参加者的百分比和数目(每份记录总数)

^＊％：＝n/N

n＝接种后D28效价≥128的参加者数目

N＝该组中D28时有效血样的参加者的总数目.

表D-6：对基线协方差调节的GMTs治疗效果的分析：D0至D28的效价差异的反应(每份记录总数)^＊

^＊治疗效果的反对数计算为治疗效果的二次方

SBA-BR抗体效价提高至少4倍的参加者的比例

表D-7显示自基线至D28 SBA抗体效价提高≥4倍的参加者的比例。

表D-7：D28时SBA抗体效价自基线提高≥4倍的参加者的数目和百分比

^＊％：＝n/N

n ＝自基线效价提高≥4倍的参加者数目

N＝各血清组中抽取血样的参加者的数目.

D0时检测不到效价(＜8)而在D28中SBA-BR抗体效价实现提高≥4倍的参加者的比例

表D-8显示D0时检测不到效价(＜8)而在D28中SBA-BR抗体效价实现提高≥4倍的参加者的比例。在两个处理组中和对所有的疫苗血清组，在基线时检测不到SBA效价(＜8)的大多数参加者在D28中SBA效价实现提高≥4倍。在TetraMenD组中，D0时SBA效价＜8而在D28自基线提高≥4倍的参加者的比例范围是90.7％至100.0％，在

组是96.9％至99.3％。

表D-8：D0时检测不到效价(＜8)而在D28中SBA-BR抗体效价实现提高≥4倍的参加者的比例

^＊％：＝n/N

n＝各血清组中D0时效价＜1∶8而D28效价≥1∶32的参加者数目

N＝各血清组中D0时效价＜1∶8的参加者的数目.

表D-9给出基线对和接种之后D28的SBA GMTs以及SBAGMTs提高倍数。

表D-9：对血清组的抗体效价(GMT)的几何平均和GMT提高倍数的总结(每份记录总数)

^＊效价或提高倍数，其中提高倍数＝D28效价/D0效价.

N：各血清组中抽血的参加者数目.注：一名参加者没有第二个血样.

根据标准分布大约值计算的GMT的95％CI.

接受所研究的疫苗TetraMenD之后第28天至56天，大多数参加者表现出对疫苗中包含的各个血清组SBA-BR抗体效价提高≥4倍。对于血清组A，C，Y，和W-135，实现抗体效价提高倍的TetraMenD受试者百分比分别是80.4％，88.5％，73.6％，和89.4％。与对于血清组C或W-135相比，对于血清组Y观察到更高的接种前的抗体水平。这可能与这样的事实相关，即目前血清组Y是在美国该年龄段与入侵性脑膜炎球菌相关的最常见的血清组，并且与该血清组自然接触可能更常见。更高的循环抗体水平反映近期天然接触，并且可能减小表现出4倍或更高抗体应答的疫苗受体的比例。这清楚地表明是当与其他血清组相比血清组Y应答的情况。与对于血清组C是88.5％，对于血清组W-135是89.4％相比，血清组Y提高四倍是73.6％。对于血清组A也观察到高的接种前抗体水平。这可能是间歇性地与几种天然存在的交叉反应抗原接触过长时间引起的结果。

为了进一步评价预先存在的效价的影响和研究血清转化的比例(由当对于任何血清组的接种之前效价＜1∶8时实现抗体效价提高4倍的疫苗接受者的比例确定)，对对疫苗中含有的4种血清组中的任一种有＜1∶8的接种之前抗体效价的参加者进行另一项分析。使用兔崽为补体来源通过SBA分析测得的＜1∶8的效价被认为代表检测不到水平的循环抗体。当使用这项标准评价参加者时，发现用TetraMenD接种之后，对于血清组A血清转化比例是100％，对于血清组C是99.4％，对于血清组W-135是96.5％，和对于血清组Y是90.7％。

如上文在另一项研究中讨论的，以对新兵的观察为基础，Goldschneider提出使用人补体来源进行SBA分析得到的≥1∶4的最小效价与抵抗血清组C入侵疾病的保护作用相关。建议将兔崽补体当作可替代来源。脑膜炎球菌显示对兔崽补体比对人补体更灵敏，产生更高的测定的抗体效价。有几个人曾提出使用兔崽补体测定的效价≥1∶128，预示有保护作用，而效价＜1∶8则预示至少对于血清组C灵敏。虽然当评价多糖疫苗时这个水平是适当的，但是它不适用于偶联物疫苗。Borrow提出，在证明接种之后SBA效价在8和64之间的接受一价C偶联物疫苗的受试者中，施用减小剂量(10微克)的脑膜炎球菌多糖疫苗几个月后证明有记忆性应答表明，这些个体也是受到保护的，实现抗体水平≥1∶128。当对疫苗中包含的各种血清组适用这些标准时，实现接种之后SBA-BR效价≥1∶128的接受TetraMenD的参加者百分比对于血清组A，C，Y，和W-135分别是99.8％，98.7％，96.9％，和97.1％。

实施例13研究E 对10-18岁孩子的Td加强研究

在该项研究中，根据测定它们各自破伤风和白喉效价中有可接受的反应的参加者的比例，将接受了试验四价脑膜炎球菌白喉偶联物疫苗TetraMenD，同时接受Td的组中的破伤风和白喉类毒素(Td)加强反应与接受Td作为安慰剂的组的反应相比较。可接受的反应定义为，接种之后28天，有预定低接种前效价的参加者自基线提高至少4倍，有预定高接种前效价的参加者自基线提高至少2倍。

根据对于各个血清组效价提高至少4倍的参加者的比例所测定的，将与Td共同施用的TetraMenD中对于血清组A，C，Y，和W-135的抗体应答与施用Td疫苗之后施用28天TetraMenD的反应相比。

这是一项随机的改进的双盲的活动受控多中心试验，总计1024名参加者随机分成两组：A和B。

	第0天V1	第28天V2	第56天V3
				A组	BS-1 Td+TetraMenD	BS-2 Plaoebo	BS-3
B组	BS-1 Td+Placebo	BS-2 TetraMenD	BS-3

选择11-17岁年龄范围的孩子作为正常接受Td疫苗作为日常孩童时期免疫日程的一部分的那些个体。另外，这个年龄段被鉴定为有发生入侵性脑膜炎球菌疾病的高风险，并且最可能是一旦许可就接种脑膜炎球菌偶联物疫苗的候选人。为了适当地评价安全性，利用使用安慰剂的改进的双盲设计。对于第一次病访，接种护士不知情并根据方案在各个臂上施用疫苗；TetraMenD(IM)或安慰剂种在右臂，Td在左臂。第一次病访，各个处理组在左臂接受疫苗。评价的护士在不知情下监测局部和全身反应和副反应。

选择11-17岁年龄范围的孩子作为正常接受Td疫苗作为日常孩童时期免疫日程的一部分的那些个体。另外，这个年龄段被鉴定为有发生入侵性脑膜炎球菌疾病的高风险，并且最可能是一旦许可就接种脑膜炎球菌偶联物疫苗的候选人。

在接种之前D0(基线)和接种1之后D28获得用于血清学试验的血样(至少5毫升全血)。病访2之后28天对参加者取第三个血样。在这些时间点，对血清测定脑膜炎球菌血清组A，C，Y，和W-135，抗-白喉抗体和抗-破伤风抗体。

为了评价TetraMenD受者的抗体功能，使用兔崽补体(SBA-BR)对所有可获得的样品测定抗各个疫苗血清组的SBA。一个免疫学终点是SBA-BR效价提高≥4倍的各处理组中参加者比例。以试验血清保护非洲绿猴肾细胞株系细胞抵抗白喉毒素进攻的能力来测量抗-白喉抗体水平。以间接酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定抗-破伤风抗体水平。

该项研究将接受一个剂量的TetraMenD的研究C较早研究的参加者的GMTs测定的对于血清组A，C，Y，和W-135的TetraMenD的抗体应答和与Td同时施用TetraMenD的和Td接种之后28天施用TetraMenD的参加者的反应相比较。

在接种之前基线(D0)和接种之后D28(窗口：+28天)和6个月获得用于血清学分析的血清样品。在接种之前和接种之后28天测定抗破伤风类毒素和白喉类毒素(Td)疫苗的抗体效价。

对在接种之前和接种之后28天获得的所有血清样品测定对脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A，C，Y，和W-135的SBA-BR抗体效价。总之，A组和B组的安全性曲线是可相比的。该项研究的结果总结在下表中。

表E-1总结GMT水平随受试者年龄和血清组的变化.

表E-2显示D28破伤风和白喉抗体提高至少4倍或2倍的参加者的数目和比例。

对于血清组A，C，Y，和W-135的破伤风和白喉抗体效价和SBA抗体效价

表E-2显示D28破伤风和白喉抗体提高至少4倍或2倍的参加者的数目和比例。比例的差异对于破伤风和白喉分别是：2.78和-2.73。

表E-3：D28天对血清组A，C，Y，和W-135的抗体效价提高至少4倍的参加者的数目和比例。

表E-4显示基线时有高白喉和破伤风效价的参加者的数目和D28天效价提高2倍的参加者的数目和比例。

表E-5显示基线时有低白喉和破伤风效价的参加者的数目和D28天效价提高4倍的参加者的数目和比例。

表E-6给出与TetraMenD或安慰剂一起给与的破伤风和白喉接种之后D28破伤风和白喉抗体效价≥1.0IU/ml的参加者的数目和比例。

表E-7给出破伤风和白喉接种(与TetraMenD或安慰剂一起给与)之后D28天破伤风和白喉几何平均抗体效价(GMTs)。

表E-8说明TetraMenD接种之后D28天对血清组A，C，Y，和W-135的SBA-BR几何平均抗体效价(GMTs)。对血清组A，C，Y，和W-135的GMT比分别是0.92，0.42，0.39，和0.32。

表E-9显示Td+TetraMenD，安慰剂组和研究MTA02所得相应结果中，TetraMenD接种之后D28天对血清组A，C，Y，和W-135的SBA-BR几何平均抗体效价(GMTs)。对血清组A，C，Y，和W-135的GMT比分别是0.48，0.38，0.34，和0.39。

表E-10显示Td+安慰剂，TetraMenD组和研究MTA02所得相应结果中，TetraMenD接种之后D28天对血清组A，C，Y，和W-135的SBA-BR几何平均抗体效价(GMTs)。对血清组A，C，Y，和W-135的GMT比分别是0.53，0.90，0.99，和1.05。

表E-11显示每份记录总数TetraMenD接种之后D0和D28天SBA-BR抗体效价随血清组的分布(SBA-BR效价＜8至1024)。

表E-12显示每份记录总数TetraMenD接种之后D0和D28天SBA-BR抗体效价随血清组的分布(SBA-BR效价2048至524288)。

对健康的10-17岁青少年进行相关研究来评价与许可的Td疫苗伴随施用的MCV-4疫苗的安全性和免疫原性。简要地说，在多中心随机试验中，健康的10-17岁青少年(平均年龄12.9岁)接受了TetraMenD(MCV-4)+Td，或者是同时的(n＝509)，或者隔一个月分别探访(n＝512)。在接种之后第8天和28天收集对分开地和同时地给与的两种疫苗的安全性评价。以对白喉和破伤风的抗体效价，和对脑膜炎球菌血清组的血清杀细菌活性(SBA)来评价接种之前和接种之后4周的免疫应答。单独施用Td的受试者的安全性状况与接受Td+TetraMenD的受试者相类似。伴随施用Td+TetraMenD不干扰对破伤风或白喉类毒素的免疫应答。下面表E-14总结了对四种血清组的SBA应答。

表E-14：对四种血清组的SBA应答

该项研究表明，共同施用Td和TetraMenD是安全的并且所试验的受试者是耐受的。伴随施用TetraMenD+Td不会负面影响对破伤风或白喉类毒素的免疫应答。当MCV-4与Td共同施用时，对血清组C，Y，和W135多糖的免疫应答被加强。在该项研究中发现的增强的免疫应答是另人惊奇的和出人意料的。

实施例14使用兔崽补体和使用人补体的对于脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C，W-135和Y的血清杀细菌试验的比较

在该项研究中使用一组来自III阶段研究A的血清样品，来比较血清组C，W-135的SBA-BR效价和SBA-HC效价获得的结果。在该项试验中登记的受试者至少2岁但是还不到11岁，并且随机分为两个接种组。在基线(接种之前)和接种之后D28天从每名受试者采集大约5毫升全血。在采集后4小时之内将来自受试者的血样离心。从血清去除凝块，转移到贴标签的冷冻管中并保存在-20℃或更低温度的有温度监测的冰箱中。该项报告中分析所使用的所有的样品来自在临床研究中登记的第一个受试者的一对血清，并且血清体积足以完成所有计划的试验。所有的样品来自2岁和3岁的受试者，只有一名4岁。有意治疗录中有两名受试者。一名来自TetraMenD疫苗组(D24天时采集接种之后D28样品)，一名来自疫苗组(D9天时采集接种之后D28样品)。

对兔崽补体(

Clinical Systems LLC，Brown Deer，WI，产品代码31038)预先筛选在各血清组特异性分析中的适应性。适应性标准包括符合使用预先定量兔补体的确定一组血清样品(2倍稀释度之内)的SBA-BR试验结果。还使用了汇集参照血清和对照样品的预先测定的效价的标准。在-70℃或更低温度下保存2.5ml兔补体等份备用。将等份样品一次解冻，使用或去除。

通过ELISA对登记的受试者的血清筛选抗-脑膜炎球菌多糖IgG和IgM水平并且在功能抗体的SBA-BR中分析，鉴定抗SBA-H中使用的补体的可能的来源。从选择人补体源确定的标准如下：(1)进行SBA-BR分析时没有可检测到的抗体，(2)当在试验中用作补体源时没有本身固有的杀细菌活性，(3)使用Dr.Ray Borrow的独立外界实验室中测得的有先前阴性试验结果的血清，当与一组阴性对照物一起用作补体源时有可接受的性能，和(4)使用一组24个样品有可接受的再现性。各血清组特异性测定中使用的外来补体源来自不同受试者。没有发现一种补体源对一个以上的血清组有效。还有，SBA分析中使用的三个补体源来自每个血清组中的一个供体。

血清组C

来自几名受试者的有可接受低ELISA值(对于IgG和IgM两者都小于0.5微克/毫升)的血清证明有杀细菌活性。

血清组Y

血清组Y SBA-H的补体源选自在采集方案中登记的受试者。来自补体源的血清通过ELISA显示低水平血清组Y IgG和IgM抗体水平并且在SBA-BR分析中呈阴性。当在SBA中使用时，来自这个补体源的血清没有显示固有的杀细菌活性。

血清组W-135

血清组W-135SBA-H的补体源选自在采集方案中登记的受试者。来自补体源的血清通过ELISA显示低水平血清组W-135IgG和IgM抗体水平，并且在SBA-BR分析中呈阴性。当在SBA中使用时，来自这个补体源的血清没有显示固有的杀细菌活性。

血清杀细菌分析

简要地说，从Centers for Disease Control，Atlanta，GA(CDC)获得脑膜炎球菌血清组C，Y，和W-135菌株。制备细菌的靶菌株用于刚解冻的接种多个血清组C，Y和W-135小瓶的试验中。每个小瓶被用来划线培养在37℃±0.5℃在5％CO₂中保温过夜的Thayer Martin板。第二天，用消毒勺收集分离的菌落并且用来接种已经温热至室温的新鲜Thayer Martin板的整个表面。平板在37℃±0.5℃在5％CO₂中培养4小时，获得一浅层的会合的细菌，用消毒勺收集并悬浮于Dulbecco′s PBS+0.1％葡萄糖缓冲液中，测定光密度(在600nm的吸光度)。在Dulbecco′s PBS+0.1％.葡萄糖缓冲液中制备有规定浓度细菌的分析溶液，保持在环境温度，并且在制备的30分钟之内使用。

将试验样品在56℃下加热处理30分钟使内源补体灭活。向96-孔微量滴定板的所有的孔加入Dulbecco′s PBS+0.1％葡萄糖缓冲液，然后在板上以两倍系列稀释度调配试验血清样品，留最后两列孔为补体和血清对照物孔。每一个平板的列包括补体列([列11]-血清/+补体)和血清对照物列([列12]+血清/-补体)。

将刚解冻的补体与分析浓度的细菌混合，并且把混合物分配给微量滴定板的所有空，但是不分配给血清对照物孔。将没有加补体的细菌分配给血清对照物孔。盖上板并放到平板摇动器上一分钟，然后转移到37℃±0.5℃在CO₂培养箱中。对于血清组A试验板，培养时间是90分钟，对于血清组C，Y，和W-135试验板，培养时间是60分钟。温育之后，将100微升50℃±1℃的琼脂糖覆盖培养基小心地加给所有的孔，避免空气泡产生。微开微量滴定板避免湿气形成，室温下培养10分钟之后，盖上平板并转移到37℃±0.5℃，5％ CO₂干燥的培养箱中培养20±4小时。温育之后，计数每孔细菌菌落数目。计算补体对照物孔的每孔菌落平均数目并且除以2，得到T₀时50％存活率。

每种未知血清的杀细菌效价表示为与T₀时50％存活率值相比较时实现≥50％杀伤的最终血清稀释度倒数。SBA-BR样品的起始稀释度是1∶8稀释。对于SBA-H，起始稀释度降低至1∶4稀释度，如最初试验中描述的。

表14-1中提供了这里描述的血清组A分析用SBA-BR程序与标准SBA程序(CDC)以及与根据Manchester Public Health LaboratoryServices，Meningococcal Reference Unit，Manchester，UK(PHLS)进行的SBA程序的比较。

表14-1：血清杀细菌测定方法比较

	AvP-US	CDC	PHLS
				冷冻原液	油渣溶液w10％甘油	油渣溶液w10％甘油	在甘油中冷却(15％)肉汤
杀细菌缓冲液	有0.1％葡萄糖的Dulbecco′s	有0.1％葡萄糖的Dulbecco′s	有0.5BSA的Geys
				过夜培养基	ThayerMartin(MR0232)	脑心浸液w/1％马血清	血琼脂w/5％马血
过夜培养条件	37℃w/5％CO₂	37℃w/5％CO₂	37℃w/5％CO₂
				补体	兔崽(Pel-冷冻)	兔崽(Pel-冷冻)	兔崽(Pel-冷冻)
A菌株	F8238	F8238	F8238
				测定这天的培养基	ThayerMartin(MR0232)	脑心浸液w/1％马血清	血琼脂
测定这天的培养条件	4小时37℃w/5％CO₂	4小时37℃w/5％CO₂	4小时37℃w/5％CO₂
				靶向的T₀	4000CFU/毫升	4000CFU/毫升	80000CFU/毫升
最初的血清起始稀释度	1∶4	1∶4	1∶2
				血清处理	56℃30分钟	56℃30分钟	56℃30分钟
保温步骤的总体积	50微升	50微升	40微升
				以占总体积的％表示的血清	50％(25微升)	50％(25微升)	50％(20微升)
混合物(体积)

细胞悬浮液％(体积)	25％(12.5微升)	25％(12.5微升)	25％(10微升)
				补体％(体积)	25％(12.5微升)	25％(12.5微升)	25％(10微升)
R’xn混合物中CFU/孔(理论值)	50	50	800
				最后的起始稀释度	1∶8	1∶8	1∶4
血清保温条件	37℃w/5％CO₂90分钟	37℃90分钟	37℃ w/o5％CO₂90分钟
				过夜培养条件	加入100微升TBS琼脂盖层(96孔板)37℃w/5％CO₂	加入100微升TBS Noble琼脂盖层37℃w/5％CO₂(96孔板)	琼脂板上10毫升(Tilt方法)37℃
T0条件	37℃90分钟(即补体对照平均值)	37℃90分钟(即补体对照平均值)	90分钟之前平板培养37℃w/5％CO₂温育过夜
				终点效价	50％杀伤率	50％杀伤率	50％杀伤率

从Dr.George Carlone，CDC(CDC donor-R21654-3430107)获得参照血清，是小瓶中冻干的粉末，使用之前在2℃至8℃下保存。当加入时，用0.5ml无菌水将小瓶各自再水合并且以100微升操作等份在-80℃至-40℃下保存。当在这些条件下重新设立时，参照血清的效价是在对于血清组A，C，Y，和W-135的标准SBA-BR中1∶256±1两倍稀释度。在常规一套平板的不同平板上用参照血清分析两次。

从Difco购得对于血清组A，C，Y，和W-135的组特异性兔抗血清，是小瓶中冻干的粉末，使用之前在2℃至8℃下保存。当需要时，用1ml无菌水将各小瓶再水合并且以50微升等份在-80℃至-40℃下保存，用作SBA中性能对照样品。

这里提供的用来测定补体-介导的对临床血样中脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C，Y，和W-135多糖杀细菌活性的使用兔崽补体(SBA-BR)的血清杀细菌测定的结果在精确性，稀释能力(线性)，特异性和检测界限方面完全有效。使用相同一套血样连续5天重复SBA-H试验(对于血清组C)来保证试验的精确性。

SBA-BR的灵敏性和特异性的计算

使用1∶4和1∶8的SBA-H基准效价，将SBA-BR中获得的效价分为真阳性(TP)(和假阳性[FP])和真阴性(TN)(和假阴性[FN])。以TP/(TP+FN)计算灵敏性，以TN/(TN+FP)计算特异性。计算结果以百分比表示。

SBA-BR对SBA-H的SBA效价分布比较

表1和4给出对于血清组C的接种之前和接种之后D28SBA效价，表2和5给出对于血清组Y的，表3和6给出对于血清组W-135的。下面部分总结的是比较从两个补体来源(BR对H)获得的结果的接种之前和接种之后SBA效价分析。

血清组C SBA效价分布

101个血清样品中，根据SBA-H效价＜1∶4和SBA-BR效价＜1∶8确定，63个是阴性的。接种前样品中27个通过SBA-H分析是阴性的(＜1∶4)但是SBA-BR分析是阳性的(＞＝1∶8)。使用SBA-BR而截止效价＜1∶8的假阳性率是30％。较高SBA-BR截止效价下假阳性率降低，1∶128截止效价时降低至小于20％，1∶512截止效价时降低至小于10％。SBA-H分析阳性(＞＝1∶4)的7个样品SBA-BR分析是阴性的(＜1∶8)。

在接种之后的血清中，SBA-H分析48个样品是阴性的，SBA-BR分析只有11个是阴性的。在11个SBA-BR阴性样品中，3个是SBA-H阳性的。偶联物组中51个接种之后样品中的17个(32％)是SBA-H阴性的，但是SBA-BR阳性(＞＝1∶8)。对于多糖组，50个接种之后样品中的23个(46％)是SBA-H阴性的，但是SBA-BR效价阳性(＞＝1∶8)。考虑接种之后血清的阳性反应，101个样品中的90个(89％)是SBA-BR阳性(＞＝1∶8)，但是101个中只有53个(52％)是SBA-H阳性的(＞＝1∶4)。当比较从两个疫苗组获得的SBA效价(BR对H)时，阳性反应有显著差异。偶联物组中51个接种之后样品，51个中的33个(65％)是SBA-H(＞＝1∶4)和SBA-BR(＞＝1∶8)阳性的。SBA效价(BR对H)之间的协和将SBA-BR阈值提高至＞＝1∶64或更高。多糖组中的个接种之后样品中，50中的17个(34％)是SBA-H(＞＝1∶4)和SBA-BR(＞＝1∶8)阳性的。SBA效价(BR对H)之间的吻合将SBA-BR阈值提高至＞＝1∶512或更高。

血清组Y SBA效价分布

和血清组C接种前血清不一样，根据SBA-H效价＜1∶4和SBA-BR效价＜1∶8确定，血清组Y接种前样品中只有9个是阴性的。61个接种前样品中52个是SBA-H阴性的(＜1∶4)但是SBA-BR阳性的(＞＝1∶8)。使用SBA-BR而截止效价＜1∶8的假阳性率是85％。较高SBA-BR截止效价下假阳性率降低，1∶256截止效价时降低至小于15％，1∶512截止效价时降低至小于2％。SBA-H分析阳性(＞＝1∶4)的2个样品SBA-BR分析是阴性的(＜1∶8)。

没有SBA-H效价＜1∶4且SBA-BR效价＜1∶8的接种之后血清样品。19个样品是SBA-H阴性(＜1∶4)但SBA-BR阳性(＞＝1∶8)。对于血清组C，假阴性结果比例没有差异。在偶联物组中，48个样品中的5个(9％)是SBA-H阴性(＜1∶4)，但是SBA-BR阳性。在多糖组中，52个样品中的14个(27％)是SBA-H阴性(＜1∶4)，但是SBA-BR阳性。

血清组Y的接种之后血清的阳性反应的两个SBA效价(BR对H)之间有好的吻合。对于整套100个样品，所有100个接种后样品SBA-BR效价＞＝1∶8，100个中的81个SBA-H效价＞＝1∶4。对于血清组C的SBA反应，与从多糖组获得的SBA效价(BR对H)相比，偶联物组中SBA效价(BR对H)之间有更好的关联。偶联物组48个接种后样品中，43个(90％)是SBA-H(＞＝1∶4)和SBA-BR(＞＝1∶8)阳性。48个样品中只有1个有小于1∶32的SBA-BR效价，而且那个样品是SBA-H阳性的(＞＝1∶4)。SBA效价(BR对H)之间的吻合不如多糖组的好。52中只有38个(73％)接种之后SBA-H效价＞＝1∶4且SBA-BR效价＞＝1∶8。多糖组接种后血清中SBA效价(BR对H)之间的吻合将SBA-BR效价提高至＞＝1∶128。

血清组W-135SBA效价分布

对于血清组W-135，100个中的54个(54％)是阴性的，其中SBA-H效价＜1∶4且SBA-BR效价＜1∶8。免疫前样品中，81个中的27个是SBA-H阴性(＜1∶4)而SBA-BR阳性(＞＝1∶8)。使用SBA-BR而截止效价＜1∶8的假阳性率是33％。较高SBA-BR截止效价下假阳性率降低，1∶128截止效价时降低至小于15％，1∶256截止效价时降低至小于5％。SBA-H分析阳性(＞＝1∶4)的11个样品SBA-BR分析是阴性的(＜1∶8)。

三个接种后样品SBA-H阴性(＜1∶4)且SBA-BR阴性(＜1∶8)。39个接种后样品SBA-H阴性(＜1∶4)但是SBA-BR效价阳性(＞＝1∶8)。在偶联物组，47个样品中的11个(23％)SBA-H阴性但是SBA-BR阳性。在多糖组，53个样品中的28个(53％)是SBA-H阴性但是SBA-BR阳性。

免疫后SBA-BR and SBA-H效价之间的吻合可与血清组C相比，但是不如血清组Y好。使用血清组C和血清组Y，当比较两个疫苗组时，两个SBA效价(BR对H)之间的吻合有显著差异。与多糖组相比，偶联物组的两个SBA效价(BR对H)之间的吻合更好一些。在偶联物组的免疫后SBA效价中，47中的36个(77％)的SBA-H效价＞＝1∶4，并且都是SBA-BR阳性(＞＝1∶8)。偶联物组的所有样品接种后SBA-BR效价＞＝1∶32。关于多糖组的接种后效价，两个效价之间的关联不够好，53个中只有22个(42％)的SBA-H效价＞＝1∶4并且53个中的50个(94％)的SBA-BR效价＞＝1∶8。

表1.血清组C SBA-H阳性和阴性的血清SBA-BR效价的比较

表2.血清组Y SBA-H阳性和阴性的血清SBA-BR效价的比较

表3.血清组W-135SBA-H阳性和阴性的血清SBA-BR效价的比较

表4.SBA-BR和SBA-H测定的血清组C效价的分布总结

¹样品总数是101.

表5.SBA-BR和SBA-H测定的血清组Y效价的分布总结

¹样品总数是100.

表6.SBA-BR和SBA-H测定的血清组W-135效价的分布总结

¹样品总数是100.

SBA-BR和SBA-H效价的灵敏度和特异性比较

在进行两组效价之间灵敏度和特异性评价中，将SBA-BR效价与1∶4和1∶8的SBA-H保护效价相比较。在该项分析中使用免疫前和免疫后血清。使用1∶4和1∶8的SBA-H基准效价，对所有三个血清组计算特异性和灵敏性并总结于表7，9和10中。接着对每一个血清组讨论特异性和灵敏性分析。

对于血清组C，对于相对于1∶4和1∶8SBA-H效价的1∶8，1∶16，和1∶32的SBA-BR阈值效价，灵敏度大于80％。但是，这些SBA-BR效价的特异性小于60％。1∶64 SBA-BR效价时，特异性提高60％，1∶128SBA-BR效价时，特异性提高70％。对于后两者SBA-BR效价，特异性开始降低。在1∶64的SBA-BR阈值效价时，灵敏性在75和78％之间，但是在1∶128 SBA-BR效价时，灵敏性降低至62和65％之间。对于1∶128和1∶256，SBA-BR效价＞1∶64时特异性继续分别提高至73％至83％的范围。但是灵敏性从43％降至小于20％。灵敏性和特异性之间有最好平衡的血清组C的SBA-BR效价落在1∶32和1∶128之间SBA-BR效价范围内。发现血清组C的灵敏性和特异性结果与SantosGF，等，2001.Clin.Diagn.Lab.Immunol.8：616-623，以不同组血清样品和试剂获得的结果是十分比得上的(表8)。关于Santos′s结果，发现灵敏性和特异性的最好平衡是SBA-BR效价在1∶64和1∶128之间，而SBA-H效价在1∶4和1∶8之间。

表7.血清组C的SBA-H保护效价时SBA-BR的灵敏性和特异性

表8.Santos等2001.Clin.Diagn.Lah.Immunol.8：616-623报道的血清组C的SBA-H保护效价时SBA-BR的灵敏性和特异性

对于血清组Y，范围是1∶8至1∶64的SBA-BR阈值效价灵敏性最高，但是，如所预期的，在较高SBA-BR阈值效价时降低。与血清组C的结果相比，血清组Y的特异性结果开始低得多，而且没有达到大于50％的水平，直到SBA-BR阈值效价为1∶128。对于血清组Y的灵敏性和特异性平衡最好的SBA-BR效价落在1∶64和1∶256之间的范围内。在1∶256时，灵敏性降低至大约55％，但是特异性从中间-30％范围提高至大约82-83％。

表9.血清组Y的SBA-H保护效价时SBA-BR的灵敏性和特异性

对于血清组W135，灵敏度的值更接近对于血清组C获得的值，但是总的模式与所有三个血清组相同。在SBA-BR阈值效价为1∶8时灵敏性开始低并在效价＞＝1∶128时降低。同样，在SBA-BR效价为1∶8时特异性开始低，效价1∶256时开始达到稳定。根据对血清组Y的观察，对于血清组W135，灵敏性和特异性之间达到最佳平衡的SBA-BR落在1∶64和1∶256之间的范围。

表10.对于血清组W135的SBA-H保护效价时SBA-BR的灵敏性和特异性

表11总结的是对于血清组C，Y，和W135使用兔崽补体或人补体相对于免疫后SBA-BR效价的SBA效价提高4倍的比例。另外对偶联物组，TetraMenD，和多糖组，进行该项分析，表11包括两套分析。比较对三个血清组和两个疫苗组的杀细菌反应，发现4倍提高模式有差异。下面对每个血清组和两个疫苗组讨论反应模式。

表11.SBA-BR和SBA-H¹测定的脑膜炎球菌多糖效价4倍提高的分层比较比例

¹该表给出SBA-BR效价，疫苗和血清组分层各分析(对免疫前和免疫后D28天成对样品)测定的SBA效价提高4倍的比例(和百分比).

对于血清组C，与对于偶联物组SBA-BR对SBA-H之间的提高4倍严密吻合。在这个疫苗组，显现出这样的趋向，即低免疫后效价时，例如1∶32-1∶128，SBA-H4倍提高置后于SBA-BR提高4倍。但是，免疫后SBA-BR效价＞＝1∶256时，实现SBA-H提高4倍的受试者人数显示大于实现SBA-BR提高4倍的受试者人数。比较两个补体源提高倍数的这种差异是小的，并且可能是由于改变实现SBA-BR提高4倍的百分比的更高免疫前SBA-BR效价。对于多糖组，SBA-BR对SBA-H之间提高4倍之间的吻合不如它对于偶联物组那么接近。还有，没有这样的显著趋向，即SBA-H提高4倍在更高免疫后SBA-BR效价下比对偶联物组发现的更灵敏。

对于血清组Y，SBA-H和SBA-BR提高4倍之间的吻合非常接近于两个疫苗组。与血清组C免疫后SBA-BR效价相比，两个疫苗组有非常少的免疫后SBA-BR效价小于1∶32。由于这个原因，实现血清组Y SBA-H和SBA-BR提高4倍的受试者比例发生在比血清组C更高免疫后SBA-BR效价时。对于血清组Y，在与偶联物组1∶128的免疫后SBA-BR效价时，提高4倍的比例增加至＞＝50％，而对于血清组C，阈值SBA-BR效价是偶联物组的1∶32。

对于血清组Wl35，SBA-H和SBA-BR提高4倍之间的吻合没有另两个血清组那么接近。根据对血清组Y的发现，对于任一种疫苗组有小于1∶32的免疫后SBA-BR效价的受试者人数是有限的。SBA-BR效价＞＝1∶256时发生SBA效价(BR对H)提高4倍之间的吻合。如对血清组C发现的，两个疫苗组之间提高4倍(BR对H)的比例有差异，这对血清组Y则不明显。与另两个血清组多糖疫苗的SBA效价(BR对H)提高4倍相比，多糖组中血清组Wl35SBA效价(BR对H)提高4倍之间的吻合最差。

将使用兔崽补体(SBA-BR)的血清杀细菌测定结果与使用人补体(SBA-H)测定接种了许可的四价脑膜炎球菌多糖疫苗

或者试验四价脑膜炎球菌多糖偶联物疫苗(TetraMenD)的2-3岁受试者的血清样品效价的相应SBA相比较。鉴定血清组C，Y，和Wl35的人补体源并且用来支持SBA的这种比较。用两种方法分析这种比较研究的SBA结果。在一种方法中，将对于两个疫苗组测定接种前和接种后效价获得的SBA-BR和SBA-H数据集合用于分析。在第二种方法中，分别分析两个疫苗组的接种前和接种后效价。该项研究的一个目的是描述与阴性SBA-H血清效价最好关联的SBA-BR血清效价。第二个目的是测定与使用人补体的阳性效价最佳关联的使用兔崽补体的效价，在该项分析中作为对血清组C的保护作用的相互关系，并且外推至血清组Y和W135的保护性杀细菌效价。其它实验公开的结果试图建立血清组C的SBA-BR的保护性阈值关联关系。将该项研究的结果与公开的结果相比较。最近，对两个补体源比较接种前和接种后测定的SBA效价的4倍提高。

只对于血清组C建立了抗疾病的保护作用的SBA效价的关联性。在SBA分析中使用人补体测定血清组C的保护作用的SBA关联性。对于其他血清组，假设血清组C的保护作用的SBA-H关联性(SBA效价1∶4)适用于其他血清组。定义的与血清组C的SBA效价1∶4关联的SBA-BR效价在血清组之间可以是不同的。关于与阴性SBA-H血清效价最佳吻合的SBA-BR效价，接种前和接种后血清中SBA-BR效价＜1∶8与SBA-H效价＜1∶4可相比。部分以比较血清组C SBA效价的(BR对H)WHO/CDC研究结果为基础，以及以最近UniversityOutbreak in the United Kingdom发现的SBA-BR效价＜1∶4与怀疑血清组C疾病相关(Jones，G.R.，等，2000.J.Infect.Dis.181：1172-1175)为基础，使用SBA-BR效价＜1∶8。

以该项研究产生的SBA效价(BR对H)为基础，使用＜1∶8的SBA-BR截止效价的血清组C的假阳性率是30％。使用更高的SBA-BR截止效价提高假阳性率如下：＞＝1∶16时，假阳性率降低至26％，＞＝1∶32时，假阳性率降低至24％，＞＝1∶64时，假阳性率降低至22％，＞＝1∶128时，假阳性率降低至18％，＞＝1∶256时，假阳性率降低至14％，和＞＝1∶512时，假阳性率降低至2％。提高SBA-BR截止效价不会提高定义的相应于SBA-H效价＜1∶4的阴性效价的精确度，但是使用较高SBA-BR截止效价时区分阳性反应和阴性反应的灵敏性却低得多。该项报告中的数据表明，1∶8，1∶16，或1∶32截止效价时SBA-BR的灵敏度最高(81-84％)。SBA-BR效价大于1∶32时，灵敏度降低至低于80％。但是，1∶8，1∶16，和1∶32截止效价时分析的特异性最小，范围是51至58％。在选择响应于人补体分析中的阴性效价的截止效价时平衡灵敏度，特异性和假阳性率。确定1∶32为SBA-BR的截止效价将导致不必要地扣除真阳性应答者。该项研究结果表明SBA-BR效价＞＝1∶16可能是更合适的截止效价。以WHO/CDC研究分析(＜1∶8)和U.K.University Outbreak分析(＜1∶4)为基础，效价之上最小2倍稀释据信是保护性的。假定杀细菌抗体保护作用与血清组C疾病类似并且杀细菌效价相应于人补体实验中的阴性效价，获得对血清组W135和Y的分析中保护性截止效价的鉴定。对于血清组Y，与血清组C的30％相比，使用SBA-BR截止效价＜1∶8的假阳性率是十分高的85％。但是，关于血清组C，SBA-BR截止效价的提高降低了假阳性率。SBA-BR截止效价是1∶16时，假阳性率降低至84％，1∶32时，假阳性率降低至75％，1∶64时，假阳性率降低至61％，1∶128时，假阳性率降低至38％，1∶256时，假阳性率降低至13％，和1∶512时，假阳性率降低至2％。即使截止效价＞＝1∶128时，与血清组C相比，血清组Y的假阳性率开始高得多，这两个血清组分析的假阳性率变得完全可比得上。这样高的截止效价，hoarer，可以夸大阳性反应的阈值效价。根据灵敏度和特异性分析，SBA-BR截止效价是1∶8至1∶32时灵敏度最大，灵敏度范围是95至98％。但是，对血清组C，这些SBA-BR效价下的特异性相当低，范围是11至18％。次最高SBA-BR效价，1∶64时，灵敏度从95％降低至88％，但是特异性急剧升高至35％。血清组Y分析中＜1∶64的截止效价表现出与人补体分析中的阴性效价最相当。

对于血清组Wl35，SBA-BR截止效价＜1∶8时假阳性率是33％，这类似于血清组C。如对于较高截止效价时血清组C和Y所注意到的，假阳性率降至更低水平。SBA-BR截止效价1∶16时，假阳性率降低至32％，1∶32时，假阳性率降低至28％，1∶64时，假阳性率降低至26％，1∶128时，假阳性率降低至12％，1∶256时，假阳性率降低至4％，和1∶512时，假阳性率最低为0％。SBA-BR效价范围是1∶8至1∶64时灵敏度最高(86％至81％)。特异性，如所预期的，在该SBA-BR效价范围内是最低的(46％至52％)。虽然与血清组Y相比，血清组W135的假阳性率开始低得多，与人补体分析中的阴性效价最相当的截止效价是＜1∶64。

鉴定了相应于人补体分析中的阴性效价的三个血清组的效价，对这些水平之上的SBA-BR效价分析了认为是阳性反应的阈值效价。对于血清组C，阳性反应的阈值效价是＞＝1∶16，对于血清组Y，阳性反应的阈值效价是＞＝1∶64，对于血清组W135，阳性反应的阈值效价是＞＝1∶64。显示，相对于1∶4或1∶8的SBA-H效价和对于血清组C 1∶4的精确SBA-H效价的相关性，血清组C的阈值SBA-BR效价＞＝1∶128为实现保护性效价提供了好的保证。该阈值效价与在对于血清组C的WHO/CDC数据组基础上以及对Santos数据组的分析很好地吻合。在这两项研究中，效价＞＝1∶128高度预示保护作用，但是SBA-BR效价小于1∶128也可能是保护性的。对于WHO/CDC和Santos数据组，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64的SBA-BR效价被认为是两可的效价。因为这里对于血清组C给出的数据组SBA-BR效价小于1∶16被认为是阴性的，该项分析的两可的效价是1∶16至1∶64，这是另两项研究的子集。在所有分析中，SBA-BR效价比得上与20世纪60年代收集的天然保护数据相关的SBA-H效价(1∶4或1∶8)。

最近，为使一价C偶联物的United Kingdom有效数据直接与SBA-BR效价相关联而进行了努力(Miller E，等，2002，Vaccine 20：S58-S67)。在该项研究中，发现SBA-BR效价＞＝1∶8和＞＝1∶128都与对接种了一剂量的一价C偶联物的15-17岁受试者采集的有效数据很好地相关联。但是，当Miller和同事对学步龄组(12至30月龄)进行相同分析时，他们发现SBA-BR效价＞＝1∶8与功效之间很好的吻合，但是SBA-BR效价＞＝1∶128时吻合不密切。Miller在第13届International Pathogenic Neisseria Conference，2002年9月1-6日，Oslo，Norway上给出另外的数据，预言接种后一个月实现SBA-BR效价＞＝1∶64的受试者的功效在对该年龄组观察的功效的95％置信区间之外。这些数据有助于支持1∶8至1∶64的两可区中SBA-BR效价可以保证保护作用的想法。根据对这项研究的分析，1∶16至1∶64的SBA-BR效价同样可以保证抗血清组C的保护作用。

1∶64的SBA-BR效价下血清组Y分析只有35％的特异性，但是随着截止效价提高至1∶128和1∶256，特异性分别提高至59％和84％。阈值效价＞＝1∶256在1∶4和1∶8人补体实验中为保护作用效价提供好的保证。但是，对于血清组Y，1∶128的阈值效价下灵敏度和特异性平衡更好。对于血清组Y，1∶64至1∶128的SBA-BR效价范围代表效价的两可范围比得上对于血清组C的1∶16至1∶64的SBA-BR效价的响应范围，后者与SBA-H效价相关联。

SBA-BR效价1∶64下的血清组W-135分析有52％的特异性，但是随着效价提高至1∶128和1∶256，特异性分别提高至64和77％。对于血清组Y，阈值效价＞＝1∶256在1∶4和1∶8人补体实验中为保护作用效价提供好的保证。和血清组Y一样，对于血清组W135，阈值效价是1∶128时灵敏度和特异性平衡更好。对于血清组W135，1∶64至1∶128的SBA-BR效价的范围代表效价的两可范围比得上对于血清组C的1∶16至1∶64的SBA-BR效价的范围，后者与该项研究中SBA-H保护效价相关联。

对各血清组计算杀细菌效价4倍提高并且利用两种分析对疫苗组分别分析。总的来说，对于所有三个血清组在较高免疫后SBA-BR效价下测得的SBA效价(BR和H)提高四倍较高是一个指征。血清组和疫苗组SBA效价(BR对H)四倍提高有差异。对于血清组C，用人补体的分析中四倍提高显示比用兔崽补体在低免疫后SBA-BR效价下的分析中的效价低。但是在较高免疫后SBA-BR效价下，效价提高四倍显示在用人补体的分析中更高。这种模式似乎提示，低免疫后SBA-BR效价下，用人补体的分析的灵敏度比用兔崽补体分析的灵敏度低，但是在高免疫后SBA-BR效价下，正好相反，即，用人补体的分析变得更灵敏。当分析多糖疫苗组的样品时这种模式不明显。在这些样品中，当在分析中使用人补体时，效价的四倍提高表现得比较低。虽然对两种样品类型之间的这种发现没有解释，但是它确实提示用人补体进行的分析没有用含有低杀细菌活性效价的血清样品的灵敏性。

对于血清组Y，比较两个补体源，SBA效价四倍提高有好的吻合。与多糖组相比，偶联物组SBA效价四倍提高(BR和H)稍微高一些，但是差异没有血清组C那样大。

对于血清组W135，在对于任一种疫苗组的分析中使用人补体或兔崽补体时SBA效价四倍提高之间的吻合没有与使用另两种血清组分析的结果那样好。SBA-BR效价四倍提高对于两个疫苗组是非常好的，但是与另两个血清组相比，SBA-H四倍提高效价的比例更低。多糖组的SBA-H四倍提高非常低，并且相对地比另两个血清组的SBA-H效价的四倍提高低。

使用BR补体的SBA效价的四倍提高已经成为脑膜炎球菌多糖疫苗登记的基准。最近，为了将SBA-BR效价四倍提高与United Kingdom(Borrow R，等，2001，Infect.Immun.69：1568-1573)中一价C偶联物的登记后监督数据的临床功效相联系已经进行了努力。以该项分析为基础，估计12至30个月龄范围内学步幼儿的一价C偶联物的功效在第一次给药16个月内是88％(69至95％)。对于该年龄组，一剂量一价C偶联物疫苗后，实现SBA-BR效价四倍提高的受试者的比例范围是89至100％。

这里提供的SBA-BR提供了比得上在血清组C的分析中使用人补体为补体源获得的值的杀细菌效价值。因此，这些SBA-BR效价与确立对血清组C脑膜炎球菌疾病的保护性免疫性的替代品的最初的研究有关并且支持这里提供的临床结果外推有保护作用，并且血清组C的SBA-BR效价比得上其他实验报道的那些结果。在测定对血清组Y和血清组W-135荚膜多糖的血清特异性反应中使用人补体的SBA的性能，类似于血清组C模型，支持测定对血清组Y和W-135的杀细菌效价的SBA-BR的关联性。

Claims

1.一种多糖-蛋白质偶联物，其中偶联物包含与一个或几个载体蛋白质偶联的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组(N.meningitidis serogroup)A，C，W-135或Y的荚膜多糖，并且该偶联物含有0.5至15微克/毫升的各种荚膜多糖，达到平均大小小于100,000道尔顿。

2.根据权利要求1的偶联物，其中荚膜多糖被衍生化至5,000至75,000道尔顿的平均大小，优选7,000至50,000道尔顿的平均大小，更优选8,000至35,000道尔顿的平均大小，更优选12,000至25,000道尔顿的平均大小，更优选15,000至22,000道尔顿的平均大小。

3.根据权利要求1的偶联物，其中载体蛋白质包括细菌毒素或类毒素，或者细菌外膜蛋白。

4.根据权利要求1的偶联物，其中载体蛋白质包括白喉毒素，白喉类毒素，CRM₁₉₇，破伤风类毒素，百日咳类毒素，大肠杆菌LT，大肠杆菌ST，外毒素A，外膜复合体c(OMPC)，膜孔蛋白，转铁蛋白结合蛋白，pneumolysis，肺炎球菌表面蛋白A(PspA)，肺炎球菌黏附素蛋白(PsaA)，卵白蛋白，匙孔血蓝蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)或者结核菌素(PPD)的纯化蛋白质衍生物。

5.根据权利要求1的偶联物，其中载体蛋白质包括白喉毒素，白喉类毒素，CRM₁₉₇，破伤风类毒素，外毒素A，或外膜复合体c(OMPC)。

6.根据权利要求1的偶联物，其中载体蛋白质包括白喉毒素，白喉类毒素，或CRM₁₉₇。

7.根据权利要求1的偶联物，其中载体蛋白质包括白喉毒素或白喉类毒素。