CN103007268A - 一种低剂量多价结合疫苗组合物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低剂量多价结合疫苗组合物及用途，低剂量多价结合疫苗组合物包含A群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的A群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，C群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的C群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，Y群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的Y群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，W135群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的W135群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，和b型流感嗜血杆菌荚膜多糖为2.0-4.8μg的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-载体蛋白结合物。本发明降低了生产成本，同时降低了产品中有毒副作用的杂质含量，因此提高了疫苗的安全性。减少了幼儿的接种次数，降低漏接率。

Description

一种低剂量多价结合疫苗组合物及用途

技术领域

本发明属于疫苗生产制备技术领域，提供一种低剂量多价结合疫苗组合物及用途。 

背景技术

流行性脑脊髓膜炎简称流脑，它是由流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌引起的急性呼吸道传染病，传染性强，可大规模流行，且病情进展迅速，即使进行了最理想的治疗，也常导致在发病后一到几天内死亡，或引起严重的后遗症。因此药物治疗对控制大多数地方性或流行性的流脑来说价值不大。全球每年流脑发病人数约为50万，死亡5万。地方性疾病主要发生在儿童和青少年，3-12月龄的婴儿发病率最高，而在流脑流行时，大龄儿童和年轻成人发病率也会增高。由于5-15%的儿童和年轻成人鼻咽部都携带流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌，因此通过服药消除鼻咽部携带菌来控制流脑几乎是不可能的，而且由于抗生素的大量使用，目前已经出现了耐抗生素的脑膜炎奈瑟菌，因此接种安全有效的疫苗是控制流脑的最有效地措施。目前已经有包括A，C，W135，Y群的多价流脑荚膜多糖疫苗和多价结合疫苗。 

b型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae type b,Hib）是一种革兰氏阴性短杆菌。人是Hib的唯一宿主，普遍附着在人的鼻、咽部，通常不会引起严重的疾病，但可引发小儿细菌性脑膜炎、肺炎、会厌炎、败血症、败血症关节炎等疾病。Hib最容易感染5岁以下的儿童，尤其是4到12月龄的儿童。到5岁时，大部分儿童已产生抗体以抵御疾病，因此，这种细菌在大年龄儿童和成人中很少引发严重的疾病。据国内有关专家的研究，Hib不仅是我国小儿化脓性脑膜炎的首要原因，而且是小儿肺炎的主要病因。全世界每年有超过300万的儿童感染发病，七十万儿童死亡，其中近五万儿童死于Hib脑膜炎，五十万以上儿童死于Hib肺炎。在5岁以下儿童中，近1/3-1/2的细菌性脑膜炎、近1/4的幼儿肺炎都是由Hib感染引起。Hib脑膜炎即使得到适当的治疗，仍会有3-25％的患儿死亡，而幸存者中有30-50％会留下终生残疾后遗症，如耳聋、学习障碍和运动障碍等。Hib病菌通过已感染儿童在咳嗽或打喷嚏时喷出的飞沫在儿童间传播，还可以通过共用儿童放入过口中的玩具或其它物品而传播。接种Hib疫苗是预防Hib感染的最有效手段。目前已经有多种Hib疫苗，其中采用的载体有CRM197，白喉类毒素，破伤风类毒素，b型流行性脑脊髓膜炎球菌外膜蛋白。 

结合疫苗有效成分为荚膜多糖与载体蛋白的偶联结合物。荚膜多糖抗原引起的抗体可以与细菌的荚膜结合，配合补体来杀死入侵细菌。结合蛋白可以促进抗体成熟使其亲和力增加。同时可以诱导接种者针对荚膜多糖的免疫记忆，使得保护的有效时间大大延长。 

为了进一步降低疫苗的接种次数，Hib和流脑的联合疫苗正在被研制中。目前GSK的Hib和C，Y群流脑结合疫苗已经上市。目前还有Hib和A，C群的结合疫苗正在临床研究中。 

中国专利ZL 02159032.X公开了一种多糖-蛋白结合疫苗的制备方法，主要涉及A，C群 流脑炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖与多种蛋白质载体的偶联与纯化方法及疫苗的配置方法，该专利所描述的荚膜多糖-蛋白结合疫苗的价数为3种，不包括Y群和W135群流脑荚膜多糖-蛋白结合疫苗。 

中国专利CN 1709595B公开了一种多糖-蛋白结合疫苗制剂及其制备方法，包括了及A，C，Y和W135群流脑炎球菌荚膜多糖、b型嗜血流感杆菌荚膜多糖与多种蛋白质载体的偶联月纯化方法及疫苗的配置方法，该专利所描述每种结合物的荚膜多糖量在5-25ug之间。该专利描述的多价结合疫苗中采取的蛋白载体为破伤风类毒素（TT），白喉类毒素（DT），人血清免疫球蛋白，b型流行性脑脊髓膜炎球菌外膜蛋白。 

载体的免疫抑制是阻碍开发多价结合疫苗的技术困难。当连接在单一的载体的上的多糖的数量和质量增多的情况下，针对多糖的抗体反应会消减。这种抑制作用不可能被简单的预测，而是和疫苗中的载体蛋白的选择，疫苗的多糖蛋白结合比，多糖的种类相关。 

尽管在上述专利中，各种不同的载体蛋白被提及。目前用于Hib和流脑进行联合疫苗制备的载体蛋白均为破伤风类毒素，这包括GSK的Hib和流脑C，Y的联合疫苗，以及国内罗益和绿竹公司正在临床研究的Hib和流脑A，C的结合疫苗。由于结合工艺的限制目前A群流脑多糖，C群流脑多糖以及Hib多糖和TT载体进行链接时，其多糖和蛋白的质量比一般分布为0.4-0.5。为了达到有效的多糖剂量，其中包含的载体的蛋白的质量一般是多糖质量的2到2.5倍。 

目前唯一公开的包括4价流脑结合疫苗和Hib结合疫苗的多糖剂量为5-25ug每个血清群或血清型，也就是多糖的总量为25ug-125ug，而相应的载体蛋白至少为50ug-250ug。 

Hib和流脑的结合疫苗在应用于3-6月的婴幼儿的免疫接种时，将可能和无细胞百日咳疫苗以及肺炎链球菌结合疫苗共同接种。无细胞百白破疫苗已经纳入到计划免疫，而其中含有约15ug的破伤风类毒素将进一步抑制对含高剂量破伤风类毒素载体的结合疫苗的免疫应答。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种低剂量多价结合疫苗。 

一种低剂量多价结合疫苗组合物，包含A群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的A群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，C群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的C群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，Y群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的Y群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，W135群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的W135群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，和b型流感嗜血杆菌荚膜多糖为2.0-4.8μg的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-载体蛋白结合物。 

所述载体蛋白为白喉CRM197蛋白或破伤风类毒素。 

还包括佐剂氢氧化铝或磷酸铝，所述氢氧化铝或磷酸铝中的铝含量为0.1-1.8mg。 

一种低剂量多价结合疫苗组合物在配制预防A群、C群、Y群、W135群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血杆菌引起的感染的疫苗制剂中的用途。 

本发明的优点： 

实验证明，本发明的低剂量的结合疫苗组合物在各成分采用2.0-4.8可以有效地预防A群、C群、Y群、W135群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血杆菌引起的感染。该 疫苗也适用于与无细胞百白破疫苗的共同接种。 

一般情况下，随着抗原含量的降低，对于该抗原的免疫反应将会减弱。但是，在本发明研究中发现，降低联合疫苗中荚膜多糖的剂量至2.0-4.8ug/剂，对各种荚膜多糖抗原的免疫反应不弱于专利发明CN1709595B所描述的高剂量组（5-25ug/剂）。而且在和无细胞百白破疫苗同时注射实验动物是发现，低剂量联合疫苗的免疫反应强于高剂量组。 

除了上述优点之外，该疫苗降低了生产成本，而且同时降低了产品中有毒副作用的杂质含量（细菌来源的杂质蛋白，DNA，内毒素等），因此提高了疫苗的安全性。 

相对于单独配制的4价流脑结合疫苗和单价的Hib结合疫苗，本发明的优势是明确的，即减少了幼儿的接种次数，降低漏接率。 

具体实施方式

低剂量的结合疫苗组合物可以由分别发酵纯化Hib，A，C，Y和W135群流脑荚膜多糖和载体蛋白，并用已知的化学偶联方法将各种荚膜多糖和载体蛋白共价连接，然后按照发明公示的剂量进行组合物的配置。具体例子见实施例1-4。 

用于本发明所描述疫苗的载体蛋白可以是破伤风类毒素和白喉CRM197蛋白，优选是CRM197蛋白或者是在同一疫苗中同时采用两种载体蛋白来偶联不同的荚膜多糖。将Hib多糖和载体蛋白TT或CRM197制备Hi-TT及Hib-CRM197结合疫苗的方法已经有报道。一般的科研人员参照技术文献即可实现。 

本发明中流脑荚膜多糖和CRM197的结合可以采用专利CN1889975A中描述的过程实现。 

上述的方法同样可以用于流脑荚膜多糖和TT的结合。而且，流脑荚膜多糖和TT的结合还可以采用CN 1709595B所报道方法实现。这些方法所实现的结合产物均可以用于配制5价结合疫苗的联合疫苗。 

流脑荚膜多糖或流脑多糖是流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖的简称。 

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 

本发明疫苗中与流脑荚膜多糖相链接的蛋白载体选自白喉杆菌生产的白喉毒素无毒突变体CRM197或破伤风类毒素TT。 

C群流脑荚膜多糖与载体CRM197的结合是利用高碘酸钠将将荚膜多糖切断成末端带有醛基的寡糖；截取大小合适的片段；在适当条件下与CRM197中的游离氨基发生成酰胺反应；多余醛基用硼氢化钠封闭；去除游离多糖和游离蛋白；最终得到结合产品。也可以利用专利CN1889975A描述的方法实现。 

Y，W135流脑荚膜多糖是利用高碘酸钠在流脑荚膜多糖氧化得到醛基；在适当条件下与CRM197中的游离氨基发生成酰胺反应；多余醛基用硼氢化钠封闭；去除游离流脑荚膜多糖和游离蛋白；最终得到结合产品。也可以利用专利CN1889975A描述的方法实现。 

A群流脑荚膜多糖通过水解得到寡糖后用己二酸二肼酰（ADH）进行衍生，然后与CRM197进行连接；去除游离流脑荚膜多糖和游离蛋白；最终得到结合产品。也可以利用专利CN1889975A描述的方法实现。 

流脑荚膜多糖和载体蛋白TT的结合可以参见已经发表的文献和专利(CN1709595B)，由 一般的实验人员实现制备。 

本发明疫苗中Hib荚膜多糖相链接的蛋白载体选自白喉杆菌生产的白喉毒素无毒突变体CRM197或者TT。 

该疫苗可以参见已经发表的文献和专利，由一般的实验人员实现制备。 

本发明疫苗中开可以加入磷酸铝或氢氧化铝作为佐剂，单位铝佐剂加入量为0.1~1.8mg/剂。 

本发明疫苗可通过以下制备工艺制备： 

（1）荚膜多糖：选用A、C、Y、W135群脑膜炎球菌菌种、b型流感嗜血杆菌菌种经过发酵培养生产出A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖。 

（2）载体蛋白CRM197：选用表达CRM197的白喉杆菌（ATCC39255），发酵并通过柱层析生产出白喉毒素无毒突变体CRM197。 

（3）载体蛋白破伤风类毒素：选用破伤风杆菌（中国医学菌种保存中心），发酵生产出破伤风毒素，脱毒纯化得到破伤风类毒素。 

（4）结合疫苗制备方法：Hib和C群流脑荚膜多糖与载体蛋白CRM197的结合是利用高碘酸钠将流脑荚膜多糖切断成末端带有醛基的寡糖；截取大小合适的片段；在适当条件下与CRM197中的游离氨基发生成酰胺反应；多余醛基用硼氢化钠封闭；去除游离流脑荚膜多糖和游离蛋白；最终得到结合产品。Y，W135流脑荚膜多糖是利用高碘酸钠在流脑荚膜多糖氧化得到醛基；在适当条件下与CRM197中的游离氨基发生成酰胺反应；多余醛基用硼氢化钠封闭；去除游离流脑荚膜多糖和游离蛋白；最终得到结合产品。A群流脑荚膜多糖通过水解得到寡糖后用己二酸二肼酰（ADH）进行衍生，然后与CRM197进行连接；去除游离流脑荚膜多糖和游离蛋白；最终得到结合产品。A，C，Y，W135群流脑荚膜多糖和Hib多糖也可以用蛋白载体TT进行结合疫苗的制备。该疫苗可以参见已经发表的文献和专利，由一般的实验人员实现制备。此处不再描述。将制备的5中流脑荚膜多糖结合产品按本发明规定的比例混合，制备流脑荚膜多糖蛋白结合疫苗。根据需要，加入氢氧化铝或磷酸铝即成为含铝佐剂的疫苗制剂。 

本发明疫苗可用于免疫3个月龄以上各年龄段的儿童，预防A群、C群、Y群、W135群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血杆菌引起的感染性疾病。本发明既能增强多糖抗原的免疫原性，又能减少婴幼儿接种疫苗的次数，减轻婴幼儿的痛苦和家长的负担，降低接种成本，提高免疫覆盖率。本发明最大的特点为有效的低剂量的多价结合疫苗，疫苗组分含量减少，效价不变，既可以提供较强的免疫功能，又能够减少婴幼儿使用该疫苗时产生的不良反应。 

在评价本发明所描述的多价结合疫苗中，该疫苗具有比高剂量疫苗更好或者不低于高剂量疫苗的免疫原性，证明了免疫抑制被消减。由于低剂量的疫苗有更好的效果，更小的毒副反应并且显著降低医疗成本，因此是更优的疫苗组合。 

以下通过实施例进一步说明本发明。 

实施例1 

A，C，Y，W-135群流脑荚膜多糖的制备 

用于生产A，C，Y，W-135群奈瑟氏脑膜炎球菌（Neisseria meningitides）荚膜多糖的菌种均来源于中国医学菌种保藏管理中心（菌种号分别为CMCC（B）29201，CMCC（B）29205，CMCC（B）29028，CMCC（B）29037）。在50L发酵罐中分别对A，C，Y，W-135群奈瑟氏脑膜炎球菌进行分别发酵培养。将获得的30L发酵液离心后取得上清并置于一不锈钢罐中，使用100KD膜包超滤浓缩至3L，向浓缩液中加入300ml质量浓度为10%的十六烷基三甲基溴化铵水溶液，搅拌均匀后于4℃静止2小时。将静止后的溶液离心以获得沉淀，向沉淀中加无菌1M氯化钠水溶液至1L，在40℃下实现沉淀的溶解。向溶解液中加入无水乙醇至最终体积浓度为25%，搅拌均匀后于-20℃静止2小时后，离心获得上清；向离心上清中补加无水乙醇至最终体积浓度为80%，搅拌均匀后于-20℃静止2小时后，离心获得沉淀。将沉淀复溶于2L纯化水中，加入来源于林伯氏白色念球菌（Tritirachiumalbum limber）的蛋白酶K至反应浓度为3U/ml，在37℃下反应2小时后，使用100KD膜包超滤15倍体积后最终得到2L超滤液。将超滤液通过0.22um过滤后进行冰冻干燥处理以得到纯化的流脑荚膜多糖粉末，将粉末保存于带有干燥剂的器皿中。 

A群流脑荚膜多糖由P元素来确定含量，C，Y，W-135群流脑荚膜多糖由唾液酸来确定含量。流脑荚膜多糖的分子大小的确定利用凝胶过滤层析柱及利用多角度激光光散射来进行，利用葡聚糖分子大小标准来校准。流脑荚膜多糖的结构完整性由质子1H和13C NMR确定。 

实施例2 

载体蛋白CRM197的制备 

生产菌种白喉杆菌（Corynebacterium diphtheriae）由美国菌种保藏中心（ATCC）购买，菌种号为菌种编号为39255。将冻干的生产白喉CRM197蛋白的种子接种到含培养基的试管中培养16小时。取一份培养物转移至含有生长培养基的0.5升摇瓶中，并将培养瓶在旋转摇床上34.5-36.5℃孵育8小时，从培养瓶取一份培养物转移至含有生长培养基的4升摇瓶中，并将培养瓶在旋转摇床上34.5-36.5℃孵育18小时。用此4升摇瓶的培养物接种含有30L生长培养基的发酵罐。将发酵罐在30-36.5℃，pH 7.4下培养28小时。发酵罐内容物通过离心和深层滤器过滤至收集器中。 

将获得的30L发酵液用30KD膜包浓缩至2L，向浓缩液中加入500mM磷酸缓冲液（钠盐）至最终浓度为10mM。将DEAE层析柱使用10mM磷酸缓冲液平衡后，将浓缩液上样后，使用0.1N氯化钠溶液洗脱得到目的蛋白。 

利用10，000NIWCO再生纤维素滤柱，将蛋白质溶液浓缩至5克／升并用10倍体积5%蔗糖溶液超滤透析。浓缩的蛋白质溶液通过0.2微米滤膜过滤。在冻干机中冻干蛋白。 

蛋白质浓度通过Lowry，O.H.等人(1951)生物化学杂志(Journal of BiologicalChemistry)193，265-275页的方法确定。蛋白质纯度通过测定无菌度、LAL（内毒素）含量和电泳方法确定。 

实施例3 

A群流脑荚膜多糖粉末的解聚和衍化 

向反应器中装入2.5g纯化的A群流脑荚膜多糖粉末，加入无菌乙酸钠缓冲液(50mM pH6.0)至流脑荚膜多糖浓度为4g/L时在4℃的温度下使流脑荚膜多糖的溶解。再将反应罐加热升温，再补加一些乙酸钠缓冲液(50mM pH6.0)稀释流脑荚膜多糖使其浓度至1.25g/L的用于后续的反应浓度。将流脑荚膜多糖溶液加热至55℃，加入30%过氧化氢至其反应浓度为1%；保持温度让反应2小时后，关闭加热器并通过冰水浴循环将流脑荚膜多糖溶液迅速冷却至室温。用HPSEC-MALLS（高压分子筛—MALLS系统）测定解聚的流脑荚膜多糖的分子量，然后将反应罐中的反应液用装有10KDMWCO规格的滤膜的超滤系统用无菌生理盐水（0.85%氯化钠）等体积10次换液并将解聚的流脑荚膜多糖浓度浓缩至15g/L，结束后将解聚的流脑荚膜多糖在1至5℃贮存直至下一工序。 

将不同批次的纯化解聚的流脑荚膜多糖分别加入反应三角瓶中，并用纯化水将其稀释到反应所需要的浓度6g/L。加入己二酸二肼酰（ADH）使其浓度达到反应所需的1g/L，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDAC）使其浓度达到反应所需的1g/L，利用酸碱调节反应体系的pH值至5.0，并将其控制此pH值，在室温环境下反应1小时，结束后加入氰基硼氢化钠（NaCNBH3），使其最终浓度达到2g/L，再次调节反应体系的pH值至5.0±0.5，在室温环境中，在搅拌的条件下反应48小时。 

反应结束后，使用装有10000MWCO规格的滤膜的超滤系统以纯化水进行等体积超滤，超滤20次使小分子物质（未反应的EDAC、ADH及中间体等）能够充分的滤除。最终，将衍生的流脑荚膜多糖浓缩至约15g/L，4℃保存。 

实施例4 

制备A群流脑荚膜多糖与CRM197蛋白质的单价结合物 

向三角瓶中装入实施例3获得的衍生的流脑荚膜多糖（反应浓度为800pmol/μL活性酰肼）以及纯化的CRM₁₉₇蛋白质（反应浓度为3g/L蛋白质）。利用生理盐水（0.85%NaCl溶液）稀释这些原料至目标反应浓度，并将pH调至6.0。向衍生的流脑荚膜多糖，蛋白质混合物中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDAC)并使其最终反应浓度为2.25g/L，调节pH至6.0并在室温环境反应，保持2个小时。反应结束后，将反应物在4℃贮存过夜，然后再进行纯化。 

用硫酸铵进行盐析沉淀以纯化衍生的A群流脑荚膜多糖与CRM197蛋白质的单价结合物，向反应混合物中加入硫酸铵晶体，使硫酸铵最终浓度达到300g/L，在过程中要多次少量的加入硫酸铵并同时用磁力搅拌器不停缓慢搅拌，待硫酸铵溶解充分，且反应体系中蛋白沉淀均匀稳定时，停止搅拌，用离心机以11000g的速度将硫酸铵沉淀后的反应产物进行分离。移除上清收集沉淀，用对沉淀进行复溶，待沉淀完全溶解后，用囊式滤器对结合原液开始过滤，过滤后连接好装有50KDa滤膜的超滤系统用生理盐水（0.85%NaCl溶液）对结合原液进行20次等体积超滤，滤除硫酸铵沉淀过程中残留的硫酸铵等小分子，收集回流并用囊式滤器再一次过滤除菌，最终将过滤好的结合产物保存于4℃冰箱中。 

表1结合反应的条件和产物中结合比及结合产物分子量 

结合物中流脑荚膜多糖的量和O-乙酰基含量利用与在解聚的和衍生的流脑荚膜多糖中所用相同的方法测定。蛋白质的量通过Lowry方法确定。结合物的分子大小利用凝胶过滤层析柱来确定，所述凝胶过滤层析柱的商品名为“TSK6000PW”，其利用DNA作为空体积标记物、ATP作为总体积标记物以及牛甲状腺球蛋白作为参考标记物。另外，从TSK6000PW柱上洗脱的结合物的分子大小通过多角度激光光散射测定。结合物的抗原特性利用双夹心ELISA方法，通过与抗荚膜多糖血清群特异性抗体的结合来测定。结合物纯度通过测游离多糖的量、游离蛋白质的量（利用毛细管电泳）、无菌度、LAL（内毒素）含量、残余EDAC含量以及残余铵离子含量来确定。 

实施例5 

活化的Y或W-135群流脑荚膜多糖的制备 

将纯化的Y，W-135群流脑荚膜多糖分别溶解于1L乙酸钠缓冲液(50mM pH5.0)中，浓度为5g/L。在室温下，用带有磁子的磁力搅拌器搅拌20分钟，以使纯化流脑荚膜多糖充分的溶解，按表2中的比例加入NaIO₄，并按表1各个反应所示的温度、时间分别进行反应，使流脑荚膜多糖上相邻的双羟基被氧化成醛基。 

表2.不同反应条件下得到的不同醛基引入比例的活化多糖 

准备装有30K MWCO的滤膜的超滤系统,将反应液放在这个系统的回流容器中，用纯化水进行10次等体积超滤换液，将反应中剩余的NaIO₄及反应过程中所生成的小分子物质滤除，得到引入了不同程度的醛基的活化的流脑荚膜多糖的水溶液；并且可将活化的流脑荚膜多糖浓缩，经过超滤将活化的流脑荚膜多糖浓缩至30g/L的浓度，放置于4℃冰箱备用； 

活化的流脑荚膜多糖的分子大小的确定利用凝胶过滤层析柱及利用多角度激光光散射来进行,利用葡聚糖分子大小标准来校准。流脑荚膜多糖的含量通过唾液酸法确定，引入的醛基含量利用Park，J．T．和Johnson，M．J．(1949)生物化学杂志(Journal of BiologicalChemistry)，18l，l49-151页所述方法确定。测量得到的数据见表1。活化流脑荚膜多糖的结构完整性由质子1H和13C NMR确定。活化的流脑荚膜多糖的纯度通过测量LAL（内毒素）含量来确定。 

实施例6 

制备活化的Y（W-135）群流脑荚膜多糖与CRM197蛋白质的单价结合物 

本反应中所使用到的材料和试剂包括活化的Y(W-135)群流脑荚膜多糖，无菌CRM197蛋白质、无菌的磷酸缓冲液（500mM，pH8.0）、氰基硼氢化钠（NaCNBH3）、疏水层析柱（FractogelPropyl(S)，Merck）硫酸铵、无菌1N盐酸、无菌1N氢氧化钠。 

将表2得到的各个活化W-135和Y流脑荚膜多糖（批号1，2）分别放入三角瓶中，用纯化水稀释流脑荚膜多糖至表2所示浓度，再加入1/9体积的无菌的磷酸缓冲液（500mM），按表2所示质量比加入CRM197蛋白粉末，并用带有磁子的磁力搅拌进行搅拌。在蛋白充分溶解于磷酸盐缓冲液后，按照表3调节pH值，然后按照表3所示比例加入氰基硼氢化钠，搅拌溶解，反应。 

在控制流脑荚膜多糖的活化程度（醛基含量）和活化的流脑荚膜多糖：CRM197投料这两个条件，可以获得结合质量比不同，分子量不同的各种免疫结合物。待反应结束后在反应混合物中加1.1g/L硼氢化钠，混合4小时后加入硫酸铵至1mol/L，用1M硫酸铵溶液+50mM磷酸缓冲液（pH7.5）平衡疏水层析柱（填料为Fractogel Propyl(S)，Merck），上样后，再用上述缓冲液洗5个柱体积，最终用50mM磷酸缓冲液洗脱并收集流脑荚膜多糖-蛋白质结合物。在装备50KDa滤膜的超滤系统中用生理盐水对流脑荚膜多糖-蛋白质结合物溶液进行15次等体积超滤，收集回流并用囊式滤器过滤除菌，保存于4℃。反应得到的结合物的流脑荚膜多糖：蛋白的比例和平均分子量见表3. 

表3.不同反应条件下得到的结合流脑荚膜多糖 

结合物中流脑荚膜多糖的量和O-乙酰基含量利用与在活化流脑荚膜多糖中所用相同的方法测定。蛋白质的量通过Lowry方法确定。结合物的分子大小利用凝胶过滤层析柱来确定。结合物的抗原特性利用双夹心ELISA方法，通过与抗多糖血清群特异性抗体的结合来测定。结合物纯度通过测定未结合（未缀合）多糖的量（通过在疏水相互作用层析柱上洗脱）、未缀合蛋白质的量（利用毛细管电泳）、无菌度、LAL（内毒素）含量、残余EDAC含量以及残余铵离子含量来确定。 

实施例7五价疫苗的配制 

向三角瓶中的生理盐水(0.85%)中加入一份无菌100-500mM磷酸钠缓冲的生理盐水以产生10mM磷酸钠的最终疫苗浓度。向含有10mM无菌磷酸钠生理盐水的积三角瓶加入4种无菌单价流脑荚膜多糖-CRM197结合物各一份，Hib荚膜多糖-CRM197结合物一份，生成每毫升缓冲液中含有每种血清群多糖终浓度如表1。其中A群流脑荚膜多糖-CRM197结合物由实施例4 方法制备，Y群和W135群流脑荚膜多糖-CRM197结合物由实施例6方法制备，Hib荚膜多糖-CRM197和C群流脑荚膜多糖-CRM197结合物购买于美国辉瑞公司，将配制的五价结合物混和并通过0.2um滤器过滤至第二个三角瓶中，然后分装至2mL西林瓶中。 

表4.多价结合疫苗的配方（以结合物中多糖含量计算） 

多价制剂中每一种血清群多糖的量通过糖成分分析，使用脉冲电流检测及高pH阴离子交换层析来确定。蛋白质的量通过Lowry方法测定。疫苗的pH值利用连接至pH计的复合电极测定。多价缀合疫苗的抗原特性利用双夹心ELISA方法，通过结合抗多糖血清群特异性抗体来测定。多价缀合疫苗的免疫原性通过测定在动物模型中疫苗的每一结合物引起初次和加强抗多糖IgG免疫应答的能力来确定。多价缀合疫苗的纯度通过测定未结合（未缀合）多糖的量（利用脉冲电流检测及高pH阴离子交换层析），无菌度、LAL（内毒素）含量、致热原含量和一般安全性来确定。 

我们按照选CN1709595B专利方法制备出以破伤风类毒素（TT）为载体的流脑ACWY群结合疫苗和Hib结合疫苗，按照下表所示剂量分别配置出2种组合物。依次为配方9和配方10。 

表5.多价结合疫苗的配方（以结合物中多糖含量计算） 

实施例8 

氢氧化铝佐剂辅助的多价疫苗的制备 

向含有生理盐水的三角瓶加入每一单价脑膜荚膜多糖CRM197结合物各一份，生成每毫升缓冲液中每一血清群多糖各8ug/mL的终浓度。向多价缀合疫苗中加入溶于生理盐水（0.85%氯化钠）的氢氧化铝和磷酸铝，以获得每毫升疫苗0.2mg或3.6mg铝离子的终浓度。将0.5mL的上述混合物分装至2mL西林瓶中，每西林瓶中含一个人用剂量的含佐剂的多价结合疫苗。 

表6.多价结合疫苗的配方（以结合物中多糖含量计算） 

实施例9 

多价疫苗（配方1，2，3，4，5，8）的免疫原性比较 

在临床评价之前，研究了五价荚膜多糖结合疫苗在小鼠上引起免疫应答的能力。利用小鼠进行疫苗（不添加铝佐剂配方1，2，3，5和添加铝佐剂5，8）的免疫原性对比研究。由于小鼠动物模型能够通过免疫应答反应对比其免疫原性，因此该研究是有意义的。 

在小鼠免疫原性研究中，共进行了七组实验，每组10小鼠（健康状况良好的,体重在12-14g的BALB∕c雌性小鼠（SPF级）），这七组分别为阴性对照组即生理盐水（0.85%氯化钠）、配方1，2，3，4，5，8，分别按人用剂量的1/4施用，即每只小鼠皮下注射125ul。进行3次免疫，并在接种后2周采集其血液样本。 

利用ELISA方法测定A，C，Y，W135群流脑荚膜多糖和b型荚膜多糖的抗体。利用牛血清白蛋白将每种荚膜多糖连接至滴定孔上。血清样本与结合在ELISA微量滴定板孔上的过量的每一种荚膜多糖孵育。孵育后，用缓冲液洗涤滴定孔，并将能够结合抗流脑荚膜多糖抗体和抗b型荚膜多糖抗体的二级抗体--酶结合物加至抗体一多糖复合体中进行孵育。孵育后，用缓冲液洗涤滴定孔，并将化学底物加至多糖一荚膜多糖抗体一二级抗体一酶结合物中。经酶水解化学底物的一部分后导致颜色形成。颜色形成的量(光吸收度OD)与结合在滴定孔中的荚膜多糖-荚膜多糖抗体成正比。统计不同实验组缀合疫苗免疫后各血清群（型）抗体滴度水平（OD>2倍的生理盐水对照组的OD值最大稀释倍数），实验结果见下表。 

表7.多价结合疫苗的免疫原性比较 

数据表明配方1，2，3（低剂量的流脑结合疫苗）和配方4（高剂量的流脑结合疫苗）的免疫 反应并无显著区别。加入磷酸铝佐剂的配方(配方5，配方8)的免疫原性略高于相同剂量的无佐剂配方（配方1）。 

实施例10 

多价疫苗（配方9，10）在于无细胞百白破疫苗同时注射的免疫原性比较 

在临床评价之前，研究了五价多糖结合疫苗在小鼠上引起免疫应答的能力。利用小鼠进行疫苗（不添加铝佐剂配方9，10）的免疫原性对比研究。由于小鼠动物模型能够通过免疫应答反应对比其免疫原性，因此该研究是有意义的。 

在小鼠免疫原性研究中，共进行了三组实验，每组10小鼠（健康状况良好的,体重在12-14g的BALB∕c雌性小鼠（SPF级）），这三组分别为阴性对照组即生理盐水（0.85%氯化钠）、配方9，10分别按人用剂量的1/4施用，即每只小鼠皮下注射125ul。进行3次免疫，在接种多价疫苗的同时用1/4人用剂量接种市售无细胞百日咳疫苗（混合接种），在接种后2周采集其血液样本。 

利用ELISA方法测定每一血清群多糖的抗体。利用牛血清白蛋白将每一血清群多糖连接至滴定孔上。血清样本与结合在ELISA微量滴定板孔上的过量的每一种荚膜多糖孵育。孵育后，用缓冲液洗涤滴定孔，并将能够结合抗脑膜炎球菌多糖抗体的二级抗体一酶结合物加至抗体一多糖复合体中进行孵育。孵育后，用缓冲液洗涤滴定孔，并将化学底物加至多糖一脑膜炎球菌抗体一二级抗体一酶结合物中。经酶水解化学底物的一部分后导致颜色形成。颜色形成的量(光吸收度OD)与结合在滴定孔中的抗原-抗体成正比。统计不同实验组缀合疫苗免疫后各血清群荚膜多糖抗体滴度水平（OD>2倍的生理盐水对照组的OD值最大稀释倍数），实验结果见下表。 

表8.多价结合疫苗与无细胞百白破疫苗共同注射的免疫原性比较 

数据表明配方9（低剂量的流脑结合疫苗）的免疫原性优于配方10（高剂量的流脑结合疫苗）。 

参考文献 

中国专利CN100556459. 

中国专利CN1889975A 

美国专利US20090311285. 

美国专利US6146902, 

美国专利US4356170 

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Hesterin，S．(1949)生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)，180,249页Park，J．T．和Johnson，M．J．1949.生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)，181，l49-151 

Oliver H.Lowry,Nira J.Rosebrough,A.Lewis Farr,和Rose J.Randall,（1951）.生物化学杂志(Journalof Biological Chemistry)193，265-275页。 

Claims (4)

1.一种低剂量多价结合疫苗组合物，其特征是包含A群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的A群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，C群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的C群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，Y群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的Y群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，W135群流脑荚膜多糖为2.0-4.8μg的W135群流脑荚膜多糖-载体蛋白结合物，和b型流感嗜血杆菌荚膜多糖为2.0-4.8μg的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-载体蛋白结合物。

2.根据权利要求1所述的一种低剂量多价结合疫苗组合物，其特征是所述载体蛋白为白喉CRM197蛋白或破伤风类毒素。

3.根据权利要求1所述的一种低剂量多价结合疫苗组合物，其特征是还包括佐剂氢氧化铝或磷酸铝，所述氢氧化铝或磷酸铝中的铝含量为0.1-1.8mg。

4.权利要求1-3之一的一种低剂量多价结合疫苗组合物在配制预防A群、C群、Y群、W135群流行性脑脊髓膜炎奈瑟氏球菌、b型流感嗜血杆菌引起的感染的疫苗制剂中的用途。