JPS59141523A - 結合ｈ．インフルエンゼｂ型ワクチン - Google Patents

結合ｈ．インフルエンゼｂ型ワクチン

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JPS59141523A
JPS59141523A JP59014537A JP1453784A JPS59141523A JP S59141523 A JPS59141523 A JP S59141523A JP 59014537 A JP59014537 A JP 59014537A JP 1453784 A JP1453784 A JP 1453784A JP S59141523 A JPS59141523 A JP S59141523A
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JP
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protein
polysaccharide
conjugate
hours
solution
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JP59014537A
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English (en)
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モーリス・アール・ヒルマン
ジヨセフ・ワイ・タイ
リチヤード・エル・トルマン
フイリツプ・ピー・ヴエラ
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Original Assignee
Merck and Co Inc
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
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    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘモフイルスインフルエンゼ（インフルエンザ菌Ｈａｅ
ｍｏｐｈｉ］ｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）　ｂ型（Ｒ
ｉｂ）は乳児の地域流行性細菌髄膜炎の最も重大な、原
因であり、また合衆国では獲得性知能遅延の主な原因と
して確認されている。■、インフルエンゼｂ型の型特異
性莢膜多糖類がこの細菌による侵入感染の主なビルレン
ト因子であることは種々の調査から明白である。この多
糖類に対する血清抗体がＨ，インフルエンゼｂ型によっ
て生じる疾病に免疫を与えることについての多くの根拠
がある。大人や２才以上の子供に精製莢膜多糖類を用い
ての予防接種が有効であることが示されている。しかし
ながら最も感染しやすい１５ケ月以下の乳児を防護する
ためにはこの多糖類は十分な血清抗体を誘発することが
できない。それ故この年令を対象とした新規なそして効
能あるワクチンを創製することが必要である。これはＨ
ｉｂ関連疾病に対する死亡率が抗生物質治療によって約
５〜１．０　％に減少してきているが、罹病率が３０〜
５０％のままであることから特に重要である。（シュニ
ールソン等、ヘモフイルスインフルエンゼＢ型多糖類−
蛋白質結合体：莢膜多糖類ワクチンの新規生成に対する
モデル、Ｈｕｍ　、＆　Ｖｅ　ｔ　、ワクチンのＮｅｗ
Ｄｅｖ第７７〜９４頁、１９８０年） Ｈ，インフルエンゼｂ型多糖類はスペーサーすなわち６
−アミノカプロン酸によりナイセリアメニンギチジス（
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）　（髄
膜炎菌）の血清型蛋白質（主要外膜蛋白質）に結合され
る。動物モデルでは、この結合体は免疫原性が高く多糖
類単独より少なくとも３０倍の、多糖類に対革る抗体を
生じる。さらにこの結合体は長く持続する防御に対して
最も望ましい種類である免疫グロブリンＧを実質的に１
００％生じる。
本発明で使用されるＨ、インフルエンゼＢ型多糖類はロ
ーゼンベルグおよびサメンホフ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　
ａｎｄ　Ｚａｍｅｎｈｏｆ　：　Ｊ、Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅ
ｍ　。
第２３６巻、第２８４５〜２８４９頁 （１９６１年））およびザメンホフ等（Ｊ。
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第２０３巻、第６９５〜７０４
頁（］、　９５３年））によって報告されている。
提案された構造は等モル量のリボース、リビトールおよ
びリン酸塩：β−Ｄ−リボース−（１−１）−リビトー
ル−５−（ＰＯ４）を基本としている（　Ａｎｄｅｒｓ
ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　：　Ｉｎｆ、＆　Ｉｍｍ。
第１５巻Ｎα２第４７２〜４７７頁（五１９７７年））
。
セファロース４ＢカラムでのＫＤ約０３４を有するＨｉ
ｂが好ましい。
本発明で用いられる蛋白質はＴ細胞刺激物質であるＮ、
メニンギチジスからの血清型外膜蛋白質である。具体例
はへルチング （Ｍｅｌｔｉｎｇ　）　Ｃ）の報告（ナイセリアメニン
ギチスの血清型決定基蛋白質、Ａｃｔａｐａｔｈ。
ｍ１ｃｒｏｂｉｏ１．５ｃａｎｄ、　５ｅｃｔ、　Ｃ’
、第８９巻、第６９〜７８頁、１９８２年）およびフラ
ッシュ（Ｆｒａｓｃｈ　Ｊ　　らの報告（Ｊ、　Ｂａｃ
ｔ、第１２７巻、第９７３〜９８１頁、（１９７６年）
）に記載されている血清型２の外膜蛋白質（５ｅｒｏｔ
ｙｐｅ２　ｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　）である。
本発明の方法において、６−アミノカプロン酸をまず）
（ｉｂＰＳ　　に共有結合させてＰＳ　−スペーサー複
合体を生成させる。この方が最初に蛋白質スペーサー複
合体を生成するよりも好ましい好適である。ｐｓを約４
℃で短時間高いｐＨにおいて臭化シアノジエン（ＣＮＢ
ｒ）で活性化する。次に活性化ｐｓを約２４時間酸と混
合し、その後透析などによって精製する。このＰＳ−ス
ペーサー複合体を弱い酸性の蛋白質溶液中で混合し、そ
れに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
−カルボジイミド塩酸塩を添加する。混合液をｐＨ４，
７５で約２時間反応させ、その後ｐｓ−スペーサー蛋白
質結合体を遠心分離およびカラムクロマトグラフィなど
によって分離する。
本明細書に記載するように本発明はスペーサ−を介して
結合された蛋白質／多糖類結合体であると言える。多糖
類、スペーサーおよび蛋白質間の結合の特定タイプに対
して本発明を限定することを意味するものではない。
本発明の結合体はＨ，インフルエンゼＢ型細胞によって
生じる画面症に対して予防上または治療上能動的または
受動的防御のために哨乳類に使用することができる。受
動的防御は医薬的に使用し得る担体の存在または不在下
で免疫原性薬剤を含有する結合体またはグロブリンをあ
らかじめ適量に投与した動物から得られた全抗血清を注
射することによって達成することができる。かかるグロ
ブリンは電気泳動のような標準技術によって全抗血清か
ら得られる。
本発明の好ましい態様では、結合体はヒト、特に新生児
の能動予防接種ｒＩ１１）乙して用いられる。
本発明の結合体は能動または受動免疫のために注射可能
な形態で使用される。本発明の結合体の注射可能な形態
は該結合体の有効量、該結合体またはｒグロブリンから
誘導された抗血清または該抗血清の他の抗体含有フラク
は本発明の範囲内であることを意味する。
有効量とは抗体の可測量を生じることができる量のこと
である。人ではこれは投与１回当９２〜５０μｇ、好適
には１０４／投与の範囲であることができる。
本発明はさらに次の実施例に関して定義されるが、それ
らは具体的に説明するものであって、限定するものでは
ない。
実施例１ 段階Ａ：ヘモフイルスインフルエンゼｂ型にューヨーク
の州立大学から受は入れたＲＯ８Ｓ　７６８で培養した
）の凍結乾燥チューブを０．８５％（ｗ／ｖ　）無菌塩
化ナトリウム１就に懸濁させ、０．２ｍｌをハートイン
フエージョンブイヨン寒天平板に塗抹した。キャンドル
ジャー中で３７℃において２４時間培養した後、平板の
増殖物をハートインフュージョンブイヨン（ＲＩＢ）５
ゴ（１２１℃で２５分滅菌したハートインフュージョン
ブイヨン（Ｄｉｆｃｏ１２５ｇ／Ｌ、酵母エキス（Ｄｉ
ｆｃｏ）　３　ｇ／　Ｌおよびデキストロース５　ｇ／
Ｌ　）に再懸濁させそして０．２　ｄをＨＩＢ　寒天（
ＨＩＢと同様プラス寒天（Ｄｉｆｃｏ）　２０　ｊｊ　
／　Ｌ　）に塗抹ｔた。
４本のＨＩＢ寒天瓶を調製した。
板の増殖物をＨＩＢ２０ｄに再懸濁させそして接種材料
培地１１に移植した。フラスコを３７℃において回転振
盪機上２００　ｒｐｍで７時間培養した。
ハートインフュージョンブイヨン（ジフコ）　　　　２
５，９Ｎａα　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　５ｇ酵母エキス透析物（ジフコ） （細孔サイ１１２０００分子量）３ｇ Ｋ２ＨＰＯ４２，５，？ 蒸留水　　　　　　　　　　　　　　１ｔＮ　Ａ　Ｄ　
”　　　　　　　　　　　　　１０　”Ｉｇ〜　、　＊
＊ ヘミン　　　　　　　　　　　　　１０ｍ７＊じやま板
のない２ｔ工ルレンマイエルフラスコ中１２１℃で２５
分間滅菌した。
＊＊２ｍ＠／ｒｎＪ２を含有するＮＡＤの保存溶液をミ
リポアフィルタ−（０２２μ）で濾過することによって
滅菌し、接種直前に無菌的に添加した。
＊＊＊　０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨ１０−中に２’００ｍ
Ｆを溶解することによってヘミン３Ｘの保存溶液を調製
し、容量を１００ｄに調製した。
溶液を１２１℃で２０分間滅菌し、接種前に最終培地に
無菌的に添加した。
ｉａｃ　：　１４　を発酵一段階Ｂの１ｔを種子培地９
ｔを含有する１４を発酵器に接 種する。
種子培地−１４を発酵 ハートインフュージョンブイヨン（ジフコ）２５Ｏｆ！
Ｎａの　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０ｇ
酵母エキス透析物（アムバー）　　　３１（細孔サイズ
１２．０００分子量） Ｋ２ＨＰＯ４２５，９ ＵＣＣ）Ｎ　　ＬＢ６２５　（８％溶液）　　　　２０
ｒｄ（１２１℃で１時間前滅菌） 蒸留水　　　　　　　　　　　　　８．５ｔデキストロ
ーズ　　　　　　　　　５０ｇ（デキストローズ５０．
９と蒸留水 ２００蔵の溶液を１２１℃で ２０分間滅菌し、接種前に無菌 的に添加した） ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　１００■ヘミン　　
　　　　　　　　　１００　ｍ’ｉ＊１２１℃で９０分
間滅菌した。
発酵は光学濃度（０，Ｄ、　ｌおよびｐＨ測定によって
Ｏ，Ｄ、０．９６に達するまで監視した。
産生−２５０を発酵 ｊ’ＩＰ’ｌｃ　期（７）　約１０１　全産生培地Ｉ　
８２　ｔ　全含有する２５０ｔフェルメンタ−に接種す
るために使用した。
産生培地　２５０２発酵 ハートインフュージョンブイヨン（ジフコｌ　　　５０
００ｇ酵母エキス透析物（アムバー）　　　６ｏｎ（細
孔サイズ１２．０００分子量） ＵＣＯＮ　　ＬＢ　　６２５（８％溶液）　　　４００
ゴ（１２１℃で１時間予備滅菌） テキストロース　　　　　　　　　１０１００Ｏデキス
トロース１００ｇと蒸留水 ４ｔの溶液を１２１℃で２０分間 滅菌し、接種前に無菌的に添加し た） Ｋ２　ＨＰ　０４　　　　　　　　　　　　　　　　５
００　ｇＮａＱ！　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１０００ｇ（塩を蒸留水４ｔに溶解し、１２１ ℃で２０分間滅菌し、次に接種前に 無菌的に添加した） ヘミン３Ｘ　　　　　　　　　　　　　　２ｇ（０，１
ＭＮａＯＨ５０−に２ｇを溶解し、容量を１０１００Ｏ
に調製するこ とによって溶液を生成し、１２１℃ で２０分間滅菌し、接種前に添加し た） ＮＡＤ　　　　　　　　　　　　　１００■（２〜７ｍ
ｇを含有するＮＡＤの保存 溶液をミリポアフィルタ−（０２２ μ）で濾過することによって滅菌し 接種前に添加した） ＊１２１℃で３０分間滅菌した。
０、　Ｄ、およびｐＨレベルを発酵中２時間毎にチェッ
クした。０．Ｄ、が２時間同じ時（最終０．　Ｄ。
は１０時間で２．８０であった）、発酵を終了した。
回収および不活性化 バッチの約１９０！−を最終濃度１　：　１００００（
Ｗ／Ｖ）にチメロサルの中に回収することによって不活
性化した。
遠心分離 不活性化を２４時間した後、バッチを流量４００ｒｎｌ
／分でシャープレス遠心機で遠心分離した。遠心分離（
３２，ＯＯＯｒｐｍ）後に得た上澄み液をセタブロン（
ヘキサデシルトリメチルアンモニウム・ブロマイド）で
処理し最終濃度を０．１％（Ｗ／Ｖ　）とした。セタブ
ロンー処理上澄み液を回収生成物として用いた。
限外濾過による濃縮 上澄み液をＸＭ−５０（５０，０００ダルトン・カット
オフ）中空繊維カートリッジ（膜面積４，５セ、空気流
量２．０７ｐｍおよび２０　ｐｓｉ濃縮速度１０ｔ／時
間）を有するアミコンＤＣ−３０ユニットで４℃におい
て濃縮した。
約２４時間後、最初の上澄み液１８０７をリチンテート
４．６７、　ｔに容量を減少させた。涙液を捨てた。
１０％エタノ、−ル沈殿 ＸＭ−５０リチンテート（４，６７１１に１００係エタ
ノール５７９ｍＡを４℃で攪拌しながら最終濃度１０容
量係エタノールに至る丑で滴加した。混合液をさらに２
〜３時間攪拌し、４℃で１２〜１８時間放置して完全に
沈殿させた。上澄液を吸引して集め、さらにベックマン
Ｊ−２１Ｂを用いｌ１００ＯＸＧ（ＪＡ−１０ロータで
８００Ｏｒｐｍ１４℃で３０分間遠心分離し、不溶の沈
殿物を捨てた。
２０％エタノール沈殿 上記の１０％エタノール可溶のフラクション（５，０８
ｔ）に、攪拌しながら１００％エタノール６３５−を滴
加して最終濃度を２０容量チとした。混合物をさらに２
ないし３時間攪拌し１２ないし１８時間４℃で静置して
沈殿を完全にした。生成した沈殿を前記のようにして集
めた（収量３２ｇ）。上澄み液をさらに処理した。
５０％エタノール沈殿 ２０％エタノール可溶フラクション（５，５８１）に１
００チェタノール３．３５１を最終濃度５０容量係まで
攪拌しながら滴加した。混合液を４℃で１２〜１８時間
放置して沈殿を完全にした。
最初のエタノールペレットの回収 生成した２０％エタノール可溶１５０％エタノール不溶
沈殿を４℃で３０分間ベックマンＪ−２１Ｂを用い１１
，０ＯＯＸＧ　（ＪＡ−１００ローター８．００Ｏｒｐ
ｍ）において遠心分離によって集めた。５０チェタノー
ル上澄み液を捨て、粘性沈殿２２６ｇを得た。
塩化カルシウム抽出 上記の５０％エタノール不溶物質のうちの５０．９の湿
潤ペーストを冷たいガラス蒸留水１！５０．Ｍと混合さ
せん。これに冷たい２ＭＣａＣ！！２・２Ｈ２０２００
，０＋＋＋ｊｌ！を添加し、混合液（最終濃度＝　１．
０　Ｍ　Ｃａα２）を３０分間オムニミキサー（Ｏｍｎ
ｉｍｉｘｅｒ）の目盛Ｎ（Ｌ　２．において氷：水浴上
で抽出した。抽出段階を上記のように３回繰り返して湿
潤ペースト約２００ｇを処理した。
上記からのＣａＣｌ２　　抽出液（容量＝１６００艷）
を４℃で攪拌しながら１００％エタノール４．００１ｎ
ｌを滴加することによって２０％エタノールにした。さ
らに２〜３時間攪拌した後、混合液を４℃で１２〜１８
時間放置して沈殿を完全にしだ。混合液をベックマンＪ
−２１Ｂ　　１１，０ＯＯＸＧ（ＪＡ−１０ローターで
８．０００ｒｍ）で４℃で３０分間遠心分離した。
上澄み液をチーズクロス（ｃｈｅｅｓｅ　ｃ］ｏｔｈ）
を通して傾注し、脂質様浮遊物質を除去した。
不溶沈殿物を捨てた。
２０％エタノール溶性上澄み液（容量＝１、８６１　）
を攪拌、しながら１００％エタノール５．１５ｔを２〜
３時間にわたり滴加することによって７５％エタノール
にした。次に混合液を４℃で１２〜１８時間放置して沈
殿を完全にした。
７５％エタノールペレットの回収 生成した不溶沈殿を中程度のガラスフリット板（細孔サ
イズ１０〜１５ミクロン）を備えたブラフネル濾過器で
回収し、１００％エタノール（１洗浄につき２５０ｍ１
）で３回およびアセトン（１洗浄につき２５０ｍ７りで
３回洗浄した。洗液全部を捨てた。収量は５６．８ｇで
あった。
フェノール抽出 前段階からの材料の一部（１８，２ｇ）をダウンスホモ
ジナイザー（Ｄｏｕｎｃｅ　ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）
を用いて０．４８８Ｍ酢酸ナトリウムｐ１１６．９１０
００ｍ６（１８，２ｍ１Ｆ／−）に再懸濁させた。
酢酸ナトリウム溶液を直ちに次の通り新しく調製したフ
ェノール水溶波谷５００−で４回抽出した：　０．４８
８　Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ６，９９００−をフェノール
（Ｍａｒｉｎｃｋｒｏｄｔ社製結晶）の５ポンドビンに
添加し、完全な溶液になるまで混合した。各フェノール
抽出液をベラマンＪ−２１Ｂにより４℃、１１，０ＯＯ
ＸＧにおいて３０分間遠心分離してエマルジョンを破壊
した。水相をプールし、同様の方法でフェノール溶液で
さらに３回抽出した。フェノール相を捨てた。
透析 プールした水相を４℃で２２時間ガラス蒸留水１４．Ｏ
ｔで３回交換して透析した。最終透析率は１：２２，０
００容量でありフェノール臭気のすべての痕跡が試料か
らなくなった。
透析物（容量＝７４０ＴＬｅ）に最終濃度０２０５ＭＣ
ａα２になるまで２．　ＯＭＣａα２１８．５ｍを添加
した。次に速く攪拌した溶液に１００％エタノール２２
７６ｄを２〜３時にわたって滴加して溶液を７５チエタ
ノールにした。４℃でさらに１２〜１．８時間放置した
後、澄明な上澄み液をサイホンで除き、沈殿を４℃で３
０分間へツクマンＪ　−２１Ｂ　２．７．０ＯＯＧ（Ｊ
Ａ−２０日−ターに対して１５．　ＯＯＯｒｐｍ）で遠
心分離して収集した。多糖類沈殿物を無水エタノール５
００ｒｎ１．でワーニングブレンダーを用いて粉砕し、
中間粗さのガラスフィルターで集め、無水エタノール２
５〇−次にアセトン２５０彪で洗浄した。次に試料を真
空内焦水Ｃａα２で４℃において１８〜２４時間乾燥し
た。収量は３．６ｇであった。
２０％エタノールでの限外濾過 物質を０．０５　Ｍ　ＣａＱ！２２００　ｍｌに再懸濁
させ、１００％エタノール５０ｍ１を滴加して２０係エ
タノールにした。混合液を直ちに４℃で２時間、１００
．０ＯＯＸＧ　（５０，２Ｔｉ　　ローターで４０．　
ＯＯＯｒｐｍ）で遠心分離することによって清澄化した
。沈殿物を捨て、澄明な上澄み液を（容量＝、２２８ｄ
１１００％エタノール５０１．６ｍ７！を添加すること
によってエタノール７５％にした。２〜３時間攪拌した
後、混合液を４℃で１２〜１８時間放置して沈殿を完全
にした。
最終多糖類生成物 多糖類を遠心分離して集め、エタノールで粉砕しそして
ガラスフィルターで回収した。
多糖類を無水エタノールおよびアセトンで洗浄し、無水
Ｃａｃｅ２で４℃において真空乾燥した。収量はＨ，イ
ンフルエンゼｂ型莢膜多糖類３．６ｇであった。表１−
１および１−２のデータを得た。
表　　１’　　−１ ＨＩＢ多糖類化学分析データ 水分（Ｔ　Ｇ　）　　　　　　　６．４％蛋白質　　　
　　　　　　０．１係 核酸　　　　　　　　　　０５％ リボース（ペントース）２８．６係 リン酸塩　　　　　　　　　５．３％ ＫＤ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，３４（最大）０．
６３（最小） この分析は次の方法によった １、　水分−パーキン−エルマー熱天秤ＴＳＧ−１を用
いる標準的熱重量分析（，１００′Ｃ−ｉでの重量損失
） ２、　蛋白質−ローリ−法、ローリ−（Ｌｏｗｒｙ）等
、Ｊ、　Ｂｉ　ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、第１９３巻、第２６
５頁（１９５１年） ３、核酸−〇、　Ｖ、法、ワーバーグおよびクリスチア
ン（Ｗａｒｂｕｒｇ及びＣｈｒｉｓｔｉａｎ　）　：Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ　Ｚ、第３１０巻、第３８４頁（１９４２
年） ４、　リボースービアル法、ディッシエおよびシュワル
ツ（］］５ｃｈｅ　ａｎｄ　Ｓｃｈｗａｒｚ）　：Ｍｉ
ｃｋｏｒｏ　ｃｈｉｍ　Ａｃｔａ第２巻、第１３頁（１
９３７年） ５　リン酸塩−モリブデート法、チェノ（Ｃｈｅｎ）等
：　Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ　第２８巻、第１７５６頁（１
９５６年） ６′ニー屈折率によりセファロース４Ｂで測定 表　　１−２ ０１（多糖類）０２．０．２．０１ 本服用量１．０ゴ さらに多糖類を寒天ゲル拡散によって確認した。寒天上
二重拡散（ラフタロニー ０ｕｃｈｔｅｒ］ｏｎｙ　ｌをハイランドパターンＤプ
レートを用いて行なった。Ｈ，インフルエンザのロース
７６８株に対して調製した抗血清を周りのウェルに置い
た。プ娑−トを温室内２０〜２５℃で２４時間保温した
。沈降素バント（０，３４（主）および０．６３におけ
る）か’５０，２５および１２．５　ｍｃ９／ｍｌ　４
度において多糖類体と特定の抗血清間で観察す畝だ。
実施例２ の調製 （ジフコ）−１本の凍結乾燥したハ′イアルを溶解し、
ゴットシリツヒ酵母透析物培地１葱で希釈した。
チューブはもともとウオルターリードアーミーインスチ
チュートオプリサーチから得た細菌（Ｎ、メニンギチジ
スのＢ−１１株）を連続培養および凍結乾燥して得た親
液性の三番目の産生であった。
ゴットシュリツヒ酵母透析物を次の通シ調製した。
Ｌ−グルタミン酸　　　１．６ Ｎａα　　　　　　　　　６．０ 無水Ｎａ　２ＨＰＯ４２，５ ＮＨ，ｃｌｌ、２５ にα　　　　　　　　　　０．０９ Ｌ−システィンＨの　　　０．０２ 蒸留水６．４ｔにシフコ酵母エキス１２８０．９を溶解
することによってフラクションＢを得た。溶液を３個の
ＨｔＯ８Ｍ　カートリッジを備えたアミコンＤＣ−３０
中空繊維透析ユニットで透析した。透析物およびＭｇＳ
Ｏ４・７７Ｈ２Ｏ３８４およびデキストロース３２００
．９を透析物に溶解し、全容量を蒸留水で１６ｔにした
。ｐＨをＮａＯＨで７４に調製し、ミリポア（０２２μ
）で濾過することによって滅菌しそして次の通９ゝゝフ
ラクションＡ“を含有する発酵物に添加した。
】ｌおよびフラクションＢ２５−を添加し、ｐＨを１ま
たは２　Ｎ　ＮａＯＨで７０〜７２に調節する。
３９ｔおよびフラクション８８００ｍｌを添加し、ｐＨ
を１または２　Ｎ　ＮａＯＨで７．０〜７．２に調節す
る。
ミュラー−ヒントン寒天平板（ジフコ）に発酵作業の前
に画線接種した（１バイアルにつき４０本）。水飽和６
％〜８　％　Ｃｏ□　恒温器中３７℃で１６〜１８時間
培養した後、平板の増殖をとシ、ゴットシュリツヒ酵母
透析媒質２０蔵に懸濁させた。
２０ｍ１を１ｔの比濁計フラスコ中のゴットシュリツヒ
酵母透析媒質８００ｍ１に懸濁させた。
ｐｉ（を７．４〜７．６に調節し、ＯＤを６６０　ｎｍ
で０．０６＝０．０８に調節した。
増殖懸濁液４００ｍ１をもう１つの１を比濁計フラスコ
に移した。ｐＨを７．０〜７．６に連続して調節した。
培養物がＯＤの対数で０．２５ないし０３になった時、
発酵を終結した。２つのフラスコを１つの１２５０ビン
にプールした（８００ｍｇｌ。
産生 生産完全培地３９ｔを含有する無菌５０１発酵物（ビル
ソベン）に接種するために種子培養約８００−を使用し
た。バッチは３７℃、５ｔ／分エアオーバーレイで６９
０　ｒｐｍおよび７．０〜７．２に一定ｐ■■コントロ
ールで培養した。ｐＨおよび溶解した酸素濃度を発酵中
連続して測定した。１７時間後、培養をフェノールで不
活性化した（最終濃度０．５　ｖ／ｖ％）。
１７時間後の最終０．　ＤＪｊ　１．６０　”ｒ’４　
ツた。
不活性化 不活性化の２時間後に試料を採取し、生菌性をチェック
した。２４〜４８時間後、平板のいずれにも増殖はみと
められず、培養株が不活化されたことを示した。
遠心分離 少なくとも４℃で２４時間後、不活・化培養液４０ｔを
ミリポフペリコンカセットシステム（ｊ’１ｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ　Ｐｅｌ］１ｃｏｎ　Ｃａ５ｓｅｔｔｅ　ｓｙｓ
ｔｅｍＪ（１０平方フイート膜で０．４５ミクロン）で
３ｔに濃縮した。残存する細胞懸濁液３ｔをＧＳ３ソア
バルローター（ＧＳ　３５ｏｒｖａｌ　ｒｏｔｅｒ）で
４℃で１０．　ＯＯＯｒｐｍ　４０分遠心分離し、細胞
ペースト（２００ｇ湿潤重量）が集められた。
洗浄および抽出 細菌細胞を蒸留水８００ｍ１（最初の増殖容量の２％）
に緩かに（磁気攪拌しながら）再懸濁し、５℃で３０分
間１１．０００．Ｇ　ＣＦＡ　−１０日−ターで８００
０ｒｐｍ）で遠心分離することｋよって沈殿化した。
洗浄した細菌細胞を０．５％ナトリウムデオキシコーレ
ート（ｐ’ｏｃ）を含有する０、　１　Ｍトリス−０，
０１Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，５緩衝液１００’Ｏｒｎ
ｌに５ｍ／！／ｇ湿潤重量で懸濁した。
（非常に緩かな磁気攪拌しながら）そして水浴で５６℃
に加熱した。混合液の温度が５６℃に達した後、緩かに
振盪しながら１５分間桶出金続けた。抽出液をタイプ１
９　Ｔｉ　　ローターを使用するベックマンし５〜６５
遠心分離機で４℃で１時間１５，０ＯＯＧ（１０，００
０ｒｐｍ）で遠心分離した。
濁った上澄み液を緩かに吸引し、３１，０００Ｇ　（１
４，５００ｒｐｍ　）で３０分間同じローターで再び遠
心分離して清澄にした。１５，０００Ｇ沈殿を０．５９
ＤＯＣ，１Ｍトリス−０，ＯＩＭＥＤＴＡ、ｐ１１８．
５緩衝液１００〇−中５６℃で１５分間再抽出した（上
記の通シ）。二番目の抽出液をタイプ１９　Ｔｉ　　ロ
ーターで３］、０ＯＯＧ（１’４．５０Ｏｒｐｍ）で４
５分間遠心分離した。二つの抽出上澄み液を合わせ、タ
イプ１９Ｔｉ　　ローターで３１，０ＯＯＧで６０分間
再遠心分離した。
超遠心分離 プールした上澄み液を各４００ｍｊのバッチとして１０
０，０ＯＯＧ（４５Ｔｉ　　ローターで４０、００Ｏｒ
ｐｍ　）で２時間遠心分離した。血清型２の蛋白質を含
有する１’ＯＯ，０ＯＯＧ沈殿物を上記の０．５％ＤＯ
Ｃ緩衝液４００ゴに懸？ｉ　サせ（ダウンス小モジナイ
ザーを用いる）ることによって２回洗浄し、５６℃で１
５分間加熱しそして上記の通り１００，０ＯＯＧで２時
間再遠心分離した。
上記の１００，０ＯＯＧ　　沈殿物をダウンスホモジナ
イザーを用いて発熱物質のない蒸留水１０５ゴに再懸濁
させた。懸濁液をＪＡ−２０日−ターを用いるベックマ
ンＪ−２１Ｃ遠心機４℃で１５分間１２，０ＯＯＧ（１
０，００Ｏｒｐｍ）で遠心分離した。沈殿物（強く凝集
した血清型蛋白質を含有する）を捨て血清型２の蛋白質
を含有する上澄み液（１０２ｍ）をチメロサル（エチル
マーキュリチオサリチル酸ナトリウム）で１／２０，０
００にし、４℃で貯蔵した。表２−１および２−２のデ
ータを得た。
表　　２−１ 髄膜炎菌Ｂ血清グループ２蛋白質 （ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａ］　Ｂ　ｓｅｒｏｇｒｏｕ
ｐ　２ｐｒｏｔｅｉｎ）溶液の化学分析データ蛋白質 ローリ−５，４■／− ＵＶ　　　　　　　　　３．８ｍｇ／ｄ吸着２８０ｎｍ
／２６０ｎｍ　　　１．０１核酸” ＵＶ　　　　　　　　　　　　　２．０％（重量／重量
）バイアル　　　　　　　　２．１％（重量／重量）ジ
フェニルアミン　　　０．１％（重！／重ｉ１中性糖＊
０．９％（重量／重量） シアル酸＊２．４％（重量／重量） 分子量 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　　　　　４１．ｏｏ。
＊溶液中ローリー蛋白質の条として計算表１−１に記載
した試験方法のほかに、次の操作を使用した。
１、核酸−蛋白質濃度の百分率として計算した２、１％
ＲＮＡに対応する発色をオルシン反応（バイアル）で観
察した。ＤＮＡに対するジフェニルアミン試験はバルク
溶液中の蛋白質百分率として計算した０、　１％ＤＮＡ
を示した。
２、　中性糖−蛋白質の百分率として計算した中性糖含
有量はアントローン比色試験を用いて得た。（スコツト
およびメルビン （５ｃｏｔｔ　ａｎｄ　Ｍｅｌｖｉｎ　）　：　Ａｎａ
ｌ　Ｃｈｅｍ第２５巻、第１６５６頁（１９５３年）） ３、　シアル酸−シアル酸含有量はレゾノしシノール−
Ｈα法を用いて得た（スベンナーホルム（Ｓｖｅｎｎｅ
ｒｈｏｌｍ　）　：　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ａｃｔａ第２４巻、第６０４頁（１９５７年））。
４、分子量−８ＤＳポリアクリルアミドゲル憶気泳動（
Ｎａｔｕｒｅ第２２７巻、第６８０頁（１９７０年）、
ＬＫＢアプリケーションノート３０６）によって定量し
たメルカプトエタノール変性蛋白質の分子量。
表　　２−２ 発熱物質試験 Ｎ、メニンギチジスＢ型血清型２蛋白質０．０２５（蛋
白質）０，２．０．０．０．１＊投与量１．Ｏｄ さらに全髄膜炎菌Ｂ型および髄膜炎菌Ｂ型蛋白質の両方
に対して調製したバルク蛋白質（５２５ｒ／ｙｄ）およ
び抗血清を用いて行なうリングテスト（実験免疫化学、
（１９６７年）、ｃ、　ｃ、　トーマス、スプリングフ
ィールド、イリノイ州）によって蛋白質を同定した。室
温で一晩培養した後両方の抗血清製剤に大きな沈殿が見
られた。
実施例３ Ｈ，インフルエンゼロ型結合体ワクチンの調！ １、実施例１の多糖類２５０■を蒸留水５〇−に溶解し
、氷で４℃に冷却した。多糖類溶液を反応中水上に維持
した。
２、　　臭化シアン←ホ讐’（ＣＮＢｒ、イーストマン
コダック社）を蒸留水中１００　ｙｎｙ／ｍｌ　で調製
した。
３、　ねじぶた付き１２５ｍ１ビトロビン中６−アミノ
カプロン酸１．２５　ｇを０．５　Ｍホウ酸塩緩衝液１
２．５葱（ｐ）１８．５）に溶解した。
ホウ酸塩緩衝液を次の通り調製した：蒸留水中ホウ酸（
シグマ）３０９５’をｌＮＮａＯＨで粉砕して最終容量
１０１００Ｏを得る。
４．６−アミノカプロン酸溶液をまた活性化反応中水上
に維持した。
５．４°　に目盛を定めたｐ）Ｉメーター２６（ラジオ
メーター）を用いて多糖類溶液のｐＨを０、１０　Ｎ　
ＮａＯＨで１０５に調製した。
６　次にＣＮＢｒ（７５０μｔ）７５ｍｇを多糖類溶液
に添加し、溶液のｐＨを０．１０　Ｎ　ＮａＯＨで直ち
に適邑に攪拌しながらｐＨ１０，５に維持し／と。
７　活性化を６分間続けた。活性化の終シに多糖類溶液
を手で混合しなから６−アミノカプロン酸溶液に移した
。
８、　混合液を緩かに攪拌しながら４°　で２０〜２４
時間培養した。管を遮光のためにアルミニウムホイルで
包んだ。
９、複合体を４°で一晩（２０〜２４時間）スペクトラ
ボア膜管、４５ｍ１分子量カットオフ１２，０００〜１
４，０００で蒸留水２０Ｌに対して蒸留水を１回交換し
て透析した。
１０　　次に多糖類スペーサー複合体を凍結乾燥して４
°に貯蔵した。
調製 実施例２の血清型蛋白質をＨ２０中濃度５．７ｍｙ／ｍ
ｌ　に調製した。蛋白質を使用前に蒸留水で５ｍｇ／ゴ
に希釈した。
結合体の調製 １、凍結乾燥した多糖類−スペーサー複合体を蛋白質溶
液４０　ｍ　（２００７ｆｆｇ）に溶解した。
２、　混合液のｐＨをｏ、ｏＩＮＨαで５．１〜５，０
に調製した。
３．１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
−カルボジイミドハイドロクロライト（ＥＤＣ、シグマ
）を蒸留水で１００■／ｍｌに調製した。
４、　　Ｅ　Ｄ　Ｃ２００ｍ９　（２，ＯＯｄ　）を多
糖類−蛋白質溶液に添加した。
５、溶液のｐＨをｐＨスタットモード（ラジオメーター
、ラニンインスツルメント社ンのＥＴＳ８２２終点滴定
系を用いて滴定しｐＨを４．７５とした。滴定はＥＤＣ
添加添加量始した。
６、反応をｐＨ４，７５で１２０分間続けた。
７、　この時間の終りに、溶液のｐＨを０．２５ＮＮａ
ＯＨで７．０にして反応を停止した。
結合体の精製 １、　カップリング反応からの結合体をソノし）（−ル
ＲＣ２Ｂ遠心機のツルバールＳ　Ｓ　−３４０−ターで
４℃で５分間１’２，０００Ｘ、９（１０，０００ｒｐ
ｍ）で遠心分離した。
２、　上澄み液を注意して除去し、Ｑ、　２　Ｍ酢酸ア
ンモニウム緩衝液（１％チメロサル、１：２００を有す
る２Ｍ酢酸アンモニウム１５４、．２．！？／Ｌ　ｍ留
水、シグマケミカル社の１０Ｘ保存溶液から希釈して生
成した）で平衡にし、溶出したセファロースＣＬ−４，
Ｂカラム（５Ｘ　１００　ｃｍ　Ｊ上に加えた。カラム
を室温で流量４０ｄ／時間で操作した。
フラクションをＬＫＢユニコード■およびＬ　Ｋ　Ｂ　
６５２０７３記録計を備えたＬＫＢ７０００ウルトロラ
ック（Ｕ］ｔｒｏｒａｃ）で集めた。フラクションを波
長２６０　ｎｍ　で監視して結合体中９蛋白質を追跡し
た。
３、　カラムの末端で１００μｔのアミノコートを１つ
おきのフラクションから取り、ノ〜イアル反応によって
多糖類を分析した。ノ１イアル反応に基づいて２つのピ
ークを得た。
ボイドボリュームでの最初のピークは結合体を含有し、
第二のピークは未反応の遊離多糖類を含有した。
４、　結合体を含有するフラクションをプールし、プー
ルした結合体を多糖類および蛋白質含有量に対して分析
した。
５、多糖類２５０　ｍ’ｉおよび蛋白質２００　ＭＥ／
で二つの結合操作を行なった。結合体１および２を１：
’２０，０００　　チメロサルの存在下生理食塩水１８
２に対して別々に生理食塩水１ｓｚを１回交換して透析
した。結果を以下に要約する。
；Ｌ１０１０／１９肩１９５μｇ鷹　１６３ｍＪ　Ｏ，
１９１３チ２８４０μｇ／ｙｄ、　１６４ｄ／ｄ　２０
０彪０．１８　１３％６、結合体１および２をプールし
、チメロサル１　：２０，０００の存在下生理食塩水に
対して透析した。プールした結合体の最終化学分析を以
下に示す。
９５０μＬ勺１７５μＬ勺３６７ｄ　０．１８　３４９
〜６４〜最終結合体生成物 プールした結合体ワクチンを０．００５％チメロサルを
含有する生理食塩水で１：３に（食塩水’ｊ３０ｍＡ中
結合体３６５ｄｌ希釈し、回転振盪機で２０分間攪拌し
た。無菌バイアルを調製し、４℃で貯蔵した。表３−１
および３−２のデータを得た。
表　　３−１ 多糖類−蛋白質結合体化学分析データ ｐＨ７，６ ネフエロス　・歌り単位５２０ １、　ネフエロス（ｎｅｐｈｅｌｏｓ）−最終ワクチン
容器のネフエロスを散乱モート（Ｍ１１ゲイン）とした
ベックマンＩＣＳアナライザー■を用いることによって
定量した。器械をベックマン散乱基準溶液Ｎ［Ｌ　５９
３０で標準化した。
表　　３−２ 多糖類−蛋白質結合体発熱物質試験 ０．０２５（結合体）０．３．０．０．０．５＊投与　
ｌ− 免疫応答の程度および誘発された抗体の種類は蛋白質担
体で変化する。これの証明として、結合体ワクチン（使
用したＮ、メニンギチジスＢ型蛋白質が実施例２の血清
型外膜蛋白質以外の表面蛋白質であるほかは実質的に実
施例３でのように調製した）を実施例３で調製したワク
チンと比較した。血清型外膜蛋白質からの結合体ワクチ
ンは非常に優れた応答を示す。詳細には血清型外膜蛋白
質結合体は主としてＩｇＧ抗体を産出するが、他の結合
体は主としてＩｇＭ抗体を生産する。
実施例４ Ｈ，インフルエンゼロ多糖類−６−アミツカ異なるロツ
、トのＨｉｂ　ＰＳ　　で実施例３と実質的に同じ操作
を行ない、多糖類−スペーサー複合体を調製し、凍結乾
燥して４℃で貯蔵した。
多糖類カップリングのだめの蛋白質の調製精製した非血
清型蛋白質２５　ＯＲ＜　５０ｍＡ＋をスペクトラポア
膜管（４５ｍ分子量カットオフ１２，０００〜１４．’
０００）を用いて蒸留水２０Ａに対して４℃で２０時間
蒸留水を１回交換して透析した。、使用する前に蒸留水
のｐｌＪをＩ　Ｎ　ＮａＯＨで７４に調整した。
結合体の調製 １、　凍結乾燥多糖類−スペーサー複合体を蛋白質溶液
５０ｄに溶解した。
２、　混合液のｐＨを０．０ＩＮＨ（ｆｆｌで５．１〜
５．０に調整した。
３、　１−エチル−３−（３−シメチルアミノプロピル
ンーカノしポジイミドハイドロクロライト（ＥＤ（、ジ
グマンを蒸留水で２５０■／ｒｎｌに調製した。
４、　　ＥＤＣ７５０’■（３，００ｍ）を多糖類−蛋
白質溶液に３つのアリコートとして１゜分離して添加し
た。
５　溶液のｐｆ（を、ＥＤＣの添加時に開始されるｐＨ
スタットモードとしたＥＴＳ８２２終点滴定系（ラジオ
メーター、ラニンインスツルメント：’７Ｃ，）を用い
て４．７５に一定に滴定した。
６、反応ヲ［）Ｈ４，７５テ２０〜２５分間続けた。
７　この時間の終りに、溶液のｐＨを０．２５ＮＮａＯ
Ｈで７．０にし、反応を停止した。
結合体の精製 １．　カップリング反応からの結合体を４℃においてツ
ルパルＲＣ２Ｂ遠心機のツルパルＳ　Ｓ　−３４０−タ
ーで５分間１２，０ＯＯＸ、９（１０，０００ｒｐｍ）
で遠心分離した。
２、上澄み液を注意して除去し、０．２Ｍ酢酸アンモニ
ウム緩衝液（２Ｍ酢酸アンモニウム１５４．２．！ｉ’
／Ｌ　　蒸留水、シグマケミカル社のＩＯＸ保存溶液を
１％チメロサル、 １：２００で希釈して調製した）で平衡され溶出された
セファロースＣＬ−４Ｂカラム（５Ｘ１００ｃｍ）に装
填した。カラムを室温で流速４ｏｍｚ／時間で操作した
。フラクションをＬＫＢユニコード■おＪ：　ヒＬＫＢ
６５２０−３記録計を備えたＬＫＢ７０００ウルトロラ
ックで集めた。各フラクションを監視し結合体中の蛋白
質を追跡した。
３、　カラムの末端下、１つおきのフラクションから１
００μｔ　部を取シ、バイアル反応によって多糖類を測
定した。バイアル反応に基づいて二つのピークを得た。
ボイドボリュームでの最初のピークは結合体を含有し、
二番目のピークは未反応の遊離多糖類を含有した。
４、結合体を含有したフラクションを集め、この集めら
れた結合体について多糖類および蛋白質含有量の測定を
行った。
５、二つの結合体ロフトを上記の操作に従って調製し、
これを合わせて１　：２０．０００チメロサルの存在下
０．８５％食塩水１５ｔに対して３６時間０．８５％食
塩水を２回交換して透析した。この結合体は使用するま
で４°で貯蔵した。集められた結合体の最後の化学分析
を以下に示す。
９４０μｔ勺１６６μＩＩ淘２９５ゴ　０，１８　２７
７■　４９〜表４−１のデータを得た。
表　　４−１ 発熱物質試験 Ｈ４ｂＰＳ−非血清型蛋白質結合体 ０．２５（結合体）０．０．０．０．０）１＊投与１．
　Ｏｒｎｅ 集めた結合体ワクチンを０．００５％チメロサルを含有
する生理食塩水で１：３（食塩水５８０蔵と結合体２９
０ｍ１）に希釈し、マグネチックベースで１０分間攪拌
した。
無菌バイアルに充填し、４℃で貯蔵した。
表４−２のデータを得た。
表　　４−２ 多糖類−非血清型蛋白質結合体 北洋分析データ リポース　　　１５．７　ｍｃｆｉ／ｍｌ（バイアル）
　　　（多糖類５５．３ｍＣｇ汐に対応）蛋白質　　　
　３１３　ｍｅ、９７ｍｇ（ローリ−） ｐＨ７，８ ネフエロス　　散乱単位５６８ 実施例５ ＨｉＢ　ｐＳ／蛋臼質結合体に対する免疫グロブＲｉｂ
　ＰＳ／蛋白質結合体をマウスの抗体応答を誘発するた
めに使用した。驚くべきことに実質的に実施例３のよう
に調製した血清型外膜蛋白質から調製した結合体は実施
例４のように調製した非血清型蛋白質からの結合体に比
較して異なったクラスの抗体を産生じた。詳細には、本
発明の結合体は主にＩｇＧを生産するが、実施例４がら
の結合体は主としてＩｇＭを生産する表５−１のデータ
を得た。
アメリカ合衆国１９４５４ペンジノｊ ヴアニア・ノース・ウエールン ・オールド・チャーチ・ロート ０６

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、Ｈ，インフルエンゼＢ型多糖類およびＴ細胞刺激性
    Ｎ、メニンギチジス血清型外膜蛋白質を包含し、該多糖
    類および蛋白質が６−アミノカプロン酸を介して結合し
    ていることを特徴とする多糖類／蛋白質結合体２、蛋白
    質がＮ、メニンギチジスＢ型血清型外膜蛋白質である特
    許請求の範囲第１項記載の結合体。 ３、ａ）アルカリ性ｐＨにおいてＨ，インフルエンゼＢ
    型多糖類をＣＮＢｒ　　で活性化し、ｂ）段階（ａ）の
    活性化Ｈ，インフルエンゼＢ型多糖類を６−アミノカプ
    ロン酸と反応させて複合体を生成する ことを特徴とする方法。 ４、さらに Ｃ）段階（ｂ）の複合体を緩かな酸性条件下でＮ、メニ
    ンギチジス血清型外膜蛋白質と混合し、 そして ｄ）それに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
    ピル）−カルボジイミドハイドロクロライトを添加する ことを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、特許請求の範囲第１項記載の多糖類／蛋白質結合体
    を有する注射可能な形態。 ６、さらに医薬的に使用し得る担体および補助薬を包含
    している特許請求の範囲第５項記載の注射可能な形態。 ７、結合体２〜５０μｇ　を包含している特許請求の範
    囲第５項記載の注射可能な形態。 ８、％許請求の範囲第１項記載の多糖類／蛋白質結合体
    を有する注射可能な形態の有効量を哺乳類に投与するこ
    とを特徴とする哺乳類の治療方法。 ９、　治療される哺乳類がヒトの新生児であれ、有効量
    が結合体１０μＩ　である特許請求の範囲第８項記載の
    方法。
JP59014537A 1983-01-31 1984-01-31 結合ｈ．インフルエンゼｂ型ワクチン Pending JPS59141523A (ja)

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