CN102724988B - 脑膜炎球菌fHBP多肽的表达 - Google Patents

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Abstract

在天然情况下，脑膜炎球菌fhbp基因(编码H因子结合蛋白)在两种差异调控的启动子控制下，由两种独立转录物表达。在一个转录物中，它与相邻上游基因由Pnmb1869启动子共同表达。另一转录物是单顺反子，由其自身专用启动子Pfhbp表达，该表达由全局调控蛋白FNR应氧气限制条件而激活。为了提高单顺反子转录物的表达，采用组成型活性FNR突变体。因此可激活Pfhbp启动子，导致FNR-激活基因如fhbp的过度表达。

Description

脑膜炎球菌fHBP多肽的表达
本申请要求2009年9月30日提交的美国临时申请61/247,428的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
技术领域
本发明涉及蛋白质表达领域，具体涉及奈瑟球菌H因子结合蛋白(fHBP)的表达。
背景技术
脑膜炎奈瑟球菌是革兰阴性的有荚膜细菌病原体。在开发对抗血清组B脑膜炎球菌的广谱疫苗中一种感兴趣的抗原是fHBP，也称为蛋白质‘741’[1]、‘NMB1870’、‘GNA1870’[2-4]、‘P2086’、‘LP2086’或‘ORF2086’[5-7]。这种脂蛋白在所有脑膜炎球菌血清组中表达，并在多种菌株中发现。已将fHBP序列分为三个家族[2](在本文中称为家族I、II和III)，又给定家族产生的血清对同一家族产生杀细菌活性，但对表达其它家族之一的菌株无活性，即存在家族内、而非家族间交叉保护。
对于疫苗接种目的，fHBP蛋白已用作大肠杆菌(E.coli)中表达的重组蛋白[8]或已经在脑膜炎球菌中过度表达，以至于从过度表达菌株中纯化的外膜囊泡将展示大量免疫原性fHBP[9]。然后，这些囊泡可用于疫苗，以提供强大的保护性抗-fHBP应答。
本发明的一个目的是提供提高脑膜炎球菌中fHBP表达的额外的改良方法。
发明内容
本发明人发现，fhbp基因由两种差异调控的启动子从两种独立转录物表达。在一个转录物中，它与相邻上游基因(nmb1869)由Pnmb1869启动子共同表达。另一转录物是单顺反子，并由其自身专用启动子Pfhbp表达，它由全局调控蛋白FNR(已知的厌氧激活物蛋白质、延胡索酸和硝酸还原酶调节物)因氧限制条件而激活。为了提高单顺反子转录物的表达，采用FNR的突变形式。该突变形式是组成型活化的，甚至在有氧条件下也是如此，因此内源性Pfhbp启动子组成型激活，导致fHBP过度表达。可采用相同方法过度表达任何其它具有FNR激活的启动子的脑膜炎球菌基因，包括经工程改造处于这种启动子控制下的基因。
因此，本发明提供一种脑膜炎球菌，其(a)具有其转录处于FNR激活的启动子控制下的基因，和(b)表达FNR的组成型活性形式。FNR的表达导致FNR活化基因的组成型表达。转录处于FNR激活的启动子控制下的基因最好是fhbp基因。虽然不是必需，但脑膜炎球菌最好不表达FNR的非组成型活性形式。
本发明也提供一种制备脑膜炎球菌突变体的方法，该方法包括修饰其内源性fnr基因的步骤，以使编码的FNR蛋白组成型活化。
本发明也提供一种制备脑膜炎球菌突变体的方法，该方法包括引入编码FNR的组成型活性形式的基因的步骤。该方法也可包括修饰脑膜炎球菌中任何内源性fnr基因的步骤以抑制或防止其表达。
因此，本发明还提供一种提高转录物表达的方法，该转录物在脑膜炎球菌中的转录受FNR激活的启动子控制，该方法包括为脑膜炎球菌提供FNR的组成型活性形式。然后，转录物表达增加可提高脑膜炎球菌中编码蛋白的水平。
因此，本发明还提供一种在脑膜炎球菌中提高转录物表达的方法，该转录物含有其表达受至少两个不同启动子控制的基因，这两个启动子中一个是FNR激活的启动子，另一个不是，所述方法包括向所述脑膜炎球菌提供FNR的组成型活性形式，从而提高该转录物的表达。在包含该基因的多种转录物中，相对于不同启动子驱动的转录物，FNR活化启动子驱动的转录物增加。
本发明还提供一种制备脂蛋白体脑膜炎球菌囊泡的方法，该方法包括处理本发明脑膜炎球菌的步骤，以破坏其外膜，从而由其形成包含外膜的蛋白质组分(如fHBP)的囊泡。所述囊泡可用作免疫原性组合物中的免疫原性组分(例如，作为对抗脑膜炎球菌的疫苗)。该方法可包括从任何活的和/或完整的细菌分离囊泡的又一步骤，例如，通过大小分离(如过滤，使用允许囊泡通过但不允许完整细菌通过的滤器)，或通过离心以使细胞相对于囊泡优先沉淀(例如低速离心)。
本发明还提供一种制备免疫原性组合物(如疫苗)的方法，该方法包括将由上述囊泡制备方法制备的囊泡与药学上可接受的运载体(如缓冲液)和/或免疫佐剂和/或一种或多种其它免疫原性组分配制在一起的步骤。
本发明还提供表达FNR的组成型活性形式的脑膜炎球菌。
本发明还提供脑膜炎球菌FNR的组成型活性形式，此外还提供编码这一FNR的核酸。
特别有用的FNR的组成型活性形式包含SEQ ID NO：5，与野生型FNR序列(来自菌株MC58的SEQ ID NO：4)相比该序列在Asp-148上有突变，如D148A，其中野生型Asp 148被Ala代替。
与现有策略相比，本发明提供在脑膜炎球菌中过度表达外膜蛋白(如fHBP)的优势。虽然已提示通过异源启动子驱动表达以过度表达蛋白质，但这些策略只有在异源启动子的基础活性高于内源性启动子时才导致过度表达。本文所述的策略通过增加或提高FNR活化基因的内源表达直接作用，在无需启动子修饰的条件下实现过度表达。
脑膜炎球菌
本发明提供各种脑膜炎球菌，其表达组成型活性FNR。因此，与正常的野生型菌株不同，FNR活化基因可高水平表达，即使在不限制氧水平时。这类基因包括fhbp基因，因此本发明脑膜炎球菌可在其外膜中过度表达fHBP蛋白。
本发明的脑膜炎球菌可由野生型菌株通过定点诱变制备，或者通过随机诱变后筛选所需修饰制备，或者通过敲除和敲入技术制备。例如，可利用定位诱变技术修饰编码内源性FNR的基因，以引入提供组成型活性的突变。在其它实施方式中，可敲除内源性fnr基因(例如，通过缺失或用标记物替换)，并可引入新的fnr基因(例如位于与缺失相同的位点上、整合到染色体上但位于不同于缺失的位点上，或在质粒上)。在其它实施方式中，引入新的fnr基因而保持内源性fnr基因。实现这些和相似目标的各种方式是显而易见的。基因NMB1428和NMB1429之间的整合是方便的。
与正常野生型菌株相比，本发明脑膜炎球菌表达组成型活性FNR。除此种修饰之外，脑膜炎球菌与野生型菌株相比还可具有至少一种其它修饰，例如通过遗传操作引入的修饰[10-13]。例如，可修饰脑膜炎球菌以提高免疫原性(例如，以高表达免疫原，包括FNR未激活的免疫原)，以降低毒性、抑制荚膜多糖合成、下调PorA表达等。
本发明脑膜炎球菌可具有修饰的fur基因[14]。参考文献21教导，应当通过伴随的porA和cps的敲除上调nspA的表达，可以使用这些修饰。脑膜炎球菌可表达多种不同的PorA亚型[15]。本发明脑膜炎球菌可具有低内毒素水平，例如通过敲除参与LPS生物合成的酶实现[16，17]。这些或其它突变体均可以与本发明一起使用。
本发明脑膜炎球菌可表达一种以上PorA亚型。之前已构建出6价和9价PorA菌株。菌株可表达2、3、4、5、6、7、8或9种PorA亚型：P1.7，16；P1.5-1，2-2；P1.19，15-1；P1.5-2，10；P1.12-1.13；P1.7-2，4；P1.22，14；P1.7-1，1和/或P1.18-1，3，6。在其它实施方式中，可以下调菌株中PorA的表达，例如，PorA的量相对于野生型水平(例如相对于H44/76菌株)减少了至少20％(例如，≥30％、≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％、≥95％等)，或甚至被敲除。
本发明脑膜炎球菌可以高表达(相对于相应的野生型菌株)某些蛋白质。例如，菌株可以高表达NspA、蛋白287[18]、TbpA和/或TbpB[19]，铜、锌超氧化物歧化酶[19]、HmbR等。
在一些实施方式中，脑膜炎球菌可以包括一个或多个参考文献20-23描述的敲除和/或高表达突变。下调和/或敲除的优选基因包括：(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[20]；(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[21]；(c)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[22]；和(d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB和/或SynC[23]。
可敲除本发明脑膜炎球菌中的MltA(NMB0033)[24]，这会提高该菌株在正常生长过程中释放的囊泡。这种“高出泡”菌株是免疫原性囊泡，例如含有高水平外膜蛋白的囊泡的有用来源，所述外膜蛋白来自过度表达的FNR-活化基因如fhbp。
在一些实施方式中，本发明脑膜炎球菌可具有以下特征中的一种或多种或全部：(i)LgtB和/或GalE下调或敲除，以截短脑膜炎球菌LOS；(ii)TbpA上调；(iii)NhhA上调；(iv)Omp85上调；(v)LbpA上调；(vi)NspA上调；(vii)PorA敲除；(viii)FrpB下调或敲除；(ix)Opa下调或敲除；(x)Opc下调或敲除；(xii)cps基因复合体缺失。截短的LOS可以不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如，其可以为半乳糖缺陷型LOS。所述LOS可以没有α链。
脑膜炎球菌可包含导致脂质A的毒性活性降低或检测不到的遗传修饰，特别是在它们用于制备脂蛋白体囊泡时。已知用于降低毒性脂质A活性的各种修饰。例如，脑膜炎球菌中可能敲除了lpxL1和/或lpxL2基因，例如得到四-或五-酰基化的脂质A。脂质A 4′-激酶基因(lpxK)中的突变也降低了脂质A的毒性活性。优选LpxL1敲除菌株，特别是当fHBP表达上调时[25]。
也可通过将突变引入参与多粘菌素B抗性的基因/基因座如pmrE和/或pmrF，改变LPS毒性活性。PhoP-PhoQ调节系统(磷酸-接替双组分调节系统)中的突变也可产生刺激E选择素表达和TNF分泌的能力降低的修饰脂质A。
脑膜炎球菌可含有一种以上fhbp基因。例如，它们可包括fHBP家族I、II和III中的一个以上家族的fhbp基因。例如，参考文献26公开了表达内源家族I和异源家族II变体的内毒素减毒的突变菌株。由这一菌株制备的囊泡提供更广的抗-fHBP抗体应答谱。各fhbp基因可受其自身的FNR活化启动子调控，但也可能在多顺反子转录物(单一FNR调节子)中包括各fhbp基因。
可修饰本发明脑膜炎球菌，以破坏Pnmb1869启动子的转录终止。
本发明脑膜炎球菌可以属于任何血清组，例如A、B、C、W135、Y。它们通常是血清组B菌株。该菌株可以是任何血清型(如1、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亚型和任何免疫型(如L1；L2；L3；L3，3，7；L10；等)。脑膜炎球菌可以来自任何适当谱系，包括高侵袭性与超毒力谱系，如以下7种超毒力谱系中任一种：亚组I、亚组III、亚组IV-1、ET 5复合物、ET-37复合物、A4簇、谱系3。
组成型活性FNR
FNR是全局厌氧调节物，其在厌氧条件下的活性需要[4Fe-4S]簇。在有氧和无氧生长过程中合成FNR多肽，但在有氧培养中相关铁-硫中心降解，半衰期约为2分钟。在厌氧生长过程中[4Fe-4S]铁-硫中心的组件促进二聚化，这是FNR结合FNR依赖性启动子上的反向重复靶序列的先决条件。
本发明脑膜炎球菌表达组成型活性FNR。已知可修饰来自大肠杆菌的FNR，以使其[4Fe-4S]簇对O2稳定，从而产生组成型活性蛋白，即它激活FNR依赖性基因的转录，即使在不限制氧气时。大肠杆菌序列中合适的突变包括[27]Asp-22(如D22G)、Leu-28(如L28H)、His-93(如H93R)、Glu-150(如E150K)和/或Asp 148(如D148A、D148G、D148V)上的修饰。突变可具有各种潜在功能效果，例如，防止改变cAMP与FNR的结合、防止[4Fe-4S]簇的氧化、促进FNR二聚化等。公开文献已对淋球菌FNR(如参考文献28确认淋球菌残基22和148上的L28H和D148A突变体即使在O2存在下也有活性)作出类似修饰，其中的实施例显示可以相似方式修饰脑膜炎球菌FNR。实施例中示出了大肠杆菌和脑膜炎球菌FNR氨基酸序列(SEQ ID NO：4和6)的比对，以帮助选择脑膜炎球菌FNR的其它有效突变。
本发明的组成型活性脑膜炎球菌FNR可驱动FNR活化的脑膜炎球菌基因以氧气依赖方式表达。优选的组成型活性FNR也对氮氧化物灭活作用(可使野生型蛋白的[4Fe-4S]簇亚硝化)有抗性。
制备野生型脑膜炎球菌FNR蛋白的突变形式(如SEQ ID NO：4的突变体)的方法是本领域众所周知的，例如定位诱变或易错PCR。因此，可修饰脑膜炎球菌中表达O2依赖性FNR的内源性fnr基因，造成编码的FNR蛋白反而组成型激活。
本发明脑膜炎球菌表达组成型活性FNR时，优选(但不一定)不表达FNR的非组成型活性形式。因此，所述组成型活性FNR可能是脑膜炎球菌表达的唯一FNR。这可通过以下方式实现：修饰内源fnr基因，或者作为替代方式，灭活内源fnr基因并引入编码组成型活性蛋白的修饰的fnr基因，或者将fnr基因引入FNR空菌株“MC-fnrKO”(参考文献29中公开)。
本发明还提供组成型活性脑膜炎球菌FNR。与野生型FNR序列(来自菌株MC58的SEQ ID NO：4)相比，这可以在残基Leu-22(如L22H)、Glu-144(如E144K)和/或Asp-148(如D148A、D148G、D148V)中的一个或多个上产生突变。例如，本发明的组成型活性脑膜炎球菌FNR可包含SEQ ID NO：5，其中野生型Asp 148被Ala取代(即对应于大肠杆菌D148A突变体的脑膜炎球菌突变)。
本发明还提供可驱动从脑膜炎球菌FNR活化启动子表达的转录因子，其中所述因子包含与SEQ ID NO：4具有至少x％序列相同性的氨基酸序列，条件是氨基酸序列的残基148(根据SEQ ID NO：4编号)不是Asp(例如是Ala、Gly或Val)。
本发明还提供编码这些FNR蛋白的核酸。可以多种方式制备本发明中的核酸，例如，完全或部分化学合成(例如DNA的亚磷酰胺合成)、利用核酸酶(例如限制性酶)消化较长核酸、连接较短核酸或核苷酸(例如使用连接酶或聚合酶)、由基因组或cDNA文库制备等。
本发明核酸可采取各种形式，例如，单链、双链、载体、引物、探针、标记、未标记等。
本发明中的核酸优选地采取分离或基本分离的形式。
术语“核酸”包括DNA和RNA，还有其类似物，如含有修饰主链的类似物，以及肽核酸(PNA)等。
本发明所述核酸可以被标记，例如，使用放射性或荧光标记。
本发明还提供包含本发明核苷酸序列(如克隆或表达载体)的载体(如质粒)和用这种载体转化的宿主细胞。
FNR活化的基因和启动子
脑膜炎球菌中多种基因由FNR依赖性启动子转录。例如，参考文献29报道由微阵列实验鉴定的各种FNR依赖性基因和操纵子：175种基因的转录差异超过2倍。FNR活化基因包括但不限于：nmb1806、mapA、pgmβ、NMB0388、galM、nmb0363、nmb1805、nosR、nmb1677、aniA和fhbp。在具有组成型活性FNR的脑膜炎球菌中，即使在有氧条件下，也能增加任何这些基因(相对于野生型)的表达。
任何这些基因均可用作天然FNR活化启动子的来源，从而可联系于和驱动下游感兴趣基因的表达。本发明也可与修饰的FNR活化启动子一起使用。例如，实施例显示NM117菌株具有Pfhbp启动子，其具有无效-10启动子元件，不显示由组成型活性FNR过度表达。因此，可用于本发明的修饰的FNR活化启动子可具有作为δ70启动子共有序列的-10和/或-35六聚体(如SEQ ID NO：20是-10且SEQ ID NO：21是-35；或者SEQ ID NO：31是-10且SEQ ID NO：32是-35)，因此可对其进行修饰以使其序列更接近(或完全接近)该共有序列。相似地，用于本发明的修饰的FNR活化启动子可具有来自基因如脑膜炎球菌aniA的对FNR有高亲和力的FNR结合位点(FNR框)，例如SEQ ID NO：30，或者可具有使其序列更接近(或完全接近)FNR框共有序列SEQ ID NO：19的修饰的FNR结合位点。因此，通常来看，可构建存在FNR时有高度活性的启动子，如通过连接来自已知FNR活化启动子的启动子元件(-10、-35和FNR框)，包括野生型或优化元件。
虽然本发明脑膜炎球菌可具有组成型活性FNR，但在翻译后水平控制这种组成型活性。因此，为了最大程度提高组成型活性FNR的胞浆水平，应该在FNR积极转录和翻译的条件下培养脑膜炎球菌。
在本发明脑膜炎球菌中实现表达的FNR活化基因可以是内源性FNR活化启动子控制下的内源性基因(如内源性fhbp基因)，引入的FNR活化启动子控制下的内源性基因，内源性FNR活化启动子控制下的引入基因，或引入的FNR活化启动子控制下的引入基因。因此，本发明可用于过度表达内源性或外源性蛋白质(例如，作为参考文献10所述方法的替代方式)，例如将编码外膜蛋白的基因与FNR活化启动子连接，从而提高这些蛋白质在外膜中(因而在囊泡中)的水平。
本发明尤其可用于由FNR依赖性启动子表达外膜蛋白。所述蛋白质如fHBP可在外膜中过度表达(相对于野生型菌株)，并保留在由脑膜炎球菌制备的脂蛋白体囊泡中。所述外膜蛋白可以是囊泡中的免疫可及形式，即可结合本发明纯化多肽的抗体也可结合存在于囊泡中的所述多肽。转录在FNR激活的启动子控制下，因而可提高其表达的最优选的基因是编码H因子结合蛋白的fhbp。
H因子结合蛋白
全长fHBP具有氨基酸序列SEQ ID NO：1(菌株MC58)。成熟脂蛋白(N-末端半胱氨酸)缺少SEQ ID NO：1的前19个氨基酸，fHBP的人工ΔG形式缺少前26个氨基酸。MC58序列属于fHBP家族I。家族II和III的示范性序列是SEQ ID NO：2(家族II；菌株2996)和SEQ ID NO：3(家族III；菌株M1239)，在野生型脑膜炎球菌中，它们类似地在N末端半胱氨酸上脂化。
fhbp基因的启动子被FNR激活，因此本发明可用于在脑膜炎球菌中表达任何这些fHBP序列。更常见的是，本发明可用于表达编码包含以下序列的氨基酸序列的fhbp基因：SEQ ID NO：1、2或3之一；(a)与SEQ ID NO：1、2或3中任一序列有至少x％序列相同性的氨基酸序列，其中x值为65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或更高；和/或(b)SEQ ID NO：1，2或3中任一序列的至少n个氨基酸的片段，其中n值为7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更高。(b)的片段优选包含所述SEQ ID NO的表位。给予宿主动物时，fhbp基因编码的蛋白质最好有能力诱导杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体。关于杀细菌反应的其它信息在下文中给出。
fhbp基因和/或其编码的氨基酸序列可能是天然产生的序列或是人工序列。例如，已知制备人工fHBP序列，其掺入来自多种不同天然fHBP序列的特征，参见例如，参考文献30-33。也了解产生不同家族的fHBP序列的融合物，参见例如，参考文献33-36。本发明可用于任何这些人工fHBP序列。这些方法可用于提供可引发识别一个以上fHBP家族的抗体的fHBP蛋白。因此，给予宿主动物时，fhbp基因编码的蛋白质可有能力诱导杀细菌性抗脑膜炎球菌抗体，该抗体识别SEQ ID NO：1、2和/或3中两种或三种序列。
例如，fhbp基因可能编码下述任何氨基酸序列：参考文献8的SEQ ID NO：1-45中的各序列；参考文献8的SEQ ID NO：79、82、83、85、87、88、89和90；参考文献8的SEQ ID NO：123-142；参考文献5的SEQ ID NO：1-329内各氨基酸序列；参考文献37的SEQ ID NO：2、4、6、8、10或12；参考文献31的SEQ ID NO：43、44、52、53、62、63、64或65；参考文献32的SEQID NO：46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、58、59、60、63、64、65、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95；参考文献30的SEQ IDNO：4-80中的各序列；参考文献38的SEQ ID NO：4-78中的各序列；参考文献38的SEQ ID NO：103-138中的各序列。例如，fhbp基因可能编码包含本文所述SEQ ID NO：12、13和14(称为9C、10A和8B)中任一项的氨基酸序列。
脂蛋白体囊泡
本发明脑膜炎球菌尤其可用于制备保留来自细菌的外膜蛋白的脂蛋白体囊泡。例如，可通过使用组成型活性FNR过度表达fHBP来提供富含fHBP的囊泡。
这些脂蛋白体囊泡可通过外膜破坏或出泡、形成包含外膜蛋白组分的囊泡而获得。因此，该术语包括OMV、出泡、微囊泡(MV[39])和“天然OMV”(“NOMV”[40])。
出泡、MV和NOMV是天然产生的膜囊泡，在细菌生长时自发形成，释放到培养基中。MV可以通过以下方法获得：在肉汤培养基中培养奈瑟球菌，将全细胞与肉汤培养基中较小的MV分离(例如，通过过滤或低速离心，只沉淀细胞而不沉淀较小囊泡)，然后从细胞耗尽的培养基中收集MV(例如，通过过滤、差速离心或MV聚集，通过高速离心沉淀MV)。通常可根据培养基中产生的MV的量选择用于生产MV的菌株，例如文献41和42描述了具有高MV产量的奈瑟氏菌。高出泡菌株可参见参考文献43。破坏mltA基因[24]也可提供在培养期间自发释放合适囊泡的菌株。
从细菌人工制备OMV，可以利用去污剂处理(例如用脱氧胆酸盐)或通过非去污剂方式(例如参见参考文献44)进行制备。形成OMV的技术包括：用胆酸盐去污剂(例如，石胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、乌索胆酸等的盐，优选用脱氧胆酸钠[45和46]处理奈瑟球菌)在不会沉淀去污剂的充分高的pH下[47]处理细菌。其它技术基本可以在没有去污剂存在的情况下[44]利用如超声、均化、微流化、空化、渗透压休克、研磨、法式压制(French press)、混合等技术进行。不使用或使用低去污剂的方法可以保留有用的抗原，如NspA[44]。因此一种方法可以使用含有0.5％或更低如约0.2％、约0.1％、＜0.05％或0浓度的脱氧胆酸盐的OMV提取缓冲液。
参考文献48描述了一种制备OMV的有用过程，涉及对粗OMV进行超滤，代替高速离心。该过程可以涉及在超滤后进行超离心的步骤。
如果LOS存在于囊泡中，可以对囊泡进行处理，以将其LOS与蛋白质组分联系起来(“内泡”偶联[23])。
所述脂蛋白体囊泡可用作免疫原性组合物中的免疫原性组分。形成囊泡的方法可包括从任何活的和/或完整的细菌分离囊泡的又一步骤，例如，通过大小分离(如过滤，使用允许囊泡通过但不允许完整细菌通过的滤器)，或通过离心以使细胞相对于囊泡优先沉淀(例如低速离心)。
免疫原性组合物
本发明提供包含本发明脂蛋白体囊泡的免疫原性组合物。这些组合物可通过将所述囊泡与药学上可接受的运载体和/或免疫佐剂和/或一种或多种其它免疫原性组分配制在一起制备得到。
所述免疫原性组合物可包括药学上可接受的载体，其可以是本身不会诱导产生对接受所述组合物的患者有害的抗体的任何物质，且可以实现无异常毒性的给药。药学上可接受的载体可以包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物质也可以存在于该类载体中，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。关于合适载体的充分讨论见参考文献49。
奈瑟球菌感染会影响身体的各个部分，因此本发明中的组合物可以制备成各种形式。例如，可将所述组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂。也可制备适合在注射前溶解或悬浮于液体运载体的固体形式。可制备所述组合物用于局部给药，例如油膏、乳膏或粉剂。可将所述组合物制备为用于口服的制剂，例如，片剂、胶囊或糖浆(任选调味)。可将所述组合物制备为采用细粉或喷雾的用于肺部给药的制剂，例如吸入剂。可将所述组合物制备为栓剂或阴道栓。所述组合物可以制成鼻部、耳部或眼部给药制剂，例如滴剂。
该组合物优选无菌。其优选无热原。优选用缓冲液处理使其处于例如pH6-pH 8，通常为约pH 7。当组合物包含氢氧化铝盐时，有用的是包括组氨酸缓冲剂[50]。本发明中的组合物可以与人体等张。
免疫原性组合物包含免疫有效量的免疫原，以及任何其它所需的其它特定组分。“免疫有效量”指在一次剂量或一系列剂量的一部分中给予个体的对治疗或预防有效的量。该量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组(例如，非人的灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验测定的较宽范围内。
以前有关脑膜炎球菌囊泡疫苗的工作为本发明提供了药学、生理学和制剂方面的指南。例如，VA-MENGOC-BCTM是可注射悬液，其在0.5ml中包含吸附于2mg氢氧化铝凝胶的50μg菌株Cu-385-83的OMV和50μg血清组C荚膜多糖，再加0.01％硫柳汞和磷酸盐缓冲液。MeNZBTM也是0.5ml悬液，并含有吸附于1.65mg氢氧化铝佐剂的25μg菌株NZ98/254的OMV，以及组氨酸缓冲液和氯化钠。MenBvac类似于MeNZBTM，但由菌株44/76制备得到。各亚型的OMV浓度要足够高，以便在通过单一剂量方案或多剂量方案(例如，包括加强剂量)给予患者后提供保护性免疫。本发明组合物的OMV浓度通常为10至500μg/ml，优选为25至200μg/ml，更优选为约50μg/ml或约100μg/ml(用OMV中的总蛋白表示)。
所述组合物可与其它免疫调节剂联合给药。
可以用于本发明组合物的佐剂包括但不限于：
A.含矿物质的组合物
本发明中适合用作佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，如氢氧化物(例如羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等，[参见，例如参考文献54的第8章和第9章]，或不同矿物化合物的混合物，其中的化合物可采取任何合适形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，优选吸附。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒。
称为″氢氧化铝″的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。可采用红外(IR)光谱将式AlO(OH)代表的羟基氧化铝与其它铝化合物，如氢氧化铝Al(OH)3区别开，具体区别是1070cm-1处存在吸收条带和3090-3100cm-1处存在强肩[参考文献54的第9章]。半峰高处衍射带的宽度(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶程度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂通常呈纤维形态(例如，如电子透射显微图中所见)。氢氧化铝佐剂的pI通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH 7.4时氢氧化铝佐剂的吸附容量为1.8-2.6毫克蛋白质/毫克Al+++。
称为″磷酸铝″的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。羟基磷酸盐的PO4/Al摩尔比通常为0.3-1.2。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO4。例如，3164cm-1处的条带(例如在200℃下)表明存在结构性羟基[参考文献54的第9章]。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形的羟基磷酸铝，包含0.6mg Al3+/ml。磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微图上观察到的板状形态)。抗原吸附后颗粒直径一般是0.5-20μm(如约5-10μm)。据报道，pH 7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5毫克蛋白质/毫克Al+++。
磷酸铝的零电点(PZC)与磷酸对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度可能取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝更多酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选为5.0-6.5，例如约为5.7。
用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可以，但不一定含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)。该悬浮液优选无菌且无热原。悬浮液可含有游离的水性磷酸根离子，如存在浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM。该悬浮液也可含有氯化钠。
在一个实施方式中，佐剂组分包括氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝多于氢氧化铝，例如重量比为至少2∶1，例如，≥5∶1、≥6∶1、≥7∶1、≥8∶1、≥9∶1等。
给予患者的组合物中Al+++的浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。优选最大值是＜0.85mg/剂。
B.油乳剂
适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59[参考文献54的第10章；也参见参考文献51](5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)。也可以使用完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。
已知各种水包油乳剂，它们通常包括至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳剂中的油滴直径通常小于5μm，有利地乳液包含具有亚微米直径的油滴，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳剂。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。
本发明可使用的油诸如来自动物(如鱼)或植物的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的示例。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质制备甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯，其不是种籽油中天然产生。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程为本领域熟知。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和诸如鲸蜡的鲸油是可以用于本发明的几种鱼油的示例。通过生化途径用5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物，即2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯。其它优选油是生育酚(见下)。包含鲨烯的水包油乳液是特别优选的。可以使用油的混合物。
表面活性剂可以按其‘HLB’(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB为至少10，优选至少15，更优选至少16。可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAXTM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(总称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。如上所述，吐温80等去污剂可提供下文实施例所见的热稳定性。
可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的组合也适合。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。
优选的表面活性剂的含量(重量％)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特定是约0.1％；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通X100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特定是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特定是0.1-1％或约0.5％。
本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
●角鲨烯、吐温80(Tween 80)和司盘(Span)85的亚微米乳液。所述乳液的体积组成可以是约5％角鲨烯、约0.5％聚山梨酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例为4.3％鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.48％司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[51-53]，参考文献54的第10章和参考文献55的第12章更详细地描述了该佐剂。.MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。
●包含鲨烯、α-生育酚和聚山梨酯80的乳液。这些乳液可含有2-10％鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，鲨烯∶生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)，因为这能使乳液更稳定。鲨烯和吐温80的体积比可以约为5∶2，或者重量比约为11∶5。可通过将吐温80溶解于PBS产生2％溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，随后使该混合物微流体化来制备一种这类乳液。得到的乳液可含有如平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。
●鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。
●含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如α-生育酚琥珀酸盐)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75∶11∶10(如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。所述乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。
●鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401(“普流罗尼克TM L121”(″PluronicTMLI21″))的乳液。所述乳液可用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，且已与含苏氨酰基-MDP的“SAF-1”佐剂[56](0.05-1％Thr-MDP、5％鲨烷、2.5％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)一起使用。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用“AF”佐剂[57](5％鲨烷、1.25％普流罗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)。优选微流体化。
●含有鲨烯、水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[58]。该乳液也可含有以下一种或多种物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。这类乳液可冻干。
●含有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献59所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。
●不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献60所述)、二甲基双十八烷基溴化铵和/或N，N-双十八烷基-N，N-双(2-羟乙基)丙二胺。
●包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[61]。
●包含矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[61]。
●皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[62]。
通常在传递给病人时混合组合物中的抗原和佐剂。可以在生产时或在递送时将该乳液与抗原临时混合。因此，在包装或出售的疫苗中该佐剂和抗原可分开保存，使用时配制成最终制剂。所述抗原通常是水性形式，从而最终通过混合两种液体制备疫苗。所述两种液体的混合体积比可变(例如5∶1-1∶5)，但通常约为1∶1。
C.皂苷制剂[参考文献54的第22章]
皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的得自皂皮树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可商品化获自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophilla paniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标StimulonTM出售。
已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献63。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[64]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献54第23章，还参见参考文献65和66]。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[67]。
开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献68和69。
D.细菌或微生物衍生物
适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌的脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。
LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见参考文献70中所述。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以在过滤除菌时通过0.22μm膜[70]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC-529[71，72]。
脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A衍生物，如OM-174。例如，参考文献73和74中描述了OM-174。
适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文结构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。
CpG可以包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链。参考文献75、76和77公开了可能的类似物取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献78-83中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。
CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[84]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞应答，如CpG-B ODN。参考文献85-87中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选CpG为CpG-A ODN。
CpG寡核苷酸优选构建成5’末端可被受体识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献88-90。
基于免疫刺激性寡核苷酸的特别有用的佐剂被称为IC-31TM[91-93]。因此，本发明使用的佐剂可以包含(i)和(ii)的混合物：(i)含有至少一个(优选多个)CpI基序(即胞嘧啶与肌苷相连形成二核苷酸)的寡核苷酸(例如15-40个核苷酸)，和(ii)聚阳离子聚合物，如含有至少一个(优选多个)Lys-Arg-Lys三肽序列的寡肽(如5-20个氨基酸)。所述寡核苷酸可以是包含26-聚体序列5′-(IC)13-3′(SEQ ID NO：7)的脱氧核苷酸。聚阳离子聚合物可以是含有11-聚体氨基酸序列KLKLLLLLKLK(SEQ ID NO：8)的肽。这种SEQ ID NO：7和8的组合提供IC-31TM佐剂。
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可以用作本发明的佐剂。优选所述蛋白衍生自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。参考文献94中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献95中描述了将其用作胃肠道外佐剂。所述毒素和类毒素优选全毒素形式，包含A和B亚单位。A亚单位优选含有脱毒突变；B亚单位优选不突变。所述佐剂优选脱毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。参考文献96-103中描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐剂。一种有用的CT突变体是CT-E29H[104]。优选根据参考文献105中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的排列对比对氨基酸取代基编号，该参考文献的全部内容特别纳入本文作为参考。
E.人免疫调节剂
适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[106]等)[107]、干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。优选的免疫调节剂是IL-12。
F.生物粘着剂和粘膜粘着剂
生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[108]或粘膜粘着剂如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[109]。
G.微粒
微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒(即直径为～100nm至～150μm，更优选直径～200nm至～30μm，最优选直径～500nm至～10μm的颗粒)由生物可降解的无毒材料(例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)形成，优选聚丙交酯乙交酯共聚物，并任选经处理而具有带负电表面(例如用SDS处理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。
H.脂质体(参考文献54第13和14章)。
适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献110-112所述。
I.咪唑并喹诺酮化合物。
适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，″瑞喹莫德3M″)，见参考文献113和114所述。
本发明也可包含以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，可将以下佐剂组合物用于本发明：(1)皂苷和水包油乳剂[115]；(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)[116]；(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任选+固醇)[117]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[118]；(6)SAF，含有10％鲨烯、0.4％吐温80TM、5％普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流体化成为亚微米乳液或涡旋振荡产生粒度较大的乳液。(7)RibiTM佐剂系统(RAS)(RI公司(RibiImmunochem))，含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；和(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。
用作免疫刺激剂的其它物质可参见参考文献54的第7章。
可用氢氧化铝佐剂，抗原一般吸附在该盐上。还优选具有包含鲨烯，具有亚微米油滴的水包油乳液是优选的，尤其是在年长者中。有用的佐剂组合包括Th1和Th2佐剂的组合，如CpG和铝盐，或雷西莫特和铝盐。可以使用磷酸铝和3dMPL的组合。
除囊泡外，免疫原性组合物可包含一种或多种其它免疫原性组分。这类组分包括但不限于：其它脑膜炎球菌抗原和/或非脑膜炎球菌抗原。
脑膜炎球菌抗原
除了包括上述囊泡外，本发明组合物还可包括一种或多种其它脑膜炎球菌抗原来提高菌株覆盖范围。因此，组合物可以包含多肽或糖，在给予哺乳动物时可以引发对脑膜炎球菌具有杀菌作用的抗体应答。
组合物可包含纯化的脑膜炎球菌抗原。下面给出有关脑膜炎球菌抗原的其它详情。例如，它可包括脑膜炎球菌抗原287、NadA、NspA、HmbR、NhhA、App、936、Omp85或额外fHBP。一种组合物(参见参考文献119和120)可包含以下的一种或多种：包含SEQ ID NO：9的多肽；包含SEQ ID NO：10的多肽；和/或包含SEQ ID NO：11的多肽(或包含SEQ ID NO：11的氨基酸24-350的多肽)。这些多肽优选在异源宿主中重组表达，然后纯化，以便(例如)与所述囊泡混合。组合物可包含脑膜炎球菌荚膜糖抗原，例如以偶联物形式。
本发明的组合物可包含287抗原。287抗原作为基因NMB2132包括在奈瑟球菌B血清组菌株MC58[121]的出版的基因组序列中(GenBank登录号GI：7227388；本文的SEQ ID NO：23)。之后已出版了来自许多菌株的287抗原序列。例如，287的等位基因形式如文献122的图5和15所示，以及例如文献123的实施例13和图21(其中的SEQ ID 3179到3184)。已报导了许多287抗原的免疫原性片段。本发明所用的优选287抗原包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：23具有50％或更高的相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：23的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7个或更多个(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多个)。(b)的优选片段包含来自SEQID NO：23的表位。本发明最有用的287抗原可在施给对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ ID NO：23组成的脑膜炎多肽结合。有利的用于本发明的287抗原可在施给对象后引发杀菌性抗奈瑟球菌抗体。
本发明的组合物可包含NadA抗体。NadA抗原作为基因NMB1994包括在奈瑟球菌B血清组菌株MC58[121]的出版的基因组序列中(GenBank登录号GI：7227256；本文的SEQ ID NO：24)。迄今已来自许多菌株的NadA抗原序列，已经详细公开了作为奈瑟氏菌粘附素的蛋白活性。已报导了许多NadA的免疫原性片段。本发明所用的优选Nad多肽包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQID NO：24具有50％或更高的相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：24的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7个或更多个(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多个)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：24的表位。本发明最有用的NadA抗原可在施给对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ ID NO：24组成的脑膜炎多肽结合。有利的用于本发明的NadA抗原可在施给对象后引发杀菌性抗奈瑟球菌抗体。一个这种片段是SEQ ID NO：11的氨基酸24-350。
本发明的组合物可包含NspA抗原。NspA抗原作为基因NMB0663包括在脑膜炎B血清组菌株MC58[121]的出版的基因组序列中(GenBank登录号GI：7225888；本文中的SEQ ID NO：25)。先前文献124和125提到该抗原。之后已出版了来自许多菌株的NspA抗原序列。已报导了许多NspA的免疫原性片段。本发明所用的优选NspA多肽包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQID NO：25具有50％或更高的相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：25的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7个或更多个(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多个)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：25的表位。本发明最有用的NspA抗原可在施给对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ ID NO：25组成的脑膜炎多肽结合。有利的用于本发明的NspA抗原可在施给对象后引发杀菌性抗奈瑟球菌抗体。
本发明的组合物可包含脑膜炎HmbR抗原。全长HmbR序列作为基因NMB1668包括在脑膜炎B血清组菌株MC58[121]的出版的基因组序列中(GenBank登录号GI：727246；本文的SEQ ID NO：26)。本发明可使用包含HmbR全长序列的多肽，但常用含有部分HmbR序列的多肽。因此在一些实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包含与SEQ ID NO：26具有i％序列相同性的氨基酸序列，其中i值为50、60、70、80、90、95、99或更高。在其它实施方式中，本发明的HmbR序列可包含SEQ ID NO：26的至少j个连续氨基酸的片段，其中j值为7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高。在其它实施方式中，根据本发明使用的HmbR序列可包含一氨基酸序列，(i)其与SEQ ID NO：26具有i％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：26中至少j个连续氨基酸的片段。优选j个氨基酸的片段包含来自SEQ ID NO：26的表位。这些表位通常包含位于HmbR表面上的氨基酸。有用的表位包括涉及HmbR与血凝素结合的氨基酸，因为与这些位点结合的抗体能够封闭细菌与宿主血凝素结合的能力。HmbR的拓扑学及其关键功能性残基如文献126所述。本发明最有用的HmbR抗原可在施给对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ ID NO：26组成的脑膜炎多肽结合。有利的用于本发明的HmbR抗原可在施给对象后引发杀菌性抗奈瑟球菌抗体。
本发明的组合物可包含NhhA抗体。NhhA抗原作为基因NMB0992包括在奈瑟球菌B血清组菌株MC58[121]的出版的基因组序列中(GenBank登录号GI：7226232；本文的SEQ ID NO：27)。自从例如文献122和127已出版了来自许多菌株的NhhA抗原序列，也已报导了许多NhhA的免疫原性片段。它也称为Hsf。本发明所用的优选NhhA抗原包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQID NO：27具有50％或更高的相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：27的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7个或更多个(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多个)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：27的表位。本发明最有用的NhhA抗原可在施给对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ ID NO：27组成的脑膜炎多肽结合。有利的用于本发明的NhhA抗原可在施给对象后引发杀菌性抗脑膜炎抗体。
本发明的组合物可包含App抗原。App抗原作为基因NMB1985包括在奈瑟球菌B血清组菌株MC58[121]的出版的基因组序列中(GenBank登录号GI：7227246；本文的SEQ ID NO：28)。之后已出版了来自许多菌株的App抗原序列。已报导了许多App的免疫原性片段。本发明所用的优选App多肽包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：28具有50％或更高的相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：28的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7个或更多个(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多个)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：28的表位。本发明最有用的App抗原可在施给对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ ID NO：28组成的脑膜炎多肽结合。有利的用于本发明的App抗原可在施给对象后引发杀菌性抗奈瑟球菌抗体。
本发明的组合物可包含Omp85抗原。Omp85抗原作为基因NMB0182包括在奈瑟球菌B血清组菌株MC58[121]的出版的基因组序列中(GenBank登录号GI：7225401；本文的SEQ ID NO：29)。之后已出版了来自许多菌株的Omp85抗原序列。Omp85的其它信息可见文献128和129。已报导了许多Omp85的免疫原性片段。本发明所用的优选Omp抗原包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：29具有50％或更高的相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：29的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7个或更多个(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多个)。(b)的优选片段包含来自SEQID NO：29的表位。本发明最有用的Omp85抗原可在施给对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ ID NO：29组成的脑膜炎多肽结合。有利的用于本发明的Omp85抗原可在施给对象后引发杀菌性抗奈瑟球菌抗体。
本发明的组合物可包含936抗原。936抗原作为基因NMB2091包括在脑膜炎B血清组菌株MC58[130]的出版的基因组序列中(本文的SEQ ID NO：22)。本发明所用的优选936抗原包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：22具有50％或更高的相同性(如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：22的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7个或更多个(如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多个)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：22的表位。本发明最有用的936抗原可在施给对象后引起抗体，其能与氨基酸序列SEQ IDNO：22组成的脑膜炎多肽结合。936抗原是fHBP的良好融合伴侣(例如见文献119和120)。
这些抗原优选以基本纯或基本分离的形式(即基本不含其它奈瑟球菌或宿主细胞多肽)或基本分离的形式制备。一般来说，在非天然发生环境中提供所述多肽，例如，将其从非天然发生环境中分离出。在一些实施例中，目标多肽存在于相对于对照该多肽富集的组合物中。照此提供纯化多肽，其中纯化指所述多肽存在于基本不含其它表达多肽的组合物中，其中基本不含指所述组合物少于90％、通常少于60％、更加通常少于50％的部分由其它表达多肽构成。
术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线性或支链聚合物，可以包含经修饰的氨基酸，可以被非氨基酸打断。该术语也包括天然方式或通过人工介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义也包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如，非天然氨基酸等)，以及本领域已知的其它修饰。多肽可以以单链或结合链的形式产生。
本发明组合物可包括来自脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y中1、2、3或4种的偶联的荚膜糖抗原。
现有的血清组C疫苗(MenjugateTM[131]，MeningitecTM和NeisVac-CTM)含有偶联糖。MenjugateTM和MeningitecTM具有与CRM197载体偶联的寡糖抗原，而NeisVac-CTM使用的是与破伤风类毒素载体偶联的完整多糖(去-O-乙酰化)。MenactraTM疫苗含有血清组Y、W135、C和A各组的偶联荚膜糖抗原。
本发明中的组合物可以包含脑膜炎球菌血清组Y、W135、C和A中一组或多组的荚膜糖抗原，其中所述抗原与载体蛋白偶联且/或其为寡糖。例如，所述组合物可以包含来自以下的荚膜糖抗原：血清组C；血清组A和C；血清组A、C和W135；血清组A、C和Y；血清组C、W135和Y；或血清组A、C、W135和Y全部四组。
每剂量各脑膜炎球菌糖抗原的通常量为1μg-20μg，例如，约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg(以糖表达)。
在混合物包含血清组A和C的荚膜糖时，MenA糖与MenC糖的比例(w/w)可以大于1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)。在混合物包含血清组Y与血清组C和W135中一组或两组的荚膜糖时，MenY糖和MenW135糖的比例(w/w)可以大于1(例如，2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10∶1或更高)，且/或MenY糖和MenC糖的比例(w/w)可以小于1(例如，1∶2、1∶3、1∶4、1∶5或更低)。血清组A∶C∶W135∶Y的糖的优选比例(w/w)为：1∶1∶1∶1；1∶1∶1∶2；2∶1∶1∶1；4∶2∶1∶1；8∶4∶2∶1；4∶2∶1∶2；8∶4∶1∶2；4∶2∶2∶1；2∶2∶1∶1；4∶4∶2∶1；2∶2∶1∶2；4∶4∶1∶2；和2∶2∶2∶1。血清组C∶W135∶Y的糖的优选比例(w/w)为：1∶1∶1；1∶1∶2；1∶1∶1；2∶1∶1；4∶2∶1；2∶1∶2；4∶1∶2；2∶2∶1；和2∶1∶1。优选使用质量基本相等的各种糖。
使用的荚膜糖可以是寡糖形式。通过对纯化荚膜多糖进行片段化(例如通过水解)可以方便地形成寡糖，片段化后通常要纯化所需大小的片段。
可进行多糖的片段化，以使寡糖的平均聚合程度(DP)最终小于30(例如，血清组A为10到20，优选约10；血清组W135和Y为15到25，优选约15-20；血清组C为12到22等)。可通过离子交换色谱或比色测定方便地测定DP[132]。
如果进行水解，通常对水解产物进行筛分，以去除短链寡糖。可用各种方法如超滤后进行离子交换色谱达到此目的。对血清组A来说，优选去除聚合程度小于或等于约6的寡糖；对血清组W135和Y来说，优选去除聚合程度小于4左右的寡糖。
参考文献131描述了MenjugateTM中使用的优选MenC糖抗原。
所述糖抗原可以经化学修饰。这对降低血清组A的水解特别有用[133；见下文]。可以进行脑膜炎球菌糖的脱-O-乙酰化。对寡糖的修饰可以在解聚之前或之后进行。
本发明中的组合物包含MenA糖抗原时，优选所述抗原为天然糖上有一个或多个羟基被封闭基团取代的修饰糖[133]。该修饰可以改善耐水解性。
本发明组合物中的荚膜糖通常会与载体蛋白偶联。通常，偶联可以增强糖的免疫原性，因为偶联可以将糖由T-非依赖性抗原转变为T-依赖性抗原，由此允许免疫记忆的引发。偶联对儿科疫苗特别有用，是一项众所周知的技术。
典型的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素，或者其类毒素或突变体。可以使用CRM197白喉毒素突变体[134]，其为PREVNARTM产品中的载体。其他合适的载体蛋白包括，脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[135]、合成肽[136，137]、热激蛋白[138，139]、百日咳蛋白[140，141]、细胞因子[142]、淋巴因子[142]、激素[142]、生长因子[142]、含有各种病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人造蛋白[143]如N19[144]、流感嗜血杆菌的D蛋白[145-147]、肺炎球菌溶血素[148]或其无毒衍生物[149]、肺炎球菌表面蛋白PspA[150]、铁摄取蛋白[151]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[152]、重组金黄色葡萄球菌胞外蛋白A(rEPA)[153]等等。
可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。
一般在偶联前活化或官能化所述糖。活化可包括例如：用氰化试剂如CDAP(如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶[154，155等])。其它合适的技术采用碳二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU等。
可用任何已知方法，如参考文献156和157所述的方法通过接头基团进行连接。一种连接类型包括多糖的还原性胺化，将得到的氨基与己二酸接头基团的一端偶联，然后将蛋白质偶联于该己二酸接头基团的另一端[158，159]。其它接头包括B-丙酰胺基[160]、硝基苯基-乙基胺[161]、卤代酰基卤化物[162]、配糖键[163]、6-氨基己酸[164]、ADH[165]、C4-C12部分[166]等。作为采用接头的替代方法，可以采用直接连接。直接连接蛋白质可包括氧化多糖，然后与蛋白质进行还原性胺化，如参考文献167和168所述。
优选包括以下步骤的方法：将氨基引入到糖中(例如用-NH2取代末端＝O基团)，然后用己二酸二酯(例如己二酸N-羟基琥珀酰亚胺基二酯)衍生后，与载体蛋白反应。另一种优选的反应采用将CDAP与蛋白D载体进行活化，例如用于MenA或MenC。
非脑膜炎球菌抗原
组合物可包括非脑膜炎球菌抗原，例如来自非脑膜炎球菌病原体，如细菌或病毒的抗原。因此，组合物可以包括一种或多种下列其它抗原：
-来自肺炎链球菌的糖抗原
-来自甲型肝炎病毒如灭活病毒的抗原
-来自乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原
-白喉抗原，如白喉类毒素
-破伤风抗原，如破伤风类毒素
-来自百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(百日咳杆菌粘附素)和/或凝集原2和3的组合
-来自乙型流感嗜血杆菌的糖抗原
-脊髓灰质炎抗原如IPV
-来自粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原
-来自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组链球菌)的蛋白质和/或糖抗原
-来自嗜热链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)的抗原
-来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原
所述组合物可以包含一种或多种这些其它抗原。
必要时，可使有毒的蛋白质抗原脱毒(如通过化学和/或遗传方式使百日咳毒素脱毒)。
在所述组合物中包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，在包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，在包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。因此，优选DTP组合。
糖抗原优选偶联物形式。上文中更详细地讨论所述偶联物的载体蛋白。
所述组合物中各抗原的浓度一般是至少1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫反应。
免疫
除提供上述免疫原性组合物外，本发明还提供一种在哺乳动物中引起抗体应答的方法，包括将本发明的免疫原性组合物给予所述哺乳动物。所述抗体应答优选地为保护性和/或杀菌性抗体应答。本发明也提供这类方法中所用的本发明组合物。
本发明还提供了一种保护哺乳动物免受奈瑟球菌(例如脑膜炎奈瑟球菌)感染的方法，包含将本发明中的免疫原性组合物给予所述哺乳动物。
本发明提供用作药物(例如，用作免疫原性组合物或疫苗)的本发明组合物。本发明还提供本发明囊泡在制备防止奈瑟球菌(例如脑膜炎球菌)感染哺乳动物的药物中的应用。
所述哺乳动物优选人。所述人可以是成人，或优选是儿童。当预防性使用疫苗时，人优选为儿童(如幼童或婴儿)；当疫苗用于治疗用途时，人优选为成人。准备给予儿童的疫苗也可给予成年人，例如用以评估安全性、剂量、免疫原性等。
所述用途和方法特别适用于防止/治疗包括但并不限于脑膜炎(特别是细菌性的脑膜炎，如脑膜炎球菌性脑膜炎)和菌血症的疾病。
治疗性措施的功效可以通过在给予本发明中的组合物后对奈瑟球菌感染进行监测来测试。可通过监测在施用组合物后针对fHBP或其它抗原的免疫应答测试预防性治疗的效力。本发明组合物的免疫原性可以通过给予受试对象(例如，12-16个月大的儿童或动物模型[169])，然后测定标准参数，包括血清杀菌抗体(SBA)和ELISA效价(GMT)来进行测定。通常在给予该组合物后约4周测定这些免疫应答，并与给予该组合物之前测定的值作比较。优选至少4倍或8倍的SBA增长。给予一个以上剂量的组合物时，可以进行一次以上的给药后测定。
本发明中的优选组合物可以在患者体内产生优于可接受百分比的人对象各抗原组分血清保护标准的抗体效价。具有相关抗体效价的抗原是众所周知的，高于该效价就认为宿主针对所述抗原发生血清转化，该类效价由如WHO一类的组织公布。优选多于80％的具有统计学显著性的对象样品发生血清转化，更优选多于90％，更优选多于93％，最优选96-100％。
本发明的组合物通常直接给予患者。可以通过胃肠外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或给予到组织间隙)，或通过直肠、口服、阴道、外用、透皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其它粘膜给药途径完成直接递送。优选在大腿或上臂进行肌肉内给药。注射可以通过针头(例如皮下针头)进行，但也可以采用无针注射。通常的肌肉内剂量为约0.5ml。
本发明可用来引发全身和/或粘膜免疫。
剂量治疗可采用单剂量方案或多剂量方案。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次给药方案之后，可以进行加强给药方案。可以通过常规方法确定初次剂量之间(例如4-16周)以及初次和加强剂量之间的适当时机。
杀菌应答
优选的免疫原性组合物可以引发对脑膜炎球菌具有杀菌作用的抗体应答。可以方便地测定小鼠的杀菌性抗体应答，其为疫苗功效的标准指标[例如，见参考文献170的尾注14]。本发明组合物可以优选地引发对来自下列三个菌株组中至少两组的每组的至少一种脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌作用的抗体应答：
(I)MC58、gb185(＝M01-240185)、m4030、m2197、m2937、iss1001、NZ394/98、67/00、93/114、bz198、m1390、nge28、lnp17592、00-241341、f6124、205900、m198/172、bz133、gb149(＝M01-240149)、nm008、nm092、30/00、39/99、72/00、95330、bz169、bz83、cu385、h44/76、m1590、m2934、m2969、m3370、m4215、m4318、n44/89、14847。
(II)961-5945、2996、96217、312294、11327、a22、gb013(＝M01-240013)、e32、m1090、m4287、860800、599、95N477、90-18311、c11、m986、m2671、1000、m1096、m3279、bz232、dk353、m3697、ngh38、L93/4286。
(III)M1239，16889，gb355(＝M01-240355)，m3369，m3813，ngp165。
例如，组合物可以引发对血清组B脑膜炎奈瑟球菌菌株MC58、961-5945和M1239中的两个或三个菌株有效的杀菌反应。
组合物可以优选地引发对至少50％(例如，60％、70％、80％、90％、95％或更多)的临床相关脑膜炎球菌血清组B菌株具有杀菌作用的抗体应答。所述组合物可引发抗体应答，其对B血清组的脑膜炎奈瑟球菌以及血清组A、C、W135和Y中的至少一组(例如1、2、3、4)的菌株具有杀菌性。所述组合物可引起对淋病奈瑟球菌(N.gonorrhoeae)和/或灰色奈瑟球菌(N.cinerea)菌株具有杀菌性的抗体应答。所述组合物可以引发对来自参考文献2中图5所示的系统树的三条主分枝中的至少两条分枝的菌株具有杀菌作用的反应。
组合物可以引发对超毒力谱系ET-37、ET-5、A4簇、谱系3、亚组I、亚组III和亚组IV-1中至少2个(例如，2、3、4、5、6、7)谱系的脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌作用的抗体应答[171，172]。组合物还可以诱导对一个或多个高侵袭性谱系的杀菌性抗体应答。
组合物可以引发对下列多基因座序列类型中至少2个(例如，2、3、4、5、6、7)类型的脑膜炎奈瑟球菌菌株具有杀菌作用的抗体应答：ST1、ST4、ST5、ST8、ST11、ST32和ST41[173]。所述组合物还可以引发对ST44菌株具有杀菌作用的抗体应答。
所述组合物不需要诱导针对指定谱系或MLST中各个和每个MenB菌株的杀菌性抗体；相反，对具体超毒力谱系或MLST中更多个血清组B脑膜炎球菌菌株中的任何四个菌株的特定组来说，所述组合物诱导的抗体优选地对所述组的至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或更多)具有杀菌作用。优选的菌株组包括下面的国家中至少四个所分离到的菌株：GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。所述血清优选地具有至少为1024(例如，210、211、212、213、214、215、216、217、218或更高，优选至少为214)的杀菌效价，即所述血清可以在以1∶1024稀释后杀死一个特定菌株中至少50％的测试细菌，如参考文献170的尾注14所述。优选的组合物可以引发小鼠中的抗体应答，甚至在血清以1∶4096稀释或更稀时仍保持杀菌性。
概述
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是可选的并表示例如x±10％。
术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。
优选通过MPSRCH程序(牛津分子科技公司(Oxford Molecular))执行的Smith-Waterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索测定“序列相同性”，参数为缺口开放罚分＝12，缺口延伸罚分＝1。
脑膜炎球菌分类在血清组之后包括血清型、血清亚型和免疫型，标准命名法包括血清组、血清型、血清亚型和免疫型，彼此之间由冒号隔开，例如B:4:P1.15:L3，7，9。在血清组B中，一些谱系经常引起疾病(高侵袭性)，一些谱系引起比其它谱系更严重形式的疾病(超毒力)，其余的很少引起疾病。识别出7个超毒力谱系，即亚组I、III和IV-1、ET-5复合体、ET-7复合体、A4簇和谱系3。通过多座位酶电泳(MLEE)对这些进行了定义，但是也可以使用多座位序列分型(MLST)对脑膜炎球菌分类[参考文献173]。4种主要的超毒力簇是ST32、ST44、ST8和ST11复合体。
附图简要说明
图1显示围绕nmb1869基因的起始密码子的基因组序列(SEQ ID NO：17)。
图2显示围绕fhbp基因的起始密码子的基因组序列(SEQ ID NO：18)。
图3显示各种菌株中短和长fhbp转录物的northern印迹。
图4显示多种菌株中三种不同蛋白的Western印迹。
具体实施方式
其它信息可由参考文献174获得。
脑膜炎奈瑟球菌MC58菌株中fhbp基因座的分析
fhbp基因侧接于nmb1869(果糖-双磷酸醛缩酶)和nmb1871基因。转录终止子分析揭示出fhbp基因下游11nt的Rho非依赖性终止子的典型茎环结构。在nmb1869和fhbp基因的GTG起始密码子之间有157bp的基因间区。在nmb1869基因下游20个核苷酸处的该基因间区中，存在另一推定的Rho非依赖性转录终止子。这些有关基因座的初步观察结果提示，fhbp基因可能转录成一个基因并且不是操纵子成员。
对MC58的总RNA进行RT-PCR分析显示产生跨上游基因间区、而不是下游基因间区的扩增产物，这提示fhbp可与上游nmb1869基因一起转录。
对MC58野生型菌株、NMB1869无效突变体(Δnmb1869)和fhbp无效突变体(Δfhbp)菌株的总RNA进行Northern印迹分析显示出＞2000nt的长转录物，在野生型菌株中通过fhbp和nmb1869探针检测到，但在两个突变株中不存在。该转录物的预计大小与双顺反子信使的预计大小良好对应，并验证了nmb1869和fhbp基因的共同转录。还在野生型和Δnmb1869突变菌株中检测到刚好低于1000nt的较短fhbp特异性mRNA，这提示存在fhbp单顺反子转录物。此外，双顺反子信使的转录被消除时Δnmb1869突变体中存在这种较短转录物表明较短的fhbp转录物是因自身专用启动子驱动的fhbp基因转录而来，而不是加工较长转录物的结果。
此外，nmb1869探针在野生型菌株和fhbp无效菌株中检测到～1100nt的较小的nmb1869特异性转录物，表明也产生nmb1869上游基因的单顺反子转录物。总之，这些结果表明两种不同启动子驱动nmb1869和fhbp基因座的三种不同mRNA转录物的合成。nmb1869和fhbp基因由其专用启动子转录到单顺反子转录物上，但也由nmb1869上游的启动子驱动共同转录到双顺反子转录物上。较长的双顺反子转录物很可能由无效终止产生，导致NMB1869下游转录终止子的通读。
由生长至对数中期的脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)培养物提取的总RNA进行引物延伸，以确定mRNA的启动点。nmb1869-特异性引物与来自MC58的总RNA杂交，并用逆转录酶延长。主要延长产物从nmb1869转录物的5′末端到其起始密码子上游29个核苷酸的位置(图1)。还用来自MC58和Δ1869突变体的总RNA进行fhbp特异性引物延伸，该项工作从fhbp单顺反子转录物的起点开始，到fhbp的起始密码子上游45个核苷酸的位置(图2)。在每种情况下，延长引物上游的核苷酸序列显示存在类似于大肠杆菌(E.coli)σ70依赖性启动子的-10和-35六聚体的元件(图1和2)。这些序列应限定脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)Pnmb 1869和Pfhbp启动子。
鉴定这两个启动子驱动合成三条mRNA后，研究它们的调节机制。在不同氧气条件下研究fhbp基因的表达情况。由生长至对数中期后接触微好氧条件(+)或氧气限制条件(-)30分钟的野生型菌株和fnr无效突变体提取总RNA。进行Northern印迹分析，以分析两种fHBP转录物的水平(图3)。野生型在氧气限制期间上调单顺反子转录物(泳道2与泳道1)，但在fnr无效突变体中没有这种现象(泳道3和4)，这表明在氧气限制下FNR介导诱导。为了验证FNR依赖性调节，采用在染色体的异源位点中表达一个拷贝的fnr基因的突变体菌株。在这种Δfnr_C菌株中，fhbp单顺反子mRNA的上调在氧气限制条件下恢复(泳道5和6)。此外，在氧气限制条件下较长的双顺反子转录物的表达水平较低，但似乎不是FNR依赖性调节。
组成型活性脑膜炎球菌FNR
虽然参考文献29已将fhbp基因鉴定为FNR调节子的可能成员，但它没有提供实验确认，并且没有意识到两种不同fhbp转录物的存在，其中只有一种是FNR活化的。为了进一步验证FNR活化活性，产生FNR蛋白的组成型活性形式。
已知可修饰大肠杆菌的FNR，以使其[4Fe-4S]簇是O2稳定的。实现此种稳定性的一个突变是D148A，其中Asp-148(例如，在SEQ ID NO：6中，大肠杆菌菌株CFT073)突变为Ala。FNR的推定二聚化结构域中发生此单氨基酸取代产生组成型活性蛋白，其可在氧气存在下用作转录激活物[175]。
大肠杆菌序列SEQ ID NO：6与脑膜炎球菌序列(SEQ ID NO：4)的比对为：
尽管这两条序列的总体相同性低(40％)，大肠杆菌残基D154(下划线)也出现在脑膜炎球菌序列的残基148处。
利用定位诱变代替编码脑膜炎球菌序列的Asp-148的密码子，并用GCC丙氨酸密码子代替它。该修饰基因和其编码蛋白在下文中称为“fnrD148A”。
用红霉素抗性盒取代整个编码序列，以产生脑膜炎球菌的Δfnr无效突变体[29]。为了补偿fnr无效突变体，将Ptac启动子控制下的野生型fnr或D148A突变体fnr基因整合到Δfnr的染色体中会聚的ORF NMB1428和NMB1429之间，具体是分别用pCompInd-fnr或pCompInd-fnrD148A转化Δfnr菌株。pCompInd-fnr是pCompInd的衍生质粒，其中野生型fnr基因由MC58基因组扩增而来并作为732bp NdeI/NsiI片段克隆到Ptac启动子下游。pCompInd-fnrD148A质粒是编码fnrD148A的pCompInd-fnr的衍生物。用QuickChangeTM试剂盒(司查塔基(Stratagene)TM)将突变引入pCompInd-fnr中。用pCompInd-fnr或pCompInd-fnrD148A质粒转化Δfnr菌株。而且，为了产生从突变基因的整合拷贝表达FnrD148A蛋白的重组菌株，将pCompInd-fnrD148A质粒转化到脑膜炎球菌分离物H44/76、4243、F6124、M6190、LNP17592、M01-240345、NM117、LNP17094、B3937、M01-240013、M3153、5/99、BZ232、1000、OX99.30304中，产生各菌株的衍生物。
为了转化天然感受态的脑膜炎奈瑟球菌，将四个或五个新鲜培养过夜的单菌落重悬于20μl PBS，打点到GC琼脂平板上，平板中加入5-10μg线性质粒DNA，干燥，并于37℃孵育4-8小时。然后，在含有合适抗生素的平板上选择转化子，将单菌落重新划线于选择性培养基以便进一步分析。将单菌落重悬于50μl PBS，放入沸水浴中5分钟，在台式离心机中以最大速度离心5分钟。1μl样品用作PCR分析模板，以矫正双交换转化子。
利用在微好氧或氧气限制条件下培养的补充有突变基因的FNR敲除菌株(Δfnr_CD148A)的总RNA进行Northern印迹分析，显示即使在氧气存在条件下，突变的FNR蛋白也能够促进fhbp单顺反子mRNA转录(图3，泳道7和8)。因此，突变FNR以不依赖氧气的方式驱动转录。敲除上游nmb1869基因，从而消除双顺反子RNA信使的合成，不会影响单顺反子转录物的FNR-氧气-依赖性调控(图3，泳道9和10)。总之，这些数据表明，在氧气限制条件下由专用FNR活化启动子诱导fhbp转录。
还在菌株H44/76中研究fhbp基因的转录和调节。该项工作也显示两条fhbp转录物，并在野生型菌株中验证fhbp单顺反子mRNA因氧气限制而上调，还因组成型活性FNR突变蛋白的表达而上调(图3，泳道11-14)。
利用Western印迹分析将FNR转录调节与所有菌株中总蛋白水平相关联。在微好氧条件下，由新鲜培养的过夜平板培养物制备总蛋白提取物，用针对NMB1869、fHBP和FNR蛋白的特异性抗体进行免疫印迹。如图4所示，fHBP表达在表达FNR的组成型活性形式的Δfnr_CD148A和H44/76_CD148A菌株中明显增加(泳道4和8)，与微好氧条件下的Northern结果相关联。
而且，与野生型菌株中的FNR表达相比，重组菌株中由异源Ptac启动子表达的各FNR蛋白等位基因过度表达，但只有D148A突变体能诱导fHBP的过度表达。这些数据强烈支持FNR活性，而不是其高表达在促进fHBP表达中的重要性。
将编码野生型和突变体FNR蛋白(fnr和fnrD148A基因)的基因克隆到pET15b表达载体中，以便在大肠杆菌中重组表达。表达这些蛋白，依靠N末端组氨酸标签用Ni2+-亲和色谱纯化。
检测两种重组蛋白与aniA启动子的体外结合活性。该启动子已在脑膜炎奈瑟球菌和淋病奈瑟球菌上通过DNA微阵列和DNA结合研究良好鉴定，在氧气限制期间它在FNR的直接控制下[28，29，176]。含有MC58的aniA启动子的特异性探针与浓度递增的重组蛋白一起培育，然后进行DNA酶I消化。加入13nM FNRD148A蛋白导致完全保护相对于转录起始位点跨-30至-50且含有aniA预测的FNR-框共有序列的DNA区域。然而在这些条件下，野生型蛋白质不产生保护作用。因此，该突变体在有氧条件下有结合DNA的组成型活性，并结合预测的FNR-框。
加入1μM FnrD148A能保护相对于Pfhbp的转录起始位点跨-28位至-50位，因而重叠-35启动子元件的核苷酸。对启动子序列进行分析揭示出存在正好重叠-35六聚体的推定FNR-框TTGAC-N4-CTCAT(SEQ ID NO：16)。该序列与大肠杆菌FNR框共有序列(SEQ ID NO：19)相比有三个核苷酸不同。这些数据表明FNR结合fhbp启动子区，以促进fHBP蛋白的转录和表达。
在多种菌株中进行研究
也在其它脑膜炎球菌菌株中研究fHBP蛋白表达的FNR依赖性调节，这些菌株来自地理多变来源并代表与疾病相关的主要克隆集合体。在不同fHBP家族的菌株上进行初步Western印迹分析。所有菌株均表达fHBP抗原，但是如前所述[2]，菌株间的表达水平不同。利用已经用于产生MC58ΔfnrC_D148A菌株的相同构建物制备表达组成型活性FNR的等基因突变体菌株。对获得的转录物和其野生型进行Western印迹分析。在这些突变体菌株中，内源性fnr基因没有灭活。
转化菌株的FNR蛋白表达水平高于野生型，验证了转化的成功。而且，重组菌株也过度表达fHBP蛋白。唯一的例外是NM117菌株。虽然它过度表达FNR，但它不显著过度表达fHBP。对Pfhbp启动子测序，虽然FNR框完全保守，但-10启动子元件相对于MC58序列具有2个突变，显示不大可能用作高效-10元件的TACCGC序列(SEQ ID NO：15)。
总之，这些结果表明fhbp基因的FNR依赖性调节不限于MC58和H44/76菌株。
囊泡产生
如上所述，编码由其天然启动子(启动的)fhbp的菌株表达FNR的组成型活性形式时，它们过度表达fHBP。因此，相对于相应野生型菌株制备的囊泡，理想情况下不使用去污剂[25，44]由这些菌株制备的囊泡富含fHBP。这些囊泡可用于产生抗-脑膜炎球菌免疫力。各自具有不同家族fHBP的这类囊泡的二价或三价混合物可用于增加覆盖谱。在其它实施方式中，工程改造表达组成型活性FNR的脑膜炎球菌，以表达两种或三种fHBP变体，以使来自该菌株的囊泡已经是fHBP二价或三价。可通过染色体的不同位点上整合、但各自在FNR激活的启动子控制下的外源基因单独表达不同变体。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和精神内。
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Claims (21)

1.一种脑膜炎球菌，其(a)具有其转录处于FNR激活的启动子控制下的基因，和(b)表达FNR的组成型活化形式，其中，所述FNR的组成型活化形式与来自菌株MC58的SEQ ID NO：4相比在残基Asp-148上具有选自D148A、D148G和D148V的突变，并任选地在Leu-22位上具有L22H突变。
2.如权利要求1所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述转录在FNR激活的启动子控制下的基因是fhbp。
3.如权利要求1所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述FNR的组成型活性形式具有突变D148A。
4.如权利要求1－3中任一项所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述脑膜炎球菌不表达活性LpxL1酶。
5.如权利要求1－3中任一项所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述脑膜炎球菌是高出泡脑膜炎球菌。
6.一种制备脑膜炎球菌突变体的方法，包括(a)修饰其内源性fnr基因，以使编码的FNR蛋白组成型活化，或(b)引入编码FNR的组成型活性形式的基因的步骤，其中，（a）所述的组成型活化的FNR蛋白和（b）所述的FNR的组成型活性形式与来自菌株MC58的SEQ ID NO：4相比在残基Asp-148上具有选自D148A、D148G和D148V的突变，并任选地在Leu-22位上具有L22H突变。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，（a）所述的组成型活化的FNR蛋白和（b）所述的FNR的组成型活性形式具有突变D148A。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述脑膜炎球菌不表达活性LpxL1酶。
9.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述脑膜炎球菌是高出泡脑膜炎球菌。
10.一种制备脂蛋白体脑膜炎球菌囊泡的方法，该方法包括处理权利要求1-5中任一项所述的或可通过权利要求6-9中任一项所述方法获得的脑膜炎球菌的步骤，以破坏其外膜，从而由其形成包含外膜的蛋白质组分的囊泡。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述脂蛋白体脑膜炎球菌囊泡包含fHBP。
12.如权利要求10或11所述的方法，其还包括从任何活的和/或完整的细菌分离所述囊泡的步骤。
13.一种脑膜炎球菌，其表达FNR的组成型活性形式，其中，所述FNR的组成型活化形式与来自菌株MC58的SEQ ID NO：4相比在残基Asp-148上具有选自D148A、D148G和D148V的突变，并任选地在Leu-22位上具有L22H突变。
14.如权利要求13所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述FNR的组成型活性形式具有突变D148A。
15.如权利要求13或14所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述脑膜炎球菌不表达活性LpxL1酶。
16.如权利要求13或14所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述脑膜炎球菌是高出泡脑膜炎球菌。
17.一种脑膜炎球菌FNR的组成型活性形式，其特征在于，所述FNR的组成型活化形式与来自菌株MC58的SEQ ID NO：4相比在残基Asp-148上具有选自D148A、D148G和D148V的突变，并任选地在Leu-22位上具有L22H突变。
18.如权利要求17所述的脑膜炎球菌FNR的组成型活性形式，其特征在于，所述FNR的组成型活性形式具有突变D148A。
19.一种核酸，其编码权利要求17或18所述的FNR的组成型活性形式。
20.一种包含权利要求19所述核酸的载体。
21.一种包含权利要求20所述的载体的宿主细胞。
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