JPH04500203A - インフルエンザワクチンおよび新規なアジュバント - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インフルエンザワクチン及び新規なアジュバント発明の分野 ワクチン技術における本発明は、リポソームとインフルエンザ抗原、特に赤血球 凝集素又はブロメライン断片を包含し、その際、該リポームと抗原は免疫付与投 与量中に存在する。インフルエンザ免疫付与投与形態に関するものである。更に 、免疫応答を生成するに適合した形態を含み、ステロールの有機酸誘導体の塩と 抗原とを包含し、その際該ステロールの有機酸誘導体と抗原とは免疫付与投与量 中に存在する、投与形態及びその使用方法に関する。 更にまた、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）／コレステロール リポソーム、これらは任意に水酸化アルミニウムゲル中にあってもよく、及び抗 原とを包含し、その際、該ＤＭＰＣ／コレステロールと抗原とは免疫付与投与量 中に存在する、免疫応答を生成するに適合した形態を含む投与形態及びその使用 法に関する。 発明の背景 ワクチン技術において抗原は、宿主（ホスト）生物体中で免疫応答を刺激するよ うな方法で該生物体中に導入される。免疫応答の誘導は多くの因子に依存するも のであり、これらの因子としては抗原の化学組成や構造、要求される生物体の免 疫原的構成及び抗原の投与方法及び投与期間が含まれると考えられる。免疫応答 は数多くの因子を有し、それらのいくつかは免疫システムの細胞（例えば、Ｂ− リンパ尊、丁−リンパ球、マクロファージ及びプラズマ細胞）により示される。 免疫システム細胞は、抗原との相互作用、免疫システムの他の細胞との相互作用 、サイトカインの放出及びこれらのサイトカインの反応性等を通して免疫応答に 関与する。免疫応答は便宜的に（任意ではあるが）２つの主なカテゴリー、即ち 体液と細胞媒体とに分けられる。免疫応答の体液性成分は抗原に特有な免疫グロ ブリンの生産を含むものである。細胞媒介成分は遅延タイプのアレルギーと抗原 に対する細胞傷害性作動体細胞の発生を含むものである。 いくつかの場合に、免疫応答は、抗原に対して１又は複数の追加免疫接触（ｅｘ ｐｏｓｕｒｅ）により引き継がれるところの最初の又は第一の抗原投与の結果起 こる。比較的強力な免疫原及びリポソームによる第一の投与はクランプ等（Ｘｒ ａｍｐ、　Ｗ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ）による“アデノウィルス型５ヘクソン及び 繊維ワクチンのリポソーム的免疫抗原性の強化（Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ　Ｅｎｈａ ｍｅｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｍｍｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　Ａｄｅｎ ｏｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　５　Ｈｅｘｏｎ　ａｒｉｄ　ＦＬｂｅｒ　Ｖａｃｕｎ ｅｓ）″　【インフェクションアンドイミュニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａ ｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）　２５　：　７７１−７７３　（１９７８）　）及び デービス等（Ｄａｖｉｓ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ　）による“免疫精製破傷風トキ ソイドを有するアジュバントとしてのリポソーム：免疫応答（ｌｉｐｏｓｏｍｅ 　ａｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｉｍｍｕｎｅｐｕｒｉｆｉｅｄ　丁ｅ ｔａｎｕｓ　丁ｏｘｏｉｄ：ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ）　＃（ イミュノロジーレターズ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｌａｔｔｅｒｓ）　１４　： 　３４３−８　（１９８６／１９８７）　）に論じられている。 理想的には、抗原は２つの性質、即ち、相当する抗原形成を刺激する能力及びこ れらの抗体と特異的に反応する傾向を示すであろう。免疫原は、抗体又は免疫グ ロブリンの結合部位により認識され得る抗原の最小部分であるところの１つ又は それ以上の抗原決定基（エピトープ）を有している。 特別な抗原もしくは抗原断片の場合、又は特別な存在状態にあっでは、所望の抗 原により生じる免疫応答は不適切又は非存在となり、十分な免疫が生成されない 、これは、特に、ペプチドや他の小さな分子を免疫原として用いた場合に起こる 。 このような場合、ワクチン技術は抗原と共に用いた時に免疫応答を強化せしめる ようなアジュバントとよばれる物質の使用を認めている。アジュバントは更に、 免疫応答をより早く、より大きくもしくはより少ない抗原を持って生起させるた めに、あるいは免疫的防御を与えるある種の抗体サブクラスの生産を増大させる ために、あるいは又免疫応答の要素（例えば、体液的、細胞的）を強めるために も用いられる。 よく知られているアジュバントは、フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’　ｓ　）アジュ バント（及び他の油、エマルジョン）、ボルテデラベルツシス（Ｂｏｒｔｅｄｅ ｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、アルミニウム塩（及び他の金属塩）、マイコバ クテリア（Ｍｙｃｏｂａｅｔｅｒｉａｌ）生産物（ムラミルジペプチドを含む） 、及びリポソームである。ここで用いたように、”アジュバント”なる語は、抗 原ど併用もしくは共用して投与される物質又は材料ひあって、該抗原に対する免 疫応答を増大させるものを意味することが理解されよう。アジュバントはエマル ジョン（例えばフロ、インドアジュバント）、ゲル（水酸化アルミニウムゲル） 、粒体（リポソーム）及び固体材料等の多くの形態であり得る。リポソームワク チン及びアジュバントは本願と同日に出願されたＰｏｐｅｓｃｕのアメリカ特許 出願（ドケットＴＬＣ−１７２）中に論じられており、そこにおける教示はここ に参考のために記載されている。 アジュバントの活性は多くの因子により達成されるものと考えられている。ニオ １らの因子とし、では、（ａ）担体効果、（［））貯蔵形成、（ｃ）変化したリ ンパ球再循環、（ｄ）Ｔ−リンパ球の刺激、（ｅ）Ｂ−リンパ球の直接刺激、及 び（ｆ）マクロファージの刺激がある。 多くのアジュバントにおいて副作用が見られる。ある場合には、副作用は、注射 部位における肉芽腫瘍の形成、注射部位における激しい炎症、発熱、アジュバン トにより誘導される関節炎もしくは他の自動免疫応答、又は発ガン性の応答を含 む。このような副作用は、フロインドアジュバントの如きアジュバントの使用を 妨げる。 特別な態様において、アジュバントはリポソームを含む、　Ａ１１ｆｓＯ等に１ ８７７年１０月１７日に付与されアミリカ特許第４，０５３，５８５号には、あ る特定な電荷のリポソームはアジュバントであることが述べられている。デービ ス等（Ｄａｖｉｓ、　Ｄ、ｅｔ　ａｌ）による“免疫精製破傷風トキソイドを有 するアジュバントとしてのリポソーム：リポソーム的特性の影９　（Ｌｊｐｏｓ ｏｍｅｓ　ａｓ　Ａｄｊｕｖａｎｔｓ　ｔｉｔｈ　Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｅ ｄ　Ｔａｔａｎｕｓ　Ｔｏｘｏｉｄ：Ｉｎｆ’１ｕｅｎｅｅ　ｏｆ　Ｌｉｐｏｓ ｏｍａｌ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）″（イミュノロジー（Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ）、　６１　：　２２９−２３４（１９８７））及びグレゴリアゾイ ス等（Ｇｒｅｇｒｉａｄｉｓ、　Ｇ、ｅｔ　ａｌ　）による“免疫学的アジュバ ントとしてのリポソーム：抗体導入研究（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ａｓ　Ｊａｍｕ ｎｏｌｏｇｉｅａｌ　Ａｄｊｕｖａｎｔｓ　：　Ａｕｔｉｇｅｎ　Ｉｎｃｏｒｐ ｏｒａｔｉｏｎ　５ｔｕｄｉｅｓ）　”［ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）、　５　 ：　１４５−１５１（＋９８７））においてＤＭＰＣ／コレルテロールリポソー ム（１：１．）と、抗原として強力な免疫原である破傷風菌とを用いた場合、は っきりした脱水／再水付加タイプの小さなユニラメラ小胞体（単層小胞体）にお いて、極小的に改善された（遊離の抗原に比べて）免疫応答が得られたことが報 告されている。このデービスやグレゴリアゾイスの報告においＣは、リボン・− ムの免疫応答は遊離の抗原の免疫応答と極く僅かな程度しか差が認められていな い３リポソームによる応答を遊離の抗原の応答と識別１゛るためには、破傷風菌 を極小応答量まで希釈する必要があフ；Σ８本発明は治療的に効果的な免疫応答 をちたら釘ようなり　Ｍ　Ｉ）　Ｇ　／＝２し、（１テロ−・ルリポソームの条 件を採用するものである。 免疫ｌ曙整剤（例えば、−インターロイキンの如き・けイトカイ′ン）等の他の 物質は、その上アジュバント／“ワクチン中に組み合わせることができる。 体液による免疫応答は多くの公知の方法ｉ：より測定することができる。シング ルラジアルイムイ２ノフエージ３ンアツセイ（Ｓｉｎｇｌｅ　Ｒａｄｉａｌ　Ｉ ｉ＋Ｑｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ、　Ｓ　ＲＩ　Ｄ）　、酵素免疫測定（Ｅｎｚ ｙｍ８ｈｔ＋Ｗｕｎｏ　Ａｓ５ａｙ、　Ｅ　Ｉ　Ａ）　、　７ｋ、びヘマグリル 子ネーショ゛ノ１′ンヒビシｊ／ア゛ソー１？ｌ：　１’　（）ｉｅｍａｇｇム ｕｔ、ｉｒ＋ａｕｏｎ　ｊｎｔ＋ｔｂｉｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ、　）ｉＡｌ）は 体液免疫応答に通常用いられている数少ない測定法である。 Ｓ　ＲＤ　Ｉにおいては、試験される免疫原を含む寒天等のゲル層を用いる。ウ ェルがこのノール中に切穿され、、試験さ才する血清がそのウェル中に置かれる 。ゲルから抗原が拡散すると沈殿環が形成され、その面積は試験される血清中の 抗体濃度に比例する。 ＥＲＡは、ヌ酵素結合免疫浩定（Ｅｎｚｙｍｅ　１ｉｎｋｅｄ　Ｉ！ｌ１ａｕｎ ＊　Ａｓｌ；ａｓｙ、ＥＬＩＳＡ）として知られており、妙ニブル中の全抗体を 決定するために用いられる。抗原はマイクロタイタープレートの表面に吸着され る。その試験血清はこのプレートにさらされ、次いでＩｇＧなどの酵素結合免疫 グロブリンにさらされる。プレート（−接督した酵素活性は分光光度計などの任 意の便利な手段に上り定量され、その試験試料中に存在する抗原に対する抗体の 濃度に比例する。 ＨＡＩは、ウィルスタンパク等の抗原がニワトリ赤血球等を凝集するような抗原 の能力を利用するものである。この測定におい°Ｃは中和抗体、即ち赤血球凝集 を阻害することができる抗体が検出される。二）試験血清を標準濃度の抗原と共 にインキュベートし、次いで赤血球を加える。抗原による赤血球の凝集は中和抗 体の存在により阻害される。 アレルギー性及び細胞による免疫応答の測定法としては遅延りｆブのアレルギー の測定又は標的となる抗ｊに対するリンパ球の増殖応答の測定が挙げられる。 リポソームは取り込まれた水性容量を含んだ、完全に閉鎖された脂質の２層膜で ある。リポソームはユニラメラ小胞体単一の２層膜を有する）又はマルチラメラ 小胞体（多層小胞体）（複数の漠２層体で特徴づけられる玉ネギ状構造であって 、各々の膜は互いに水層により分離されている）であり得る。２層体（ｂｉｌａ ｙｅｒ）は疎水性の「末尾」部と親水性の「頭」部分とを有する２つの脂質単一 層から成っている。膜２層体の構造は脂質単一層の疎水性（非極性）の「末尾」 が２層体の中央に向かっ°Ｃ配向し、親水性の「頭」が水相に向かって配向して いるような構造である、パンガム等（Ｂａｎｇｈａｍ　ｅｔ　ａｌ）　、ジャー ナル・サブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　、 ＋２　：　２３８−２５２（＋９６５）のオリジナルのリポソームの調製は、ま ずリン脂質を有機溶媒に分散させ、次いでこれを蒸発乾固して、反応容器にリン 脂質の膜を形成させ、次に、適当量の水を加えて混合物を「膨潤Ｊさせ、斯くし て得たマルチラメラ小胞体（ＭＬＶｓ）から成るリポソームを機械的手段により 分散させることを含むものである。この技術は、パパハジョパウロ等（Ｐａｐａ ｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ　ｅｔ　ａｌ）　、　［バイオシミ力。 工・バイオフィジカ・アクタ］　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔ ａ、、　１３５　：６２４−６３８（１９６８）　］により報告されている超音 波処理された小さなユニラメラ小胞体や大きなユニラメラ小胞体の発展の基礎を 提供するものである。小さなユニラメラ小胞体は約１１００ｎ以下の直径を有す るものである。 ユニラメラ小胞体は、ここに参考のために記載しているカリス等（Ｃｕｌｌｉｓ 　ｅｔ　ａｌ）による１９８６年１月１６日公開の発明の名称「ユニラメラ小胞 体の製造のための押出し技術」のＰ　ＣＴ　ｌ！ｆ５’ｌＲＷＯ８７１００２３ ８に記載された方法により押出し機を用いて製造することができる。この技術に より作られる小胞体（ＬＵＶＥＴＳと呼ばれる）は一度又は多数回膜フィルター を通して加圧下で押出される。ＬｔＪＶＥＴＳは「ユニラメラ小胞体」なる語に 含まれるものと理解されたい。 マルチラメラ（多層）リポソームの他のクラスは、実質的に等しい層溶質分布を 持つことを特徴とするものがある。このクラスのリポソームとしてはレンク等（ Ｌｅｎｋ　ｅｔ　ａｌ）の米国特許第４，５２２、８０３号に記載されている安 定なプルリラメラ（複数層）小胞体（ＳＰＬＶ）、ファウンテン等（Ｆｏｕｎｔ ａｉｎ　ｅｔ　ａｔ）の米国特許第４．５８８，５７８号に記載されているユニ ラメラ小胞体、及びバリー等（Ｂａｌｍｙ　ｅｔ　ａｌ）による１９８７年】月 １５日公開の発明の名称［改良されたトラッピング効果を持つマルチラメラリポ ソーム」のＰＣＴ公開公報８７１０００４３に記載されている、小胞体を少なく とも１回凍結融解サイクルにかける方法により得られる凍結融解マルチラメラ小 細胞体（ＦＡＴＭＬＶ）が挙げられる。 ヤノフ等（Ｊａｎｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ）の米国特許第４，７２１，６１２号には 多種の使用目的のためのステロイド系リポソームが記載されている。これらの先 行技術におけるリポソームの製造と使用についての教示は、ここに参考のために 記載している、ｌ豆二ｌ股 本発明の１つの側面は、リポソームとインフルエンザの抗原とを包含する、イン フルエンザ免疫付与調剤を含むものであり、該リポソームとインフルエンザ抗原 は免疫付与調剤中に存在するものである。特別な態様においては、抗原は赤血球 凝集素断片又はブロメライン断片を包含する。別な態様においては、リポソーム はステロールの有機酸誘導体の塩をも含む、ある投与形態においては、抗原はリ ポソーム、好ましくはマルチラメラ小胞体、更に好ましくは直径が少なくとも１ ミクロンのものに捕捉されている。 特に有用なリポソームは、ステロールの有機酸誘導体のトリス（ヒドロキシメチ ル）アミノメタン塩形態を包含するものである。 他の特に有用なリポソームはＤＭＰＣＩコレステロールを包含するものであって 、殊にモル比で約２０〜８０のコレステロールに対して８０〜２０のＤＭＰＣ， 更に特にそのモル比が約４０　：　６０〜６０　＋　４０のものであり、更に該 リポソームは実質的に等しい層溶賀分布（ＳＰＬＶ）の一つであるようなマルチ ラメラ小胞体である。 本発明はステロールの有機酸誘導体の塩と抗原とを包含し、該ステロールの有機 酸誘導体と抗原とは免疫付与投与量中に存在する投与形態を含む。ある態様にお いて、投与形態は、マルチラメラ小胞体、特に直径が少なくとも約１ミクロンの マルチラメラ小胞体のようなリポソームである。ある態様においては、抗原はリ ポソーム中に捕捉されている。 特別な態様においては、投与形態はステロールの有機酸誘導体の塩、殊にトリス （ヒドロキシメチル）アミノメタン塩を含む。 他の態様においては、その塩形態はステロールのカルボン酸誘導体（例えば脂肪 族カルボン酸で、特に炭素数が５までのもの）、ステロールのジカルボン酸誘導 体（例えば脂肪族ジカルボン酸で特に炭素数が７までのもの）の塩、ステロール のビトロキシ酸誘導体（例えばクエン酸）、ステロールのアミノ酸誘導体、ステ ロールのポリアミノ酸誘導体の塩、ステロールのポリカルボキシ酸誘導体の塩で ある。 投与形態の一態様においては、脂肪族ジカルボン酸はコバ））酸である。 本発明の投与形態の特別な態様においては、免疫原はタンパク質、ペプチド、多 糖類、核酸、脂質、糖脂質、リボタンバグ質、生動物断片、組織断片及び細胞断 片の中から選ばれるものである。 特別の抗原としては、赤血球凝集素、バラインフルエンザ３（融合及び赤血球凝 集素−ノイラミニダーゼ）、マラリャスボロゾイト断片、肝炎（Ａ、Ｂ及び非Ａ ／非Ｂ）断片、骨髄炎断片、ＨＩＶ断片（全ての種類）及び黒色腫断片等のイン フルエＣ・ザ断片があげられる、 本発明の投与形態は更にす５イトカイン（例えばインターフエロン、血ｚｊＸ板 由来の因子、モノカイン及びＩＬ２の如きり：／フオカイン）の如き免疫ＩＩ！ 整剤を含むことができる。 本発明の他の側面は、ヒトを含む動物における免疫応答を強化する方法であって 、ステロールの有機酸誘導体と抗原とを含む組成物の免疫付与投与量を該動物に 投与する工程を含む方法である。 １つの態様においては、免疫応答の強化方法はマルチラメラ小胞体、殊に少なく とも直径約１ミクロンのマルチラメラ小胞体のようなリポソームであるところの 投与調剤を用いることを含む。いくつかの態様において、その抗原はリポソーム 中に取り込まれている。 特別な態様においては、ステロールの有機酸誘導体の塩としてのト・リス（ヒド ロキシメチル）アミノメタン塩を含む投与量が免疫応答の強化方法に用いられる 。他の態様において、その塩形態はステロ−・ルのカルボン酸誘導体（例えば脂 肪族カルボン酸で、特し：炭素数が５までのもの）、ステロールのジカルボン酸 誘導体（例えば脂肪族ジカルボン酸で特に炭素数が７までのもの）の塩、スプロ ールのヒドロキシ誘導体（例えばクエン酸）、ステロールステロールのポリカル ボン酸誘導体の塩である。 免疫応答の強化方法の一態様においては、脂肪族ジカルボン酸はコハク酸である 。 本発明の免疫応答強化方法の特別な態様においては、抗原はタンパク質、ペプチ ド、多糖類、核酸、脂質、糖脂質２リボタンバグ質、リボ多糖類、合成ペプチド 、バグテリア断片、ウィルス断片、ｇ生動物断片、組織断片及び細胞断片を含む 群から選ばれるものである。 本発明の免疫応答強化方法は更にサイトカインの如き免疫ｍ整剤を使用すること を含む。 本発明の他の態様においては、アジュバントを使用することを包含する、人間を 含む動物における免疫応答を強化する方法を包含し２、その際該アジュバントは ステロールの有機酸の塩を含むものである。 特別な態様においては、アジュバントの使用による免疫応答強化方法は、ステロ ールの有機酸誘導体の塩形態がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩又は ナトリウム塩であるものを含む投与調剤を用いるものである。他の態様において は、塩はステロールのカルボン酸誘導体（例えば脂肪族カルボン酸で、特に炭素 数が５までのもの）、ステロールのジカルボン酸誘導体（例えば脂肪族ジカルボ ン酸で特に炭素数が７までのもの）の塩、ステロールのヒドロキシ誘導体（例え ばクエン酸）、ステロールのアミノ酸誘導体、ステロールのポリアミノ酸誘導体 の塩、ステロールのポリカルボン酸誘導体の塩形態である。 免疫応答の強化方法の一態様においては、脂肪族ジカルボン酸はコハク酸である 。 本４を門は更に人間を含む動物に免疫ｄ：答を初回感作（ｐｒｉｍｉｎｇ、−次 刺激）する方法であって、リポソームアジュバント（任意のタイプのリポソーム であってよいが、特にステロールの有機酸誘導体であるリポソーム）吉７ジユバ ントー必須免疫原を含む組成物の投与量１″′１．１を該町１ヤ、フ：二対し、 て投与するこ１′二を包含し、アジユバノドの不存在下でｉ゛ジフハシトー必須 免疫原の迫力口の投、′、トにより免疫反応がＷ〔こ強化され・会様；ニした方 法である。時刻シ゛態様においでは、動物５．７）免疫応答上）υ同感作す・ρ 力と：は、ステ二〜ルの有機酸誘導体Ｖ）塩で、１５−ｙζ該マＡは入子ロール の有機酸誘導体のトす、ス（ヒドロキシメチル）アミノメタ゛■はす）・リウム 塩である饗、。 のと用い３）、ｉ８゜Ｊバシトの不存在下では免疫応答を生ｈｉ、　ｌ、な１） ような免疫原なり（Ｈ（する？’ｊ・・）」感作は、−フ〕も様にβまれミもの である６カ物における免疫応）”←＋）υ１回ｒ”Ｂ　Ｉ乍−ｊｂ（・）也の態 様にお１）では、リポソームは、ステロールのカルボン酸誘導体（例えば脂肪族 カルボン酸で、特に炭素数が５までのもの）、ステロールのジカルボン酸誘導体 （例えば脂肪族ジカルボン酸で特に炭素数が７までのもの）の塩、ステロールの ヒドロキシ誘導体（例えばクエン酸）、ステロールのアミノ酸誘導体、ステロー ルのポリアミノ酸誘導体の塩、ステロールのポリカルボン酸誘導体の塩である。 更に、５ＰＬＶリポソーム、又はマルチラメラリポソーム、特にこれらの１ミク ロンもしくはそれ以上の直径のものも、ホスファチジルコリン、コレステロール 、ホスファチジルセリン又はホスファチジルエタノールアミンを含むリポソーム と同様に用いることができる。初回感作方法の好ましい態様は、アジュバントの 不存在下でアジュバント−必須免疫原の少なくとも１回の追加抗原投与を初回感 作した動物に対して投与することにより該動物に免疫付与することを含む。 本発明の更に別の側面は、人間を含む動物に対し免疫を与える方法である。この 方法は該動物に対して治療的に有効な免疫付与投与剤を投与する工程を含むもの であって、その治療の少なくとも１つの要素は、抗原とステロールの有機酸誘導 体を含む組成物の免疫付与投与量を投与することである。ある態様においては、 二の組成物は更にリポソーム（マルチラメラ小細胞体を含む）を包含し、この場 合好ましくは抗原は直径少なくとも１ミクロンのリボゾームに捕捉されているの である。この方法を採用するに当り２前記組成物は更にステロールの有機酸誘導 体のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩形態、ステロールの脂肪族カル ボン酸（任意に炭素数が５までのもの）の如きカルボン酸誘導体の塩、ステロー ルの脂肪族ジカルボン酸（任意に炭素数が７までのｆＪの、）（例えば′：ｌハ ク＾を）ｌ）如きジカルボン酸誘導体の塩、）こは。 、＾テＩコー、、、ｌｌ、のボ’Ｊ　ノＪルボニ／酸の＠を＾も１゛二とができ る。こ（７）プｊ法の特％ｌＩン；１１においで、は、ｈ：ｊ記徂ム５１′、物 は更にステロールの・′７．ニー〕／庸のム１１きヒトに）キジ酸の誘・難一本 の塩冬・含イ、゛ことができシロ長に、′１１：発明は免子公”・１・１辱没与 量中ζこ免疫原とｌ’）＼ｉ　））Ｃ／Ｄ　Ｌ−ス；′Ｄ　−、、’ｌむ゛含む １゛ルシ゛・ラメラリボゾームとを含む投与形態を侶禽し、−噛様におい（、ｊ に、二の稽“与ｆ［、′熊は更ζ１．水酸イ１ｚ・、ルミニー・リムリシレのＶ 、Ｉｊキ″′計゛）ｂ　Ｈ，二゛二Ｖ”ツムアジ）、パン［・を含む、ｌで）（ ））態様においも゛、は、こｔ、Ｄ　ｊｙｌ与形狐のリボン・−・９＼はモル化 で約２０からＦｊ　８０のコ１、／　、１５０−）Ｌ’　Ｃ：、＜ｔ　Ｌ約８０ カら部１２００’）　ｉ）　Ｍ　Ｐ　ｉｙ　ｋ　’−８ｔｊ　４−＋　Ｌ’）　 テａｂ　奄i、 ど＜　ｌ：　ｌ二の）几・Ｌ：：蘇糸り１３０４．＋□）か↓鷲夙１７ｆ〜・３ １）゛びあり、好ましくは７０・；）Ｏで、Ｂ　６　、持％ｌｉな態様ｊ・、。 おいて、没仲γ態のマルチラメラリポソームはセ’ｉ（−い俗瓜分う′ｆ、（ニ ）１−冒−４■＞々、］］′−コイｌ７）ものひあり、及び５パヌｉ寸直拌が少 なく−１−１１竜・２・ロンの失）（））シーあり、殊ｉニア０て３０のモル比 のＬ）八ＩＰＣ”／“′コし・スー１−′、ノ一一ルミペ１゛１、■である。 （４７ｊ杉態（ア）特Ｈｌｉな可供様ζ２〜才１いて、ｊテＬ原ｉスタン・バイ ア質、ペプチド、多糖〉“１、パリ−，−・ＩビＦ１７１片、パフィルス断ハ、 原生動物断片、合成べ？°千ド階ひ目、ンぐ鴬糖９・ノ）中ン’Ｊ’　”ｒ　ｚ ば才する、贋に、投与形態はサイト力１ンを含む免碍〆り整軸１を１！２．菖４ −　、、：、二、ヒができる。すｊ！ニ、υ゛怪形態ｉま適当な製ン都ｙ、的ｉ 。形体を、左ｊ、）゛ご−、−が”Ｑちる。 木：ｊｐ　ｔｊ、ｉＪ　ｔ−’）他Ｃいイ：Ｉ・ｊ百１↓−還４人間を含むん↑ Ｊ１８けイ）キ、疫応隅′を強化。 ′１′ル方法Ｃある、：＝　ｃ−ｓ　ｔｓ法はｐ　ｄ物１ｒ、対し、抗原と、１ ）〜ｉ　ｉ’　Ｃ／”：ＴＩレスデ「−一ルを含む多層・ノボソームを含し′組 成物（７）免疫イづｌ員を損与すｒ・」程ち含み、この組成物は任意に、更に水 酸化アルミニウムの如きアルニミウム′５−２″−パンｌ−・を６む。この方法 の一態様においては、そのリボ゛、！−ムはモル化で、約２０から約８０のコレ ステロ−、＋１弓ご、対し約８０から約２０のＤ　Ｍ　Ｐ　Ｃを含むものであり 、特にこのモル比は約３０　：　７０から約７０・３０である。この方法の特別 な態様において、マルチラメラリポソームは等しい溶質分布（ＳＰＬＶ）タイプ のものであり、及び／′又は少なくとも直径が１ミクロンのものであ↓、ｌ、殊 に７０　二３０のモル比のＤ　Ｍ　Ｐ　Ｃ、／コレステローノ１畳Ｓ　Ｐ　Ｌ　 Ｖである。 こ１１）方法の特別な態様において、抗原はタンパク質、ペプチド、＠、　ｍ　 ｓ、バクテリア断片、ウィルス断片、原生動物断片、合成ペプチド及びリポ多糖 間からなる群から選ばれる。更に、この方法を用いシ（５，当り、ζ？与量はサ イトｂインを含む免疫調整剤を含むことがでろイ・、更に投与形態は適当な製薬 学的担体を含むことができｂ６ へ発閏ｉ″、’、Ｙ！　ｉこ含まれるものは、人間を含む動物における免疫応答 を強化する方法であり、二の方法はアジュバントを用いることを含むものｋあり 、このアジユバノドとし、ではＤＭＰＣ／コレスラ゛ロールをＮむリポソームを 包含ｌ２、更にある態様において水酸化フ′ルミ！ウムの如きアルニミウムアジ ュバントを含む。この方法（７）　−、、、−Ｂ様においては、リボン・−ムは モル比で、約２０から約８０の；フレステＤ−ルに対ｊ１４．約８０から約２０ のＩ）　ｋｉ　Ｐ　Ｃを含むものであり、特に１′：′のモル化は約３０　：　 ７０から約７ｎ　：　３０ひある。この方性の特別な態様において、マルチラメ ラリポソームは等しい溶質分布（Ｓｐ　ｌ＼１）タイプのものであり、及び／３ は直径が少なくとも１ミ）７Ｌｌンのものであり、殊Ｉこ７０　：　３０のモル 比のＤＭＰＣ／コレステロールＳ　Ｐ　Ｌ　■である。 この方法の特別なｉｌｌにおいて、その抗原はタンパク質、ペプチド、多糖類、 バクテリア断片、ウィルス断片、原生動物断片、合成ペプチド又はリボ多糖類を 含む群から選ばれる。更に、この方法を用いるに当り、投与量はサイトカインを 含む免疫調整剤を含むことができる。更に投与形態は適当な製薬学的担体を含む ことができる。 更に本発明の態様は、ヒト多食む動物の免疫応答を初回感作する方法であって、 ＤＭＰＣ／コレステロールを含むマルチラメラリポソームであることろのアジュ バントと７ジユバントー必須免疫原とを含む組成物の投与量（任意に、水酸化ア ルミニウムゲルの如きアルミニウムアジュバントを含む）を該動物に対して投与 し、アジュバントの不存在下でアジュバント−必須免疫原を追加投与することに より免疫応答が更に強化されるようにした方法である。 特別な場合、この初回感作方法におけるリボゾームは等し、い溶質分布（ＳＰＬ Ｖ）タイプのものであり、及び／又は直径が少なくとも１ミクロンのものであり 、殊に７０　：　３０のモル比のＤＭＰＣ／コＬ／ステロールＳ　Ｐ　Ｌ　■で ある。この投与形態及びこの方法の特別な免疫原は、赤血球凝集素、パラインフ ルエン＋ｆ３　（ツユ−・ジョン及び赤血球凝集素−ニュウミラニダー・ゼ）、 マラリャスボロゾイト断片、肝炎（Ａ、Ｂ及び非Ａ／非１３）断片、骨髄炎断片 、ＨＩ　Ｖ断片（全ての積項）及び黒色腫断片等のインフル：、′−ンぜ断片で ある。 更に別の態様における本発明は、人間を１吃１・動物に対（−免疫を与える方法 である。この方法は該動物に対して治療的に有効な免疫付与治療を投与する工程 を含むものであって、その治療の少なくも１つの要素は、抗原とＤＭＰＣ／コレ ステロールを轡も゛マルチラメラリポソームとを含む組成物の免疫４＝＋　４投 与亀を投与中る二とである、この方法の一側面においては前記組成物は更に水酸 化アルミニウムゲルの如きアルミニウムアジュバントを更に含む。 この方法において、特別なリポソームはモル比で約２０から約８０のコレステロ ールに対し約８０から約２０のＤ　Ｍ　Ｐ　Ｃを含むものであり、好ましくはこ のモル比は約７０　：　３０から約３０　＋　７０であり、最も好ましくは７０ 　：　３０であり、この場合リボソー・ムは特に等しい溶質分布（ＳＰＬＶ）タ イプのものであり、及び／又は直径が１ミクロン以上のものであるリポソームを 包含する。 動物に免疫を与える方法を実施するに当り、抗原はタンパク質、ペプチド、多糖 類、バクテリア断片、ウィルス断片、原生動物断片、合成べ゛プチド及びリボ多 糖類を含有する群から遺ばＪ′１．る。更に、この方法を用いるに当り、投与量 はサイトカインを含む免疫！１１整剖を含むことができ、又適当な製薬学的担体 を含む、二とかｚＳきる。 更に別な側面において、本発明は、抗原とＤＭＰＣ／コレステロール７０　：　 ３０±５（モル）を含むリボソー・ムとを免疫性ケ投与員中に３む投与形態を含 む主・出である。二の投１ｉ−形態は水酸化アルミニーラムゲルの如き７Ｍレミ ニウムアジコバントを更に含むことができる、いくつノ）１の態様においては、 ＋ｃつ１．ｊボソームは３　ｉゝＬＸ’の如きマル千うメラＩ！ボッ−１＼、好 まし７くは直径が少なくとも【ミタロン以上のもの、又はユニラメラ、好ましく は直径が少な・：Ｊ：キノ１ミクロニ／以−１：のｔ・のである。コニラ）′、 ラリボリームを含む投−む゛彫性の店、榎の場合、免疫原（ｊタンパク質、ベブ ブ・ド、Ｓ糖類、バクテリア断片、ウィルス断片、原生ａ物断片、合成ペプチド ８、びリボ多糖類の中から遣ばれ、更１−、サイトカインの如き免疫調整剤や適 当な薬物担体を含む、：とがひきる５更に別な側面において、本発明は、ヒトを 含む動物の免ダ応答を強化する方法を包含し、免疫原とＤＭＰＣ／コレス千ｐ− ルア０：３０±５　（モル）を含むリポソームとを含有する組成物の免疫イｌ与 投与量を該動物に投与する工程を含む方法である。この方法の組成物は、水酸化 アルミニウムの如きアルミニム“７ジエバン１−を更に含むことができる。この 方法におけるリボソーふは５ＰＬＶの如きマルチラメラリポソームやユニラメラ リポソームを１゛むものであって、好ましくは直径が少なくとも１ミクロンのも のである。ユニラメラリポソームを含むこの方法の態様において、抗原はタンパ ク質、ペプチド、多糖類、バクテリア断片、ウィルス断片、原生動物断片、合成 ペプチド及びリボ多糖類の群から選ばれ、更に、サイトカインの如き免疫調整剤 や適当な製薬学的担体を含むことができる。 更に１つの観点において、本発明は、人間を含む動物の免疫応答を強化する方法 であり、アジュバントを用いることを含み、その際そのアジュバントはＤＭ　Ｐ 　Ｃ／コレステロール７０　：　３０出５（モル）を含むリポソームを含む。こ の方法は水酸化アルミニウムゲルの如きアルミニムアジュバントを更に含むこと ができる。 この方法でのリポソームは５ＰＬＶの如きマルチラメラ１ｊボソーム及びユニラ メラリポソームを含むものであって、好ましくはその際、該リポソームは直径が 少なくとも１ミクロンのものであるや更に本発明は、ヒトを含む動物の免疫応答 を初回感作する方法であって、ＤＭＰＣ／コレステロール７０　：　３０±５　 （モル）を含むリポソームであることろのアジュバントとアジュバント−必須免 疫原とを包含する組成物の免疫付与投与量を該動物に投与する工程を包含し、ア ジュバントの不存在下でアジュバント−必須免疫原の炉前投与により免疫応答を 更ζ−強化させるようにした方法であるにの方法は水酸化アルミニウムの如きア ルニミウムアジエベント・を更に含むことができる。この方法でのリポソームｉ ′１ｓＰＬＶの如ぎマルチラメラリポソームやユニラメラリポソームを含むもの であＩＪ、好ましくは直径が少なくともｌミクロソのものである。 更に本発明は、ヒトを含む動物に免疫を与える免疫付与治療を投与する工程を含 むものであってその治療の少なくとも１つの要素は、抗原とＤＭＰＣ／コレステ ロール７０　：　３０±５（モル）を含むリポソームとを含有する組成物の免疫 付与量を投与することである。 この方法における組成物は水酸化アルミニウムゲルの如きアルミニムアジュバン トを更に含むことができる。この方法のリポソームはＳ　Ｐ　Ｌ　’ｖ’の如き マルチラメラリポソームやユニラメラリポソームを含み、好ましくは直径が少な くとも１ミクロンのものである。ユニラメラリポソームを含む態様において、抗 原はタンパク質、ペプチド、多糖類、バクテリア断片２ウィルス断片、原生動物 断片、合成ペプチド及びリボ多糖類の群から選ばれ、サイトカインの如き免疫調 整剤や適当な薬物担体を含むことができる。 遣Ｊ！ＩＬ胆ぶ一五皿 本発明のアジュバントは、リポソームとインフルエンザ抗原とを包含するインフ ルエンザ抗原付与投与形態を包含し、その際該リポソーム及び抗原は抗原付与投 与量中に存在する投与形態を含むものであることが今や発見された。そのような インフルエンザ抗原は赤血球凝集素断片やブロメライン（ｂｒｏｘｅ）ａｉｎ） 断片であ更に、（ｉ）ステロールの有機酸誘導体の塩形態が製薬学的アジュバン ト（特にリポソームの形態で）であること、及び（ｉｉ）ＤＭ　Ｐ　Ｃ／コ１． ノステロールリポソーム（特にマルチラメラリポソーム）が特に有用な製薬学的 アジュバント（そのようなアジユバ〉・ト１′！水酸化アルミニウムゲル中で有 利に用いられる）であることが今や発見された。更に好ましくは、ＤＭＰＣ／コ レステロールリポソーム、マルチラメラ及びユニラメラのいずれでもよく、この ＤＭＰＣ／コレステロール比は７０：３０土５　（モル）である。 免疫学−トの概念を定義するために用いられている種々の用語は１＝、ばしばイ の定義があいまいでありノ一り誤って用いられている。 明確にしておくＩ−めに１本発明の説明においては次のような定義力〜採用され る、 「抗原」とは、抗体により特異的に認識され、及び／又は抗体と結合する物質又 は材料８：意味する。 「）・ジュバ゛トｊは抗原ど共じ用いたときに、免疫応答を高めか物質又は材ｐ を意味すて）。アジ−１バントは、ｙｌ、１キ疫応′Ｓを；、ｉｊ　、９　＜、 またはより大２￥いＬ７；容性で、よ八はより少ない抗原量で’Ｆ　Ａ’ｅさせ る九、ブ）番Ｔち中８０：）：’＋る。　（７ジ二Ｉ〈〕−トー必噴免疫原Δど はそ第１単独では″・免疫原もこはならないがアジュバントと共に甲い５ときに 免疫原と７．’、、Ｈ、！Ｎ　、ｉ’、うな抗原をｉス機する、「免疫原ｌは、 それＮ１独又はアミノノリ・１・と共に犀いたときに免疫応答を誘引てきる物質 Ｖは材料（抗ｒ９．を＾ｔ、゛）も意味１Ｓ。 天然及び合成物質のいずオ〕キ、富、笹原でオ）り得る、免疫原に、一般には、 タニ・べ・′）質、ペプチド、４．糖類、該タニ、バク、リボ々ンバク、合成ポ リペプチドであり、又はタンパク質、ペプチド、多糖類、核タンパク、もしくは 、合成ポリペプチド又は他のバクテリア、ウィルス又は原生動物の断片に結合し たハブテンである。 「免疫原」なる語は、「アジュバント−必須」免疫原とよぶところの、アジュバ ント（例えば小さなペプチド）と共に用いない限り免疫応答を生じ得ない（又は 治療的に効果が無い程度にしか生じえない）物質も含むことを理解されたい。 ｒ免疫応答」とは、抗原又は免疫原に対する動物の免疫システムの特異的な応答 を意味する。免疫応答は抗体の生産を含む。 「免疫付与条件」とは、免疫応答に影響をおよぼす因子を意味し、それは人間を 含む動物に対して搬送される免疫原もしくはアジュバントの量と１頴、搬送方法 、接種の数、接種の間隔、被検動物の種類及びその条件を含む３ 「ワクチン」とは、免疫を誘起できる製薬学的調剤を意味する。 「免疫」とは感染生物もしくは物質に対する人間を含む被検動物の耐性状態を意 味する、ここで感染生物もしくは物質は広義に定義されており、バクテリアやウ ィルスばかりでなく、寄生虫、事物、がん、及び細胞も含むものであることを理 解されたい。 １治療的に効果的な免疫付与治療」は抗原に対する特異的な抗体の生産及び、／ 又は免疫細胞の反応性により示されるような免疫応答を生じる。 「免疫役俟付与量ｊは免疫応答を促進するに必要な抗原又は免疫原の量を意味す る。この量は種々のアジュバントの存在やその有効性によ番、１変化する、この 量は動物によっても変わり、抗原、免疫原又はアジュバントによっても変わる。 しかし、一般には、一度の接種につき約０．１μｇ７’ｍｉ又はそれ以下から約 ５００μｇ程度であ・へう４、免疫付り・投与織は当業者によく知られｔ、−ｐ 法、例えば統計学上有効なホスト・動物の免１］付与及び銹、１研究を行う二と により、容易に決定できる。例えば、０−ズアンドフリートマン（Ｈ，Ｒ，Ｒｑ ）ｓｅ　ａｎｄ　Ｈ，Ｆｒ１ｅｄ＊＋ａ＋＋）の「１宋免疫学マニュアル」、〒 メリカン・ゝ１′す１′ニテイ・７オア□・マイクｌＪ、Ｉべ、１′オＣジーロ 　ミノニ・ト　ン　Ｄ、、　Ｃ，、（Ａ’１ｅｒｌｃｉ：１１Ｉ　ＳＯＩ：ｉｅ Ｔ：’＋’　ｆｏｒ　ＭｉＣｒＯＤｉ＋１］Ｏ呂島　Ｗａ■ Ｉｌｉｎｙｖｏｎ、　Ｄ、Ｃ，）　（１９”１１つ）’ａ　参５Ｎれたい。ある 場合には、遣加抗原投与免を含むいくつかの免疫投砂付与１が免疫を生じさせる べく投与され５が、こねは集合的（二、　「治療的に効屏的な免疫付与治療」と 呼５．へ；ことと７６８ １”初回感作（ｐｒｉｍｉｎｇ、−次刺激）コとは、抗原に対する動物によ５− 次的（これはＥ次的又は高次的に剣ず５語である）な応答の刺激を意味する。− 次的応答は、動物による抗原に対する抗体の生産に特徴づけらオ］るが、理想的 （、゛は迅速化と相当量の抗体の生産を伴うところの、二次もしくはその後の免 疫誘発（これはアジュバントの非存在下であっても起こる）に応答するＢ−リン パ球や′ｒ−リンパ球群の生成により特徴づけられる。このような応答に基づい て、アジュバントの不存在下で、１．２．３又はそれ。 以、ヒの免疫原の溶加抗原ｒ”４承により抗原に対する治療上効果的な免疫応答 が生じる。 本発明の特別な態様においては、リボーノームは電荷を有するか又は中性であ６ ６電荷を帯びた、特に負に帯電したリポソ・−ムは中性のリポソームよりもより 優れたアジュバント性を示す。 リポソームを生成するための蛇ましい脂質はへミコハク酸コレスチロール（ＣＩ −Ｉ　Ｓ　）のものであり、特に対イオンとしてサトリウムを持つもの（ＣＨＳ 　ｓｏｄｉｕｍ）又はトリス（ヒドロキシメチノＩ）アミノメタンを持つもの（ ＣＨＯｔｒｉｓ）であり、こわらは通常負にｆｌしている。 本発明ではコレステロールの有機酸誘導体の塩形態を用いることができる。一般 に５有機酸の結合により変性され得るいかなるステロールも本発明の実施に使用 できる。例えば、そのようなスクロールどしては、コレステロール、ビタミンＤ 、フィトステロール（例えば５シトステロール、カンペステロール、スチグマス 予Ｏ−ル等であるが、これに限るものではない）、ステロイドホルモン等が挙げ られるが、これに限定されるものではない。 ステロールの誘導体を形成するところの有機酸としては、カルボン酸、ジカルボ ン酸、ポリカルボン酸、ヒドロキシ酸、アミノ酸及びポ１１アミノさんが挙げら れるがこれに限定されるものではない。有機酸の水への溶解度は塩の形態にする ことにより増大するので、いかなる有機酸のステロールの誘導体化に用いること ができる。しかしながら、有機酸自体が水溶性であることが有利である。そのよ うな水溶性有機酸としては次のようなものを挙げることができるが、これに限る ものではない。酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸等の水溶性脂肪族カルボン酸 （注：炭素数４以下のものが水と混和し、炭素数５の遊離の酸は一部水に可溶で 、それより長い鎖の遊離の酸は実際上水不溶性である）　；マロン酸、コハク酸 、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、マレイン酸等の水溶性脂肪族ジカルボ ン酸（注：短い鎖のものは水により溶けやすいことが知られており、炭素数６な いし７が水溶性の上限のものである）；ヘミメトリ酸、チロメシン酸、コハク酸 イミド等の水不溶性芳香族ジカルボン酸；ポリカルボン酸；グリコール酸、乳酸 、マンデル酸、グリセリン酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸等の水溶性ヒドロキ シ酸（注二カルボニル基のα−位に側鎖を持つα−ヒドロキシ酸は加水分解しに くく、本発明に有利に適用されル）；そして任意のアミノ酸及びポリアミノ酸。 有機酸は、従来法に従ってステロールの水酸基に対し、エーテルもしく」すエス テル結合により結合させることができる（例えば、米国特許第３，８５８，０４ ７　、４，０４０，７８４　、４，０４２，３３０　；　４．１８３，８４７　 、及び４．１８９，４００参照）。ステロール誘導体の塩形態はステロールの有 機酸誘導体と塩の対イオン（例えば塩の遊離塩基）を適当な揮発性溶媒に溶解し 、溶媒を蒸発もしくは同様な技術により除去してステロールの有機酸誘導体の塩 から成る残渣を得ることにより製造することができる、使用することのできる対 イオンとしては、相当する塩を形成するためのトリス、２−アミノ−２−メチル −１，３−プロパンジオ−・ル、２−アミノエタノール５ビス−トリスプロパン 、トリエタノールアミン等が挙げられるが、これに限るものではない。実際、ミ コナゾール遊離塩基等のイオン化し得る生物活性剤の遊離塩基が対イオンとして 用いることができる。 ＣＨ３は、これを水性材料に加える時、リポソームを形成する。 これは２０〜２５℃（室温）で常、千下で行うことができる。二のり９パソーム 形成方法は撹拌により促進され、撹拌は渦流、超音波又はその他の公知の方法に より行わｊる。得られたリボーノームは、所望に応じ、０．４又は０．２μｍフ ィルター（Ｎｕｓｉｅｏｐｏｒｅ、　Ｐｌｅａｓａ！１ｔｏｎ。 カリフォルニア）等の積層フィルターを通すことによりろ過、又はサイズに分け られる。脂質の量が多いほうがアジュバント応答性がよくなることが観察されて いる。ＣＨＳリポソームにおけるメラ、！−マ抗原のように、リポソーム薄膜中 に分割する免疫原は、くり返し接種を行ない且つ追加の免疫刺激を行なわないと 免疫応答が不十分と成る。特別な理論に縛られるものではないが、この分割によ り抗原決定基がアジュバントリポソームの外に露出するのが制限されるものと考 えられる。免疫原は、アミノ酸の付加ヌは削除、又は他の基との共役によるなど の当業者に熟知された多くの方法により変性できる。 リポソームを形成するための好ましい脂質の種類はシミリストイルホスファチジ ルコリンとコレステロール（ＤＭＰＣ／コｌノルテロ・−ル）から成るものであ る、Ｄ　Ｍ　Ｐ　Ｃ／　Ｄレルテロールは約１００：１（モル）から約２０　： 　８０にわたる広い範囲で所望のマルチラメラリポソームを形成するっこの比の 更に好ましい範囲は約７０＝３０から約３０　＋　７０で、最も好ましくは約７ ０　：　３０である。ＤＭＰＣｌつｌノルチロールには、シミリスト・イルホス ファチジルグリセリロール、ジセチルホスフエ−１・、ホスファチジン酸、ホス フ′・′ナジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン及びヘミコハク酸コレ ルステロール（ＣＨ３，例えば対イオンとしてナトリウム（ＣＨＳ　５ｏｄｉｕ ＋ｎ）ヌはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｃ）ｉ　Ｓ　ｔｒｉ、ｓ ）を用いたものの如き他の脂質を混合することができる、アルミニウム化合物は よく知られたアジュバントであって、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム 、酸化アルミ＝、カム又は硫酸アルミニウムを含むものであり、こ７１らは集合 的にアルミニウムアジュバントとよばれるであろう１例えば、水酸化アルミニウ ムは獣医薬への応用の他にシフテリでや破傷風毒素ワクチンに広く用いられてい る、水酸化アルミニウム粉末は水和により自然にゲル・を形成するい水酸化アル ミニウムを含むワクチンを製造するために、通常あらかじめ形成したゲル中に水 性緩衝液中の免疫原を加える、このようなワクチンをアルミニウムー吸着ワグチ ンとよんでいる。 ５ＰＬＶ法によるＤＭＰＣ／コレルテロールマルチラメラリポソームが好ましい が、他の種類のリポソームも用いることができる。５ＰＬＶ法は一般に、丸底フ ラスコ中で溶媒中の脂質を回転蒸発させて薄膜を形成することを含むものである 。この脂質薄膜をエーテルやメチレンクロライドのような水と混ざらない溶剤中 に分散させ、次いで水性溶質（免疫原を含む）を加える。混合物を次に、有機溶 剤を追い出すべく窒素ガス気流により乾燥させながら超音波処理する。得られた リポソームペーストを水性緩衝液中に再分散させる。このような方法はレンダ等 の米国特許第４，５２２、８０３号に述べられており、ここに参考のために記載 する。所望により得られたリポソームを０．４又は０．２μｍフィルター（Ｎｕ ｃｌｅ。 ｐｏｒｅ、　Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、カリフォルニア）の如き積層フィルターを 通すことによりろ過、又はサイズに分けられる。 得られたリポソームは水性材料中で有利に投与される。水性材料の量は投与され るリポソームにより変化し、特に限定されるものではないが、通常的０．５ｍ　 ｌが便宜的なリポソームの投与量である。脂質の量が多いほどより良いアジュバ ント応答性が見られる。 ステロール又はＤＭ　Ｐ　Ｃ／コレルテロールリポソームのためのいずれにも適 当な水性材料は生理食塩水、リン酸緩衝液又は他の公知の水性の製薬学的希釈剤 である。 これらのリポソームは免疫付与量の抗原又は免疫原と連合させると好都合である 。この連合は混合、吸着、カプセル化、共形成、もしくは他の当業者に熟知され た方法により達成できる。 本発明のアジュバント効果は、ステロールリポソームについては表１，２及び３ の結果から、ＤＭ　Ｐ　Ｃ／コレルテロールコノボソームについては表４，５及 び６の結果から、及びステロールとＤＭＰＣ／コレルテロールの両者については 表７の結果かられかる。 表ＩＡは、インフルエンザＢ　／　Ａ　ｎ　ｎアーバー赤血球凝集素（ＨＡ）単 独とこれをＣＨ５ｔｒｉｓリポソームと調合したものによりそれぞれ免疫化した モルモットにおける免疫応答を比較したものである。ＨＡはアジュバント無しで ある程度の免疫応答を誘導するが５この応答性はアジュバントにより増強される 。ＣＨＳｔｒｉｓ　リポソームは、その結果から、この抗体産出を強化すること がわかる。特にＨＡがステロイドアジュバントと共に投与される場合は、ＨＡの ５又は０．５μｇに対するＨＡＩにより検出された中和抗体応答性はそれぞれ５ ０倍及び７０倍に増大している。 表ＩＢはＨＡ（ＨＡ、Ｂ）のプロメライン断片を種々に調合したもので、免疫化 したモルモットにおける抗体応答を示したものでおる。ＨＡ　Ｖは単独で接種し た場合は１通常免疫原性ではなく、アジュバント−必須免疫原の例である。ステ ロイドアジュバントをＣＨ５の形態で用いることにより、完全フロインドアジュ バントと同等もしくはそれ以上の免疫応答の増加が得られ、特にＨＡＩで検出さ れるような保護性の中和抗体の産出において顕著である。この増大は約１４００ 倍である。更に、アジュバントの量を増大させると免疫応答性は増大する。 表２は免役応答の発現に初回感作が重要であることを示すものである。ＨＡＢは 弱い免疫応答を示し、そしてそれは本発明のアジュバントを用いても二次誘発に よってそれほど強化されない、しかしながら、ＨＡＢが本発明のアジュバント（ ここではＣＨ８ｔｒｉｓ　リポソームの形）と共に投与されるときは、第２回の ＨＡＢ接種（ここでは溶液の形態）を行なうことにより大きな免疫応答が生じる 。被検動物にたいしてアジュバント−必須免疫原とアジュバントから成る初回感 作することにより、アジュバントを含まない嵐にアジュバント−必須免疫原の溶 液である後の追加の投与効果を高めるということは、本発明における重要な一側 面である。本発明のアジュバントによる免疫応答を初回感作することが、たとえ この免疫原がアジュバントと共に投与せずには免疫応答を当初は生じないもので あろうにせよ、アジュバントなしのアジュバント−必須免疫原の追加投与を可能 （こするのである。本発明のこの態様においては、アジュバント−必須免疫原と 共に用いるべき初回感作アジュバントとしては単にステロイドリポソームだけで なく、他のいかなるリポソームも使用できるという点に注意さｔたい。 表３は、抗原が本発明のアジュバントリポソームと単に混合されているので１− なく、それに捕捉されている場合により優れた結果が得られることを示すもので ある。これは特に初回感作応答性を考える場合Ｃ−あてはまる。表３のデータを 表２のデータと共に考慮すると、この捕捉が第二次の応で以上に第一次刺激の応 答性の強化国【である、′とがわかる。友３は又、塩をトリスがらナトリウムに 変えてもＣ，ＨＡリポソームによるアジュバント効ツ、が変わらないことを示（ 、ている。 表４はイ〉フル；ンザＢ　／　Ａ　ｎ　ｎアーバー赤血球凝集素（Ｈ、ＡＢ）の ブロスライン断片を種々の形態でモルモットを免疫化した抗体応答を比較したも のである。ＨＡ　Ｂは単独で投与ヌは水酸化アルミニウムゲルと共に投与しても 免疫付与効果が悪いことがらアジュバント−必須免疫原である。しかしその免疫 付与性は種々。 のモル比と脂質温度におけるＤ　Ｍ、　Ｐ　Ｃ／コレステロールＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖ 内に捕捉された場合は著しく増大する。ＨＡＢをＤ　ｆｖｌ　Ｐ　Ｃ／コレステ ロールＳ　Ｐ　Ｌ　Ｖ２Ｏ：　７０及び７０　：　３０のモル比で投与したとき には、ＥＩＡにより検出される余技ＨＡＩｇＧ応答性は５．　ｏｏｏ倍にまで増 大し、ＨＩＡにより検出される保護中和抗体は６週間で３５倍にまでそれぞれ増 大しているａ５０：５０モル比の組成に示されるように、脂質濃度を増大するこ とによりアジュバント効果は増大する。 表５はＤＭＰＣ／コレステロールＳＰｉ、■（モル比７０　：　３０）によるイ ンフルエンザＢ　／　Ａ　ｎΩΩアバー赤血球凝集素（ＨＡＢ’）に対するアジ ュバント効果を示すものである。遊離の状態で５μｇの投与量でＨ，Ａを投与す る場合、ＨＡは比較的良好な免疫原であるが０．５μｇの投与量では低い抗体量 しか示さない。一方リポソームのＨＡはこれらの投与量でも遊離のＨＡの場合の ８０倍までの応答性を示す。 表６は、Ｄ　Ｍ　Ｐ　Ｃ／コレステロール５ＰＬＶと水酸化アルミニウムゲルの アジュバント効果を示すものである。表６の実験■の結果から、ＨへＢをＤ　Ｍ 　Ｐ　Ｃ／コレステロールリポソーム（初期脂質濃度２００ｍｇ）と共に投与す ることにより、ＨＡ　Ｂ単独の場合の１００倍までの強い抗−）（ＡＩｇＧ応答 性と１０倍までのＨＡＩ（中和）抗体力価を示す。この初期１ＡＩｆを５００ｍ ｇに増やすとアジュバント効果は更に（それぞれ５００倍と３０倍）増大する。 同様な組成を水酸化アルミニウムの組合せによるアジュバント効果は表６の実験 ＩＩから明らかである。第１番目の実験の場合と同様に、リポソームのＨＡ　Ｂ は遊離のＨＡＢ　（５μｇ投与量）の２００倍の抗体応答の増大を示している。 これを水酸化アルミニウムを共に投与する時は抗体力価は更に５倍の増加を示す 。最も注目すべきは０．５μｇのリポソームＨＡＢの投与量を水酸化アルミニウ ムと共に投与すると５μｇのリポソームＨＡＢの場合と同等な応答が見られるこ とである。 表７はインフルエンザウィルスを洗剤で分割した後、ワクチン化に用いたＨＡに ついて得られた結果を示すものである。表７の結果は、抗原が１３．６ｍ　ｇの 脂質１．９ｍｇの脂質のどちらかに捕捉されているかにかかわらず、ＣＨ３ｔｒ ｉｓ　リポソーム中の５　ｍ　ｇのＨＡは強いアジュバント効果を誘導すること を示している。ＤＭＰＣ／コレステロール組成物の場合も同様な結果を与える。 更に、ＣＨ３ｔｒｉｓ組成（０，５μｇ　）（Ａ）の１／１０希釈物は０．５又 は５μｇＨＡの非捕捉抗原対照の数倍高い値を示している。以上の結果を総合す ると、組成中の脂質含有量を減じてもリポソームのアジュバント効果に悪影響を 与えないことがわかる。 アルミニウムアジュバントは当業者に熟知されている形態、組成で用いられる。 破傷風毒素のようなワクチンを含む水酸化アルミニウムゲルの市販品は１ｍｌ当 り約０．２ないし１ｍｇのアルミニウム量の範囲である。ヒトに対する安全許容 量はこれよりはるかに高く、獣医学上の応用の場合には１投与量当り１５ｍｇ以 上の水酸化アルミニウムを有するワクチンも制限無く知られている。 ワクチンは投与形態で便利に投与される。「投与形態」なる語はワクチンを投与 するいかなる薬物形態をも意味するものと理解されよう、投与形態は、皮下、経 口、筋肉内及び点眼投与を含むものであり、生きた、希釈した又は合成もしくは 部分形態でワクチンをアジュバントと共に、そして任意にサイトカインの如き免 疫！！ｌ整剤と共に用いるものである。ヒトを含む被検動物になるべく容易に且 つ効果的に免疫応答を誘導するのに適合した投与形態となるように上述の要素が 組み合わされる。 本発明の方法によりもたらされるリポソーム投与形態を含む投与形態は、ヒトを 含む哺乳動物の如き動物において、免疫原をその生物活性形態で供することを要 求する感染又は状態を処理する際に治療的に用いることができる。このような状 態はワクチンにより処理できるような病気の状態を含むものであるがこれに限る ものではない。免疫応答性組織の体外処理も又意図するものである。 投与形態は又、アルミニウムゲルなどのゲル、液晶、粉体、沈殿及び溶液に導入 したアジュバントばかりでなく、ミセル形状のアジュバントを含む。特別な態様 においては、投与形態は単一投与に適合及び形成されたユニット投与形態である ことができる。 投与形態の投与の方式により、投与形態が加えられる生物体の部位及び細胞が決 まる。本発明のリポソーム投与形態を含む投与形態は単独で投与できるが、通常 は意図する投与ルート及び標準的な薬物プラクティスに関連して選ばれる製薬学 的担体との混合物として投与される。投与形態は非経口的、例えば、皮下もしく は筋肉内に注射できる。投与形態は、又、経口的に投与できる。 非経口的投与の場合、投与形態は例えば無菌水溶液の形で用いることができ、こ の場合、他の溶買、例えば溶液を等張化するのに充分な塩やグルコースを含有さ せることができる。調剤の特別な性質によっては他の使用法も当業者により考え 得る。 ワクチン治療に応える病状の予防又は治療的な処理においてヒトに投与する場合 、処方医師は被検者に対し適切な治療的に有効な投与を決定するが、これは患者 の性質と重症度ばかｉノでなく個々の年齢、体重、及び対応により変わると考え られる。リポソーム投与形態における抗原の投与は、通常、遊離の抗原の際に用 いられる投与量とほぼ同じがそれよりも少ないが、場合によってはこれらの限界 外の投与を要することもあろう。 実施例１ 五ｌヱ」Ｊ」、ゴ強ヨＳ二一トリボソニ」−ＣＨ５ｔｒｉｓ　（粉体）　５０１ ｇを１５ｍ１の試験管にとり、これに１００１、Ｊ　１（７）　ＨＡ　ノブＯメ ラ４シ断片ノ水性緩衝液＜６７３ｕｇのＨＡＢ（７）０、ＯｉＭのリン酸緩衝０ ．９重量シＯＮ　ａ　Ｃ１食塩水）を加えた。混合物を２２．５±２．５℃で２ 時間断続的に撹拌し、大きな塊が見えなくなるまで放置した。得られたりボゾー ムを１０口１の水性緩衝液で３回洗浄し２、各洗浄の度にＩＳ分遠心（ＩＯ，０ ＯＯｒ、ｐ、ｖ、、　Ｊ−２００−タ（ベッ々マ〉・、バロカル）・、力）Ｉフ ォルニア））分離した。最終的に得らｊたべ！、・・ソトに緩衝液を加えて４． 抛ユどし５、窒素下で琥珀色ガラスひんに封入した。 実施例２ −ｕｋＪ　ｔ　Ａ　”御名’−、；　、び≦と一トユＬづら″二ニゴ＼２と斃− 上ユ。 Ｇ　ｌ（Ｓ　ｔｒｉｓ　（粉体）　、′１００＊）；　を１５ｍ１　の試Ｍ’ｆ にとｊ、ｉ、ご」１に１ｍ１のＨ、Ａｌの水性緩衝ｅｆ　３００　ｕ　ｙ、のＨ Ａ　（７）　Ｏ，Ｏｌ＼１の−ｉ　：ｚ　＠　＜９．　＆　０．９重−歇％さ丁 ａｃ１食塩水）を加えた、。混合物を２２．　Ｄ±２．５°ｃ７・り時間断続的 にｆ＃、ｆ９　Ｌ、た４、得らｊ〕たリボソ、−ムをｌ　ｌ）ｒ：ｌ　１の水性 緩衝ぺび：３同洗浄し１、各洗浄の変に１５分遠心（ｉ　０ｒ　０ＯＯｒ、ｐ　 −ｍ−＋　Ｊ−ｃｏ　Ｄ−文（＜ツクマン、バロカンレト９カリ７オルニ７）） 分離した。２紋的に得ら２またべＬラミ・に緩衝液を加えて４．Ｏｍｌとし、窒 素下で琥珀色ガラスびんに封入した。 実施例３ ■　するアジュバントリポソームの１に（：、Ｈ３ｔｒｉｓ（粉体）　５００ｍ ｇを１５ｍ１の試験管にとり、これに１ｍｌのＨＡのプロメライン断片の水性緩 衝液（６７ａ　ｕ　ｇのＨＡの０．０１Ｍのリン酸緩衝０．９重量％ＮａＣ］食 塩水）を加えた。混合物を２２．５±２．５℃で２時間断続的に撹拌した。得ら れたリポソームをｌｏｍｌの水性緩衝液で３回洗浄し、各洗浄の度に１５分遠心 （１０，０００ｒ、ｐ、ｍ、、　Ｊ−２０ロータ）分離した。最終的に得られた ベレットに緩衝液を加えて４．０＋ｘｌとし、窒素下で琥珀色ガラスびんに封入 した。実施例４ 皿１ユ」ま」ｌ」−６−バ之土ユず一又二り豆粕ＬＬＣＨ５ｔｒｉｓ　（粉体） 　５０ＣｒｆｆＩｇを１５ｒＱｌ　の試験管にとり、これに２Ｉｌ１１のＨＡの プロメライン断片の水性緩衝液（］Ｉ００ｕｇのＨＡＢｏ。 ９重量％ＮａＣ１食塩水）を加えた。混合物を２２．５±２．５℃で２時間断続 的に攪拌し７ノと。得られたリポソームをｌｏｍｌの水性緩衝液で３回洗浄し、 各洗浄の度に１５分遠心（ＩＱ、０００ｒ、ｐ、ｍ、、　Ｊ−２０口・−タ）分 離した、最ｆ的に得られたベレットに緩衝液を加えて４．０＋ｎｌどし、窒素下 で琥珀色ガラ。（びんに封入した。 実施例５ 茄Ｊ更−Ｕ」二・トニ乙ｊＬ互−ぷン６０、ト巳り其ｙ二翼＼℃−斃込二、Ｃ！ −（Ｓ　ｔｒｉｓ　（粉体）　１５００ｍｇを１！５；＋＋１の試験管にとり、 これに３ｈ＋ｌのＨＡのプロメライン断片の水性緩衝液（６７３ＬＩ　ＥのＨＡ Ｂの０゜０１１’、４のリン酸緩衝０．９重ｉ％ＮａＣ１食塩水〕を加λた。混 合物を２２．５±２．５°Ｃで２時間１ｒ？もｉ的に撹拌した。得られたリポソ ームをｌｏｍｌの水性緩衝液び３：しコ洸浄１、各洗浄の度に１５分遠心（１０ ゜０００ｒ、ｐ、ｍ、。、Ｊ　−２０ロータ）分離した。最終的に得られたベレ ットに緩衝液を加えτ４．Ｏｍｌと＋５、窒素下で琥珀色ガラスびんに圭１人し た。 実施例（３ 幻Ｉ工ぢ二工記長−巳ｊ１ヱ−リＩ」二ＣＨＳ　ｔｒｉｓ　（粉体）　５００ｍ ｇを１５ｚｌの試験管にとり、これに１ｍｌのＨＡのプロメライ〕・断丼の水性 緩衝液（６７３ｕｇのＨＡのＴ’ｌ、０１Ｍのリシ酸緩衝０．９重素％ＮａＣ１ 食塩水）を加。えた。混合物を２２．５±２．５°Ｃで２時間断続的に撹拌した 。得られたリポソ・−ムを１０Ｉｌｌｌの水性緩衝液で３回洗浄し、各洗浄の度 に１５分遠心（１０，００Ｏｒ、　ｐ、コ＋ｌ　Ｊ−２０ロータ）分離した。、 最終的に得ら、れたベレットに緩衝液を加えｒ４．Ｏ＋ａｌとし、窒素下で琥珀 色ガラスびんに封入した。実施例７ ヱジユバ２−と豊玉： ＨＡＢを含むリポソームは実施例２のようにして製造した。捕捉価は５ＲＩＤに より決定した。リポソームを生理食塩水で希釈してｌＯｕｇ蛋白／蛋白７レｌゴ ム栓圧縮封入によりガラスびんに封入した。 ５匹の４ご０〜５００ｇのモルモット（バックベルブラボマンマルス。 ランデイスストア、ペンシルバニア）の右後足に上記リポソーム分散液０．５＋ ｎｌ又はＨＡＢｏ、５ｃｌを筋肉注射した（５重ｇ）、免疫付与から４週間の後 、モルモ・ソトｉ二軽くエーテルで麻酔をかけ約４＝１の血液を心臓穿刺法によ り吸引した、血液を室温で一晩放置して凝固させた。血液を遠心分離し、血清を 吸引して試験まで４℃で保存した。採血の翌日に０．５ｍｌの遊離又はリポソー ム）（ＡＢ（５重ｇ）を左後足に筋肉下注射した。その後、最初の注封から〕年 まで上記と同様にして採血した。 血清中の全粒ＨＡのＩｇＧ抗体をエユザイムイムノアッセイ（Ｅ、ｌ′Ａ″ｌで めると共に、中性抗体を赤血球凝固イ〉・ヒビジョンアッセイ　（ＨＡ　Ｘ　） で測定した、結果を表１．２及び３に示す１、実施例８ 肌」ＬとＪＬす１Ｔ１−ン、：Ｌガレ−１・２ムボ巳仁二為上−１００ｍ　ｇの コレステロールど４０ＤｍｇのＤＭＰＣを５００ｍ１の丸底フラスコに入れ、３ ｊ′ｎｌのクロロホルム中に分散後回転蒸発にｊ−ノ、乾燥してフィルムを得た 。次いで２０ｍ１の無水エーテルをプラス−に加え、更に１．５ｍ１Ｃ）ＨＡの 水性緩衝液（９１５ｕ　ｇ　ＨＡ　。 ０、ＯＩＭリン酸緩衝食塩水０．９％Ｎ　Ｂ　Ｃ１）を加えた７混合物をフォイ ルでゆるく覆い、４０℃のウォーターバス中で窒素ガス気流下エーテルを留去！ 、７ながら超音波処理した。＄ｔられた脂質ペーストを窒素下でエーテル臭が感 知できなくなるまで徹底的に乾燥した。 １０ｍ１の緩衝液をフラスコに加え、リポソーム分散液を１５ｒｙｘｌの試験管 に移した。このリポソームを】Ｏｍｌの水性緩衝液で３回洗浄した。各洗浄毎に １０分間遠心分離した（１０，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、、　Ｊ−２００−タ（ベラ・ クマン、バロアルト、カリフォルニア））。ベレットを緩衝液で６．Ｏｍｌにし て窒素下で琥珀色ガラスびん封入した。 実施例９ 五ＬＥ虹９０ｊＡΔ云−１亡亡躯ｍ丞二１００ｍｇのコレステロールと４００ｍ ｇのＤＭＰＣを５００ｍ１の丸ｊこフラスコに人ね、３ｎ）１のクロロホルム中 に分散後回転蒸発により、乾燥してフィルムを得た、次いで２０ｍ１の無水エー テルをフラスコに加え、１．５ｍ　ｌのＨＡの水性緩衝液（１，０００ｕ　ｇＨ Ａ　。 ０．０１Ｍリン酸緩衝食塩水０．９％ＮａＣ１）を更に加λた。混合物をフォイ ルでゆるく覆い、４０℃のウォーターバス中で窒素ガス気流下エーテルを留去し ながら超音波処理した。得られた脂質ペーストを窒素下でエーテル臭が感知でき なくなるまで徹底的に乾燥した６１０ｒｎｌの緩衝液をフラスコに加え、リポソ ーム分散液を１５ｍ１の試験管に移した。こ、Ｄリポソームをｌｏｍｌの水性緩 衝液で３回洗浄（−１た。各洗浄毎に１０分間遠心分離し、た（ｉｏ、ｏｏｏｒ 、ｔ）、ｍ、、　Ｊ−２０ロータ（ベツグマン、バロアルト、カリフォルニア） ）、べし・・！トを緩衝液で６、Ｏｍｌにして窒素下で琥珀色ガラスびん封入（ たゎ 実施例１０ 二星玉ｆｌユジュバニトリボン二ム二」とＬ二９２ｒｎｇのコレステロールと１ ０８ｍＨのＤＭＰＣをｌｏＯｍｌの丸底フラスコに入れ、３ｍｌのクロロホルム 中に分散後回転蒸発により、乾燥して：フイルムを得た８次いでｌｏｍｌの無水 エーテルをフラスコに加λ、更に２．ＯｍｌのＨＡＢの水性緩衝液（１，１０１ ００ｕ　Ａ　Ｂ　、　Ｏ，Ｏｉ　Ｎｉリン酸緩衝食塩水０．９％Ｎ　１１．　Ｃ Ｊ　）を加えた。混合物を７プ１ルＣゆＳく覆い、＋ｏｒのウォーターバス中で 窒素ガス気流］−工−子ルを留去し、ｔ：がら超音波処理（Ａ−０得られた脂質 （〜ストを窒素五でエーテル臭が感知でき１・＜なりまで徹底的にうン燥（た、 １０　ｍ　ｌ　（７，）緩衝液をフラスコ（−加；【、リポソーム分散液？ｊｉ ５゜、１１の試験管に移し、た、このリボ゛、゛〜ムをｌｏｍｌの水性緩衝敵で ：（ｌ（’ｌ　：１　ｊ’？　ｌ−た、各洗浄毎１’Ｔ、　Ｉ　Ｏ分間遠心分子 ｆｌし、た（１０．０ＯＯｒ、　ｐ、ｍ。 、　、’、−２０１ニア、−タ（−りパ・・／フマン、パ０：″ル；・、カリフ プルニア））、ベレ・・・ｉ・を緩＆液で６．０ｍ　ｌ　：：　ｌ−て窒素下で 琥珀色“、Ｌｊ’ラスτｒん封入し。 実施例１１ ■−力３．ゴ’＝　ｆｆ−二ミニー；λ二ニーー名ｌ二；Ｌ−乙メｊ−、ｊミ丑 」づ±Ｆ、４二ムー、］１−４０ｍｇのコレステロールと１６０ｒｎｇのＤＭＰ Ｃを１００ｍ１の丸底フラスコに入れ、３ｍｌのクロロホルム中に分散後回転蒸 発により、乾燥してフィルムを得た。次いでｌｏｍｌの無水エーテルをフラスコ に加え、更に２．０ｒｒｉｌのＨＡＢの水性緩衝液（１，ｌｏｏｕｇＨＡＢ、０ ．０１Ｍリン酸緩衝食塩水０，９％Ｎ　ａ　Ｃｌ　）を加えた。混合物をフォイ ルでゆるく覆い、４０℃のウォーターバス中で窒素ガス気流下エーテルを留去し ながら超音波処理した。得られた脂質ペーストを窒素下でエーテル臭が感知でき なくなるまで徹底的に乾燥した。１０ｍ１の緩衝液をフラスコに加え、リポソー ム分散液を１５ｍ１の試験管に移した。このリポソームを１０ｍ　ｌの水性緩衝 液で３回洗浄した。各済浄毎に１０分間遠心分靜した（１０，０ＯＯｒ、ｐ、ｍ 。 、　Ｊ−２０ロータ（ベックマン、バロアルト、カリフォルニア））。ペレット を緩衝液で６．Ｏｍｌにして窒素下で琥珀色ガラスびん封入し。 たい 実施例１２ リポソームベレットたヱＬΦ）亘ニ ア、２ｎｍ　ｇ　／　ｉのアルミニウム＼を含む２％の水酸化アルミニウムゲル （Ａｌｍｙｄｒｏｇｅｌ　（商標）；フンノーラボラトリーズ社、スウイフ１− ウォータ、べ゛／シルバニア）を実施例１０のようにして得た本発明のリポソー ム１．０２ｍ１と共に用いた。リポソームを０．６７　ｒｎ　ｌの水酸化アルミ ニウハゲル及υ５゜３１　ｍ　ｌの食塩水と混合し７た。最に的なアルミニウム ａＳは０．７ｒｎｇ／ｍｌでＨ、Ａ　Ｂ　ｆｉ度はｉｏｕｇ／ｍｌであった、混 合物をゴム栓圧縮？か−小付きのガラスびんに封入した６実施例１３ 二ン且土口」上・ １（ＡＢを含むリボソ・−ムは実施例！〕のようにして製造した。捕捉価は５ｔ ＲＴＤにより決定した。リポソームを生理食塩水で希釈して１０ｕｇ蛋白／＋ｎ ｌとし、ゴム栓圧縮封入によりガラスびんに封入した。 ξ）匹の４５０〜５００にのモルモット　（バックベルブラボマンマルス。 ランデイスストア３ペンシルバーア）の右後足に上記リポソーム分散液Ｑ、５ｍ ｌ又はＨＡＢｏ、５ｍｌを筋肉注射した（５ｕｇ）ｅ免疫付与から４週間の後、 モルモットに軽くエーテルで麻酔をかけ約４ｍ＋１の血液を心臓穿刺法シニより 吸引した。血液を室温で一晩放置して凝固させた。血液を遠心分離し、血清を吸 引して試験まで４℃で保存したい採血の翌日に０゜５ｒ＋１の遊離又はリポソー ムＨＡＢ（５ｕｇ）を左後足に筋肉下注射し、た。その後、え初の注射から１年 まで」−記と同様にして採血した。。 血清中の余技ＨＡのＩｇＧ抗体をエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）でめると 共に、中性抗体を赤血球蔓固インヒビジョンアッセイ（ＨＡＴ）で測定した。結 果を表４，５及び６に示す。 実施例１４ 星立正五五− ガ〉・グリＡ゛シトＧＤ、（−ニーヨーク州、ニューヨーク、スローンカッタリ ング癌研究所のビー・ルピングツト〉博士の厚意により供与された）を含むリポ ソームを１ｍｇのＧＹ）、に対して１０ｍｇの脂質及び１．５ｍｇのＧ［）、に 対して１５０ｍｇの脂質を用いて、抗原（Ｇ　Ｄ　、　）に対する脂質の比が１ ０：１及び１００：　ｌ　（Ｗ／Ｗ）となるように作成した。リポソームはＣＨ Ｓｔｒｉｓ又はＤＭＰＣ／コレステロール（７０：　３０モル％）を用いて作成 した。 リン酸緩衝食塩水（Ｃａ＋十又はＭｇ＋十を含まないＰＢＳ）中にｐＨ７，２で 分散したＧＤ、をＣＨ５ｔｒｉｓ脂質リポソーム又はＤＭＰＣ／＝レスチロール （７０：３０−Ｅル％）のいずれかに捕捉させた。 ＣＨ３ｔｒｉｓ　／ＧＤ、　ＭＬＶリポソームは方法Ａ（下記）により、又Ｄ　 Ｍ　Ｐ　Ｃ／コレステロール／ＧＤ、５ＰＬＶリポソームは方法Ｂ（下記）によ り作成した。 このリポソーム抗原調製品をマウスに４回注射し抗体１ノベルを試験した。黒色 腫ＧＤ、に対する抗体が生産されていた。しかしながら、他の黒色腫ワクチンの 方がここに記載した本調製品よりも高い抗体価を得たことがわかった。 １豊Ａ ３０ｕｉＰＢＳ中のｌ０ｒｎ　ｇ　ＣＨＳ　ｔｒｉｓ　（粉体）及びｌ　ｍｇＧ Ｄ、（１０：　１重量比）を試験管にとり、断続的に撹拌して室温で２時間脂質 の水和を行なった。この脂質物をＣａ＋÷やＭｇ＋＋を含まない１０ｍ１のＰＢ Ｓに再分散し１３，０００　ｒ　ｐ　ｍで３０分間２回遠心分離した。 最終的に得られたリポソームベレットを２．５ｍｌのＰＢＳに再分散した。リポ ソーム調製品を試験に供するまで窒素下で琥珀色ガラスびん中に封入した。１５ ０ｍｇのＣＨＳｔｒｉｓと３００ｕｇＰＢＳ中の１．５ｍ　ｇのＧＤ、を用いて 上記と同様にして＋００：１脂質／抗原比の調製品を更に作成した。 皇亘旦 ０．５ｍｌのクロロホルム中の２ｍｇのコレステロール及び８ｍｇのＤＭＰＣを ２５ｍ１丸底フラスコ中で回転蒸発により乾燥させ、２ｍ］のエーテルに再溶解 させた後、６０ｕｌＰＢＳ中の１．５ｍ　ｇのＧＤ、を混合した。 得られた混合物をＮ、気流中４０℃で超音波処理して脂質ペーストを得て、これ を更にＮ、下で乾燥させた。乾燥品を１０ｍ１のＰＢＳに再分散し、１０，００ ０　ｒ　ｐ　ｍで１０分間３回遠心分離した。最終的に得たリポソームベレット を２．２８ｍ１にしてアルヒドロゲル（０，７ｍｇ　Ａｌ／ｒｎｌ）で補った。 １２０ｍｇのＤＭＰＣ，３０ｍｇのコレステロール及び０．４５ｍ　Ｉ　Ｐ　Ｂ 　Ｓ中の１．５ｍｇのＧＤ、を用いて、上記と同様にして、１００：１脂質／抗 原比の調製品を更に作成した。 実施例１５ ゛　の　、　： ＨＡ（スプリット抗原）及び脂質両方を投与することの役割を更に見るために、 種々の量の脂質（表７）に捕捉させた５もしくは０．５＋、＋ｇのＩ−ＩＡを含 む調製品をモルモットに接種した。実施例２に記載と同様にして２つのＣＨ５ｔ ｒｉｓ調製品を作成し、１３．６ｍｇの脂質（〜ｊＬＶ、ＣＨ３ｔｒｉｓ、Ｈ） 又は１．９ｍｇのＣＨＳのマルチラメラ小胞体とし、ての脂質（ＭＬＶ、　ＣＨ ３ｔｒｉｓ、　ｉ、、）とＨＡで５．０の投与量を得た。Ｈ”及び“Ｌ″なる表 示はそれぞれ投与量にお１する脂質の量の高低を意味する。この高低の境界は任 烈びあって、脂質の相対量がワ′クチンの効果において果たす役割を概念化する ために便宜的なものである。実施例８に記載と同様にして２つのＤＭＰＣ／Ｃ， ＨＯＬ！ＩＩ製品を作成して、９．７ｍｇの安定なマルチラメラ小胞体脂質５シ ミｒノストイルポヌフアチジルコリン／′コレステロール（Ｓ　Ｐ　Ｌ　Ｖ　、 Ｄ　Ｍ　Ｐ　Ｃ／　Ｃ、ｉＩ　）又は２．９ｍｇの脂１（ＳＰＬＶ、Ｄ＼４Ｉ〕 （二／Ｃ，Ｌ）と５、Ｏｍ、ｇの１−１Ａを含む投与量を得た２゜ 更に０．５ｍｇの接＋４源当りで比較的高い脂質量を示ず１１１；曙製品をＰＢ Ｓで］・１０に希釈し２．得らｊた０、５　ｕ　ｇ　Ｈ、Ａと１．４ｍｇ　（二 １（Ｓ　ｔ、ｒｉｑ又は］、Ｏｍ　ｇ　Ｕ）　Ｍ　Ｐ　Ｃ／　ＣＨ○Ｌを含む分 散体を阿じバイアルびんで接種した。モルモットの接種及びＥＩＡ又はＨＡＩに よる抗体の決定は実施例７及び１５に記載の如く行なった。 一式 国際調査報告 Ｉｆｉ””’−””””畷””ＰＣＴ／ＩＪ５−８９１０３６５８

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．リポソーム、任意にマルチラメラ小胞体であるものと、インフルエンザの免 疫原とを包含し、その際該リポソームと免疫原とは免疫付与投与量中に存在し、 任意に該インフルエンザの免疫原は赤血球凝集素断片又はブロメライン断片を包 含するものであるインフルエンザ免疫付与投与形態。
2. ２．該リポソームがステロールの有機酸誘導体の塩を包含し、任意に該免疫原は 該リポソームに捕促されているものである請求の範囲１記載の投与形態。
3. ３．該リポソームが直径が少なくとも約１ミクロンである請求の範囲１又は２記 載の投与形態。
4. ４．該リボン−ムがステロールの有機酸誘導体のトリス（ヒドロキシメチル）ア ミノメタン塩又はＤＭＰＣ／コレステロールを包含するものである前記請求の範 囲のいずれかに記載の投与形態。
5. ５．該リポソームが、コレステロール約２０から８０に対してＤＭＰＣ約８０か ら２０のモル比、任意に約４０：６０から約６０：４０のモル比のＤＭＰＣ／コ レステロールを包含し、任意に該リポソームはＳＰＬＶでああ請求の範囲４記載 の投与形態。
6. ６．任意にリポソーム中にステロールの有機酸誘導体塩と免疫原とを包含し、該 ステロールの有機酸誘導体及び免疫原が免疫付与投与量中に存在するものである 投与形態。
7. ７．該免疫原がリボン−ム、任意にマルチラメラ小胞体、任意に直径が少なくと も約１ミクロンのリポソーム中に捕捉されている請求の範囲６記載の投与形態。
8. ８．該ステロールが、ステロールの有機酸誘導体もしくはステロールのカルボン 酸誘導体のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩、ステロールのカルボン 酸誘導体、ステロールのジカルボン酸誘導体の塩、又はステロールのポリカルボ ン酸誘導体の塩を包合するものであり、任意に該力ルボン酸が脂肪族カルボン酸 、任意に炭素数が５までの脂肪族カルボン酸を含み、又、該ジカルボン酸が脂肪 族ジカルボン酸、任意にコハク酸の如き炭素数が７までの脂肪族ジカルボン酸を 含むものである請求の範囲６または７記載の投与形態。
9. ９．ステロールのジカルボン酸誘導体の塩を含む請求の範囲６又は７記載の投与 形態。
10. １０．該免疫原が、タンパク質、ペプチド、多糖類、核酸、脂質、糖脂質、リボ タンパク質、リポ多糖類、合成ペプチド、又はバクテリア、ウィルス、原生動物 、組織もしくは細胞の断片の中から選ばれたものであり、更に任意にサイトカイ ンの如き免疫調整剤を含むものである請求の範囲６又は７記載の投与形態。
11. １１．動物に対し該組成物の免疫投与量を投与し、及び任意にアジユバントの不 存在下でアジュバントー必須免疫原を該動物に少なくとも追加抗原投与すること により該動物における免疫応答を強化又は初回感作するための、請求の範囲６な いし１０記載の組成物の製造方法。
12. １２．免疫投与量中に抗原とマルチラメラリポソーム、任意にＳＰＬＶ，任意に 直径が少なくとも約１ミクロンのものを含み、免疫付与投与量中にシミリストイ ルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）／コレステロールを含み、及び任意にさら にアルミニウムアジュバント、任意に水酸化アルミニウムゲルを含むものである 投与形態。
13. １３．該リポソームが、モル比でコレステロール２０〜８０に対し８０〜２０の ＤＭＰＣを含むものであり、任意に約７０：３０から３０：７０、任意に約７０ ：３０のモル比である請求の範囲１２記載の投与形態。
14. １４．該免疫原がタンパク質、ペプチド、多糖類、バクテリア断片、ウイルス断 片、原生動物断片、合成ペプチド、及びリポ多糖類を含む群から選ばれたもので ある請求の範囲１２又は１３記載の投与形態。
15. １５．サイトカインの如き免疫調整剤を更に含む請求の範囲１２又は１３記載の 投与形態。
16. １６．適当な製薬学的担体を更に含む請求の範囲１２又は１３記載の投与形態。
17. １７．動物に対し該組成物の免疫投与量の投与、そして任意にアジュバントの不 存在下でアジュバントー必須免疫原の少なくとも追加抗原投与量を動物に対して 投与することによる該動物における免疫応答を強化又は初回感作するための請求 の範囲１２ないし１６記載の組成物の製造方法。
18. １８．該免疫原が、タンパク質、ペプチド、多糖類、バクテリア断片、ウィルス 断片、原生動物断片、合成ペプチド又はリポ多糖類を含む群から選ばれたもので あり、及び、任意にサイトカインの如き免疫調整剤を含むものである請求の範囲 １７記載の方法。
19. １９．免疫投与量中に抗原とリポソーム、任意にＳＰＬＶ、任意に直径が少なく とも約１ミクロンのものであって、ＤＭＰＣ／コレステロールを７０：３０±５ （モル）を含むリポソームを包含し、任意に水酸化アルミニュームの如きアルミ ニュームアジュバントを含む投与形態。
20. ２０．免疫原はタンパク質、ペプチド、多糖類、バクテリア断片、ウイルス断片 、原生動物断片、合成ペプチド又はリポ多糖類を含む群から選ばれたものであり 、任意にサイトカインの如き免疫調整剤及び任意に適当な製薬学的担体を含む請 求の範囲１９記載の投与形態。