CN104736180A - 脑膜炎球菌血清组x偶联物 - Google Patents

脑膜炎球菌血清组x偶联物 Download PDF

Info

Publication number
CN104736180A
CN104736180A CN201380038432.5A CN201380038432A CN104736180A CN 104736180 A CN104736180 A CN 104736180A CN 201380038432 A CN201380038432 A CN 201380038432A CN 104736180 A CN104736180 A CN 104736180A
Authority
CN
China
Prior art keywords
conjugate
polysaccharide
capsular polysaccharide
serum group
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380038432.5A
Other languages
English (en)
Inventor
M·R·罗马诺
F·米科利
F·伯尔蒂
R·阿达莫
P·科斯塔蒂诺
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG filed Critical Novartis AG
Publication of CN104736180A publication Critical patent/CN104736180A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8827—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8836—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving saccharides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了一种脑膜炎奈瑟球菌血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联物。一般通过以下步骤制备该偶联物：(a)氧化荚膜多糖中的伯羟基，以得到具有醛基的经氧化的多糖；和(b)使经氧化的多糖通过醛基与载体分子偶联，从而得到该偶联物。该偶联物可以是免疫原性组合物的部分。该组合物可包含一种或多种其他抗原，尤其是来自血清组A、W135、C和Y的荚膜多糖及其偶联形式。该组合物可以在水性制剂中。该组合物可用作疫苗，例如，用于在哺乳动物中引起免疫应答。本发明还提供制备该偶联物的方法。

Description

脑膜炎球菌血清组X偶联物
相关申请
本申请要求2012年5月22日提交的美国临时申请号61/650,025；2012年9月9日提交的美国临时申请号61/698,677；以及2013年3月15日提交的美国临时申请号61/799,528的权益。前述的申请通过引用全文纳入本文用于所有目的。
技术领域
本发明涉及细菌荚膜糖的领域，具体是脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitidis)血清组X荚膜多糖。该多糖可与载体偶联以形成偶联物。多糖和偶联物可用于免疫，尤其是在水性制剂中。
背景技术
在抵御有荚膜细菌的疫苗中使用细菌的荚膜糖已有多年历史。然而，由于糖是T非依赖性抗原，它们的免疫原性较弱。与载体偶联可将T非依赖性抗原转化成T依赖性抗原，从而增强记忆反应并能发展出保护性免疫。因此，最有效的糖疫苗基于糖偶联物，原型偶联疫苗针对流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(‘Hib’)[例如见参考文献86的第14章]。
基于生物体的荚膜多糖，已经鉴定了脑膜炎奈瑟球菌的12种血清组(A、B、C、H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z)。组A是非洲撒哈拉沙漠以南地区流行疾病中最常涉及的病原体。血清组B和C是美国和大多数发达国家中的大多数病例的病因。血清组W135和Y是美国和发达国家中剩余病例的病因。多年来已知来自血清组A、C、Y和W135的荚膜多糖的四价疫苗[1，2]。虽然在儿童和成人中有效，但是因为多糖是诱导不能加强的弱免疫应答的非T细胞依赖性抗原，其诱导的免疫应答弱且保护持续时间短，并且不能用于婴儿[例如参考文献3]。该疫苗中的多糖不是偶联的[4]。针对血清组C的偶联疫苗已被批准用于人，并且其包括MenjugateTM[5]、MeningitecTM和NeisVac-CTM。来自血清组A+C的偶联物的混合物是已知的[6-8]并且已经报道了来自血清组A+C+W135+Y的偶联物的混合物[9-13]。
自20世纪70年代以来，已知组X荚膜多糖的结构[14]并且该血清组与脑膜炎疾病的多次爆发相关，例如，在非洲撒哈拉沙漠以南地区和中国[15，16]。在5岁以下的儿童中，血清组X已知具有比血清组A明显高的攻击率。虽然多年来已经认识到需要针对这种血清组的疫苗[17]，但是还没有开发出有效的疫苗。已经提出了针对血清组X的偶联物疫苗[17，18]，但是这类偶联物是否针对该血清组有免疫原性或保护性还是未知的。
因此，仍然存在对血清组X荚膜多糖偶联物的需求。此外，仍然存在对可用于针对由该血清组造成的疾病的疫苗接种的偶联物的需求。
组X荚膜多糖的结构由通过不含O-乙酰基的α1-4磷酸二酯键[19]结合在一起的N-乙酰葡糖胺-4-磷酸残基组成：{→4)-D-GlcpNAc-α-(1→OPO3→}(图1)。基于遇它们的结构相似性，已经假定MenA和MenX荚膜多糖之间的生物合成关系[14]。MenA荚膜多糖易于在水性溶液中发生明显水解[20]。这种不稳定性被认为是由于涉及异头位的磷酸二酯连接和甘露糖胺2位中的N-乙酰基的存在而造成的，其可有助于磷酸单酯基团的离开[21]。另一种可能性是N-乙酰甘露糖胺亚基的4位上的羟基与磷酸二酯基团相互作用通过内部参与机制促进水解，如在6A型肺炎链球菌[22]和B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b)[23]的荚膜多糖中所见。在MenX和MenA荚膜多糖的结构中的相似性，尤其是它们共有的异头磷酸二酯连接，表示在水性溶液中时，MenX多糖可能存在相似的稳定性问题。MenA荚膜多糖在水溶液中的固有不稳定性表明当包含于疫苗(例如，在多糖疫苗MencevaxTM和偶联物疫苗MenAfriVacTM、MenveoTM和NimenrixTM)中时，其通常以冻干形式存在。虽然MenX荚膜多糖可以相似地以冻干形式存在以改善其稳定性，但是水性制剂是更为方便的。在水性制剂中含有MenA荚膜多糖偶联物的仅有的疫苗是MenactraTM，但是这种疫苗需要在低温下储存。这种低温储存是昂贵的并且在MenA和MenX时常爆发的许多国家(例如，非洲撒哈拉沙漠以南地区)中存在实际困难。
因此，存在对血清组X荚膜多糖及其偶联物的水性制剂的需求，尤其是无需冷藏的水性制剂。
针对MenX的疫苗的开发需要用于多糖定量的方法，其可用作加工中测试和/或用于最终疫苗的表征。在MenX荚膜多糖中磷酸基团的存在表示可通过测量总磷含量的比色法来定量多糖[24]。然而，这种方法缺少选择性并且因此不适于某些加工中应用，例如，磷酸盐缓冲液中或在含磷酸盐杂质存在下的多糖分析。更有选择性的方法是NMR，其已经被提出用于MenX多糖定量[25]。然而，这种方法要求纯的样品和大量的材料。参考文献26证明了替代的方法，其中通过HPAEC-PAD来对MenX多糖进行定量，其比NMR更灵敏并且比测量磷酸含量更有选择性。参考文献26的作者通过水解样品生成葡糖胺，并且将释放的葡糖胺的量与衍生自N-乙酰基-葡糖胺-6-磷酸的定量标准物的校准曲线做比较来对MenX多糖进行定量。然而，由于污染，可能存在葡糖胺，其产生不精确的结果。因此，存在对测量MenX多糖的替代或改良方法，并且尤其是对MenX更有选择性的方法的需求。
发明内容
本发明部分基于用于将血清组X荚膜多糖偶联至载体分子的方法。本发明的发明人已经发现，所得的偶联物是免疫原性的并且能够诱导杀菌抗体应答。因此，血清组X偶联物可用于免疫原性组合物，并且尤其是用于疫苗。本发明的发明人已经发现，能够将血清组X荚膜多糖抗原，例如，血清组X偶联物与其他抗原结合而不失去针对血清组X的免疫应答。具体地，血清组X偶联物可与其他偶联物组合，例如包含其他细菌荚膜糖抗原的偶联物。血清组X偶联物特别适于与包含来自其他脑膜炎奈瑟球菌血清组(例如，血清组A、C、W135和Y)的荚膜糖抗原的偶联物组合。在这些组合中，不仅血清组X偶联物保持其免疫原性，血清组A、C、W135和/或Y偶联物也保持其免疫原性。此外，本发明的发明人也已经发现尽管其与血清组A荚膜多糖在结构上相似，来自血清组X的荚膜多糖令人惊讶地在溶液中稳定。因此，血清组X荚膜多糖及其偶联物特别适用于水性制剂。
在第一方面，本发明提供了脑膜炎奈瑟球菌血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联物。本发明的发明人已经发现可使用下述的本发明的第二方面的第一实施方式的过程来制备血清组X荚膜多糖和载体分子的特别稳定的偶联物。例如，在37℃下28天后，偶联物可含有低于50％的游离糖。可如下文稳定性研究(2)所述测定游离的糖％。因此，在本发明的第一方面内，本发明提供了在37℃下28天后包含低于50％的游离的糖的血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联物。偶联物可具体包含低于25％的游离的糖，尤其是低于20％的游离的糖并且更具体地低于15％的游离的糖，例如，约10％的游离的糖。
在第二方面，本发明提供了用于制备血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联物的方法，尤其是下述第一、第二和第三实施方式的方法。第二方面也提供了下述的第四实施方式的方法。通常通过这些方法之一得到或可得到本发明的第一方面的偶联物。然而，可通过任意合适的方法替代性地制备第一方面的偶联物。当通过这些其他方法之一制备本发明的偶联物时，该方法通常不包括以下步骤中的一个或两个：a)将多糖与接头偶联，以形成多糖-接头中间体，其中接头的游离末端是酯基团，尤其是其中偶联间接地发生，即采用额外的接头，该接头用于在偶联到接头上之前对多糖衍生化；和b)通过将多糖的还原末端处的羰基基团与接头的一个末端处的伯胺基团反应的还原性胺化。
在第三方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含(a)血清组X荚膜多糖，尤其是本发明的第一方面的偶联物的形式；和(b)药学上可接受的载体。该组合物通常是水性制剂。
在其他方面，本发明提供了可用于本发明的方法的中间体以及制备这些中间体的方法。本发明也提供了本发明的偶联物的用途，例如在免于原性组合物内，具体地，疫苗内的用途，并且用于提高哺乳动物中的免疫应答。
在本发明的第二方面的第一实施方式中，本发明提供了用于制备血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联物的方法，包括以下步骤：(a)使荚膜多糖中的伯羟基基团氧化，以得到具有醛基团的氧化的多糖；和(b)通过该醛基团使氧化的多糖与载体分子偶联，从而得到偶联物。该方法被认为特别适用于(例如，根据产量)较长的多糖，例如具有20至200，尤其是60至100(例如，70至90，尤其是80左右)的聚合度(DP)的那些。该方法也包括较少步骤，使其更易于扩大规模至工业化。所得的偶联物也可以更稳定，尤其是其中多糖通过其还原末端与载体连接的偶联物相比。步骤(b)中的偶联通常是直接的，例如，通过醛基和载体分子上的伯胺基之间的还原性胺化。作为本发明的第一方面的部分，本发明也提供了通过该方法得到或可得到的偶联物。本发明也提供了该方法的单独步骤(a)和(b)；以及通过该方法的步骤(a)得到或可得到的氧化的多糖中间体。
在本发明的第二方面的第二实施方式中，本发明提供了用于制备血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联物的方法，包括以下步骤：(a)荚膜多糖的还原末端的还原性胺化，以得到具有通过共价键与末端亚基的C-1原子结合的伯胺基的经修饰的多糖；和(b)通过该伯胺基使经修饰的多糖与载体分子偶联，从而得到偶联物。该方法特别适用于较短的多糖，例如具有5至50，尤其是10至20，例如约15的DP的多糖。在步骤(b)中的偶联通常是间接的，例如，通过接头。作为本发明的第一方面的部分，本发明也提供了通过该方法得到或可得到的偶联物。本发明也提供了该方法的单独步骤(a)和(b)；以及通过该方法的步骤(a)得到或可得到的经修饰的多糖中间体。
在本发明的第二方面的第三实施方式中，本发明提供了用于制备血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联物的方法，包括以下步骤：(a)荚膜多糖还原末端的还原，以得到在该末端具有2个相邻羟基的经修饰的多糖；(b)相邻羟基的氧化切割，以得到在末端具有醛基的经进一步修饰的多糖；(c)醛基的还原性胺化，以得到在末端具有伯胺基的经进一步修饰的多糖和(d)通过伯胺基使经进一步修饰的多糖与载体分子偶联，从而得到偶联物。该方法可比第一和第二实施方式的方法提供更高的产量，尤其是对于较短的多糖，例如具有5至50，尤其是10至20，例如约15的DP的多糖。在步骤(d)中的偶联通常是间接的，例如，通过接头。作为本发明的第一方面的部分，本发明也提供了通过该方法得到或可得到的偶联物。本发明也提供了该方法的单独步骤(a)、(b)、(c)和(d)以及步骤(a)与(b)，(b)与(c)，(c)与(d)，(a)、(b)和(c)以及(b)、(c)和(d)的组合；以及通过该方法的步骤(a)、(b)或(c)得到或可得到的经修饰的多糖中间体。
在本发明的第二方面的第四实施方式中，本发明提供了用于制备血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联物的方法，包括以下步骤：(a)荚膜多糖还原末端的还原，以得到在该末端具有2个相邻羟基的经修饰的多糖；(b)相邻羟基的氧化切割，以得到在末端具有醛基的经进一步修饰的多糖；(c)通过醛基与载体分子上的伯胺基的还原性胺化将经进一步修饰的多糖与载体分子直接偶联，从而得到偶联物。作为本发明的第一方面的部分，本发明也提供了通过该方法得到或可得到的偶联物。本发明也提供了该方法的单独步骤(a)、(b)和(c)以及步骤(a)与(b)以及(b)与(c)的组合；以及通过该方法的步骤(a)或(b)得到或可得到的经修饰的多糖中间体。
本发明的发明人也已经开发了用于测试血清组X荚膜多糖的方法。该方法涉及葡糖胺-4-磷酸的检测，其具有MenX多糖的特征并且不常存在于杂质中。因此，在其他方面，本发明提供了用于测试疑似含有血清组X荚膜多糖的样品的方法，包括以下步骤：(i)使样品中的任意血清组X荚膜多糖水解，得到水解物；(ii)使该水解物经过液相色谱；和(iii)检测步骤(ii)中分离的任意葡糖胺-4-磷酸。
在其他方面，本发明提供了用于制备N-乙酰葡糖胺-4-磷酸的方法和试剂。该化合物可用作用于测试上述血清组X荚膜多糖的方法中的分析标准物。
荚膜多糖
本发明涉及脑膜炎奈瑟球菌血清组X的荚膜多糖。组X荚膜多糖的结构由通过不含O-乙酰基的α1-4磷酸二酯键[19]结合在一起的N-乙酰葡糖胺-4-磷酸残基组成：{→4)-D-GlcpNAc-α-(1→OPO3→}(图1)。
可通过已知技术，例如参考文献19中所述的方法纯化荚膜多糖。通常，通过一种方法制备脑膜炎球菌荚膜多糖，该方法包括如下步骤：多糖沉淀(例如，使用阳离子去污剂)、乙醇分级分离、冷苯酚提取(为了去除蛋白质)和超速离心(为了去除LPS)[例如，参考文献27]。然而，在参考文献10中描述了血清组X荚膜多糖的优选方法。该方法包括在多糖沉淀之后使用低级醇溶解沉淀的多糖。可以使用诸如四丁基铵和十六烷基三甲基铵盐(例如，氢溴酸盐)，或海美溴铵(hexadimethrine bromide)和肉豆蔻基三甲基铵盐的阳离子去污剂实现沉淀。通常使用十六烷基三甲基溴化铵(“CTAB”)[28]。使用诸如甲醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、丁-2-醇、2-甲基-丙-1-醇、2-甲基-丙-2-醇、二元醇等的低级醇来实现沉淀物质的溶解，但是乙醇特别适于溶解CTAB-多糖复合物。优选向沉淀的多糖加入乙醇以得到50％至95％的乙醇终浓度(基于乙醇和水的总含量)。
再溶解后，可进一步处理多糖以除去污染物。这在甚至非常微量的污染也不能接受(例如对于人疫苗生产)的情况下特别重要。这通常会包括一个或两个过滤步骤，例如深度过滤(可以使用通过活性炭的过滤)、尺寸过滤和/或超滤。
一旦经过滤去除污染物，可以沉淀多糖用于进一步处理和/或加工。这通常可以通过交换阳离子来方便地实现(例如，通过加入钙盐或钠盐)。
然而本发明不限于从天然来源纯化的多糖，并且可通过其它方法如全部合成或部分合成，例如通过参考文献29中所述的酶促合成获得该多糖。
可以相对于天然情况下发现的荚膜多糖对该多糖进行化学修饰。例如，可对该多糖进行去-N-乙酰化(部分或完全)、N-丙酰化(部分或完全)等。可在偶联之前、期间或之后进行去乙酰化，但通常在偶联前进行。本发明所用血清组X荚膜多糖的N-乙酰化程度可以是0-100％、50-100％、75-100％、80-100％、90-100％或95-100％。通常，N-乙酰化程度为100％。多糖的N-乙酰化程度可通过本领域已知的任何方法测定，例如通过质子NMR(例如，参考文献30或31所述)。
通常使用寡糖形式的荚膜多糖。通过对纯化荚膜多糖进行片段化(例如通过水解)可以方便地形成寡糖，片段化后通常要纯化所需大小的片段。
优选对多糖进行片段化以使寡糖中的最终平均聚合度(DP)为20至200，尤其是60至100(例如，70至90，尤其是80左右)。本发明的发明人发现该长度的多糖特别适用于上述第一实施方式的方法。然而，本发明的发明人发现也可使用较短的多糖，例如，具有5至50，尤其是10至20，例如约15的DP的多糖。本发明的发明人发现该长度的多糖特别适用于上述第二和第三实施方式的方法。可以通过离子交换色谱、NMR或比色测定方便地测量DP[32]。
可以筛分多糖以得到需要的多糖尺寸范围[33]。可以用各种方法实现此目的，如超滤后进行离子交换色谱。
载体分子
本发明包括使用载体分子，它们一般是蛋白质。一般，糖与载体的共价偶联增强糖的免疫原性，因为这将糖由T非依赖性抗原转变为T-依赖性抗原，由此能够引发免疫记忆。偶联对于儿科疫苗特别有用[例如参考文献34]，而且是公知技术[例如在参考文献35-43中所综述的]。
优选的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素、或其类毒素或突变体，尤其是白喉类毒素或破伤风类毒素。本发明的发明人发现CRM197白喉毒素突变体[44]是特别合适的。也可使用来自流感嗜血杆菌的蛋白D[45-47]。
其他合适的载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白复合物[48]、合成肽[49，50]、热激蛋白[51，52]、百日咳蛋白[53，54]、细胞因子[55]、淋巴因子[55]、激素[55]、生长因子[55]、人血清白蛋白(通常是重组的)、包含多种来自各种病原体衍生抗原的人CD4+T细胞表位的人工蛋白[56]例如N19[57]、肺炎球菌表面蛋白PspA[58]、肺炎球菌溶血素[59]或其无毒衍生物[60]、摄铁蛋白[61]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[62]、GBS蛋白[63]、GAS蛋白[64]等。
在参考文献65中描述了其他合适的载体蛋白，尤其是该文献中SEQ IDNO：9的载体蛋白。也在参考文献66中描述了这些载体蛋白，并且在下面的“示例性载体蛋白”部分中提供了更详细的描述。
氧化
在上述第一实施方式的方法的步骤(a)中，荚膜多糖中的伯羟基经氧化得到醛基。该伯羟基通过共价键结合到MenX荚膜多糖亚基的C-6原子上，使得该步骤如下进行：
该步骤可包括超过一个这类伯羟基的氧化，导致沿着多糖主链导入超过一个醛基。例如，本发明的发明人已经发现可通过使血清组X多糖内1-50％、优选1-20％并且更优选1-10％，例如约4-8％的残基上的伯羟基氧化来制备合适的偶联物。可通过各种氧化反应(例如，斯文(Swern)氧化、戴斯马丁氧化、CrVI氧化等)将羟基转化为醛。然而，本发明的发明人发现TEMPO(2，2，6，6-四甲基哌啶氧基基)-介导的氧化是特别合适的。参考文献67中描述了TEMPO-介导的氧化。为了防止醛基氧化成羧基，优选在非水性条件下进行TEMPO-介导的氧化，例如，使用参考文献68中所述的DMF溶剂。本领域技术人员能够鉴定适合氧化的条件。例如，本发明的发明人发现在0℃下用TEMPO(相对于MenX重复亚基0.06当量)、NaHCO3(相对于MenX重复亚基9当量)和TCC(三氯异氰脲酸，相对于MenX重复亚基2当量)处理多糖过夜是合适的。
氧化切割
在上述的第三和第四实施方式的方法的步骤(b)中，在荚膜多糖中两个相邻羧基经过氧化切割得到醛基：
氧化切割(例如，使用NaIO4、Pb(OAc)4等)是本领域所熟知的。本发明的发明人发现在室温下将pH 7.2的10mM NaPi缓冲液中6-8mg/ml的多糖与NaIO4(相对于MenX的分子量10当量，固体)反应1.5小时是合适的。
还原
在上述第三和第四实施方式的方法的步骤(a)中，荚膜多糖的还原末端经还原得到在末端具有两个相邻羧基的经修饰的多糖：
多糖的还原(例如，使用NaBH4等)是本领域所熟知的。本发明的发明人发现在室温下将pH 8的10mM NaPi缓冲液中15mg/ml的多糖与NaBH4(相对于MenX的分子量12当量，固体)反应1.5小时是合适的。
还原性胺化
在上述第二实施方式的方法的步骤(a)中，荚膜多糖的还原末端经过还原性胺化得到具有通过共价键与末端亚基的C1-原子连接的伯胺基的经修饰的多糖：
还原性胺化是有机化学中的标准技术。例如，可使用氨将还原末端的醛基转化为伯胺基。这可使用铵盐(例如，氯化铵或乙酸铵)与合适的还原剂(例如，氰基硼氢化物，如氰基硼氢化钠NaBH3CN；硼烷-吡啶；三乙酰氧基硼氢化钠；硼氢化物交换树脂)组合来方便地实现。本领域技术人员能够鉴定适合还原型胺化的条件。
也在上述第三实施方式的方法的步骤(c)中进行还原性胺化，以得到在末端含伯胺基的经修饰的多糖。例如，醛基可如上述转化为伯胺基。因此，还原性胺化可产生含有通过共价键与末端亚基的C-5原子连接的伯胺基的经修饰的多糖：
然而，在第三实施方式的其他示例中，还原性胺化发生在醛基和接头的末端伯胺基之间。接头是提供用于与醛基反应的第一末端伯胺基和用作经修饰的多糖的末端处的伯胺基的第二末端伯胺基的双官能接头。例如，式X1-L-X2的双官能接头可用作该接头，其中X1包含可与醛基发生反应的伯胺基；X2包含伯胺基；并且L是接头中的连接部分。典型的L基团是含1-10个碳原子(例如，C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)的直链烷基，尤其是-(CH2)4-。式X-L-X的同双官能接头特别适于作为接头，其中两个X基团彼此相同；并且其中L是接头中的连接部分。典型的X基团是-NHNH2基团。L通常为式-L′-L2-L′-，其中L′是羰基。典型的L2基团是含1-10个碳原子(例如，C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)的直链烷基，尤其是-(CH2)4-。因此，典型的接头是己二酸二酰肼(ADH)。也可使用较短的接头，例如，卡巴二肼(CDH，例如X-L-X，其中X是-NHNH2且L是羰基)。
也在上述的第四实施方式的方法的步骤(c)中进行还原性胺化，以得到偶联物。还原性胺化发生在经进一步修饰的多糖和载体分子上的伯胺基之间。
偶联至载体分子
在上述第一实施方式的步骤(b)中通过醛基将氧化的多糖与载体分子偶联可以是直接的或通过接头的偶联。然而，该偶联优选是直接的，因为这涉及较少的合成步骤。在上述第二实施方式的步骤(b)中通过伯胺基将经修饰的多糖与载体分子偶联也可以是直接的或通过接头的偶联。在该实施方式中，通常使用接头来在多糖与载体分子之间产生间隔。在上述第三实施方式的步骤(d)中通过伯胺基将经修饰的多糖与载体分子偶联也可以是直接的或通过接头的偶联。在该实施方式中，通常使用接头来再次产生多糖与载体分子之间的空间。对于所有的三个实施方式，可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。
将多糖或接头衍生的多糖连接于载体通常通过伯胺基(-NH2)进行，例如载体蛋白中的赖氨酸或残基侧链中的伯胺基，或精氨酸残基侧链中的伯胺基。连接至载体也可通过巯基(-SH)进行，例如半胱氨酸残基侧链中的巯基。
对于上述第一实施方式的方法，本发明的发明人发现可使氧化的多糖中的醛基与载体中的胺基通过还原型胺化发生反应，方便地实现直接偶联。因此，该实施方式中优选此种性质的直接偶联。如上述，还原性胺化是标准技术，并且已经在用于疫苗的荚膜多糖的偶联物的生产中广泛使用。在一个方法中，氧化的多糖中的醛基与载体中的氨基发生反应。这可通过在合适还原剂(例如氰基硼氢化物，如氰基硼氢化钠NaBH3CN；硼烷-吡啶；三乙酸基硼氢化钠；硼氢化物交换树脂；等)存在下将多糖与载体混合方便地实现。本领域技术人员能够鉴定适合还原型胺化的条件。例如，本发明的发明人发现用pH 7.2的NaPi 10mM缓冲液中4∶1w/w比例的10mg/mlCRM197和1∶1w/w比例的NaBH3CN处理氧化的多糖是合适的。可在37℃下在缓慢搅拌下使该混合物放置72小时以实现还原性胺化的效果。如果需要，本发明可采用通过接头的偶联，例如通过使氧化的多糖中的醛基与接头中的胺基发生还原性胺化反应，或者通过由还原性胺化将醛基转化成胺基以提供接头连接用的胺基。
在所有的实施方式的方法中，可使用任意已知的方法进行通过接头的偶联。例如，当多糖包含醛基(例如，上述第一实施方式的方法的步骤(a)中产生的醛基)时，可使用双官能接头来提供用于与醛基偶联的第一基团和用于与载体偶联的第二基团。例如，可使用式X1-L-X2的双官能接头，其中X1可与醛发生反应；X2可与载体发生反应；且L是接头中的连接部分。典型的X1基团是氨基。典型的L基团是含1-10个碳原子(例如，C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)的直链烷基，如-(CH2)4-或-(CH2)3-。相似地，当多糖包含伯胺基(例如，在第二实施方式的方法的步骤(a)中产生的伯胺基或在第三实施方式的方法的步骤(c)中产生的伯胺基)时，可使用双官能接头来提供用于与胺基偶联的第一基团和用于与载体偶联的第二基团(通常用于与载体中的胺偶联)。例如，可使用式X-L-X的均质双官能接头，其中两个X基团相同，并可与胺发生反应；L是接头中的连接部分。典型的X基团是N-氧琥珀酰亚胺。L通常具有式-L′-L2-L′-，其中L′是羰基。典型的L2基团是含1-10个碳原子(例如，C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)的直链烷基，如-(CH2)4-。因此，典型接头是己二酸N-羟基琥珀酰亚胺二酯(SIDEA)：
其它X基团是与HO-L-OH混合时形成酯的基团，如降冰片烷、对硝基苯甲酸和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。其它与本发明所用胺发生反应的双官能接头包括丙烯酰卤(如丙烯酰氯)[70]、卤代酰基卤[71]、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯、乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯]等。
通常向多糖中加入摩尔过量的接头。接头/多糖反应通常在非质子溶剂(如DMSO、乙酸乙酯(ethanol acetate)等)中进行，因为接头通常不溶于水。然而，使用水溶性接头时，可采用更大范围的溶剂，包括质子溶剂如水。合适接头包括磺化形式，如磺化的SIDEA：
使用接头时，该偶联物包括接头部分。此部分既不源自多糖也不源自载体，但是偶联物制备期间使用的第三个分子，不难与最终偶联产物中的多糖和载体蛋白区别开。该接头部分可包括原子如碳、氢、氧和/或氮。通常是包含碳和氢的接头，也可采用还包含氧和/或氮的接头。包含氮原子的接头可包括与氮原子键合的碳原子，该氮原子进而与第二个碳原子键合(-C-N-C-)。包含氧原子的接头通常以羰基一部分的形式包括氧原子。分子量为30-500Da的接头部分是典型的。含有两个羰基的接头也是常见的。
特别有用的接头部分是-NH-C(O)-(CH2)n-C(O)-，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。n的值通常为4。该接头中的末端-NH-通常连接于多糖部分的碳原子。末端-C(O)-通常连接于载体氨基酸侧链中的氮原子。优选的接头部分可通过包括以下步骤的方法方便地引入：-NH2基团与双官能接头(如二元酸(如己二酸，HOOC-(CH2)4-COOH)的二酯(如二琥珀酰亚胺基酯))发生反应；和产物的还原性胺化(见图6[69])。
可用于将接头连接于多糖中的-NH2基团的其它化学方式包括：
-烯丙酰化(例如，与烯丙酰氯反应)，然后进行迈克尔加成至氨基酸侧链的ε-NH2或半胱氨酸侧链的-SH[70]。所得接头是-NH-C(O)-(CH2)2-(丙酰胺基)。
-与卤代酰基卤发生反应，然后与氨基酸侧链的ε-NH2或半胱氨酸侧链的-SH[71]。所述接头是-NH-C(O)-CH2-。
通常通过本发明方法产生多糖∶蛋白质比例(w/w)为1∶20(即蛋白质过量)至20∶1(即多糖过量)的偶联物。优选比例为1∶10-1∶1，特别是1∶2-1∶1的比例，最优选约1∶1.5。对于本发明的第二方面的第一实施方式的方法制备的偶联物，典型的比例为0.1至1.0，更优选0.2至0.4，例如约0.35。对于本发明的第二方面的第二实施方式的方法制备的偶联物，典型的比例为0.1至1.0，更优选0.1至0.3，例如约0.22。对于本发明的第二方面的第三实施方式的方法制备的偶联物，典型的比例为0.1至1.0，更优选0.1至0.3，例如约0.21。
组合物可包含少量游离的载体[72]。当给定载体蛋白在本发明组合物中游离和偶联形式存在时，未偶联形式优选整体上不多于组合物中载体蛋白总量的5％，更优选以少于2％重量存在。
偶联后，可分离游离和偶联的多糖。有许多合适的方法，例如，疏水层析、切向超滤、透析等[也可参见参考文献73和74等]。
偶联物与其它抗原的组合
除提供上述单独偶联物外，本发明还提供包含本发明偶联物和一种或多种其它抗原的组合物。该组合物通常是免疫原性组合物。
所述其他抗原可以包含其他偶联物。在这些实施方式中，对于组合物中的不同偶联物可以使用一种以上的载体，例如，以降低载体抑制的风险。通常，对于所有的偶联物使用相同载体，包括本发明的偶联物。然而，本发明的发明人发现对于本发明的偶联物使用不同的载体可减少该偶联物与其他偶联物组合时的免疫干扰。因此，在一些实施方式中，本发明的偶联物使用一种载体(尤其是破伤风类毒素或参考文献65和66的SEQ ID NO：9)，同时其他偶联物使用不同的载体(尤其是CRM197)。
一种载体蛋白可携带一种以上多糖抗原[75，76]。为了实现这一目的，可以在偶联过程之前混合不同多糖。然而，通常各多糖形成不同偶联物，偶联后混合不同多糖。如上所述，不同的偶联物通常基于相同的载体。
具体而言，其他抗原可选自下组：血清组A荚膜多糖、血清组C荚膜多糖、血清组Y荚膜多糖和血清组W135荚膜多糖。通常，选自该组的其他抗原各自独立地与载体蛋白偶联。优选的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素、或其类毒素或突变体，尤其是白喉类毒素或破伤风类毒素。本发明的发明人发现CRM197白喉毒素突变体是特别合适的。也可使用来自流感嗜血杆菌的蛋白D。通常，对于所有的偶联物使用相同的载体蛋白，任选地包括本发明的偶联物。本发明的发明人已经发现CRM197白喉毒素突变体是特别合适的，虽然也可使用白喉类毒素和破伤风类毒素。如上所述，本发明的发明人发现对于本发明的偶联物使用不同的载体可减少该偶联物与其他偶联物组合时的免疫干扰。因此，在一些实施方式中，本发明的偶联物使用一种载体(尤其是破伤风类毒素或参考文献65和66的SEQID NO：9)，同时其他偶联物使用不同的载体(尤其是CRM197)。
专门考虑到了以下的组合用于本发明：
1)本发明的偶联物以及血清组A荚膜多糖和载体蛋白的偶联物；
2)本发明的偶联物以及血清组W135荚膜多糖和载体蛋白的偶联物；
3)本发明的偶联物，血清组A荚膜多糖和载体蛋白的偶联物，以及血清组W135荚膜多糖和载体蛋白的偶联物；以及
4)本发明的偶联物，血清组A荚膜多糖和载体蛋白的偶联物，血清组C荚膜多糖和载体蛋白的偶联物，血清组W135荚膜多糖和载体蛋白的偶联物以及血清组Y荚膜多糖和载体蛋白的偶联物。
通过包括来自血清组X和血清组A和/或血清组W135的抗原，包含组合1)-3)的组合物可提供针对在非洲造成大多数脑膜炎奈瑟球菌疾病的血清组的保护。因此，这类组合是特别优选的。虽然添加了其他抗原可提供额外的保护，例如在组合4)中包含了来自血清组C和Y的抗原，但是该额外保护的益处可能没有超过所涉及的额外成本。因此，在本发明的一些实施方式中，该组合物并不含有来自血清组C的抗原，尤其是血清组C荚膜多糖和载体蛋白的偶联物。相似地，在本发明的相同或其他实施方式中，该组合物并不含有来自血清组Y的抗原，尤其是血清组Y荚膜多糖和载体蛋白的偶联物。
其他抗原可包括另外的细菌、病毒或寄生虫抗原。这些抗原可选自下列：
-肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如参考文献77-79；参考文献86的第22和23章]。
-甲型肝炎病毒，如灭活病毒的抗原[如80，81；参考文献86的第15章]。
-乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如81，82；参考文献86的第16章]。
-丙型肝炎病毒的抗原[如83]。
-百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(pertactin)和/或凝集原2和3组合[例如参考文献84和85；文献86的第21章]。
-白喉抗原，如白喉类毒素[例如，参考文献86的第13章]。
-破伤风抗原，如破伤风类毒素[如参考文献86的第27章]。
-流感嗜血杆菌B的糖抗原[如参考文献86的第14章]。
-肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原[例如87-93]。
-沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原[例如，94]。
-牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原[例如，95]。
-脊髓灰质炎病毒抗原[例如96、97；文献86的第24章]，如IPV。
-狂犬病抗原[如98]如冻干的失活病毒[如99，RabAvertTM]。
-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献86的第19、20和26章]。
-流感抗原[如参考文献86的第17和18章]，如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
-粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)抗原[例如100]。
-酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A型链球菌)的抗原[如101、102、103]。
-酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(B型链球菌)的抗原[如64、104-106]。
-表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的抗原[如可由菌株ATCC-31432、SE-360和SE-10获得的I、II和/或III型荚膜多糖，如参考文献107、108和109所述]。
在采用糖或碳水化合物抗原时，通常与载体偶联以增强免疫原性。流感嗜血菌B、脑膜炎球菌和肺炎球菌的糖抗原的偶联是熟知的。
必要时，可以使有毒的蛋白质抗原脱毒(例如，通过化学和/或遗传方式使百日咳毒素脱毒[85])。
在所述组合物中包含白喉抗原时，通常还包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，在包含破伤风抗原时，通常还包含白喉和百日咳抗原。相似地，在包含百日咳抗原时，通常还包含白喉和破伤风抗原。
抗原可以吸附于铝盐。
所述组合物中抗原存在的浓度一般是至少各1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫反应。
作为本发明组合物中使用蛋白质抗原的另一种替代方式，可使用编码该抗原的核酸[例如文献110-118]。本发明的组合物的蛋白质组分可被编码该蛋白的核酸(通常是DNA，如质粒形式的DNA)取代。
在实践层面上，本发明组合物中包含的抗原数可能有上限。本发明组合物中抗原数可以少于20、少于19、少于18、少于17、少于16、少于15、少于14、少于13、少于12、少于11、少于10、少于9、少于8、少于7、少于6、少于5、少于4、或少于3。
药物组合物和方法
本发明提供了一种药物组合物，其包含(a)血清组X荚膜多糖，尤其是本发明的偶联物的形式；和(b)药学上可接受的载体。通常“药学上可接受的载体”包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体一般是代谢慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖[119]、海藻糖[120]、乳糖和脂质聚集体(如油滴或脂质体)。这种载体为本领域普通技术人员熟知。疫苗也可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，也可存在辅助剂，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌、无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是一种典型载体。药学上可接受的赋形剂的全面讨论参见参考文献121。
本发明组合物可以是水性制剂(即溶液或悬浮液)或干燥形式(如冻干)。优选水性制剂，因为本发明的发明人发现血清组X荚膜多糖在水性环境中意想不到地稳定。如果使用干燥的疫苗，则在注射前将其在水性制剂中重建。偶联疫苗的冻干是本领域已知的，例如MenjugateTM产品以冻干形式提供，而NeisVac-CTM和MeningitecTM以水性形式提供。为了在冻干过程中稳定偶联物，通常可以在组合物中包含例如1mg/ml-30mg/ml(如约25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)。在重建之后，这些稳定剂可存在于水性制剂中。
组合物可装在药瓶中，或者可装在填充好的注射器中。注射器可装有或未装有针头。注射器可包含一个组合物剂量，而小瓶可包含单一剂量或多个剂量。
本发明的水性制剂也适用于从冻干形式重建其它疫苗。本发明组合物用于所述临用前重建时，本发明提供药盒，其可包括两个药瓶，或可包括一个已填充注射器和一个药瓶，其中在注射前用所述注射器的内容物再活化药瓶的内容物。
本发明组合物可以包装成单位剂型或多剂型。就多剂型而言，与预填充注射器相比更优选药瓶。可用常规方法确定有效剂量体积，但组合物的人用注射剂量一般为0.5ml体积，例如用于肌内注射时。
组合物的pH通常为6至8，例如约7。可使用缓冲剂来维持稳定的pH。例如，用于本发明的水性制剂的典型缓冲剂是磷酸盐。例如，通常是无水磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的混合物。合适的浓度是10mM无水磷酸氢二钠和10mM磷酸二氢钠。当组合物包含氢氧化铝盐时，通常采用组氨酸缓冲剂[122]。所述组合物可以是无菌和/或无热原的。本发明的组合物可以与人体等张。
本发明组合物有免疫原性，更优选是疫苗组合物。本发明的疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)疫苗，但通常是预防性疫苗。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它组分。“免疫学有效量”是指以单一剂量或一系列剂量的部分给予个体的对治疗或预防有效的量。该量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组(例如，非人的灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验可确定的相对较宽范围内。
在各剂内，单独糖抗原的含量通常是1-50μg(以糖的质量计)，如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg。
脑膜炎奈瑟球菌会影响身体的各个部分，因此本发明中的组合物可以制备成各种形式。例如，可将所述组合物制备为水性溶液或悬浮液形式的注射剂。所述组合物可以制备成使用细粉或喷雾的肺部给药制剂，例如吸入剂。所述组合物可制备为栓剂或子宫托。该组合物可制备成用于鼻腔、耳内或眼部给药的制剂，例如喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉末剂[如参考文献123和124]。已报道成功地经鼻给予肺炎球菌糖[125，126]、Hib糖[127]、MenC糖[128]和Hib与MenC糖偶联物的混合物[129]。
本发明组合物可包含抗微生物剂，特别是以多剂量形式包装时。
本发明组合物可包含去污剂，如吐温(聚山梨酯)，如吐温80。去污剂的含量水平通常较低，如＜0.01％。
本发明组合物可含有钠盐(如氯化钠)以产生张力。一般是浓度为2-20mg/ml，例如约10±2mg/ml或约5±1mg/ml(尤其是约4.25mg)的NaCl。
本发明组合物通常包括缓冲剂。一般是磷酸盐缓冲剂。
本发明的组合物通常与其它免疫调节剂联合给予。具体说，组合物通常包括一种或多种佐剂。这类佐剂包括但不限于：
A.含有矿物质的组合物
适用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如，参见参考文献130的第8和9章]，或不同无机化合物的混合物(如磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选地含有过量磷酸盐)，化合物可采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，并且一般吸附于该盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[131]。
本发明的疫苗中可包含铝盐，使Al3+剂量为每剂0.2-1.0mg。
磷酸铝佐剂一般是无定形羟基磷酸铝，PO4/Al摩尔比为0.84至0.92，包括约0.6mg Al3+/ml。可采用低剂量磷酸铝吸附，如每剂量50-100μg Al3+/偶联物。采用磷酸铝并且不需要使抗原吸附于佐剂时，在溶液中包含游离的磷酸根离子(如采用磷酸盐缓冲液)比较有利。
B.油乳剂
适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59(5％鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)[参考文献130的第10章；也参见参考文献132-134]。将MF59用作FLUADTM流感病毒三价亚单位疫苗的佐剂。
尤其可用于组合物的佐剂是亚微米水包油乳液。本文所用的优选亚微米水包油乳剂是任选地含有各种含量的MTP-PE鲨烯/水乳剂，如含有4-5％w/v鲨烯、0.25-1.0％w/v吐温80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)和/或0.25-1.0％司盘85(山梨聚糖三油酸酯)，以及任选的N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳剂。参考文献132和135-136详细描述了亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫刺激剂(如胞壁酰肽)在本发明组合物中的应用。
也可将完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)用作本发明中的佐剂。
C.皂苷制剂[参考文献130的第22章]
皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的分离自皂树(Quillaia saponaria)Molina树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜)、满天星(Gypsophillapaniculata)(婚纱花)和肥皂草(Saponaria officianalis)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。
已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定纯化组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献137。皂苷制剂也可以包含甾醇，如胆固醇[138]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献130的第23章]。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任意已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献138-140中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[141]。
开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献142和143。
D.病毒小体和病毒样颗粒
病毒体和病毒样颗粒(VLP)也可以用作本发明的佐剂。这些结构通常包含任选与磷脂组合或一起配制的一种或多种病毒蛋白质。其通常无病原性，非复制型，且通常不含任意天然病毒基因组。所述病毒蛋白可重组生成或分离自全病毒。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括衍生自流感病毒(例如HA或NA)、乙肝病毒(例如核心蛋白或衣壳蛋白)、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体(如外壳蛋白)、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty(如反转录转座子Ty蛋白p1)的蛋白。VLP在参考文献144-149中有进一步描述。病毒体在例如参考文献150中有进一步描述。
E.细菌或微生物衍生物
适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌的脂多糖(LPS)的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。
LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A(MPL)和3-O-脱酰基MPL(3dMPL)。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见参考文献151中所述。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以在过滤除菌时通过0.22μm膜[151]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC-529[152，153]。
脂质A衍生物包括大肠杆菌(Escherichia coli)，如OM-174的脂质A衍生物。例如参考文献154和155中描述了OM-174。
适用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列(含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)。含回文或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。
CpG可以包含核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸酯修饰，且可以是双链或单链。参考文献156、157和158公开了可能的类似物取代，例如用2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献159-164中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。
所述CpG序列可以导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[160]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫反应，如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞反应，如CpG-B ODN。参考文献166-168中讨论了CpG-A和CpG-BODN。优选CpG为CpG-A ODN。
优选构建CpG寡核苷酸从而5’末端可被受体识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如，参考文献165和169-171。
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可以用作本发明的佐剂。优选所述蛋白衍生自大肠杆菌(大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”)、霍乱菌(“CT”)或百日咳菌(“PT”)。参考文献172中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献173中描述了将其用作胃肠道外佐剂。所述毒素或类毒素优选全毒素形式，包含A和B亚基。A亚基优选含有脱毒突变；B亚基优选不突变。佐剂优选脱毒的LT突变体如LT-K63、LT-R72和LT-G192。参考文献174-181中描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐剂。优选根据参考文献182中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的排列对比对氨基酸取代基编号，特别通过引用将其全文纳入本文。
F.人免疫调节剂
适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[183]等)[184]，干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
G.生物粘着剂和粘膜粘着剂
生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[185]或粘膜粘着剂，如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可以用作本发明的佐剂[186]。
H.微粒
微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒(即直径约100nm至约150μm，更优选约200nm至约30μm，最优选约500nm至约10μm的颗粒)由生物可降解的无毒材料(例如聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等)形成，优选聚(丙交酯-共-乙交酯共聚物)，并任选经处理而具有带负电荷的表面(例如用SDS处理)或带正电荷的表面(例如用阳离子去污剂处理，如CTAB)。
I.脂质体(参考文献130的第13和14章)
适用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献187-189所述。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂
适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[190]。该类制剂还包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇的组合[191]，以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种另外的非离子表面活性剂如辛苯糖醇的组合[192]。优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
K.聚磷腈(PCPP)
PCPP制剂参见例如参考文献193和194。
L.胞壁酰肽
适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺去甲-MDP)和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE)。
M.咪唑并喹诺酮(Imidazoquinolone)化合物
适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，“瑞喹莫德3M”)，见参考文献195和196所述。
N.缩氨基硫脲化合物
缩氨基硫脲化合物的例子，以及配制、制造和筛选适合用作本发明佐剂的所有这类化合物的方法包括参考文献197所述内容。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。
O.色胺酮化合物
色胺酮化合物的例子，以及配制、制造和筛选适合用作本发明佐剂的所有这类化合物的方法包括参考文献198所述内容。色胺酮化合物在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面尤其有效。
本发明也可包含以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，以下组合可用作本发明佐剂组合物：(1)皂苷和水包油乳液[199]；(2)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(例如3dMPL)[200]；(3)皂苷(例如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IL-12(任选+固醇)[201]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳液的组合[202]；(6)SAF，含有10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普流罗尼-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流体化形成亚微米乳液或涡旋产生粒度较大的乳液。(7)RibiTM佐剂系统(RAS)(瑞比免疫化学公司(Ribi Immunochem))，含有2％鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；和(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。
用作免疫刺激剂的其它物质可参见参考文献130的第7章。
使用铝盐佐剂特别有用，抗原通常吸附于这类盐。MenjugateTM和NeisVacTM偶联物采用氢氧化物佐剂，而MeningitecTM采用磷酸盐佐剂。可本发明组合物中使某些抗原吸附于氢氧化铝，而使另一些抗原结合磷酸铝。然而，通常只使用一种盐，如氢氧化物或磷酸盐，但二者不同时使用。并非所有偶联物都需要吸附，即某些或全部偶联物可在溶液中游离。
治疗方法
本发明还提供了一种在哺乳动物中引起免疫反应的方法，包含将本发明的药物组合物给予所述哺乳动物。免疫反应优选为保护性，优选涉及抗体。所述方法可以产生加强的应答。
所述哺乳动物优选人。当疫苗用于预防性用途时，人优选为儿童(例如，幼童或婴儿)或青少年；当疫苗用于治疗用途时，人优选为成人。意图用于儿童的疫苗也可给予成年人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。
本发明也提供用作药物的本发明组合物。药物优选能够引起哺乳动物的免疫反应(即它是一种免疫原性组合物)，并且更优选是疫苗。
本发明也提供本发明偶联物在制备引起哺乳动物免疫应答的药物中的应用。
本发明中的优选组合物能在可接受百分比的人对象中产生优于各抗原组分血清保护标准的抗体效价。众所周知抗原的关联抗体效价，高于该效价就认为宿主针对所述抗原发生血清转化，该类效价由诸如WHO的组织公布。优选多于80％的具有统计学显著性的对象样品发生血清转化，更优选多于90％，更优选多于93％，最优选96-100％。
本发明的组合物通常直接给予患者。可以通过胃肠外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或给予到组织间隙)，或通过直肠、口服、阴道、外用、透皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其它粘膜给药途径完成直接递送。优选肌肉内给予到大腿或上臂。注射可以通过针头(例如皮下针头)进行，但也可以采用无针注射。肌内剂量通常是0.5ml。
本发明可用来引发全身和/或粘膜免疫。
剂量治疗可采用单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强的免疫方案。初次给药方案之后，可以进行加强给药方案。可以常规确定初次剂量之间(例如4-16周)以及初次和加强剂量之间的适当时机。
示例性载体蛋白
如上述，本发明的发明人发现参考文献65和66中所述的载体蛋白特别适合用作本发明中的载体分子，尤其是这些文献中SEQ ID NO：9的蛋白质(其也是本文中的SEQ ID NO：9)。
这些载体分子包括spr0096抗原和spr2021抗原。载体分子通常包括作为单多肽链的spr0096抗原和spr2021抗原(“杂交”多肽)。在下文中更详细地描述了spr0096抗原、spr2021抗原和杂交多肽的性质。
spr0096抗原
参考文献203中的原始“spr0096”多肽序列标注为“假拟蛋白”(参见GI：15902140)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr0096的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：1。
本发明的spr0096抗原包括至少一种CD4+T细胞表位。CD4+T细胞辅助B淋巴细胞产生针对抗原的抗体[204]。可凭经验确定T-细胞表位(如利用PEPSCAN[205，206]或相似方法)，或可预测这些表位(如利用Jameson-Wolf抗原性指数[207]、基于矩阵的方法[208]、T表位[209]、神经网络[210]、OptiMer和EpiMer[211，212]、ADEPT[213]、Tsites[214]、亲水性[215]、抗原性指数[216]或参考文献217中所述的方法等)。
本发明所用的优选spr0096抗原包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQID NO：1具有50％或以上的相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO：1至少n个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些spr0096多肽包含SEQ IDNO：1的变体(如SEQ ID NO：2；见下)。(b)的优选片段包括来自SEQID NO：1的至少一种CD4+T细胞表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：1的C-末端的一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或N-末端的一个或多个氨基酸(例如，1、2、1、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)，同时保留SEQ ID NO：1的至少一个CD4+T细胞表位。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。一个合适的片段是SEQ ID NO：14，其省略了天然前导肽序列。spr0096抗原可以由来自SEQ ID NO：1的单个CD4+T细胞表位组成。
相对于SEQ ID NO：1在C-端附近有插入物的spr0096的变体形式是本文所述的SEQ ID NO：2。参考文献218中报道将此种变体(其中的SEQ IDNO：150)用于免疫，在其中标注为LysM结构域蛋白。因此，本发明所用的spr0096抗原可包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQ ID NO：2具有50％或以上的相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO：2至少n个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些多肽包含SEQ ID NO：2的变体。(b)的优选片段包括来自SEQ ID NO：2的至少一种CD4+T细胞表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：2的C-末端的一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或N-末端的一个或多个氨基酸(例如，1、2、2、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)，同时保留SEQ ID NO：2的至少一个CD4+T细胞表位。其它片段省去一个或多个蛋白结构域。一个合适的片段是SEQ ID NO：15，其省略了天然前导肽序列。参考文献218的表1中鉴定了SEQ ID NO：2的免疫原性片段。spr0096抗原可以由来自SEQ ID NO：2的单个CD4+T细胞表位组成。
spr0096抗原可以二聚体，例如同源二聚体的形式使用。
spr2021抗原
参考文献203中将原始“spr2021”多肽序列标注为“全身应激蛋白GSP-781”(参见GI：15904062)。出于参比目的，R6菌株中发现的全长spr2021的氨基酸序列在本文中列为SEQ ID NO：3。
本发明的spr2021抗原包括至少一种CD4+T细胞表位。
本发明所用的优选spr2021抗原包含某氨基酸序列，该序列：(a)与SEQID NO：3具有50％或以上的相同性(例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或以上)；和/或(b)包含SEQ ID NO：3至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。这些spr2021多肽包含SEQ ID NO：3的变体。(b)的优选片段包括来自SEQ ID NO：3的至少一种CD4+T细胞表位。其他优选片段缺少来自SEQ ID NO：3的C-末端的一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)和/或N-末端的一个或多个氨基酸(例如，1、3、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)，同时保留SEQ ID NO：3的至少一个CD4+T细胞表位。其它片段省去一个或多个蛋白质结构域。一个合适的片段是SEQ ID NO：4，其省略了天然前导肽序列。spr0096抗原可以由来自SEQID NO：3的单个CD4+T细胞表位组成。
参考文献218将spr2021标注为与GbpB具有同源性的分泌型45kDa蛋白并且公开了它作为免疫原的应用(其中的SEQ ID NO：243；SP2216)。参考文献218的表1中鉴定了spr2021的免疫原性片段(第73页)。另一个有用的spr2021片段公开于参考文献219的SEQ ID NO：1(本文中SEQ IDNO：3的氨基酸28-278)。
杂交多肽
spr0096抗原和spr2021抗原通常以单个多肽链表达(“杂交”多肽)。杂交多肽可以通式NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH表示，其中：A是任选的N-末端氨基酸序列；B是任选的C-末端氨基酸序列；n是2或更大的整数(例如，2、3、4、5、6等)；各X是spr0096抗原或spr2021抗原的氨基酸序列(如上述)，其中至少一个X是spr0096抗原并且至少一个X是spr2021抗原；并且L是任选的接头氨基酸序列。n通常为2。当n为2时，X1通常是spr0096抗原而X2通常是spr2021抗原。当n大于2时，各spr0096抗原(当存在超过一种时)可以是相同的或不同的并且各spr2021抗原(当存在超过一种时)可以是相同的或不同的。
各X的氨基酸序列的spr0096抗原或spr2021抗原如上定义。当这些抗原定义为(a)与给定的序列有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含给定的序列的至少‘n’个连续氨基酸的片段，其中‘n’是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)时，对于各X而言，(a)中的相同性水平和(b)中“n”的值可以是相同的。
在杂交蛋白中可以包括或缺少各-X-部分的野生型中的前导肽序列。在一些实施方式中，前导肽可缺失，除非-X-部分位于杂交蛋白的N-末端，即保留X1的前导肽，但略去X2...Xn的前导肽。这相当于删除所有前导肽并使用X1的前导肽作为-A-部分。
在{-X-L-}的各个n值的情况下，接头氨基酸序列-L-可存在或不存在。例如，当n＝2时，杂交体可以是NH2-X1-L1-X2-L2-COOH、NH2-X1-X2-COOH、NH2-X1-L1-X2-COOH、NH2-X1-X2-L2-COOH等。接头氨基酸序列-L-一般较短(如20个或更少个氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。示例包括有利于克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接头(即包含Glyn，其中n＝2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大)，和组氨酸标签(即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。本领域技术人员显然了解其它合适的接头氨基酸序列。有用的接头是GSGGGG(SEQ ID NO：5)或GSGSGGGG(SEQ ID NO：6)，Gly-Ser二肽由BamHI限制位点形成，因而有助于克隆和操作，(Gly)4四肽是常用的多聚甘氨酸接头。其他合适接头，尤其是用作最后一个Ln的接头，是Leu-Glu二肽或SEQ ID NO：7。
-A-是任选的N末端氨基酸序列。其一般较短(如40个或更少个氨基酸，即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。示例包括指导蛋白质运输的前导序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大)。其它合适的N-末端氨基酸序列对于本领域技术人员来说是显而易见的。如果X1缺少其自身的N末端甲硫氨酸，-A-优选是提供N末端甲硫氨酸的寡肽(例如，具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)，如Met-Ala-Ser或单个Met残基。
-B-是任选的C末端氨基酸序列。其一般较短(如40个或更少个氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。示例包括指导蛋白质运输的前导序列、有利于克隆或纯化的短肽序列(例如包含组氨酸标签，即Hisn，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更大，例如SEQ ID NO：8)，或增强蛋白质稳定性的序列。其它合适的C末端氨基酸序列对于本领域技术人员来说是显而易见的。
杂交体的示例包含包括spr0096-spr2021(例如SEQ ID NO：9)或spr2021-spr0096(例如，SEQ ID NO：10)的氨基酸序列的多肽。杂交体也可以包括与SEQ ID NO：9或10有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)的氨基酸序列。杂交体通常包括SEQ ID NO：9的氨基酸序列。杂交体也可以包括与SEQ ID NO：9有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)的氨基酸序列。
在特定的实施方式中，载体分子包括(a)一个或多个(例如，1、2、3、4、5个等)来自SEQ ID NO：2的CD4+T细胞表位；以及(b)一个或多个(例如，1、2、3、4、5个等)来自SEQ ID NO：3的CD4+T细胞表位。
测试样品的方法
在一个特定的方面，本发明提供了用于测试疑似含有血清组X荚膜多糖的样品的方法，包括以下步骤：(i)使样品中的任意血清组X荚膜多糖水解，得到水解物；(ii)使该水解物经过液相色谱；和(iii)检测步骤(ii)中分离的任意葡糖胺-4-磷酸。
该方法可用于对样品中的血清组X荚膜多糖进行定量。在该方法中，能够测定样品中多糖的浓度。通常，定量包括与N-乙酰葡糖胺-4-磷酸标准物的比较。然而，也可使用其他标准物，包括葡糖胺-6-磷酸。
虽然已经开发了针对血清组X荚膜多糖的方法，该方法适用于在其结构中具有葡糖胺-4-磷酸的任意物质，例如，细菌脂质A。因此，本发明提供了用于测试疑似含有在其结构中具有葡糖胺-4-磷酸的物质的样品的方法，包括以下步骤：(i)使样品中在其结构中具有葡糖胺-4-磷酸的任意物质水解，得到水解物；(ii)使该水解物经过液相色谱；和(iii)检测步骤(ii)中分离的任意葡糖胺-4-磷酸。
样品
样品通常是疫苗，例如，当该方法用于在疫苗产品的表征中的多糖定量时。然而，该方法也可用作疫苗制备期间的加工中测试。在这些实施方式中，样品会是来自制备加工的加工中间体。本发明的方法能够对非常低浓度的血清组X荚膜多糖(≥0.5μg/ml)进行定量并且因此适于在小样品中测试血清组X荚膜多糖，例如取自制备加工期间的加工中的样品。该方法也对血清组X荚膜多糖有特异性，甚至当存在杂质时。因此，样品可以是发酵液，或取自发酵液的上清液。
样品可含有游离(未偶联)的血清组X荚膜多糖和/或偶联的血清组X荚膜多糖。因此，该方法可用于测试从细菌制备的多糖、纯化后的多糖、偶联前的多糖和/或偶联后的多糖。
在含有偶联的血清组X荚膜多糖的样品中，可使用样品中游离的多糖与总体多糖的水平比较(即，未偶联的多糖：(未偶联+偶联)的多糖之比)来确定稳定性。不希望有高水平的未偶联的多糖。这类试验的时序特征可揭示例如在储存期间偶联物是否稳定。游离的多糖的水平也可用于检查偶联反应是否进行完全。
样品通常是水性的，但是可以从干燥形式(例如冻干物)重建成水性形式。因此，样品可含有冻干稳定剂。这些稳定剂包括如糖醇(例如，甘露醇等)、二糖(例如蔗糖、海藻糖等)和其他简单糖类的物质。本发明的方法的一个优势在于它们可相对于杂质背景测试血清组X荚膜多糖，而不需要多糖和杂质的预先分离。
可在分析之前对样品进行稀释。在分析之后，样品中多糖的水平可与原始未稀释的材料中的水平相关。稀释可用于，例如，确保对样品的分析得出落在校准曲线的需要部分内的结果。
除了血清组X荚膜多糖以外，样品可含有例如来自B型流感嗜血杆菌、来自其他脑膜炎球菌血清组(例如，A、C、W135和/或Y)、来自肺炎链球菌等的细菌荚膜糖。
样品也可含有其他组分，如在疫苗中常发现非抗原组分。例如，如上述，这些可包括载体、佐剂、赋形剂、缓冲剂等。
在一些情况中，可用已知量的讨论中的分析物掺混样品以，例如添加已知量的偶联或未偶联形式的血清组X荚膜多糖。掺混研究可用于校准，并且用于研究灵敏度、变异性、回收率等。
水解
该方法包括血清组X荚膜多糖的水解。一般的水解方法包括例如使用三氟乙酸(TFA)的酸水解。本发明的发明人发现特别有效的条件是用2MTFA在100℃下处理2至3小时(例如，2.5小时)。这些条件允许多糖单体亚基在不发生降解的情况下良好释放。然而，例如持续1至6小时的较短或较长的处理也是可能的。
如上述，通过使整个样品经过水解来从包含偶联的多糖的样品中制备总体血清组X荚膜多糖。如果仅需要测量偶联的或未偶联的血清组X荚膜多糖，然而，则应该在水解之前将偶联和未偶联的多糖互相分开。合适的分离技术包括选择性沉淀、基于尺寸的方法、固相萃取[220]等。
液相色谱
通过液相色谱分析血清组X荚膜多糖水解的结果。因此，本发明的方法通常会采用液相色谱柱，并且会包括分析该柱的输出物。
可使用各种液相色谱柱，但本发明通常会使用高效液相色谱(HPLC)。本发明可特别用于分析由高效阴离子交换色谱(HPAEC)或高效阳离子交换色谱(HPCEC)分离的结果。HPAEC是一种在糖表征中常用的技术，通常与脉冲电流检测(PAD)[221，222]组合以对多糖进行检测和定量。由DionexTM公司(加利福尼亚州萨尼维尔)，例如BioLCTM系统提供合适的HPAEC-PAD系统。在这些系统中，使用PAD对来自HPAEC柱的洗脱物进行分析，即基于电流。在合适的(高)pH下，可通过在电极的表面上施加正电势来使碳水化合物电催化氧化。以这种方式产生的电流与糖浓度成比例，使得可通过电流分析法对糖进行检测和定量。与简单的电流分析检测相比，PAD可在标准检测电势中间插清除和再生电势的短脉冲，从而避免当分析物的氧化产物在电极处堆积时产生的困难。
非电流分析方法可与PAD组合用于分析洗脱物，例如参见参考文献223。
因此，经水解的血清组X荚膜多糖可经过HPAEC用于分离并且可检测经分离的材料，并任选地由PAD定量。如下文实施例所示，HPAEC-PAD可从样品中的其他背景材料分离经水解的葡糖胺-4-磷酸残基。
优选柱自发保留糖，从而必须从柱中洗脱它们。从色谱柱中洗脱可以是等度洗脱或梯度洗脱。包含氢氧化物和/或乙酸盐的洗脱剂是用于糖的HPAEC-PAD分析中使用的一般洗脱剂。然而，也能够使用阴离子，如硝酸根、氯离子等。一般使用钠盐。为从AEC柱洗脱分析物，所述洗脱剂通常为碱性，例如，pH＞8、＞9、＞10、＞11、＞12、＞13等。可使用氢氧化物盐(例如，NaOH)来实现需要的pH。
可对洗出液进行氢氧离子化学抑制，特别是在所述离子干扰所采用的分析检测技术的情况中。可方便地采用微膜抑制剂，如DionexTM的MMS产品。“MMS III”产品采用连续的化学抑制以增大分析物的导电率和减小洗脱剂的导电率，能够在宽浓度范围内进行采用等度或梯度洗脱应用离子交换的直接电导检测。
用于本发明的合适的HPAEC柱是戴安公司(Dionex)销售的“CarboPac”柱，如PA1[2％与二乙烯基苯交联的10μm直径聚苯乙烯底物，与500nm微珠(MicroBead)季铵官能化胶乳(5％交联)附聚]、PA100、PA20、PA10[55％与二乙烯基苯交联的10μm直径乙基乙烯基苯底物，与460nm微珠双官能季铵离子(5％交联)]、PA200或MA1柱。
分析型HPAEC柱可与前置柱和/或捕获柱联用。例如，PA10分析型柱可与在线PA10保护柱和/或在线捕获(预处理)柱联用。这种柱可去除其它情况下会干扰分析的物质，例如，“氨基捕获(Amino Trap)”柱可在糖分析之前去除氨基酸。还可使用硼酸盐捕获。一般的“氨基捕获”树脂是移接有双官能季铵阴离子交换位点的10μm直径的物质(55％与二乙烯基苯交联的乙基乙烯基苯)，而一般的“硼酸盐捕获(Borate Trap)”具有20μm直径高容量树脂，其对硼酸盐有非常高的选择性。
PA1和PA10柱都是设计用于PAD以递送单糖和二糖的高分辨率分离的阴离子交换柱，并且其树脂都是由官能化的微珠的细乳胶覆盖的10μm直径无孔珠。它们的薄膜树脂结构允许出色的传质，产生高分辨率色谱和快速再平衡。虽然PA1是适于在多种基质中测定单糖和二糖的万能柱并且是选择的用于线性多糖的高分辨率分离的柱，PA10经优化以测定在哺乳动物糖蛋白的碳水化合物部分中发现的氨基、中性和酸性单糖。PA1和PA10柱之间的主要差异在于PA1中的树脂是2％与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯，但是在PA10中，其是55％与二乙烯基苯交联的乙基乙烯基苯。
迄今，最优选的用于血清组X荚膜多糖的HPAEC分离方法包括CarboPac PA1柱(4x250mm)与保护PA1前置柱(4x50mm)的组合。
在洗脱和检测之后，本发明可包括测定在样品中鉴定的任意血清组X荚膜多糖的特征，例如其DP(通常是平均DP)、其分子量、其纯度等的额外步骤。
N-乙酰葡糖胺-4-磷酸的制备
在其他方面，本发明提供了用于制备N-乙酰葡糖胺-4-磷酸的方法和试剂。如上所述，该化合物可用作用于测试血清组X荚膜多糖的方法中的分析标准物。
在该方面的第一实施方式中，本发明提供了一种方法，该方法包括：对式A的化合物进行N-脱保护和对经脱保护的化合物进行N-酰基化，以得到式B的化合物；
其中PG是氧保护基团；PGN是氮保护基团并且所有的PG基团是一样的。PG和PGN可以是任意合适的保护基团，例如，如参考文献224中所述。
在该方面的第二实施方式中，本发明提供了用于在式B的化合物中导入有机磷酸酯基团以得到式C的化合物的方法：
其中两个RP基团是相同的并且RP是H或芳基甲基磷酸保护基团，例如，如参考文献224中所述；或RP基团连接在一起以形成单个芳基甲基保护基团，例如，邻-二甲苯基。PG如上定义并且所有的PG基团是相同的。在RP是H的情况下，式B的化合物一般与磷酸化试剂和氧化剂反应。一般在吡啶和新戊酰氯存在下，磷酸化试剂可以是氯亚磷酸水杨基酯(salicylchlorophosphite)。磷酸化试剂也可以是PCl3，之后是水或水性NaHCO3。氧化剂可以是I2或mCPBA，一般是I2。在RP基团连接在一起形成单个保护基团的情况中，式B的化合物一般与含邻-二甲苯的有机磷试剂反应，然后与氧化剂反应。含邻-二甲苯的有机磷试剂一般是亚磷酰胺，如N-二乙基-1，5-二氢-3H-2，3，4-苯并二氧杂膦-3-胺。氧化剂可以是I2或mCPBA，一般是mCPBA。在RP基团并不连接在一起形成单个保护基团的情况中，式B的化合物一般与含RP基团的焦磷酸试剂反应。合适的焦磷酸试剂是四苄基焦磷酸，其中RP是苄基。
在该方面的第三实施方式中，本发明提供了包括使式C的化合物脱保护以得到N-乙酰葡糖胺-4-磷酸的方法：
PG和RP如上述定义并且所有的PG基团是相同的。一般地，当Rp是磷酸保护基团时，在相同的步骤中去除所有的PG基团和RP基团，例如通过氢解。
在该方面的其他实施方式中，本发明提供了包括第一实施方式之后是第二实施方式；第二实施方式之后是第三实施方式以及第一实施方式之后是第二实施方式，其之后是第三实施方式的方法。在包括第一实施方式的这些实施方式中，可通过下述的其他实施方式进行第一实施方式。
在该方面的其他实施方式中，本发明提供了用于制备上述式A的化合物的方法，该方法包括使式Z的化合物还原以得到式A′的化合物：
其中R1是苯基或由一个或多个选自烷基的基团(如甲基或乙基)取代的苯基；O-烷基，如O-甲基；和硝基，使得式A′中的R1CH2-部分是取代的或未取代的苄基醚氧保护基团。保护基团可以是例如参考文献224中所述的任意合适的保护基团。具体地，保护基团可以是苄基、对甲氧基苄基、3，4-二甲氧基苄基、2，6-二甲氧基苄基、邻硝基苄基、对硝基苄基，并且一般是苄基。PGN是上述定义的氮保护基团。一般的PGN基团是邻苯二甲酰亚胺；氨基甲酸酯如Boc和Fmoc；硝基苯基磺酰基(nosyl)、甲苯磺酰基和甲磺酰基。具体地，PGN是邻苯二甲酰亚胺。一般地，反应包括式Z的化合物(其中R1是苯基并且PGN是邻苯二甲酰亚胺基)与含硼化合物以及路易斯酸在有机溶剂中发生反应得到式A′的化合物。含硼化合物可以是氢硼化物试剂，如三烷基氨基硼烷，尤其是三乙基氨基硼烷或三甲基氨基硼烷，并且一般是三甲基氨基硼烷。路易斯酸可以是AlCl3或含硼的路易斯酸，如三氟化硼复合物，并且一般是BF3·Et2O。有机溶剂可以是氯化的有机溶剂，例如CHCl3或CH2Cl2或者非氯化的溶剂，并且一般是乙腈。该反应可在约-10至约10℃，约-5至约5℃，一般约0℃的温度范围内进行。
该方面的第一实施方式的一个示例包括步骤i)式A′的化合物的N-脱保护和步骤ii)对经脱保护的化合物进行N-酰基化以得到式B′的化合物：
其中R1和PGN如上述所定义。一般地，该反应包括将步骤i)中的式A′的化合物，其中PGN是邻苯二甲酰亚胺与1，2-二氨基乙烷在醇溶剂如甲醇或乙醇(一般是乙醇)中反应。步骤i)通常在室温和溶剂的回流温度之间进行，例如在约25℃或更高、约25至约80℃、约35至约80℃、约45至约80℃、约55至约80℃、约65至约80℃、约75至约80℃、一般约80℃或大约溶剂的回流点。步骤ii)包括添加酰基化试剂。酰基化试剂可以是任意合适的酰基化试剂，一般是含胺碱如吡啶或三乙基胺或咪唑的Ac2O。或者，酰基化试剂可以是EtOH∶Ac2O的约4∶1的混合物。可在大约室温下，例如约25℃下进行步骤ii)。一般地，在步骤i)和ii)之间没有纯化步骤，例如在进行步骤ii)之前仅去除步骤i)的溶剂。
该方面的第二实施方式的一个示例包括向式B′的化合物中导入有机磷酸基团以得到式C′的化合物：
其中，R1按照前面定义。一般地，在胺碱(一般为1H-四唑)存在下，式B′的化合物首先与含邻二甲苯的有机磷试剂，例如亚磷酰胺如N-二乙基-1，5-二氢-3H-2，3，4-苯并二氧杂膦-3-胺，在有机溶剂(如THF或CH2Cl2，一般是CH2Cl2)中反应。然后加入氧化剂，如吡啶和水中的I2或mCPBA。通常在约-20℃至约20℃、约-15℃至约15℃、约-10℃至约10℃、约-5℃至约5℃，并且一般约0℃的温度下使用mCPBA。mCPBA通常加入到与第一步骤中使用的反应溶剂相同的反应溶剂中。例如，在加入mCPBA之前可通过TLC分析检测第一步骤的完成。
该方面的第二实施方式的另一个示例包括向式B′的化合物中导入有机磷酸基团以得到式C″的化合物：
其中，R1按照前面定义。一般地，式B′的化合物与焦磷酸试剂，例如四苄基焦磷酸发生反应。在碱存在下进行该反应，合适的碱是氨化锂，如LDA或LiHMDS。在有机溶剂中进行该反应，例如诸如CH2Cl2的氯化溶剂或者其他醚溶剂，一般是二乙醚或THF。一般地，在低于约0℃下进行该反应，例如，约-10℃、约-20℃、约-30℃、约-40℃、约-50℃、约-60℃、约-70℃、合适地约-80℃然后约-30℃。
该方面的第二实施方式的另一个示例包括向式B′的化合物中导入有机磷酸基团以得到式C″′的化合物：
其中，R1按照前面定义。一般地，用合适的磷酸化试剂和氧化剂将式B′的化合物磷酸化。一般的磷酸化试剂是氯亚磷酸水杨基酯或PCl3和水或水性NaHCO3。当磷酸化试剂是氯亚磷酸水杨基酯时，一般在吡啶溶剂中进行反应并且一般存在新戊酰氯。通常在室温下进行反应，例如约25℃。然后加入氧化剂，如吡啶和水中的I2，或者mCPBA，一般是I2。在加入氧化剂之前，反应一般冷却至低于约0℃，例如冷却至约-10℃、约-20℃、约-30℃、约-40℃、约-50℃、一般约-40℃。一般在约0℃的温度下完成氧化。I2一般以吡啶/水中溶液的形式添加。溶液的浓度一般为约0.1至1M、约0.2至0.9M、约0.3至0.8M、约0.4至0.7M、合适地约0.5M。吡啶与水的比率一般为约10∶1至30∶1、约12∶1至约28∶1、约14∶1至约26∶1、约16∶1至约24∶1、约18∶1至约22∶1、合适地约19∶1。氧化剂通常加到与第一步骤中使用的反应溶剂相同的反应溶剂中。例如，在加入氧化剂之前可通过TLC分析检测第一步骤的完成。式C″′的化合物通常分离为盐，一般是二-三乙基铵盐。
当磷酸化试剂是PCl3和水或水性NaHCO3时，一般在有机溶剂如MeCN中进行反应。合适地在室温下，在PCl3之后加入水或水性NaHCO3。然后加入氧化剂，如I2或mCPBA，一般是I2。通常，在加入氧化剂之前去除溶剂并且加入新的溶剂。新溶剂一般是吡啶和三乙基胺的混合物。吡啶与三乙基胺的比率一般为约2∶1至约8∶1，合适地为约4∶1。I2一般以吡啶/水中溶液的形式添加。溶液的浓度一般为约0.1至1M、约0.2至0.9M、约0.3至0.8M、合适地约0.4M。式C″′的化合物通常分离为盐，一般是二-三乙基铵盐。
该方面的第三实施方式的示例包括对式C′的化合物进行脱保护，一般通过氢解脱保护以得到N-乙酰葡糖胺-4-磷酸：
其中，R1按照前面定义。一般地，在钯催化剂如10％Pd/C或珀尔曼催化剂(Pearlman’s catalyst)Pd(OH)2/C存在下，式C′的化合物与H2在醇溶剂(例如甲醇或乙醇，并且一般是甲醇)中反应。通常在约1至约5atm、约1至约4atm、约1至约3atm、约至约2atm、一般约1atm的压力下进行反应。
该方面的第三实施方式的另一个示例包括对式C″的化合物进行脱保护，一般通过氢解脱保护以得到N-乙酰葡糖胺-4-磷酸：
其中，R1按照前面定义。一般地，在钯催化剂如10％Pd/C或珀尔曼催化剂Pd(OH)2/C存在下，式C″的化合物与H2在醇溶剂(例如甲醇或乙醇，并且一般是甲醇)中反应。通常在约1至约5atm、约1至约4atm、约1至约3atm、约至约2atm、一般约1atm的压力下进行反应。
该方面的第三实施方式的另一个示例包括对式C″′的化合物或其二-三乙基铵盐进行脱保护，一般通过氢解脱保护以得到N-乙酰葡糖胺-4-磷酸：
其中，R1按照前面定义。一般地，在钯催化剂如10％Pd/C或珀尔曼催化剂Pd(OH)2/C存在下，式C″′的化合物与H2在醇溶剂(例如甲醇或乙醇，并且一般是甲醇)中反应。通常在约1至约5atm、约1至约4atm、约1至约3atm、约至约2atm、一般约1atm的压力下进行反应。
例如，可通过结晶，或更典型地通过色谱，尤其是使用疏水性改性的二氧化硅固定相的色谱来纯化N-乙酰葡糖胺-4-磷酸。
本发明也提供了该方面的方法的化合物和中间体，尤其是式C的化合物，并且更特别是式C′、C″和C″′的化合物。
在另一个实施方式中，该方面的方法可以如下：
该实施方式的合适反应条件在下文中的“本发明的实施方式”部分中提供(例如，在方案1中)。
概述
除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，参考文献225-232等。
上文使用“GI”编号。GI编号，或者“基因信息识别号”(GenInfoIdentifier)是NCBI将序列加入其数据库时，连续对每一序列记录指定的一串数字。GI编号与序列记录登录号没有相似之处。序列更新(如纠正或加入更多注释或信息)后，将接受新GI编号。因此与给定GI编号相关的序列是不变的。
当抗原“结构域”被省略时，可以包括省略信号肽、胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域等。
术语“包括”涵盖“包含”以及“由……组成”，例如，“包括”X的组合物可以仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”表示例如，x±10％。
术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。如有需要，“基本上”一词可从本发明的定义中省略。
当本发明提供一种涉及多个连续步骤的方法时，本发明还可以提供涉及比步骤总数少的方法。相似地，起始多糖材料已被部分加工时，本发明包括仅涉及某方法的后续步骤的方法。可在不同时间由不同人员在不同地点(例如在不同国家)进行这些不同的步骤。
应理解糖环可以是开放或闭合形式，而且虽然本文结构式中显示的是闭合形式，但本发明也包括开放形式。类似的，应理解糖可以吡喃糖和呋喃糖形式存在，而且虽然本文的结构式中显示的是吡喃糖形式，但也包括呋喃糖形式。还可包含糖的不同异头形式。
两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同氨基酸的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献233的7.7.18部分所描述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。优选的比对通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法使用仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。参考文献234中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。
本发明的具体实施方式
本发明的具体实施方式包括：
1.一种脑膜炎奈瑟球菌血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联物。
2.如实施方式1所述的偶联物，其中可通过包括以下步骤的方法得到该偶联物：(a)使荚膜多糖中的伯羟基氧化，以得到具有醛基的经氧化的多糖；和(b)使经氧化的多糖通过醛基与载体分子偶联，从而得到该偶联物。
3.如实施方式2所述的偶联物，其中步骤(a)中的氧化是荚膜多糖中1-10％的残基上的伯羟基的氧化。
4.如实施方式3所述的偶联物，其中氧化是荚膜多糖中4-8％的残基上的伯羟基的氧化。
5.如实施方式2-4中任一项所述的偶联物，其中，步骤(a)中的氧化是TEMPO-介导的氧化。
6.如实施方式2-5中任一项所述的偶联物，其中，步骤(b)中的偶联是直接的。
7.如实施方式6所述的偶联物，其中步骤(b)中的偶联是通过醛基与载体分子上的伯胺基之间的还原性胺化。
8.如实施方式1所述的偶联物，其中可通过包括以下步骤的方法得到该偶联物：(a)荚膜多糖的还原末端的还原性胺化，以得到具有通过共价键与末端亚基的C-1原子连接的伯胺基的经修饰的多糖；和(b)通过伯胺基将经修饰的多糖与载体分子偶联，从而得到该偶联物。
9.如实施方式8所述的偶联物，其中步骤(b)中的偶联是通过接头。
10.如实施方式1所述的偶联物，其中可通过包括以下步骤的方法得到该偶联物：(a)荚膜多糖还原末端的还原，以得到在末端具有2个相邻羟基的经修饰的多糖；(b)相邻羟基的氧化切割，以得到在末端具有醛基的经进一步修饰的多糖；(c)醛基的还原性胺化，以得到在末端具有伯胺基的经进一步修饰的多糖和(d)通过伯胺基使经进一步修饰的多糖与载体分子偶联，从而得到该偶联物。
11.如实施方式10所述的偶联物，其中伯胺基通过共价键与末端亚基的C-5原子结合。
12.如实施方式10所述的偶联物，其中步骤(c)中的还原性胺化在醛基和式X1-L-X2的双官能接头的末端伯胺基之间发生，其中X1包括末端伯胺基；X2包括另一个末端伯胺基；并且L是连接部分。
13.如实施方式12所述的偶联物，其中X1和X2基团都是-NHNH2。
14.如实施方式10-13中任一项所述的偶联物，其中，步骤(d)中的偶联通过接头。
15.如实施方式9或14所述的偶联物，其中偶联是通过双官能接头，其含有用于与伯胺基偶联的第一基团和用于与载体分子中的胺偶联的第二基团。
16.如实施方式15所述的偶联物，其中双官能接头是式X-L-X的均质双官能接头，其中两个X基团彼此相同并可与伯胺发生反应；并且其中L是接头中的连接部分。
17.如实施方式16所述的偶联物，其中X基团是N-氧基琥珀酰亚胺。
18.如实施方式12、13、16或17中任一项所述的偶联物，其中L具有式-L′-L2-L′-，其中L′是羰基。
19.如实施方式18所述的偶联物，其中L2是-(CH2)4-。
20.如前述实施方式中任一项所述的偶联物，其中荚膜多糖是寡糖。
21.如实施方式20所述的偶联物，其中寡糖具有60至100或10至20的聚合度。
22.如前述实施方式中任一项所述的偶联物，其中载体分子是白喉类毒素或破伤风类毒素、CRM197或蛋白D。
23.如实施方式1-21中任一项所述的偶联物，其中载体分子包括spr0096抗原和spr2021抗原。
24.如实施方式23所述的偶联物，其中spr0096抗原包括与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2有50％或更高相同性的氨基酸序列。
25.如实施方式23或实施方式24所述的偶联物，其中spr2021抗原包括与SEQ ID NO：3有50％或更高相同性的氨基酸序列。
26.如实施方式23-25中任一项所述的偶联物，其中载体分子包含单多肽链形式的spr0096抗原和spr2021抗原。
27.如实施方式26所述的偶联物，其中多肽链具有式NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH，其中：A是任选的N-末端氨基酸序列；B是任选的C-末端氨基酸序列；n是2或更大的整数；各X是spr0096抗原或spr2021抗原的氨基酸序列，其中至少一个X是spr0096抗原并且至少一个X是spr2021抗原；并且L是任选的接头氨基酸序列。
28.如实施方式27所述的偶联物，其中n为2。
29.如实施方式28所述的偶联物，其中X1是spr0096抗原而X2是spr2021抗原。
30.如实施方式29所述的偶联物，其中多肽链包括与SEQ ID NO：9有50％或更高相同性的氨基酸序列，尤其是SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
31.一种包括血清组X荚膜多糖的免疫原性组合物，尤其是以任意前述实施方式所定义的偶联物的形式。
32.如实施方式31所述的免疫原性组合物，还包含一种或多种其他抗原。
33.如实施方式31或实施方式32所述的免疫原性组合物，该组合物还包括血清组A荚膜多糖。
34.如实施方式33所述的免疫原性组合物，其中血清组A荚膜多糖与载体分子偶联。
35.如实施方式31-34中任一项所述的免疫原性组合物，该组合物还包括血清组W135荚膜多糖。
36.如实施方式35所述的免疫原性组合物，其中该组合物包括与载体分子偶联的血清组A荚膜多糖。
37.如实施方式35或实施方式36所述的免疫原性组合物，其中血清组W135荚膜多糖与载体分子偶联。
38.如实施方式34、36或37所述的组合物，其中载体分子如实施方式22中所定义。
39.如实施方式31-38中任一项所述的免疫原性组合物，该组合物还包括血清组C荚膜多糖。
40.如实施方式31-39中任一项所述的免疫原性组合物，该组合物还包括血清组Y荚膜多糖。
41.如实施方式39或实施方式40所述的免疫原性组合物，其中荚膜多糖与载体分子偶联。
42.如实施方式41所述的组合物，其中载体分子如实施方式22中所定义。
43.如实施方式31-42中任一项所述的免疫原性组合物，其中该组合物是水性制剂。
44.一种包含如实施方式31-43中任一项所述的免疫原性组合物的疫苗。
45.一种在哺乳动物中引起免疫应答的方法，该方法包括向哺乳动物给予如实施方式31-44中任一项所述的免疫原性组合物。
46.一种用于制备血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联物的方法，其中该方法如实施方式2-19中任一项所定义。
47.如实施方式46所述的方法，其中偶联物如实施方式20-30中任一项所定义。
48.一种药物组合物，其包含(a)血清组X荚膜多糖和(b)药学上可接受的载体，其中该组合物是水性制剂。
49.如实施方式48所述的药物组合物，其中血清组X荚膜多糖是如实施方式1-30中任一项所定义的偶联物的形式。
50.如实施方式48或实施方式49所述的药物组合物，该组合物还包含如实施方式32-42中任一项所定义的一种或多种其他抗原。
51.一种用于测试疑似含有血清组X荚膜多糖的样品的方法，该方法包括以下步骤：(i)使样品中的任意血清组X荚膜多糖水解，得到水解物；(ii)使该水解物经过液相色谱；和(iii)检测步骤(ii)中分离的任意葡糖胺-4-磷酸。
52.如实施方式51所述的方法，其中该样品含有未偶联的血清组X荚膜多糖和/或偶联的血清组X荚膜多糖。
53.如实施方式51或实施方式52所述的方法，其中在步骤(i)之前将样品中偶联的和未偶联的血清组X荚膜多糖互相分离。
54.如实施方式53所述的方法，其中分离使用固相萃取。
55.如实施方式1-54中任一项所述的方法，其中步骤(ii)包括高效阴离子交换色谱(HPAEC)。
56.如实施方式1-55中任一项所述的方法，其中步骤(iii)包括脉冲电流分析检测(PAD)。
57.如实施方式1-56中任一项所述的方法，其中步骤(i)包括酸水解。
58.如实施方式1-57中任一项所述的方法，其中步骤(iii)是定量的。
59.如前述实施方式中任一项所述的方法，其中通过分离一个试样中的偶联的和未偶联的血清组X荚膜多糖来制备样品，并且然后使用未偶联的物质作为样品。
60.一种用于分析疑似含有血清组X荚膜多糖的试样的方法，其中通过如实施方式51-59中除了实施方式53以外任一项所述的方法测量总体血清组X荚膜多糖含量，如实施方式53-59中任一项所述测量未偶联的血清组X荚膜多糖含量，并且因此可计算未偶联的血清组X荚膜多糖与总体血清组X荚膜多糖的比率。
附图说明
图1显示了血清组X荚膜多糖的重复单元。
图2显示了天然和水解的血清组X荚膜多糖的超高效液相色谱。
图3显示了通过TEMPO氧化随后还原性胺化将血清组X荚膜多糖偶联到CRM197的方案，以及对所得偶联物的SDS PAGE分析。
图4显示了在用磷酸盐缓冲的盐水的Sephacryl S300柱上进行的偶联混合物的色谱。
图5显示了通过SIDEA接头将血清组X荚膜多糖偶联到CRM197的方案，以及对所得偶联物的SDS PAGE分析。
图6显示了使用不同的方法通过SIDEA接头将血清组X荚膜多糖偶联到CRM197的方案，以及对所得偶联物的SDS PAGE分析。
图7显示了对使用不同的接头制备的血清组X荚膜多糖-CRM197偶联物的SDS PAGE分析。
图8显示了在用多种脑膜炎奈瑟球菌偶联物免疫之后针对血清组X荚膜多糖的IgG抗体效价和针对血清组X的血清杀菌抗体效价。
图9显示了针对血清组A荚膜多糖的IgG抗体效价和针对来自相同实验的血清组A的血清杀菌抗体效价。
图10显示了针对血清组C荚膜多糖的IgG抗体效价和针对来自相同实验的血清组C的血清杀菌抗体效价。
图11显示了针对血清组W135荚膜多糖的IgG抗体效价和针对来自相同实验的血清组W135的血清杀菌抗体效价。
图12显示了针对血清组Y荚膜多糖的IgG抗体效价和针对来自相同实验的血清组Y的血清杀菌抗体效价。
图13显示了对由酸水解产生的MenA(a)和MenX(b)寡糖在400MHz和25±0.1℃下记录的2D 1H-31P HMBC NMR谱。标记了峰归属。
图14显示了a)avDP和b)pH随着MenA和MenX荚膜多糖收集的时间的变化以及C)仅在37℃和45℃下的MenA荚膜多糖的O-乙酰基状态。
图15显示了avDP随着时间变化的概况，其被收集用于37℃和45℃下a)MenA和b)MenX荚膜多糖的在以下时间点上的稳定性研究：45℃下的(a)0、(b)7、(c)10、(d)14、(e)21天和37℃下的(f)7、(g)14、(h)21、(i)28天。另外，b)(1)中显示了通过酸处理(柠檬酸钠pH 4.0，80℃下持续约4小时)得到的实验性降解的MenX荚膜多糖的概况。
图16显示了在用多种脑膜炎奈瑟球菌偶联物免疫之后针对血清组X荚膜多糖的IgG抗体效价和针对血清组X的血清杀菌抗体效价。
图17显示了使用其他方法将血清组X荚膜多糖偶联到CRM197的方案，以及对所得偶联物的SDS PAGE分析。
图18显示了在用多种脑膜炎奈瑟球菌偶联物免疫之后针对血清组A荚膜多糖的IgG抗体效价和针对血清组A的血清杀菌抗体效价。
图19显示了在用多种脑膜炎奈瑟球菌偶联物免疫之后针对血清组C荚膜多糖的IgG抗体效价和针对血清组C的血清杀菌抗体效价。
图20显示了在用多种脑膜炎奈瑟球菌偶联物免疫之后针对血清组W135荚膜多糖的IgG抗体效价和针对血清组W135的血清杀菌抗体效价。
图21显示了在用多种脑膜炎奈瑟球菌偶联物免疫后针对血清组Y荚膜多糖的IgG抗体效价。
图22显示了在用多种脑膜炎奈瑟球菌偶联物免疫后针对血清组X荚膜多糖的高亲和力IgG抗体效价。
具体实施方式
用于产生血清组X荚膜多糖的细菌生长
为了鉴定在上清液中产生并释放血清组X荚膜多糖的最优化细菌生长条件，测试了使用MenX 5967(ST 750)菌株的3种不同的培养基。在烧瓶中进行不同的生长并且由质子核磁共振波谱法(1H NMR)监测。用扩散过滤器通过NMR序列来分析培养物上清液以截除衍生自低分子量(MW)物质的信号并且突出高MW血清组X荚膜多糖的信号。通过高分辨率魔角旋转NMR(HR-MAS NMR)对固态下的相应团块的进一步分析并没有显示血清组X荚膜多糖信号，表明在上清液中释放了大多数的多糖(考虑到该试验的检测限制，在细菌上剩余的多糖的最大量应该是起始量的1/8)。用3种培养基得到相似的结果。
除了NMR方法以外，使用高效阴离子交换色谱法用脉冲电流分析检测(HPAEC-PAD)开发了对澄清培养肉汤中的血清组X荚膜多糖定量的更精确方法(见下文)。如下表所示，培养基#3产生了最高量的多糖。因此，其被选择用于较大规模(18L)发酵，其在上清液中产生356μg/mL的血清组X荚膜多糖。
在不同培养基中的MenX 5967(ST 750)菌株生长和相对的多糖生产
生长培养基* OD(600nm) 糖(μg/mL) μg糖/OD
#1 2 22.55 13.3
#2 6 42.73 7.1
#3 2.8 62.6 22.4
*1.经修饰的Catlin v.6：酪蛋白氨基酸10g/L，NaCl 5.8g/L，葡萄糖10g/L，K2HPO44g/L，NH4Cl 1g/L，K2SO41g/L，MgCl2·6H2O 0.4g/L，CaCl2·2H2O 0.03g/L，柠檬酸铁0.5mg/L，pH 7.2；2.MCDM1：葡萄糖10g/L，大豆蛋白胨15g/L，NaCl 5.80g/L，K2SO41g/L，K2HPO44g/L，L-谷氨酸5g/L，L-精氨酸0.3g/L，L-丝氨酸0.5g/L，L-半胱氨酸0.23g/L，MgCl20.19g/L，CaCl20.021g/L，FeSO40.002g/L；3.经修饰的Frantz：L-谷氨酸1.6g/L，Na2HPO4·2H2O 15.5g/L，KCl 0.09g/L，NH4Cl 1.25g/L，pH 7.6，补充：葡萄糖50g/L，MgSO4·7H2O 30g/L，25g/L经超滤的酵母提取物，L-半胱氨酸1.5g/L。
血清组X荚膜多糖的纯化
通过从参考文献235中获得的方法进行用于纯化血清组X荚膜多糖的方法。
偶联物的生产和鉴定
使用不同链长度和不同偶联化学物的多糖制备偶联物。
通过氧化和还原性胺化的偶联(方法A)：
在pH 4.7，100℃下在50mM柠檬酸钠中水解经纯化的血清组X荚膜多糖，持续1小时(图2)。所得的寡糖的平均聚合度测定为80，对应于通过NMR测得的分子量25-30kDa。在加工中通过超高效液相色谱-尺寸排阻色谱(UPLC-SEC)和磷(31P)NMR谱监测多糖解聚，并且其通过当达到需要的avDP时的中和来猝灭。用四丁基溴化铵来交换缓冲液以使得糖在二甲基甲酰胺溶剂中溶解。然后在0℃下用TEMPO(相对于MenX重复亚基0.06当量)、NaHCO3(相对于MenX重复亚基9当量)、TCC(相对于MenX重复亚基2当量)使糖氧化过夜。该氧化在个体亚基的C-6位上产生醛基(图3)。通过用丙酮/NaCl沉淀和使用Sephadex G15柱的凝胶过滤来纯化氧化的糖。使用HPAEC-PAD来对糖定量并且使用NMR来确认其结构特性。每条链大约有4.5个氧化基团，对应于沿着约80个残基链的约6％的氧化度。通过UPLC-SEC测量氧化的糖的分子量分布。
使用醛基来通过还原性胺化偶联至载体蛋白CRM197(图3)。简单地说，将糖在NaPi 10mM pH 7.2缓冲液中与4∶1w/w比率的10mg/ml CRM197和1∶1w/w比率的NaBH3CN混合。在37℃下，混合物在缓慢搅拌下放置72小时。用磷酸盐缓冲盐水在Sephacryl S300柱上纯化偶联物并且在收集池中收集馏分(图4)。通过SDS PAGE来验证偶联(图3)。如下给出了经纯化的偶联物(收集池1)的性质。
也通过该方法制备偶联物，其中未用乙酸钠水解多糖并且因此具有天然的平均聚合度。制备含有130的平均聚合度的多糖的其他偶联物。
也通过该方法制备偶联物，其中载体蛋白是破伤风类毒素(TT)或SEQID NO：9(SEQ9)。在这些偶联物中的多糖具有130的平均聚合度。下面给出了这些偶联物的其他特征：
通过还原性胺化之后用SIDEA接头反应来偶联(方法B)：
在pH 4.7，100℃下在50mM柠檬酸钠中使经纯化的血清组X荚膜多糖水解，持续2小时(图2)。所得的寡糖的平均聚合度测定为15，对应于通过NMR测得的分子量5kDa。然后在pH 6.5的含300mg/ml NH4OAc和49mg/ml NaBH3CN的5mM乙酸钠缓冲液中以5mg/ml使糖溶解，并在37℃下持续5天。该步骤导致末端醛基的还原性胺化以产生伯胺基(图5)。然后通过用200cm2Hydrosart(纤维素)2kDa-截止膜的切向流过滤对1MNaCl和水纯化反应混合物。然后使用伯胺基用于采用SIDEA的活化以及随后与载体蛋白CRM197偶联(图5)。简单地说，在室温下，经修饰的糖以mol SIDEA∶总mol NH2基团为12∶1的比率溶解于含NEt3(5∶1的NEt3∶总NH2基团的摩尔比)的9∶1(v/v)的DMSO/水中。然后通过用90％二噁烷(v/v)沉淀来纯化反应混合物。然后以13∶1(活性酯基团∶CRM197的摩尔比)的比率将SIDEA-修饰的糖与25mg/ml CRM197在pH 7.2的25mM NaPi缓冲液中反应。在室温下，混合物在缓慢搅拌下放置5小时。通过用(NH4)2SO4沉淀来纯化偶联物。通过SDS PAGE来验证偶联(图5)。下面给出了这些偶联物中的一个批次的性质：
通过还原、氧化、还原性胺化之后用SIDEA接头反应来偶联(方法C)：
在室温下将pH 8的10mM NaPi缓冲液中15mg/ml的纯化的血清组X荚膜糖与NaBH4(相对于MenX的分子量12当量，固体)反应1.5小时。该步骤导致糖的还原。在室温下将pH 7.2的10mM NaPi缓冲液中6-8mg/ml的还原的糖与NaIO4(相对于MenX的分子量10当量，固体)反应1.5小时。这两个步骤的组合效果是在糖的还原末端产生醛基(图6)。然后经修饰的糖经过还原性胺化提供伯胺基，其可用于采用SIDEA的活化和随后的与载体蛋白CRM197的偶联(图6)。简单地说，在37℃下，经修饰的糖以4-5mg/ml溶解于pH 7的含300mg/ml NH4OAc和49mg/ml NaBH3CN的10mM NaPi缓冲液中持续5天。然后在室温下，经修饰的糖以mol SIDEA∶总mol NH2基团为12∶1的比率溶解于含NEt3(5∶1的NEt3∶总NH2基团的摩尔比)的9∶1(v/v)的DMSO/水中。然后通过用80％丙酮(v/v)沉淀来纯化反应混合物。然后以13∶1(活性酯基团∶CRM197的摩尔比)的比率将所得的SIDEA-修饰的糖与25mg/ml CRM197在pH 7.2的100mM NaPi缓冲液中反应。在室温下，混合物在缓慢搅拌下放置过夜。通过用(NH4)2SO4沉淀来纯化偶联物。通过SDS PAGE来验证偶联(图6)。下面给出了这些偶联物中的一个批次的形式：
通过替代接头偶联(方法D)：
如上述，经纯化的平均聚合度为15的血清组X荚膜多糖也使用按照US 61/534,751中图7的方法的不同的接头与CRM197偶联。通过SDS PAGE来验证偶联(本文中的图7)。
通过还原、氧化和还原性胺化与载体偶联(方法E)：
在室温下将pH 8的10mM NaPi缓冲液中15mg/ml的纯化的血清组X荚膜糖与NaBH4(相对于MenX的分子量12当量，固体)反应2小时。该步骤导致糖的还原。在室温下将pH 7.2的10mM NaPi缓冲液中6-8mg/ml的还原的糖与NaIO4(相对于MenX的分子量10当量，固体)反应1.5小时。这两个步骤的组合效果是在糖的还原末端产生醛基(图17)。然后经修饰的糖经过与载体蛋白CRM197的还原性胺化。简单地说，2mg/ml的经修饰的糖溶解于pH 8的300mM NaPi缓冲液(8∶1的糖∶CRM197的分子量)和NaBH3CN(4∶1的糖∶NaBH3CN重量比)持续4天。通过SDS PAGE来验证偶联(图17)。
免疫研究(1)
总体试验方案：通过按照下述的方案的皮下注射来免疫Balb/c小鼠。注射体积为200μl并且注射含有磷酸铝佐剂(每次剂量120μg)。在第1、14和28天进行注射，在第0天(免疫前血清)、第28天(第二次免疫后血清)和第42天(第三次免疫后血清)采血。
MenACWY＝根据参考文献10制备的MenA-CRM197、MenC-CRM197、MenW135-CRM197和MenY-CRM197的混合物。
第三次免疫后针对血清组X荚膜多糖的IgG抗体效价和针对血清组X菌株Z9615的血清杀菌抗体效价示于图8。血清组X偶联物是免疫原性的并且诱导杀菌抗体。当剂量降低至十分之一(至0.1μg)时，应答没有减弱。当偶联物与衍生自血清组A、C、W135和Y的偶联物组合时，应答轻微降低，但是仍然明显高于对照。因此，这些偶联物和血清组X偶联物之间的免疫干扰似乎是较小的。
也测量第5、6、7和8组针对血清组A、C、W135和Y荚膜多糖的第三次免疫后IgG抗体效价和针对这些血清组的血清杀菌抗体效价(分别使用菌株F8238、11、240070和860800)。结果如图9-12所示。当与血清组X偶联物组合时，针对血清组A、C、W135和Y偶联物的应答通常不会减弱。这些结果再次表明在这些偶联物和血清组X偶联物之间几乎没有免疫干扰。
发现抗-血清组X荚膜多糖IgM ELISA单位对于所有的偶联物是低的，如同对于偶联物疫苗的预期，因为有效同种型从IgM转变为IgG。
使用经修饰的ELISA来仅测量较高亲合力的IgG抗体(图22)。经修饰的ELISA使用离液盐来仅选择并检测较高亲合力的IgG抗体。与标准ELISA的单位相比，对于所有的偶联物在第二次和第三次剂量之后抗血清组X荚膜多糖IgG ELISA单位是低的，但是对于所有偶联物在第三次剂量之后观察到统计学上显著的加强效果(P为0.0006至＜0.0001)。
下表总结了第三次免疫后收集的免疫血清中针对各菌株的兔补体血清杀菌抗体效价。
免疫研究(2)
总体试验方案：通过按照下述的方案的皮下注射来免疫Balb/c小鼠。注射体积为200μl并且注射含有磷酸铝佐剂。
MenACWY＝根据参考文献10制备的MenA-CRM197、MenC-CRM197、MenW135-CRM197和MenY-CRM197的混合物。
第三次免疫后针对血清组X荚膜多糖的IgG抗体效价和针对血清组X菌株Z9615的血清杀菌抗体效价示于图16。血清组X偶联物是免疫原性的并且诱导杀菌抗体。当MenX-CRM197偶联物与其他衍生自血清组A、C、W135和Y的偶联物组合时，应答轻微降低，但是仍然明显高于对照。相反，当MenX-TT或MenX-SEQ9偶联物与这些偶联物组合时，看到没有或几乎没有降低。因此，对MenX多糖使用不同载体蛋白可能有助于减少血清组X偶联物和这些偶联物之间的任意免疫干扰。
图18中显示了当MenX偶联物与衍生自血清组A、C、W135和Y的偶联物组合时第三次免疫后针对血清组A荚膜多糖的IgG抗体效价和针对血清组A菌株F8238的血清杀菌抗体效价。图19-21中显示了血清组C、W135和Y的相应数据。
稳定性研究(1)
材料：根据参考文献10的方法得到纯化的MenA和MenX多糖。通过估计残留的蛋白质和核酸含量来评价多糖制备物的纯度，其低于糖的1％w/w。
NMR分析：在Bruker Avance III 400MHz摄谱仪上记录了1H、13C和31PNMR实验，该摄谱仪装配了高精度温度控制器并且使用5-mm宽带探针(布鲁克公司(Bruker))。为了获得并处理数据，使用了TopSpin 2.6版软件(布鲁克公司)。在25±0.1℃下收集1H NMR谱在10ppm谱宽，累积128次扫描下的32k数据点。用0.2Hz谱线增宽对谱加权并经傅立叶变换。传输器设为水频率，其用作参比信号(4.79ppm)。在100.6MHz和37±0.1℃下记录13CNMR谱在200ppm谱宽，累积4k次扫描下的32k数据点。用0.2Hz谱线增宽对谱加权并经傅立叶变换。传输器设为丙酮频率，其用作参比信号(30.89ppm)。在161.9MHz和25±0.1℃下记录31P NMR谱在20ppm谱宽，累积1k次扫描下的32k数据点。用3.0Hz增宽对谱加权并经傅立叶变换。重水中85％的磷酸被用作外部标准(0ppm)。用全部再循环时间以定量方式获得所有1H和31P NMR谱，以保证完全覆盖各信号(5x纵向松弛时间T1)。为了确认MenA和MenX荚膜多糖的降解机制并因此指定31P NMR峰，在MenA和MenX寡糖样品上需要进行二维1H-31P异核多键相关(HMBC)实验，之前分别由73℃下在50mM pH 4.8的乙酸钠(约10mg/mL的糖浓度)持续约2.5小时和80℃下pH 4.0持续约5.5小时(约2.5mg/mL的糖浓度)中的酸水解产生。如31P NMR分析所估计(参见下面的稳定性实验段落)，MenA和MenX寡糖的平均聚合度(avDP)分别是约12和约10。通过用标准脉冲项目(standard pulse-program)在0.75mL重水(99.9％原子D-艾尔德里奇(Aldrich))中溶解约10mg的干糖来制备这些NMR分析样品。在F2和F1维中分别收集到4096和512个数据点。在傅立叶变换之前累积64次扫描以分别在F2和F1中每个点产生0.2Hz和5.0Hz的数据分辨率。
HPLC分析：使用连接至装配有脉冲电流分析器的ICS 3000Dionex系统的带保护柱(4mm x 50mm；迪奥耐斯公司(Dionex))的CarboPac PA200柱(4mm x 250mm；迪奥耐斯公司)来进行HPLC分析。使用100mM NaOH+10mM乙酸钠缓冲液用于柱平衡并且使用具有增加量的乙酸钠的三步梯度(100mM NaOH+10mM、250mM、500mM乙酸钠分别持续80、15和3分钟)来洗脱。使用0.4mL/分钟的流速用于120分钟的整个运行。以约1mg/mL的浓度注射20μL样品。使用带金工作电极和Ag/AgCl参比电极的脉冲电流检测模式的电化学检测器来监测流出物。施加糖的四倍电势波形。使用Chromeleon 6.8软件(迪奥耐斯公司)处理所得的色谱数据。
稳定性试验：分别在37℃和45℃下孵育用氘代水制备的在pH 7.0的100mM磷酸钾缓冲液中约1mg/mL浓度的MenA和MenX多糖溶液。在不同的时间点上取样并通过NMR和HPLC分析。也在各时间点上监测pH。对于多糖稳定性，监测MenA和MenX的avDP。通过整合31P NMR谱来计算avDP值并表示为[(Pde/Pme)+1]，其中Pde是链基团中的磷酸二酯的摩尔浓度并且Pme是磷酸单酯末端基团的摩尔浓度。也对HPLC概况进行半定量评价以确认由31P NMR试验收集的更精确的稳定性评价。
MenA和MenX多糖的降解机制。图13(a)报道了由温和的酸水解产生的MenA寡糖上的NMR1H-31P HMBC数据。由于在甘露糖胺残基的C3和C4处存在O-乙酰基团，检测并指定了几个自旋系统：(i)3-或4-O-乙酰化残基的C1处的质子(H1-Pde)3/4OAc；(ii)脱-O-乙酰化残基C1处的质子(H1-Pde)deOAc；(iii)O-乙酰基团的成对C3和C4处的质子(H3/H4-Pde)3/4OAc；(iv)3-O-乙酰化残基的C2处的质子(H2-Pde)3OAc；(v)4-O-乙酰化残基的C2处的质子(H2-Pde)4OAc；(vi)脱-O-乙酰化残基C2处的质子(H2-Pde)deOAc；(vii)3-或4-O-乙酰化残基C5和C6处的质子(H5/6-Pde)3/4OAc；(viii)脱-O-乙酰化残基的C3、C4、C5和C6处的质子(H3/4/5/6-Pde)deOAc。通过磷酸单酯与3-或4-O-乙酰化残基的C6处的质子(H6-Pme)3/4OAc和脱-O-乙酰化残基的C6处的质子(H6-Pme)deOAc的交叉峰确认C6处的磷酸连接，表明在水解期间，磷酸二酯键经切割留下了与非还原末端连接的磷酸基团，其与磷酸-C1连接的弱稳定性相一致。因为没有检测到其他1H-31P标量校正，在水解期间没有在C4或C3处发生涉及游离羟基的磷酸迁移。在MenX寡糖上的1H-31PHMBC(图13(b))也表明磷酸-C1连接的较不稳定并且在这种情况下非还原末端具有在C4处连接的磷酸基团：磷酸单酯显示出仅与C4处的质子的交叉相关性。同样对于MenX，在水解期间在C3或C6处没有发生涉及游离羟基的磷酸迁移。指定了所有的31P自旋系统，分别在-1.40和4.65ppm处的磷酸二酯和磷酸单酯信号。也通过收集31P-脱偶联的谱指出质子NMR概况，该脱偶联减少了由这种标量耦合产生的峰结构。所有的谱指定都与主要基于13C NMR分析的公开数据(参考文献30)一致。MenX荚膜多糖的13C NMR化学位移与公开数据(参考文献14)一致，如下表1所示：
表1：MenX荚膜多糖的13C NMR化学位移。
MenA和MenX多糖的热稳定性。作为磷酸二酯键处水解的结果，MenA和MenX荚膜多糖的降解导致低avDP的片段，其暴露了新形成的磷酸单酯末端基团。在NMR实验中，这些磷酸单酯基团在比源自内部磷酸二酯基团的场更高的场处产生31P共振信号，从而使得如上述的稳定性实验所述进行avDP计算。储存期间avDP和由31P NMR测量的在37℃和45℃下暴露期间不同时间点处的MenA和MenX荚膜多糖的样品的avDP的变化是多糖稳定性的指标(表2和图14(a))：
表2：对不同的时间点和37℃与45℃温度下的MenA和MenX样品的由31P NMR分析估计的avDP以及检测的pH值。也报道了MenA荚膜多糖的O-乙酰化状态，表示为每摩尔重复单元的O-乙酰基的摩尔数。
在使用的样品浓度下，当avDP高于100时，该技术的灵敏度并不允许测量两种多糖在0时间点上的avDP。对于各时间点样品，pH维持在7.0±0.1的范围内(图14(b))。
在37℃下，在28天的孵育后MenA荚膜多糖被降解至22.9的avDP，而在45℃下降解加速，在21天后avDP为5.1。在相同条件下，MenX荚膜多糖没有显示降解(在两个孵育温度下的所有时间点上avDP＞100；基于试验灵敏度，100是可检测的最大avDP值)。在37℃和45℃下孵育的MenA荚膜多糖的HPLC概况(图15)逐渐显示出较短寡糖的增加的强度峰，其表示链的解聚。在比较中，由于在约87分钟处的长链多糖，在所有的MenX样品上收集的HPLC概况实际上未由宽峰修饰，这另证明了该糖的较高稳定性。1H NMR分析确认MenA和MenX荚膜多糖在37℃和45℃下的孵育不会改变多糖重复单元的结构。在37℃和45℃下分别仅仅观察到O-乙酰化水平(仅在MenA荚膜多糖中存在O-乙酰基)从0.932至0.883和0.826mol/mol重复单元的有限降低(表2和图14(c))。总之，这些NMR和HPLC数据证明MenX与MenA荚膜多糖相比在水溶液中具有更高的稳定性。
稳定性研究(2)
材料：根据上述的方法A、B和C制备MenX-CRM197偶联物。
根据方法A制备的偶联物含有平均聚合度为100的多糖。下面给出了该偶联物批次的其他特征：
根据方法B制备的偶联物具有以下特征：
根据方法C制备的偶联物含有平均聚合度为19的多糖。下面给出了该偶联物批次的其他特征：
进行加速的稳定性研究以提供这些偶联物稳定性的初步信息。在37℃下持续28天进行稳定性研究，测量的时间点是每7天(第0、7、14、21、28天)。通过测量来自偶联物的游离的糖来监测样品。通过使用洗脱缓冲液ACN 10-20％+TFA 0,05％的SPE-C4筒来进行游离的糖的分离。通过HPAEC-PAD分析来对总的和游离的糖进行定量，以计算游离的糖％。下面给出了3个批次的偶联物的值：
使用方法A制备的偶联物比由方法B和C制备的偶联物更稳定。
分析研究
材料：通过脑膜炎奈瑟球菌X5967菌株(ST750)的细菌生长产生并通过参考文献235的方法纯化MenX多糖。通过使用比色测定法估计残留的蛋白质和核酸含量(都以＜1％w/w的糖存在)，和使用LAL试验来估计内毒素含量(＜10EU/μg的糖)来评价多糖制备物的纯度。乙酸钠盐(热科学迪奥耐斯公司(Thermo Scientific Dionex))、50％氢氧化钠溶液(J.T.B.公司(J.T.Baker))、三氟乙酸(西格玛公司(Sigma))、MilliQ级水(密理博公司(Millipore))都是分析用品质。
一般方法：根据参考文献24的方法测量总磷含量。
通过硅胶60F254(西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma Aldrich))上的薄层色谱(TLC)监测反应；在紫外光下检查之后，通过用10％(v/v)乙醇H2SO4加热来观察化合物。使用预填充的二氧化硅筒RediSep(TI公司(Teledyne-Isco)，0.040-0.063nm)来进行柱色谱。除非另外说明，在Combiflash Rf(TI公司)仪器中采用0→100％梯度的洗脱混合物。
在Bruker Avance III 400MHz摄谱仪上记录了1H、13C和31P NMR实验，该摄谱仪装配了高精度温度控制器并且使用5-mm宽带探针(布鲁克公司)。为了获得并处理数据，使用了TopSpin 2.6版软件(布鲁克公司)。
在25±0.1℃下收集1H NMR谱在10ppm谱宽下的32k数据点。用0.2Hz谱线增宽对谱加权并经傅立叶变换。化学漂移值以相对于Me4Si(0.00ppm，CDCl3)或溶剂信号(4.79ppm，D2O)的ppm报告。在100.6MHz和37±0.1℃下记录13C NMR谱在200ppm谱宽下的32k数据点。用0.2Hz谱线增宽对谱加权并经傅立叶变换。化学漂移值以相对于CDCl3信号(77.0ppm，CDCl3)的ppm报告。
在161.9MHz和25±0.1℃下记录31P NMR谱在20ppm谱宽下的32k数据点。用3.0Hz谱线增宽对谱加权并经傅立叶变换。重水中85％的磷酸被用作外部标准(0ppm)。
通过使用Q-Tof micro Macromass(沃特世公司(Waters))仪器的电喷雾离子化截止质谱来测量精确的质量。用P-2000Jasco旋光计测量旋光度。苄基3，6-二-O-苄基-2-脱氧-2-苯二酰亚氨基-β-D-吡喃葡糖苷3。在氮气下将起始物质2(参考文献236)(1.8g，3.1mmol)溶解在乙腈(200ml)中，并且在0℃下用三甲基氨基硼烷(1.4g，18.4mmol)和BF3·Et2O(2.6ml，18.4mmol)处理。在0℃下搅拌1小时之后，混合物允许达到环境温度，此时反应完全(TLC，7∶3环己烷-EtOAc)。加入甲醇(3ml)和三乙基胺(3ml)，并且浓缩混合物。用NaHCO3水溶液分配残留物，并且浓缩合并的有机层并在硅胶(环己烷-EtOAc)上纯化以得到1.5g的产物3(83％)。[α]D 24＝+1.9(c 0.5，CHCl3).1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ＝7.80-6.95(m，19H，Ph)，5.15(d，1H，J1，28.0Hz，H-1)，4.78，4.47(2d，2H，2J 12.2Hz，CH2Ph)，4.72，4.51(2d，2H，2J 12.0Hz，CH2Ph)，4.67，4.59(2d，2H，2J 12.0Hz，CH2Ph)，4.26-4.18(m，2H，H-2，3)，3.87-3.88(m，3H，H-4，6)，3.66-3.62(m，1H，H-5)，2.89(d，1H，J2，OH 2.3Hz，OH-4).13C NMR(CDCl3，100MHz)：δ＝167.81(CO)，138.15，137.59，137.10，133.67，131.61，128.12，127.91，127.86，127.81，127.58，127.40(Ar)，97.35(C-1)，78.49(C-3)，74.37，74.24(CH2Ph)，73.78(C-5)，73.45(C-4)，70.80(CH2Ph)，70.69(C-6)，55.37(C-2).ESI HR-MS(C35H33NO7)：m/z＝([M+Na]+测定值597.2547；理论值597.2601)；([M+Na]+测定值618.1895；理论值618.1894).
苄基2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷4。含有1.2ml乙二胺的EtOH(20ml)中的N-苯二酰亚氨基化合物3(1g，1.7mmol)的混合物回流过夜。在TLC(甲苯-EtOAc 4∶1)显示反应完全后，浓缩混合物并且在4∶1EtOH-Ac2O(25ml)中重溶。对混合物搅拌3小时，然后浓缩。对残留物(环己烷-EtOAc)的色谱得到740mg的单糖4，其NMR数据与在文献[237]中最近报道的那些相同。
苄基2-乙酰氨基-3，6-二-O-苄基-4-(1，5-二氢-3-氧代-3λ5-3H-2，4，3-苯并二氧杂亚磷-3-基)-β-D-吡喃葡糖苷5。在0℃下向CH2Cl2(9ml)中的单糖(500mg，1mmol)和乙腈(9ml)中的0.45M 1H-四唑的溶液中加入N，N-二乙基-1，5-二氢-3H-2，3，4-苯并二氧杂磷(benzodioxaphosphepin)-3-胺(717mg，3mmol)。在10分钟后，去除冰浴并持续搅拌。在另外搅拌3小时后，反应完全(TLC，1∶1甲苯-EtOAc)。混合物冷却至-20℃并且加入m-CPBA。在20分钟后，加入水性NaHCO3来猝灭。用CH2Cl2稀释并用水性NaHCO3在分液漏斗中提取混合物。合并的有机层经浓缩并且在硅胶(环己烷-EtOAc)上纯化残留物以得到630mg的产物(92％)。来自EtOAc的白色晶体，m.p.159-160℃.＝[α]D 24＝+34.7(c 0.1，CHCl3).1H NMR(CDCl3，400MHz)：δ＝7.41-7.12(m，18H，Ph)，5.90(d，1H，J1，27.6Hz，H-1)，5.17-5.12(m，2H，2CHPh)，5.00-4.78(m，4H，4CHPh)，4.65-4.58(m，5H，4CHPh，H-4)，4.32(t，1H，J 9.0Hz，H-3)，3.89(d，1H，J6a，59.0Hz，H-6a)，3.76-3.69(m，2H，H-5，6b)，3.46-3.42(m，1H，H-2)，1.80(s，3H，CH3CO).13C NMR(CDCl3，100MHz)：δ＝170.61(CO)，138.26，137.36，134.98，128.94，128.35，127.95，127.98，127.80，127.71，127.57，127.50(Ar)，98.85(C-1)，78.71(C-3)，76.72(C-4)，73.97(C-5)，73.76，73.42，70.09(CH2Ph)，69.04(C-6)，68.30，60.25(CH2Ph)，56.95(C-2)，23.40(CH3CO).31P NMR(CDCl3，162MHz)：δ＝0.32.ESI HR-MS(C37H40NO9P)：m/z＝([M+H]+测定值674.2476；理论值674.2519).
2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖基磷酸6。经保护的单糖5(100mg，0.15mmol)溶解于MeOH(10ml)并在10％Pd/C(30mg)上氢化。对混合物搅拌1天，然后通过硅藻土垫过滤。蒸发溶剂并在C-18Isolute SPE筒上纯化回收的粗物质。含糖的馏分经冻干得到42mg的泡沫状产物6(95％)，其NMR数据与文献[238]中报道的相一致。
用于MenX定量的高效阴离子交换色谱和脉冲电流分析检测(HPAEC-PAD)：用终浓度2M的TFA处理MenX样品以稀释至600μL的0.5-8μg/mL范围的总体积。在封闭的螺帽试管中在100℃下加热样品持续2.5小时，然后在2-8℃下冷却约30分钟，加入700μL的2M NaOH并在分析之前用0.45μm Acrodisc(颇尔公司(PALL))滤器过滤。通过对总磷含量的比色方法测量效价的MenX PS或合成单体4-GlcNAc-4P的纯制剂被用于构建校准曲线，其在0.5-8μg/mL的范围内设定标准。用配置有与PA1保护柱(4x 50mm；迪奥耐斯公司)偶联的CarboPac PA1柱(4x 250mm；迪奥耐斯公司)的Dionex ICS3000进行HPAEC-PAD。以1mL/分钟的流速运行样品，使用在100mM NaOH中在10分钟内从100mM至500mM AcONa的梯度。使用带金工作电极和Ag/AgCl参比电极的脉冲电流检测模式的电化学检测器来监测流出物。施加糖的四倍电势波形。使用Chromeleon 6.8软件处理所得的色谱数据。
MenX多糖和GlcNAc-4P的酸水解以及NMR表征：对MenX多糖和合成的单体(10mg)进行大规模的酸水解。两个样品都溶解于2mL 2M TFA中并且在100℃下水解2.5小时。在分析之前，样品经干燥并与D2O交换三次。
水解条件的选择：为了鉴定MenX水解能够完全释放单体亚基并且最小化它们的降解的最优条件，探索了在100℃下2M TFA中进行水解的不同MenX多糖水解反应时间(1至6小时)。以两个不同的浓度(0.5和2μg/mL)使用通过总磷含量的比色方法测定效价的MenX多糖的纯制剂。由HPAEC-PAD分析检测到一个最常见的峰。峰的面积随时间增加，在2和3小时之间最大，之后是较长时间的下降。最后选择2.5小时作为水解的最优时间。
该方法的线性在0.5-8μg/mL的范围内得到验证(R2＝99.807)。该方法成功地应用于纯化过程中间体，包括发酵液，并且为了测定方法的准确性，进行了回收研究。向经分析的标准样品中加入已知量的多糖。基于经掺入的样品所测定的总浓度和未经掺入的样品中发现的浓度之间的差异计算回收率。平均回收率范围是98至102％，表明高度的准确性。通过用1％的CV和0.5％的相应平均CV分析相同样品四次以进行可重复性中间分析。
4P-GlcNAc的合成：如方案1所示，目标化合物6的合成从经保护的GlcN 2区域选择性开环(92％产率)开始，其通过如参考文献236中所述由盐酸半乳糖胺制备。通过乙二胺的方式去除N-苯二酰亚氨基保护，之后是通过选择性N-乙酰化提供87％产率的已知化合物4[237]。4与N，N-二乙基-1，5-二氢-3H-2，3，4-苯并二氧杂亚磷-3-胺和1H-四唑反应并且随后由间氯过氧苯甲酸(m-CPBA)氧化使得磷酸基团导入比之前其他方法所报道的有明显高的产率[238]并且得到晶体储存稳定的化合物5(m.p.159-160℃)。在31P NMR谱中0.32ppm处的磷酸单酯峰，其与1H-31P HMBC NMR谱中4.58ppm处的H-4信号和CH系统的两个偶联(分别为5.13、4.98和5.14、4.99ppm)相关，使得能评估5的结构。相对于存在未保护的磷酸时得到的50％产率，最后在10％Pd-C上的氢解提供了出色产率的目标4P-GlcNAc 6(95％)。最终产物的NMR数据与文献中报道的那些相一致[239]。
方案1.a.参考文献231；b.三甲基氨基硼烷，BF3·Et2O，CH3CN，0℃，83％；c.H2NCH2CH2NH2，EtOH，回流；Ac2O，吡啶，87％(两步)；d.N，N-二乙基-1，5-二氢-3H-2，3，4-苯并二氧杂亚磷-3-胺，1H-四唑，CH2Cl2；m-CPBA，CH2Cl2，H2O，92％；e.H2，10％Pd-C，95％。
通过MenX多糖或4P-GlcNAc的酸水解形成的产物的NMR表征：根据优化用于HPAEC-PAD分析的步骤大规模水解MenX多糖和合成的单体6，以通过NMR分析确认所得物质的结构。在两种情况中，4P-GlcNH被评价为最常见物质。
4P-GlcNAc 6的1H NMR谱分别显示在5.19和4.72ppm处的α/β异头峰，以及在4.00-3.69ppm范围中的质子信号。通过同核COSY NMR相关性在3.91ppm和3.72ppm信号处指定H-2α和H-2β。在31P NMR中检测到0.58ppm处的磷酸单酯的单一峰。
在标准物6和天然MenX PS的水解之后，对所得的4P-GlcN的1H NMR分析显示分别相应于5.40和4.92ppm处5.5∶4.5和6.7∶3.3比率的α/β混合物的两个主要异头信号。其余的环质子信号落入4.08和3.44ppm之间，同时H-2α(dd，J3.7和10.3Hz，3.91ppm处)和H-2β(dd，J8.5和10.5Hz，3.06ppm处)由于乙酰基的缺失而转向高场。此外，没有检测到N-乙酰基CH3信号表明水解导致总体脱-N-乙酰化。
二维1H-31P HMBC NMR证实了2个重叠的交叉峰，指定31P NMR谱中0.68和0.14ppm处的磷酸单酯信号，分别与1H NMR中的3.94和3.96ppm处的H-4α和H-4β相关。
4P-GlcNAc作为通过HPAEC-PAD的MenX定量的标准物的用途：通过比色方法对合成单体6的总磷含量进行定量并且然后用作与天然MenX多糖比较的校准曲线(范围0.5-8μg/mL)。在将合成单体和天然多糖经过对MenX多糖样品优化的相同水解条件之后，由HPAEC-PAD检测到相同的峰并且所得的曲线完美重叠。未知样品和多糖纯化方法的中间体的浓度一致独立于用于定量的曲线(所有测试的样品中的糖浓度的差异＜2％)。在CarboPac PA1柱上也通过HPAEC-PAD分析经水解的MenX多糖和合成单体的混合物，用10mM氢氧化钠洗脱，以验证使用的水解条件中GlcN的最终形成[26]。对于天然MenX和合成单体样品，GlcN的形成都低于5摩尔％。
我们也使用对于MenX优化的相同水解条件验证了使用市售得到的葡糖胺-6-磷酸(6P-GlcN)作为用于分析的标准物的可能性。所得的校准曲线与天然MenX及其合成单体所得的那些曲线重叠，但是由HPAEC-PAD所检测到的所得的峰的洗脱时间不同(8.97分钟，对比MenX的9.88分钟)，证明采用4P-GlcNAc是更直接的。
这种用于MenX多糖定量的方法是用于监测纯化过程中间物和最终偶联物疫苗的糖含量的关键分析工具。除了允许计算加工产率以外，定量允许计算偶联物的糖/蛋白质比和游离的糖％，两者都是验证最终疫苗制剂的品质和一致性的重要参数。
合成单体的使用表明不需要对用于分析的多糖批次进行标准化。总体方法是快速的，能够监测非常低浓度的糖(≥0.5μg/mL的多糖)，具有最小化的样品清除并且已经验证能很好地用于表征纯化过程中间物，包括发酵液。该方法可适于对偶联方法的中间物的定量和对最终疫苗制剂的表征。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，在本发明的范围和构思内可对之进行修改。
参考文献
[1]Armand等.(1982)J.Biol.Stand.10：335-339.
[2]Cadoz等.(1985)Vaccine 3：340-342.
[3]MMWR(1997)46(RR-5)1-10.
[4]Baklaic等.(1983)Infect.Immun.42：599-604.
[5]Jones(2001)Curr Opin Investig Drugs 2：47-49.
[6]Costantino等.(1992)Vaccine 10：691-8.
[7]Lieberman等.(1996)JAMA 275：1499-503.
[8]WO2005/000345.
[9]WO02/058737.
[10]WO03/007985.
[11]Rennels等.(2002)Pediatr Infect Dis J 21：978-979.
[12]WO2004/013400.
[13]Campbell等.(2002)J Infect Dis 186：1848-1851.
[14]Bundle等.(1974)J Biol Chem.249(15)：4797-801.
[15]Delrieu等.(2011)PLoS One.6(5)：e19513.Epub 2011年5月20日.
[16]Chen等.(2008)Chin Med J(Engl).121(7)：664-6.
[17]Gagneux等.(2002)Emerg Infect Dis.8(5)：462-6.
[18]WO 2008/102173
[19]Bundle等.(1974)J Biol Chem 249：2275-81.
[20]Tiesjema等.(1977)Bull World Health Organ 55：3578-48.
[21]P.Synthesis of oligosaccharides related to the capsular polysaccharide ofNeisseria meningitidis serotype A(与脑膜炎奈瑟球菌血清组A的荚膜多糖相关的寡糖的合成).Doctoral Thesis-Stockholm University 2005.
[22]Zon等.(1982)Infect Immun 1982；37：89-103.
[23]Egan等.(1982)J Am Chem Soc 104：2898-910.
[24]Chen等.(1956)Anal.Chem.28：1756-1758.
[25]Garrido等.(2012)J.Pharm.Biomed.Anal.70：295-300.
[26]Xie等.(2012)Vaccine 2012(30)5812-5582.
[27]Frash(1990)Advances in Biotechnological Processes卷13(Mizrahi和Van Wezel编)第123-145页
[28]Inzana(1987)Infect.Immun.55：1573-1579.
[29]WO 2011/023764.
[30]Lemercinier和Jones(1996)Carbohydrate Res.296：83-96.
[31]Jones和Lemercinier(2002)J Pharm Biomed Anal.30(4)：1233-47.
[32]Ravenscroft等.(1999)Vaccine 17：2802-2816.
[33]Costantino等.(1999)Vaccine 17：1251-1263.
[34]Ramsay等.(2001)Lancet 357(9251)：195-196.
[35]Lindberg(1999)Vaccine 17增刊2：S28-36.
[36]Buttery和Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34：163-168.
[37]Ahmad和Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13：113-33，vii.
[38]Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47：563-567.
[39]欧洲专利0477508.
[40]美国专利5,306,492.
[41]WO98/42721.
[42]Dick等.in Conjugate Vaccines(Cruse等编)Karger，Basel，1989，10：48-114.
[43]Hermanson Bioconjugate Techniques(《生物偶联技术》)，学术出版社(Academic Press)，San Diego(1996)ISBN：0123423368.
[44]Research Disclosure，453077(Jan 2002)
[45]EP-A-0594610.
[46]Ruan等.(1990)JImmunol 145：3379-3384.
[47]WO00/56360.
[48]EP-A-0372501.
[49]EP-A-0378881.
[50]EP-A-0427347.
[51]WO93/17712
[52]WO94/03208.
[53]WO98/58668.
[54]EP-A-0471177.
[55]WO91/01146
[56]Falugi等.(2001)Eur J Immunol 31：3816-3824.
[57]Baraldo等.(2004)Infect Immun 72(8)：4884-7.
[58]WO02/091998.
[59]Kuo等.(1995)Infect Immun 63：2706-13.
[60]Michon等.(1998)Vaccine.16：1732-41.
[61]WO01/72337
[62]WO00/61761.
[63]WO2004/041157.
[64]WO02/34771.
[65]美国专利申请号61/556,456.
[66]国际专利申请号PCT/IB2012/056240.
[67]Kato等.(2003)Carbohydr.Polym.51：69-75.
[68]Angelin等.(2006)Eur.J.Org.Chem.，4323-4326.
[69]美国专利4711779.
[70]WO00/10599.
[71]美国专利4,057,685.
[72]WO96/40242.
[73]Lei等.(2000)Dev Biol(Basel)103：259-264.
[74]WO00/38711；美国专利6,146,902.
[75]WO99/42130.
[76]WO2004/011027.
[77]Watson(2000)Pediatr Infect Dis J 19：331-332.
[78]Rubin(2000)Pediatr Clin North Am 47：269-285，v.
[79]Jedrzejas(2001)Microbiol Mol Biol Rev 65：187-207.
[80]Bell(2000)Pediatr Infect Dis J 19：1187-1188.
[81]Iwarson(1995)APMIS 103：321-326.
[82]Gerlich等.(1990)Vaccine 8增刊：S63-68和79-80.
[83]Hsu等.(1999)Clin LiverDis 3：901-915.
[84]Gustafsson等.(1996)N.Engl.J.Med.334：349-355.
[85]Rappuoli等.(1991)TIBTECH9：232-238.
[86]Vaccines(2004)Plotkin和Orenstein编.ISBN 0-7216-9688-0.
[87]WO02/02606.
[88]Kalman等.(1999)Nature Genetics 21：385-389.
[89]Read等.(2000)Nucleic Acids Res 28：1397-406.
[90]Shirai等.(2000)J.Infect.Dis.181(Suppl 3)：S524-S527.
[91]WO99/27105.
[92]WO00/27994.
[93]WO00/37494.
[94]WO99/28475.
[95]Ross等.(2001)Vaccine 19：4135-4142.
[96]Sutter等.(2000)Pediatr Clin North Am 47：287-308.
[97]Zimmerman和Spann(1999)Am Fam Physician 59：113-118，125-126.
[98]Dreesen(1997)Vaccine 15Suppl：S2-6.
[99]MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998年1月16日；47(1)：12，19.
[100]McMichael(2000)Vaccine 19增刊1：S101-107.
[101]WO02/34771.
[102]Dale(1999)Infect Dis Clin North Am 13：227-43，viii.
[103]Ferretti等.(2001)PNAS USA 98：4658-4663.
[104]WO03/093306.
[105]WO2004/018646.
[106]WO2004/041157.
[107]lchiman和Yoshida(1981)J.Appl.Bacteriol.51：229.
[108]US4197290
[109]lchiman等.(1991)J.Appl.Bacteriol.71：176.
[110]Robinson和Torres(1997)Seminars in Immunology 9：271-283.
[111]Donnelly等.(1997)Annu Rev Immunol 15：617-648.
[112]Scott-Taylor和Dalgleish(2000)Expert Opin Investig Drugs 9：471-480.
[113]Apostolopoulos和Plebanski(2000)Curr Opin Mol Ther 2：441-447.
[114]Ilan(1999)Curr Opin Mol Ther1：116-120.
[115]Dubensky等.(2000)Mol Med 6：723-732.
[116]Robinson和Pertmer(2000)Adv Virus Res 55：1-74.
[117]Donnelly等.(2000)Am J Respir Crit Care Med 162(4Pt 2)：S190-193.
[118]Davis(1999)Mt.Sinai J.Med.66：84-90.
[119]Paoletti等.(2001)Vaccine 19：2118-2126.
[120]WO00/56365.
[121]Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药物科学与实践》).第20版，ISBN：0683306472.
[122]WO03/009869.
[123]Almeida和Alpar(1996)J.Drug Targeting 3：455-467.
[124]Agarwal和Mishra(1999)Indian J Exp Biol 37：6-16.
[125]WO00/53221.
[126]Jakobsen等.(2002)Infect Immun 70：1443-1452.
[127]Bergquist等.(1998)APMIS 106：800-806.
[128]Baudner等.(2002)Infect Immun 70：4785-4790.
[129]Ugozzoli等.(2002)J Infect Dis 186：1358-1361.
[130]Vaccine Design...(《疫苗设计……》)(1995)Powell和Newman编.ISBN：030644867X.普莱努出版社(Plenum).
[131]WO00/23105.
[132]WO90/14837.
[133]Podda(2001)Vaccine 19：2673-80.
[134]Frey等.(2003)Vaccine 21：4234-7.
[135]美国专利6,299,884.
[136]美国专利6,451,325.
[137]美国专利5,057,540.
[138]WO96/33739.
[139]EP-A-0109942.
[140]WO96/11711.
[141]WO00/07621.
[142]Barr等.(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32：247-271.
[143]Sjolanderet等.(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32：321-338.
[144]Niikura等.(2002)Virology 293：273-280.
[145]Lenz等.(2001)J Immunol 166：5346-5355.
[146]Pinto等.(2003)J Infect Dis 188：327-338.
[147]Gerber等.(2001)Virol75：4752-4760.
[148]WO03/024480
[149]WO03/024481
[150]Gluck等.(2002)Vaccine 20：B10-B16.
[151]EP-A-0689454.
[152]Johnson等.(1999)Bioorg Med Chem Lett 9：2273-2278.
[153]Evans等.(2003)Expert Rev Vaccines 2：219-229.
[154]Meraldi等.(2003)Vaccine 21：2485-2491.
[155]Pajak等.(2003)Vaccine 21：836-842.
[156]Kandimalla等.(2003)Nucleic Acids Research 31：2393-2400.
[157]WO02/26757.
[158]WO99/62923.
[159]Krieg(2003)Nature Medicine 9：831-835.
[160]McCluskie等.(2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology 32：179-185.
[161]WO98/40100.
[162]美国专利6,207,646.
[163]美国专利6,239,116.
[164]美国专利6,429,199.
[165]Kandimalla等.(2003)Biochemical Society Transactions 31(part 3)：654-658.
[166]Blackwell等.(2003)J Immunol 170：4061-4068.
[167]Krieg(2002)Trends Immunol 23：64-65.
[168]WO01/95935.
[169]Kandimalla等.(2003)BBRC 306：948-953.
[170]Bhagat等.(2003)BBRC 300：853-861.
[171]WO03/035836.
[172]WO95/17211.
[173]WO98/42375.
[174]Beignon等.(2002)Infect Immun 70：3012-3019.
[175]Pizza等.(2001)Vaccine 19：2534-2541.
[176]Pizza等.(2000)Int J Med Microbiol 290：455-461.
[177]Scharton-Kersten等.(2000)Infect Immun 68：5306-5313.
[178]Ryan等.(1999)Infect Immun 67：6270-6280.
[179]Partidos等.(1999)Immunol Lett 67：209-216.
[180]Peppoloni等.(2003)Expert Rev Vaccines 2：285-293.
[181]Pine等.(2002)J Control Release 85：263-270.
[182]Domenighini等.(1995)Mol Microbiol 15：1165-1167.
[183]WO99/40936.
[184]WO99/44636.
[185]Singh等(2001)J Cont Release 70：267-276.
[186]WO99/27960.
[187]美国专利6,090,406
[188]美国专利5,916,588
[189]EP-A-0626169.
[190]WO99/52549.
[191]WO01/21207.
[192]WO01/21152.
[193]Andrianov等.(1998)Biomaterials 19：109-115.
[194]Payne等.(1998)Adv Drug Delivery Review 31：185-196.
[195]Stanley(2002)Clin Exp Dermatol 27：571-577.
[196]Jones(2003)Curr Opin InvestigDrugs 4：214-218.
[197]WO04/60308
[198]WO04/64759.
[199]WO99/11241.
[200]WO94/00153.
[201]WO98/57659.
[202]欧洲专利申请0835318，0735898和0761231.
[203]Hoskins等.(2001)J.Bacteriol.183：5709-5717.
[204]Falugi等.(2001)Eur J Immunol.31(12)：3816-24.
[205]Geysen等.(1984)PNAS USA 81：3998-4002.
[206]Carter(1994)Methods Mol Biol 36：207-23.
[207]Jameson，BA等.1988，CABIOS4(1)：181-186.
[208]Raddrizzani和Hammer(2000)Brief Bioinform 1(2)：179-89.
[209]De Lalla等.(1999)J.Immunol.163：1725-29.
[210]Brusic等.(1998)Bioinformatics 14(2)：121-30
[211]Meister等.(1995)Vaccine 13(6)：581-91.
[212]Roberts等.(1996)AIDS Res Hum Retroviruses 12(7)：593-610.
[213]Maksyutov和Zagrebelnaya(1993)Comput Appl Biosci 9(3)：291-7.
[214]Feller和de la Cruz(1991)Nature 349(6311)：720-1.
[215]Hopp(1993)Peptide Research 6：183-190.
[216]Welling等.(1985)FEBS Lett.188：215-218.
[217]Davenport等.(1995)Immunogenetics 42：392-297.
[218]WO2004/092209.
[219]WO2008/061953.
[220]WO2005/090985
[221]Hardy等.(1988)Anal Biochem 170：54-62.
[222]Wang等.(1990)Anal Biochem 190：182-187.
[223]WO2005/114171.
[224]T.W.Greene和P.G.M.Wuts in“Protective groups in organic chemistry(有机化学中的保护基团)”约翰韦利森出版社(John Wiley and Sons)，第4版，2006.
[225]Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药物科学与实践》).第20版，ISBN：0683306472.
[226]Methods In Enzymology(《酶学方法》)(S.Colowick和N.Kaplan编，学术出版社(Academic Press，Inc.))
[227]Handbook of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)，卷I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986，布莱克威尔科学出版公司(Blackwell ScientificPublications))
[228]Sambrook等.(2001)Molecular Cloning.：A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第3版(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)).
[229]Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(《表面和胶体化学手册》)(Birdi，K.S.编，CRC出版社，1997)
[230]Ausubel等.(编)(2002)Short protocols in molecular biology(《精编分子生物学实验指南》)，第5版(最新实验指南).
[231]Molecular Biology Techniques：An Intensive Laboratory Course(《分子生物学技术：详细实验室课程》)，(Ream等编，1998，学术出版社)
[232]PCR(Introduction to Biotechniques Series)(《PCR(生物技术入门系列)》)，第2版.(Newton和Graham编，1997，施普林格出版公司(Springer Verlag))
[233]Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(F.M.Ausubel等编，1987)增刊30
[234]Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482-489.
[235]Micoli等.(2012)Vaccine 30：853-861.
[236]Debenham等.(1997)J.Org.Chem.62：4591-4600.
[237]Bera等.(2011)J.Org.Chem.76：3181-3193.
[238]Bundle等.(1974)Can.J.Biochem.52(9)：723-725.
[239]Berti等.(2012)Vaccine 30：6409-6415.

Claims (25)

1.脑膜炎奈瑟球菌血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联物。
2.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述偶联物可通过包括以下步骤的方法得到：(a)氧化所述荚膜多糖中的伯羟基，以得到带醛基的经氧化的多糖；和(b)使所述经氧化的多糖通过所述醛基与载体分子偶联，从而得到所述偶联物。
3.如权利要求2所述的偶联物，其特征在于，步骤(a)中的所述氧化是在所述荚膜多糖中1-10％的残基上的伯羟基的氧化。
4.如权利要求2或3所述的偶联物，其特征在于，步骤(b)中的所述偶联是直接的。
5.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述偶联物可通过包括以下步骤的方法得到：(a)所述荚膜多糖的还原末端的还原性胺化，以得到具有通过共价键与末端亚基的C-1原子连接的伯胺基的经修饰的多糖；和(b)通过所述伯胺基将所述经修饰的多糖与载体分子偶联，从而得到所述偶联物。
6.如权利要求1所述的偶联物，其特征在于，所述偶联物可通过包括以下步骤的方法得到：(a)所述荚膜多糖还原末端的还原，以得到该末端具有2个相邻羟基的经修饰的多糖；(b)所述相邻羟基的氧化切割，以得到在所述末端带醛基的经进一步修饰的多糖；(c)所述醛基的还原性胺化，以得到在所述末端带伯胺基的经进一步修饰的多糖，和(d)通过所述伯胺基使所述经进一步修饰的多糖与载体分子偶联，从而得到所述偶联物。
7.如权利要求5或6所述的偶联物，其特征在于，步骤(d)中的所述偶联通过接头。
8.如前述权利要求中任一项所述的偶联物，其特征在于，所述荚膜多糖是寡糖。
9.如前述权利要求中任一项所述的偶联物，其特征在于，所述载体分子是白喉类毒素或破伤风类毒素、CRM197或蛋白D。
10.如权利要求1-8中任一项所述的偶联物，其特征在于，所述载体分子包括spr0096抗原和spr2021抗原。
11.一种包含血清组X荚膜多糖的免疫原性组合物，所述血清组X荚膜多糖尤其是如前述权利要求中任一项所定义的偶联物的形式。
12.如权利要求11所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物还包含一种或多种其他抗原。
13.如权利要求11或22所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物还包含血清组A荚膜多糖。
14.如权利要求13所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述血清组A荚膜多糖与载体分子偶联。
15.如权利要求11-14中任一项所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物是水性制剂。
16.一种包含如权利要求11-15中任一项所述的免疫原性组合物的疫苗。
17.一种在哺乳动物中引起免疫应答的方法，所述方法包括向所述哺乳动物给予如权利要求11-15中任一项所述的免疫原性组合物。
18.一种用于制备血清组X荚膜多糖和载体分子的偶联物的方法，其中所述方法如权利要求2-7中任一项所定义。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述偶联物如权利要求8-10中任一项所定义。
20.一种药物组合物，其包含(a)血清组X荚膜多糖和(b)药学上可接受的载体，其中所述组合物在水性制剂中。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，所述血清组X荚膜多糖是如权利要求1-10中任一项所定义的偶联物的形式。
22.如权利要求20或21所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物还包含如权利要求13或14所定义的一种或多种其他抗原。
23.一种用于测试疑似含有血清组X荚膜多糖的样品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)使所述样品中的任意血清组X荚膜多糖水解，以得到水解物；(ii)使所述水解物经过液相色谱；和(iii)检测步骤(ii)中分离的任意葡糖胺-4-磷酸。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，在步骤(i)之前将所述样品中偶联的和未偶联的血清组X荚膜多糖互相分离。
25.一种用于分析疑似含有血清组X荚膜多糖的试样的方法，其中通过如权利要求22或23所述的方法测量总体血清组X荚膜多糖含量，如权利要求24所述测量未偶联的血清组X荚膜多糖含量，由此可计算未偶联的血清组X荚膜多糖与总体血清组X荚膜多糖的比率。
CN201380038432.5A 2012-05-22 2013-05-22 脑膜炎球菌血清组x偶联物 Pending CN104736180A (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261650025P 2012-05-22 2012-05-22
US61/650,025 2012-05-22
US201261698677P 2012-09-09 2012-09-09
US61/698,677 2012-09-09
US201361799528P 2013-03-15 2013-03-15
US61/799,528 2013-03-15
PCT/EP2013/060447 WO2013174832A1 (en) 2012-05-22 2013-05-22 Meningococcus serogroup x conjugate

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104736180A true CN104736180A (zh) 2015-06-24

Family

ID=48470983

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380038432.5A Pending CN104736180A (zh) 2012-05-22 2013-05-22 脑膜炎球菌血清组x偶联物

Country Status (14)

Country Link
US (2) US10124051B2 (zh)
EP (1) EP2852414B9 (zh)
JP (2) JP2015518845A (zh)
KR (1) KR20150021933A (zh)
CN (1) CN104736180A (zh)
AU (1) AU2013265336A1 (zh)
BR (1) BR112014029313A2 (zh)
CA (1) CA2874210A1 (zh)
ES (1) ES2820898T3 (zh)
IL (1) IL235543A0 (zh)
MX (1) MX2014014067A (zh)
RU (1) RU2014151567A (zh)
SG (2) SG11201407440WA (zh)
WO (1) WO2013174832A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110809477A (zh) * 2017-06-27 2020-02-18 默沙东和惠康基金会合资的希勒曼实验室私人有限公司 新型多价多糖-蛋白轭合物疫苗组合物及其制剂

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ564606A (en) 2005-06-27 2010-10-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition comprising atleast two N. meningitidis capsular polysaccharides conjugated through a linker protein
US9198977B2 (en) * 2012-01-30 2015-12-01 Serum Institute Of India Ltd. Immunogenic composition
JP2015518845A (ja) * 2012-05-22 2015-07-06 ノバルティス アーゲー 髄膜炎菌血清群ｘコンジュゲート
CN104936615B (zh) * 2012-11-21 2017-03-29 印度血清研究所私人有限公司 高产量的细菌多糖的制备
WO2015158898A2 (en) * 2014-04-17 2015-10-22 Medizinische Hochschule Hannover Means and methods for producing neisseria meningitidis capsular polysaccharides of low dispersity
EP2952586B1 (en) 2014-06-02 2021-10-27 Serum Institute Of India Private Limited Bacterial capsular polysaccharide yield enhancement by addition of defoaming agents
US10365272B2 (en) * 2014-07-25 2019-07-30 Serum Institute Of India Private Limited Highly sensitive immunoassay for rapid quantification of meningococcal capsular polysaccharide antigens
DK3506935T3 (en) 2016-09-02 2024-04-02 Sanofi Pasteur Inc Neisseria meningitidis-vaccine
SI3544637T1 (sl) * 2016-11-25 2021-02-26 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Nativni OMV-antigen konjugati in njihova uporaba
CN110214022A (zh) * 2016-11-25 2019-09-06 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性缀合物及其用途
MX2022006054A (es) 2019-11-22 2022-06-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Dosificacion y administracion de una vacuna de glucoconjugados de sacaridos bacterianos.

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008102173A1 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 Health Protection Agency Compositions comprising polysaccharide conjugates and their use as vaccines
WO2011023764A1 (en) * 2009-08-26 2011-03-03 Medizinische Hochschule Hannover Means and methods for producing artificial capsular polysaccharides of neisseria meningitidis
WO2012061400A2 (en) * 2010-11-01 2012-05-10 University Of Maryland, Baltimore Method for reduction of free polysaccharide in polysaccharide-protein vaccines reactions using ion-exchange matrices
WO2013038375A2 (en) * 2011-09-14 2013-03-21 Novartis Ag Methods for making saccharide-protein glycoconjugates

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4057685A (en) 1972-02-02 1977-11-08 Abbott Laboratories Chemically modified endotoxin immunizing agent
JPS5452794A (en) 1977-09-30 1979-04-25 Kousaku Yoshida Extracting of polysacchride from capusle containing epidermis staphylococus
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US5916588A (en) 1984-04-12 1999-06-29 The Liposome Company, Inc. Peptide-containing liposomes, immunogenic liposomes and methods of preparation and use
US6090406A (en) 1984-04-12 2000-07-18 The Liposome Company, Inc. Potentiation of immune responses with liposomal adjuvants
IT1187753B (it) 1985-07-05 1987-12-23 Sclavo Spa Coniugati glicoproteici ad attivita' immunogenica trivalente
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
JPH04500203A (ja) 1988-08-25 1992-01-16 ザ　リポソーム　カンパニー，インコーポレイテッド インフルエンザワクチンおよび新規なアジュバント
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
EP0378881B1 (en) 1989-01-17 1993-06-09 ENIRICERCHE S.p.A. Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
JPH04506662A (ja) 1989-07-14 1992-11-19 アメリカン・サイアナミド・カンパニー 接合体ワクチンのためのサイトカイニンおよびホルモンのキヤリヤー
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
ATE128628T1 (de) 1990-08-13 1995-10-15 American Cyanamid Co Faser-hemagglutinin von bordetella pertussis als träger für konjugierten impfstoff.
US5153312A (en) 1990-09-28 1992-10-06 American Cyanamid Company Oligosaccharide conjugate vaccines
FR2686798B1 (fr) 1992-01-31 1994-03-25 Salomon Sa Dispositif visant a modifier la repartition d'un ski sur sa surface de glisse et ski equipe d'un tel dispositif.
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
PT761231E (pt) 1992-06-25 2000-06-30 Smithkline Beecham Biolog Composicao de vacina contendo adjuvantes
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
EP1175912A1 (en) 1993-03-23 2002-01-30 SmithKline Beecham Biologics SA Vaccine compositions containing 3-O deacylated monophosphoryl lipid A
GB9326174D0 (en) 1993-12-22 1994-02-23 Biocine Sclavo Mucosal adjuvant
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
HUP9802199A3 (en) 1995-06-07 1999-07-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine comprising a polysaccharide antigen-carrier protein conjugate and free carrier protein and use of
GB9513261D0 (en) 1995-06-29 1995-09-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
JP5087758B2 (ja) 1997-03-10 2012-12-05 オタワ ホスピタル リサーチ インスティチュート アジュバントとして非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸の使用
US6818222B1 (en) 1997-03-21 2004-11-16 Chiron Corporation Detoxified mutants of bacterial ADP-ribosylating toxins as parenteral adjuvants
US6299881B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Uronium salts for activating hydroxyls, carboxyls, and polysaccharides, and conjugate vaccines, immunogens, and other useful immunological reagents produced using uronium salts
GB9712347D0 (en) 1997-06-14 1997-08-13 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
CA2302554C (en) 1997-09-05 2007-04-10 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
KR20010032336A (ko) 1997-11-21 2001-04-16 브랑디 빠스깔 클라미디아 뉴모니아 게놈 서열과 폴리펩티드, 이의 단편및 이의 용도, 특히, 감염의 진단, 예방 및 치료 용도
JP2002517179A (ja) 1997-11-28 2002-06-18 ジェンセット Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓゲノム配列およびポリペプチド、それらのフラグメント、ならびに特に感染症の診断、予防および治療のためのそれらの使用
GB9725084D0 (en) 1997-11-28 1998-01-28 Medeva Europ Ltd Vaccine compositions
CN1200730C (zh) 1998-02-12 2005-05-11 惠氏控股有限公司 用白细胞介素－12配制的肺炎球菌和脑膜炎球菌疫苗
US7018637B2 (en) 1998-02-23 2006-03-28 Aventis Pasteur, Inc Multi-oligosaccharide glycoconjugate bacterial meningitis vaccines
US6303114B1 (en) 1998-03-05 2001-10-16 The Medical College Of Ohio IL-12 enhancement of immune responses to T-independent antigens
BR9909915A (pt) 1998-04-09 2000-12-26 Smithkline Beecham Biolog Composições adjuvantes
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
GB9817052D0 (en) 1998-08-05 1998-09-30 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
AU771330B2 (en) 1998-08-19 2004-03-18 Baxter Healthcare Sa Immunogenic beta-propionamido-linked polysaccharide protein conjugate useful as a vaccine produced using an N-acryloylated polysaccharide
DE69935606T9 (de) 1998-10-16 2021-03-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Adjuvanzsysteme und impfstoffe
WO2000027994A2 (en) 1998-11-12 2000-05-18 The Regents Of The University Of California Chlamydia pneumoniae genome sequence
GB9828000D0 (en) 1998-12-18 1999-02-10 Chiron Spa Antigens
US6146902A (en) 1998-12-29 2000-11-14 Aventis Pasteur, Inc. Purification of polysaccharide-protein conjugate vaccines by ultrafiltration with ammonium sulfate solutions
EP1034792A1 (en) 1999-03-11 2000-09-13 Pasteur Merieux Serums Et Vaccins Intranasal delivery of pneumococcal polysaccharide vaccines
MY125387A (en) 1999-03-19 2006-07-31 Smithkline Beecham Biologicals S A Vaccine
FR2791895B1 (fr) 1999-03-23 2001-06-15 Pasteur Merieux Serums Vacc Utilisation de trehalose pour stabiliser un vaccin liquide
AU781027B2 (en) 1999-04-09 2005-04-28 Department Of Health & Human Services Recombinant toxin a protein carrier for polysaccharide conjugate vaccines
CA2383413A1 (en) 1999-09-24 2001-03-29 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Use of combination of polyoxyethylene sorbitan ester and octoxynol as adjuvant and its use in vaccines
WO2001021152A1 (en) 1999-09-24 2001-03-29 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Adjuvant comprising a polyxyethylene alkyl ether or ester and at least one nonionic surfactant
CA2396871A1 (en) 2000-01-20 2001-12-20 Ottawa Health Research Institute Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
EP1297005B1 (en) 2000-07-03 2009-08-26 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Immunisation against chlamydia pneumoniae
EP1322656B1 (en) 2000-09-26 2008-01-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory activity of immunostimulatory oligonucleotide analogs by positional chemical changes
NZ560966A (en) 2000-10-27 2010-06-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A & B
MXPA03006561A (es) 2001-01-23 2004-10-15 Aventis Pasteur Vacuna del conjugado proteina-polisacarido meningococico, multivalente.
US20030035806A1 (en) 2001-05-11 2003-02-20 D'ambra Anello J. Novel meningitis conjugate vaccine
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
EP1409013B1 (en) 2001-07-26 2009-11-18 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Vaccines comprising aluminium adjuvants and histidine
JP4360906B2 (ja) 2001-09-14 2009-11-11 サイトス バイオテクノロジー アーゲー ウィルス様粒子によって誘導される免疫応答を高めるための、抗原提示細胞のインビボでの活性化
JP4516748B2 (ja) 2001-09-14 2010-08-04 サイトス バイオテクノロジー アーゲー ウィルス様粒子中への免疫賦活物質のパッケージ化：調製法および使用法
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
GB0210128D0 (en) 2002-05-02 2002-06-12 Chiron Spa Nucleic acids and proteins from streptococcus groups A & B
WO2004011027A1 (en) 2002-07-30 2004-02-05 Baxter International Inc. Chimeric multivalent polysaccharide conjugate vaccines
GB0217909D0 (en) 2002-08-01 2002-09-11 Du Pont Chintzed stretch fabrics
US20070053924A1 (en) 2002-08-26 2007-03-08 Herve Tettelin Conserved and specific streptococcal genomes
US20070036828A1 (en) 2002-09-13 2007-02-15 Chiron Corporation Group b streptococcus vaccine
WO2004060308A2 (en) 2002-12-27 2004-07-22 Chiron Corporation Thiosemicarbazones as anti-virals and immunopotentiators
EP1594524B1 (en) 2003-01-21 2012-08-15 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Use of tryptanthrin compounds for immune potentiation
AU2004230244B2 (en) 2003-04-15 2011-09-22 Intercell Ag S. pneumoniae antigens
JP5557415B2 (ja) * 2003-06-02 2014-07-23 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド 吸着させたトキソイドおよび多糖類含有抗原を含む微粒子に基づく免疫原性組成物
MXPA05014171A (es) 2003-06-23 2007-02-21 Sanofi Pasteur Inc Metodo de inmunizacion contra neisseria meningitidis serogrupos a y c.
GB0406013D0 (en) 2004-03-17 2004-04-21 Chiron Srl Analysis of saccharide vaccines without interference
AU2005246093B2 (en) 2004-05-20 2011-09-29 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Analysis of liquid chromatography eluates
AU2006336187A1 (en) * 2005-12-28 2007-07-26 Alza Corporation Stable therapeutic formulations
EP1923069A1 (en) 2006-11-20 2008-05-21 Intercell AG Peptides protective against S. pneumoniae and compositions, methods and uses relating thereto
GB0700562D0 (en) * 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
WO2010109324A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor h binding protein and pneumococcal saccharide conjugates
GB201003922D0 (en) * 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Conjugation process
MX342912B (es) * 2010-04-15 2016-10-19 Marine Polymer Tech Inc Aplicaciones antibacterianas de nanofibras de poli-n-acetilglucosamina.
MX354924B (es) 2011-11-07 2018-03-22 Novartis Ag Molecula portadora que comprende un antigeno spr0096 y un spr2021.
JP2015518845A (ja) * 2012-05-22 2015-07-06 ノバルティス アーゲー 髄膜炎菌血清群ｘコンジュゲート
US20140260023A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Allan Henderson Continuous strand hoop reinforcement for concrete foundations

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008102173A1 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 Health Protection Agency Compositions comprising polysaccharide conjugates and their use as vaccines
WO2011023764A1 (en) * 2009-08-26 2011-03-03 Medizinische Hochschule Hannover Means and methods for producing artificial capsular polysaccharides of neisseria meningitidis
WO2012061400A2 (en) * 2010-11-01 2012-05-10 University Of Maryland, Baltimore Method for reduction of free polysaccharide in polysaccharide-protein vaccines reactions using ion-exchange matrices
WO2013038375A2 (en) * 2011-09-14 2013-03-21 Novartis Ag Methods for making saccharide-protein glycoconjugates
CN103917245A (zh) * 2011-09-14 2014-07-09 诺华股份有限公司 用于制备糖-蛋白质糖缀合物的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
OULI XIE ET AL: "Characterization of size, structure and purity of serogroup X Neisseria meningitidis polysaccharide, and development of an assay for quantification of human antibodies", 《VACCINE》 *
ZHONGWU GUO ET AL: "《Carbohydrate-based vaccines and immunotherapies》", 31 December 2009 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110809477A (zh) * 2017-06-27 2020-02-18 默沙东和惠康基金会合资的希勒曼实验室私人有限公司 新型多价多糖-蛋白轭合物疫苗组合物及其制剂

Also Published As

Publication number Publication date
RU2014151567A (ru) 2016-07-10
JP2015518845A (ja) 2015-07-06
US20190060437A1 (en) 2019-02-28
AU2013265336A1 (en) 2014-12-04
WO2013174832A1 (en) 2013-11-28
JP2017088622A (ja) 2017-05-25
EP2852414B1 (en) 2020-07-08
US20150104479A1 (en) 2015-04-16
EP2852414B9 (en) 2020-12-09
BR112014029313A2 (pt) 2017-06-27
IL235543A0 (en) 2015-01-29
SG10201608675YA (en) 2016-12-29
ES2820898T3 (es) 2021-04-22
EP2852414A1 (en) 2015-04-01
MX2014014067A (es) 2015-02-04
US10668143B2 (en) 2020-06-02
KR20150021933A (ko) 2015-03-03
CA2874210A1 (en) 2013-11-28
SG11201407440WA (en) 2014-12-30
US10124051B2 (en) 2018-11-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10188719B2 (en) Conjugation of Streptococcal capsular saccharides
US10668143B2 (en) Meningococcus serogroup X conjugate
EP2616099B1 (en) Immunogenic compositions
AU2008202708B2 (en) Hypo-and hyper-acetylated meningococcal capsular saccharides
CN1809380B (zh) 广泛防御高毒性脑膜炎球菌谱系的多肽-疫苗
US10736959B2 (en) Conjugation of Staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular polysaccharides

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150624

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication