ES2820898T3 - Conjugado del serogrupo X de meningococos - Google Patents

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Abstract

Una composición inmunogénica que comprende un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo X de Neisseria meningitidis y una proteína portadora, en la que el acoplamiento del polisacárido capsular a la proteína portadora es directo.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugado del serogrupo X de meningococos
Campo técnico
Esta invención pertenece al campo de los sacáridos capsulares bacterianos, particularmente los polisacáridos capsulares del serogrupo X de Neisseria meningitidis. Los polisacáridos se pueden conjugar con portadores para formar conjugados. Los polisacáridos y conjugados son útiles para inmunización, particularmente en formulaciones acuosas.
Técnica antecedente
Los sacáridos capsulares de bacterias se han utilizado durante muchos años en vacunas contra bacterias encapsuladas. Como sacáridos son antígenos independientes de T, sin embargo, son poco inmunogénicos. La conjugación con un portador puede convertir antígenos independientes de T en antígenos dependientes de T, mejorando así las respuestas de memoria y permitiendo que se desarrolle una inmunidad protectora. Por tanto, las vacunas de sacáridos más eficaces se basan en glicoconjugados, y el prototipo de vacuna conjugada fue contra Haemophilus influenzae tipo b ('Hib') [por ejemplo, véase el capítulo 14 de la referencia 86].
Con base en el polisacárido capsular del organismo, se han identificado doce serogrupos de N. meningitidis (A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X, Y y Z). El grupo A es el patógeno implicado con mayor frecuencia en enfermedades epidémicas en África subsahariana. Los serogrupos B y C son responsables de la gran mayoría de los casos en los Estados Unidos de América y en la mayoría de los países desarrollados. Los serogrupos W135 y Y son responsables de los casos restantes en Estados Unidos de América y en países desarrollados. Desde hace muchos años se conoce una vacuna tetravalente de polisacáridos capsulares de los serogrupos A, C, Y y W135 [1, 2]. Aunque es eficaz en adolescentes y adultos, induce una respuesta inmunitaria deficiente y una protección de corta duración y no se puede utilizar en bebés [por ejemplo, la referencia 3] porque los polisacáridos son antígenos independientes de las células T que inducen una respuesta inmunitaria débil que no se puede reforzar. Los polisacáridos en esta vacuna no están conjugados [4]. Las vacunas conjugadas contra el serogrupo C han sido aprobadas para uso humano e incluyen MenjugateMR [5], MeningitecMR y NeisVac-CMR. Se conocen mezclas de conjugados de los serogrupos A C [6-8] y se han informado mezclas de conjugados de los serogrupos A C W135 Y [9-13].
La estructura del polisacárido capsular del grupo X se conoce desde la década de 1970 [14] y este serogrupo se ha asociado con varios brotes de enfermedad meningocócica, por ejemplo, en África subsahariana y China [15,16]. Se sabe que el serogrupo X tiene una tasa de ataque significativamente más alta que el serogrupo A entre los niños menores de 5 años. Aunque durante muchos años se ha reconocido la necesidad de una vacuna contra este serogrupo [17], no se ha desarrollado una vacuna eficaz. Se han propuesto vacunas conjugadas contra el serogrupo X [17, 18], pero se desconoce si tales conjugados serían inmunogénicos o protectores contra este serogrupo.
Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de conjugados de polisacáridos capsulares del serogrupo X. Además, sigue existiendo la necesidad de conjugados que puedan usarse para la vacunación contra enfermedades causadas por este serogrupo.
La estructura del polisacárido capsular del grupo X consiste en residuos de N-acetilglucosamina-4-fosfato unidos por enlaces fosfodiéster a1-4 sin grupos O-acetilo [19]: {^4)-D-GlcpNAc-a-(1^OPO3^} (Figura 1). Basado en la similitud entre sus estructuras, se ha postulado una relación biosintética entre los polisacáridos capsulares MenA y MenX [14]. El polisacárido capsular MenA tiende a hidrolizarse significativamente en solución acuosa [20]. Esta inestabilidad se cree que es causada por la presencia de un enlace fosfodiéster que involucra la posición anomérica y del grupo N-acetilo en la posición 2 de manosamina, que puede ayudar a la salida de un grupo fosfomonoéster [21]. Otra posibilidad es que los grupos hidroxilo en la posición 4 de las subunidades de N-acetilmanosamina interactúan con los grupos fosfodiéster facilitando la hidrólisis a través de un mecanismo de participación interna, como se observa en el polisacárido capsular del neumococo tipo 6A [22] y Haemophilus influenzae tipo b [23]. La similitud en las estructuras de los polisacáridos capsulares MenX y MenA, particularmente su enlace fosfodiéster anomérico común, significa que el polisacárido MenX puede sufrir problemas de estabilidad similares cuando está en solución acuosa. La inestabilidad intrínseca del polisacárido capsular MenA en solución acuosa significa que a menudo se presenta en forma liofilizada cuando está contenido en vacunas (por ejemplo, en la vacuna de polisacáridos MencevaxMR y las vacunas conjugadas MenAfriVacMR, MenveoMR y NimenrixMR). Aunque el polisacárido capsular MenX podría presentarse de forma similar en forma liofilizada para mejorar su estabilidad, sería más conveniente una formulación acuosa. La única vacuna que contiene un conjugado de polisacárido capsular MenA en una formulación acuosa es MenactraMR, pero esta vacuna requiere almacenamiento a bajas temperaturas. Este almacenamiento en frío es costoso y presenta dificultades prácticas en muchos de los países en el que los brotes de MenA y MenX son comunes (por ejemplo, África subsahariana).
Por consiguiente, existe la necesidad de formulaciones acuosas de polisacáridos capsulares del serogrupo X y conjugados de los mismos, particularmente formulaciones acuosas que no requieren refrigeración.
El desarrollo de una vacuna contra MenX requiere un procedimiento para la cuantificación de polisacáridos que pueda usarse como un ensayo en proceso y/o para la caracterización de la vacuna final. La presencia de grupos fosfato en el polisacárido capsular MenX significa que el polisacárido puede cuantificarse mediante un procedimiento colorimétrico que mide el contenido total de fósforo [24]. Sin embargo, este procedimiento carece de selectividad y, por lo tanto, no sería adecuado para ciertas aplicaciones en proceso, por ejemplo, para el análisis de polisacáridos en tampones de fosfato o en presencia de impurezas que contienen fosfato. Un procedimiento más selectivo sería la RMN, que ya se ha propuesto para la cuantificación de polisacáridos MenX [25]. Sin embargo, este enfoque requiere muestras puras y una gran cantidad de material. La referencia 26 demuestra un enfoque alternativo, en el que el polisacárido MenX se cuantifica mediante HPAEC-PAD, que es más sensible que la RMN y más selectivo que la medición del contenido de fosfato. Los autores de la referencia 26 cuantificaron el polisacárido MenX hidrolizando la muestra para producir glucosamina y comparando la cantidad de glucosamina liberada con una curva de calibración derivada de un estándar cuantitativo de N-acetil-glucosamina-6-fosfato. Sin embargo, la glucosamina puede estar presente debido a contaminación, lo que da lugar a resultados inexactos.
Por consiguiente, existe la necesidad de procedimientos alternativos o mejorados para analizar el polisacárido MenX y, en particular, de procedimientos que sean más selectivos para MenX.
Divulgación de la invención
La invención se basa en parte en procedimientos para conjugar un polisacárido capsular del serogrupo X con una molécula portadora. Los inventores han descubierto que los conjugados resultantes son inmunogénicos y capaces de inducir una respuesta de anticuerpos bactericidas. Por tanto, los conjugados del serogrupo X son útiles en composiciones inmunogénicas y, en particular, en vacunas. Los inventores también han descubierto que es posible combinar antígenos de polisacáridos capsulares del serogrupo X, por ejemplo, conjugados del serogrupo X, con otros antígenos sin perder la respuesta inmune al serogrupo X. En particular, los conjugados del serogrupo X pueden combinarse con otros conjugados, por ejemplo, conjugados que comprenden otros antígenos de sacárido capsular bacteriano. Los conjugados del serogrupo X son particularmente adecuados para la combinación con conjugados que comprenden antígenos de sacáridos capsulares de otros serogrupos de N. meningitidis, por ejemplo, serogrupos A, C, W135 y Y. En estas combinaciones, no sólo el conjugado del serogrupo X retiene su inmunogenicidad, sino que los conjugados de serogrupos A, C, W135 y/o Y también retienen su inmunogenicidad. Además, los inventores también han descubierto que a pesar de su similitud estructural con el polisacárido capsular del serogrupo A, el polisacárido capsular del serogrupo X es sorprendentemente estable en solución. Por tanto, los polisacáridos capsulares del serogrupo X y sus conjugados pueden ser particularmente adecuados para su uso en formulaciones acuosas.
La invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo X de Neisseria meningitidis y una molécula portadora, en la que el acoplamiento del polisacárido capsular a la proteína portadora es directo. Los inventores han descubierto que pueden prepararse conjugados particularmente estables de un polisacárido capsular del serogrupo X y una molécula portadora usando el procedimiento del primer procedimiento descrito a continuación. Por ejemplo, los conjugados pueden contener menos del 50 % de sacárido libre después de 28 días a 37 °C. El % de sacárido libre puede determinarse como se describe en el Estudio de estabilidad (2) a continuación. Por consiguiente, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo X y una molécula portadora que comprende menos del 50 % de sacárido libre después de 28 días a 37 °C. La composición inmunogénica puede comprender en particular menos del 25 % de sacárido libre, particularmente menos del 20 % de sacárido libre y más particularmente menos del 15 % de sacárido libre, por ejemplo, aproximadamente un 10 % de sacárido libre.
El conjugado típicamente se obtiene o se puede obtener mediante uno de los cuatro procedimientos descritos a continuación. Sin embargo, el conjugado se puede preparar alternativamente mediante cualquier procedimiento adecuado.
Un primer procedimiento para preparar un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo X y una molécula portadora, comprende las etapas de: (a) oxidar un grupo hidroxilo primario en el polisacárido capsular, para obtener un polisacárido oxidado con un grupo aldehído; y (b) acoplar el polisacárido oxidado a una molécula portadora a través del grupo aldehído, proporcionando así el conjugado. Se cree que este procedimiento es particularmente adecuado (por ejemplo, en términos de rendimiento) para polisacáridos relativamente largos, por ejemplo, aquellos con un grado de polimerización (GP) de entre 20 y 200, particularmente entre 60 y 100 (por ejemplo, entre 70 y 90, particularmente alrededor de 80). Este procedimiento también contiene relativamente pocas etapas, lo que facilita el escalamiento a nivel industrial. Los conjugados resultantes también pueden ser más estables, particularmente en comparación con los conjugados en los que el polisacárido está unido al portador a través de su extremo reductor. El acoplamiento en la etapa (b) es, por ejemplo, por aminación reductora entre el grupo aldehído y un grupo de amina primaria en la molécula portadora.
Un segundo procedimiento para preparar un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo X y una molécula portadora, comprende las etapas de: (a) aminación reductora del extremo reductor del polisacárido capsular, para obtener un polisacárido modificado con un grupo de amina primaria unido al átomo C-1 de la subunidad terminal mediante un enlace covalente; y (b) acoplar el polisacárido modificado a una molécula portadora a través del grupo de amina primaria, obteniendo así el conjugado. Este procedimiento es particularmente adecuado para polisacáridos relativamente cortos, por ejemplo, polisacáridos con un GP entre 5 y 50, particularmente entre 10 y 20, por ejemplo, aproximadamente 15.
Un tercer procedimiento para preparar un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo X y una molécula portadora, comprende las etapas de: (a) reducción del extremo reductor del polisacárido capsular, para obtener un polisacárido modificado con dos grupos hidroxilo vecinos en ese terminal; (b) escisión oxidativa de los grupos hidroxilo vecinos, para obtener un polisacárido modificado adicional con un grupo aldehído en el extremo; (c) aminación reductora del grupo aldehído, para obtener un polisacárido modificado adicional con un grupo de amina primaria en el extremo y (d) acoplar el polisacárido modificado adicionalmente a una molécula portadora a través del grupo de amina primaria, obteniendo así el conjugado. Este procedimiento puede proporcionar un mejor rendimiento que el primer y segundo procedimiento, particularmente para polisacáridos relativamente cortos, por ejemplo, polisacáridos con un GP entre 5 y 50, particularmente entre 10 y 20, por ejemplo, aproximadamente 15.
Un cuarto procedimiento para preparar un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo X y una molécula portadora, comprende las etapas de: (a) reducción del extremo reductor del polisacárido capsular, para obtener un polisacárido modificado con dos grupos hidroxilo vecinos en ese extremo; (b) escisión oxidativa de los grupos hidroxilo vecinos, para obtener un polisacárido modificado adicional con un grupo aldehído en el extremo; (c) acoplamiento directo del polisacárido modificado adicionalmente a la molécula portadora por aminación reductora del grupo aldehído con un grupo de amina primaria en la molécula portadora, obteniendo así el conjugado.
El polisacárido capsular
La invención involucra el polisacárido capsular del serogrupo X de N. meningitidis. La estructura del polisacárido capsular del grupo X consiste en residuos de N-acetilglucosamina-4-fosfato unidos por enlaces fosfodiéster a1-4 sin grupos O-acetilo [19] : {^4)-D-GlcpNAc-a-(1^OPO3^} (Figura 1).
El polisacárido capsular se puede purificar mediante técnicas conocidas, por ejemplo mediante el procedimiento descrito en la referencia 19. En general, los polisacáridos capsulares meningocócicos se preparan mediante un procedimiento que comprende las etapas de precipitación de polisacáridos (por ejemplo, usando un detergente catiónico), fraccionamiento con etanol, extracción con fenol frío (para eliminar proteínas) y ultracentrifugación (para eliminar LPS) [por ejemplo, referencia 27]. Sin embargo, un procedimiento preferido para el polisacárido capsular del serogrupo X se describe en la referencia 10. Este procedimiento implica la precipitación del polisacárido seguida de la solubilización del polisacárido precipitado usando un alcohol inferior. La precipitación se puede lograr usando un detergente catiónico tal como sales de tetrabutilamonio y cetiltrimetilamonio (por ejemplo, las sales de bromuro), o bromuro de hexadimetrina y sales de miristiltrimetilamonio. Típicamente se utiliza bromuro de cetiltrimetilamonio ("CTAB") [28]. La solubilización del material precipitado se puede lograr usando un alcohol inferior como metanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2-metil-propan-2-ol, dioles, etc., pero el etanol es particularmente adecuado para solubilizar complejos CTAB-polisacárido. Preferiblemente, se añade etanol al polisacárido precipitado para obtener una concentración final de etanol (basada en el contenido total de etanol y agua) de entre 50 % y 95 %.
Después de la resolubilización, el polisacárido puede tratarse adicionalmente para eliminar los contaminantes. Esto es particularmente importante en situaciones en las que ni siquiera una contaminación mínima es aceptable (por ejemplo, para la producción de vacunas humanas). Típicamente, esto implicará una o más etapas de filtración, por ejemplo, se puede utilizar filtración profunda, filtración a través de carbón activado, filtración por tamaños y/o ultrafiltración.
Una vez filtrado para eliminar los contaminantes, el polisacárido puede precipitarse para su posterior tratamiento y/o procesamiento. Esto puede lograrse convenientemente mediante el intercambio de cationes (por ejemplo, mediante la adición de sales de calcio o sodio).
Sin embargo, la invención no se limita a polisacáridos purificados de fuentes naturales y los polisacáridos pueden obtenerse mediante otros procedimientos, tales como síntesis total o parcial, por ejemplo, por la síntesis enzimática descrita en la referencia 29.
El polisacárido puede modificarse químicamente con respecto al polisacárido capsular que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, el polisacárido puede des-N-acetilarse (parcial o totalmente), N-propionarse (parcial o totalmente), etc. La desacetilación puede ocurrir antes, durante o después de la conjugación, pero típicamente ocurre antes de la conjugación. El grado de N-acetilación del polisacárido capsular del serogrupo X usado en la invención puede ser del 0-100 %, 50-100 %, 75-100 %, 80-100 %, 90-100 % o 95-100 %. Típicamente, el grado de N-acetilación es del 100 %. El grado de N-acetilación del polisacárido se puede determinar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante RMN de protón (por ejemplo, como se describe en las referencias 30 y 31).
Los polisacáridos capsulares se utilizarán generalmente en forma de oligosacáridos. Estos se forman convenientemente mediante la fragmentación del polisacárido capsular purificado (por ejemplo, por hidrólisis), que típicamente irá seguida de la purificación de los fragmentos del tamaño deseado.
La fragmentación de polisacáridos se realiza preferiblemente para obtener un grado promedio final de polimerización (GP) en el oligosacárido de entre 20 y 200, particularmente entre 60 y 100 (por ejemplo, entre 70 y 90, particularmente alrededor de 80). Los inventores han descubierto que los polisacáridos de esta longitud son particularmente adecuados para su uso en el primer procedimiento descrito anteriormente. Sin embargo, los inventores han descubierto que también pueden usarse polisacáridos más cortos, por ejemplo, polisacáridos con un GP entre 5 y 50, particularmente entre 10 y 20, por ejemplo, aproximadamente 15. Los inventores han descubierto que los polisacáridos de esta longitud son particularmente adecuados para su uso en el segundo y tercer procedimientos descritos anteriormente. El GP puede medirse convenientemente mediante cromatografía de intercambio iónico, RMN o mediante ensayos colorimétricos [32].
El polisacárido puede dimensionarse para obtener un intervalo deseado de tamaños de polisacárido [33]. Esto se puede lograr de varias formas, tal como ultrafiltración seguida de cromatografía de intercambio iónico.
La molécula portadora
La invención implica el uso de proteínas portadoras. En general, la conjugación covalente de sacáridos con portadores mejora la inmunogenicidad de los sacáridos, ya que los convierte de antígenos independientes de T en antígenos dependientes de T, lo que permite el cebado para la memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas [por ejemplo, referencia 34] y es una técnica bien conocida [por ejemplo, revisado en referencias 35 a 43].
Las proteínas portadoras preferidas son toxinas bacterianas, tales como toxinas de la difteria o del tétanos, o toxoides o mutantes de las mismas, particularmente el toxoide de la difteria o el toxoide del tétanos. Los inventores han descubierto que el mutante de la toxina de la difteria CRM197 [44] es particularmente adecuado. También se puede utilizar la proteína D de H. influenzae [45-47].
Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen el complejo proteico de la membrana externa de N. meningitidis [48], péptidos sintéticos [49, 50], proteínas de choque térmico [51, 52], proteínas de la tos ferina [53, 54], citocinas [55], linfocinas [55], hormonas [55], factores de crecimiento [55], albúmina de suero humano (típicamente recombinante), proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de células T CD4+ humanas de varios antígenos derivados de patógenos [56] tales como N19 [57], proteína de superficie neumocócica PspA [58], neumolisina [59] o sus derivados no tóxicos [60], proteínas de captación de hierro [61], toxina A o B de C. difficile [62], una proteína GBS [63], una proteína GAS [64], etc.
Otras proteínas portadoras adecuadas se describen en la referencia 65, en particular la proteína portadora de la SEQ ID NO: 9 en ese documento. Estas proteínas portadoras también se describen en la referencia 66, y se proporcionan más detalles en la sección "Proteínas portadoras ejemplares" a continuación.
Oxidación
En la etapa (a) del primer procedimiento descrito anteriormente, se oxida un grupo hidroxilo primario en el polisacárido capsular para obtener un grupo aldehído. El grupo hidroxilo primario está unido al átomo C-6 de una subunidad de polisacárido capsular MenX mediante un enlace covalente, de modo que la etapa procede de la siguiente manera:
Figure imgf000005_0001
Esta etapa puede implicar la oxidación de más de uno de tales grupos hidroxilo primario, dando como resultado la introducción de más de un grupo aldehído a lo largo de la cadena de polisacárido. Por ejemplo, los inventores han descubierto que se pueden preparar conjugados adecuados oxidando el grupo hidroxilo primario entre el 1-50 %, particularmente el 1-20 % y más particularmente el 1-10 %, por ejemplo, aproximadamente 4-8 %, de residuos dentro del polisacárido del serogrupo X. Los grupos hidroxilo pueden convertirse en aldehídos mediante diversas reacciones de oxidación (por ejemplo, oxidación de Swern, oxidación de Dess-Martin, oxidaciones de CrVI, etc.). Sin embargo, los inventores han descubierto que la oxidación mediada por TEMPO (radical 2,2,6,6-tetrametilpiperidiniloxi) es particularmente adecuada. La oxidación mediada por TEMPO se describe en la referencia 67. Para evitar la oxidación del grupo aldehído a un grupo carboxilo, la oxidación mediada por TEMPO se lleva a cabo preferiblemente en condiciones no acuosas, por ejemplo, utilizando un disolvente DMF como se describe en la referencia 68. El experto en la materia sería capaz de identificar las condiciones adecuadas para la oxidación. Por ejemplo, los inventores han descubierto que el tratamiento del polisacárido con TEMPO (0,06 equivalentes con respecto a la subunidad de repetición MenX), NaHCO3 (9 equivalentes con respecto a la subunidad de repetición de MenX) y TCC (ácido tricloroisocianúrico, 2 equivalentes con respecto a la subunidad de repetición de MenX) a 0 °C durante la noche es adecuado.
Escisión oxidativa
En la etapa (b) del tercer y cuarto procedimiento descritos anteriormente, dos grupos hidroxilo vecinos en el polisacárido capsular experimentan escisión oxidativa para obtener un grupo aldehído:
Figure imgf000006_0001
La escisión oxidativa (por ejemplo, usando NaIO4, Pb(OAc)4, etc.) es bien conocida en la técnica. Los inventores han descubierto que es adecuado hacer reaccionar el polisacárido a razón de 6-8 mg/ml en tampón NaPi 10 mM a pH 7,2 con NaIO4 (10 equivalentes con respecto al peso molecular de MenX, sólido) durante 1,5 horas a temperatura ambiente.
Reducción
En la etapa (a) del tercer y cuarto procedimiento descritos anteriormente, el extremo reductor del polisacárido capsular se reduce para obtener un polisacárido modificado con dos grupos hidroxilo vecinos en el extremo:
Figure imgf000006_0002
La reducción de polisacáridos (por ejemplo, usando NaBH4, etc.) es bien conocida en la técnica. Los inventores han encontrado que es adecuado hacer reaccionar el polisacárido a razón de 15 mg/ml en tampón NaPi 10 mM a pH 8 con NaBH4 (12 equivalentes con respecto al peso molecular de MenX, sólido) durante 1,5 horas a temperatura ambiente.
Aminación reductora
En la etapa (a) del segundo procedimiento descrito anteriormente, el extremo reductor del polisacárido capsular se somete a aminación reductora para obtener un polisacárido modificado con un grupo de amina primaria unido al átomo C-1 de la subunidad terminal mediante un enlace covalente:
Figure imgf000006_0003
La aminación reductora es una técnica estándar en química orgánica. Por ejemplo, el grupo aldehído en el extremo reductor puede convertirse en un grupo de amina primaria usando amoniaco. Esto se puede lograr convenientemente usando una sal de amonio (por ejemplo, cloruro de amonio o acetato de amonio) en combinación con un agente reductor apropiado (por ejemplo, cianoborohidruros, tales como cianoborohidruro de sodio NaBH3CN; borano-piridina; triacetoxiborohidruro de sodio; resina de intercambio de borohidruro). El experto en la materia sería capaz de identificar las condiciones adecuadas para la aminación reductora.
La aminación reductora también se lleva a cabo en la etapa (c) del tercer procedimiento descrito anteriormente, para obtener un polisacárido modificado con un grupo de amina primaria en el extremo. Por ejemplo, el grupo aldehído se puede convertir en un grupo de amina primaria como se describió anteriormente. Por lo tanto, la aminación reductora puede dar como resultado un polisacárido modificado con un grupo de amina primaria unido al átomo C-5 de la subunidad terminal mediante un enlace covalente:
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La aminación reductora también se lleva a cabo en la etapa (c) del cuarto procedimiento descrito anteriormente, para obtener el conjugado. La aminación reductora se encuentra entre el grupo aldehído del polisacárido modificado adicionalmente y un grupo de amina primaria en la molécula portadora.
Acoplamiento a una molécula portadora
El acoplamiento del polisacárido oxidado a la molécula portadora a través del grupo aldehído en la etapa (b) del primer procedimiento descrito anteriormente es directo. El acoplamiento del polisacárido modificado a la molécula portadora a través del grupo de amina primaria en la etapa (b) del segundo procedimiento anterior también es directo. El acoplamiento del polisacárido modificado a la molécula portadora a través del grupo de amina primaria en la etapa (d) del tercer procedimiento descrito anteriormente también es directo. Para las tres etapas, se puede usar cualquier reacción de conjugación adecuada.
La unión del polisacárido al portador es típicamente a través de un grupo de amina primaria (-NH2), por ejemplo, en la cadena lateral de una lisina o residuo en una proteína portadora, o de un residuo arginina. La unión al portador también puede ser mediante un grupo sulfhidrilo (-SH), por ejemplo, en la cadena lateral de un residuo de cisteína. Para el primer procedimiento descrito anteriormente, los inventores han descubierto que el acoplamiento directo se puede lograr convenientemente haciendo reaccionar el grupo aldehído en el polisacárido oxidado con un grupo amina en el portador por aminación reductora. Por tanto, se prefiere el acoplamiento directo de esta naturaleza. Como se discutió anteriormente, la aminación reductora es una técnica estándar y se ha utilizado ampliamente en la producción de conjugados de polisacáridos capsulares para uso en vacunas. En un enfoque, un grupo aldehído en el polisacárido oxidado reacciona con un grupo amina en el portador. Esto se puede lograr de manera conveniente combinando el polisacárido con el portador en presencia de un agente reductor apropiado (por ejemplo, cianoborohidruros, tales como cianoborohidruro de sodio NaBHaCN; borano-piridina; triacetoxiborohidruro de sodio; resina de intercambio de borohidruro, etc.). El experto en la materia sería capaz de identificar las condiciones adecuadas para la aminación reductora. Por ejemplo, los inventores han descubierto que es adecuado el tratamiento del polisacárido oxidado con 10 mg/ml de CRM197 en una relación p/p de 4:1 y NaBHaCN en una relación p/p de 1:1 en un tampón NaPi 10 mM pH 7,2. Esta mezcla puede dejarse durante 72 horas con agitación lenta a 37 °C para efectuar la aminación reductora.
Son de interés los conjugados con una relación polisacárido:proteína (p/p) entre 1:20 (es decir, exceso de proteína) y 20:1 (es decir, exceso de polisacárido). Se prefieren relaciones de 1:10 a 1:1, particularmente relaciones entre 1:2 y 1:1 y, lo más preferiblemente, aproximadamente 1:1,5. Para los conjugados preparados mediante el primer procedimiento, una relación típica está entre 0,1 y 1,0, más particularmente entre 0,2 y 0,4, por ejemplo, alrededor de 0,35. Para los conjugados preparados mediante el segundo procedimiento, una relación típica está entre 0,1 y 1,0, más particularmente entre 0,1 y 0,3, por ejemplo, alrededor de 0,22. Para los conjugados preparados por el tercer procedimiento, una relación típica está entre 0,1 y 1,0, más particularmente entre 0,1 y 0,3, por ejemplo, alrededor de 0,21.
Las composiciones pueden incluir una pequeña cantidad de portador libre [72]. Cuando una proteína portadora dada está presente tanto en forma libre como conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada es preferiblemente no más del 5 % de la cantidad total de la proteína portadora en la composición como un todo, y más preferiblemente presente en menos del 2 % en peso.
Después de la conjugación, se pueden separar los polisacáridos libres y conjugados. Hay muchos procedimientos adecuados, que incluyen cromatografía hidrófoba, ultrafiltración tangencial, diafiltración, etc. [véanse también las referencias 73 y 74, etc.].
Combinaciones de conjugados y otros antígenos
Además de proporcionar conjugados individuales como se describió anteriormente, una composición inmunogénica puede comprender uno o más antígenos adicionales.
El o los antígenos adicionales pueden comprender conjugados adicionales. En estas realizaciones, es posible usar más de un portador para los diferentes conjugados en la composición, por ejemplo, para reducir el riesgo de supresión del portador. Típicamente, se usa el mismo portador para todos los conjugados. Sin embargo, los inventores han descubierto que el uso de un portador diferente para el conjugado del serogrupo X de N. meningitidis puede reducir la interferencia inmunitaria cuando el conjugado del serogrupo X de N. meningitidis se combina con otros conjugados. En consecuencia, en algunas realizaciones, el conjugado del serogrupo X de N. meningitidis usa un portador (particularmente toxoide de tétanos o la SEQ ID NO: 9 de la referencia 65 y la referencia 66), mientras que el conjugado adicional usa un portador diferente (particularmente CRM197).
Una única proteína portadora podría portar más de un antígeno de polisacárido [75, 76]. Para lograr este objetivo, se pueden mezclar diferentes polisacáridos antes del procedimiento de conjugación. Sin embargo, típicamente hay conjugados separados para cada polisacárido, mezclándose los diferentes polisacáridos después de la conjugación. Los conjugados separados se basan típicamente en el mismo portador, como se discutió anteriormente.
El o los antígenos adicionales pueden seleccionarse en particular del grupo que consiste en polisacárido capsular del serogrupo A, polisacárido capsular del serogrupo C, polisacárido capsular del serogrupo Y y polisacárido capsular del serogrupo W135. Típicamente, el antígeno o antígenos adicionales seleccionados de este grupo se conjugan cada uno por separado con una proteína portadora. Las proteínas portadoras preferidas son toxinas bacterianas, tales como toxinas de la difteria o del tétanos, o toxoides o mutantes de las mismas, particularmente toxoide de la difteria o toxoide del tétanos. Los inventores han descubierto que el mutante de la toxina de la difteria CRM197 es particularmente adecuado. También se puede usar la proteína D de H. influenzae. Típicamente, se usa la misma proteína portadora para todos los conjugados, incluido opcionalmente el conjugado del serogrupo X de N. meningitidis. Los inventores han descubierto que el mutante de toxina de la difteria CRM197 es particularmente adecuado, aunque también se pueden usar toxoide de la difteria y toxoide del tétanos. Como se indicó anteriormente, los inventores han descubierto que el uso de un portador diferente para el conjugado del serogrupo X de N. meningitidis puede reducir la interferencia inmune cuando el conjugado se combina con más conjugado o conjugados. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el conjugado del serogrupo X de N. meningitidis usa un portador (particularmente toxoide del tétanos o la SEQ ID NO: 9 de referencia 65 y referencia 66), mientras que el conjugado adicional usa un portador diferente (particularmente CRM197).
Las siguientes combinaciones se prevén específicamente para su uso en la invención:
1) un conjugado del serogrupo X de N. meningitidis y un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo A y una proteína portadora;
2) un conjugado del serogrupo X de N. meningitidis y un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo W135 y una proteína portadora;
3) un conjugado del serogrupo X de N. meningitidis, un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo A y una proteína portadora, y un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo W135 y una proteína portadora; y
4) un conjugado del serogrupo X de N. meningitidis, un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo A y una proteína portadora, un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo C y una proteína portadora, un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo W135 y una proteína portadora, y un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo Y y una proteína portadora.
Al incluir antígenos del serogrupo X y del serogrupo A y/o del serogrupo W135, las composiciones que comprenden las combinaciones 1)-3) pueden proporcionar protección contra los serogrupos que causan la mayoría de las enfermedades por N. meningitidis en África. Por tanto, estas combinaciones son particularmente preferidas. Aunque la adición de más antígenos, por ejemplo, los antígenos de los serogrupos C y Y incluidos en la combinación 4), pueden proporcionar protección adicional, el beneficio de esta protección adicional puede no compensar los costes adicionales involucrados. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la invención, la composición no contiene un antígeno del serogrupo C, particularmente un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo C y una proteína portadora. De manera similar, en la misma u otras realizaciones de la invención, la composición no contiene un antígeno del serogrupo Y, particularmente un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo Y y una proteína portadora.
El o los antígenos adicionales pueden comprender antígenos bacterianos, virales o parasitarios adicionales. Estos pueden seleccionarse entre los siguientes:
- un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, referencias 77-79; capítulos 22 y 23 de la referencia 86].
- un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como un virus inactivado [por ejemplo, 80, 81; capítulo 15 de la referencia 86].
- un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o del núcleo [por ejemplo, 81, 82;
capítulo 16 de la referencia 86].
- un antígeno del virus de la hepatitis C [por ejemplo, 83].
- un antígeno de Bordetella pertussis, tal como holotoxina de tos ferina (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, referencias 84 y 85; capítulo 21 de la referencia 86].
- un antígeno de difteria, tal como un toxoide de difteria [por ejemplo, capítulo 13 de la referencia 86].
- un antígeno del tétanos, tal como un toxoide del tétanos [por ejemplo, capítulo 27 de la referencia 86].
- un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, capítulo 14 de la referencia 86].
- un antígeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93].
- un antígeno de Chlamydia trachomatis [por ejemplo, 94].
- un antígeno de Porphyromonas gingivalis [por ejemplo, 95].
- antígeno o antígenos de polio [por ejemplo, 96, 97; capítulo 24 de la referencia 86] tal como IPV.
- antígeno o antígenos de la rabia [por ejemplo, 98] tal como virus inactivado liofilizado [por ejemplo, 99, RabAvertMR].
- antígenos de sarampión, paperas y/o rubéola [por ejemplo, capítulos 19, 20 y 26 de la referencia 86].
- antígeno o antígenos de gripe [por ejemplo, capítulos 17 y 18 de la referencia 86], tal como las proteínas de superficie hemaglutinina y/o neuraminidasa.
- un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 100].
- un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A) [por ejemplo, 101, 102, 103].
- un antígeno de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B) [por ejemplo, 64, 104-106].
- un antígeno de S. epidermidis [por ejemplo, polisacárido capsular de tipo I, II y/o III obtenible a partir de las cepas ATCC-31432, SE-360 y SE-10 como se describe en las referencias 107, 108 y 109.
Cuando se usa un sacárido o un antígeno de carbohidrato, típicamente se conjuga con un portador para mejorar la inmunogenicidad. La conjugación de H. influenzae B, antígenos sacáridos meningocócicos y neumocócicos es bien conocida.
Los antígenos de proteínas tóxicas pueden destoxificarse cuando sea necesario (por ejemplo, destoxificación de la toxina de la tos ferina por medios químicos y/o genéticos [85]).
Cuando se incluye un antígeno de difteria en la composición, es típico también incluir antígeno del tétanos y antígenos de tos ferina. De manera similar, cuando se incluye un antígeno del tétanos, es típico incluir también los antígenos de difteria y tos ferina. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de tos ferina, es típico incluir también antígenos de difteria y tétanos.
Los antígenos se pueden adsorber en una sal de aluminio.
Los antígenos en la composición estarán típicamente presentes a una concentración de al menos 1 pg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para provocar una respuesta inmune contra ese antígeno.
Como alternativa al uso de antígenos de proteínas en la composición de la invención, se puede usar el ácido nucleico que codifica el antígeno [por ejemplo, referencias 110 a 118]. Por tanto, los componentes proteicos de las composiciones de la invención pueden reemplazarse por ácido nucleico (típicamente ADN, por ejemplo, en forma de plásmido) que codifica la proteína.
En términos prácticos, puede haber un límite superior para el número de antígenos incluidos en las composiciones de la invención. El número de antígenos en una composición de la invención puede ser menor de 20, menor de 19, menor de 18, menor de 17, menor de 16, menor de 15, menor de 14, menor de 13, menor de 12, menor de 11, menor de 10, menor de 9, menor de 8, menor de 7, menor de 6, menor de 5, menor de 4 o menor de 3.
Composiciones y procedimientos farmacéuticos
La composición farmacéutica comprende (a) un conjugado del serogrupo X de N. meningitidis, y (b) un portador farmacéuticamente aceptable. Los 'portadores farmacéuticamente aceptables' típicos incluyen cualquier portador que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son típicamente macromoléculas grandes, de metabolización lenta, tal como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarosa [119], trehalosa [120], lactosa y agregados lipídicos (tal como gotitas de aceite o liposomas). Dichos portadores son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las vacunas también pueden contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etc. Además, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares. La solución salina fisiológica estéril libre de pirógenos y tamponada con fosfato es un portador típico. En la referencia 121 se encuentra disponible una discusión detallada de los excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones de la invención pueden estar en una formulación acuosa (es decir, soluciones o suspensiones) o en forma seca (por ejemplo, liofilizada). Se prefieren las formulaciones acuosas porque los inventores han descubierto que el polisacárido capsular del serogrupo X es sorprendentemente estable en un entorno acuoso. Si se usa una vacuna seca, se reconstituirá en una formulación acuosa antes de la inyección. La liofilización de vacunas conjugadas es conocida en la técnica, por ejemplo, el producto MenjugateMR se presenta en forma liofilizada, mientras que NeisVac-CMR y MeningitecMR se presentan en forma acuosa. Para estabilizar conjugados durante la liofilización, puede ser típico incluir un alcohol de azúcar (por ejemplo, manitol) o un disacárido (por ejemplo, sacarosa o trehalosa), por ejemplo, entre 1 mg/ml y 30 mg/ml (por ejemplo, aproximadamente 25 mg/ml) en la composición. Después de la reconstitución, estos estabilizadores pueden estar presentes en la formulación acuosa. Las composiciones pueden presentarse en viales o pueden presentarse en jeringas ya llenas. Las jeringas se pueden suministrar con o sin agujas. Una jeringa incluirá una dosis única de la composición, mientras que un vial puede incluir una dosis única o múltiples dosis.
Las formulaciones acuosas de la invención también son adecuadas para reconstituir otras vacunas a partir de una forma liofilizada. Cuando se va a utilizar una composición de la invención para dicha reconstitución extemporánea, la invención proporciona un kit, que puede comprender dos viales, o puede comprender una jeringa ya llena y un vial, y el contenido de la jeringa se utiliza para reactivar el contenido del vial antes de la inyección.
Las composiciones de la invención pueden envasarse en forma de dosis unitaria o en forma de dosis múltiples. Para formas de dosis múltiples, se prefieren los viales a las jeringas precargadas. Se pueden establecer de forma rutinaria volúmenes de dosificación eficaces, pero una dosis humana típica de la composición tiene un volumen de 0,5 ml, por ejemplo, para inyección intramuscular.
El pH de la composición está típicamente entre 6 y 8, por ejemplo, aproximadamente 7. Se puede mantener un pH estable mediante el uso de un tampón. Tampones típicos, por ejemplo, para uso en las formulaciones acuosas de la invención, son sales de fosfato. Por ejemplo, es típica una mezcla de fosfato de sodio dibásico anhidro y fosfato de sodio monobásico. Una concentración adecuada es fosfato de sodio dibásico anhidro 10 mM y fosfato de sodio monobásico 10 mM. Si una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, es habitual utilizar un tampón de histidina [122]. La composición puede ser estéril y/o exenta de pirógenos. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los seres humanos.
Las composiciones de la invención son inmunogénicas y, más preferiblemente, son composiciones de vacuna. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir una infección) o terapéuticas (es decir, para tratar una infección), pero típicamente serán profilácticas. Las composiciones inmunogénicas utilizadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno o antígenos, así como cualquier otro componente, según sea necesario. Por 'cantidad inmunológicamente eficaz' se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía según la salud y la condición física del individuo a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primates no humanos, primates, etc.), la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico tratante de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar mediante ensayos de rutina.
Dentro de cada dosis, la cantidad de un antígeno de sacárido individual estará generalmente entre 1 y 50 |jg (medida como masa de sacárido), por ejemplo, aproximadamente 1 jg, aproximadamente 2,5 jg, aproximadamente 4 jg, aproximadamente 5 jg o aproximadamente 10 jg.
N. meningitidis afecta a diversas zonas del cuerpo y, por tanto, las composiciones de la invención se pueden preparar de diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones acuosas. La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, como inhalador, usando un polvo fino o un aerosol. La composición se puede preparar como supositorio o pesario. La composición se puede preparar para administración nasal, auditiva u ocular, por ejemplo, como atomizador, gotas, gel o polvo [por ejemplo, referencias 123 y 124]. Se ha informado sobre el éxito de la administración nasal de sacáridos neumocócicos [125, 126], sacáridos de Hib [127], sacáridos de MenC [128] y mezclas de conjugados de sacáridos de Hib y MenC [129].
Las composiciones de la invención pueden incluir un antimicrobiano, particularmente cuando se envasan en formato de dosis múltiples.
Las composiciones de la invención pueden comprender detergente, por ejemplo, un Tween (polisorbato), tal como Tween 80. Los detergentes generalmente están presentes en niveles bajos, por ejemplo < 0,01 %.
Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para producir tonicidad. Una concentración de 2-20 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 10 2 mg/ml o aproximadamente 5 ± 1 mg/ml (particularmente aproximadamente 4,25 mg) de NaCl es típica.
Las composiciones de la invención generalmente incluirán un tampón. Es típico un tampón de fosfato.
Las composiciones de la invención generalmente se administrarán junto con otros agentes inmunorreguladores. En particular, las composiciones típicamente incluirán uno o más adyuvantes. Dichos adyuvantes incluyen, pero no se limitan a:
A. Composiciones que contienen minerales
Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. [por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de la referencia 130], o mezclas de diferentes compuestos minerales (por ejemplo, una mezcla de un adyuvante de fosfato e hidróxido, opcionalmente con un exceso de fosfato), tomando los compuestos cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), y siendo típica la adsorción para la sal o las sales. Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular como una partícula de sal metálica [131].
Pueden incluirse sales de aluminio en las vacunas de la invención de manera que la dosis de Al3+ esté entre 0,2 y 1,0 mg por dosis.
Un adyuvante típico de fosfato de aluminio es hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de PO^Al entre 0,84 y 0,92, incluida de 0,6 mg de Al3+/ml. Puede usarse la adsorción con una dosis baja de fosfato de aluminio, por ejemplo, entre 50 y 100 |jg de Al3+ por conjugado por dosis. Cuando se utiliza fosfato de aluminio y no se desea adsorber un antígeno en el adyuvante, esto se favorece al incluir iones fosfato libres en solución (por ejemplo, mediante el uso de un tampón de fosfato).
B. Emulsiones de aceite
Las composiciones de emulsión de aceite adecuadas para usar como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 ( % de escualeno, 0,5 % de Tween 80 y 0,5 % de Span 85, formuladas en partículas de tamaño inferior a los micrómetros usando un microfluidizador) [Capítulo 10 de la referencia 130; véase también las referencias 132-134]. MF59 se usa como adyuvante en la vacuna con la subunidad trivalente del virus de la gripe FLUADMR.
Los adyuvantes particularmente útiles para su uso en las composiciones son las emulsiones de tamaño inferior a los micrómetros de aceite en agua. Las emulsiones de tamaño inferior a los micrómetros de aceite en agua preferidas para su uso en el presente documento son emulsiones de escualeno/agua que contienen opcionalmente cantidades variables de MTP-PE, tal como una emulsión de tamaño inferior a los micrómetros de aceite en agua que contiene 4 - 5 % p/v de escualeno, 0,25-1,0 % p/v de Tween 80 (monooleato de polioxietilensorbitán) y/o 0,25-1,0 % de Span 85 (trioleato de sorbitán) y, opcionalmente, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isogluatminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-snglicero-3-hidroxifosfoforiloxi)-etilamina (MTP-PE). Las emulsiones de tamaño inferior a los micrómetros de aceite en agua, los procedimientos para preparar las mismas y los agentes inmunoestimulantes, tales como péptidos de muramilo, para su uso en las composiciones, se describen en detalle en las referencias 132 y 135-136.
El adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA) también se pueden usar como adyuvantes en la invención.
C. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de la referencia 130]
Las formulaciones de saponina también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterólogo de glucósidos de esterol y glucósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso flores de una amplia gama de especies vegetales. Las saponinas aisladas de la corteza del árbol de Molina Quillaja saponaria han sido ampliamente estudiadas como adyuvantes. La saponina también se puede obtener comercialmente a través de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officianalis (raíz de jabón). Las formulaciones de adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones de lípidos, como ISCOM.
Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado fracciones purificadas específicas que utilizan estas técnicas, incluidas QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferiblemente, la saponina es QS21. Un procedimiento de producción de QS21 se describe en la referencia 137. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como el colesterol [138].
Pueden usarse combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM) [capítulo 23 de la referencia 130]. Los ISCOM típicamente también incluyen un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. En los ISCOM se puede utilizar cualquier saponina conocida. Preferiblemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen con más detalle en las referencias 138-140. Opcionalmente, los ISCOM pueden carecer de detergente o detergentes adicionales [141].
Se puede encontrar una revisión del desarrollo de adyuvantes basados en saponina en las referencias 142 y 143.
D. Virosomas y partículas similares a virus
Los virosomas y las partículas similares a virus (VLP) también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Estas estructuras contienen generalmente una o más proteínas de un virus opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolípido. Generalmente no son patógenos, no se replican y generalmente no contienen nada del genoma viral nativo. Las proteínas víricas pueden producirse de forma recombinante o aislarse de virus completos. Estas proteínas virales adecuadas para su uso en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas del virus de la gripe (tales como HA o NA), virus de la hepatitis B (tales como proteínas del núcleo o de la cápside), virus de la hepatitis E, virus del sarampión, virus Sindbis, rotavirus, virus de la fiebre aftosa, retrovirus, virus de Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fagos Qp (como las proteínas de la cubierta), fagos GA, fagos fr, fagos AP205 y Ty (como la proteína Ty de retrotransposón p1). Las VLP se analizan con más detalle en las referencias 144-149. Los virosomas se analizan con más detalle, por ejemplo, en la referencia 150.
E. Derivados bacterianos o microbianos
Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), derivados del lípido A, oligonucleótidos inmunoestimuladores y toxinas ribosilantes de ADP y derivados detoxificados de los mismos.
Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-desacilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma de "partícula pequeña" preferida del monofosforil lípido A 3-des-O-acilado se describe en la referencia 151. Estas "partículas pequeñas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas como para esterilizarlas por filtración a través de una membrana de 0,22 pm [151]. Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen imitadores de monofosforil lípido A, tales como derivados de fosfato de aminoalquil glucosaminida, por ejemplo, RC-529 [152, 153].
Los derivados del lípido A incluyen derivados del lípido A de Escherichia coli tales como OM-174. OM-174 se describe, por ejemplo, en las referencias 154 y 155.
Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene una citosina no metilada unida por un enlace fosfato a una guanosina). También se ha demostrado que los ARN bicatenarios y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) son inmunoestimulantes.
Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Las referencias 156, 157 y 158 describen posibles sustituciones analógicas, por ejemplo, reemplazo de guanosina por 2'-desoxi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se analiza con más detalle en las referencias 159-164.
La secuencia CpG puede dirigirse a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [165]. La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune Th1, como un ODN CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tal como un ODN CpG-B. Los ODN de CpG-A y CpG-B se describen en las referencias 166-168. Preferiblemente, el CpG es un ODN CpG-A.
Preferiblemente, el oligonucleótido CpG se construye de modo que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, se pueden unir dos secuencias de oligonucleótidos CpG en sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Véase, por ejemplo, las referencias 165 y 169-171.
Las toxinas bacterianas de ribosilación de ADP y sus derivados detoxificados pueden usarse como adyuvantes en la invención. Preferiblemente, la proteína se deriva de E. coli (enterotoxina termolábil "LT" de E. coli), cólera ("CT") o tos ferina ("PT"). El uso de toxinas ribosilantes de ADP detoxificadas como adyuvantes de la mucosa se describe en la referencia 172 y como adyuvantes parenterales en la referencia 173. La toxina o toxoide está preferiblemente en forma de holotoxina, que comprende las subunidades A y B. Preferiblemente, la subunidad A contiene una mutación detoxificante; preferiblemente, la subunidad B no está mutada. Preferiblemente, el adyuvante es un mutante LT detoxificado tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de toxinas ribosilantes de ADP y sus derivados detoxificados, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes se puede encontrar en las referencias 174-181. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferiblemente en las alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas ribosilantes de ADP expuestas en la referencia 182, específicamente incorporada aquí como referencia en su totalidad.
F. Inmunomoduladores humanos
Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [183] ], etc.) [184], interferones (por ejemplo, interferón y), factor estimulante de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral.
G. Bioadhesivos y mucoadhesivos
También se pueden usar bioadhesivos y mucoadhesivos como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificadas [185] o mucoadhesivos tales como derivados entrecruzados de poli(ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. El quitosano y sus derivados también pueden usarse como adyuvantes en la invención [186].
H. Micropartículas
También se pueden usar micropartículas como adyuvantes en la invención. Se prefieren micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a — 150 pm de diámetro, más preferiblemente de ~200 nm a ~30 pm de diámetro, y más preferiblemente de —500 nm a — 10 pm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(a-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(láctido-co-glicólido), opcionalmente tratados para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).
I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de la referencia130)
Los ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes se describen en las referencias 187-189.
J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno
Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [190]. Dichas formulaciones incluyen además tensioactivos de éster de polioxietilensorbitán en combinación con un octoxinol [191] así como tensioactivos de éteres o éter de polioxietilén alquilo en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol [192]. Éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: éter de polioxietilen-9-laurilo (laureth 9), éter de polioxietilen-9-esteorilo, éter de polioxietilen-8-esteorilo, éter de polioxietilen-4-laurilo, éter de polioxietilen-35-laurilo y éter de polioxietilen-23-laurilo.
K. Polifosfaceno (PCPP)
Las formulaciones de PCPP se describen, por ejemplo, en las referencias 193 y 194.
L. Péptidos de muramilo
Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) y N-acetilmuramil -L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).
M. Compuestos de imidazoquinolona
Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo, "Resiquimod 3M"), descritos además en las referencias 195 y 196.
N. Compuestos de tiosemicarbazona
Los ejemplos de compuestos de tiosemicarbazona, así como los procedimientos de formulación, fabricación y selección de compuestos, todos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención, incluyen los descritos en la referencia 197. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tales como TNF-a.
O. Compuestos de triptantrina
Los ejemplos de compuestos de triptantrina, así como los procedimientos de formulación, fabricación y selección de compuestos, todos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención, incluyen los descritos en la referencia 198. Los compuestos de triptantrina son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la producción de citocinas, tales como TNF-a.
Las composiciones inmunogénicas también pueden comprender combinaciones de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, se pueden usar las siguientes combinaciones como composiciones adyuvantes en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [199]; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) [200]; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) 3dMPL IL-12 (opcionalmente un esterol) [201]; (5) combinaciones de 3dMPL, por ejemplo, con QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [202]; (6) SAF, que contiene 10 % de escualano, 0,4 % de Tween 80MR, 5 % de polímero de bloque L121 plurónico y thr-MDP, microfluidizado en una emulsión de tamaño inferior a los micrómetros o con agitación tipo vórtice para generar una emulsión de tamaño de partícula mayor. (7) Sistema adyuvante RibiMR (RAS), (Ribi Immuno Chem) que contiene 2 % de escualeno, 0,2 % de Tween 80 y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil Lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de pared celular (CWS), preferiblemente MPL CWS (DetoxMR); y (8) una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL).
Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se describen en el capítulo 7 de la referencia 130. El uso de adyuvantes de sal de aluminio es particularmente útil, y los antígenos generalmente se adsorben en tales sales. Los conjugados MenjugateMR y NeisVacMR usan un adyuvante de hidróxido, mientras que MeningitecMR usa un adyuvante de fosfato. En las composiciones de la invención, es posible adsorber algunos antígenos en un hidróxido de aluminio pero tener otros antígenos en asociación con un fosfato de aluminio. Típicamente, sin embargo, solo se usa una sal, por ejemplo, un hidróxido o un fosfato, pero no ambos. No todos los conjugados necesitan ser adsorbidos, es decir, algunos o todos pueden estar libres en solución.
Métodos de tratamiento
La invención divulga un procedimiento para generar una respuesta inmune en un mamífero, que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención al mamífero. La respuesta inmune es preferiblemente protectora y preferiblemente involucra anticuerpos. El procedimiento puede generar una respuesta de refuerzo. El mamífero es preferiblemente un ser humano. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferiblemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un bebé) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferiblemente un adulto. También se puede administrar una vacuna destinada a niños a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc.
La invención también proporciona una composición inmunogénica de la invención para su uso como medicamento. El medicamento es preferiblemente capaz de generar una respuesta inmune en un mamífero (es decir, es una composición inmunogénica) y es más preferiblemente una vacuna.
Las composiciones preferidas de la invención pueden conferir un título de anticuerpos en un paciente que sea superior al criterio de seroprotección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Los antígenos con un título de anticuerpos asociado por encima del cual se considera que un huésped está seroconvertido contra el antígeno son bien conocidos, y tales títulos son publicados por organizaciones como la OMS. Preferiblemente, más del 80 % de una muestra estadísticamente significativa de sujetos está seroconvertida, más preferiblemente más del 90 %, aún más preferiblemente más del 93 % y lo más preferiblemente del 96-100 %. Las composiciones de la invención generalmente se administrarán directamente a un paciente. La administración directa se puede lograr mediante inyección parenteral (por ejemplo, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o al espacio intersticial de un tejido), o por vía rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, auditiva, pulmonar u otra administración a mucosa. Se prefiere la administración intramuscular en el muslo o en la parte superior del brazo. La inyección puede ser a través de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero alternativamente se puede usar una inyección sin aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0,5 ml.
La invención puede usarse para provocar inmunidad sistémica y/o mucosa.
El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Se pueden usar múltiples dosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. Una pauta de dosis primaria puede ir seguida de una pauta de dosis de refuerzo. El momento adecuado entre las dosis de sensibilización (por ejemplo, entre 4-16 semanas) y entre la sensibilización y el refuerzo, se puede determinar de forma rutinaria.
Proteínas portadoras ejemplares
Como se discutió anteriormente, los inventores han encontrado que las proteínas portadoras descritas en la referencia 65 y la referencia 66 son particularmente adecuadas para su uso como molécula portadora en la invención, especialmente la proteína de la SEQ ID NO: 9 en esos documentos (que también es la SEQ ID NO: 9 en este documento).
Estas moléculas portadoras comprenden un antígeno spr0096 y un antígeno spr2021. Típicamente, la molécula portadora comprende el antígeno spr0096 y el antígeno spr2021 como una única cadena polipeptídica (un polipéptido "híbrido"). El antígeno spr0096, el antígeno spr2021 y la naturaleza del polipéptido híbrido se describen con más detalle a continuación.
Antígeno spr0096
La secuencia polipeptídica original de 'spr0096' se anotó en la referencia 203 como 'proteína hipotética' (véase GI: 15902140). Con fines de referencia, la secuencia de aminoácidos de spr0096 de longitud completa que se encuentra en la cepa R6 se proporciona como la SEQ ID NO: 1 en este documento.
El antígeno spr0096 de la invención comprende al menos un epítopo de células T CD4+. Las células T CD4+ ayudan a los linfocitos B a producir anticuerpos contra los antígenos [204]. Los epítopos de células T pueden identificarse empíricamente (por ejemplo, utilizando PEPSCAN [205, 206] o procedimientos similares), o pueden predecirse (por ejemplo, utilizando el índice antigénico de Jameson-Wolf [207], enfoques basados en matrices [208], TEPITOPE [209], redes neuronales [210], OptiMer & EpiMer [211, 212], ADEPT [213], Tsites [214], hidrofilicidad [215], índice antigénico [216] o los procedimientos descritos en la referencia 217, etc.).
Los antígenos spr0096 preferidos para usar con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 1; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estos polipéptidos de spr0096 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2; ver más abajo). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden al menos un epítopo de células T CD4+ de la SEQ ID NO: 1. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo terminal C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo terminal N de la SEQ ID NO: 1 mientras se retiene al menos un epítopo de células T CD4+ de la SEQ ID NO: 1. Otros fragmentos omiten uno o más dominios proteicos. Un fragmento adecuado es la SEQ ID NO: 14, que omite la secuencia del péptido líder natural. El antígeno spr0096 puede consistir en un solo epítopo de células T CD4+ de la SEQ ID NO: 1.
Una forma variante de spr0096, con un inserto cerca de su extremo terminal C en relación con la SEQ ID NO: 1, es la SEQ ID NO: 2 en este documento. El uso de esta variante para la inmunización se informa en la referencia 218 (SEQ ID NO: 150 en la misma), en el que se anota como una proteína de dominio LysM. Por tanto, un antígeno spr0096 para usar con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 2; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 2, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estos polipéptidos incluyen variantes de la SEQ ID NO: 2. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden al menos un epítopo de células T CD4+ de la SEQ ID NO: 2. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo terminal C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo terminal N de la SEQ ID NO: 2 mientras se retiene al menos un epítopo de células T CD4+ de la SEQ ID NO: 2. Otros fragmentos omiten uno o más dominios proteicos. Un fragmento adecuado es la SEQ ID NO: 15, que omite la secuencia del péptido líder natural. Los fragmentos inmunogénicos de la SEQ ID NO: 2 se identifican en la tabla 1 de la referencia 218. El antígeno spr0096 puede consistir en un solo epítopo de células T CD4+ de la SEQ ID NO: 2. Se puede utilizar un antígeno spr0096 en forma de un dímero, por ejemplo, un homodímero.
Antígeno spr2021
La secuencia polipeptídica original de 'spr2021' se anotó en la referencia 203 como 'Proteína de estrés general GSP-781' (véase GI: 15904062). Con fines de referencia, la secuencia de aminoácidos de spr2021 de longitud completa que se encuentra en la cepa R6 se proporciona como la SEQ ID NO: 3 en este documento.
El antígeno spr2021 de la invención comprende al menos un epítopo de células T CD4+.
Los antígenos spr2021 preferidos para usar con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 3; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 3, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estos polipéptidos de spr2021 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 3. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden al menos un epítopo de células T CD4+ de la SEQ ID NO: 3. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo terminal C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo terminal N de la s Eq ID NO: 3 mientras se retiene al menos un epítopo de células T CD4+ de la SEQ ID NO: 3. Otros fragmentos omiten uno o más dominios proteicos. Un fragmento adecuado es la SEQ ID NO: 4, que omite la secuencia del péptido líder natural. El antígeno spr0096 puede consistir en un solo epítopo de linfocitos T CD4+ de la SEQ ID NO: 3.
La referencia 218 anota spr2021 como una proteína de 45 kDa secretada con homología con GbpB y describe su uso como inmunógeno (SEQ ID NO: 243 en el mismo; SP2216). Los fragmentos inmunogénicos de spr2021 se identifican en la tabla 1 de la referencia 218 (página 73). Otro fragmento útil de spr2021 se describe como la SEQ ID NO: 1 de la referencia 219 (aminoácidos 28-278 de la SEQ ID NO: 3 en este documento).
Polipéptido híbrido
Típicamente, el antígeno spr0096 y el antígeno spr2021 se expresan como una única cadena polipeptídica (un polipéptido "híbrido"). Los polipéptidos híbridos se pueden representar mediante la fórmula NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH, en la que: A es una secuencia de aminoácidos del extremo terminal N; B es una secuencia de aminoácidos del extremo terminal C; n es un número entero de 2 o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, etc.); cada X es una secuencia de aminoácidos de un antígeno spr0096 o un antígeno spr2021 (como se describió anteriormente), en la que al menos una X es un antígeno spr0096 y al menos una X es un antígeno spr2021; y L es una secuencia de aminoácidos enlazadora opcional. Típicamente n es 2. Cuando n es 2, X1 suele ser un antígeno spr0096 y X2 suele ser un antígeno spr2021. Cuando n es más de 2, cada antígeno spr0096 (cuando hay más de uno presente) puede ser el mismo o diferente y cada antígeno spr2021 (cuando está presente más de uno) puede ser el mismo o diferente. El antígeno spr0096 o el antígeno spr2021 que es la secuencia de aminoácidos de cada X es como se definió anteriormente. Cuando estos antígenos se definen en términos de (a) tener 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con una secuencia dada; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de una secuencia dada, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más), el nivel de identidad en (a) y el valor de 'n' en (b) pueden ser el mismo para cada X. La secuencia del péptido líder en la forma de tipo silvestre de cada fracción -X- puede incluirse u omitirse en la proteína híbrida. En algunas realizaciones, los péptidos líderes se eliminarán excepto el de la fracción -X- ubicada en el extremo terminal N de la proteína híbrida, es decir, se retendrá el péptido líder de X1, pero los péptidos líderes de X2... Xn se omitirán. Esto es equivalente a eliminar todos los péptidos líderes y usar el péptido líder de X1 como la fracción -A-.
Para cada n ejemplos de {-X-L-}, la secuencia de aminoácidos del enlazador -L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n = 2, el híbrido puede ser NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH, etc. La secuencia o secuencias de aminoácidos del enlazador -L- serán típicamente cortas (por ejemplo, 20 o menos aminoácidos, es decir, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos comprenden secuencias de péptidos cortas que facilitan la clonación, enlazadores de poliglicina (es decir, que comprenden Glyn en la que n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) y etiquetas de histidina (es decir, Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos enlazadoras adecuadas resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Un enlazador útil es GSGGGG (SEQ ID NO: 5) o GSGSGGGG (SEQ ID NO: 6), formándose el dipéptido Gly-Ser a partir de un sitio de restricción de BamHI, lo que ayuda a la clonación y manipulación, y el tetrapéptido (Gly)4 es un enlazador de poliglicina típico. Otros enlazadores adecuados, particularmente para su uso como Ln final, son un dipéptido Leu-Glu o la SEQ ID NO: 7.
-A- es una secuencia de aminoácidos opcional del extremo terminal N. Esta típicamente será corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, es decir, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias líder para dirigir el tráfico de proteínas o secuencias de péptidos cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, etiquetas de histidina, es decir, Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos adecuadas del extremo terminal N resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Si X1 carece de su propia metionina del extremo terminal N, -A- es preferiblemente un oligopéptido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos) que proporciona una metionina del extremo terminal N, por ejemplo, Met-Ala-Ser, o un solo residuo de Met.
-B- es una secuencia de aminoácidos opcional del extremo terminal C. Esta típicamente será corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias de péptidos cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, que comprenden etiquetas de histidina, es decir, Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, tal como la s Eq ID NO: 8), o secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas. Otras secuencias de aminoácidos adecuadas del extremo terminal C serán evidentes para los expertos en la técnica.
Los ejemplos de híbridos incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de spr0096-spr2021 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 9) o spr2021-spr0096 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 10). El híbrido también puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 9 o 10. Típicamente, el híbrido comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9. El híbrido también puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 9.
En realizaciones particulares, la molécula portadora comprende (a) uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, etc.) epítopos de células T CD4+ de la SEQ ID NO: 2; y (b) uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, etc.) epítopos de células T CD4+ de la SEQ ID NO: 3.
Método para analizar una muestra
Se divulga un procedimiento para analizar una muestra que se sospecha que contiene polisacárido capsular del serogrupo X, que comprende las etapas de: (i) hidrolizar cualquier polisacárido capsular del serogrupo X en la muestra, para obtener un hidrolizado; (ii) someter el hidrolizado a cromatografía líquida; y (iii) detectar cualquier glucosamina-4-fosfato separada en la etapa (ii).
El procedimiento se puede usar para cuantificar el polisacárido capsular del serogrupo X en la muestra. De esta forma, es posible determinar la concentración del polisacárido en la muestra. Típicamente, la cuantificación implica la comparación con un estándar de N-acetilglucosamina-4-fosfato. Sin embargo, se pueden usar otros estándares, que incluyen glucosamina-6-fosfato.
Aunque el procedimiento ha sido desarrollado para polisacárido capsular del serogrupo X, es adecuado para cualquier sustancia con glucosamina-4-fosfato en su estructura, por ejemplo, lípido bacteriano A. En consecuencia, también se describe un procedimiento para analizar una muestra que se sospecha que contiene una sustancia con glucosamina-4-fosfato en su estructura, que comprende las etapas de: (i) hidrolizar cualquier sustancia con glucosamina-4-fosfato en su estructura en la muestra, para obtener un hidrolizado; (ii) someter el hidrolizado a cromatografía líquida; y (iii) detectar cualquier glucosamina-4-fosfato separada en la etapa (ii).
Muestra
La muestra es típicamente una vacuna, por ejemplo, cuando el procedimiento se utiliza para la cuantificación de polisacáridos en la caracterización de un producto de vacuna. Sin embargo, el procedimiento también se puede utilizar como un ensayo en proceso durante la fabricación de la vacuna. En estas realizaciones, la muestra será un procedimiento intermedio del procedimiento de fabricación. El procedimiento es capaz de cuantificar concentraciones muy bajas de polisacárido capsular del serogrupo X (> 0,5 pg/ml) y, por lo tanto, es adecuado para analizar el polisacárido capsular del serogrupo X en muestras pequeñas, por ejemplo, tomado en proceso durante un procedimiento de fabricación. El procedimiento también es específico para el polisacárido capsular del serogrupo X, incluso cuando hay impurezas. Por tanto, la muestra puede ser un caldo de fermentación o un sobrenadante extraído de un caldo de fermentación.
La muestra puede contener polisacárido capsular del serogrupo X libre (no conjugado) y/o polisacárido capsular del serogrupo X conjugado. Por tanto, el procedimiento puede usarse para analizar polisacárido preparado a partir de una bacteria, polisacárido después de la purificación, polisacárido antes de la conjugación y/o polisacárido después de la conjugación.
En una muestra que contiene polisacárido capsular del serogrupo X conjugado, se puede usar una comparación de los niveles de polisacárido libre con el polisacárido total en una muestra (es decir, la relación de polisacárido no conjugado : polisacárido (no conjugado conjugado)) para determinar la estabilidad. No son deseables niveles elevados de polisacárido no conjugado. Una serie temporal de tales ensayos puede revelar si un conjugado es estable, por ejemplo, durante el almacenamiento. El nivel de polisacárido libre también se puede utilizar para comprobar si una reacción de conjugación se ha completado.
La muestra será típicamente acuosa, pero puede haber sido reconstituida en forma acuosa a partir de una forma seca, por ejemplo, de un liofilizado. Por tanto, la muestra puede contener estabilizadores de liofilización. Estos estabilizadores incluyen sustancias tales como alcoholes de azúcar (por ejemplo, manitol, etc.), disacáridos (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, etc.) y otros sacáridos simples. Una ventaja de los procedimientos es que pueden analizar el polisacárido capsular del serogrupo X frente a un fondo de impurezas, sin requerir ninguna separación previa del polisacárido y las impurezas.
La muestra puede diluirse antes del análisis. Después del análisis, el nivel de polisacárido en la muestra se puede relacionar con el nivel en el material original sin diluir. La dilución es útil, por ejemplo, para asegurar que el análisis de una muestra dé un resultado dentro de la porción deseada de una curva de calibración.
Además del polisacárido capsular del serogrupo X, la muestra puede contener otros sacáridos capsulares bacterianos, por ejemplo, de Haemophilus influenzae tipo B, de otros serogrupos meningocócicos (por ejemplo, A, C, W135 y/o Y), de Streptococcus pneumoniae, etc.
Las muestras también pueden incluir otros componentes, tales como componentes que no son antígenos que se encuentran a menudo en las vacunas. Por ejemplo, estos pueden incluir portadores, adyuvantes, excipientes, tampones, etc., como se describió anteriormente.
En algunas situaciones, es útil añadir a la muestra una cantidad conocida del analito en cuestión, por ejemplo, para añadir una cantidad conocida de polisacárido capsular del serogrupo X, ya sea en forma conjugada o no conjugada. Los estudios de enriquecimiento pueden ser útiles para la calibración y para estudiar la sensibilidad, variabilidad, recuperación, etc.
Hidrólisis
El procedimiento implica la hidrólisis del polisacárido capsular del serogrupo X. Los procedimientos de hidrólisis típicos implican hidrólisis ácida, por ejemplo, utilizando ácido trifluoroacético (TFA). Los inventores han descubierto que las condiciones particularmente eficaces son el tratamiento con TFA 2 M durante entre 2 y 3 (por ejemplo, 2,5) horas a 100 °C. Estas condiciones permiten una buena liberación de las subunidades monoméricas del polisacárido, sin su degradación. Sin embargo, tratamientos más cortos o más largos, por ejemplo, también son posibles entre 1 y 6 horas.
El polisacárido capsular total del serogrupo X se puede preparar a partir de una muestra que incluye el polisacárido conjugado sometiendo toda la muestra a hidrólisis, como se describió anteriormente. Sin embargo, si se desea medir únicamente el polisacárido capsular del serogrupo X conjugado o no conjugado, entonces el polisacárido conjugado y no conjugado debe separarse antes de la hidrólisis. Las técnicas de separación adecuadas incluyen precipitación selectiva, procedimientos basados en el tamaño, extracción en fase sólida [220], etc.
Cromatografía líquida
Los resultados de la hidrólisis del polisacárido capsular del serogrupo X se analizan mediante cromatografía líquida. Por tanto, los procedimientos utilizarán típicamente una columna de cromatografía líquida e implicarán analizar la salida de dicha columna.
Se pueden usar varias columnas de cromatografía líquida, pero el procedimiento se usará típicamente con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El procedimiento es particularmente útil para analizar los resultados de la separación mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento (HPAEC) o mediante cromatografía de intercambio catiónico de alto rendimiento (HPCEC). HPAEC es una técnica común utilizada para la caracterización de sacáridos, a menudo en combinación con la detección amperométrica pulsada (PAD) [221, 222] para detectar y cuantificar el polisacárido. Los sistemas HPAEC-PAD adecuados los proporciona DionexMR Corporation (Sunnyvale, CA), por ejemplo, el sistema BioLCMR. En estos sistemas, el eluido de una columna HPAEC se analiza usando PAD, es decir, basándose en la corriente eléctrica. A un pH adecuado (alto), los carbohidratos se pueden oxidar electrocatalíticamente en la superficie de los electrodos aplicando un potencial positivo. La corriente generada de esta manera es proporcional a la concentración de carbohidratos, lo que permite la detección y cuantificación del carbohidrato por amperometría. En comparación con la detección amperométrica simple, PAD intercala pulsos cortos de un potencial de limpieza y regeneración con el potencial de detección estándar, evitando así las dificultades que surgen cuando los productos de oxidación de los analitos contaminan los electrodos.
Los procedimientos no amperométricos se pueden combinar con PAD para analizar eluidos, por ejemplo, véase la referencia 223.
Por tanto, el polisacárido capsular del serogrupo X hidrolizado puede someterse a HPAEC para su separación y los materiales separados pueden detectarse y, opcionalmente, cuantificarse mediante PAD. Como se muestra en los ejemplos siguientes, HPAEC-PAD puede separar residuos de glucosamina-4-fosfato hidrolizados de otros materiales de fondo en una muestra.
Las columnas preferidas son aquellas que retienen de forma espontánea los sacáridos de manera que tienen que eluirse de la columna. La elución de la columna de cromatografía puede ser una elución isocrática o una elución en gradiente. Los eluyentes que incluyen sales de hidróxido y/o acetato son eluyentes típicos usados durante el análisis HPAEC-PAD de sacáridos. Sin embargo, también es posible usar aniones tales como nitrato, cloruro, etc. Se usan típicamente sales de sodio. Para eluir analitos de columnas AEC, el eluyente será generalmente básico, por ejemplo, el pH será > 8, > 9, > 10, > 11, > 12, > 13, etc. Pueden usarse sales de hidróxido (por ejemplo, NaOH) para lograr el pH deseado.
Los eluatos pueden someterse a la supresión química de iones hidróxido, particularmente cuando los iones interfieren con una técnica de detección analítica que se está utilizando. Se puede usar convenientemente un supresor de micromembrana, tal como los productos MMS de DionexMR. El producto 'MMS III' usa supresión química continua para mejorar la conductividad del analito mientras disminuye la conductividad del eluyente, y permite la detección de conductividad directa con aplicaciones de intercambio iónico usando elución isocrática o en gradiente en amplios intervalos de concentración.
Las columnas de HPAEC adecuadas para usar con los procedimientos son las columnas "CarboPac" comercializadas por Dionex, tales como PA1 [sustrato de poliestireno de 10 pm de diámetro entrecruzado al 2 % con divinilbenceno, aglomerado con látex funcionalizado con amonio cuaternario MicroBead de 500 nm (entrecruzado 5 %)], PA100, PA20, PA10 [sustrato de etil-vinil-benceno de 10 pm de diámetro 55 % entrecruzado con divinilbenceno, aglomerado con ion amonio cuaternario difuncional MicroBead de 460 nm (5 % entrecruzado)], columnas PA200 o MA1.
Las columnas analíticas de HPAEC se pueden usar junto con precolumnas y/o columnas trampa. Por ejemplo, se puede usar una columna analítica PA10 junto con una columna de protección PA10 en línea y/o una columna de trampa en línea (pretratamiento). Estas columnas pueden eliminar materiales que de otro modo interferirían con los análisis, por ejemplo, una columna "AminoTrap" puede eliminar los aminoácidos antes del análisis de sacáridos. También se pueden utilizar trampas de borato. La resina "AminoTrap" TÍPICA tiene un sustrato de 10 pm de diámetro (etil-vinil-benceno 55 % entrecruzado con divinilbenceno) injertado con sitios de intercambio aniónico de amonio cuaternario difuncional, mientras que una "BorateTrap" típica tiene una resina de alta capacidad de 20 pm de diámetro con muy alta selectividad para el borato.
Las columnas PA1 y PA10 son columnas de intercambio aniónico diseñadas para usarse con PAD para proporcionar separaciones de alta resolución de mono y disacáridos, y las resinas en ambas son perlas no porosas de 10 pm de diámetro cubiertas con un látex fino de MicroBeds funcionalizadas. Su estructura de resina pelicular permite una excelente transferencia de masa, lo que da como resultado una cromatografía de alta resolución y un reequilibrio rápido. Mientras que PA1 es una columna multiusos adecuada para determinar monosacáridos y disacáridos en una variedad de matrices, y es la columna de elección para separaciones de alta resolución de polisacáridos lineales, PA10 está optimizada para determinar los monosacáridos amino, neutros y ácidos que se encuentran en las fracciones de carbohidratos de las glicoproteínas de mamíferos. La principal diferencia entre las columnas PA1 y PA10 es que la resina en PA1 es poliestireno 2 % entrecruzado con divinilbenceno, pero en PA10 es etil-vinilbenceno 55 % entrecruzado con divinilbenceno.
Hasta la fecha, el procedimiento de separación por HPAEC más preferido para el polisacárido capsular del serogrupo X implica una columna CarboPac PA1 (4 x 250 mm) combinada con una precolumna Guard PA1 (4 x 50 mm).
Después de la elución y detección, el procedimiento puede incluir la etapa adicional de determinar una característica de cualquier polisacárido capsular del serogrupo X que se identificó en la muestra, por ejemplo, su GP (típicamente un GP promedio), su peso molecular, su pureza, etc.
Preparación de N-acetilglucosamina-4-fosfato
Se divulgan procedimientos y reactivos útiles para preparar N-acetilglucosamina-4-fosfato. Como se discutió anteriormente, este compuesto puede usarse como un estándar analítico en el procedimiento para analizar el polisacárido capsular del serogrupo X.
El procedimiento puede desproteger N de un compuesto de fórmula A y la acilación de N del compuesto desprotegido para obtener un compuesto de fórmula B;
Figure imgf000019_0001
en el que PG es un grupo protector de oxígeno; PGn es un grupo protector de nitrógeno y todos los grupos PG son iguales. PG y PGn pueden ser cualquier grupo protector adecuado, por ejemplo, como se describe en la referencia 224.
El procedimiento puede comprender la introducción de un grupo organofosfato en un compuesto de fórmula B para obtener un compuesto de fórmula C:
Figure imgf000020_0001
en el que ambos grupos Rp son iguales y Rp es H o un grupo protector de fosfato de arilmetilo, por ejemplo como se describe en la referencia 224; o los grupos Rp se unen para formar un solo grupo protector arilmetilo, por ejemplo oxilenilo. PG es como se definió anteriormente y todos los grupos PG son iguales. Cuando Rp es H, el compuesto de fórmula B se hace reaccionar típicamente con un reactivo de fosforilación y un agente oxidante. El agente de fosforilación puede ser clorofosfito de salicilo, típicamente en presencia de piridina y cloruro de pivaloilo. El agente de fosforilación también puede ser PCh seguido de agua o NaHCO3 acuoso. El agente oxidante puede ser I2 o mCPBA, típicamente I2. Cuando los grupos Rp se unen para formar un solo grupo protector, el compuesto de fórmula B se hace reaccionar típicamente con un reactivo organofosforado que contiene o-xileno y luego con un agente oxidante. El reactivo organofosforado que contiene o-xileno es típicamente una fosforamidita tal como N-dietil-1,5-dihidro-3H-2,3,4-benzodioaxafosfina-3-amina. El agente oxidante puede ser I2 o mCPBA, típicamente mCPBA. Cuando los grupos RP no se unen para formar un solo grupo protector, el compuesto de fórmula B se hace reaccionar típicamente con un reactivo pirofosfato que contiene los grupos Rp. Un reactivo pirofosfato adecuado es tetrabencilpirofosfato, en cuyo caso Rp es un grupo bencilo.
El procedimiento puede comprender desproteger un compuesto de fórmula C para obtener N-acetilglucosamina-4-fosfato:
Figure imgf000020_0002
PG y Rp son como se definieron anteriormente y todos los grupos PG son iguales. Típicamente, cuando Rp es un grupo protector de fosfato, todos los grupos PG y el grupo Rp se eliminan en la misma etapa, por ejemplo mediante hidrogenólisis.
Un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula A anterior, puede comprender reducir un compuesto de fórmula Z para obtener un compuesto de fórmula A':
Figure imgf000020_0003
en el que Ri es fenilo o fenilo sustituido con uno o más grupos seleccionados de alquilo, tales como metilo o etilo; O­ alquilo, tal como O-metilo; y nitro, de modo que la fracción R1CH2- en la fórmula A' es un grupo protector de oxígeno de bencil éter sustituido o no sustituido. El grupo protector puede ser, por ejemplo, cualquier grupo protector adecuado descrito en la referencia 224. En particular, el grupo protector puede ser bencilo, p-metoxibencilo, 3,4-dimetoxibencilo, 2 ,6-dimetoxibencilo, o-nitrobencilo, p-nitrobencilo, y es típicamente bencilo. PGn es un grupo protector de nitrógeno como se definió anteriormente. Los grupos PGn típicos son ftalimida; carbamatos tales como Boc y Fmoc; nosilo, tosilo y mesilo. Particularmente, PGn es ftalimida. Típicamente, la reacción comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula Z, en el que Ri es fenilo y PGn es un grupo ftalimida, con un compuesto que contiene boro y un ácido de Lewis en un disolvente orgánico para obtener un compuesto de fórmula A'. El compuesto que contiene boro puede ser un reactivo de borohidruro tal como trialquilaminoborano, particularmente trietilaminoborano o trimetilaminoborano, y es típicamente trimetilaminoborano. El ácido de Lewis puede ser AlCh o un ácido de Lewis que contiene boro, tal como un complejo de trifluoruro de boro, y es típicamente BF3 • Et2O. El disolvente orgánico puede ser un disolvente orgánico clorado, por ejemplo CHCh o C ^C h o un disolvente no clorado, y típicamente es acetonitrilo. La reacción se puede llevar a cabo en un intervalo de temperatura de aproximadamente -10 a aproximadamente 10 °C, de aproximadamente -5 a aproximadamente 5 °C, típicamente a aproximadamente 0 °C.
Un ejemplo del procedimiento comprende la etapa i) desprotección de N de un compuesto de fórmula A' y la etapa ii) acilación de N del compuesto desprotegido para obtener un compuesto de fórmula B':
Figure imgf000021_0001
en el que Ri y PGn son como se definieron anteriormente. Típicamente, la reacción comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula A' en el que PGn es ftalimida en la etapa i) con 1,2-diaminoetano en un disolvente alcohólico tal como MeOH o EtOH, típicamente EtOH. La etapa i) se lleva a cabo típicamente entre temperatura ambiente y el punto de reflujo del disolvente, por ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 25 °C o más, de aproximadamente 25 a aproximadamente 80 °C, de aproximadamente 35 a aproximadamente 80 °C, desde de aproximadamente 45 a aproximadamente 80 °C, de aproximadamente 55 a aproximadamente 80 °C, de aproximadamente 65 a aproximadamente 80 °C, de aproximadamente 75 a aproximadamente 80 °C típicamente aproximadamente 80 °C o aproximadamente el punto de reflujo del disolvente. La etapa ii) incluye la adición de un agente de acilación. El agente acilación puede ser cualquier agente de acilación adecuado, típicamente Ac2O con una base amina tal como piridina o trietilamina o imidazol. Alternativamente, el agente de acilación puede ser una mezcla de EtOH:Ac2O de aproximadamente 4:1. La etapa ii) se puede llevar a cabo aproximadamente a temperatura ambiente, por ejemplo a aproximadamente 25 °C. Típicamente, no hay ninguna etapa de purificación entre las etapas i) y ii), por ejemplo, solo se elimina el disolvente de la etapa i) antes de realizar la etapa ii).
Un ejemplo del procedimiento comprende introducir un grupo organofosfato en un compuesto de fórmula B' para obtener un compuesto de fórmula C':
Figure imgf000021_0002
en el que Ri es como se definió anteriormente. Típicamente, el compuesto de fórmula B' se hace reaccionar primero con un reactivo organofosforado que contiene o-xileno, por ejemplo, una fosforamidita tal como A/-dietil-1,5-dihidro-3H-2,3,4-benzodioxafosfina-3-amina, en presencia de una base de amina, típicamente 1H-tetrazol, en un disolvente orgánico como THF o CH2Ch, típicamente CH2Ch. Luego se agrega un agente oxidante, tal como I2 en piridina y agua o mCPBA. El mCPBA se usa típicamente a una temperatura de aproximadamente -20 °C a aproximadamente 20 °C, de aproximadamente -15 °Ca aproximadamente 15 °C, de aproximadamente -10 °Ca aproximadamente 10 °C, de aproximadamente -5 °C hasta aproximadamente 5 °C, y típicamente aproximadamente 0 °C. El mCPBA generalmente se agrega al mismo solvente de reacción que se usó en la primera etapa. La finalización de la primera etapa puede detectarse, por ejemplo, mediante análisis de TLC, antes de que se agregue el mCPBA.
Un ejemplo adicional del procedimiento comprende introducir un grupo organofosfato en un compuesto de fórmula B' para obtener un compuesto de fórmula C":
Figure imgf000021_0003
en el que Ri es como se definió anteriormente. Típicamente, el compuesto de fórmula B' se hace reaccionar con un reactivo pirofosfato, por ejemplo, pirofosfato de tetrabencilo. La reacción se lleva a cabo en presencia de una base, las bases adecuadas son amidas de litio tales como LDA o LiHMDS. La reacción se lleva a cabo en un disolvente orgánico, por ejemplo, un disolvente clorado tal como CH2Ch o un disolvente de éter, típicamente éter dietílico o THF. Típicamente, la reacción se lleva a cabo por debajo de aproximadamente 0 °C, por ejemplo aproximadamente -10 °C, aproximadamente -20 °C, aproximadamente -30 °C, aproximadamente -40 °C, aproximadamente -50 °C, aproximadamente -60 °C, aproximadamente -70 °C, adecuadamente aproximadamente -80 °C y luego aproximadamente -30 °C.
Un ejemplo adicional del procedimiento comprende la introducción de un grupo organofosfato en un compuesto de fórmula B' para obtener un compuesto de fórmula C''':
Figure imgf000022_0001
en el que Ri es como se definió anteriormente. Típicamente, el compuesto de fórmula B' se fosforila con un reactivo de fosforilación y un agente oxidante adecuados. Los reactivos de fosforilación típicos son clorofosfito de salicilo o PCl3 y agua o NaHCO3 acuoso. Cuando el agente de fosforilación es clorofosfito de salicilo, la reacción se lleva a cabo típicamente en un disolvente de piridina y típicamente está presente cloruro de pivaloilo. La reacción se lleva a cabo típicamente a temperatura ambiente, por ejemplo aproximadamente a 25 °C. Luego se agrega un agente oxidante como I2 en piridina y agua, o mCPBA, típicamente I2. La reacción se enfría típicamente por debajo de aproximadamente 0 °C antes de la adición del oxidante, por ejemplo a aproximadamente -10 °C, aproximadamente -20 °C, aproximadamente -30 °C, aproximadamente -40 °C, aproximadamente -50 °C, típicamente aproximadamente -40 °C. La oxidación se completa típicamente a una temperatura de aproximadamente 0 °C. El I2 se agrega típicamente como una solución en piridina/agua. La concentración de la solución es típicamente de aproximadamente 0,1 a 1 M, aproximadamente de 0,2 a 0,9 M, aproximadamente de 0,3 a 0,8 M, aproximadamente de 0,4 a 0,7 M, adecuadamente aproximadamente 0,5 M. La proporción de piridina a agua es típicamente de aproximadamente 10:1 a 30:1, aproximadamente 12:1 a aproximadamente 28:1, aproximadamente 14:1 a aproximadamente 26:1 aproximadamente 16:1 a aproximadamente 24:1, aproximadamente 18:1 hasta aproximadamente 22:1, adecuadamente aproximadamente 19:1. El oxidante generalmente se agrega al mismo solvente de reacción que se usó en la primera etapa. La finalización de la primera etapa puede detectarse, por ejemplo, mediante análisis por TLC, antes de añadir el oxidante. El compuesto de fórmula C''' típicamente se aísla como una sal, típicamente la sal de di-trietilamonio.
Cuando el agente de fosforilación es PCl3 y agua o NaHCO3 acuoso, la reacción se lleva a cabo típicamente en un disolvente orgánico tal como MeCN. Se añade agua o NaHCO3 acuoso después de PCh, adecuadamente a temperatura ambiente. Luego se agrega un agente oxidante tal como I2 o mCPBA, típicamente I2. Por lo general, los disolventes se eliminan antes de la adición del oxidante y se agrega un nuevo disolvente. El nuevo disolvente suele ser una mezcla de piridina y trietilamina. La relación de piridina a trietilamina es típicamente de aproximadamente 2: 1 a aproximadamente 8:1, adecuadamente aproximadamente 4:1. Típicamente, se agrega I2 como una solución en agua de piridina. La concentración de la solución es típicamente de aproximadamente 0,1 a 1 M, aproximadamente de 0,2 a 0,9 M, aproximadamente de 0,3 a 0,8 M, adecuadamente aproximadamente 0,4 M. El compuesto de fórmula C''' típicamente se aísla como una sal, típicamente la sal de di-trietilamonio.
Un ejemplo del procedimiento comprende desproteger, típicamente por hidrogenólisis, un compuesto de fórmula C' para obtener W-acetilglucosamina-4-fosfato:
Figure imgf000022_0002
en el que Ri es como se definió anteriormente. Típicamente, el compuesto de fórmula C' se hace reaccionar con H2 en presencia de un catalizador de paladio tal como Pd/C al 10 % o catalizador de Pearlman Pd(OH)2/C, en un disolvente alcohólico, por ejemplo MeOH o EtOH, y típicamente MeOH. La reacción se lleva a cabo típicamente a una presión de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 atm, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 atm, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 atm, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 atm, típicamente aproximadamente 1 atm.
Un ejemplo adicional del procedimiento comprende desproteger, típicamente por hidrogenólisis, un compuesto de fórmula C" para obtener W-acetilglucosamina-4-fosfato:
en el que Ri es como se definió anteriormente. Típicamente, el compuesto de fórmula C" se hace reaccionar con H2 en presencia de un catalizador de paladio tal como Pd/C al 10 % o catalizador de Pearlman Pd(OH)2/C, en un disolvente alcohólico, por ejemplo MeOH o EtOH, y típicamente MeOH. La reacción se lleva a cabo típicamente a una presión de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 atm, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 atm, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 atm, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 atm, típicamente aproximadamente 1 atm.
Un ejemplo adicional del procedimiento comprende desproteger, típicamente por hidrogenólisis, un compuesto de fórmula C''', o la sal de di-trietilamonio del mismo, para obtener A/-acetilglucosamina-4-fosfato:
Figure imgf000023_0001
en el que Ri es como se definió anteriormente. Típicamente, el compuesto de fórmula C''' se hace reaccionar con H2 en presencia de un catalizador de paladio tal como Pd/C al 10 % o catalizador de Pearlman Pd(OH)2/C, en un disolvente alcohólico, por ejemplo MeOH o EtOH, y típicamente MeOH. La reacción se lleva a cabo típicamente a una presión de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 atm, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 atm, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 atm, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 atm, típicamente aproximadamente 1 atm.
La W-acetilglucosamina-4-fosfato puede purificarse, por ejemplo, mediante cristalización, o más típicamente mediante cromatografía, particularmente cromatografía usando una fase estacionaria de sílice modificada hidrófobamente.
El procedimiento puede ser el siguiente:
Figure imgf000023_0002
Las condiciones de reacción adecuadas para este procedimiento se proporcionan en la sección "Modos para llevar a cabo la invención" a continuación (por ejemplo, en el Esquema 1).
General
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de los conocimientos de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, las referencias 225-232, etc.
La numeración "GI" se usa más arriba. Un número GI, o "Identificador GenInfo", es una serie de dígitos asignados consecutivamente a cada registro de secuencia procesado por el NCBI cuando las secuencias se agregan a sus bases de datos. El número GI no se parece en nada al número de acceso del registro de secuencia. Cuando se actualiza una secuencia (por ejemplo, para corregirla o para agregar más anotaciones o información), recibe un nuevo número GI. Por lo tanto, la secuencia asociada con un número GI dado nunca se cambia.
Cuando se omite un "dominio" de antígeno, esto puede implicar la omisión de un péptido señal, de un dominio citoplásmico, de un dominio transmembrana, de un dominio extracelular, etc.
El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.
El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x ± 10 %.
La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.
Se apreciará que los anillos de azúcar pueden existir en forma abierta y cerrada y que, aunque las formas cerradas se muestran en las fórmulas estructurales de la presente invención, las formas abiertas también están incluidas en la invención. De manera similar, se apreciará que los azúcares pueden existir en formas de piranosa y furanosa y que, aunque las formas de piranosa se muestran en las fórmulas estructurales de la presente invención, también se incluyen las formas de furanosa. También se incluyen diferentes formas anoméricas de azúcares.
Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significan que, cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia se pueden determinar usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo los descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 233. Una alineación preferida se determina mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman utilizando una búsqueda de huecos afines con una penalización de apertura de hueco de 12 y una penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se divulga en la referencia 234. Las realizaciones particulares de la invención incluyen:
1. Una composición inmunogénica que comprende un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo X de Neisseria meningitidis y una molécula portadora, en la que el acoplamiento del polisacárido capsular es directo.
2. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de la realización 1, en la que el conjugado se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de: (a) oxidar un grupo hidroxilo primario en el polisacárido capsular, para obtener un polisacárido oxidado con un grupo aldehido; y (b) acoplar el polisacárido oxidado a una molécula portadora a través del grupo aldehido, obteniendo así el conjugado.
3. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de la realización 2, en la que la oxidación en la etapa (a) es del grupo hidroxilo primario entre el 1 y el 10 % de los residuos en el polisacárido capsular.
4. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de la realización 3, en la que la oxidación es del grupo hidroxilo primario entre el 4-8 % de los residuos en el polisacárido capsular.
5. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de cualquiera de las realizaciones 2-4, en la que la oxidación en la etapa (a) es oxidación mediada por TEMPO.
6. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de cualquiera de las realizaciones 2-5, en la que el acoplamiento en la etapa (b) es por aminación reductora entre el grupo aldehído y un grupo de amina primaria en la molécula portadora.
7. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de la realización 1, en la que el conjugado se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de: (a) aminación reductora del extremo reductor del polisacárido capsular, para obtener un polisacárido modificado con un grupo de amina primaria unido al átomo C-1 de la subunidad terminal por un enlace covalente; y (b) acoplar el polisacárido modificado a una molécula portadora a través del grupo de amina primaria, obteniendo así el conjugado.
8. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de la realización 1, en la que el conjugado se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de: (a) reducción del extremo reductor del polisacárido capsular, para obtener un polisacárido modificado con dos grupos hidroxilo vecinos en ese extremo; (b) escisión oxidativa de los grupos hidroxilo vecinos, para obtener un polisacárido modificado adicional con un grupo aldehído en el extremo; (c) aminación reductora del grupo aldehído, para obtener un polisacárido modificado adicional con un grupo de amina primaria en el extremo y (d) acoplar el polisacárido modificado adicionalmente a una molécula portadora a través del grupo de amina primaria, obteniendo así el conjugado. 9. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de la realización 8, en la que el grupo de amina primaria está unido al átomo C-5 de la subunidad terminal mediante un enlace covalente.
10. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de cualquiera de las realizaciones 2-9, en la que el polisacárido capsular es un oligosacárido.
11. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de la realización 10, en la que el oligosacárido tiene un grado de polimerización entre 60 y 100 o entre 10 y 20.
12. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de cualquiera de las realizaciones 1-11, en la que la molécula portadora es un toxoide de la difteria o del tétanos, CRM197 o proteína D.
13. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de cualquiera de las realizaciones 1-11, en la que la molécula portadora comprende un antígeno spr0096 y un antígeno spr2021.
14. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de la realización 13, en la que el antígeno spr0096 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 50 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.
15. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de acuerdo con la realización 13 o la realización 24, en la que el antígeno spr2021 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 50 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 3.
16. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 13-15, en la que la molécula portadora comprende el antígeno spr0096 y el antígeno spr2021 como una única cadena polipeptídica.
17. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de acuerdo con la realización 16, en la que la cadena polipeptídica es de fórmula NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH, en la que: A es una secuencia opcional de aminoácidos del terminal N; B es una secuencia opcional de aminoácidos del terminal C; n es un número entero de 2 o más; cada X es una secuencia de aminoácidos de un antígeno spr0096 o un antígeno spr2021, en la que al menos una X es un antígeno spr0096 y al menos una X es un antígeno spr2021; y L es una secuencia opcional de aminoácidos enlazadores.
18. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de acuerdo con la realización 17, en la que n es 2.
19. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de acuerdo con la realización 18, en la que X1 es un antígeno spr0096 y X2 es un antígeno spr2021.
20. La composición inmunogénica que comprende un conjugado de acuerdo con la realización 19, en la que la cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 50 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 9, particularmente una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9.
21. La composición inmunogénica de cualquiera de las realizaciones 1-20, que comprende además uno o más antígenos adicionales.
22. La composición inmunogénica de la realización 21, que comprende además un polisacárido capsular del serogrupo A.
23. La composición inmunogénica de la realización 22, en la que el polisacárido capsular del serogrupo A se conjuga con una molécula portadora.
24. La composición inmunogénica de cualquiera de las realizaciones 21-23, que comprende además un polisacárido capsular del serogrupo W135.
25. La composición inmunogénica de la realización 24, en la que la composición comprende un polisacárido capsular del serogrupo A conjugado con una molécula portadora.
26. La composición inmunogénica de la realización 24 o la realización 25, en la que el polisacárido capsular del serogrupo W135 está conjugado con una molécula portadora.
27. La composición inmunogénica de la realización 23, 25 o 26, en la que la molécula portadora es como se define en la realización 12.
28. La composición inmunogénica de cualquiera de las realizaciones 21-27, que comprende además un polisacárido capsular del serogrupo C.
29. La composición inmunogénica de cualquiera de las realizaciones 21-28, que comprende además un polisacárido capsular del serogrupo Y.
30. La composición inmunogénica de la realización 28 o la realización 29, en la que el polisacárido capsular está conjugado con una molécula portadora.
31. La composición de la realización 30, en la que la molécula portadora es como se define en la realización 12.
32. La composición inmunogénica de cualquiera de las realizaciones 1-31, en la que la composición está en una formulación acuosa.
33. Una vacuna que comprende la composición inmunogénica de cualquiera de las realizaciones 1-32.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la unidad de repetición del polisacárido capsular del serogrupo X.
La Figura 2 muestra un cromatograma de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento para el polisacárido capsular del serogrupo X nativo e hidrolizado.
La Figura 3 muestra un esquema para la conjugación de un polisacárido capsular del serogrupo X a CRM197 por oxidación TEMPO seguida de aminación reductora, y un análisis SDS PAGE del conjugado resultante.
La Figura 4 muestra un cromatograma de una mezcla de conjugación llevada a cabo en una columna Sephacryl S300 con solución salina tamponada con fosfato.
La Figura 5 muestra un esquema para la conjugación de un polisacárido capsular del serogrupo X a CRM197 a través del enlazador SIDEA, y un análisis SDS PAGE del conjugado resultante.
La Figura 6 muestra un esquema para la conjugación de un polisacárido capsular del serogrupo X a CRM197 a través del enlazador SIDEA usando un procedimiento diferente, y un análisis SDS PAGe del conjugado resultante.
La Figura 7 muestra un análisis SDS PAGE de un conjugado de polisacárido capsular del serogrupo X-CRM197 elaborado usando un enlazador diferente.
La Figura 8 muestra los títulos de anticuerpos IgG contra el polisacárido capsular del serogrupo X y los títulos de anticuerpos bactericidas en suero contra el serogrupo X después de la inmunización con una variedad de conjugados de N. meningitidis.
La Figura 9 muestra los títulos de anticuerpos IgG contra el polisacárido capsular del serogrupo A y los títulos de anticuerpos bactericidas en suero contra el serogrupo A del mismo experimento.
La Figura 10 muestra los títulos de anticuerpos IgG contra el polisacárido capsular del serogrupo C y los títulos de anticuerpos bactericidas en suero contra el serogrupo C del mismo experimento.
La Figura 11 muestra títulos de anticuerpos IgG contra el polisacárido capsular del serogrupo W135 y títulos de anticuerpos bactericidas en suero contra el serogrupo W135 del mismo experimento.
La Figura 12 muestra los títulos de anticuerpos IgG contra el polisacárido capsular del serogrupo Y y los títulos de anticuerpos bactericidas en suero contra el serogrupo Y del mismo experimento.
La Figura 13 muestra el espectro de RMN de HMBC 1H-31P 2D registrado a 400 MHz y 25 ± 0,1 °C en oligosacárido MenA (a) y MenX (b) generado por hidrólisis ácida. Las asignaciones de picos están marcadas. La Figura 14 muestra a) GP promedio y b) pH en función del tiempo recogido para los polisacáridos capsulares MenA y MenX y c) estado de O-acetilo para el polisacárido capsular MenA solo a 37 °C y 45 °C.
La Figura 15 muestra perfiles de GP promedio en función del tiempo, recolectados para el estudio de estabilidad a 37 °C y 45 °C para a) el polisacárido capsular MenA y b) MenX en los puntos de tiempo (a) 0, (b) 7, (c) 10, (d) 14, (e) 21 días a 45 °C y a (f) 7, (g) 14, (h) 21, (i) 28 días a 37 °C. Además, se muestra en b) (l) un perfil de polisacárido capsular MenX degradado experimentalmente, obtenido mediante tratamiento ácido (acetato de sodio pH 4,0, a 80 °C durante ~ 4 horas).
La Figura 16 muestra los títulos de anticuerpos IgG contra el polisacárido capsular del serogrupo X y los títulos de anticuerpos bactericidas en suero contra el serogrupo X después de la inmunización con una variedad de conjugados de N. meningitidis.
La Figura 17 muestra un esquema para la conjugación de un polisacárido capsular del serogrupo X a CRM197 usando un procedimiento adicional, y un análisis SDS PAGE del conjugado resultante.
La Figura 18 muestra los títulos de anticuerpos IgG contra el polisacárido capsular del serogrupo A y los títulos de anticuerpos bactericidas en suero contra el serogrupo A después de la inmunización con una variedad de conjugados de N. meningitidis.
La Figura 19 muestra los títulos de anticuerpos IgG contra el polisacárido capsular del serogrupo C y los títulos de anticuerpos bactericidas en suero contra el serogrupo C después de la inmunización con una variedad de conjugados de N. meningitidis.
La Figura 20 muestra los títulos de anticuerpos IgG contra el polisacárido capsular del serogrupo W135 y los títulos de anticuerpos bactericidas en suero contra el serogrupo W135 después de la inmunización con una variedad de conjugados de N. meningitidis.
La Figura 21 muestra los títulos de anticuerpos IgG contra el polisacárido capsular del serogrupo Y después de la inmunización con una variedad de conjugados de N. meningitidis.
La Figura 22 muestra títulos de anticuerpos IgG de alta afinidad contra el polisacárido capsular del serogrupo X después de la inmunización con una variedad de conjugados de N. meningitidis.
Modos para llevar a cabo la invención
Crecimiento bacteriano para la producción de polisacáridos capsulares del serogrupo X
Con el fin de identificar las condiciones óptimas de crecimiento bacteriano para la producción y liberación del polisacárido capsular del serogrupo X en el sobrenadante, se probaron tres medios diferentes usando la cepa MenX 5967 (ST 750). Se realizaron diferentes crecimientos en matraces y se controlaron mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protones (RMN 1H). Los sobrenadantes del cultivo se analizaron mediante secuencia de RMN con un filtro de difusión para cortar las señales derivadas de especies de menor peso molecular (PM) y resaltar las señales del polisacárido capsular del serogrupo X de mayor Pm . Un análisis adicional de los gránulos correspondientes por RMN de giro de ángulo mágico de alta resolución 1H (RMN HR-MAS) en estado sólido no mostró señales de polisacárido capsular del serogrupo X, lo que indica que la mayoría del polisacárido se liberó en el sobrenadante (considerando el límite de detección de este ensayo, la cantidad máxima de polisacárido que queda en las bacterias debe ser 1/8 de la cantidad inicial). Se obtuvieron resultados similares con los tres medios.
Además de la metodología de RMN, se desarrolló un procedimiento más preciso para la cuantificación de polisacáridos capsulares del serogrupo X en el caldo de cultivo clarificado (véase más abajo) usando cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). Como se muestra en la tabla siguiente, el medio # 3 dio como resultado una mayor cantidad de polisacárido. Por lo tanto, se seleccionó para una fermentación a mayor escala (18 litros) que produjo 356 pg/ml de polisacárido capsular del serogrupo X en el sobrenadante.
Crecimiento de la cepa MenX 5967 (ST 750) en diferentes medios y producción relativa de polisacáridos
Figure imgf000027_0001
Purificación del polisacárido capsular del serogrupo X
El procedimiento para purificar el polisacárido capsular del serogrupo X se realizó mediante un procedimiento adaptado de la referencia 235.
Producción y caracterización del conjugado
Se prepararon conjugados utilizando polisacáridos de diferentes longitudes de cadena y diferentes químicas de conjugación.
Conjugación por oxidación y aminación reductora (procedimiento A):
Se hidrolizó polisacárido capsular del serogrupo X purificado en acetato de sodio 50 mM a pH 4,7, 100 °C durante 1 hora (Figura 2). Se determinó que el grado promedio de polimerización del oligosacárido resultante era 80, correspondiente a un peso molecular de 25-30 kDa, mediante RMN. La despolimerización del polisacárido se controló en el procedimiento mediante cromatografía líquida de ultra alto rendimiento - cromatografía de exclusión por tamaño (UPLC-SEC) y espectroscopía de RMN de fósforo (31P), y se inactivó mediante neutralización cuando se alcanzó el GP promedio deseado. El tampón se intercambió con bromuro de tetrabutil amonio para permitir la disolución del sacárido en el disolvente dimetilformamida. A continuación, el sacárido se oxidó con TEMPO (0,06 equivalentes en relación con la subunidad de repetición MenX), NaHCO3 (9 equivalentes en relación con la subunidad de repetición MenX), TCC (2 equivalentes en relación con la subunidad de repetición MenX) a 0 °C durante la noche. Esta oxidación genera un grupo aldehído en la posición C-6 de subunidades individuales (Figura 3). El sacárido oxidado se purificó mediante precipitación con acetona/NaCl y filtración en gel usando una columna Sephadex G15. El sacárido se cuantificó usando HPAEC-PAD y su identidad estructural se confirmó usando RMN. Había aproximadamente 4,5 grupos oxidados por cadena, lo que corresponde a un grado de oxidación de aproximadamente el 6 % a lo largo de la cadena de alrededor de 80 residuos. La distribución del peso molecular del sacárido oxidado se midió mediante UPLC-SEC.
El grupo aldehído se utilizó para la conjugación con la proteína portadora CRM197 mediante aminación reductora (Figura 3). Brevemente, el sacárido se mezcló con 10 mg/ml de CRM197 en una relación de 4:1 p/p y NaBH3CN en una relación de 1:1 p/p en un tampón NaPi 10 mM a pH 7,2. La mezcla se dejó durante 72 horas con agitación lenta a 37 °C. Los conjugados se purificaron en una columna Sephacryl S300 con solución salina tamponada con fosfato y las fracciones se recogieron en grupos (Figura 4). La conjugación se verificó mediante SDS PAGE (Figura 3). Las propiedades de los conjugados purificados (grupo 1) se dan a continuación:
Figure imgf000029_0001
También se prepararon conjugados mediante este procedimiento en el que los polisacáridos no se hidrolizaron con acetato de sodio y por lo tanto tenían un grado promedio nativo de polimerización. Se prepararon más conjugados que contenían polisacáridos con un grado promedio de polimerización de 130.
También se prepararon conjugados mediante este procedimiento en el que la proteína portadora era toxoide del tétanos (TT) o la SEQ ID NO: 9 (SEQ9). Los polisacáridos de estos conjugados tenían un grado promedio de polimerización de 130. A continuación se indican otras características de estos conjugados:
Figure imgf000030_0002
Conjugación por aminación reductora seguida de reacción con enlazador SIDEA (procedimiento B):
Se hidrolizó polisacárido capsular del serogrupo X purificado en acetato de sodio 50 mM a pH 4,7, 100 °C durante 2 horas (Figura 2). El grado medio de polimerización del oligosacárido resultante se determinó en 15, correspondiente a un peso molecular de 5 kDa, por RMN. El sacárido se solubilizó luego a razón de 5 mg/ml en tampón de acetato de sodio 5 mM a pH 6,5 con 300 mg/ml de NH4OAc y 49 mg/ml de NaB^CN durante 5 días a 37 °C. Esta etapa dio como resultado la aminación reductora del grupo aldehído terminal para generar un grupo de amina primaria (Figura 5). A continuación, la mezcla de reacción se purificó mediante filtración de flujo tangencial con una membrana de 200 cm2 Hydrosart (celulosa) de corte de 2 kDa frente a NaCl 1 M y agua. El grupo de amina primaria se usó luego para la activación con SIDEA y la posterior conjugación con la proteína portadora CRM197 (Figura 5). Brevemente, el sacárido modificado se disolvió en DMSO/agua a 9:1 (v/v) con NEt3 (en una relación molar de NEt3:grupos NH2 totales de 5:1) en una SIDEA molar:grupos NH2 molares totales de 12:1 durante 3 horas a temperatura ambiente. Después, la mezcla de reacción se purificó mediante precipitación con dioxano al 90 % (v/v). El sacárido modificado con SIDEA se hizo reaccionar luego con 25 mg/ml de CRM197 en una proporción de 13:1 (relación molar de grupos éster activos:CRM197) en un tampón de NaPi 25 mM a pH 7,2. La mezcla se dejó durante 5 horas con agitación lenta a temperatura ambiente. Los conjugados se purificaron mediante precipitación con (NH4)2SO4. La conjugación se verificó mediante SDS PAGE (Figura 5). Las propiedades de un lote de estos conjugados se presentan a continuación:
Figure imgf000030_0001
Conjugación por reducción, oxidación y aminación reductora seguida de reacción con enlazador SIDEA (procedimiento C):
El sacárido capsular del serogrupo X purificado se hizo reaccionar a razón de 15 mg/ml en tampón NaPi 10 mM a pH 8 con NaBH4 (12 equivalentes con respecto al peso molecular de MenX, sólido) durante 1,5 horas a temperatura ambiente. Esta etapa resultó en la reducción del sacárido. El sacárido reducido se hizo reaccionar luego a razón de 6-8 mg/ml en tampón NaPi 10 mM a pH 7,2 con NaIO4 (10 equivalentes con respecto al peso molecular de MenX, sólido) durante 1,5 horas a temperatura ambiente. El efecto combinado de estas dos etapas es la generación de un grupo aldehído en el extremo reductor del sacárido (Figura 6). A continuación, el sacárido modificado se somete a aminación reductora para proporcionar un grupo de amina primaria que puede usarse para la activación con SIDEA y la posterior conjugación con la proteína portadora CRM197 (Figura 6). Brevemente, el sacárido modificado se solubilizó a razón de 4-5 mg/ml en tampón NaPi 10 mM a pH 7 con 300 mg/ml de NH4OAc y 49 mg/ml de NaBHaCN durante 5 días a 37 °C. A continuación, el sacárido modificado se disolvió en DMSO/agua en proporción 9:1 (v/v) con NEt3 (a una relación molar de NEt3:grupos NH2 totales de 5:1) a una SIDEA molar:grupos NH2 molares totales de 12: 1 durante 3 horas a temperatura ambiente. Después, la mezcla de reacción se purificó mediante precipitación con acetona al 80 % (v/v). El sacárido resultante modificado con SIDEA se hizo reaccionar luego con 25 mg/ml de CRM197 a una relación de 13:1 (relación molar de grupos éster activos: RM197) en un tampón NaPi 100 mM a pH 7,2. La mezcla se dejó durante la noche con agitación lenta a temperatura ambiente. Los conjugados se purificaron mediante precipitación con (NH4)2SO4. La conjugación se verificó mediante SDS PAGE (Figura 6). Las propiedades de un lote de estos conjugados se presentan a continuación:
Figure imgf000030_0003
Conjugación mediante enlazador alternativo (procedimiento D):
El polisacárido capsular del serogrupo X purificado con un grado medio de polimerización de 15, como se describió anteriormente, también se conjugó con CRM197 usando un enlazador diferente de acuerdo con el procedimiento de la Figura 7 en el documento US 61/534.751. La conjugación se verificó mediante SDS PAGE (Figura 7 en este documento).
Conjugación por reducción, oxidación y aminación reductora con el portador (procedimiento E):
Se hizo reaccionar sacárido capsular del serogrupo X purificado a razón de 15 mg/ml en tampón NaPi 10 mM a pH 8 con NaBH4 (12 equivalentes con respecto al peso molecular de MenX, sólido) durante 2 horas a temperatura ambiente. Esta etapa resultó en la reducción del sacárido. El sacárido reducido se hizo reaccionar luego a razón de 6-8 mg/ml en tampón NaPi 10 mM a pH 7,2 con NaIO4 (10 equivalentes con respecto al peso molecular de MenX, sólido) durante 1,5 horas a temperatura ambiente. El efecto combinado de estas dos etapas es la generación de un grupo aldehído en el extremo reductor del sacárido (Figura 17). A continuación, el sacárido modificado se somete a aminación reductora con la proteína portadora CRM197. Brevemente, el sacárido modificado a razón de 2 mg/ml se disolvió en tampón NaPi 300 mM a pH 8 (a una relación en peso de sacárido:CRM197 de 8:1) y NaBHaCN (a una relación en peso de sacárido:NaBH3CN de 4:1) para 4 días a 37 °C. La conjugación se verificó mediante SDS PAGE (Figura 17).
Estudio de inmunización (1)
Protocolo general del ensayo: Se inmunizaron ratones Balb/c mediante inyección subcutánea de acuerdo con el programa que se describe a continuación. El volumen de inyección fue de 200 pl y la inyección contenía adyuvante de fosfato de aluminio (120 pg por dosis). Las inyecciones se llevaron a cabo los días 1, 14 y 28, con sangrados tomados en el día 0 (para sueros previamente inmunes), 28 (sueros posteriores a la segunda inmunización) y 42 (sueros posteriores a la tercera inmunización).
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En la Figura 8 se muestran el título de anticuerpo IgG posterior a la tercera inmunización contra el polisacárido capsular del serogrupo X y el título de anticuerpo bactericida en suero contra la cepa Z9615 del serogrupo X. Los conjugados del serogrupo X fueron inmunogénicos e indujeron anticuerpos bactericidas. La respuesta no disminuyó cuando la dosis se redujo diez veces (a 0,1 pg). Las respuestas se redujeron ligeramente cuando los conjugados se combinaron con conjugados derivados de los serogrupos A, C, W135 y Y, pero todavía muy por encima de los controles. Por consiguiente, la interferencia inmune entre estos conjugados y los conjugados del serogrupo X parece ser relativamente pequeña.
Los títulos de anticuerpos IgG posteriores a la tercera inmunización contra los polisacáridos capsulares de los serogrupos A, C, W135 y Y y los títulos de anticuerpos bactericidas en suero contra estos serogrupos (usando las cepas F8238, 11, 240070 y 860800 respectivamente) también se midieron para los grupos 5, 6, 7 y 8. Los resultados se muestran en las Figuras 9-12. Las respuestas a los conjugados del serogrupo A, C, W135 y Y generalmente no disminuyeron cuando se combinaron con los conjugados del serogrupo X. Una vez más, estos resultados sugieren que hay poca interferencia inmunológica entre estos conjugados y los conjugados del serogrupo X.
Se encontró que las unidades de ELISA de IgM del polisacárido capsular antiserogrupo X eran bajas para todos los conjugados, como se esperaba para las vacunas conjugadas debido al cambio de isotipo eficaz de IgM a IgG.
Se usó un ELISA modificado para medir solo anticuerpos IgG de mayor avidez (Figura 22). El ELISA modificado utiliza una sal caotrópica para seleccionar y detectar únicamente anticuerpos IgG de mayor avidez. Las unidades de ELISA de IgG del polisacárido capsular antiserogrupo X fueron bajas para todos los conjugados, tanto después de la segunda como de la tercera dosis, en comparación con las unidades mediante ELISA estándar, pero se observó un efecto de refuerzo estadísticamente significativo después de la tercera dosis para todos los conjugados (P de 0,0006 a <0,0001).
La siguiente tabla resume los títulos de anticuerpos bactericidas en suero del complemento de conejo contra las diversas cepas de los sueros combinados posteriores a la tercera inmunización.
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Estudio de inmunización (2)
Protocolo general del ensayo: Se inmunizaron ratones Balb/c mediante inyección subcutánea de acuerdo con el programa que se describe a continuación. El volumen de inyección fue de 200 j l y la inyección contenía adyuvante de fosfato de aluminio.
Figure imgf000032_0001
En la Figura 16 se muestran el título del anticuerpo IgG posterior a la tercera inmunización contra el polisacárido capsular del serogrupo X y el título del anticuerpo bactericida en suero contra la cepa Z9615 del serogrupo X. Los conjugados del serogrupo X fueron inmunogénicos e indujeron anticuerpos bactericidas. Las respuestas se redujeron ligeramente cuando los conjugados MenX-CRM197 se combinaron con conjugados derivados de los serogrupos A, C, W135 y Y, pero todavía muy por encima de los controles. Por el contrario, se observó poca o ninguna reducción cuando se combinaron conjugados MenX-TT o MenX-SEQ9 con estos conjugados. Por consiguiente, el uso de una proteína portadora diferente para el polisacárido MenX puede ayudar a reducir cualquier interferencia inmunitaria entre el conjugado del serogrupo X y estos conjugados.
El título del anticuerpo IgG posterior a la tercera inmunización contra el polisacárido capsular del serogrupo A y el título del anticuerpo bactericida en suero contra la cepa F8238 del serogrupo A cuando los conjugados de MenX se combinaron con conjugados derivados de los serogrupos A, C, W135 y Y se muestran en la Figura 18. Los datos correspondientes para los serogrupos C, W135 y Y se muestran en las Figuras 19-21.
Estudio de estabilidad (1)
Materiales: Se obtuvieron polisacáridos de MenA y MenX purificados de acuerdo con el procedimiento de la referencia 10. La pureza de la preparación de polisacárido se evaluó mediante la estimación de los contenidos residuales de proteína y ácidos nucleicos, que eran inferiores al 1 % p/p de sacárido.
Análisis de RMN: Los experimento de RMN 1H, 13C y 31P se registraron en un espectrómetro Bruker Avance III a 400 MHz, equipado con un controlador de temperatura de alta precisión y usando una sonda de banda ancha de 5 mm (Bruker). Para la adquisición y procesamiento de datos se utilizó el software TopSpin versión 2.6 (Bruker). Los espectros de RMN 1H se recogieron a 25 ± 0,1 °C con 32k puntos de datos sobre un ancho espectral de 10 ppm, acumulando 128 barridos. Los espectros se ponderaron con un ensanchamiento de línea de 0,2 Hz y una transformada de Fourier. El transmisor se ajustó a la frecuencia del agua que se utilizó como señal de referencia (4,79 ppm). Los espectros de RMN 13C se registraron a 100,6 MHz y 37 ± 0,1 °C, con 32k puntos de datos sobre un ancho espectral de 200 ppm, acumulando 4k barridos. Los espectros se ponderaron con un ensanchamiento de línea de 0,2 Hz y una transformada de Fourier. El transmisor se ajustó a la frecuencia de la acetona que se utilizó como señal de referencia (30,89 ppm). Los espectros de RMN 31P se registraron a 161,9 MHz a 25 ± 0,1 °C, con 32k puntos de datos sobre un ancho espectral de 20 ppm, acumulando aproximadamente 1k de barridos. Los espectros se ponderaron con un ensanchamiento de línea de 3,0 Hz y una transformada de Fourier. Se utilizó ácido fosfórico al 85 % en óxido de deuterio como patrón externo (0 ppm). Todos los espectros de RMN de 1H y 31P se obtuvieron de manera cuantitativa usando un tiempo de reciclado total para asegurar una recuperación completa de cada señal (5 x tiempo de relajación longitudinal T1). Para confirmar el mecanismo de degradación de los polisacáridos capsulares MenA y MenX y, en consecuencia, para asignar los picos de RMN 31P, se adquirieron experimentos bidimensionales de correlación de enlaces múltiples heteronucleares (HMBC) 1H-31P en muestras de oligosacáridos MenA y MenX, previamente generadas por hidrólisis ácida en acetato de sodio 50 mM pH 4,8 (concentración de sacárido de ~ 10 mg/ml) a 73 °C durante ~ 2,5 horas y pH 4,0 a 80 °C durante ~ 5,5 horas (concentración de sacárido de ~ 2,5 mg/ml) respectivamente. El grado promedio de polimerización (GP promedio) de los oligosacáridos MenA y MenX fue ~12 y ~10 respectivamente, según se estimó mediante análisis de RMN 31P (véase el párrafo Experimentos de estabilidad más adelante). Estas muestras analíticas de RMN se prepararon solubilizando aproximadamente 10 mg de sacárido seco en 0,75 ml de óxido de deuterio (99,9 % de átomos de Deuterio - Aldrich), con un programa de pulso estándar. Se recopilaron 4.096 y 512 puntos de datos en la dimensión F2 y F1 respectivamente. Se acumularon 64 barridos antes de la transformación de Fourier para producir una resolución digital de 0,2 Hz y 5,0 Hz por punto en F2 y F1 respectivamente.
Análisis de HPLC: los análisis de HPLC se realizaron usando una columna CarboPac PA200 (4 mm x 250 mm; Dionex) con una columna de protección (4 mm x 50 mm; Dionex) conectada a un sistema ICS 3000 Dionex equipado con un detector amperométrico pulsado. Se usó tampón de NaOH 100 mM de nitrato de sodio 10 mM para el equilibrio de la columna y se utilizó un gradiente de tres etapas con una cantidad creciente de nitrato de sodio (NaOH 100 mM nitrato de sodio 10 mM, 250 mM, 500 mM durante 80, 15 y 3 min respectivamente) para la elución. Se utilizó un caudal de 0,4 ml/min durante toda el proceso de 120 min. Se inyectaron muestras de 20 pl a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml. El efluente se controló usando un detector electroquímico en el modo amperométrico de pulso con un electrodo de trabajo de oro y un electrodo de referencia de Ag/AgCl. Se aplicó una forma de onda de potencial cuádruple para los carbohidratos. Los datos cromatográficos resultantes se procesaron utilizando el software Chromeleon 6.8 (Dionex).
Experimentos de estabilidad: Se incubaron soluciones de polisacáridos MenA y MenX a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml en tampón de fosfato de potasio 100 mM pH 7,0 preparado con agua deuterada a 37 °C y 45 °C respectivamente. En diferentes momentos, se extrajeron muestras y se analizaron mediante RMN y HPLC. También se controló el pH en cada momento. Se controló el GP promedio de MenA y MenX para determinar la estabilidad del polisacárido. Los valores de GP promedio se calcularon mediante la integración de espectros de RMN 31P y se expresaron como [(Pde/Pme) 1], en el que Pde es la concentración molar del fosfodiéster en los grupos de cadena y Pme la concentración molar de los grupos terminales del fosfomonoéster. Los perfiles de HPLC también se evaluaron semicuantitativamente para confirmar la evaluación de estabilidad más precisa recopilada por el ensayo de RMN 31P.
Mecanismo de degradación de los polisacáridos MenA y MenX. Los datos de HMBC 1H-31P de RMN sobre el oligosacárido MenA, generado por hidrólisis ácida suave, se describen en la Figura 13 (a). Debido a la presencia de grupos O-acetilo en C3 y C4 de residuos de manosamina, se detectaron y asignaron varios sistemas de espín: (i) protón en C1 de residuos de 3- o 4-O-acetilados (H1-Pde)3/4OAc; (ii) protón en C1 de residuos des-O-acetilados (H1-Pde)desOAc; (iii) protón en C3 y C4 geminal de grupos O-acetilo (H3/H4-Pde)3/4OAc; (iv) protón en C2 de residuos 3-O-acetilados (H2-Pde)3OAc; (v) protón en C2 de residuos 4-O-acetilados (H2-Pde)4OAc; (vi) protón en C2 de residuos des-O-acetilados (H2-Pde)desOAc; (vii) protones en C5 y C6 de residuos 3- o 4-O-acetilados (H5/6-Pde)3/4OAc; (viii) protones en C3, C4, C5 y C6 de residuos des-O-acetilados (H3/4/5/6-Pde)desOAc. La unión del fosfato en C6, confirmada por los picos cruzados del fosfomonoéster al protón en C6 de los residuos 3- o 4-O-acetilados (H6-Pme)3/4OAc y al protón en C6 de los residuos des-O-acetilados (H6-Pme)desOAc, indicó que durante la hidrólisis el enlace fosfodiéster se escinde dejando un grupo fosfato unido al extremo no reductor, lo que es consistente con la menor estabilidad del enlace fosfato-Ci. Debido a que no se detectó ninguna otra correlación escalar de 1H-31P, no se produjo migración de fosfato que implicara grupos hidroxilo libres en C4 o C3 durante la hidrólisis. HMBC 1H-31P en los oligosacáridos MenX (Figura 13 (b)) también indicó que el enlace fosfato-Ci es menos estable y en este caso el extremo no reductor tiene un grupo fosfato unido en C4: el monoéster fosfato muestra una correlación cruzada solo con el protón en C4. También para MenX, no se produjo migración de fosfato que implicara grupos hidroxilo libres en C3 o C6 durante la hidrólisis. Se asignaron todos los sistemas de espín 31P, las señales del fosfodiéster y del fosfomonoéster a -1,40 y 4,65 ppm respectivamente. El perfil de RMN del protón se asignó también mediante la recolección del espectro desacoplado de 31P que reduce la estructura de los picos debido a este acoplamiento escalar. Todas las asignaciones de espectros estaban de acuerdo con los resultados publicados basados principalmente en el análisis de NMR 13C (referencia 30). Los cambios químicos de RMN 13C del polisacárido capsular MenX estaban de acuerdo con los datos publicados (referencia14), como se muestra en la Tabla 1 a continuación:
Tabla 1: Desplazamientos químicos de RMN 13C del polisacárido capsular MenX.
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Estabilidad térmica de los polisacáridos MenA y MenX. La degradación de los polisacáridos capsulares MenA y MenX, como consecuencia de la hidrólisis en los enlaces fosfodiéster, da como resultado fragmentos de GP promedio inferior que exponen grupos terminales de fosfomonoéster recién formados. En los experimentos de RMN, estos grupos fosfomonoéster generan una señal de resonancia de 31P en campos más altos que la originada por los grupos fosfodiéster internos, lo que permite el cálculo de GP promedio como se describió en los Experimentos de estabilidad más arriba. La variación de GP promedio durante el almacenamiento es un indicador de la estabilidad del polisacárido y, por lo tanto, el GP promedio de muestras de polisacáridos capsulares MenA y MenX, tomadas en diferentes momentos durante la exposición a 37 °C y 45 °C, se midió mediante RMN 31P (Tabla 2 y Figura 14 (a)): Tabla 2: GP promedio estimado por análisis de RMN 31P y valores de pH detectados en muestras de MenA y MenX en diferentes puntos de tiempo y temperaturas de 37 °C y 45 °C. También se informa el estado de O-acetilación del
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A la concentración de muestra utilizada, la sensibilidad de la técnica no permitió la medición del GP promedio en el tiempo cero para ambos polisacáridos, cuando el GP promedio es superior a 100. Para cada punto de tiempo de la muestra, el pH se mantuvo en el intervalo de 7,0 ± 0,1 (Figura 14 (b)).
A 37 °C, el polisacárido capsular MenA se degradó a un GP promedio de 22,9 después de 28 días de incubación, mientras que a 45 °C la degradación se aceleró con un GP promedio de 5,1 después de 21 días. En las mismas condiciones, el polisacárido capsular MenX no mostró degradación (GP promedio > 100 para todos los puntos de tiempo en ambas temperaturas de incubación; de acuerdo con la sensibilidad del ensayo, 100 es el valor máximo de GP promedio detectable). Los perfiles de HPLC del polisacárido capsular MenA incubados a 37 °C y 45 °C (Figura 15) mostraron progresivamente picos de intensidad aumentados de oligosacáridos más cortos que indicaban la despolimerización de las cadenas. En comparación, los perfiles de HPLC recolectados en todas las muestras de MenX permanecen prácticamente sin modificar con un pico ancho debido a los polisacáridos de cadena larga a aproximadamente 87 min, lo que además demuestra la mayor estabilidad de este carbohidrato. El análisis de RMN 1H confirmó que la incubación de polisacáridos capsulares MenA y MenX a 37 °Cy 45 °C no alteró la estructura de las unidades repetidas de polisacárido. Solo se observó una disminución limitada del nivel de O-acetilación (los grupos O-acetilo están presentes solo en el polisacárido capsular MenA), de 0,932 a 0,883 y 0,826 unidades de repetición mol/mol a 37 °C y 45 °C, respectivamente (Tabla 2 y Figura 14 (c)). Tomados en conjunto, estos datos de RMN y HPLC confirman la mayor estabilidad del polisacárido capsular MenX en comparación con el polisacárido capsular MenA en solución acuosa.
Estudio de estabilidad (2)
Materiales: Se prepararon conjugados de MenX-CRM197 de acuerdo con los procedimientos A, B y C anteriores. Los conjugados preparados de acuerdo con el procedimiento A contenían polisacáridos con un grado promedio de polimerización de 100. Otras características de este lote de conjugados se detallan a continuación:
Figure imgf000034_0002
Los conjugados preparados de acuerdo con el procedimiento B tenían las siguientes características:
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Los conjugados preparados de acuerdo con el procedimiento C contenían polisacáridos con un grado promedio de polimerización de 19. A continuación se detallan otras características de este lote de conjugados:
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Se realizaron estudios de estabilidad acelerada para proporcionar información preliminar sobre la estabilidad de estos conjugados. Los estudios de estabilidad se realizaron a 37 °C durante 28 días, los puntos de tiempo para la medición fueron cada 7 días (0, 7, 14, 21, 28 días). Las muestras se controlaron midiendo el sacárido libre liberado de los conjugados. La separación del sacárido libre se realizó mediante un cartucho SPE-C4 utilizando como tampón de elución ACN 10-20 % TFA 0,05 %. El sacárido total y libre se cuantificó mediante análisis HPAEC-PAD, lo que permitió calcular el % de sacárido libre. Los valores para los tres lotes de conjugado se dan a continuación:
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Los conjugados preparados usando el procedimiento A fueron más estables que los conjugados preparados por los procedimientos B y C.
Estudio analítico
Materiales: El polisacárido MenX se produjo mediante el crecimiento bacteriano de la cepa Neisseria meningitidis X5967 (ST 750) y se purificó mediante un procedimiento adaptado de la referencia 235. La pureza de la preparación de polisacárido se evaluó mediante la estimación del contenido residual de proteína y ácido nucleico usando ensayos colorimétricos (ambos estaban presentes con < 1 % p/p de sacárido) y contenido de endotoxinas utilizando el ensayo LAL (< 10 UE/pg de sacárido). La sal de acetato de sodio (Thermo Scientific Dionex), la solución de hidróxido de sodio al 50 % (J.T. Baker), el ácido trifluoroacético (Sigma) y el agua calidad MilliQ (Millipore) eran de calidad para análisis.
Métodos generales: Se midió el contenido total de fósforo de acuerdo con el procedimiento de la referencia 24. Las reacciones se controlaron mediante cromatografía en capa fina (TLC) sobre gel de sílice 60 F254 (Sigma Aldrich); después del examen bajo luz ultravioleta, los compuestos se visualizaron calentando con H2SO4 etanólico al 10 % (v/v). La cromatografía en columna se realizó utilizando cartuchos de sílice previamente empacados RediSep (Teledyne-Isco, 0,040-0,063 nm). A menos que se especifique lo contrario, se aplicó un gradiente de 0 ^ 100 % de la mezcla de elución en un instrumento Combiflash Rf (Teledyne-Isco).
Los experimentos de RMN de 1H, 13C y 31P se registraron en un espectrómetro Bruker Avance III de 400 MHz, equipado con un controlador de temperatura de alta precisión y usando una sonda de banda ancha de 5 mm (Bruker). Para la adquisición y procesamiento de datos se utilizó el software TopSpin versión 2.6 (Bruker).
Los espectros de r Mn 1H se recogieron a 25 ± 0,1 °C con 32k puntos de datos sobre un ancho espectral de 10 ppm. Los espectros se ponderaron con un ensanchamiento de línea de 0,2 Hz y transformada de Fourier. Los valores de desplazamiento químico se informaron en ppm, en relación con el Me4Si interno (0,00 ppm, CDCh) o la señal del disolvente (4,79 ppm, D2O). Los espectros de RMN de 13C se registraron a 100,6 MHz y 37 ± 0,1 °C, con 32k puntos de datos sobre una ancho espectral de 200 ppm. Los espectros se ponderaron con un ensanchamiento de línea de 0,2 Hz y transformada de Fourier. Los valores de desplazamiento químico se informaron en ppm en relación con la señal de CDCl3 (77,0 ppm, CDCl3).
Los espectros de RMN 31P se registraron a 161,9 MHz a 25 ± 0,1 °C, con 32k puntos de datos sobre un ancho espectral de 20 ppm. Los espectros se ponderaron con un ensanchamiento de línea de 3,0 Hz y una transformada de Fourier. Se utilizó ácido fosfórico al 85 % en óxido de deuterio como patrón externo (0 ppm).
Se midieron masas exactas mediante espectroscopia de corte de ionización por electroaspersión, usando un instrumento Q-Tof micro Macromass (Waters). La rotación óptica se midió con un polarímetro Jasco P-2000. Bencil 3,6-di-O-bencil-2-desoxi-2-ftalimido-p-D-glucopiranósido 3. El material de partida 2 (referencia 236) (1,8 g, 3,1 mmol) se disolvió en acetonitrilo (200 ml) bajo atmósfera de nitrógeno y se trató con trimetilaminoborano (1,4 g, 18,4 mmol) y BF3-Et2O (2,6 ml, 18,4 mmol) a 0 °C. Después de agitar durante 1 hora a 0 °C, se dejó que la mezcla alcanzara la temperatura ambiente, momento en el que se completó la reacción (TLC, ciclohexano-EtOAc 7:3). Se añadieron MeOH (3 ml) y trietilamina (3 ml) y la mezcla se concentró. El residuo se repartió con NaHCO3 acuoso y las capas orgánicas combinadas se concentraron y purificaron sobre gel de sílice (ciclohexano-EtOAc) para proporcionar 1,5 g del producto 3 (83 %). [a]o24= 1,9 (c 0,5, CHCl3). RMN 1H (CDCl3, 400 MHz): 8 = 7,80 - 6,95 (m, 19 H, Ph), 5,15 (d, 1 H, J128,0 Hz, H-1), 4,78, 4,47 (2 d, 2 H, 2J 12,2 Hz, C^Ph), 4,72, 4,51 (2 d, 2 H, 2J 12,0 Hz, C^Ph), 4,67, 4,59 (2 d, 2 H, 2J 12,0 Hz, CH2Ph), 4,26 - 4,18 (m, 2 H, H-2,3), 3,87 - 3,88 (m, 3 H, H-4,6), 3,66 - 3,62 (m, 1 H, H-5), 2,89 (d, 1 H, J2oh 2,3 Hz, OH-4), RMN 13C (CDCh, 100 MHz): 8 = 167,81 (CO), 138,15, 137,59, 137,10, 133,67, 131,61, 128,12, 127,91, 127,86, 127,81, 127,58, 127,40 (Ar), 97,35 (C-1), 78,49 (C-3), 74,37, 74,24 (CH2Ph), 73,78 (C-5), 73,45 (C-4), 70,80 (CH2Ph), 70,69 (C-6), 55,37 (C-2), ESI HR-MS (C35H33NO7): m / z = ([M+Na]+ encontrado 597,2547; calculado 597,2601); ([M+Na]+ encontrado 618,1895; calculado 618,1894).
B e n c i l 2 - a c e t a m i d o - 3 , 6 - d i - O - b e n c i l - 2 - d e s o x i - @ - D - g l u c o p i r a n ó s i d o 4. Una mezcla del compuesto N-ftalimido 3 (1 g, 1,7 mmol) en EtOH (20 ml), que contenía 1,2 ml de etilendiamina, se mantuvo a reflujo durante la noche. Después de que la TLC (tolueno-EtOAc 4:1) mostrara que la reacción se había completado, la mezcla se concentró y se volvió a disolver en EtOH-Ac2O 4:1 (25 ml). La mezcla se agitó durante 3 horas, luego se concentró. La cromatografía del residuo (ciclohexano-EtOAc) produjo 740 mg del monosacárido 4 , cuyos datos de RMN eran idénticos a los publicados recientemente en la bibliografía [237].
B e n c i l 2 - a c e t a m i d o - 3 , 6 - d i - O - b e n c i l - 4 -( 1 , 5 - d i h i d r o - 3 - o x o - 3 Á 5- 3 H - 2 , 4 , 3 - b e n z o d i o x a f o s f e p i n - 3 - i l ) - p - D - g l u c o p i r a n ó s i d o 5. Se añadió N,N-dietil-1,5-dihidro-3H-2,3,4-benzodioxafosfepin-3-amina (717 mg, 3 mmol) a una solución del monosacárido (500 mg, 1 mmol) en CH2Ch (9 ml) y 1H-tetrazol 0,45 M en acetonitrilo (9 ml) a 0 °C. Después de 10 min, se retiró el baño helado y se continuó agitando. Después de agitar durante 3 horas más, la reacción se completó (TLC, tolueno-EtOAc 1:1). La mezcla se enfrió a -20 °C y se añadió m-CPBA. Después de 20 min, se añadió algo de NaHCO3 acuoso para inactivarla. La mezcla se diluyó con CH2Cl2 y se extrajo en un embudo de decantación con NaHCO3 acuoso. Las capas orgánicas combinadas se concentraron y el residuo se purificó sobre gel de sílice (ciclohexano-EtOAc) para proporcionar 630 mg de producto (92 %). Cristales blancos de EtOAc, p.f.
159-160 °C. = [a]D24 = 34,7 (c 0,1, CHCh). RMN 1H (CDCla, 400 MHz): 8 = 7,41 - 7,12 (m, 18 H, Ph), 5,90 (d, 1 H, J127,6 Hz, H-1), 5,17 - 5,12 (m, 2 H, 2 CHPh), 5,00 - 4,78 (m, 4 H, 4 CHPh), 4,65 - 4,58 (m, 5 H, 4 CHPh, H-4), 4,32 (t, 1 H, J 9,0 Hz, H-3), 3,89 (d, 1 H, J6a,59,0 Hz, H-6a), 3,76 - 3,69 (m, 2 H, H-5,6b), 3,46 - 3,42 (m, 1 H, H-2), 1,80 (s, 3 H, CH3CO). RMN 13C (CDCla, 100 MHz): 8 = 170,61 (CO), 138,26, 137,36, 134,98, 128,94, 128,35, 127,95, 127,98, 127,80, 127,71, 127,57, 127,50 (Ar), 98,85 (C-1), 78,71 (C-3), 76,72 (C-4), 73,97 (C-5), 73,76, 73,42, 70,09 (CH2Ph), 69,04 (C-6), 68,30, 60,25 (CH2Ph), 56,95 (C-2), 23,40 (CH3CO). RMN 31P (CDCh, 162 MHz): 8 = 0,32. ES1HR-MS (C37H40NO9P): m/z = ([M+H]+ encontrado 674,2476; calculado 674,2519).
F o s f a t o d e 2 - a c e t a m i d o - 2 - d e s o x i - p - D - g l u c o p i r a n o s i l o 6. El monosacárido 5 protegido (100 mg, 0,15 mmol) se disolvió en MeOH (10 ml) y se hidrogenó sobre Pd/C al 10 % (30 mg). La mezcla se agitó durante 1 día, luego se filtró a través de una almohadilla de Celite. El disolvente se evaporó y el material crudo recuperado se purificó en un cartucho C-18 Isolute SPE. Las fracciones que contenían el azúcar se liofilizaron para obtener 42 mg de producto 6 espumoso (95 %), cuyos datos de RMN coincidían con los publicados en la bibliografía [238].
C r o m a t o g r a f í a d e i n t e r c a m b i o a n i ó n i c o d e a l t o r e n d i m i e n t o c o n d e t e c c i ó n a m p e r o m é t r i c a p u l s a d a ( H P A E C - P A D ) p a r a c u a n t iU c a c ió n d e M e n X : las muestras de MenX se trataron con TFA a una concentración final de 2 M diluida hasta un volumen total de 600 pl en el intervalo de 0,5 a 8 pg/ml. Las muestras se calentaron a 100 °C durante 2,5 horas en un tubo de ensayo cerrado con tapón de rosca, luego se enfriaron a 2-8 °C durante aproximadamente 30 minutos, se agregaron 700 pl de NaOH 2 M y se filtraron con filtros Acrodisc (PALL) de 0,45 pm antes del análisis. Se utilizó una preparación pura de PS MenX o el monómero sintético 4-GlcNAc-4P, titulado mediante el procedimiento colorimétrico para el contenido total de fósforo, para construir la curva de calibración, configurada con estándares en el intervalo de 0,5-8 pg/ml. Se realizó la HPAEC-PAD con un Dionex ICS3000 equipado con una columna CarboPac PA1 (4 x 250 mm; Dionex) acoplada con una columna de protección PA1 (4 x 50 mm; Dionex). Las muestras se corrieron con un caudal de 1 ml/min, usando un gradiente en 10 minutos de AcONa 100 mM a 500 mM en NaOH 100 mM. El efluente se controló usando un detector electroquímico en el modo amperométrico de pulso con un electrodo de trabajo de oro y un electrodo de referencia de Ag/AgCl. Se aplicó una forma de onda de potencial cuádruple para los carbohidratos. Los datos cromatográficos resultantes se procesaron utilizando el software Chromeleon 6.8.
H i d r ó l i s i s á c i d a d e l p o l i s a c á r i d o M e n X y G l c N A c - 4 P y c a r a c t e r i z a c i ó n p o r R M N : Se llevó a cabo una hidrólisis ácida a gran escala sobre el polisacárido MenX y sobre el monómero sintético (10 mg). Ambas muestras se disolvieron en 2 ml de TFA 2 M y se hidrolizaron a 100 °C durante 2,5 horas. Las muestras se secaron y se intercambiaron con D2O tres veces antes del análisis.
S e l e c c i ó n d e l a s c o n d i c i o n e s d e h i d r ó l i s i s : Para identificar las condiciones óptimas para la hidrólisis de MenX capaces de liberar completamente las subunidades monoméricas y minimizar su degradación, se exploraron diferentes tiempos de reacción para la hidrólisis del polisacárido MenX (de 1 a 6 horas) realizando la hidrólisis en TFA 2 M a 100 °C. Se utilizó una preparación pura de polisacárido MenX, titulada mediante el procedimiento colorimétrico para el contenido de fósforo total, en dos concentraciones diferentes (0,5 y 2 pg/ml). Se detectó un pico prevalente mediante el análisis HPAEC-PAD. El área del pico aumentó con el tiempo, con un máximo entre dos y tres horas, antes de disminuir durante tiempos más prolongados. Finalmente, se seleccionaron 2,5 horas como tiempo óptimo de hidrólisis.
La linealidad del procedimiento se verificó en el intervalo de 0,5 a 8 pg/ml (R2 = 99,807). El procedimiento se aplicó con éxito a los compuestos intermedios del procedimiento de purificación, incluidos los caldos de fermentación, y para determinar la precisión del procedimiento se realizó un estudio de recuperación. Se agregaron cantidades conocidas de polisacárido a muestras estándar que se sometieron al análisis. La recuperación se calculó con base en la diferencia entre la concentración total determinada para las muestras enriquecidas y la concentración encontrada en las muestras sin enriquecer. La recuperación media osciló entre el 98 y el 102 %, lo que indica un alto grado de precisión. El interanálisis de repetibilidad se realizó analizando la misma muestra cuatro veces con un CV del 1 % y un CV promedio correspondiente del 0,5 %.
Síntesis de 4P-GlcNAc: Como se muestra en el Esquema 1, la síntesis del compuesto 6 objetivo comenzó a partir de la apertura regioselectiva del anillo de GlcN 2 protegido (92 % de rendimiento), que se preparó a partir de clorhidrato de galactosamina como se describe en la referencia 236. Eliminación de la protección de N-ftalimido mediante etilendiamina, seguida de N-acetilación selectiva proporcionó el compuesto 4 conocido con un rendimiento del 87 % [237]. La reacción de 4 con N,N-dietil-1,5-dihidro-3H-2,3,4-benzodioxafosfepin-3-amina y 1H-tetrazol y la posterior oxidación con ácido m-cloroperbenzoico (m-CPBA) permitió la introducción del grupo fosfato con un rendimiento significativamente mayor que el informado previamente con otros procedimientos [238] y proporcionó el compuesto 5 cristalino estable durante el almacenamiento (pf 159-160 °C). Un pico de fosfomonoéster a 0,32 ppm en el espectro de RMN 31P, que se correlacionó con la señal H-4 a 4,58 ppm y dos pares de sistemas CH (5,13, 4,98 y 5,14, 4,99 ppm respectivamente) en el espectro de RMN de HMBC 1H-31P permitió evaluar la estructura de 5. Finalmente, la hidrogenólisis sobre Pd/C al 10 % proporcionó el 4P-GlcNAc 6 objetivo con un rendimiento excelente (95 %) con respecto al rendimiento del 50 % obtenido cuando estaba presente fosfato desprotegido. Los datos de RMN del producto final concordaron bien con los publicados en la bibliografía [239].
Figure imgf000037_0001
Esquema 1. a. Ref. 236; b. trimetilaminoborano, BF3-Et2O, CH3CN, 0 °C, 83 %; c. H2NCH2CH2NH2, EtOH, reflujo; Ac2O, piridina, 87 % (en 2 etapas); d. N,N-dietil-1,5-dihidro-3H-2,3,4-benzodioxafosfepin-3-amina, 1H-tetrazol, CH2Cl2; m-CPBA, CH2Ch, H2O, 92 %; e. H2, Pd/C al 10 %, 95 %.
Caracterización por RMN de los productos formados por hidrólisis ácida del polisacárido MenX o 4P-GlcNAc: el polisacárido MenX y el monómero 6 sintético se hidrolizaron a mayor escala de acuerdo con el procedimiento optimizado para el análisis HPAEC-PAD con el fin de confirmar la estructura de la especie resultante por análisis de RMN. En ambos casos se evaluó la 4P-GlcNH como especie prevalente.
El espectro de RMN 1H de 4P-GlcNAc 6 mostró los picos anoméricos a/p a 5,19 y 4,72 ppm respectivamente, y las señales de protones en el intervalo de 4,00 - 3,69 ppm. Se asignaron H-2a y H-2p a señales de 3,91 ppm y 3,72 ppm mediante correlación de RMN COSY homonuclear. Se detectó un solo pico para el monoéster de fosfato a 0,58 ppm en la RMN 31P.
Después de la hidrólisis tanto del estándar 6 como del PS MenX nativo, el análisis de RMN 1H de la 4P-GlcN obtenida mostró dos señales anoméricas principales correspondientes a mezclas a/p en la relación de 5,5:4,5 y 6,7: 3,3 a 5,40 y 4,92 ppm, respectivamente. Las señales de protones del anillo restantes cayeron entre 4,08 y 3,44 ppm, mientras que H-2a (dd, J 3,7 y 10,3 Hz, a 3,91 ppm) y H-2p (dd, J 8,5 y 10,5 Hz, a 3,06 ppm) se desplazaron campo arriba debido a la pérdida del grupo acetilo. Además, no se detectaron señales de N-acetil CH3 lo que indica que la hidrólisis dio como resultado la des-N-acetilación total.
La RMN de HMBC 1H-31P bidimensional evidenció dos picos cruzados superpuestos, asignados a las señales de monoéster de fosfato a 0,68 y 0,14 ppm del espectro de RMN 31P, que se correlacionan con H-4a y H-4p a 3,94 y 3,96 ppm, respectivamente, en la RMN 1H.
Uso de 4P-GlcNAc como estándar para la cuantificación de MenX por HPAEC-PAD: El monómero 6 sintético se cuantificó mediante el procedimiento colorimétrico para el contenido de fósforo total y luego se usó para construir una curva de calibración (en el intervalo 0,5-8 pg/ml) en comparación con el polisacárido MenX nativo. Después de someter el monómero sintético y el polisacárido nativo a las mismas condiciones de hidrólisis optimizadas para muestras de polisacárido MenX, se detectó el mismo pico por HPAEC-PAD y las curvas obtenidas se superpusieron perfectamente. La concentración de muestras desconocidas y compuestos intermedios del procedimiento de purificación de polisacáridos fue consistente independientemente de la curva utilizada para la cuantificación (la diferencia en los valores de concentración de sacáridos fue < 2 % para todas las muestras analizadas). También se analizaron mezclas de polisacárido MenX hidrolizado y monómero sintético mediante HPAEC-PAD en una columna CarboPac PA1, eluyendo con hidróxido de sodio 10 mM, para verificar la eventual formación de GlcN en las condiciones de hidrólisis utilizadas [26]. La formación de GlcN fue inferior al 5 % en moles tanto para muestras de monómero de MenX nativo como sintético.
También se verificó la posibilidad de usar la glucosamina-6-fosfato (6P-GlcN) disponible comercialmente como estándar para el análisis, usando las mismas condiciones de hidrólisis optimizadas para MenX. La curva de calibración resultante se superpuso a las obtenidas con MenX nativo y su monómero sintético, pero el tiempo de elución del pico resultante detectado por HPAEC-PAD fue diferente (8,97 min frente a 9,88 min para MenX), lo que demuestra que la utilización de 4P-GlcNAc es más sencilla.
Este procedimiento para la cuantificación de polisacáridos MenX es una herramienta analítica crucial para controlar el contenido de sacáridos de los compuestos intermedios del procedimiento de purificación y una vacuna conjugada final. Además de permitir calcular el rendimiento del procedimiento, la cuantificación permite calcular la relación sacárido/proteína del conjugado y el % de sacárido libre, ambos parámetros importantes para verificar la calidad y consistencia de una formulación de vacuna final.
El uso de un monómero sintético significa que no hay necesidad de estandarizar un lote de polisacárido para el análisis. El procedimiento general es rápido, permite la detección de concentraciones muy bajas de azúcar (> 0,5 |jg/ml de polisacárido), con una limpieza mínima de la muestra y se ha verificado que funciona bien para la caracterización de compuestos intermedios del procedimiento de purificación, incluidos los caldos de fermentación. El procedimiento puede ser adecuado para la cuantificación de compuestos intermedios de los procedimientos de conjugación y para la caracterización de las formulaciones finales de la vacuna.
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunogénica que comprende un conjugado de un polisacárido capsular del serogrupo X de Neisseria meningitidis y una proteína portadora, en la que el acoplamiento del polisacárido capsular a la proteína portadora es directo.
2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que el polisacárido capsular es un oligosacárido y en la que el grado promedio final de polimerización (GP) en el oligosacárido está entre 20 y 200.
3. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 o 2, en la que la proteína portadora es un toxoide de la difteria o del tétanos, CRM197 o proteína D.
4. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 o 2, en la que la proteína portadora comprende un antígeno spr0096 y un antígeno spr2021.
5. La composición inmunogénica de cualquier reivindicación anterior, que comprende además uno o más antígenos adicionales.
6. La composición inmunogénica de la reivindicación 5, que además comprende un polisacárido capsular del serogrupo A de Neisseria meningitidis conjugado opcionalmente con una molécula portadora.
7. La composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la composición está en una formulación acuosa.
8. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el conjugado se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de: (a) oxidar un grupo hidroxilo primario en el polisacárido capsular, para obtener un polisacárido oxidado con un grupo aldehído; y (b) acoplar el polisacárido oxidado a la proteína portadora a través del grupo aldehído, obteniendo así el conjugado.
9. La composición inmunogénica de la reivindicación 8, en la que la oxidación en la etapa (a) es del grupo hidroxilo primario entre el 1 y el 10 % de los residuos en el polisacárido capsular.
10. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el conjugado se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de: (a) aminación reductora del extremo reductor del polisacárido capsular, para obtener un polisacárido modificado con un grupo de la amina primaria unido al átomo C-1 de la subunidad terminal por un enlace covalente; y (b) acoplar el polisacárido modificado a la proteína portadora a través del grupo de la amina primaria, obteniendo así el conjugado.
11. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el conjugado se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de: (a) reducción del extremo reductor del polisacárido capsular, para obtener un polisacárido modificado con dos grupos hidroxilo vecinos en ese extremo; (b) escisión oxidativa de los grupos hidroxilo vecinos, para obtener un polisacárido modificado adicionalmente con un grupo aldehído en el extremo; (c) aminación reductora del grupo aldehído, para obtener un polisacárido modificado adicionalmente con un grupo de la amina primaria en el extremo y (d) acoplar el polisacárido modificado adicionalmente a la proteína portadora a través del grupo de la amina primaria, obteniendo así el conjugado.
12. Una vacuna que comprende la composición inmunogénica de cualquier reivindicación anterior.
13. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o la vacuna de la reivindicación 12 para su uso en un procedimiento para generar una respuesta inmune en un mamífero que comprende administrar al mamífero la composición inmunogénica.
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