ES2677358T3 - Composiciones inmunogénicas - Google Patents

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ES2677358T3
ES2677358T3 ES11768149.4T ES11768149T ES2677358T3 ES 2677358 T3 ES2677358 T3 ES 2677358T3 ES 11768149 T ES11768149 T ES 11768149T ES 2677358 T3 ES2677358 T3 ES 2677358T3
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gbs
iii
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Mario Contorni
Paolo Costantino
Oretta Finco
Guido Grandi
Domenico Maione
John Telford
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GlaxoSmithKline Biologicals SA
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Abstract

Una composición inmunogénica que comprende: (a) un producto conjugado que es un sacárido capsular de serotipo Ia del Grupo B de Streptococcus conjugado con una proteína portadora; (b) un producto conjugado que es un sacárido capsular de serotipo Ib del Grupo B de Streptococcus conjugado con una proteína portadora; y (c) un producto conjugado que es un polisacárido capsular de serotipo III del Grupo B de Streptococcus conjugado con una proteína portadora en donde (i) cada sacárido capsular de GBS está presente en una cantidad de aproximadamente 5 μg, 10 μg o 20 μg por dosis unitaria, (ii) la proteína portadora en (a), (b) y (c) es toxoide diftérico o CRM197 y (iii) la composición inmunogénica no contiene un coadyuvante de sal de aluminio.

Description

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10
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20
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DESCRIPCION
Composiciones inmunogenicas Campo tecnico
Esta invencion pertenece al campo de las composiciones inmunogenicas que comprenden productos conjugados de sacaridos capsulares de Streptococcus agalactiae y protemas portadoras. Las composiciones son utiles para la inmunizacion.
Tecnica anterior
Los sacaridos capsulares de bacterias se han utilizado durante muchos anos en vacunas contra bacterias encapsuladas. Puesto que los sacaridos son antigenos independientes de celulas T, sin embargo, son poco inmunogenicos. La conjugacion con un portador puede convertir los antigenos independientes de celulas T en antigenos dependientes de celulas T, mejorando asf las respuestas de memoria y permitiendo que se desarrolle inmunidad protectora. Las vacunas de sacaridos mas eficaces se basan, por lo tanto, en productos glicoconjugados, y la vacuna de producto conjugado prototipo era contra Haemophilus influenzae tipo b ('Hib') [p.ej. vease el capftulo 14 de la ref. 84].
Otra bacteria para la cual se han descrito vacunas de producto conjugado es Streptococcus agalactiae, tambien conocido como 'estreptococo del grupo B', o simplemente como 'GBS'. La mayor parte de este trabajo ha sido realizado por Dennis Kasper y colaboradores, y se describe en documentos tales como las referencias 1 a 9. Se ha demostrado que las vacunas de producto conjugado para cada uno de los serotipos la, Ib, II, III y V de GBS son seguras e inmunogenicas en seres humanos [10]. Lancaster et al. [283] describe ensayos en ratones de una vacuna de producto conjugado de GBS que incluye polisacaridos de los serotipos Ia, Ib y III de GBS. Paoletti et al. [203] describen una composicion tetravalente que comprende polisacaridos capsulares de los serotipos Ia, Ib, II y III GBS conjugados con toxoide tetanico. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de vacunas de producto conjugado de GBS adicionales y mejoradas.
Descripcion de la invencion
En un primer aspecto, la invencion proporciona una composicion inmunogenica que comprende (a) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ia de GBS conjugado con una protema portadora; (b) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ib de GBS conjugado con una protema portadora; y (c) un producto conjugado que es un polisacarido capsular de serotipo III de GBS conjugado con una protema portadora en donde (i) cada sacarido capsular de GBS esta presente en una cantidad de aproximadamente 5 |jg, l0 |jg o 20 |jg por dosis unitaria, (ii) la protema portadora en (a), (b) y (c) es toxoide difterico o CRM197 y (iii) la composicion inmunogenica no contiene un coadyuvante de sal de aluminio. Las composiciones se pueden utilizar como vacunas para prevenir la infeccion por estos serotipos de GBS.
En un segundo aspecto, la invencion proporciona composiciones inmunogenicas del primer aspecto para su uso como un medicamento, una vacuna y en un metodo para inmunizar a un paciente contra la infeccion por GBS que comprende la etapa de administracion al paciente, en donde el paciente ha sido preinmunizado con un toxoide difterico o derivado del mismo.
Composiciones inmunogenicas
A continuacion se describen realizaciones de la invencion que comprenden tres o cuatro productos conjugados. De estas composiciones, los autores de la presente invencion han descubierto que las composiciones que comprenden un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ib de GBS conjugado con una protema portadora pueden conferir proteccion contra el serotipo Ia de GBS ademas del serotipo Ib de GBS. Esta observacion contrasta con la ensenanza de la referencia 11, que sugiere que los productos conjugados de tipo Ib no son capaces de inducir anticuerpos que puedan destruir bacterias de tipo Ia. Por consiguiente, las realizaciones descritas a continuacion que comprenden un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ib de GBS conjugado con una protema portadora pueden ser ventajosas ya que proporcionan una mejor proteccion contra el serotipo Ia (cuando la composicion tambien comprende un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ia de GBS conjugado con una protema portadora).
Las composiciones inmunogenicas comprenden tres productos conjugados. El primer producto conjugado es un sacarido capsular de serotipo Ia de GBS conjugado con una protema portadora, mientras que el segundo producto conjugado es un sacarido capsular de serotipo Ib de GBS conjugado con una protema portadora y el tercer conjugado es un sacarido capsular de serotipo III de GBS conjugado con una protema portadora. Los autores de la presente invencion han descubierto que tales composiciones (p.ej., como se ilustra a continuacion) son particularmente adecuadas para su uso como vacunas para prevenir la infeccion por GBS.
Las composiciones inmunogenicas pueden comprender cuatro productos conjugados. En una realizacion, el primer producto conjugado es un sacarido capsular de serotipo Ia de GBS conjugado con una protema portadora, mientras
10
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que el segundo producto conjugado es un sacarido capsular de serotipo Ib de GBS conjugado con una protema portadora, el tercer conjugado es un sacarido capsular de serotipo III de GBS conjugado con una protema portadora y el cuarto conjugado es un sacarido capsular de serotipo V de GBS conjugado con una protema portadora.
Tfpicamente, las composiciones inmunogenicas descritas anteriormente no comprenderan ningun producto conjugado distinto de los espedficamente mencionados, particularmente productos conjugados que comprenden sacaridos capsulares de serotipos de GBS distintos de los mencionados espedficamente. Sin embargo, en algunas realizaciones, las composiciones pueden comprender otros productos conjugados, incluyendo productos conjugados que comprenden sacaridos capsulares de otros serotipos de GBS. Por ejemplo, las composiciones pueden comprender un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo II de GBS conjugado con una protema portadora. De forma similar, las composiciones pueden comprender un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo VI de GBS conjugado con una protema portadora. En otra posibilidad, las composiciones pueden comprender un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Viii de GBS conjugado con una protema portadora.
Tambien se describen composiciones inmunogenicas que comprenden cantidades del sacarido o los sacaridos capsular es de 0,1 a 50 |jg por dosis unitaria. Tfpicamente, cada sacarido capsular de GBS esta presente en una cantidad de 1 a 30 jg, por ejemplo de 2 a 25 jg, y en particular de 5 a 20 jg. Cantidades adecuadas del sacarido o los sacaridos capsulares pueden incluir 5, l0 y 20 jg por dosis unitaria, particularmente cuando la composicion inmunogenica comprende sacaridos capsulares de los serotipos, Ia, Ib y III de GBS. Por lo tanto, las cantidades adecuadas por dosis unitaria de cada sacarido capsular pueden seleccionarse entre las opciones numeradas en las siguientes tablas, en donde la realizacion relevante se indica mediante la referencia al serotipo o los serotipos de los que derivan el sacarido o los sacaridos capsulares en la composicion:
Tabla C - Composiciones inmunogenicas que comprenden tres productos conjugados
Opcion de dosificacion
Realizacion
la, Ib y III
Ia, Ib y V Ia, III y V Ib, III y V
1
Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ib: 5 jg
Ib: 5 jg
Ib: 5 jg
III: 5jg III: 5jg
III: 5jg
V: 5jg V: 5jg V: 5jg
2
Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ib: 5 jg
Ib: 5 jg
Ib: 5 jg
III: 5jg III: 5 jg
III: 10 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
3
Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ib: 5 jg
Ib: 5 jg
Ib: 5 jg
III: 5 jg III: 5 jg
III: 20jg
V: 20jg V: 20jg V: 20jg
4
Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ib: 5 jg
Ib: 10 jg
Ib: 10 jg
III: 10 jg III: 10 jg
III: 5jg
V: 5jg V: 5jg V: 5jg
5
Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ib: 5 jg
Ib: 10 jg
Ib: 10 jg
III: 10 jg III: 10 jg
III: 10 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
6
Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ib: 5 jg
Ib: 10 jg
Ib: 10 jg
III: 10 jg III: 10 jg
III: 20 jg
V: 20 jg V: 20 jg V: 20 jg
7
Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ib: 5 jg
Ib: 20 jg
Ib: 20 jg
III: 20 jg III: 20 jg
III: 5 jg
V: 5 jg V: 5 jg V: 5 jg
8
Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ia: 5 jg Ib: 5 jg
Opcion de dosificacion
Realizacion
la, Ib y III
Ia, Ib y V Ia, III y V Ib, III y V
Ib: 20 pg
Ib: 20 Mg III: 20 Mg III: 20 Mg
III: 10 Mg
V: 10 Mg V: 10 Mg V: 10 Mg
9
la: 5 Mg Ia: 5 Mg Ia: 5 Mg Ib: 5 Mg
Ib: 20 Mg
Ib: 20 Mg
III: 20 Mg III: 20 Mg
III: 20 Mg
V: 20 V: 20 V: 20 Mg
10
Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ib: 10 Mg
Ib: 5 Mg
Ib: 5 Mg
III: 5 Mg III: 5 Mg
III: 5 Mg
V: 5 Mg V: 5 Mg V: 5 Mg
11
Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ib: 10 Mg
Ib: 5 Mg
Ib: 5 Mg
III: 5 Mg III: 5 Mg
III: 10 Mg
V: 10 Mg V: 10 Mg V: 10 Mg
12
Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ib: 10 Mg
Ib: 5 Mg
Ib: 5 Mg
III: 5 Mg III: 5 Mg
III: 20 Mg
V: 20 Mg V: 20 Mg V: 20 Mg
13
Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ib: 10 Mg
Ib: 10 Mg
Ib: 10 Mg
III: 10 Mg III: 10 Mg
III: 5 Mg
V: 5 Mg V: 5 Mg V: 5 Mg
14
Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ib: 10 Mg
Ib: 10 Mg
Ib: 10 Mg
III: 10 Mg III: 10 Mg
III: 10 Mg
V: 10 Mg V: 10 Mg V: 10 Mg
15
Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ib: 10 Mg
Ib: 10 Mg
Ib: 10 Mg
III: 10 Mg III: 10 Mg
III: 20 Mg
V: 20 V: 20 Mg V: 20 Mg
16
Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ib: 10 Mg
Ib: 20 Mg
Ib: 20 Mg
III: 20 Mg III: 20 Mg
III: 5 Mg
V: 5 Mg V: 5 Mg V: 5 Mg
17
Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ib: 10 Mg
Ib: 20 Mg
Ib: 20 Mg
III: 20 Mg III: 20 Mg
III: 10 Mg
V: 10 Mg V: 10 Mg V: 10 Mg
18
Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ia: 10 Mg Ib: 10 Mg
Ib: 20 Mg
Ib: 20 Mg
III: 20 Mg III: 20 Mg
III: 20 Mg
V: 20 Mg V: 20 Mg V: 20 Mg
19
Ia: 20 Mg Ia: 20 Mg Ia: 20 Mg Ib: 20 Mg
Ib: 5 Mg
Ib: 5 Mg
III: 5 Mg III: 5 Mg
III: 5 Mg
V: 5 Mg V: 5 Mg V: 5 Mg
20
Ia: 20 Mg Ia: 20 Mg Ia: 20 Mg Ib: 20 Mg
Ib: 5 Mg
Ib: 5 Mg
III: 5 Mg III: 5 Mg
Opcion de dosificacion
Realizacion
la, Ib y III
Ia, Ib y V Ia, III y V Ib, III y V
Ill: 10 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
21
la: 20 jg la: 20 jg la: 20 jg lb: 20 jg
lb: 5 jg
lb: 5 jg
lll: 5 jg lll: 5 jg
lll: 20 jg
V: 20 jg V: 20 jg V: 20 jg
22
la: 20 jg la: 20 jg la: 20 jg lb: 20 jg
lb: 10 jg
lb: 10 jg
lll: 10 jg lll: 10 jg
lll: 5 jg
V: 5 jg V: 5 jg V: 5 jg
23
la: 20 jg la: 20 jg la: 20 jg lb: 20 jg
lb: 10 jg
lb: 10 jg
lll: 10 jg lll: 10 jg
lll: 10 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
24
la: 20 jg la: 20 jg la: 20 jg lb: 20 jg
lb: 10 jg
lb: 10 jg
lll: 10 jg lll: 10 jg
lll: 20 jg
V: 20 jg V: 20 jg V: 20 jg
25
la: 20 jg la: 20 jg la: 20 jg lb: 20 jg
lb: 20 jg
lb: 20 jg
lll: 20 jg lll: 20 jg
lll: 5 jg
V: 5 jg V: 5 jg V: 5 jg
26
la: 20 jg la: 20 jg la: 20 jg lb: 20 jg
lb: 20 jg
lb: 20 jg
lll: 20 jg lll: 20 jg
lll: 10 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
27
la: 20 jg la: 20 jg la: 20 jg lb: 20 jg
lb: 20 jg
lb: 20 jg
lll: 20 jg lll: 20 jg
lll: 20 jg
V: 20 jg V: 20 jg V: 20 jg
De las opciones de dosificacion descritas en la Tabla C, los autores de la presente invencion han descubierto que las opciones 1, 14 y 27 son eficaces, cuando la composicion inmunogenica comprende: a) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo la de GBS conjugado con una protema portadora; b) un producto conjugado que 5 es un sacarido capsular de serotipo lb de GBS conjugado con una protema portadora; y c) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ill de gBs conjugado con una protema portadora. Por lo tanto, estas opciones de dosificacion son preferidas para su uso en la invencion, particularmente para esta realizacion. Puede ser ventajoso minimizar la cantidad total de sacarido o sacaridos capsulares por dosis unitaria para reducir la posible toxicidad. Por consiguiente, la opcion de dosificacion 1 es particularmente preferida.
10 Es posible minimizar adicionalmente la cantidad de sacarido o sacaridos capsulares por dosis unitaria. Por lo tanto, tambien se describen cantidades de sacarido o sacaridos capsulares de 0,1 a 5 |jg por dosis unitaria. Por ejemplo, una cantidad de 0,1 a 5 jg, p.ej. 0,5, 2,5 o 5 jg, por dosis unitaria, por ejemplo, cada sacarido capsular de GBS puede estar presente en una cantidad de 0,5 a 5 jg, 1 a 4 jg, 2 a 3 jg, o aproximadamente 2,5 jg por dosis unitaria. Tales cantidades por dosis unitaria de cada sacarido capsular se describen en la tabla a continuacion:
Tabla C '- Composiciones inmunogenicas que comprenden sacaridos capsulares de los serotipos la, Ib y III de GBS
Opcion de dosificacion
Cantidad de sacarido capsular por dosis unitaria (pg)
I a
Ib III
1
0,5 0,5 0,5
2
0,5 0,5 2,5
3
0,5 0,5 5
4
0,5 2,5 0,5
5
0,5 2,5 2,5
6
0,5 2,5 5
7
0,5 5 0,5
8
0,5 5 2,5
9
0,5 5 5
10
2,5 0,5 0,5
11
2,5 0,5 2,5
12
2,5 0,5 5
13
2,5 2,5 0,5
14
2,5 2,5 2,5
15
2,5 2,5 5
16
2,5 5 0,5
17
2,5 5 2,5
18
2,5 5 5
19
5 0,5 0,5
20
5 0,5 2,5
21
5 0,5 5
22
5 2,5 0,5
23
5 2,5 2,5
24
5 2,5 5
Opcion de dosificacion
Cantidad de sacarido capsular por dosis unitaria (pg)
I a
Ib III
25
5 5 0,5
26
5 5 2,5
27
5 5 5
De las opciones de dosificacion descritas en la Tabla C', los autores de la presente invencion contemplan en particular las opciones 1, 14 y 27. En estas opciones, la cantidad de cada sacarido capsular de GBS es la misma (p.ej., en las composiciones con dosis mas altas ilustradas a continuacion).
5 Tabla D - Composiciones inmunogenicas que comprenden cuatro conjugados
Realizacion - Ia, Ib, III y V
Opcion de dosificacion
Opcion de dosificacion Opcion de dosificacion
la: 5 |jg la: 10 jg la: 20 jg
1
Ib: 5 jg 28 Ib: 5 jg 55 Ib: 5 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
V: 5 jg V: 5 jg V: 5 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
2
Ib: 5 jg 29 Ib: 5 jg 56 Ib: 5 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
3
Ib: 5 jg 30 Ib: 5 jg 57 Ib: 5 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
V: 20 jg V: 20 jg V: 20 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
4
Ib: 5 jg 31 Ib: 5 jg 58 Ib: 5 jg
Ill: 10 jg
Ill: 10 jg
Ill: 10 jg
V: 5 jg V: 5 jg V: 5 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
5
Ib: 5 jg 32 Ib: 5 jg 59 Ib: 5 jg
Ill: 10 jg
Ill: 10 jg
Ill: 10 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
6
Ib: 5 jg 33 Ib: 5 jg 60 Ib: 5 jg
Ill: 10 jg
Ill: 10 jg
Ill: 10 jg
V: 20 jg V: 20 jg V: 20 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
7
Ib: 5 jg 34 Ib: 5 jg 61 Ib: 5 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
V: 5 jg V: 5 jg V: 5 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
8
Ib: 5 jg 35 Ib: 5 jg 62 Ib: 5 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
9
Ib: 5 jg 36 Ib: 5 jg 63 Ib: 5 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
V: 20 jg V: 20 jg V: 20 jg
Realizacion - la, Ib, III y V
Opcion de dosificacion
Opcion de dosificacion Opcion de dosificacion
la: 5 |jg la: 10 jg la: 20 jg
10
Ib: 10 jg 37 Ib: 10 jg 64 Ib: 10 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
V: 5 jg V: 5 jg V: 5 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
11
Ib: 10 jg 38 Ib: 10 jg 65 Ib: 10 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
12
Ib: 10 jg 39 Ib: 10 jg 66 Ib: 10 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
V: 20 jg V: 20 jg V: 20 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
13
Ib: 10 jg Ill: 10 jg 40 Ib: 10 jg Ill: 10 jg 67 Ib: 10 jg Ill: 10 jg
V: 5 jg V: 5 jg V: 5 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
14
Ib: 10 jg 41 Ib: 10 jg 68 Ib: 10 jg
Ill: 10 jg
Ill: 10 jg
Ill: 10 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
15
Ib: 10 jg Ill: 10 jg 42 Ib: 10 jg Ill: 10 jg 69 Ib: 10 jg Ill: 10 jg
V: 20 jg V: 20 jg V: 20 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
16
Ib: 10 jg 43 Ib: 10 jg 70 Ib: 10 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
V: 5 jg V: 5 jg V: 5 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
17
Ib: 10 jg 44 Ib: 10 jg 71 Ib: 10 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
18
Ib: 10 jg 45 Ib: 10 jg 72 Ib: 10 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
V: 20 jg V: 20 jg V: 20 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
19
Ib: 20 jg 46 Ib: 20 jg 73 Ib: 20 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
V: 5 jg V: 5 jg V: 5 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
20
Ib: 20 jg 47 Ib: 20 jg 74 Ib: 20 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
21
Ib: 20 jg 48 Ib: 20 jg 75 Ib: 20 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
Ill: 5 jg
V: 20 jg V: 20 jg V: 20 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
22
Ib: 20 jg Ill: 10 jg 49 Ib: 20 jg Ill: 10 jg 76 Ib: 20 jg Ill: 10 jg
V: 5 jg V: 5 jg V: 5 jg
Realizacion - la, Ib, III y V
Opcion de dosificacion
Opcion de dosificacion Opcion de dosificacion
la: 5 |jg la: 10 jg la: 20 jg
23
Ib: 20 jg 50 Ib: 20 jg 77 Ib: 20 jg
Ill: 10 jg
Ill: 10 jg
Ill: 10 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
24
Ib: 20 jg 51 Ib: 20 jg 78 Ib: 20 jg
Ill: 10 jg
Ill: 10 jg
Ill: 10 jg
V: 20 jg V: 20 jg V: 20 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
25
Ib: 20 jg 52 Ib: 20 jg 79 Ib: 20 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
V: 5 jg V: 5 jg V: 5 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
26
Ib: 20 jg Ill: 20 jg 53 Ib: 20 jg Ill: 20 jg 80 Ib: 20 jg Ill: 20 jg
V: 10 jg V: 10 jg V: 10 jg
la: 5 jg la: 10 jg la: 20 jg
27
Ib: 20 jg 54 Ib: 20 jg 81 Ib: 20 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
Ill: 20 jg
V: 20 jg V: 20 jg V: 20 jg
La razon de la masa de un sacarido capsular dado con respecto a la masa del otro o los otros sacaridos capsulares puede variar. Las razones adecuadas (p/p) para cada sacarido capsular se describen como opciones numeradas en las siguientes tablas:
5 Tabla F - Composiciones inmunogenicas que comprenden tres conjugados
Opcion de proporcion
Realizacion
Ia: Ib: III
1
1:1:1
2
1:1:2
3
1:1:4
4
1:2:1
5
1:2:2
6
1:2:4
7
1:4:1
8
1:4:2
9
1:4:4
10
2:1:1
11
2:1:2
12
2:1:4
13
2:2:1
14
2:4:1
15
4:1:1
16
4:1:2
Opcion de proporcion
Realizacion
la: Ib: III
17
4:1:4
18
4:2:1
19
4:4:1
De las opciones de las razones descritas en la Tabla F, los autores de la presente invencion han encontrado que la opcion 1 es eficaz, cuando la composicion inmunogenica comprende: a) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo la de GBS conjugado con una protema portadora; b) un producto conjugado que es un sacarido 5 capsular de serotipo lb de GBS conjugado con una protema portadora; y c) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ill de GBS conjugado con una protema portadora. Por lo tanto, esta opcion de razon se prefiere para su uso en la invencion, particularmente para esta realizacion.
Tabla G - Composiciones inmunogenicas que comprenden cuatro productos conjugados
Realizacion - Ia, Ib, III y V
Opcion de razon
Ia: Ib: III: V Opcion de razon Ia: Ib: III: V Opcion de razon Ia: Ib: III: V
1
1:1:1:1 23 1:4:2:2 45 2:4:2:1
2
1:1:1:2 24 1:4:2:4 46 2:4:4:1
3
1:1:1:4 25 1:4:4:1 47 4:1:1:1
4
1:1:2:1 26 1:4:4:2 48 4:1:1:2
5
1:1:2:2 27 1:4:4:4 49 4:1:1:4
6
1:1:2:4 28 2:1:1:1 50 4:1:2:1
7
1:1:4:1 29 2:1:1:2 51 4:1:2:2
8
1:1:4:2 30 2:1:1:4 52 4:1:2:4
9
1:1:4:4 31 2:1:2:1 53 4:1:4:1
10
1:2:1:1 32 2:1:2:2 54 4:1:4:2
11
1:2:1:2 33 2:1:2:4 55 4:1:4:4
12
1:2:1:4 34 2:1:4:1 56 4:2:1:1
13
1:2:2:1 35 2:1:4:2 57 4:2:1:2
14
1:2:2:2 36 2:1:4:4 58 4:2:1:4
15
1:2:2:4 37 2:2:1:1 59 4:2:2:1
16
1:2:4:1 38 2:2:1:2 60 4:2:4:1
17
1:2:4:2 39 2:2:1:4 61 4:4:1:1
18
1:2:4:4 40 2:2:2:1 62 4:4:1:2
19
1:4:1:1 41 2:2:4:1 63 4:4:1:4
20
1:4:1:2 42 2:4:1:1 64 4:4:2:1
21
1:4:1:4 43 2:4:1:2 65 4:4:4:1
22
1:4:2:1 44 2:4:1:4
10 Como se comento anteriormente, la invencion se refiere en parte a composiciones inmunogenicas que comprenden adicionalmente un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo V de GBS conjugado con una
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protema portadora. Los autores de la presente invencion han descubierto que la respuesta inmunitaria al sacarido capsular de serotipo V de GBS en estas composiciones se puede disminuir si la composicion inmunogenica comprende uno o mas antigenos adicionales. Sin desear estar limitados por la teona, se cree que la presencia del antigeno o los antigenos adicionales da como resultado una "interferencia inmunitaria", disminuyendo la respuesta al sacarido capsular de serotipo V de GBS.
Los autores de la presente invencion han descubierto que se puede mejorar la respuesta al sacarido capsular de serotipo V de GBS en estas composiciones inmunogenicas si la composicion comprende un coadyuvante. Esta observacion esta en contraste con la ensenanza de la referencia 12, que sugiere que los coadyuvantes pueden no mejorar la respuesta inmunitaria a productos conjugados de GBS. El experto en la tecnica sena capaz de identificar coadyuvantes que se podnan utilizar en estas composiciones.
Los autores de la presente invencion tambien han encontrado que se puede mejorar la respuesta al sacarido capsular de serotipo V de GBS si se aumenta la dosis de este sacarido capsular. En particular, la respuesta al sacarido capsular de tipo V se puede mejorar si la dosis del sacarido capsular de tipo V es mayor que la dosis del sacarido capsular del otro serotipo de GBS. Por consiguiente, en otra realizacion, la presente invencion proporciona una composicion inmunogenica que comprende: a) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo
V de GBS conjugado con una protema portadora; en donde la dosis del sacarido capsular de tipo V es mayor que la dosis o las dosis totales de los sacaridos capsulares de los otros serotipos de GBS, o es mayor que al menos una de las dosis o la dosis media de los sacaridos capsulares de los otros serotipos de GBS. La dosis del sacarido capsular de tipo V puede ser 1,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces mayor. Es tfpico que la dosis del sacarido capsular de tipo V sea mayor que la dosis media de los sacaridos capsulares de los otros serotipos de GBS. Por consiguiente, esta realizacion de la invencion abarca cualquiera de las composiciones inmunogenicas descritas en la presente memoria que comprenden un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo V de GBS conjugado con una protema portadora y comprende adicionalmente productos conjugados que son sacaridos capsulares de los serotipos la, Ib y III de GBS conjugados con protemas portadoras; en donde la dosis del sacarido capsular de tipo V es mayor que la dosis o las dosis totales del sacarido o los sacaridos capsulares del otro o los otros serotipos de GBS, o es mayor que al menos una de las dosis o la dosis media de los sacaridos capsulares de los otros serotipos de GBS.
A continuacion se tratan los metodos de administracion de las composiciones inmunogenicas de la invencion. Brevemente, las composiciones inmunogenicas de la invencion se pueden administrar en dosis individuales o multiples. Los autores de la presente invencion han descubierto que la administracion de una dosis individual de las composiciones inmunogenicas de la invencion es eficaz, particularmente cuando la composicion inmunogenica comprende sacaridos capsulares de los serotipos, Ia, Ib y III de GBS; y mas concretamente cuando la composicion inmunogenica comprende: a) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ia de GBS conjugado con una protema portadora; b) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ib de GBS conjugado con una protema portadora; y c) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo III de GBS conjugado con una protema portadora. La administracion de una dosis individual es por lo tanto preferida en la invencion, particularmente para estas realizaciones.
Alternativamente, puede ser eficaz una dosis unitaria seguida de una segunda dosis unitaria. Tfpicamente, la segunda (o tercera, cuarta, quinta etc.) dosis unitaria es identica a la primera dosis unitaria. La segunda dosis unitaria se puede administrar en cualquier momento adecuado despues de la primera dosis unitaria, en particular despues de 1, 2 o 3 meses. Por ejemplo, cuando la composicion inmunogenica comprende sacaridos capsulares de los serotipos Ia, Ib y III de GBS, la segunda dosis unitaria se puede administrar 3 meses despues de la primera dosis unitaria. En otro ejemplo, si la composicion inmunogenica tambien comprende sacaridos capsulares de los serotipos
V de GBS, la segunda dosis unitaria se puede administrar 1 mes despues de la primera dosis unitaria. Tfpicamente, las composiciones inmunogenicas de la invencion se administraran por via intramuscular, p.ej. mediante administracion intramuscular al muslo o la parte superior del brazo como se describe a continuacion.
Los autores de la presente invencion han descubierto que el uso de composiciones sin coadyuvante anadido es eficaz, particularmente cuando la composicion inmunogenica comprende sacaridos capsulares de los serotipos Ia, Ib y III de GBS; y mas concretamente cuando la composicion inmunogenica comprende: a) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ia de GBS conjugado con una protema portadora; b) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ib de GBS conjugado con una protema portadora; y c) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo III de GBS conjugado con una protema portadora en donde (i) cada sacarido capsular de GBS esta presente en una cantidad de 5 |jg, 10 |jg o 20 |jg por dosis unitaria y (ii) la protema portadora en (a), (b) y (c) es toxoide difterico o CRM197. Puede ser ventajoso omitir los coadyuvantes para reducir la posible toxicidad. De acuerdo con esto, se prefieren las composiciones inmunogenicas que no contienen ningun coadyuvante (especialmente que no contienen ningun coadyuvante de sal de aluminio) para su uso en la invencion, particularmente para estas realizaciones.
El sacarido capsular
La invencion se basa en el sacarido capsular de Streptococcus agalactiae. El sacarido capsular esta unido covalentemente al esqueleto de peptidoglicano del GBS, y es distinto del antfgeno del grupo B, que es otro sacarido
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que esta unido al esqueleto de peptidoglicano.
Los sacaridos capsulares de GBS estan qmmicamente relacionados, pero son antigenicamente muy diferentes. Todos los sacaridos capsulares de GBS comparten el siguiente nucleo trisacarido:
P-D-GlcpNAc(1 ^ 3)P-D-Galp(1^ 4)P-D-Glcp
Los diversos serotipos de GBS difieren en la forma en que se modifica este nucleo. La diferencia entre los serotipos la y III, por ejemplo, surge del uso de GlcNAc (la) o Gal (III) en este nucleo para unir nucleos de trisacaridos consecutivos (Figura 1). Los serotipos Ia y Ib tienen ambos un disacarido [a-D-NeupNAc(2 ^ 3)p-D-Galp-(1 ^] unido a GlcNAc en el nucleo, pero el enlace es 1 ^ 4 (Ia) o 1 ^ 3 (Ib).
La enfermedad relacionada con GBS surge principalmente de los serotipos Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII y VIII, estando mas de 85% causada por cinco serotipos: Ia, Ib, III y V. La invencion preferiblemente utiliza un sacarido de tres o mas de estos cuatro serotipos, particularmente de serotipos: Ia, Ib y III. Como se muestra en la Figura 2, los sacaridos capsulares de cada uno de estos cuatro serotipos incluyen: (a) un resto de acido acetil-neurammico (NeuNAc) terminal (comunmente denominado acido sialico), que en todos los casos se une 2 ^ 3 a un resto de galactosa; y (b) un resto de W-acetil-glucosamina (GlcNAc) dentro del nucleo trisacarido.
Los cuatro sacaridos incluyen restos de galactosa dentro del nucleo trisacarido, pero los serotipos Ia, Ib, II y III tambien contienen restos de galactosa adicionales en cada unidad repetitiva.
Los sacaridos utilizados de acuerdo con la invencion pueden estar en su forma nativa, o pueden haber sido modificados. Por ejemplo, el sacarido puede ser mas corto que el sacarido capsular nativo, o puede modificarse qmmicamente. En particular, el sacarido capsular de serotipo V utilizado en la invencion se puede modificar como se describe en las ref. 13 y 14. Por ejemplo, esta espedficamente previsto un sacarido capsular de serotipo V que ha sido sustancialmente desialilado (Figura 3) como se describe en las ref. 13 y 14 para su uso en la presente invencion. El sacarido capsular de serotipo V de GBS desialilado se puede preparar tratando el sacarido capsular de serotipo V de GBS purificado en condiciones ligeramente acidas (p.ej., acido sulfurico 0,1 M a 80°C durante 60 minutos) o mediante tratamiento con neuraminidasa, como se describe en la referencia 13. Un metodo preferido para preparar el sacarido capsular de serotipo V de GBS desialilado, es mediante tratamiento del sacarido purificado con acido acetico 1 M a 81°C +/- 3°C durante 2 h. De este modo, el sacarido utilizado de acuerdo con la invencion puede ser un polisacarido capsular sustancialmente completo, como se encuentra en la naturaleza, o puede tener una longitud menor que la natural. Los polisacaridos completos se pueden despolimerizar para proporcionar fragmentos mas cortos para su uso en la invencion p.ej. mediante hidrolisis en acido debil, mediante calentamiento, mediante cromatograffa de exclusion por tamano, etc. Se ha informado de que la longitud de la cadena afecta a la inmunogenicidad de los sacaridos de GBS en conejos [4]. En particular, los sacaridos capsulares de serotipo II y/o III utilizados en la invencion se pueden despolimerizar como se describe en las ref. 15 y 16. Estos documentos describen la despolimerizacion parcial de sacaridos capsulares de tipo II y tipo III mediante escision desaminativa suave a fragmentos antigenicos con restos de 2,5-anhidro-D-manosa reductores terminales. Brevemente, el sacarido capsular se disuelve en NaOH 0,5 N y se calienta a 70°C durante aproximadamente 1-4 h. La duracion de esta incubacion controla el grado de despolimerizacion, que puede determinarse por metodos convencionales (p.ej., por HPLC como se describe en la referencia 15). La muestra se enfna en un bano de agua helada antes de anadir acido acetico glacial para llevar el pH a 4. El producto parcialmente desacetilado en N se desamina mediante la adicion de NaNO2 al 5% (p/v) con agitacion a 4°C durante 2 h. Los aldetudos libres de los restos de 2,5-anhidro-D-manosa recien formados se pueden utilizar para la conjugacion con una protema portadora, como se describe a continuacion.
Se ha informado sobre la despolimerizacion del sacarido capsular de serotipo III por endo-p-galactosidasa [ref. 1 y 46], incluyendo el uso del material despolimerizado para formar productos conjugados con un portador de toxoide tetanico. La ozonolisis de los polisacaridos capsulares de los serotipos III y VIII de GBS tambien se ha utilizado para la despolimerizacion [17]. Se prefiere utilizar sacaridos con PM> 30 kDa, y se pueden utilizar polisacaridos capsulares sustancialmente completos. Para el serotipo Ia, se prefiere utilizar polisacaridos con un PM en el intervalo de 150-300 kDa, particularmente 175-275 kDa. Tfpicamente, se utiliza un sacarido de serotipo Ia con un PM de aproximadamente 200 kDa o aproximadamente 260 kDa. Para el serotipo Ib, se prefiere utilizar polisacaridos con un PM en el intervalo de 150-300 kDa, particularmente 175-250 kDa. Tfpicamente, se utiliza un sacarido de serotipo Ib con un PM de aproximadamente 200 kDa o aproximadamente 230 kDa. Para el serotipo III, se prefiere utilizar polisacaridos con un PM en el intervalo de 50-200 kDa, particularmente 80-150 kDa. Tfpicamente, se utiliza un sacarido de serotipo III con un PM de aproximadamente 100 kDa o aproximadamente 140 kDa. Para el serotipo V, tambien se prefiere utilizar polisacaridos con un PM de hasta ~50 kDa. Tfpicamente, se utiliza un sacarido de serotipo V con un PM de aproximadamente 100 kDa. Estas masas moleculares se pueden medir mediante filtracion en gel con respecto a patrones de dextrano, tales como los disponibles de Polymer Standard Service [18].
El sacarido se puede modificar qmmicamente con respecto al sacarido capsular tal como se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, el sacarido puede ser des-O-acetilado (parcial o totalmente), des-N-acetilado (parcial o totalmente), N-propionado (parcial o totalmente), etc. La desacetilacion puede ocurrir antes, durante o despues de la conjugacion, pero preferiblemente se produce antes de la conjugacion. Dependiendo del sacarido particular, la desacetilacion puede afectar o no la inmunogenicidad. La relevancia de la O-acetilacion en sacaridos de GBS en
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diversos serotipos se comenta en la referencia 19, y en algunas realizaciones la O-acetilacion de restos de acido sialico en las posiciones 7, 8 y/o 9 se conserva antes, durante y despues de la conjugacion p.ej. mediante proteccion/desproteccion, mediante re-acetilacion, etc. Sin embargo, tipicamente el sacarido de GBS utilizado en la presente invencion no tiene sustancialmente O-acetilacion de restos de acido sialico en las posiciones 7, 8 y/o 9. En particular, cuando el sacarido de GBS se ha purificado por extraccion con alcali como se describe a continuacion, la O-acetilacion tfpicamente se pierde (ref. 19). El efecto de la desacetilacion etc. puede evaluarse mediante ensayos de rutina.
Los sacaridos capsulares se pueden purificar mediante tecnicas conocidas, como se describe en las referencias de la presente memoria, tales como las ref. 2 y 20. Un procedimiento tfpico implica extraccion con alcali, centrifugacion, filtracion, tratamiento con ARNasa/ADNasa, tratamiento con proteasa, concentracion, cromatograffa de exclusion por tamano, ultrafiltracion, cromatograffa de intercambio anionico y ultrafiltracion adicional. El tratamiento de celulas de GBS con la enzima mutanolisina, que escinde la pared celular bacteriana para liberar los componentes de la pared celular, tambien es util.
Como alternativa, se puede utilizar el procedimiento de purificacion descrito en la referencia 21. Esto implica extraccion con alcali, tratamiento con etanol/CaCl2, precipitacion con CTAB y re-solubilizacion. Un procedimiento alternativo adicional se describe en la referencia 22.
La invencion no esta limitada a sacaridos purificados de fuentes naturales, sin embargo, y los sacaridos se pueden obtener por otros metodos, tales como smtesis total o parcial.
Conjugacion
La invencion implica productos conjugados que son sacaridos capsulares de los serotipos la, Ib, III y opcionalmente V de GBS conjugados con una protema portadora. En general, la conjugacion covalente de sacaridos con los portadores potencia la inmunogenicidad de los sacaridos a medida que los convierte de antfgenos independientes de celulas T a antfgenos dependientes de celulas T, permitiendo asf el cebado de la memoria inmunologica. La conjugacion es particularmente util para vacunas pediatricas [p.ej. ref. 23] y es una tecnica bien conocida [p.ej. revisado en las ref. 24 a 32]. Por lo tanto, los procedimientos de la invencion pueden incluir la etapa adicional de conjugar el sacarido purificado con una molecula portadora.
La conjugacion de los sacaridos de GBS ha sido ampliamente referida p.ej. veanse las referencias 1 a 9. El procedimiento tfpico de la tecnica anterior para la conjugacion de sacaridos de GBS implica tfpicamente la aminacion reductiva de un sacarido purificado a una protema portadora tal como toxoide tetanico (TT) o CRM197 [2]. La aminacion reductiva implica un grupo amino en la cadena lateral de un aminoacido en el portador y un grupo aldehndo en el sacarido. Puesto que los sacaridos capsulares de GBS no incluyen un grupo aldehndo en su forma natural, este se genera tfpicamente antes de la conjugacion por oxidacion (p.ej., oxidacion con peryodato) de una porcion (p.ej. entre 5 y 40%, particularmente entre 10 y 30%, preferiblemente aproximadamente 20%) de los restos de acido sialico del sacarido [2,33]. Las vacunas de producto conjugado preparadas de esta manera han demostrado ser seguras e inmunogenicas en seres humanos para cada uno de los serotipos Ia, Ib, II, III y V de GBS [10]. Tfpicamente, todos los productos conjugados en las composiciones inmunogenicas de la presente invencion se han preparado de esta manera. Sin embargo, cuando la invencion utiliza un sacarido capsular de serotipo V que esta desialilado, se puede generar un grupo aldehndo en este sacarido antes de la conjugacion por oxidacion (p.ej. oxidacion con peryodato) de una porcion (p.ej. entre 5 y 40%, particularmente entre 10 y 30%, preferiblemente aproximadamente 20%) de los restos de galactosa del sacarido [14]. Un procedimiento de conjugacion alternativo implica el uso de grupos -NH2 en el sacarido (ya sea a partir de des-N-acetilacion, o despues de la introduccion de aminas) junto con conectores bifuncionales, como se describe en la ref. 34. En algunas realizaciones, uno o mas de los productos conjugados en las composiciones inmunogenicas de la presente invencion se han preparado de esta manera. Un procedimiento alternativo adicional se describe en las ref. 15 y 16. En este procedimiento, los grupos aldehndo libres de los restos de 2,5-anhidro-D-manosa terminales de la despolimerizacion de sacaridos capsulares de tipo II o tipo III por escision desaminativa suave se utilizan para la conjugacion por aminacion reductiva. En algunas realizaciones, uno o mas de los productos conjugados en las composiciones inmunogenicas de la presente invencion se han preparado de esta manera.
La invencion implica el uso de moleculas portadoras, que son toxoide difterico o CRM197. Tambien se describen protemas portadoras que incluyen otras toxinas bacterianas o toxoides, tales como toxoide tetanico. Tambien se describen fragmentos de toxinas o toxoides p.ej. fragmento C de toxoide tetanico [35]. El mutante CRM197 de la toxina difterica [36-38] es particularmente util en la invencion. Tambien se describen en la presente memoria protemas portadoras, incluyendo la protema de la membrana externa de N. meningitidis [39], peptidos sinteticos [40, 41], protemas de choque termico [42,43], protemas de la tos ferina [44,45], citoquinas [46], linfoquinas [46], hormonas [46], factores de crecimiento [46], albumina de suero humano (preferiblemente recombinante), protemas artificiales que comprenden epttopos multiple de celulas T CD4+ humanas de diversos antfgenos derivados de patogenos [47] tales como N19 [48], protema D de H. influenzae [49, 50], protema de superficie neumococica PspA [51], neumolisina [52], protemas de captacion de hierro [53], toxina A o B de C. difficile [54], exoprotema A de Pseudomonas aeruginosa recombinante (rEPA) [55], una protema GBS (vease a continuacion, particularmente GBS67) [204], etc.
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El anclaje al portador es preferiblemente a traves de un grupo -NH2 p.ej. en la cadena lateral de un resto de lisina en una protema portadora, o de un resto de arginina, o en el extremo N-terminal. El anclaje tambien puede ser a traves de un grupo -SH p.ej. en la cadena lateral de un resto de cistema.
Es posible utilizar mas de una protema portadora p.ej. para reducir el riesgo de supresion del portador. Por lo tanto, en la presente memoria se describe el uso de diferentes protemas portadoras para diferentes serotipos de GBS p.ej. se podnan conjugar sacaridos del serotipo la con CRM197, mientras que los sacaridos del serotipo Ib se podnan conjugar con el toxoide tetanico. Tambien es posible utilizar mas de una protema portadora para un antigeno sacarido concreto p.ej. los sacaridos del serotipo Ill podnan estar en dos grupos, algunos conjugados con CRM197 y otros conjugados con el toxoide tetanico. En general, sin embargo, se prefiere utilizar la misma protema portadora para todos los sacaridos.
Una sola protema portadora podna portar mas de un antigeno sacarido [56, 57]. Por ejemplo, una sola protema portadora podna tener conjugados sacaridos de los serotipos la y Ib. Para lograr este objetivo, se pueden mezclar diferentes sacaridos antes de la reaccion de conjugacion. En general, sin embargo, se prefiere tener productos conjugados separados para cada serogrupo, mezclandose los diferentes sacaridos despues de la conjugacion. Los productos conjugados separados pueden basarse en el mismo portador.
Se utilizan tipicamente productos conjugados con una razon de sacarido:protema (p/p) de entre 1:5 (es decir exceso de protema) y 5:1 (es decir exceso de sacarido), en particular razones entre 1:5 y 2:1. Cuando la invencion utiliza un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo la de GBS conjugado con una protema portadora, la razon de sacarido:protema (p/p) esta tipicamente entre aproximadamente 1:1 y 1:2, particularmente aproximadamente 1:1,3. De forma similar, cuando la invencion utiliza un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo lb de GBS conjugado con una protema portadora, la razon esta tipicamente entre aproximadamente 1:1 y 1:2, particularmente aproximadamente 1:1,3. Cuando la invencion utiliza un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo lll de GBS conjugado con una protema portadora, la razon de sacarido:protema (p/p) esta tipicamente entre aproximadamente 3:1 y 1:1, particularmente aproximadamente 2:1. Sin embargo, tambien se puede utilizar un serotipo lll de GBS conjugado con una protema portadora con una razon de sacarido:protema (p/p) de aproximadamente 1:1 a 1:5, particularmente aproximadamente 1:3,3. Finalmente, cuando la invencion utiliza un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo V de GBS conjugado con una protema portadora, la razon esta tipicamente entre aproximadamente 2:1 1: 1, particularmente
aproximadamente 1,1: 1. Por lo tanto, es tipico un exceso en peso de sacarido, particularmente con cadenas de sacaridos mas largas.
Las composiciones pueden incluir una pequena cantidad de portador libre [58]. Cuando una protema portadora dada esta presente tanto en forma libre como conjugada en una composicion de la invencion, la forma no conjugada es preferiblemente no mas de 5% de la cantidad total de la protema portadora en la composicion en su totalidad, y mas preferiblemente presente en menos de 2% en peso.
Despues de la conjugacion, se pueden separar los sacaridos libres y conjugados. Existen muchos metodos adecuados, que incluyen cromatogratia hidrofoba, ultrafiltracion tangencial, diafiltracion etc. [veanse tambien las ref. 59 y 60, etc.]. Un metodo preferido se describe en la referencia 61.
Cuando la composicion de la invencion incluye un oligosacarido despolimerizado, se prefiere que la despolimerizacion preceda a la conjugacion.
Combinaciones de productos conjugados y otros antigenos
Las composiciones inmunogenicas de la invencion pueden comprender uno o mas antigenos adicionales.
El antigeno o los antigenos adicionales pueden comprender adicionalmente productos conjugados de GBS. Los diferentes productos conjugados de GBS pueden incluir diferentes tipos de productos conjugados del mismo serotipo de GBS y/o productos conjugados de diferentes serotipos de GBS. La composicion tipicamente se producira preparando productos conjugados separados (p.ej. un producto conjugado diferente para cada serotipo) y a continuacion combinando los productos conjugados.
El antigeno o los antigenos adicionales pueden comprender secuencias de aminoacidos de GBS, como se expone a continuacion.
El antigeno o los antigenos adicionales pueden comprender antigenos de patogenos distintos de GBS. Por lo tanto, las composiciones de la invencion pueden comprender adicionalmente uno o mas antigenos distintos de GBS, incluyendo antigenos bacterianos, virales o parasitarios adicionales. Estos se pueden seleccionar entre los siguientes:
• un antigeno proteico del serogrupo B de N. meningitidis, tal como los de las ref. 62 a 68, siendo especialmente preferida la protema "287" (vease a continuacion) y derivados (p.ej., "AG287").
• una preparacion de vesmula de membrana externa (OMV) del serogrupo B de N. meningitidis, tal como las
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descritas en las ref. 69, 70, 71, 72 etc.
un antfgeno sacarido del serogrupo A, C, W135 y/o Y de N. meningitidis, tal como el oligosacarido descrito en la ref. 73 del serogrupo C o los oligosacaridos de la ref. 74.
un antigeno sacarido de Streptococcus pneumoniae [p.ej. ref. 75-77; capftulos 22 y 23 de la ref. 84].
un antigeno del virus de la hepatitis A, tal como virus inactivado [p.ej. 78, 79; capftulo 15 de la ref. 84].
un antfgeno del virus de la hepatitis B, tal como los antigenos de superficie y/o nucleo [p.ej. 79, 80; capftulo
16 de la ref. 84].
un antigeno del virus de la hepatitis C [p.ej. 81].
un antfgeno de Bordetella pertussis, tal como la holotoxina pertussis (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente tambien combinado con pertactina y/o aglutinogenos 2 y 3 [p.ej. ref. 82 y 83; capftulo 21 de la ref. 84].
un antigeno difterico, tal como un toxoide difterico [p.ej. capftulo 13 de la ref. 84].
un antigeno tetanico, tal como un toxoide tetanico [p.ej. capftulo 27 de la ref. 84].
un antigeno sacarido de Haemophilus influenzae B [p.ej. capftulo 14 de la ref. 84]
un antigeno de N. gonorrhoeae [p.ej. 62, 63, 64].
un antigeno de Chlamydia pneumoniae [p.ej. 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91].
un antigeno de Chlamydia trachomatis [p.ej. 92].
un antigeno de Porphyromonas gingivalis [p.ej. 93].
antigeno o antigenos de polio [p.ej. 94, 95; capftulo 24 de la ref. 84] tal como IPV.
antigeno o antigenos de la rabia [p.ej. 96] tal como el virus inactivado liofilizado [p.ej. 97, RabAvert™].
antigenos de sarampion, parotiditis y/o rubeola [p.ej. capftulos 19, 20 y 26 de la ref. 84].
antigeno o antigenos de la influenza [p.ej. capftulos 17 y 18 de la ref. 84], tales como las protemas de superficie de hemaglutinina y/o neuraminidasa.
un antigeno de Moraxella catarrhalis [p.ej. 98].
un antigeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A) [p.ej. 99, 100, 101]. un antigeno de Staphylococcus aureus [p.ej. 102].
Cuando se utiliza un antfgeno sacarido o carbohidratado, preferiblemente se conjuga con un portador con el fin de potenciar la inmunogenicidad. La conjugacion de antfgenos sacaridos de H. influenzae B, meningococicos y neumococicos es bien conocida.
Los antfgenos proteicos toxicos pueden destoxificarse cuando sea necesario (p.ej. destoxificacion de la toxina pertussis por medios qmmicos y/o geneticos [83]).
Cuando se incluye un antfgeno difterico en la composicion, tambien se prefiere incluir antfgenos tetanicos y antfgenos de la tos ferina. De forma similar, cuando se incluye un antfgeno tetanico, tambien se prefiere incluir antfgenos de difteria y tos ferina. De forma similar, cuando se incluye un antfgeno de tos ferina, tambien se prefiere incluir antfgenos de difteria y tetanos.
Un tipo de composicion preferida incluye antfgenos adicionales de patogenos de transmision sexual, tales como: herpesvirus; N. gonorrhoeae; C. trachomatis; etc. Otro tipo de composicion preferida incluye antfgenos adicionales que afectan a ancianos y/o individuos inmunocomprometidos, por lo que los antfgenos de GBS de la invencion se pueden combinar con uno o mas antfgenos de los siguientes patogenos sin GBS: virus de influenza, Euterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, y virus de parainfluenza.
Los antfgenos en la composicion tfpicamente estaran presentes a una concentracion de al menos 1 pg/ml cada uno. En general, la concentracion de cualquier antfgeno dado sera suficiente para provocar una respuesta inmunitaria contra ese antfgeno.
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Como alternativa al uso de antigenos proteicos en la composicion de la invencion, se puede utilizar acido nucleico que codifica el antfgeno [p.ej. ref. 103 a 111]. Los componentes proteicos de las composiciones de la invencion pueden ser reemplazados por acido nucleico (preferiblemente ADN p.ej. en forma de un plasmido) que codifica la protema.
En terminos practicos, puede haber un Kmite superior para la cantidad de antigenos incluidos en las composiciones de la invencion. El numero de antigenos (incluyendo los antigenos de GBS) en una composicion de la invencion puede ser inferior a 20, inferior a 19, inferior a 18, inferior a 17, inferior a 16, inferior a 15, inferior a 14, inferior a 13, inferior de 12, inferior a 11, inferior a 10, inferior a 9, inferior a 8, inferior a 7, inferior a 6, inferior a 5, inferior a 4, inferior a 3 o inferior a 2. El numero de antigenos de GBS en una composicion de la invencion puede ser inferior a 6, inferior a 5, inferior a 4, inferior a 3 o inferior a 2.
Metodos y usos farmaceuticos
Las composiciones inmunogenicas de la invencion pueden comprender adicionalmente un portador farmaceuticamente aceptable. Los "portadores farmaceuticamente aceptables" tfpicos incluyen cualquier portador que no induzca por sf mismo la produccion de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composicion. Los portadores adecuados son tfpicamente macromoleculas grandes, lentamente metabolizadas tales como protemas, polisacaridos, acidos polilacticos, acidos poliglicolicos, aminoacidos polimericos, copolfmeros de aminoacidos, sacarosa [112], trehalosa [113], lactosa y agregados lipfdicos (tales como gotitas de aceite o liposomas). Tales portadores son bien conocidos por los expertos en la tecnica. Las vacunas tambien pueden contener diluyentes, tales como agua, solucion salina, glicerol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras de pH y similares. La solucion salina fisiologica esteril libre de pirogenos y tamponada con fosfato es un portador tfpico. Una discusion detallada de los excipientes farmaceuticamente aceptables esta disponible en la referencia 114.
Las composiciones de la invencion pueden estar en forma acuosa (es decir soluciones o suspensiones) o en forma seca (p.ej. liofilizado). Si se utiliza una vacuna seca, se reconstituira en un medio lfquido antes de la inyeccion. La liofilizacion de vacunas de producto conjugado es conocida en la tecnica p.ej. el producto Menjugate™ se presenta en forma liofilizada. Cuando las composiciones inmunogenicas de la invencion incluyen productos conjugados que comprenden sacaridos capsulares de mas de un serotipo de GBS, es tfpico que los productos conjugados se preparen por separado, se mezclen y a continuacion se liofilicen. De esta manera, se pueden preparar composiciones liofilizadas que comprenden dos, tres o cuatro etc. productos conjugados como se describe en la presente memoria. Para estabilizar los productos conjugados durante la liofilizacion, se puede preferir incluir un alcohol de azucar (p.ej. manitol) y/o un disacarido (p.ej. sacarosa o trehalosa) p.ej. entre 1 mg/ml y 30 mg/ml (p.ej. aproximadamente 25 mg/ml) en la composicion. El uso de sacarosa se ha recomendado como un estabilizador para vacunas de producto conjugado de GBS (ref. 115). Sin embargo, es tfpico que el estabilizador de la presente invencion sea manitol. Cuando la vacuna seca se reconstituye en un medio lfquido antes de la inyeccion, la concentracion de manitol residual generalmente sera de aproximadamente 2-20 mg/ml, p.ej. 3,75 mg/ml, 7,5 mg/ml o 15 mg/ml. El uso de manitol es ventajoso porque el manitol es qmmicamente distinto de las subunidades de monosacaridos de los sacaridos capsulares de GBS. Esto significa que la deteccion de los sacaridos capsulares, p.ej. para el analisis de control de calidad, puede basarse en la presencia de las subunidades de sacaridos sin interferencia del manitol. Por el contrario, un estabilizador como sacarosa contiene glucosa, que puede interferir en la deteccion de subunidades de glucosa en los sacaridos.
Las composiciones pueden presentarse en viales, o pueden presentarse en jeringas ya cargadas. Las jeringas pueden ser suministradas con o sin agujas. Una jeringa incluira una sola dosis de la composicion, mientras que un vial puede incluir una sola dosis o multiples dosis.
Las composiciones acuosas de la invencion tambien son adecuadas para reconstituir otras vacunas a partir de una forma liofilizada. Cuando se va a utilizar una composicion de la invencion para dicha reconstitucion extemporanea, la invencion proporciona un kit, que puede comprender dos viales, o puede comprender una jeringa y un vial ya cargados, utilizandose el contenido de la jeringa para reactivar la contenido del vial antes de su inyeccion.
Las composiciones de la invencion se pueden envasar en forma de dosis unitaria o en forma de dosis multiple. Para formas de dosis multiples, se prefieren los viales a las jeringas precargadas. Se pueden establecer rutinariamente volumenes de dosificacion eficaces, pero una dosis humana tfpica de la composicion tiene un volumen de 0,5 ml. p.ej. para inyeccion intramuscular.
El pH de la composicion esta preferiblemente entre 6 y 8, preferiblemente aproximadamente 7. El pH estable puede mantenerse mediante el uso de un tampon. Las composiciones inmunogenicas de la invencion comprenden tfpicamente un tampon de dihidrogenofosfato de potasio. El tampon de dihidrogenofosfato de potasio puede comprender dihidrogenofosfato de potasio aproximadamente 1-10 mM, p.ej. 1,25 mM, 2,5 mM o 5,0 mM. La composicion puede ser esteril y/o libre de pirogenos. Las composiciones de la invencion pueden ser isotonicas con respecto a los seres humanos.
Las composiciones de la invencion son inmunogenicas, y mas preferiblemente son composiciones de vacunas. Las
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vacunas de acuerdo con la invencion pueden ser profilacticas (es decir para prevenir la infeccion) o terapeuticas (es decir para tratar la infeccion), pero tipicamente seran profilacticas. Las composiciones inmunogenicas utilizadas como vacunas comprenden una cantidad inmunologicamente eficaz de uno o varios antfgenos, asf como cualquier otro componente, segun sea necesario. Por "cantidad inmunologicamente eficaz", se entiende que la administracion de esa cantidad a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevencion. Esta cantidad vana dependiendo de la salud y las condiciones ffsicas del individuo que se vaya a tratar, la edad, el grupo taxonomico del individuo que se vaya a tratar (p.ej. primate no humano, primate etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de proteccion deseado, la formulacion de la vacuna, la evaluacion por parte del medico a cargo de la situacion medica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encuentre en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a traves de ensayos de rutina.
Dentro de cada dosis, la cantidad de un antfgeno sacarido individual generalmente estara entre 0,1-50 |jg (medida como masa de sacarido), particularmente entre 1-50 jg o 0,5-25 jg, mas concretamente 2,5-7,5 jg, p.ej. aproximadamente 1 jg, aproximadamente 2,5 jg, aproximadamente 5 jg, aproximadamente 10 jg, aproximadamente 15 jg, aproximadamente 20 jg o aproximadamente 25 jg. Dentro de cada dosis, la cantidad total de sacaridos capsulares de GBS generalmente sera < 70 jg (medida como masa de sacarido), p.ej. < 60 jg. En particular, la cantidad total puede ser < 40 jg (p.ej. < 30 jg) o < 20 jg (p.ej. < 15 jg). Los autores de la presente invencion han descubierto que estas cantidades totales son eficaces, particularmente cuando la composicion inmunogenica comprende: a) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo la de GBS conjugado con una protema portadora; b) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo lb de GBS conjugado con una protema portadora; y c) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ill de GBS conjugado con una protema portadora. Por lo tanto, estas cantidades totales son preferidas para su uso en la invencion, particularmente para esta realizacion. Puede ser ventajoso minimizar la cantidad total de sacarido o sacaridos capsulares por dosis unitaria para reducir la toxicidad potencial. Por consiguiente, se prefiere una cantidad total de < 20 jg, p.ej. <15 jg, < 7,5 jg o < 1,5 jg.
El GBS afecta a diversas zonas del cuerpo y, por lo tanto, las composiciones de la invencion se pueden preparar de diversas formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, como soluciones lfquidas o suspensiones. La composicion se puede preparar para administracion pulmonar p.ej. como inhalador, utilizando un polvo fino o un aerosol. La composicion se puede preparar como un supositorio o pesario. La composicion se puede preparar para administracion nasal, aural u ocular p.ej. como aerosoles, gotas, gel o polvo [p.ej. ref. 116 y 117]. Se ha informado sobre el exito de la administracion nasal de sacaridos neumococicos [118, 119], sacaridos Hib [120], sacaridos MenC [121] y mezclas de productos conjugados de sacaridos Hib y MenC [122].
Las composiciones de la invencion pueden incluir un antimicrobiano, particularmente cuando se envasan en formato de dosis multiples.
Las composiciones de la invencion pueden comprender detergente p.ej. Tween (polisorbato), tal como Tween 80. Los detergentes generalmente estan presentes a niveles bajos p.ej. <0,01%.
Las composiciones de la invencion pueden incluir sales de sodio (p.ej. cloruro de sodio) para conferir tonicidad. Es tfpica una concentracion de 10 ± 2 mg/ml de NaCl. En algunas realizaciones, se puede utilizar una concentracion de 4-10 mg/ml de NaCl, p.ej. 9,0, 7,0, 6,75 o 4,5 mg/ml.
Las composiciones de la invencion generalmente incluiran un tampon. Es tfpico un tampon de fosfato.
Las composiciones de la invencion se pueden administrar junto con otros agentes inmunorreguladores. Las composiciones pueden incluir uno o mas coadyuvantes, pero no contienen un coadyuvante de sal de aluminio. Tales coadyuvantes incluyen, pero no estan limitados a:
A. Composiciones que contienen minerales
Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como coadyuvantes en la invencion incluyen sales minerales, tales como sales de calcio (o mezclas de las mismas). Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (p.ej. partmulas "CAP" descritas en la ref. 123). Se prefiere la adsorcion a estas sales. Las composiciones que contienen minerales tambien se pueden formular como una partmula de sal metalica [124].
B. Emulsiones oleosas
Las composiciones de emulsiones oleosas adecuadas para su uso como coadyuvantes en la invencion incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 (5% de escualeno, 0,5% de Tween 80 y 0,5% de Span 85, formulados en partmulas submicrometricas utilizando un microfluidificador) [veanse tambien las ref. 125-127]. MF59 se utiliza como coadyuvante en la vacuna de subunidad trivalente del virus de influenza FLUAD™.
Los coadyuvantes particularmente preferidos para su uso en las composiciones son emulsiones submicrometricas de aceite en agua. Las emulsiones de aceite en agua submicrometricas preferidas para su uso en la presente invencion son emulsiones de escualeno/agua que opcionalmente contienen cantidades variables de MTP-PE, tales
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como una emulsion submicrometrica de aceite en agua que contiene 4-5% p/v de escualeno, 0,25-1,0% p/v Tween 80 (monooleato de polioxietilensorbitan), y/o 0,25-1,0% de Span 85 (trioleato de sorbitan), y, opcionalmente, N- acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE). Las emulsiones submicrometricas de aceite en agua, los metodos para fabricar las mismas y los agentes inmunoestimuladores, tales como los muramilpeptidos, para su uso en las composiciones, se describen en detalle en las referencias 125 y 128-129. Tambien se pueden utilizar el coadyuvante completo de Freund (CFA) y el coadyuvante incompleto de Freund (IFA) como coadyuvantes en la invencion.
C. Formulaciones de saponina
Tambien se pueden utilizar formulaciones de saponina como coadyuvantes en la invencion. Las saponinas son un grupo heterologo de glucosidos de esterol y glucosidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, rames e incluso flores de una amplia gama de especies de plantas. Las saponinas aisladas de la corteza del arbol Quillaia saponaria Molina han sido ampliamente estudiadas como coadyuvantes. La saponina tambien puede obtenerse comercialmente de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia), y Saponaria officinalis (hierba jabonera). Las formulaciones de coadyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, asf como formulaciones de lfpidos, tales como ISCOM.
Las composiciones de saponina se han purificado utilizando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado fracciones espedficas purificadas utilizando estas tecnicas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferiblemente, la saponina es QS21. Un metodo de produccion de QS21 se describe en la ref. 130. Las formulaciones de saponina tambien pueden comprender un esterol, tal como el colesterol [131].
Las combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden utilizar para formar partmulas unicas llamadas complejos inmunoestimuladores (ISCOM). Los ISCOM tfpicamente tambien incluyen un fosfolfpido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Cualquier saponina conocida puede utilizarse en los ISCOM. Preferiblemente, el ISCOM incluye uno o mas de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen con mas detalle en las referencias. 131-133. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de detergentes adicionales [134].
Se puede encontrar una revision del desarrollo de coadyuvantes basados en saponina en las ref. 135 y 136.
D. Virosomas y particulas de tipo virus
Los virosomas y las partmulas de tipo virus (VLP) tambien se pueden utilizar como coadyuvantes en la invencion. Estas estructuras generalmente contienen una o mas protemas de un virus opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolfpido. Generalmente no son patogenos, no se replican y generalmente no contienen el genoma viral nativo. Las protemas virales pueden producirse de forma recombinante o aislarse de virus completos. Estas protemas vmcas adecuadas para su uso en virosomas o VLP incluyen protemas derivadas del virus de la influenza (tales como HA o NA), virus de la hepatitis B (tales como protemas nucleo o de la capsida), virus de la hepatitis E, virus del sarampion, virus Sindbis, rotavirus, virus de la enfermedad del pie y la boca, retrovirus, virus de tipo Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fagos Qp (tales como protemas de la envoltura), fagos GA, fagos fr, fago AP205 y Ty (tal como la protema p1 del retrotransposon Ty). Las VLP se comentan adicionalmente en las ref. 137-142. Los virosomas se comentan adicionalmente, porejemplo, en la ref. 143.
E. Derivados bacterianos o microbianos
Los coadyuvantes adecuados para su uso en la invencion incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no toxicos de lipopolisacaridos (LPS) enterobacterianos, derivados de lfpido A, oligonucleotidos inmunoestimuladores y toxinas ribosilantes de ADP y derivados destoxificados de los mismos.
Los derivados no toxicos de LPS incluyen monofosforil lfpido A (MPL) y MPL 3 des-O-acilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla de 3 monofosforil lfpido A des-O-acilados con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma preferida de "partmula pequena" de monofosforil lfpido 3 Des-O-acilado se describe en la ref. 144. Tales "partmulas pequenas" de 3dMPL son lo suficientemente pequenas como para ser filtradas de manera esteril a traves de una membrana de 0,22 pm [144]. Otros derivados de LPS no toxicos incluyen mimeticos de monofosforil lfpido A, tales como derivados de aminoalquil glucosaminida fosfato p.ej. RC-529 [145,146].
Los derivados de lfpido A incluyen derivados de lfpido A de Escherichia coli tales como OM-174. OM-174 se describe, porejemplo, en las ref. 147 y 148.
Los oligonucleotidos inmunoestimuladores adecuados para su uso como coadyuvantes en la invencion incluyen secuencias de nucleotidos que contienen un motivo CpG (una secuencia de dinucleotidos que contiene una citosina no metilada unida por un enlace de fosfato a una guanosina). Tambien se ha demostrado que los ARN y los oligonucleotidos de doble hebra que contienen secuencias palindromicas o poli(dG) son inmunoestimuladores.
Los CpG pueden incluir modificaciones/analogos de nucleotidos tales como modificaciones fosforotioato y pueden ser de doble hebra o de hebra sencilla. Las referencias 149, 150 y 151 revelan posibles sustituciones analogas p.ej. reemplazo de guanosina por 2'-desoxi-7-desazaguanosina. El efecto coadyuvante de los oligonucleotidos CpG se
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analiza adicionalmente en las ref. 152-157.
La secuencia de CpG puede dirigirse a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [158]. La secuencia CpG puede ser espedfica para inducir una respuesta inmunitaria Th1, tal como un ODN CpG-A, o puede ser mas espedfica para inducir una respuesta de celulas B, tal como un ODN CpG-B. Los ODN CpG-A y CpG-B se comentan en las ref. 159-161. Preferiblemente, el CpG es un ODN CpG-A.
Preferiblemente, el oligonucleotido CpG esta construido de modo que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, se pueden unir dos secuencias de oligonucleotidos CpG en sus extremos 3' para formar "inmunomeros". Veanse, porejemplo, las ref. 158 y 162-164.
Las toxinas ribosilantes de ADP bacterianas y los derivados destoxificados de las mismas se pueden utilizar como coadyuvantes en la invencion. Preferiblemente, la protema deriva de E. coli (enterotoxina de E. coli labil al calor "LT"), colera ("CT") o pertussis ("PT"). El uso de toxinas ribosilantes de ADP destoxificadas como coadyuvantes de la mucosa se describe en la ref. 165 y como coadyuvantes parenterales en la ref. 166. La toxina o toxoide esta preferiblemente en forma de una holotoxina, que comprende ambas subunidades A y B. Preferiblemente, la subunidad A contiene una mutacion destoxificante; preferiblemente la subunidad B no esta mutada. Preferiblemente, el coadyuvante es un mutante LT destoxificado tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de toxinas ribosilantes de ADP y sus derivados destoxificados, particularmente LT-K63 y LT-R72, como coadyuvantes se puede encontrar en las ref. 167-174. La referencia numerica para las sustituciones de aminoacidos se basa preferiblemente en los alineamientos de las subunidades A y B de las toxinas ribosilantes de ADP expuestas en la ref. 175, incorporada espedficamente aqrn como referencia en su totalidad.
F. Inmunomoduladores humanos
Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como coadyuvantes en la invencion incluyen citoquinas, tales como interleuquinas (p.ej. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [176], etc.) [177], interferones (p.ej. interferon-y), factor estimulador de colonias de macrofagos y factor de necrosis tumoral.
G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos
Los bioadhesivos y mucoadhesivos tambien se pueden utilizar como coadyuvantes en la invencion. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de acido hialuronico esterificadas [178] o mucoadhesivos tales como derivados entrecruzados de poli(acido acnlico), poli(alcohol vimlico), polivinilpirrolidona, polisacaridos y carboximetilcelulosa. El quitosano y sus derivados tambien se pueden utilizar como coadyuvantes en la invencion [179].
H. Microparticulas
Las microparticulas tambien se pueden utilizar como coadyuvantes en la invencion. Se prefieren microparticulas (es decir una partfcula de ~100 nm a ~150 pm de diametro, mas preferiblemente de ~200 nm a ~30 pm de diametro, y lo mas preferiblemente de ~500 nm a ~10 pm de diametro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no toxicos (p.ej. un poli(a-hidroxiacido), un acido polihidroxibutmco, un poliortoester, un polianfndrido, una policaprolactona, etc.), con poli(lactida-co-glicolida), opcionalmente tratados para tener una superficie cargada negativamente (p.ej. con SDS) o una superficie cargada positivamente (p.ej. con un detergente cationico, tal como CTAB).
I. Liposomas
Los ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como coadyuvantes se describen en las ref. 180-182.
J. Formulaciones de eter de polioxietileno y ester de polioxietileno
Los coadyuvantes adecuados para su uso en la invencion incluyen eteres de polioxietileno y esteres de polioxietileno [183]. Tales formulaciones incluyen adicionalmente tensioactivos de ester de polioxietilensorbitan combinados con un octoxinol [184] asf como tensioactivos alquil eteres o esteres de polioxietilenp combinados con al menos un tensioactivo no ionico adicional tal como un octoxinol [185]. Los eteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: polioxietilen-9-lauril eter (laureth 9), polioxietilen-9-estearil eter, polioxiteilen-8-estearil eter, polioxietilen-4-lauril eter, polioxietilen-35-lauril eter, y polioxietilen-23-lauril eter.
K. Polifosfaceno (PCPP)
Las formulaciones de PCPP se describen, por ejemplo, en las ref. 186 y 187.
L. Muramil peptidos
Los ejemplos de muramil peptidos adecuados para su uso como coadyuvantes en la invencion incluyen N-acetil- muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), y N-
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acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanin-2- (1-2-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).
M. Compuestos de Imidazoguinolona.
Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para utilizar coadyuvantes en la invencion incluyen Imiquamod y sus homologos (p.ej. "Resiquimod 3M"), descrito adicionalmente en las ref. 188 y 189.
N. Compuestos de tiosemicarbazona.
Los ejemplos de compuestos de tiosemicarbazona, asf como los metodos de formulacion, fabricacion y escrutinio de compuestos, todos ellos adecuados para su uso como coadyuvantes en la invencion, incluyen los descritos en la ref. 190. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulacion de celulas mononucleares de sangre periferica humana para la produccion de citoquinas, tales como TNF-a.
O. Compuestos Triptantrina.
Los ejemplos de compuestos de triptantrina, asf como los metodos de formulacion, fabricacion y escrutinio de compuestos todos adecuados para su uso como coadyuvantes en la invencion incluyen los descritos en la ref. 191. Los compuestos de triptantrina son particularmente eficaces en la estimulacion de celulas mononucleares de sangre periferica humana para la produccion de citoquinas, tales como TNF-a.
La invencion tambien puede comprender combinaciones de aspectos de uno o mas de los coadyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, las siguientes combinaciones se pueden utilizar como composiciones coadyuvantes en la invencion: (1) una saponina y una emulsion de aceite en agua [192]; (2) una saponina (p.ej. QS21) + un derivado de LPS no toxico (p.ej. 3dMpL) [193]; (3) una saponina (p.ej. QS21) + un derivado de LpS no toxico (p.ej. 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (p.ej. QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [194]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [195]; (6) SAF, que contiene 10% de escualano, 0,4% de Tween 80™, 5% de polfmero de bloques pluronico L121, y thr-MDP, microfluidificado en una emulsion submicrometrica o agitado vorticialmente para generar una emulsion de mayor tamano de partfcula. (7) sistema coadyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene 2% de escualeno, 0,2% de Tween 80 y uno o mas componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de pared celular (CWS), preferiblemente MPL + CWS (Detox™); y (8) una o mas sales minerales + un derivado no toxico de LPS (tal como 3dMPL).
No es necesario que todos los productos conjugados sean adsorbidos, es decir algunos o todos pueden estar libres en solucion.
Metodos de tratamiento
La invencion tambien proporciona composiciones inmunogenicas para su uso en un metodo para elevar una respuesta inmunitaria en un mairnfero, que comprende administrar una composicion farmaceutica de la invencion al marnffero. La respuesta inmunitaria es preferiblemente protectora y preferiblemente implica anticuerpos. El metodo puede generar una respuesta de refuerzo.
El mamffero es preferiblemente un ser humano. Cuando la vacuna es para uso profilactico, el ser humano es preferiblemente un nino (p.ej. un nino pequeno o lactante) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapeutico, el ser humano es preferiblemente un adulto. Tambien se puede administrar a adultos una vacuna para ninos p.ej. para evaluar la seguridad, la dosificacion, la inmunogenicidad, etc. Una clase preferida de seres humanos para el tratamiento son las mujeres en edad fertil (p.ej. adolescentes y mayores). Otra clase preferida son las mujeres embarazadas. Los pacientes de edad avanzada (p.ej. aquellos por encima de 50, 60, 70, 80 o 90 etc. anos de edad, particularmente mayores de 65 anos de edad), especialmente aquellos que viven en hogares de ancianos donde el riesgo de infeccion por GBS puede aumentar ([196]), son otra clase preferida de seres humanos para el tratamiento. En algunas realizaciones, el ser humano tiene un nivel indetectable de anticuerpos contra el sacarido capsular de serotipo la del GBS antes de la administracion de la composicion farmaceutica. En otras realizaciones, el ser humano tiene un nivel indetectable de anticuerpos contra el sacarido capsular de serotipo lb de GBS antes de la administracion de la composicion farmaceutica. En otras realizaciones, el ser humano tiene un nivel indetectable de anticuerpos contra el sacarido capsular de serotipo Ill de GBS antes de la administracion de la composicion farmaceutica. En particular, el ser humano puede tener un nivel indetectable de anticuerpos contra el sacarido capsular de serotipo la de GBS y un nivel indetectable de anticuerpos contra el sacarido capsular de serotipo lb de gBs antes de la administracion de la composicion farmaceutica. Alternativamente o ademas, el ser humano puede tener un nivel indetectable de anticuerpos contra el sacarido capsular de serotipo lll de GBS antes de la administracion de la composicion farmaceutica. El nivel o los niveles de anticuerpos contra el sacarido o los sacaridos capsulares se pueden determinar utilizando el ELlSA descrito en Estudio en seres humanos (1) mas abajo. El nivel o los niveles de anticuerpos pueden ser de un mes antes de la administracion, particularmente en el plazo del mes anterior a la administracion (p.ej. en el plazo de dos semanas, en el plazo de una semana o el dfa de la administracion). Las mujeres con estos niveles indetectables de anticuerpos contra el sacarido o los sacaridos capsulares pueden tener tasas mas altas de infeccion por GBS en sus recien nacidos. Esto se debe a que los niveles mas altos de anticuerpos maternos contra los sacaridos capsulares de GBS se correlacionan con un menor
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riesgo de enfermedad en los recien nacidos [ref. 197 y 198]. Por consiguiente, la administracion a estas mujeres esta espedficamente prevista en la presente invencion.
En algunas realizaciones, el paciente ha sido preinmunizado con un toxoide difterico o un derivado del mismo, p.ej. como se describe a continuacion con respecto al segundo aspecto de la invencion en la seccion El paciente preinmunizado. En estas realizaciones, se prefiere que al menos un producto conjugado en la composicion inmunogenica sea un sacarido capsular de GBS conjugado con un toxoide difterico o un derivado del mismo. Los autores de la presente invencion han descubierto que la respuesta inmunitaria al sacarido capsular puede mejorarse presentando el sacarido en un toxoide difterico o un derivado del mismo, cuando el paciente ha sido preinmunizado con un toxoide difterico o un derivado del mismo. El sacarido capsular conjugado con el toxoide difterico o derivado del mismo en la composicion puede ser, por ejemplo, de serotipo la, Ib o III de GBS. En particular, el sacarido capsular puede ser del serotipo III de GBS (como se ilustra a continuacion). En estas realizaciones, es tipico que todos los sacaridos capsulares de GBS en la composicion se conjuguen con un toxoide difterico o un derivado del mismo. Cuando el portador o el antigeno de preinmunizacion es un derivado de un toxoide difterico, ese derivado preferiblemente permanece inmunologicamente reactivo de forma cruzada con Dt, y es preferiblemente CRM197.
La invencion tambien proporciona una composicion de la invencion para su uso como medicamento. El medicamento es preferiblemente capaz de elevar una respuesta inmunitaria en un mamffero (es decir es una composicion inmunogenica) y es mas preferiblemente una vacuna.
La invencion tambien proporciona el uso de una composicion de la invencion en la fabricacion de un medicamento para elevar una respuesta inmunitaria en un mairtifero.
Estos usos y metodos son preferiblemente para la prevencion y/o el tratamiento de una enfermedad causada por S. agalactiae, p.ej. sepsis o bacteriemia neonatal, neumoma neonatal, meningitis neonatal, endometritis, osteomielitis, artritis septica, etc.
El sujeto en el que se previene la enfermedad puede no ser el mismo que el sujeto que recibe el producto conjugado de la invencion. Por ejemplo, un producto conjugado se puede administrar a una mujer (antes o durante el embarazo) para proteger a la descendencia (la llamada "inmunizacion materna" [199-201]).
Una forma de verificar la eficacia del tratamiento terapeutico implica controlar la infeccion por GBS despues de la administracion de la composicion de la invencion. Una forma de verificar la eficacia del tratamiento profilactico implica controlar las respuestas inmunitarias contra los antigenos de GBS despues de la administracion de la composicion.
Las composiciones preferidas de la invencion pueden conferir un titulo de anticuerpo en un paciente que sea superior al criterio de seroproteccion para cada componente antigenico para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Los antigenos con un tftulo de anticuerpos asociado por encima del cual se considera que un anfitrion se seroconvierte contra el antigeno son bien conocidos, y tales titulos son publicados por organizaciones tales como la OMS. Preferiblemente, mas de 80% de una muestra estadfsticamente significativa de sujetos se seroconvierte, mas preferiblemente mas de 90%, aun mas preferiblemente mas de 93% y lo mas preferiblemente de 96 a 100%.
Las composiciones de la invencion generalmente se administraran directamente a un paciente. La administracion directa puede lograrse mediante inyeccion parenteral (p.ej. subcutaneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, o al espacio intersticial de un tejido), o mediante administracion rectal, oral, vaginal, topica, transdermica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra mucosal. Se prefiere la administracion intramuscular al muslo o la parte superior del brazo. La inyeccion puede ser a traves de una aguja (p.ej. una aguja hipodermica), pero alternativamente puede utilizarse una inyeccion sin aguja. Una dosis intramuscular tipica es de 0,5 ml.
La invencion se puede utilizar para provocar inmunidad sistemica y/o mucosal.
El tratamiento de dosificacion puede ser un programa de dosis unitaria o un programa de dosis multiple. Se pueden utilizar dosis multiples en un cronograma de inmunizacion primaria y/o en un cronograma de inmunizacion de refuerzo. Un cronograma de dosis primaria puede estar seguido por un cronograma de dosis de refuerzo. El tiempo adecuado entre las dosis de cebado (p.ej. entre 4 y 16 semanas), y entre el cebado y el refuerzo, se puede determinar de forma rutinaria.
Antigenos proteicos de GBS
Como se ha mencionado anteriormente, las protemas GBS se pueden incluir en las composiciones de la invencion. Estas se pueden utilizar como protemas portadoras para productos conjugados de la invencion, protemas portadoras para otros productos conjugados o como antigenos proteicos no conjugados.
Los antigenos proteicos de GBS para su uso en la invencion incluyen los descritos en las referencias 99 y 202-204. Dos antigenos proteicos de GBS preferidos para su uso en la invencion se conocen como: GBS67; y GBS80 [vease la ref. 99]. Otro antigeno proteico de GBS adicionalmente preferido para su uso en la invencion se conoce como
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Spb1 [vease la ref. 205]. A continuacion se proporcionan mas detalles de estos tres antigenos.
Las secuencias completas para estas tres protemas de GBS son SEQ ID NO 1 a 3 de la presente memoria. Las composiciones de la invencion pueden incluir as^ (a) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre SEQ ID NO 1 a 3, y/o (b) un polipeptido que comprende (i) una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia con uno o mas de SEQ ID NO 1 a 3 y/o (ii) un fragmento de SEQ ID NO 1 a 3.
Las composiciones de la invencion tambien pueden comprender mezclas de estos antigenos proteicos de GBS.
En particular, las composiciones de la invencion pueden incluir:
(a-i) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 1, y/o (b-i) un polipeptido que comprende (i) una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia con SEQ ID NO 1 y/o (ii) un fragmento de SEQ ID NO 1; y
(a2) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 2, y/o (b2) un polipeptido que comprende (i) una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia con SEQ ID NO 2 y/o (ii) un fragmento de SEQ ID NO 2.
De forma similar, las composiciones de la invencion pueden incluir:
(a1) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 1, y/o (b1) un polipeptido que comprende (i) una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia con SEQ ID NO 1 y/o (ii) un fragmento de SEQ ID NO 1; y
(a2) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 3, y/o (b2) un polipeptido que comprende (i) una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia con SEQ ID NO 3 y/o (ii) un fragmento de SEQ ID NO 3.
Del mismo modo, las composiciones de la invencion pueden incluir:
(a1) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 2, y/o (b1) un polipeptido que comprende (i) una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia con SEQ ID NO 2 y/o (ii) un fragmento de SEQ ID NO 2; y
(a2) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 3, y/o (b2) un polipeptido que comprende (i) una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia con SEQ ID NO 3 y/o (ii) un fragmento de SEQ ID NO 3.
Las composiciones de la invencion pueden incluir:
(a1) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 1, y/o (b1) un polipeptido que comprende (i) una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia con SEQ ID NO 1 y/o (ii) un fragmento de SEQ ID NO 1;
(a2) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 2, y/o (b2) un polipeptido que comprende (i) una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia con SEQ ID NO 2 y/o (ii) un fragmento de SEQ ID NO 2; y
(a3) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 3, y/o (b3) un polipeptido que comprende (i) una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia con SEQ ID NO 3 y/o (ii) un fragmento de SEQ ID NO 3.
Otros tres antfgenos proteicos de GBS preferidos para su uso en la invencion se conocen como: GBS104; GBS276; y GBS322 [vease la ref. 99]. La secuencia de aminoacidos de GBS104 de tipo salvaje de la cepa 2603 V/R aislada del serotipo V se proporciona en la referencia 21 como SEQ ID NO: 3 en la misma. Cuando las realizaciones de la presente invencion se definen en la presente memoria mediante la referencia a SEQ ID NO: 1, las referencias a SEQ ID NO: 1 pueden sustituirse por las referencias a SEQ ID NO: 3 de la referencia 21. La secuencia de aminoacidos de GBS276 de tipo salvaje de la cepa aislada del serotipo V 2603 V/R se proporciona en la referencia 21 como SEQ ID NO: 4 en la misma. Cuando las realizaciones de la presente invencion se definen en la presente memoria mediante la referencia a SEQ ID NO: 2, las referencias a SEQ ID NO: 2 pueden sustituirse por las referencias a SEQ ID NO: 4 de la referencia 21. La secuencia de aminoacidos de GBS322 de tipo salvaje de la cepa aislada del serotipo V 2603 V/R se proporciona en la referencia 21 como SEQ ID NO: 5 en la misma. Cuando las realizaciones de la presente invencion se definen en la presente memoria mediante referencia a SEQ ID NO: 3, las referencias a SEQ ID NO: 3 pueden sustituirse por las referencias a SEQ ID NO: 5 de la referencia 21.
Dependiendo del SEQ ID NO concreto, el grado de identidad de secuencia en (i) es preferiblemente mayor que 50% (p.ej. 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mas). Estos polipeptidos incluyen homologos, ortologos, variantes alelicas y mutantes funcionales. Tfpicamente, 50% de
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identidad o mas entre dos secuencias polipeptidicas se considera una indicacion de equivalencia funcional. La identidad entre polipeptidos se determina preferiblemente mediante el algoritmo de busqueda de homolog^a de Smith-Waterman implementado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), utilizando una busqueda de hueco afm con parametros de penalizacion por apertura de hueco =12 y penalizacion por extension de hueco =1.
Dependiendo del SEQ ID NO concreto, los fragmentos de (ii) deben comprender al menos n aminoacidos consecutivos de las secuencias y, dependiendo de la secuencia concreta, n es 7 o mas (p.ej. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o mas). El fragmento puede comprender al menos un epttopo de celula T o, preferiblemente, un epftopo de celula B de la secuencia. Los epftopos de celulas T y B pueden identificarse empmcamente (p.ej. utilizando PEPSCAN [206,207] o metodos similares), o pueden predecirse (p.ej. utilizando el mdice antigenico de Jameson-Wolf [208], enfoques basados en matrices [209], TEPITOPE [210], redes neuronales [211], OptiMer y EpiMer [212, 213], ADEPT [214], Tsites [215], caracter hidrofilo [216], mdice antigenico [217] o los metodos descritos en la referencia 218 etc.). Otros fragmentos preferidos son SEQ ID NO 1 a 3 sin su resto de aminoacido N-terminal o sin su peptido senal N-terminal. Se puede utilizar la eliminacion de uno o mas dominios, tales como una region lfder o secuencia senal, una region transmembrana, una region citoplasmica o un motivo de anclaje a la pared celular. Los fragmentos preferidos de una protema concreta se pueden unir a un anticuerpo que se puede unir a la protema concreta completa p.ej. se puede unir a un anticuerpo que se une a SEQ ID NO: 1, 2 o 3. Algunos fragmentos utiles se proporcionan a continuacion (SEQ ID NO 4 a 13).
Estos polipeptidos pueden, en comparacion con SEQ ID NO 1 a 3, incluir uno o mas (p.ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) reemplazos de aminoacidos conservativos es decir reemplazos de un aminoacido por otro que tiene una cadena lateral relacionada. Los aminoacidos geneticamente codificados generalmente se dividen en cuatro familias: (1) acidos es decir aspartato, glutamato; (2) alcalinos es decir lisina, arginina, histidina; (3) no polares es decir alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polares sin carga es decir glicina, asparragina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptofano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoacidos aromaticos. En general, la sustitucion de aminoacidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto importante sobre la actividad biologica. Los polipeptidos tambien pueden incluir uno o mas (p.ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) deleciones de un unico aminoacido con respecto a SEQ ID NO 1 a 3. Los polipeptidos tambien pueden incluir uno o mas (p.ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) inserciones (p.ej. cada uno de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoacidos) con respecto a SEQ ID NO 1 a 3.
Los polipeptidos de la invencion se pueden preparar de muchas maneras, p.ej. mediante smtesis qmmica (en su totalidad o en parte), mediante la digestion de polipeptidos mas largos utilizando proteasas, mediante traduccion a partir de ARN, mediante purificacion del cultivo celular (p.ej. a partir de la expresion recombinante), a partir del propio organismo (p.ej. despues del cultivo bacteriano, o directamente a partir de los pacientes), etc. Un metodo preferido para la produccion de peptidos con menos de 40 aminoacidos de longitud implica smtesis qmmica in vitro [219,220]. La smtesis de peptidos en fase solida es particularmente preferida, tal como los metodos basados en la qmmica tBoc o Fmoc [221]. La smtesis enzimatica [222] tambien se puede utilizar en parte o en su totalidad. Como alternativa a la smtesis qmmica, se puede utilizar smtesis biologica p.ej. los polipeptidos pueden producirse mediante traduccion. Esto puede llevarse a cabo in vitro o en vivo. Los metodos biologicos se restringen en general a la produccion de polipeptidos basados en L-aminoacidos, pero se puede utilizar la manipulacion de la maquinaria de traduccion (p.ej. de las moleculas de aminoacil ARNt) para permitir la introduccion de D-aminoacidos (o de otros aminoacidos no naturales, como la yodotirosina o la metilfenilalanina, la azidohomoalanina, etc.) [223]. Sin embargo, cuando se incluyen D-aminoacidos, se prefiere utilizar smtesis qmmica. Los polipeptidos de la invencion pueden tener modificaciones covalentes en el extremo C-terminal y/o el extremo N-terminal.
Si estas protemas de GBS se incluyen en las composiciones de la invencion, pueden adoptar diversas formas (p.ej. nativa, fusiones, glicosilada, no glicosilada, lipidada, no lipidada, fosforilada, no fosforilada, miristoilada, no miristoilada, monomerica, multimerica, particulada, desnaturalizada, etc.). Se utilizan preferiblemente en forma purificada o sustancialmente purificada es decir sustancialmente libres de otros polipeptidos (p.ej. libres de polipeptidos de origen natural), particularmente de otros polipeptidos de GBS o de la celula anfitriona).
GBS67
La secuencia de nucleotidos y de aminoacidos de GBS67 secuenciada a partir de la cepa 2603 V/R de serotipo V se exponen en la ref. 99 como SEQ ID NO 3745 y 3746. La secuencia de aminoacidos es SEQ ID NO: 1 en la presente memoria:
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MRKYQKFSKILTLSLFCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLWKKTDDQNKPLSKATFVLKTTAHPESKIEKVTAELT GEATFDNLIPGDYTLSEETAPEGYKKTNQTWQVKVESNGKTTIQNSGDKNSTIGQNQEELDKQYPPTGIYEDTKESYKL EHVKGSVPNGKSEAKAVNPYSSEGEHIREIPEGTLSKRISEVGDLAHNKYKIELTVSGKTIVKPVDKQKPLDVVFVLDN SNSMNNDGPNFQRHNKAKKAAEALGTAVKDILGANSDNRVALVTYGSDIFDGRSVDWKGFKEDDKYYGLQTKFTIQTE NYSHKQLTNNAEEIIKRIPTEAPKAKWGSTTNGLTPEQQKEYYLSKVGETFTMKAFMEADDILSQVNRNSQKIIVHVTD GVPTRSYAINNFKLGASYESQFEQMKKNGYLNKSNFLLTDKPEDIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHYLDLNL NYPKGTIYRNGPVKEHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEEYKKNQDGTFQKLKEEAFKLSDGEITELM RSFSSKPEYYTPIVTSADTSNNEILSKIQQQFETILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLQLGNGQTLQPSDYTLQGNDGSV MKDGIATGGPNNDGGILKGVKLEYIGNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEDPNTLR DFPIPKIRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFIKVDKDNNKLLLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKVVTGENGKISYK DLKDGKYQLIEAVSPEDYQKITNKPILTFEVVKGSIKNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGIIPMTGGKGILS FILIGGAMMSIAGGIYIWKRYKKSSDMSIKKD
GBS67 contiene una region transmembrana en el extremo C-terminal que esta indicada por la region subrayada mas cercana al extremo C-terminal de SEQ ID NO: 1 anterior. Se pueden eliminar uno o mas aminoacidos de la region transmembrana, o el aminoacido se puede truncar antes de la region transmembrana. Un ejemplo de dicho fragmento de GBS67 se expone a continuacion como SEQ ID NO: 4.
MRKYQKFSKILTLSLFCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLWKKTDDQNKPLSKATFVLKTTAHPESKIEKVTAELT GEATFDNLIPGDYTLSEETAPEGYKKTNQTWQVKVESNGKTTIQNSGDKNSTIGQNQEELDKQYPPTGIYEDTKESYKL EHVKGSVPNGKSEAKAVNPYSSEGEHIREIPEGTLSKRISEVGDLAHNKYKIELTVSGKTIVKPVDKQKPLDVVFVLDN SNSMNNDGPNFQRHNKAKKAAEALGTAVKDILGANSDNRVALVTYGSDIFDGRSVDWKGFKEDDKYYGLQTKFTIQTE
NYSHKQLTNNAEEIIKRIPTEAPKAKWGSTTNGLTPEQQKEYYLSKVGETFTMKAFMEADDILSQVNRNSQKIIVHVTD GVPTRSYAINNFKLGASYESQFEQMKKNGYLNKSNFLLTDKPEDIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHYLDLNL NYPKGTIYRNGPVKEHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEEYKKNQDGTFQKLKEEAFKLSDGEITELM RSFSSKPEYYTPIVTSADTSNNEILSKIQQQFETILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLQLGNGQTLQPSDYTLQGNDGSV MKDGIATGGPNNDGGILKGVKLEYIGNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEDPNTLR DFPIPKIRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFIKVDKDNNKLLLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKVVTGENGKISYK DLKDGKYQLIEAVSPEDYQKITNKPILTFEVVKGSIKNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGIIPMTGGKGILS
GBS67 contiene un motivo aminoaddico indicativo de un ancla a la pared celular, que se muestra en cursiva en SEQ ID NO: 1 anterior. En algunos sistemas de celulas anfitrionas recombinantes, puede ser preferible eliminar este motivo para facilitar la secrecion de una protema recombinante GBS67 de la celula anfitriona. Por consiguiente, en un fragmento preferido de GBS67 para su uso en la invencion, los motivos transmembrana y de ancla a la pared celular se eliminan de GBS67. Un ejemplo de dicho fragmento de GBS67 se expone a continuacion como sEq ID NO: 5.
MRKYQKFSKILTLSLFCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLWKKTDDQNKPLSKATFVLKTTAHPESKIEKVTAELT GEATFDNLIPGDYTLSEETAPEGYKKTNQTWQVKVESNGKTTIQNSGDKNSTIGQNQEELDKQYPPTGIYEDTKESYKL EHVKGSVPNGKSEAKAVNPYSSEGEHIREIPEGTLSKRISEVGDLAHNKYKIELTVSGKTIVKPVDKQKPLDVVFVLDN SNSMNNDGPNFQRHNKAKKAAEALGTAVKDILGANSDNRVALVTYGSDIFDGRSVDWKGFKEDDKYYGLQTKFTIQTE NYSHKQLTNNAEEIIKRIPTEAPKAKWGSTTNGLTPEQQKEYYLSKVGETFTMKAFMEADDILSQVNRNSQKIIVHVTD GVPTRSYAINNFKLGASYESQFEQMKKNGYLNKSNFLLTDKPEDIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHYLDLNL NYPKGTIYRNGPVKEHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEEYKKNQDGTFQKLKEEAFKLSDGEITELM RSFSSKPEYYTPIVTSADTSNNEILSKIQQQFETILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLQLGNGQTLQPSDYTLQGNDGSV MKDGIATGGPNNDGGILKGVKLEYIGNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEDPNTLR DFPIPKIRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFIKVDKDNNKLLLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKVVTGENGKISYK DLKDGKYQLIEAVSPEDYQKITNKPILTFEVVKGSIKNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGI
Alternativamente, en algunos sistemas de celulas anfitrionas recombinantes, puede ser preferible utilizar el motivo de ancla a la pared celular para anclar la protema expresada de forma recombinante a la pared celular. El dominio extracelular de la protema expresada se puede escindir durante la purificacion o la protema recombinante se puede dejar anclada a celulas anfitrionas inactivadas o membranas celulares en la composicion final.
Se han identificado tres motivos de pilina, que contienen restos de lisina conservados en GBS67. Los restos de lisina conservados estan en los restos de aminoacido 478 y 488, en los restos de aminoacido 340 y 342, y en los restos de aminoacido 703 y 717. Se cree que las secuencias de pilina, en particular los restos conservados de lisina, son importantes para la formacion de estructuras oligomericas, de tipo pilus de GBS67. Los fragmentos preferidos de gBs 67 incluyen al menos un resto de lisina conservado. Tambien se han identificado en GBS67 dos cajas E que contienen restos glutamicos conservados. Los fragmentos preferidos de GBS67 incluyen al menos un resto de acido glutamico conservado. GBS67 contiene varias regiones que se pronostica que forman estructuras alfa helicoidales. Es probable que tales regiones alfa helicoidales formen estructuras de bobina en espiral y pueden estar implicadas en la oligomerizacion de GBS67. GBS67 tambien contiene una region que es homologa al dominio Cna_B de la protema de superficie de union al colageno S. aureus (pfam05738). Esta puede formar una estructura sandwich
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beta. GBS67 contiene una region que es homologa a un dominio de tipo A de von Willebrand (vWF).
La secuencia de aminoacidos de GBS67 secuenciada a partir de la cepa H36B de serotipo Ib se expone en la ref. 224 como SEQ ID NO 20906. La secuencia de aminoacidos es SEQ ID NO: 24 en la presente memoria:
MRKYQKFSKILTLSLFCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLWKKTDDQNKPLSKATFVLKPTSHSESKVEKVTTEVT GEATFDNLTPGDYTLSEETAPEGYKKTTQTWQVKVESNGKTTIQNSDDKKSIIEQRQEELDKQYPLTGAYEDTKESYNL EHVKNSIPNGKLEAKAVNPYSSEGEHIREIQEGTLSKRISEVNDLDHNKYKIELTVSGKSIIKTINKDEPLDVVFVLDN SNSMKNNGKNNKAKKAGEAVETIIKDVLGANVENRAALVTYGSDIFDGRTVKVIKGFKEDPYYGLETSFTVQTNDYSYK KFTNIAADIIKKIPKEAPEAKWGGTSLGLTPEKKREYDLSKVGETFTMKAFMEADTLLSSIQRKSRKIIVHLTDGVPTR
SYAINSFVKGSTYANQFERIKEKGYLDKNNYFITDDPEKIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHYLDLNLNYPKG TIYRNGPVREHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEDYKKNQDGTFQKLKEEAFELSDGEITELMNSFSS KPEYYTPIVTSADVSNNEILSKIQQQFEKILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLHLGNGQTLQPSDYTLQGNDGSIMKDSI ATGGPNNDGGILKGVKLEYIKNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEEPDTLRDFPIP KIRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFTKVDKDNNKLLLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKVVTGENGKISYKDLKDG KYQLIEAVSPKDYQKITNKPILTFEWKGSIQMIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGIJPMYGGKGILSFILIG GAMMSIAGGIYIWKRHKKSSDASIEKD
En algunas realizaciones, se puede utilizar esta variante de GBS67. Por consiguiente, cuando las realizaciones de la presente invencion se definen en la presente memoria mediante la referencia a SEQ ID NO: 1, las referencias a SEQ ID NO: 1 se pueden sustituir por las referencias a SEQ ID NO: 24.
Al igual que GBS67 secuenciado a partir de la cepa 2603 V/R de serotipo V, GBS67 secuenciado a partir de la cepa H36B de serotipo Ib contiene una region transmembrana en el extremo C-terminal que esta indicada por la region subrayada mas cercana al extremo C terminal de SEQ ID NO: 24 anterior. Se pueden eliminar uno o mas aminoacidos de la region transmembrana, o el aminoacido se puede truncar antes de la region transmembrana. Un ejemplo de dicho fragmento de GBS67 se expone a continuacion como SEQ ID NO: 25.
MRKYQKFSKILTLSLFCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLWKKTDDQNKPLSKATFVLKPTSHSESKVEKVTTEVT GEATFDNLTPGDYTLSEETAPEGYKKTTQTWQVKVESNGKTTIQNSDDKKSIIEQRQEELDKQYPLTGAYEDTKESYNL EHVKNSIPNGKLEAKAVNPYSSEGEHIREIQEGTLSKRISEVNDLDHNKYKIELTVSGKSIIKTINKDEPLDVVFVLDN SNSMKNNGKNNKAKKAGEAVETIIKDVLGANVENRAALVTYGSDIFDGRTVKVIKGFKEDPYYGLETSFTVQTNDYSYK KFTNIAADIIKKIPKEAPEAKWGGTSLGLTPEKKREYDLSKVGETFTMKAFMEADTLLSSIQRKSRKIIVHLTDGVPTR SYAINSFVKGSTYANQFERIKEKGYLDKNNYFITDDPEKIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHYLDLNLNYPKG TIYRNGPVREHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEDYKKNQDGTFQKLKEEAFELSDGEITELMNSFSS KPEYYTPIVTSADVSNNEILSKIQQQFEKILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLHLGNGQTLQPSDYTLQGNDGSIMKDSI ATGGPNNDGGILKGVKLEYIKNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEEPDTLRDFPIP KIRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFTKVDKDNNKLLLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKVVTGENGKISYKDLKDG KYQLIEAVSPKDYQKITNKPILTFEWKGSIQNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGIIPMTGGKGILS
Al igual que GBS67 secuenciado a partir de la cepa 2603 V/R de serotipo V, GBS67 secuenciado a partir de la cepa H36B de serotipo Ib contiene un motivo aminoaddico indicativo de un ancla a la pared celular, que se muestra en cursiva en SEQ ID NO: 24 anterior. Por consiguiente, en un fragmento preferido de GBS67 para su uso en la invencion, los motivos transmembrana y de ancla a la pared celular se eliminan de GBS67. Un ejemplo de tal fragmento de GBS67 se expone a continuacion como SEQ ID NO: 26.
MRKYQKFSKILTLSLFCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLWKKTDDQNKPLSKATFVLKPTSHSESKVEKVTTEVT GEATFDNLTPGDYTLSEETAPEGYKKTTQTWQVKVESNGKTTIQNSDDKKSIIEQRQEELDKQYPLTGAYEDTKESYNL EHVKNSIPNGKLEAKAVNPYSSEGEHIREIQEGTLSKRISEVNDLDHNKYKIELTVSGKSIIKTINKDEPLDVVFVLDN SNSMKNNGKNNKAKKAGEAVETIIKDVLGANVENRAALVTYGSDIFDGRTVKVIKGFKEDPYYGLETSFTVQTNDYSYK KFTNIAADIIKKIPKEAPEAKWGGTSLGLTPEKKREYDLSKVGETFTMKAFMEADTLLSSIQRKSRKIIVHLTDGVPTR SYAINSFVKGSTYANQFERIKEKGYLDKNNYFITDDPEKIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHYLDLNLNYPKG TIYRNGPVREHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEDYKKNQDGTFQKLKEEAFELSDGEITELMNSFSS KPEYYTPIVTSADVSNNEILSKIQQQFEKILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLHLGNGQTLQPSDYTLQGNDGSIMKDSI ATGGPNNDGGILKGVKLEYIKNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEEPDTLRDFPIP KIRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFTKVDKDNNKLLLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKVVTGENGKISYKDLKDG KYQLIEAVSPKDYQKITNKPILTFEWKGSIQNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGI
GBS80
GBS80 se refiere a una supuesta protema de la familia de anclas a la superficie de la pared celular. La secuencia de nucleotidos y de aminoacidos de GBS80 secuenciada a partir de la cepa 2603 V/R aislada del serotipo V se exponen en la ref. 99 como SEQ ID NO 8779 y 8780. La secuencia de aminoacidos se expone a continuacion como SEQ ID NO: 2:
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MKLSKKLLFSAAVLTMVAGSTVEPVAQFATGMSIVRAAEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVIS NYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYV EDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNWTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIP
ANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQD ALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQT LGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKA PEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPSJPNTGGIGTAIFVAIGAAVMAFAVKGMKRRTKD N
GBS80 contiene un Ifder N-terminal o region de secuencia senal que se indica mediante la secuencia subrayada anterior. Se pueden eliminar uno o mas aminoacidos de la region Ifder o secuencia senal de GBS80. Un ejemplo de dicho fragmento de GBS80 se expone a continuacion como SEQ ID NO: 6:
AEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTV EAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEIN IYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRD EHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTF ELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAV TGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPD TIKNNKRPSIPNTGGIGTAIFVAIGAAVMAFAVKGMKRRTKDN
GBS80 contiene una region transmembrana C-terminal que esta indicada por la secuencia subrayada cerca del final de SEQ ID NO: 2 anterior. Se pueden eliminar uno o mas aminoacidos de la region transmembrana y/o una region citoplasmica. Un ejemplo de tal fragmento se expone a continuacion como SEQ ID NO: 7:
MKLSKKLLFSAAVLTMVAGSTVEPVAQFATGMSIVRAAEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVIS NYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLWDALDSKSNVRYLYV EDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNWTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIP ANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQD ALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQT LGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKA PEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPSIPNTG
GBS80 contiene un motivo aminoaddico indicativo de un ancla a la pared celular, que se muestra en cursiva en SEQ ID NO: 2 anterior. En algunos sistemas de celulas anfitrionas recombinantes, puede ser preferible eliminar este motivo para facilitar la secrecion de una protema GBS80 recombinante de la celula anfitriona. Por lo tanto, las regiones transmembrana y/o citoplasmica y el motivo de ancla de la pared celular se pueden eliminar de GBS80. Un ejemplo detal fragmento se expone a continuacion como SEQ ID NO: 8.
MKLSKKLLFSAAVLTMVAGSTVEPVAQFATGMSIVRAAEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVIS NYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYV EDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNWTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIP ANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQD ALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQT LGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKA PEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPS
Alternativamente, en algunos sistemas de celulas anfitrionas recombinantes, puede ser preferible utilizar el motivo de ancla a la pared celular para anclar la protema expresada de forma recombinante a la pared celular. El dominio extracelular de la protema expresada se puede escindir durante la purificacion o la protema recombinante se puede dejar anclada a celulas anfitrionas inactivadas o membranas celulares en la composicion final.
En una realizacion, la region lfder o secuencia senal, las regiones transmembrana y citoplasmica y el motivo de ancla a la pared celular se eliminan de la secuencia de GBS80. Un ejemplo de dicho fragmento de GBS80 se expone a continuacion como SEQ ID NO: 9:
AEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTV
EAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEIN
IYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRD EHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTF ELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAV TGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPD TIKNNKRPS
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AEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTV
EAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEIN
IYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRD
EHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKG
Spb1
La secuencia de SpbI de tipo salvaje de la cepa COH1 de serotipo III es SEQ ID NO: 3 de la presente memoria:
MKKKMIQSLLVASLAFGMAVSPVTPIAFAAETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEA EYKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKKDTASANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNG AVIMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDGGGKTVDQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASWDLNE GSYEVTITDGSGNITTLTQGSEKATGKYNLLEENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKS GAKPGSADLPENTNIATINPNTSNDDPGQKVTVRDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTE ANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYLVEKKAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVNPTVENNKGTELPSFGGI GTTIFYIIGAILVIGAGIVLVARRRLRS
SpbI de tipo salvaje contiene una region lfder o de secuencia senal N-terminal que se indica mediante la secuencia subrayada anterior (aa 1-29). Se pueden eliminar uno o mas aminoacidos de la region lfder o secuencia senal de SpbI. Un ejemplo de dicho fragmento de SpbI se expone a continuacion como SEQ ID NO: 11:
AETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEAEYKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKKDTA SANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNGAVIMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDGGGK TVDQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASVVDLNEGSYEVTITDGSGNITTLTQGSEKATGKYN LLEENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKSGAKPGSADLPENTNIATINPNTSNDDPGQ KVTVRDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYLVEK KAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVNPTVENNKGTELPSTGGIGTTIFYIIGAILVIGAGIVLVARRRLRS
La secuencia de SpbI de tipo salvaje contiene un motivo aminoaddico indicativo de un ancla a la pared celular (LPSTG). En algunos sistemas de celulas anfitrionas recombinantes, puede ser preferible eliminar este motivo para facilitar la secrecion de una protema SpbI recombinante a partir de la celula anfitriona. Por lo tanto, el motivo de ancla a la pared celular y la secuencia C-terminal para este motivo pueden eliminarse de SpbI. Un ejemplo de tal fragmento se expone a continuacion como SEQ ID NO: 12:
MKKKMIQSLLVASLAFGMAVSPVTPIAFAAETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEA EYKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKKDTASANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNG AVIMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDGGGKTVDQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASVVDLNE GSYEVTITDGSGNITTLTQGSEKATGKYNLLEENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKS GAKPGSADLPENTNIATINPNTSNDDPGQKVTVRDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTE ANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYLVEKKAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVNPTVENNKGTE
Alternativamente, en algunos sistemas de celulas anfitrionas recombinantes, puede ser preferible utilizar el motivo de ancla a la pared celular para anclar la protema expresada de forma recombinante a la pared celular. El dominio extracelular de la protema expresada se puede escindir durante la purificacion o la protema recombinante se puede dejar anclada a celulas anfitrionas inactivadas o membranas celulares en la composicion final.
En una realizacion, la region lfder o de secuencia senal, el motivo de ancla a la pared celular y la secuencia C- terminal para este motivo se eliminan de SpbI. Un ejemplo de dicho fragmento de SpbI se expone a continuacion como SEQ ID NO: 13:
AETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEAEYKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKKDTA SANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNGAVIMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDGGGK TVDQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASVVDLNEGSYEVTITDGSGNITTLTQGSEKATGKYN LLEENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKSGAKPGSADLPENTNIATINPNTSNDDPGQ KVTVRDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYLVEK KAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVMPTVENNKGTE
Una caja E que contiene un resto glutamico conservado tambien se ha identificado en SpbI (subrayado), con un acido glutamico conservado en el resto 423 (negrita). El motivo de la caja E puede ser importante para la formacion de estructuras oligomericas de tipo pilus, y los fragmentos utiles de SpbI pueden incluir el resto de acido glutamico conservado.
La secuencia de Spb1 de tipo salvaje incluye un codon de metionina interno (Met-162) que tiene una Secuencia TAATGGAGCTGT (SEQ ID NO: 14) de 12 unidades aguas arriba que incluye la secuencia nucleo (subrayada) de
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una secuencia Shine-Dalgarno. Se ha encontrado que esta secuencia de Shine-Dalgarno inicia la traduccion de una secuencia de Spb1 truncada. Para evitar el inicio de la traduccion en este sitio, la secuencia de Shine-Dalgarno puede alterarse en una secuencia codificante de Spb1 utilizada para la expresion. Aunque se puede mutar cualquier nucleotido adecuado para evitar la union al ribosoma, la secuencia incluye un codon de glicina GGA que es parte del nucleo de Shine-Dalgarno y esta en marco con el codon de metionina interno. La tercera base en este codon puede mutarse a C, G o T sin cambiar la glicina codificada, evitando asf cualquier cambio en la secuencia de Spb1.
Las composiciones de la invencion tambien pueden incluir un polipeptido definido en la referencia [225] por la secuencia de aminoacidos NH2-W-X-L-Y-Z-CO2H, en donde: X es una secuencia de Spb1; L es un conector opcional; e Y es una secuencia de GBS80; W es una secuencia N-terminal opcional; y Z es una secuencia C- terminal opcional. A continuacion se proporcionan mas detalles de este polipeptido.
Estas composiciones tambien pueden comprender uno o mas de los antigenos proteicos de GBS descritos anteriormente. En particular, las composiciones de la invencion pueden incluir (a) un polipeptido de la secuencia de aminoacidos NH2-W-X-L-Y-Z-CO2H; y B1) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO 1 como se describio anteriormente, y/o (b2) un polipeptido que comprende (i) una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia con SEQ iD NO 1 como se describio anteriormente y/o (ii) un fragmento de SEQ ID No 1 como se describio anteriormente.
Polipeptido NH2-W-X-L-Y-Z-CO2H
Tfpicamente, el polipeptido comprende una secuencia de aminoacidos X-L-Y, en donde: X es una secuencia de Spb1; L es un conector opcional; e Y es una secuencia de GBS80.
X: Secuencia de Spb1
El radical X es una secuencia de Spb1. Esta secuencia de Spb1, cuando se administra a un sujeto, provoca una respuesta de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen a la protema Spb1 de tipo salvaje p.ej. a la protema de S. agalactiae que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3 (la secuencia de tipo salvaje completa de la cepa COH1).
La secuencia de Spb1 puede comprender una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad a% con SEQ ID NO: 13. El valor de a se puede seleccionar entre 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o mas. La secuencia de Spb1 puede comprender SEQ ID NO: 13.
La secuencia de Spb1 puede comprender un fragmento de SEQ ID NO: 3 y/o de SEQ ID NO: 13. El fragmento generalmente incluira al menos b aminoacidos de SEQ ID NO: 3/13, en donde b se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60 , 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200 o mas. El fragmento generalmente incluira al menos un epftopo de celula T o, preferiblemente, un epftopo de celula B de SEQ ID NO: 3/13. Los epftopos de celulas T y B pueden identificarse mediante los metodos descritos anteriormente. El SEQ ID NO: 13 es en sf mismo un fragmento de SEQ ID NO: 3, como se explico anteriormente.
La secuencia de Spb1 puede comprender una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad a% con SEQ ID NO: 13 y comprende un fragmento de SEQ ID NO: 13, como se definio anteriormente.
El radical X generalmente tendra al menos c aminoacidos de longitud, donde c se selecciona entre 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400 o mas.
El radical X generalmente no tendra mas de d aminoacidos de longitud, donde d se selecciona entre 500, 480, 460, 440, 420, 400, 380, 360, 340, 320, 300, 280, 260, 240, 220, 200 o menos.
El radical X generalmente tendra entre 300 y 500 aminoacidos de longitud p.ej. 350-480, 400-460, 430-450.
La secuencia de SpbI de tipo salvaje de la cepa COH1 de serotipo III es SEQ ID NO: 3 anterior. Los derivados espedficos de los mismos descritos en la seccion "SpbI" anterior son aplicables a la secuencia de Spb1 de esta realizacion de la invencion.
Y: Secuencia de GBS80
El radical Y es una secuencia de GBS80. Esta secuencia de GBS80, cuando se administra a un sujeto, provoca una respuesta de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen a la protema GBS80 de tipo salvaje p.ej. a la protema de S. agalactiae que tiene la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 (la secuencia de tipo salvaje completa de la cepa 2603V/R).
La secuencia de GBS80 puede comprender una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad de e% con SEQ ID NO: 9. El valor de e se puede seleccionar entre 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o mas. La secuencia de GBS80 puede comprender SEQ ID NO: 9.
La secuencia de GBS80 puede comprender un fragmento de SEQ ID NO: 2 o de SEQ ID NO: 9. El fragmento
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generalmente incluira al menos f aminoacidos de SEQ ID NO: 2/9, en donde f se selecciona entre 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 40, 50, 60 , 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 175, 200 o mas. El fragmento generalmente incluira al menos un epttopo de celulas T o, preferiblemente, de celulas B de SEQ ID NO: 2/9. El SEQ ID NO: 9 es en sf mismo un fragmento de SEQ ID NO: 2, como se explico anteriormente.
La secuencia de GBS80 puede comprender una secuencia de aminoacidos que tiene, al menos, una identidad de e% con SEQ ID NO: 9 y comprende un fragmento de SEQ ID NO: 9, como se definio anteriormente.
El radical Y generalmente tendra al menos g aminoacidos de longitud, donde g se selecciona de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600 o mas.
El radical Y generalmente no sera mas largo de h aminoacidos de longitud, donde h se selecciona entre 600, 580, 560, 540, 520, 500, 480, 460, 440, 420, 400, 380, 360, 340, 320, 300, 280, 260, 240, 220, 200 o menos.
El radical Y generalmente tendra entre 350-550 aminoacidos de longitud p.ej. 400-520, 450-500, 470-490.
La secuencia de GBS80 de tipo salvaje de la cepa 2603 V/R aislada del serotipo V es SEQ ID NO: 2 anterior. Los derivados espedficos de la misma descritos en la seccion "GBS80' mas arriba son aplicables a la secuencia de GBS80 de esta realizacion de la invencion.
L: Conector
El polipeptido opcionalmente incluye un radical L para conectar los radicales X e Y. El radical L es tipicamente una secuencia de aminoacidos corta p.ej. en el intervalo de 2-40 aminoacidos p.ej. que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 aminoacidos.
Los conectores generalmente contienen al menos un resto de glicina, lo que facilita la flexibilidad estructural. El conector puede contener, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas restos de glicina. Las glicinas pueden estar dispuestas para incluir al menos dos glicinas consecutivas en una secuencia de dipeptido Gly-Gly, o una secuencia de oligo-Gly mas larga es decir Glyn donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas, p.ej. SeQ ID NO: 15:
GGGG
Los conectores pueden estar codificados por codones encontrados en las secuencias de reconocimiento de enzimas de restriccion. Por ejemplo, una secuencia de 6 unidades que es la diana de una enzima de restriccion concreta puede codificar un dipeptido. Por lo tanto, la secuencia de reconocimiento para BamHI (GGATCC) codifica Gly-Ser, por lo que un conector puede incluir una secuencia de dipeptido Gly-Ser. Tales secuencias facilitan la clonacion y la manipulacion.
Las secuencias conectoras utiles incluyen SEQ ID NO 15 anterior y SEQ ID NO 16, 17 y 18 a continuacion: GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 16)
GGGGSGGGGSGGGGSEL (SEQ ID NO: 17)
GSGGGG (SEQ ID NO: 18)
Sin embargo, los conectores preferidos no incluyen una secuencia que comparta 10 o mas aminoacidos contiguos en comun con una secuencia polipeptfdica humana. Por ejemplo, una secuencia conectora rica en glicina que se puede utilizar en la invencion es sEq ID NO: 16 de 14 unidades. Sin embargo, este polfmero de 14mero tambien se encuentra en una protema de union a ARN humana (gi: 8051631) y por lo tanto se evita preferiblemente dentro del radical L.
W: Secuencia N-terminal
El radical X puede estar en el extremo N terminal del polipeptido, pero tambien es posible que tenga aminoacidos aguas arriba de X. Estos aminoacidos opcionales forman un radical W.
El radical W es tfpicamente una secuencia de aminoacidos corta p.ej. en el intervalo de 2-40 aminoacidos p.ej. que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 aminoacidos.
Los ejemplos de radicales W son secuencias lfder que dirigen el trafico de protemas, o comprenden secuencias peptfdicas cortas que facilitan la clonacion o la purificacion (p.ej. etiquetas de histidina es decir Hisn, donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas). Otras secuencias de aminoacidos N-terminales adecuadas seran evidentes para los expertos en la tecnica.
En un polipeptido naciente, el radical W puede proporcionar la metionina N-terminal del polipeptido (formil-metionina;
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fMet, en bacterias). Sin embargo, se pueden escindir uno o mas aminoacidos del extremo N de un radical W naciente, de modo que el radical W en un polipeptido de la invencion no incluya necesariamente una metionina N- terminal.
Los radicales W utiles incluyen SEQ ID NO 19:
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Z: Secuencia C-terminal
El radical Y puede estar en el extremo C-terminal del polipeptido, pero tambien es posible que tenga aminoacidos aguas abajo de Y. Estos aminoacidos opcionales forman un radical Z.
El radical Z es tipicamente una secuencia de aminoacidos corta p.ej. en el intervalo de 2-40 aminoacidos p.ej. que 10 consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 aminoacidos.
Los ejemplos de radicales Z incluyen secuencias para dirigirel trafico de protemas, secuencias peptfdicas cortas que facilitan la clonacion o la purificacion (p.ej. que comprende etiquetas de histidina es decir Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas), o secuencias que mejoran la estabilidad de la protema. Otras secuencias de aminoacidos C- 15 terminales adecuadas seran evidentes para los expertos en la tecnica, tales como una glutation-S-transferasa, tiorredoxina, fragmento de 14 kDa de protema A de S. aureus, un peptido biotinilado, una protema de union a maltosa, una etiqueta FLAG de enteroquinasa, etc. Un radical Z util comprende la SEQ ID NO 20:
HHHHHH
Combinaciones utiles
20 De los diversos radicales X, Y y L, las combinaciones utiles incluyen, pero no estan limitadas a:
SEQ ID
W X L Y Z
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19 13 17 9 -
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19 13 18 9 -
MASAETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEAEYKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKK DTASANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNGAVIMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDG GGKTVDQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASVVDLNEGSYEVTITDGSGNITTLTQGSEKATG KYNLLEENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKSGAKPGSADLPENTNIATINPNTSNDD PGQKVTVRDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYL VEKKAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVNPTVENNKGTEGGGGSGGGGSGGGGSELAEVSQERPAKTTVNIY KLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVS LPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNVVTDEPKTDKD VKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTL KITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKP SNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFE IKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPS (SEQ ID NO:21)
MASAETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEAEYKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKK DTASANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNGAVIMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDG GGKTVDQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASVVDLNEGSYEVTITDGSGNITTLTQGSEKATG KYNLLEENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKSGAKPGSADLPENTNIATINPNTSNDD PGQKVTVRDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYL VEKKAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVNPTVENNKGTEGGGGSGGGGSGGGGSELAEVSQERPAKTTVNIY KLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVS LPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNVVTDEPKTDKD VKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTL KITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKP SNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFE IKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPSHHHHHH
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(SEQ ID NO: 22)
MASAETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEAEYKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKK DTASANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNGAVIMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDG GGKTVDQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASVVDLNEGSYEVTITDGSGNITTLTQGSEKATG KYNLLEENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKSGAKPGSADLPENTNIATINPNTSNDD PGQKVTVRDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYL VEKKAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVNPTVENNKGTEGSGGGGELAEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKS EITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQG LVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDA GYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKF KEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEV HTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVD ANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPS (SEQ ID NO:23)
El polipeptido puede comprender una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad de secuencia de i% con SEQ iD NO: 21. El valor de i se puede seleccionar entre 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o mas. El polipeptido puede comprender SEQ ID NO: 21.
El polipeptido puede comprender una secuencia de aminoacidos que tiene al menos una identidad de secuencia de i% con SEQ iD NO: 23. El valor de i se puede seleccionar entre 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o mas. El polipeptido puede comprender SEQ ID NO: 23.
Un polipeptido utilizado con la invention puede comprender una secuencia de aminoacidos que:
(a) es identica (es decir 100% identica) a SEQ ID NO: 21 o 23;
(b) comparte identidad de secuencia con SEQ ID NO: 21 o 23;
(c) tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o mas) alteraciones de un solo aminoacido (deleciones, inserciones, sustituciones), que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparacion con las secuencias de (a) o (b); y
(d) cuando se alinea SEQ ID 21 o 23 utilizando un algoritmo de alineamiento por pares, cada ventana movil de x aminoacidos del extremo N terminal al extremo C terminal (de modo que para un alineamiento que se extiende a p aminoacidos, donde p>x, existen p-x+1 de tales ventanas) tiene al menos x - y aminoacidos alineados identicos, donde: x se selecciona entre 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si x - y no es un numero entero, se redondea al numero entero mas cercano. El algoritmo preferido de alineamiento por pares es el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch [226], que utiliza parametros por defecto (p.ej. con una penalization de apertura de Hueco = 10,0, y con una penalization de extension de Huevo = 0,5, utilizando la matriz de puntuacion EBLOSUM62). Este algoritmo se implementa convenientemente en herramienta needle en el paquete EMBOSS [227].
Dentro del grupo (c), las deleciones o sustituciones pueden estar en el extremo N-terminal y/o el extremo C-terminal, o pueden estar entre los dos extremos. Por lo tanto, un truncamiento es un ejemplo de una deletion. Los truncamientos pueden implicar la delecion de hasta 40 (o mas) aminoacidos en el extremo N-terminal y/o el extremo C-terminal.
Las secuencias de Spb1 y GBS80 en los polipeptidos se pueden obtener a partir de una o mas cepas de GBS. Por ejemplo, los SEQ ID NO: 21 y 23 incluyen la secuencia de Spb1 de la cepa COH1 y la secuencia de GBS80 de la cepa 2603V/R.
Polipeptidos
Los polipeptidos, o radicales individuales, pueden, en comparacion con SEQ ID NO: 2, 3, 9, 10, 13, 21 o 23, incluir uno o mas (p.ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) reemplazos de aminoacidos conservativos es decir reemplazos de un aminoacido por otro que tiene una cadena lateral relacionada. Los aminoacidos geneticamente codificados generalmente se dividen en cuatro familias: (1) acidos es decir aspartato, glutamato; (2) alcalinos es decir lisina, arginina, histidina; (3) no polares es decir alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; y (4) polares sin carga es decir glicina, asparragina, glutamina, cistelna, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptofano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoacidos aromaticos. En general, la sustitucion de aminoacidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto importante sobre la actividad biologica. Los polipeptidos pueden tener uno o mas (p.ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) deleciones de un solo aminoacido con respecto a una secuencia de referencia. Los polipeptidos tambien pueden incluir una o mas (p.ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) inserciones (p.ej. cada una de1, 2, 3, 4 o5 aminoacidos) con respecto a una secuencia de referencia.
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Los polipeptidos se pueden preparar de muchas maneras, como se describio anteriormente. Los polipeptidos tambien pueden adoptar diversas formas (p.ej. nativa, fusiones, glicosilada, no glicosilada, lipidada, no lipidada, fosforilada, no fosforilada, miristoilada, no miristoilada, monomerica, multimerica, particulada, desnaturalizada, etc.), como se describio anteriormente. Los polipeptidos se proporcionan preferiblemente en forma purificada o sustancialmente purificada, como se describio anteriormente.
El termino "polipeptido" se refiere a polfmeros de aminoacidos de cualquier longitud. El polfmero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoacidos. Los terminos tambien abarcan un polfmero de aminoacido que se ha modificado naturalmente o por intervencion; por ejemplo, formacion de enlaces disulfuro, glicosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion o cualquier otra manipulacion o modificacion, tal como la conjugacion con un componente de marcaje. Tambien se incluyen dentro de la definicion, por ejemplo, polipeptidos que contienen uno o mas analogos de un aminoacido (incluyendo, por ejemplo, aminoacidos no naturales, etc.), asf como otras modificaciones conocidas en la tecnica. Los polipeptidos pueden aparecer como cadenas simples o cadenas asociadas. Los polipeptidos pueden estar glicosilados de forma natural o no natural (es decir el polipeptido tiene un patron de glicosilacion que difiere del patron de glicosilacion encontrado en el polipeptido natural correspondiente).
Los polipeptidos pueden tener al menos 40 aminoacidos de longitud (p.ej. al menos 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 300, 350, 400, 450, 500 o mas). Los polipeptidos pueden ser mas cortos que 1100 aminoacidos.
Preinmunizacion
En un segundo aspecto, la invencion proporciona un metodo para inmunizar a un paciente contra la infeccion por GBS que comprende la etapa de administracion al paciente de un producto conjugado que es un sacarido capsular de GBS conjugado con un toxoide difterico o derivado del mismo, en donde el paciente ha sido preinmunizado con un toxoide difterico o derivado del mismo. Los productos conjugados de GBS son los de la composicion inmunogenica del primer aspecto de la invencion, como se describio anteriormente. En otras palabras, las composiciones inmunogenicas del primer aspecto de la invencion se utilizan en el segundo aspecto de la invencion. El sacarido capsular conjugado con el toxoide difterico o derivado del mismo en la composicion es de los serotipos la, Ib y III de GBS. En este aspecto, todos los sacaridos capsulares de GBS en la composicion estan conjugados con un toxoide difterico o un derivado del mismo. Cuando el portador o el antfgeno de preinmunizacion es un derivado de un toxoide difterico, ese derivado preferiblemente permanece inmunologicamente reactivo de forma cruzada con Dt, y es preferiblemente CRM197. Los autores de la presente invencion han descubierto que los productos conjugados que son sacaridos capsulares de GBS conjugados con un toxoide difterico o derivado del mismo no parecen sufrir supresion epitopica inducida por portador (o "supresion por portador", como se conoce generalmente), particularmente supresion que surge cebado del portador. Como se analiza a continuacion, la "supresion por portador" es el fenomeno mediante el cual la preinmunizacion de un animal con una protema portadora evita que posteriormente provoque una respuesta inmunitaria contra un nuevo epftopo antigenico que se presenta en ese portador [228]. En contraste con este fenomeno conocido, los autores de la presente invencion han descubierto que la respuesta inmunitaria a los productos conjugados de sacarido capsular de GBS-toxoide difterico o derivado del mismo se puede mejorar de hecho mediante preinmunizacion con el toxoide difterico o derivado del mismo.
Como se informa en la referencia 229, donde varios antfgenos de vacuna contienen el mismo componente de protema (que se utiliza como un inmunogeno y/o como una protema portadora en un producto conjugado), existe la posibilidad de interferencia entre esos antfgenos. En la referencia 229, la respuesta inmunitaria contra un antfgeno que se conjugo con un portador de toxoide tetanico (Tt) se suprimio mediante la inmunidad preexistente contra Tt.
La referencia 230 informa de como una combinacion de vacunas D-T-P con una vacuna de producto conjugado de Hib se vio afectada adversamente cuando el portador para el producto conjugado Hib era el mismo que el antfgeno tetanico de la vacuna D-T-P. Los autores concluyen que este fenomeno de "supresion por portador", que surge de la interferencia causada por un portador de protema comun, debe tenerse en cuenta cuando se introducen vacunas que incluyen productos conjugados multiples.
En contraste con las referencias 229 y 230, la referencia 231 informo de que el cebado con toxoide tetanico no tuvo un impacto negativo en la respuesta inmunitaria contra un producto conjugado de Hib-Tt administrado posteriormente, pero se observo supresion en pacientes con anticuerpos anti-Tt adquiridos por via materna. Sin embargo, en la referencia 232, se informo de un efecto de "supresion epitopica" para un producto conjugado de peptido basado en Tt en pacientes que teman anticuerpos anti-Tt existentes que resultaban de la vacunacion contra el tetanos.
En la referencia 233, se sugirio que un producto conjugado que tema CRM197 (un mutante destoxificado de toxina difterica) como portador puede ser ineficaz en ninos que no habfan recibido previamente toxina difterica como parte de una vacuna (p.ej. como parte de una vacuna D-T-P o D-T). Este trabajo se desarrollo adicionalmente en la referencia 234, donde se observo que persistfa un efecto de cebado del portador por inmunizacion D-T para inmunizacion posterior con productos conjugados de Hib.
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En la referencia 235, los autores encontraron que la preinmunizacion con una protema portadora de toxoide difterico o tetanico reduda el aumento de los niveles de anticuerpos anti-Hib despues de una inmunizacion posterior con el sacarido capsular Hib conjugado con esos portadores, resultando igualmente afectadas IgG1 e IgG2. Las respuestas a las porciones portadoras de los productos conjugados tambien se suprimieron. Ademas, se observo una supresion mas general no espedfica de epftopo, ya que se observo que la preinmunizacion con un producto conjugado afectaba las respuestas inmunitarias tanto frente al portador como frente a las porciones de sacarido de un segundo producto conjugado que se administro cuatro semanas despues.
El uso de diferentes protemas portadoras en una unica vacuna de producto conjugado neumococico multivalente se informa en la referencia 236, utilizandose multiples portadores para evitar la supresion del portador. Los autores pronostican que existe una carga maxima de una protema portadora que puede tolerarse en una vacuna de producto conjugado multivalente sin dar lugar a interferencia negativa. En la referencia 237 se informo de que las vacunas de producto conjugado neumococico que incluyen protemas portadoras mixtas provocaban, en paralelo a la respuesta antineumococica, respuestas de refuerzo accidentales a los portadores.
En la referencia 238, una investigacion de si los refuerzos de difteria y tetanos podnan administrarse con productos conjugados de serogrupo C meningococico monovalente, se encontro que los tttulos contra el producto conjugado meningococico se redujeron cuando el portador era portador de toxoide tetanico y el paciente habfa recibido inmunizacion previa con una vacuna que contema tetanos.
Ademas del problema de cebado con un portador que tiene un impacto negativo en las respuestas inmunitarias contra los productos conjugados de sacaridos, tambien puede ocurrir lo contrario, es decir la inmunizacion con un producto conjugado puede tener un impacto negativo en las respuestas inmunitarias contra el portador [239].
Por lo tanto, este segundo aspecto de la invencion proporciona un metodo para inmunizar a un paciente contra la infeccion por GBS que comprende la etapa de administracion al paciente de un producto conjugado que es un sacarido capsular de GBS conjugado con un toxoide difterico o derivado del mismo, en donde el paciente ha sido preinmunizado con un toxoide difterico o derivado del mismo. Este aspecto tambien proporciona un producto conjugado que es un sacarido capsular de GBS conjugado con un toxoide difterico o derivado del mismo para su uso en la inmunizacion de un paciente contra la infeccion por GBS, en donde el paciente ha sido preinmunizado con un toxoide difterico o un derivado del mismo. Este aspecto proporciona adicionalmente el uso de un producto conjugado que es un sacarido capsular de GBS conjugado con un toxoide difterico o derivado del mismo en la fabricacion de un medicamento para inmunizar a un paciente contra la infeccion por GBS, en donde el paciente ha sido preinmunizado con un toxoide difterico o derivado del mismo.
El paciente preinmunizado
Este paciente que se va a inmunizar ha sido preinmunizado con un toxoide difterico o derivado del mismo. El toxoide difterico o derivado del mismo puede haberse administrado como portador en un producto conjugado de un sacarido capsular de un organismo distinto de GBS y un toxoide difterico o un derivado del mismo. La preinmunizacion tfpica habra incluido: un antfgeno de toxoide difterico; un producto conjugado de sacarido capsular Hib que utiliza un toxoide difterico o un portador CRM197; y/o un producto conjugado de sacarido capsular neumococico que utiliza un toxoide difterico o un portador CRM197.
El paciente habra recibido al menos una (p.ej. 1,2, 3 o mas) dosis del antfgeno o antfgenos de preinmunizacion, y esa dosis (o la mas temprana de multiples dosis) habra sido administrada al paciente al menos seis (p.ej. 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 36, 48, 60, 120, 180, 240, 300 o mas) meses antes de la inmunizacion con los productos conjugados de GBS de acuerdo con este aspecto de la invencion. En un grupo preferido de pacientes, la preinmunizacion tuvo lugar en el plazo de los 3 anos posteriores al nacimiento p.ej. en el plazo de los 2 anos posteriores al nacimiento, en el plazo de 1 ano posterior al nacimiento, en el plazo de los 6 meses posteriores al nacimiento, o incluso en el plazo de los 3 meses, 2 meses o 1 mes posteriores al nacimiento. Los pacientes adecuados para ser inmunizados de acuerdo con este aspecto de la invencion se han descrito anteriormente en la seccion Metodos de tratamiento.
Cuando el antfgeno de preinmunizacion es un toxoide difterico, el paciente tfpicamente habra recibido el toxoide como antfgeno "D" en una preinmunizacion de D-T-P o D-T. Tales inmunizaciones generalmente se administran a los recien nacidos a las edades de 2, 3 y 4 meses. Cuando la inmunizacion incluye una vacuna contra la tos ferina, esa vacuna puede ser una vacuna contra la tos ferina de celulas completas o celular ("Pw"), pero es preferiblemente una vacuna contra la tos ferina acelular ("Pa"). Las vacunas Pa de preinmunizacion generalmente incluiran uno, dos o tres de los siguientes, antfgenos de B. pertussis bien conocidos y bien caracterizados: (1) toxoide pertussis ('PT'), destoxificado por medios qmmicos o por mutagenesis dirigida al sitio p.ej. el mutante '9K/129G' [240]; (2) hemaglutinina filamentosa ('FHA'); (3) pertactina (tambien conocida como protema de membrana externa de '69 kiloDalton'). Las vacunas contra la tos ferina acelulares tambien pueden incluir aglutinogeno 2 y/o aglutinogeno 3. El antfgeno "T" en una preinmunizacion de D-T-P es tfpicamente un toxoide tetanico.
Cuando el antfgeno de preinmunizacion es un toxoide difterico, el paciente puede recibir tambien, o alternativamente, el toxoide como protema portadora de un producto conjugado de protema-sacarido. Tales productos conjugados incluyen el producto conjugado HIB "PRP-D" [vease la Tabla 14-7 de la ref. [241] p.ej. el
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producto ProHIBIT™.
Cuando el antigeno de preinmunizacion es CRM197, el paciente tfpicamente habra sido preinmunizado con un producto conjugado de Hib y/o un producto conjugado neumococico multivalente. Tales inmunizaciones generalmente se administran a los recien nacidos a las edades de 2, 3 y 4 meses. Los productos conjugados de Hib que utilizan un portador CRM197 incluyen los productos conjugados "HbOC" [Tabla 14-7 de la ref. 241] p.ej. el producto HibTITER™. Los productos conjugados neumococicos que utilizan un portador CRM197 incluyen las mezclas heptavalentes PCV7 p.ej. la vacuna PrevNar™ [242]. El paciente tambien puede haber sido preinmunizado con un producto conjugado meningococico del serogrupo C ('MenC'). Los productos conjugados MenC que utilizan el portador CRM197 incluyen Meninvact™/Menjugate™ [243] y Meningitec™.
Cuando la preinmunizacion era con un antfgeno conjugado, el paciente casi inevitablemente tambien habna recibido una pequena cantidad de toxoide difterico libre (o derivado) como resultado de la contaminacion de bajo nivel del producto conjugado (p.ej. causado por la hidrolisis del producto conjugado durante el almacenamiento), pero esta pequena cantidad tfpicamente no sera adecuada para proporcionar una respuesta inmunitaria significativa.
El toxoide difterico es una protema bien conocida y bien caracterizada [p.ej. vease el capftulo 13 de la ref. 241] que puede obtenerse tratando la exotoxina ribosilante de ADP de Corynebacterium diphtheriae con un compuesto qrnmico inactivante, tal como formalina o formaldelddo. CRM197 tambien es bien conocido y esta bien caracterizado [244-247], y se ha utilizado ampliamente como portador en vacunas de sacaridos conjugadas. CRM197 y Dt comparten muchos epftopos portadores.
El resultado de la preinmunizacion es que el sistema inmunitario del paciente ha estado expuesto a los antfgenos de preinmunizacion. Para la preinmunizacion con toxoide difterico (Dt), esto generalmente significa que el paciente habra presentado una respuesta de anticuerpos anti-Dt (por lo general para proporcionar un tftulo anti-Dt> 0,01 Ul/ml) y poseera linfocitos B y/o T de memoria espedficos para Dt es decir la preinmunizacion con Dt es tfpicamente adecuada para provocar una respuesta inmunitaria anamnesica anti-Dt en el paciente. Para la preinmunizacion en donde Dt (o derivado) es un portador de un sacarido dentro de un producto conjugado, la preinmunizacion habra provocado una respuesta antisacarido y el paciente poseera linfocitos B y/o T de memoria espedficos para el sacarido es decir la preinmunizacion es tfpicamente adecuada para provocar una respuesta inmunitaria anamnesica antisacarido en el paciente. La preinmunizacion fue preferiblemente adecuada para provocar inmunidad protectora en el paciente p.ej. contra la enfermedad de la difteria.
Por lo tanto, los pacientes que se van a inmunizar de acuerdo con este aspecto de la invencion son distintos de los pacientes en general, ya que son miembros de un subgrupo de la poblacion general cuyos sistemas inmunitarios ya han montado una respuesta inmunitaria a los antfgenos de preinmunizacion, de manera que la inmunizacion de acuerdo con este aspecto con un producto conjugado de GBS que incluye un portador de toxoide difterico (o derivado del mismo), provoca una respuesta inmunitaria diferente en el subconjunto que en pacientes que no han montado previamente una respuesta inmunitaria a los antfgenos de preinmunizacion. Se prefieren los pacientes que han sido preinmunizados con Dt (o derivado) como portador de un producto conjugado (particularmente de un producto conjugado de Hib). Los pacientes particularmente preferidos se han preinmunizado con Dt (o derivado) como portador de un producto conjugado y tambien con Dt como un inmunogeno no conjugado.
Ademas de haberse preinmunizado con un toxoide difterico (o derivado), en forma conjugada o no conjugada, el paciente puede haberse preinmunizado con otros antfgenos. Tales antfgenos incluyen, pero no se limitan a: uno o varios antfgenos de tos ferina (vease mas arriba); toxoide tetanico - vease mas arriba; Haemophilus influenzae tipo B - vease mas arriba; antfgeno de superficie de hepatitis B (HBsAg); poliovirus, tal como una vacuna de poliovirus inactivado (IPV); Steptococcus pneumoniae - vease mas arriba; virus de la influenza; BCG; antfgenos del virus de la hepatitis A; virus del sarampion; virus de la parotiditis; virus de rubeola; virus varicela; etc.
El paciente puede o no haberse preinmunizado con uno o mas productos conjugados de GBS. En algunas realizaciones preferidas, en el momento en que un paciente recibe por primera vez un producto conjugado de GBS, ya se ha preinmunizado con Dt (o derivado). En otras realizaciones, se administra un producto conjugado de GBS a un paciente que ya ha sido preinmunizado con (i) Dt o un derivado y (ii) un producto conjugado de GBS.
Portadores de toxoide tetanico
Tambien se describe en la presente memoria un metodo para inmunizar a un paciente contra la infeccion por GBS que comprende la etapa de administracion al paciente de un producto conjugado que es un sacarido capsular de GBS conjugado con un toxoide tetanico o un derivado del mismo, en donde el paciente ha sido preinmunizado con un toxoide tetanico o derivado del mismo. Este metodo utiliza un producto conjugado que es un sacarido capsular de GBS conjugado con un toxoide tetanico o derivado del mismo para su uso en la inmunizacion de un paciente contra la infeccion por GBS, en donde el paciente ha sido preinmunizado con un toxoide tetanico o un derivado del mismo. Este metodo proporciona adicionalmente el uso de un producto conjugado que es un sacarido capsular de GBS conjugado con un toxoide tetanico o derivado del mismo en la fabricacion de un medicamento para inmunizar a un paciente contra la infeccion por GBS, en donde el paciente ha sido preinmunizado con un toxoide tetanico o derivado del mismo. Los productos conjugados que son sacaridos capsulares de GBS conjugados con un toxoide tetanico o
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un derivado del mismo pueden no sufrir supresion por portador, particularmente supresion que surge del cebado del portador. La respuesta inmunitaria a los productos conjugados de sacarido capsular de GBS-toxoide tetanico o derivados del mismo puede de hecho mejorarse mediante preinmunizacion con el toxoide tetanico o derivado del mismo.
El toxoide tetanico es una protema bien conocida [p.ej. vease el capftulo 27 de la ref. 241], y se puede obtener inactivando la exotoxina ribosilante de ADP de Clostridium tetani. Los pacientes tfpicamente habran recibido toxoide tetanico como antfgeno "T" en una preinmunizacion D-T-P o D-T, o como protema portadora en un producto conjugado. Tales productos conjugados incluyen el producto conjugado de Hib 'PRP-T' [vease la Tabla 14-7 de la ref. 241] p.ej. los productos ActHIB™, OmniHIB™ e HIBERIX ™.
General
El termino "que comprende" abarca "que incluye" as^ como "que consiste" p.ej. una composicion "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional p.ej. X + Y.
El termino "aproximadamente" en relacion con un valor numerico x representa, x±10%.
La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" p.ej. una composicion que esta "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definicion de la invencion.
Se apreciara que los anillos de azucar pueden existir en forma abierta y cerrada y que, mientras que las formas cerradas se muestran en las formulas estructurales de la presente memoria, las formas abiertas tambien estan abarcadas por la invencion. De manera similar, se apreciara que los azucares pueden existir en formas de piranosa y furanosa y que, mientras que las formas de piranosa se muestran en las formulas estructurales de la presente memoria, tambien estan abarcadas las formas de furanosa. Tambien estan incluidas diferentes formas anomericas de azucares.
A menos que se indique espedficamente, un procedimiento que comprende una etapa de mezclado de dos o mas componentes no requiere ningun orden espedfico de mezclado. Por lo tanto, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, dos componentes se pueden combinar entre sf, y a continuacion la combinacion se puede combinar con el tercer componente, etc.
Los anticuerpos generalmente seran espedficos para su diana. Por lo tanto, tendran una mayor afinidad por la diana que por una protema de control irrelevante, tal como la albumina de suero bovino.
A menos que se indique lo contrario, la identidad entre las secuencias polipeptfdicas se determina preferiblemente mediante el algoritmo de busqueda de homologfa de Smith-Waterman implementado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular), utilizando una busqueda de hueco afm con parametros de penalizacion de abertura de hueco = 12 y penalizacion por extension de hueco = 1.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 muestra la diferencia entre las estructuras repetitivas en los serotipos Ia y III de GBS.
La figura 2 muestra las estructuras repetitivas de los sacaridos capsulares en los serotipos, Ia, Ib, II, III y V de GBS.
La Figura 3 muestra la estructura repetitiva de la forma desialilada del sacarido capsular de serotipo V de GBS.
La Figura 4 muestra el efecto del cebado con CRM197 antes de la administracion de un producto conjugado de sacarido capsular de serotipo III de GBS y CRM197, con y sin coadyuvante.
Modos de llevar a cabo la invencion
Produccion de producto conjugado
Los sacaridos capsulares purificados de los serotipos Ia, Ib y III de Streptococcus agalactiae se conjugaron con una protema portadora mediante oxidacion con peryodato seguida de aminacion reductiva (ref. 2). El sacarido capsular desialilado purificado del serotipo V de Streptococcus agalactiae se conjugo con una protema portadora mediante oxidacion con peryodato seguida de aminacion reductiva (ref. 14). La protema portadora en la mayona de los casos fue CRM197. El toxoide tetanico se utilizo como protema portadora cuando se indico espedficamente.
Estudio con ratones (1).
En este estudio, se evaluo el efecto del coadyuvante sobre la eficacia y la inmunogenicidad de los productos conjugados de serotipo Ia, Ib y III de GBS, ya sea como vacunas monovalentes o combinadas, en un modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo.
El modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal, adaptado de la referencia 248, se utiliza para evaluar la
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eficacia en neonatos de anticuerpos espedficos adquiridos transplacentariamente de madres activamente vacunadas. Espedficamente, los ratones hembra CD-1, con edades comprendidas entre 5-6 semanas de Charles River Laboratories (Calco, Italia), son vacunados por inyeccion intraperitoneal con dos o tres inmunizaciones los d^as 1, 21 y eventualmente 35, con o sin coadyuvante. Despues de la ultima inmunizacion, los ratones se cnan y se 5 mantienen hasta el parto. Se utiliza un inoculo de una cepa de GBS (0,05 ml de caldo Todd-Hewitt), letal para 90% de las cnas no inmunizadas (100-1000 veces DL50), para sensibilizar los ratones reden nacidos. La sensibilizacion es por via intraperitoneal en el plazo de de las 48 horas posteriores al nacimiento. Se registra el numero de cnas supervivientes a las 72 horas y se comparan las tasas de supervivencia en todos los grupos tratados utilizando la prueba exacta de Fisher. En un grupo de control, las madres reciben PBS por la misma ruta y se utiliza el mismo 10 cronograma de dosificacion. Dos semanas despues de la ultima inmunizacion, se recogen muestras de sangre para la evaluacion de la inmunogenicidad utilizando dos ensayos in vitro (los ensayos ELISA y de Opsonofagocitosis descritos a continuacion).
El ensayo ELISA se realiza para determinar el titulo de anticuerpos espedficos de GBS producidos despues de la inmunizacion. El ELISA tambien se utiliza para cuantificar la IgG total contra cada antfgeno de sacarido capsular. Se 15 analiza el suero de cada raton individual y se calcula el titulo medio geometrico (GMT) para cada grupo. Los titulos de anticuerpo para los tipos de sacarido capsular Ia, Ib y III se expresan como unidad ELISA de raton (UER) y se calculan en base al metodo de ensayo de la lmea de referencia.
El ensayo de Opsonophagocytosis (OPA) se realiza para evaluar el titulo de anticuerpos inducidos por vacuna capaces de destruir gBs mediado por complemento (utilizando el enfoque descrito en la referencia 249). El ensayo 20 se realiza combinando los siguientes componentes: bacterias, celulas fagodticas (PMN extrafdos de sangre humana o la lmea celular HL-60 diferenciada), complemento y suero inmunitario. Se cultivan en placa almuotas de la mezcla de reaccion antes y despues de una incubacion de 1 hora a 37°C para determinar las unidades formadoras de colonias (UFC) restantes. La cantidad de destruccion opsonofagodtica (log destruccion) se determina restando el log del numero de colonias supervivientes del log del numero de UFC presentes en el momento inicial. Se utiliza un 25 suero preinmunitario y un complemento inactivado por calor sin PMN como control negativo. El titulo bactericida se expresa como una dilucion de suero redproca que conduce a la reduccion de 50% de las bacterias.
En este estudio, se inmunizaron ratones hembra CD1 con dos dosis (1 |jg cada una) de los tres productos conjugados diferentes en presencia de coadyuvante (hidroxido de aluminio o MF59) los dfas 0 y 21. Los neonatos se sensibilizaron con cepas de tipo espedfico como se muestra a continuacion en la Tabla 1.
30 Tabla 1: Determinacion del nivel de proteccion y titulos de anticuerpo obtenidos con productos conjugados de serotipo Ia, Ib y III de GBS/RM197 en presencia de hidroxido de aluminio o MF59 en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo.
Antigeno
Coadyuvante Titulos de GMT Cepa de Sensibilizacion (tipo) Vivo/Tratado Supervivencia (%)
CRM-Ia
Al-H 281 A909 (Ia) 77/80 96
CRM-Ia
MF59 1253 A909 (Ia) 66/75 88
PBS
- - A909 (Ia) 1/65 1
CRM-Ib
Al-H 1097 7357B (Ib) 65/70 93
CRM-Ib
MF59 7843 7357B (Ib) 47/60 78
PBS
- - 7357B (Ib) 6/70 8
CRM-III
Al-H 234 COH1 (III) 44/45 98
CRM-III
MF59 898 COH1 (III) 68/80 85
PBS
- - COH1 (III) 0/68 0
- No aplicable
Se lograron altos niveles de proteccion con las vacunas monovalentes para los tres serotipos con hidroxido de 35 aluminio y MF59. Sin embargo, se obtuvieron tasas de supervivencia ligeramente inferiores con el coadyuvante MF59 incluso en presencia de titulos de anticuerpo mas elevados.
En un experimento adicional, los ratones se inmunizaron con tres dosis de combinaciones a 1 jg de cada producto conjugado en presencia de coadyuvante los dfas 0, 21 y 35. Los neonatos se sensibilizaron con cepas de tipo espedfico como se muestra a continuacion en la Tabla 2.
Antfgeno
Coadyuvante Tftulos de GMT Cepa de Sensibilizacion (tipo) Vivo/Tratado Supervivencia (%)
Combo
Al-H 1279 090 (I a) 27/30 90
Combo
MF59 4592 090 (I a) 61/65 94
Combo
Sin coadyuvante 218 090 (I a) 59/77 77
PBS
- - 090 (I a) 0/70 0
Combo
Al-H 2086 H36B (Ib) 64/70 91
Combo
MF59 5921 H36B (Ib) 65/80 81
Combo
Sin coadyuvante 386 H36B (Ib) 56/70 80
PBS
- - H36B (Ib) 6/79 7
Combo
Al-H 596 M781 (III) 30/40 75
Combo
MF59 1978 M781 (III) 70/70 100
Combo
Sin coadyuvante 163 M781 (III) 60/79 76
PBS
- - M781 (III) 3/77 4
Combo = CRM197-Ia + CRM197-Ib + CRM197-NI; -: No aplicable
5 Se lograron altos niveles de proteccion con las vacunas combinadas en las tres formulaciones en presencia o ausencia de coadyuvante, aunque se obtuvieron tftulos de anticuerpo mas bajos en ausencia de coadyuvante.
Estudio con ratones (2)
En este estudio, se evaluo el efecto de la liofilizacion sobre la eficacia y la inmunogenicidad de los productos conjugados de serotipo la, Ib y III/CRM197 en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo. Los 10 ratones se inmunizaron con dos dosis (1 |jg cada una) de los tres productos conjugados diferentes, en presencia o ausencia de coadyuvante los dfas 0 y 21. Los neonatos se sensibilizaron con cepas de tipo espedfico como se muestra a continuacion en la Tabla 3.
Tabla 3: Determinacion del nivel de proteccion, titulos de anticuerpo y titulos bactericidas alcanzados por los productos conjugados de serotipo Ia, Ib y III/CRM197, cuando se administran a ratones en forma de antigeno tfquido 15 o liofilizado en presencia o ausencia de hidroxido de aluminio en el modelo de raton de sensibilizacion materno- neonatal activo.
Antigeno
Coadyuvante Tftulo de GMT Tftulo bactericida Cepa de Sensibilizacion (tipo) Vivo/Tratado Supervivencia (%)
CRM-Ia liofilizado
PBS 48 < 100 090 (Ia) 46/78 59
CRM-Ia liofilizado
Al-H 1201 567 090 (Ia) 47/51 92
CRM-Ia Lfquido
PBS 14 < 100 090 (Ia) 11/60 18
CRM-Ia Lfquido
Al-H 901 436 090 (Ia) 58/60 96
PBS
Al-H - - 090 (Ia) 1/57 2
CRM-Ib Liofilizado
PBS 23 366 H36B (Ib) ND ND
CRM-Ib Liofilizado
Al-H 172 2146 H36B (Ib) ND ND
CRM-Ib Lfquido
PBS 27 375 H36B (Ib) 12/40 30
Antigeno
Coadyuvante Tftulo de GMT Tftulo bactericida Cepa de Sensibilizacion (tipo) Vivo/Tratado Supervivencia (%)
CRM-Ib Lfquido
Al-H 169 1756 H36B (Ib) 73/78 93
PBS
Al-H - - H36B (Ib) 6/72 8
CRM-III Liofilizado
PBS 59 419 M781 (III) ND ND
CRM-III Liofilizado
Al-H 429 1861 M781 (III) ND ND
CRM-III Lfquido
PBS 127 1707 M781 (III) 48/50 96
CRM-III Lfquido
Al-H 198 1100 M781 (III) 44/45 98
PBS
Al-H - - M781 (III) 5/66 7
- No aplicable; ND: no determinado
El procedimiento de liofilizacion no afecto a la inmunogenicidad de los productos conjugados de GBS. Los t^tulos de anticuerpo y los tftulos bactericidas fueron comparables en ratones que recibieron formulaciones tanto lfquidas como liofilizadas.
5 Estudio con ratones (3)
En este estudio, se evaluo el efecto de la liofilizacion sobre la eficacia del producto conjugado de serotipo V/CRM197 en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo. Los ratones se inmunizaron con dos dosis (1, 5 o 10 |jg cada una) de los productos conjugados en presencia o ausencia de coadyuvante los dfas 0 y 21. Los neonatos se sensibilizaron con una cepa de tipo V. Los resultados se muestran en la Tabla 4 a continuacion.
10 Tabla 4: Determinacion del nivel de proteccion logrado por el producto conjugado de serotipo V/CRM197, cuando se administra a ratones en forma de antigeno tiquido o liofilizado en presencia o ausencia de hidroxido de aluminio en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo.
Antigeno
Sin coadyuvante Hidroxido de aluminio
Muerto/tratado (% de supervivencia)
CRM-V Liofilizado (1 jg)
20/30 (33) 13/44 (70)
CRM-V Liofilizado (5 jg)
28/39 (28) 31/40 (22)
CRM-V Liofilizado (10 jg)
40/54 (26) 33/49 (33)
CRM-V Lfquido (1 jg)
63/70 (10) 19/47 (59)
CRM-V Lfquido (5 jg)
29/40 (27) 37/60 (38)
CRM-V Lfquido (10 jg)
46/52 (11) 46/70 (34)
Placebo liofilizado
108/119(9) 70/88 (20)
El procedimiento de liofilizacion no afecto a la inmunogenicidad del producto conjugado de GBS. Las tasas de 15 supervivencia fueron comparables en los ratones que recibieron formulaciones tanto lfquidas como liofilizadas.
Estudio con ratones (4)
En este estudio, se evaluo el efecto de diferentes dosis sobre la eficacia de una mezcla de los productos conjugados de serotipo la, Ib, III y V de GBS en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo. Los ratones se inmunizaron con dos dosis de la combinacion a 0,2, 1 o 5 jg de cada uno de los productos conjugados de serotipo 20 Ia, Ib, III y V de GBS sin coadyuvante los dfas 0 y 21. Los neonatos se sensibilizaron con cepas espedficas de tipo como se muestra mas abajo en la siguiente Tabla 5.
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Antfgeno
Dosis Cepa de Sensibilizacion (tipo)
090 (I a)
H36B (Ib) M781 (III) CJB111 (V)
Muerto/tratado (% de supervivencia)
Combo
5 jg cada uno 17/60 (72) 13/70 (81) 18/70 (74) 20/68 (70)
Combo
1 jg cada uno 23/70 (67) 18/70 (74) 6/60 (90) 44/66 (33)
Combo
0.2 jg cada uno 14/51 (72) 25/79 (68) 18/78 (77) 41/60 (32)
PBS
0 57/58 (2) 49/50 (2) 49/50 (2) 45/50 (10)
Combo = CRM197-Ia + CRM197-Ib + CRM197-MI + CRM197-V
Una dosis mas alta de producto conjugado de serotipo V de GBS elevo el nivel de proteccion.
Estudio con ratones (5)
En este estudio, se evaluo el efecto de diferentes numeros de dosis sobre la eficacia de una mezcla de productos conjugados de serotipo la, Ib, III y V de GBS en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo. Los ratones se inmunizaron con una, dos o tres dosis (1 |jg de cada producto conjugado) de la combinacion en presencia de un coadyuvante de alum. los dfas 0, 21 y 35, segun corresponda. Los neonatos fueron sensibilizados con cepas de tipo espedfico como se muestra mas abajo en la siguiente Tabla 6.
Tabla 6: Determinacion del nivel de proteccion obtenido con combinaciones de producto conjugado de serotipo la, Ib, Ill y V de GBS/CRM197 en presencia de coadyuvante en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo.
Antfgeno
Dosis Cepa de Sensibilizacion (tipo)
090 (Ia)
H36B (Ib) M781 (III) CJB111 (V)
Muerto/tratado (% de supervivencia)
Combo
3 5/80 (94) 4/60 (93) 1/50 (98) 32/70 (54)
Combo
2 6/80 (92) 11/60 (82) 1/70 (98) 42/57 (26)
Combo
1 61/90 (32) 21/50 (58) 4/60 (93) 52/58 (10)
PBS
3 50/50 (0) 49/50 (2) 52/58 (10) 59/60 (2)
Combo = CRM197-Ia + CRM197-Ib + CRM197-III + CRM197-V
Los tttulos bactericidas se midieron despues de la administracion de la mezcla de productos conjugados de serotipo Ia, Ib, III y V en este estudio. Los tftulos de OPA se muestran a continuacion:
la Ib Ill V
Post-3
515 >900 1174 135
Post-2
<100 455 525 <100
Post-1
<100 182 358 <100
El numero de inmunizaciones afecto fuertemente a la respuesta inmunitaria al producto conjugado de serotipo V de GBS.
Estudio con ratones (6)
En este estudio, se evaluo la eficacia de una mezcla de los productos conjugados de serotipo Ia, Ib, III y V de GBS en comparacion con el producto conjugado de serotipo V de GBS solo en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo. Los ratones se inmunizaron con tres dosis de combinaciones a 1 jg de cada producto conjugado o producto conjugado de serotipo V de GBS a 1 jg en presencia de coadyuvante de alum. los dfas 0, 21 y 35. Los neonatos se sensibilizaron con las cepas de tipo V CJB 111 y 2603 V/R. Los resultados se muestran en la Tabla 7 a continuacion.
5
10
15
20
25
30
Antfgeno
Cepa de Sensibilizacion (tipo)
CJB111 (V)
2603 V/R (V)
Muerto/tratado
(% de supervivencia)
CRM197-V
78/253 (69) 9/117 (92)
Combo
218/583 (63) 32/118 (73)
PBS
333/350 (5) 138/149 (6)
Combo = CRM197-Ia + CRM197-Ib + CRM197-MI + CRM197-V
La respuesta inmunitaria al sacarido capsular de serotipo V de GBS disminuyo cuando los productos conjugados de serotipo Ia, Ib y III de GBS tambien estuvieron presentes en la composicion.
Estudio con ratones (7)
En este estudio, se evaluo el efecto del coadyuvante sobre la inmunogenicidad y la eficacia de una mezcla de los productos conjugados serotipo Ia, Ib, III y V de GBS en comparacion con el producto conjugado de serotipo V de GBS solo en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo. Los ratones se inmunizaron con tres dosis de combinaciones a 1 |jg de cada producto conjugado o producto conjugado de serotipo V de GBS a 1 |jg en presencia o ausencia de coadyuvante los dfas 0, 21 y 35. Los neonatos se sensibilizaron con la cepa de tipo V CJB111. Los resultados se muestran en la Tabla 8 a continuacion.
Tabla 8: Determinacion del nivel de proteccion, titulos de anticuerpo y titulos bactericidas obtenidos con combinaciones de producto conjugado de serotipo la, Ib, Ill y V de GBS/CRM197 o producto conjugado de serotipo V de GBS solo en presencia o ausencia de coadyuvante en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo.
Antigeno
Coadyuvante Tftulo de GMT Tftulo bactericida Muerto/tratado (% de supervivencia)
CRM197-V
PBS 83 838 21/68 (69)
Combo
PBS 22 251 62/130 (52)
CRM197-V
Alum. 130 1430 30/80 (62)
Combo
Alum. 59 <100 66/148 (55)
PBS
Alum. - - 122/131 (7)
Combo = CRM197-Ia + CRM197-Ib + CRM197-III + CRM197-V; - No aplicable
Una vez mas, la respuesta inmunitaria al sacarido capsular de serotipo V de GBS disminuyo cuando los productos conjugados de serotipo Ia, Ib y III de GBS tambien estuvieron presentes en la composicion. La supervivencia se mejoro mediante la adicion de coadyuvante, incluso aunque la adicion de coadyuvante al producto conjugado de serotipo V de GBS solo no tuvo este efecto en este experimento.
Estudio con ratones (8)
En este estudio, se evaluo el efecto del aumento de la dosis de producto conjugado de serotipo V de GBS sobre la eficacia de una mezcla de los productos conjugados de serotipo Ia, Ib, III y V de GBS en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo. Los ratones se inmunizaron con dos dosis de combinaciones a 1 jg de cada producto conjugado o dos dosis de combinaciones a 1 jg de los productos conjugados de serotipo Ia, Ib, III de GBS y 5 jg del producto conjugado de serotipo V de GBS en presencia o ausencia de coadyuvante los dfas 0 y 21. Los neonatos fueron sensibilizados con cepas de tipo espedfico como se muestra mas abajo en la siguiente Tabla 9.
Antfgeno
Coadyuvante Cepa de Sensibilizacion (tipo)
090 (I a)
H36B (Ib) M781 (III) CJB111 (V)
Muerto/tratado (% de supervivencia)
Combo
PBS 20/59 (66) 12/50 (76) 1/40 (97) 49/50 (2)
Combo
Alum. 36/50 (28) 10/30 (67) 1/40 (97) 22/40 (45)
Combo plus
PBS 40/40 (0) 23/26 (11) 37/40 (7) 31/38 (18)
Combo plus
Alum. 13/45 (71) 15/40 (62) 0/50 (100) 26/50 (48)
Combo = CRM197-Ia + CRM197-Ib + CRM197-MI + CRM197-V (todos a 1 jg)
Combo plus = CRM197-Ia + CRM197-Ib + CRM197-III + CRM197-V (todos a 1 jg, excepto para CRM197-V a 5 jg)
5 En este experimento, la respuesta inmunitaria al sacarido capsular de serotipo V de GBS en la mezcla se mejoro una vez mas mediante la adicion de coadyuvante. La respuesta tambien se mejoro aumentando la dosis de este sacarido capsular en la composicion. Sin embargo, la presencia de una alta dosis de sacarido capsular de serotipo V de GBS parecio reducir la respuesta a los sacaridos capsulares de serotipo la, Ib y III de GBS. Esta consecuencia se redujo por la adicion de coadyuvante.
10 Estudio con ratones (9)
En este estudio, se evaluo la eficacia de una mezcla de productos conjugados de serotipo Ia, Ib y III de GBS con protemas GBS67 y GBS80 en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo. Los ratones se inmunizaron con combinaciones en presencia o ausencia de diversos coadyuvantes diferentes. Los neonatos fueron sensibilizados con cepas de tipo espedfico como se muestra mas abajo en la siguiente Tabla 10.
15 Tabla 10: Determinacion del nivel de proteccion obtenido con combinaciones de productos conjugados de serotipo la, Ib y Ill de GBS/CRM197 y protemas GBS67 y GBS80 en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo.
Ag
Coadyuvante Cepa de Sensibilizacion (tipo)
090 (Ia)
H36B (Ib) 3050 (II) M781 (III) CJB111 (V) JM9130013 (VIII)
Muerto/tratado (% de supervivencia)
Combo
Hidroxido de alum./ solucion salina 9/60 (85) 6/60 (90) 12/58(79) 0/60 (100) 11/55 (80) 28/56 (50)
Combo
Hidroxido de alum./ PBS 19/78 (76) 5/57 (91) 16/66 (76) 4/53 (92) 55/80 (31)
Combo
MF59 4/60 (93) 12/57 (79) 18/60 (70) 3/77 (96) 45/70 (36)
Combo
Ninguno 13/80 (84) 11/70 (84) 28/60 (53) 14/77 (82) 47/59 (20)
PBS
Hidroxido de alum./ solucion salina 60/60 (0) 74/77 (4) 36/56 (36) 73/80 (9) 86/99 (13) 53/69 (23)
PBS
Ninguno 70/70 (0) 73/79 (7) 42/54 (22) 74/77 (4) 63/74 (15)
Combo = CRM197-Ia + CRM197-Ib + CRM197-III + GBS67 + GBS80
Los tttulos de anticuerpo se midieron despues de la administracion de la mezcla de productos conjugados de 20 serotipo Ia, Ib, III y V y protemas GBS67 y GBS80 en este estudio. Los resultados de cinco experimentos separados se muestran a continuacion:
Hidroxido de aluminio/solucion salina Hidroxido de aluminio/PBS MF 59 Sin coadyuvante
GBS 80
45395 50277 15626 3358
GBS 67
25846 29513 9616 4232
Ps Ia
811 711 2190 404
Ps Ib
1929 1277 2571 691
Ps III
862 1043 1314 275
Estudio con ratones (10)
En este estudio, se evaluo la eficacia de una mezcla de productos conjugados de serotipo la, Ib y III de GBS con protemas GBS67 y GBS80 en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo. Los ratones se 5 inmunizaron con tres dosis de combinaciones en presencia o ausencia de diversos coadyuvantes diferentes los dfas 0, 21 y 35. Los neonatos se sensibilizaron con cepas de tipo espedfico como se muestra mas abajo en la siguiente Tabla 11.
Tabla 11: Determinacion del nivel de proteccion obtenido con combinaciones de productos conjugados de serotipo la, Ib y III de GBS/CRM197 y protemas GBS67 y GBS80 en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal 10 activo.
Antigeno
Coadyuvante Cepa de Sensibilizacion (tipo)
090 (I a)
M781 (111)
Muerto/tratado (% de supervivencia)
Combo
Alum. 4/48 (92) 6/50 (88)
Combo
Alum. + CpG 6/78 (92) 7/8 (91)
Combo
MF59 4/69 (94) 13/55 (76)
Combo
MF59+ CpG 5/66 (92) 6/70 (91)
Combo
PBS 22/60 (63) 13/55 (76)
Combo
PBS + CpG 5/59 (91) 11/66 (83)
PBS
- 69/69 (0) 60/65 (7)
Combo = CRM197-Ia + CRM197-Ib + CRM197-III + CRM197-V
Estudio con ratones (11)
En este estudio, se evaluo la eficacia de una mezcla de productos conjugados de serotipo Ia, Ib, III y V de GBS con protema GBS67 y una protema de fusion SpbI-GBS80 en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal 15 activo. Los ratones se inmunizaron con la combinacion en presencia de coadyuvante. Los neonatos fueron sensibilizados con cepas de tipo espedfico como se muestra mas abajo en la siguiente Tabla 12.
Tabla 12: Determinacion del nivel de proteccion obtenido con combinaciones de producto conjugado de serotipo Ia, Ib, III y V de GBS/CRM197, prote^na GBS67 y una prote^na de fusion SpbIGBS80 en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo.
Ag
Coadyuvante Cepa de Sensibilizacion (tipo)
090 (la)
H36B (Ib) 3050 (II) COH1 (III) M781 (III) M732 (III) CJB111 (V) JM913 (VII)
Muerto/tratado (% de supervivencia)
Combo
Alum. 16/70 (77) 10/70 (86) 7/70 (90) 4/77 (95) 0/60 (100) 19/30 (36) 20/58 (65) 29/50 (42)
Ag
Coadyuvante Cepa de Sensibilizacion (tipo)
090 (Ia)
H36B (Ib) 3050 (II) COH1 (III) M781 (III) M732 (III) CJB111 (V) JM913 (VII)
Muerto/tratado (% de supervivencia)
PBS
Alum. 68/68 (0) 37/50 (26) 25/40 (37) 65/69 (6) 37/40 (8) 32/60 (47) 36/40 (10) 33/40 (17)
Combo = CRM197-Ia + CRM197-Ib + CRM197-III + protema GBS67 + protema de fusion SpbI-GBS80
Estudio con ratones (12)
En este estudio, se evaluo la eficacia de los productos conjugados de serotipo la, Ib, III y V de GBS en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo. Los ratones se inmunizaron a 1 |jg de cada producto conjugado. 5 Los neonatos fueron sensibilizados con cepas de tipo espedfico como se muestra mas abajo en la siguiente Tabla 13. El experimento se repitio dos veces.
Tabla 13: Determinacion del nivel de proteccion obtenido con productos conjugados de serotipo la, Ib, III y V de GBS/CRM197 en el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo.
Expt
Antigeno Cepa de Sensibilizacion (tipo)
090 (I a)
H36B (Ib) M781 (III) CJB111 (V)
Muerto/tratado (% de supervivencia)
CRM197-Ia 10/70 (86) 64/70 (9) 76/80 (5)
CRM197-Ib 48/94 (51) 12/99 (88)
1
CRM 197-III 69/70 (1) 3/60 (95) 60/68 (12)
CRM197-V 80/89 (10) 5/100 (95)
PBS/Alum 50/50 (0) 39/40 (2) 61/69 (12) 10/10 (0)
CRM197-Ia 14/78 (82) 68/70 (2) 41/42 (2)
CRM197-Ib 66/110 (40) 2/110 (98)
2
CRM197-III 70/80 (12) 1/60 (98)
CRM197-V 38/192 (80)
PBS/Alum 45/45 (0) 57/58 (2) 32/36 (11) 50/58 (14)
10 El producto conjugado que comprende el sacarido capsular de serotipo Ib de GBS confiere proteccion contra el serotipo la de GBS ademas del serotipo Ib de GBS.
Estudio con ratones (13)
En este estudio, el sacarido capsular conjugado con la protema portadora del toxoide tetanico (TT) o la protema portadora CRM197 se analizaron y compararon para determinar su inmunogenicidad. Se inmunizaron ratones 15 hembra CD1 con dos dosis de 1 jg de productos conjugados de serotipo la, Ib y Ill de GBS con coadyuvante de hidroxido de aluminio los dfas 0 y 21. Los neonatos se sensibilizaron con tipos de cepas espedficos como se muestra mas abajo en la siguiente Tabla 14.
Tipo de
Cepa de sensibilizacion Protema portadora de Toxoide Protema Portadora DRC*
CPS
(tipo) Tetanico* Crm*
Ia
090 (la) 78 (52/67) 86 (54/63) 0 (0/59)
Ib
7357B (Ib) 62 (50/80) 73 (71/97) 0 (0/38)
III
COH1 (Ill) 97 (37/38) 93 (95/102) 2 (1/48)
*% De supervivencia (vivo/tratado)
5
10
15
Antfgeno
Nivel de oxidacion (%) Titulos de GMT Cepa de Sensibilizacion (tipo) Vivo/Tratado Supervivencia (%) Tftulo Bactericida
CRM-Ia
5,1 ND A909 (la) 42/80 52 ND
CRM-Ia
14,2 ND A909 (la) 58/60 97 ND
CRM-Ia
44,7 ND A909 (la) 48/78 61 ND
CRM-Ia
79 ND A909 (la) 6/50 12 ND
PBS
- - A909 (la) 11/87 13 -
TT- Ill
3,9 5135 COH1 (Ill) 66/78 85 575
TT-III
16 7662 COH1 (Ill) 55/59 93 470
TT-III
20 6850 COH1 (Ill) 47/48 98 1320
TT-III
55 13290 COH1 (Ill) 64/70 91 1320
PBS
- - COH1 (Ill) 1/79 1 -
CRM-Ill
4,3 972 COH1 (Ill) 64/100 64 127
CRM-Ill
17,5 812 COH1 (Ill) 77/83 93 150
CRM-Ill
40,9 2484 COH1 (Ill) 98/107 91 183
CRM-Ill
61,8 8690 COH1 (Ill) 75/85 88 140
CRM-Ill
78,9 58629 COH1 (Ill) 67/80 84 150
PBS
- - COH1 (Ill) 0/73 0 -
- No aplicable
Las tasas de supervivencia en los grupos inmunizados con productos conjugados de CRM197 de los tres serotipos fueron comparables a las tasas de supervivencia observadas en el grupo inmunizado con productos conjugados de TT. En base a estos resultados, se selecciono CRM197 como la protema portadora para su desarrollo ulterior.
Estudio con ratones (14)
En este estudio, se evaluo el impacto del nivel de oxidacion de sacaridos capsulares durante el procedimiento de conjugacion covalente sobre la inmunogenicidad. Se obtuvieron varios lotes de productos conjugados de serotipo la, Ib y Ill de GBS con los sacaridos preparados a diferentes porcentajes de oxidacion conjugados con TT y/o con CRM197 y sometidos a ensayo en ratones hembra CD1 para determinar su inmunogenicidad. Los ratones se inmunizaron con dos dosis (1 |jg cada una) de los tres productos conjugados diferentes en presencia de coadyuvante de hidroxido de aluminio los dfas 0 y 21. Los neonatos se sensibilizaron con cepas espedficas de tipo como se muestra mas abajo en la siguiente Tabla 15.
Tabla 15: Determinacion del nivel de proteccion, titulos de anticuerpo y titulos bactericidas de sacarido capsular de serotipo Ia y III de GBS conjugado con TT o CRM197 y diferente porcentaje de oxidacion utilizando el modelo de raton de sensibilizacion materno-neonatal activo.
Las tasas de supervivencia alcanzaron un pico cuando las madres se inmunizaron con productos conjugados 20 preparados a partir de sacaridos oxidados al 15-20%. Los tttulos de anticuerpo aumentaron al aumentar los niveles de oxidacion sin ningun impacto en la funcion. Los tftulos bactericidas no aumentaron con tttulos de anticuerpo mas altos. En base a estos resultados y en experimentos adicionales (datos no mostrados), se definio que el porcentaje optimo de oxidacion de CPS para los tres serotipos estaba entre 10 y 30%.
5
10
15
20
25
30
35
Estudios de toxicologia reproductiva y del desarrollo en conejos y ratas
Los resultados de dos especies no mostraron ningun efecto de los productos conjugados de serotipo la, Ib y III/CRM197 sobre el desarrollo embrionario o fetal.
En conejos, se administro una combinacion de los tres productos conjugados con coadyuvante de hidroxido de aluminio mediante inyeccion intramuscular a una dosis clmica de 20/20/20 |jg (basandose en la masa de cada sacarido) los dfas -35, -21 y -7 con respecto al apareamiento el dfa 0 (penodo previo al apareamiento) y los d^as de gestacion 7 y 20 o los d^as de gestacion 7 o 20 solamente. El tratamiento no produjo toxicidad materna, efectos sobre el apareamiento ni evidencia de letalidad embrionaria, fetotoxicidad o teratogenicidad a ningun nivel de dosis.
En ratas, tampoco se observo toxicidad materna ni evidencia de efectos sobre la funcion reproductiva y el desarrollo embriofetal cuando se administro la combinacion, y no se observo diferencia entre los grupos a los que se administro la combinacion en solucion salina frente la combinacion en coadyuvante de hidroxido de aluminio en 3 (durante gestacion solamente) o 6 (antes de la gestacion y durante la gestacion) inyecciones. Las inyecciones se administraron los dfas -35, -21 y -7 con respecto al apareamiento el dfa 0, asf como los dfas 6, 12 y 17 de gestacion o solo los dfas 6, 12 y 17 de gestacion. No hubo ningun efecto sobre la supervivencia de las cnas, el estado clmico o el peso corporal de la generacion F1 durante el penodo previo al destete.
Estudio en seres humanos (1)
Este estudio investigo una vacuna de producto conjugado de sacarido capsular de serotipo la de GBS-CRM197 monovalente. A los grupos de ensayo de 10 sujetos se les administraron 1 o 2 inyecciones a dosis de 5, 10 o 20 jg (medidas como masa de sacarido). Los grupos de placebo de 3 y 2 sujetos recibieron 1 y 2 inyecciones de solucion salina, respectivamente. Se extrajo sangre de cada sujeto en el escrutinio y un mes despues de la primera inyeccion para el analisis mediante ELISA. Ademas, a los 3 meses del estudio, a los grupos de 2 inyecciones se les extrajeron sangre en el momento en que recibieron la segunda inyeccion y a continuacion volvieron un mes despues para extraer otra muestra de sangre. Se llevaron a cabo extracciones de sangre a los 6, 12 y 24 meses despues de la ultima inyeccion recibida por el sujeto.
El ELISA mide la concentracion de anticuerpos espedficos contra sacaridos capsulares la (o Ib y Ill en los estudios descritos a continuacion) de GBS. Las placas de microtitulacion se recubrieron con 1 jg/ml del sacarido de GBS apropiado (conjugado con HSA) y se incubaron con sueros de los sujetos de estudio durante 1 hora a 37°C. Despues de 3 lavados, las placas se incubaron con un anticuerpo secundario anti-IgG humana marcado con fosfatasa alcalina (AP) durante 90 minutos a 37°C seguido de 3 lavados adicionales. Se anadio el sustrato (pNPP) a la placa y se incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente. La AP cataliza la hidrolisis del sustrato generando una reaccion colorimetrica que puede cuantificarse mediante un lector de ELISA a 405 nm (filtro de referencia 650 nm). La evaluacion de la concentracion de anticuerpo se realizo utilizando una curva patron. Un resumen de la concentracion media geometrica (jg/ml) de anticuerpos anti-la para cada grupo se proporciona en la tabla 16 a continuacion:
Tabla 16: Concentraciones medias geometricas (y razones de medias geometricas) para el estudio de vacuna de producto conjugado de sacarido capsular de serotipo la de GBS-CRM197 monovalente.
Placebo N = 3 Placebo + N = 2 GBS la 5 N = 10 GBS la 5+ N = 10 GBS Ia10 N = 10 GBS Ia10 + N = 10 GBS Ia20 N = 10 GBS Ia20 + N = 10
Valor basal (visita 0)
0,84 (0,12-5,86) 0,16 (0,015-1,77) 1,05 (0,36-3,05) 0,42 (0,14-1,29) N = 9 1,25 (0,38-4,1) N = 8 0,37 (0,1-1,32) N = 7 0,54 (0,19 1,57) 0,2 (0,07-0,59)
1 mes despues de la ultima vacunacion
0,8 (0,034-19) 0,16 (0,0007-38) N = 1 43 (7,6-240) 5,94 (1,06-33) 7,94 (1,41-45) 14 (2,52-79) 25 (4,45-140) 6,88 (1,12-42) N = 9
1 mes despues de la ultima vacunacion hasta el Valor basal (visita 0)
0,96 (0,0939,92) 1 (0,018-57) N = 1 41 (11-146) 16 (4,05-60) N = 9 10 (2,4-42) N = 8 53 (12-246) N = 7 46 (13166) 33 (8,55-127) N = 9
6 meses despues de la ultima vacunacion
0,73 (0,05-11) 0,16 (0,0016-17) N = 1 19 (4,43-83) 3,08 (0,71-13) 12 (2,66-50) 7,03 (1,63-30) 14 (3,22-60) 4,21 (0,9-20) N = 9
6 meses despues de la ultima vacunacion hasta el Valor basal (visita 0)
0,87 (0,12-6,39) 1 (0,032-31) N = 1 18 (6,14-54) 7,9 (2,5-25) N = 9 13 (3,71-43) N = 8 27 (7,2-98) N = 7 26 (8,67-77) 20 (6,39-64) N = 9
12 meses despues de la ultima vacunacion
0,79 (0,054-12) 0,16 (0,0016-17) 14 (3,3-62) 2,23 (0,51-9,68) 7,28 (1,68-32) 7,17 (1,53-34) 9,96 (2,29-43) 3,24 (0,63-17)
5
10
15
20
25
30
Placebo N = 3 Placebo + N = 2 GBS la 5 N = 10 GBS la 5+ N = 10 GBS Ia10 N = 10 GBS Ia10 + N = 10 GBS Ia20 N = 10 GBS Ia20 + N = 10
N = 1 N = 9 N = 8
12 meses despues de la ultima vacunacion hasta el Valor basal (visita 0)
0,94 (0,14-6,46) 1 (0,036-28) N = 1 14 (4,76-39) 5,59 (1,84-17) N = 9 8,02 (2,46-26) N = 8 19 (5,49-68) N = 7 18 (6,43-53) 17 (5,31-56) N = 8
24 meses despues de la ultima vacunacion
0,66 (0,043-10) 3,57 (0,59-21) N = 7 2,74 (0,56-13) N = 9 10 (1,74-63) N = 7 5,05 (0,84-30) N = 7 8,63 (1,78-42) N = 9 3,46 (0,65-19) N = 8
24 meses despues de la ultima vacunacion hasta el Valor basal (visita 0)
0,79 (0,11-5,95) 7,47 (2-28) N = 7 6,51 (1,9-22) N = 8 7,88 (1,9-33) N = 6 14 (3,26-56) N = 6 14 (4,38-45) N = 9 16 (4,68-55) N = 8
+ dos inyecciones
En general, los datos de GMC muestran un aumento significativo entre los puntos temporales del valor basal y posteriores (p.ej. GMC oscila de 6 a 43 pg/ml un mes despues de la ultima vacunacion) y aunque hubo una disminucion a lo largo del tiempo, a los 24 meses del estudio, el grupo de GMC aun es multiples veces mas alto que el valor basal (GMR oscila de 7 a 14 a los 24 meses). A juzgar por la estimacion puntual de GMC, el grupo que recibio la dosis de 5 pg como vacunacion unica tuvo la respuesta global mas alta un mes despues de la ultima vacunacion.
El numero de sujetos con niveles de anticuerpos > 3 pg/ml mostro un numero similar de "respondedores" en las diferentes dosis (11, 13 y 12 de 20 para 5, 10 y 20 dosis, respectivamente) y diferentes esquemas de vacunacion (18 de 20 para ambos), un mes despues de la ultima vacunacion (datos no mostrados). El porcentaje de sujetos con niveles de anticuerpos > 5 pg/ml confirmo las mismas observaciones (datos no mostrados). Estos puntos de corte estaban destinados a permitir que las respuestas se evaluaran en el contexto de posibles correlaciones serologicas de proteccion (basandose en la referencia 250). Estos datos sugieren que no hay una contribucion observable ni por una segunda vacunacion ni por una dosis de vacuna mas alta. Puesto que no se observo una respuesta a la dosis, es posible que una dosis de 5 pg o menos pueda ser una dosis optima en una poblacion adulta. No se observo una ventaja sostenida por la administracion de 2 inyecciones en comparacion con 1 inyeccion para los grupos que recibieron 5 y 20 pg. El grupo que recibio 10 pg de dosis mostro respuestas pico mas altas (1 mes despues de la vacunacion) despues de dos frente a una inyeccion, pero esta tendencia se revirtio en puntos temporales posteriores (estado estacionario).
El analisis de seguridad se evaluo en funcion de una serie de criterios diferentes. No se destacaron problemas de seguridad y no se observo una respuesta dependiente de la dosis.
Estudio en seres humanos (2)
Este estudio investigo las vacunas de producto conjugado de sacarido capsular de serotipo Ib y III de GBS-CRM197 monovalente. A los grupos de ensayo de 10 componentes se les administraron 1 o 2 inyecciones a dosis de 5, 10 o 20 pg (medidas como masa de sacarido). Los grupos de placebo de 3 y 2 sujetos recibieron 1 y 2 inyecciones de solucion salina, respectivamente. Se extrajo sangre de cada sujeto en el escrutinio y un mes despues de la primera inyeccion para el analisis mediante ELISA. Ademas, a los 3 meses del estudio, a los grupos de 2 inyecciones se les extrajo sangre en el momento en que recibieron la segunda inyeccion y a continuacion volvieron un mes despues para extraer otra muestra de sangre. Se llevaron a cabo extracciones de sangre a los 6, 12 y 24 meses despues de la ultima inyeccion recibida por el sujeto. Un resumen de la concentracion media geometrica de anticuerpos anti-Ib y III para cada grupo se proporciona en la tabla 17 a continuacion.
Placebo Placebo+ GBS IB 5 GBS Ib 5+ GBS 1b10 GBS 1b10+ GBS 1b20 GBS 1b20+
N=2 N=2 N=8 N=10 N=9 N=11 N=9 N=10
Valor basal (Visita 0) 0,1 (0,0042-2,38) N=1 0,042 (0,0017 0,99) N=1 0,27 (0,066-1,13) N=5 0,24 (0,08-0,75) N=8 0,088 (0,021 0,36) N=5 0,44 (0,16-1,21) N=10 0,38 (0,11-1,25) N=7 0,2 (0,074 0,55)
1 mes despues de la ultima inmunizacion 1 mes despues de la ultima inmunizacion con respecto al Valor basal (visita 0) 0,3 (0,0019-47) N=1 0,53 (0,015-19) 9,64 (0,26-359) N=1 1,89 (0,32-11) 60 (9,78-364) N=4 11 (1,77-63) N=8 47 (11-208) N=6 2,63 (0,49-14) 46 (9,13-232) N=5 18 (3,82-81) 48 (15-152) N=10 14 (2,6-76) 67 (17-267) N=7 10 (2,11-52) 56 (17-186) N=9
6 meses despues de la ultima inmunizacion 0,091 (0,0051-1,63) 0,3 (0,0051-18) N=1 1,53 (0,36-6,48) 7,52 (2,07-27) 5,45 (1,4-21) 11 (3,09-36) 6,23 (1,6-24) 9,2 (2,53-33)
GBS Ib
6 meses despues de la ultima inmunizacion con respecto al Valor basal (visita 0) 0,42 (0,031-5,64) N=1 32 (8,56-116) N=4 36 (14-91) N=8 97 (30-310) N=5) 28 (12-63) N=10 26 (9,61-69) N=7 47 (20-112) N=9
12 meses despues de la ultima inmunizacion
0,091 (0,0054-1,53) 0,4 (0,0074-22) N=1 1,29 (0,31-5,26) 5,77 (1,53-22) N=9 3,24 (0,79-13) N=8 9,52 (2,86-32) 4,98 (1,32-19) 6,67 (1,89-24)
12 meses despues de la ultima inmunizacion con respecto al Valor basal (visita 0) 0,42 (0,036-4,85) N=1 22 (6,52-76) N=4 29 (12-75) N=7 45 (13-152) N=4 26 (12-57) N=10) 23 (8,96-57) N=7 34 (15-78) N=9
24 meses despues de la ultima inmunizacion 0,091 (0,004-2,7) 0,1 (0,0012 8,29) N=1 1,34 (0,28-6,4) 3,8 (0,94-15) 2,58 (0,59-11) 9,49 (2,35-38) N=10 3,22 (0,53-20) N=6 3,92 (0,9-17) N=9
24 meses despues de la ultima inmunizacion con respecto al Valor basal (visita 0) 27 (6,49-111) N=4 19 (7,07-53) N=8 53 (15-188) N=5 25 (9,65-64) N=9 15 (3,55-61) N=4 22 (7,95-59) N=8
N=3 N=2 N=8 N=10 N=10 N=9 N=9 N=10
Valor basal (Visita 0) 0,034 (0,0007-1,55) N=1 0,27 (0,018-3,98) 0,27 (0,057-1,3) N=6 1,64 (0,46-5,86) N=9 0,23 (0,065 0,83) N=9 0,65 (0,18-2,34) 0,89 (0,21-3,77) N=7 1,93 (0,58-6,47)
1 mes despues de la ultima inmunizacion 0,14 (0,0099-2,11) 0,88 (0,033-24) 13 (2,44-65) 31 (7,07-134) 2,72 (0,63-12) 31 (6,64-147) 22 (4,73-105) 22 (5,03-95)
1 mes despues de la ultima inmunizacion con respecto al Valor basal (visita 0) 8,82 (0,64-122) N=1 3,31 (0,51-21) 44 (15-130) N=6 31 (12-84) N=7 10 (4,26-25) N=9 42 (16-106) N=8 63 (23-172) N=7 14 (5,94-34) N=9
CO CD O
6 meses despues de la ultima inmunizacion 0,034 (0,0005-2,11) N=1 1,9 (0,031-118) N=1 4,97 (1,04-24) N=7 21 (5,57-76) 2,7 (0,73-9,95) 19 (4,89-77) 18 (4,43-69) 15 (3,84-60) N=9
6 meses despues de la ultima inmunizacion con respecto al Valor basal (visita 0) 0,9 (0,086-9,48) N=1 23 (8,85-60) N=6 22 (8,87-52) N=7 11 (5-24) N=9 25 (11-58) N=8 33 (14-80) N=7 9,86 (4,3-23) N=8
12 meses despues de la ultima inmunizacion 0,1 (0,01-1,02) 2 (0,036-110) N=1 3,7 (0,81-17) N=7 16 (4,39-55) 2,56 (0,72-9,09) 15 (3,97-57) 13 (3,35-48) 13 (3,05-52) N=8
5
10
15
20
25
12 meses despues de la ultima inmunizacion con respecto al Valor basal (visita 0)
8,82 (0,75-104) N=1 0,4 (0,029-5,51) 0,33 (0,039-2,81) N=3 13 (3,92-41) 0,71 (0,14-3,73) N=5 24 (4,62-127) N=5 11 (2,11-58) N=5 6.15 (1,66-23) N=8
24 meses despues de la ultima inmunizacion
0,034 (0,0008-1,39) N=1 0,4 (0,029-5,51) 0,33 (0,039-2,81) N=3 13 (3,92-41) 0,71 (0,14-3,73) N=5 24 (4,62-127) N=5 11 (2,11-58) N=5 6,15 (1,66-23) N=8
24 meses despues de la ultima inmunizacion con respecto al Valor basal (visita 0)
1 (0,092-11) N=1 1,5 (0,28-8,1) 2,45 (0,45-13) N=2 14 (5,57-34) N=7 6,55 (2,25-19) N=5 23 (8,06-68) N=5 13 (4,39-37) N=5 6,21 (2,52-15) N=7
+ dos inyecciones
Una vez mas, no se
observo una respuesta a la dosis o ventaja significativas de la administracion de dos
inyecciones en comparacion con una en este pequeno estudio.
El analisis de seguridad se evaluo basandose de una serie de criterios diferentes. No se destacaron problemas de seguridad y no se observo una respuesta dependiente de la dosis. Entre los indicadores de reactogenicidad, el dolor en el sitio de la inyeccion (15 casos de 98 inyecciones para el serotipo Ib y 14 casos de 96 inyecciones para el serotipo IN) fue la queja mas comun en las reacciones locales solicitadas para ambos serotipos, y el dolor de cabeza fue la unica en las reacciones sistemicas solicitadas, pero no se observaron diferencias obvias entre el placebo y los individuos vacunados.
Estudio en seres humanos (3)
Este estudio investigo una vacuna de producto conjugado de sacarido capsular de serotipo la, Ib y III de GBS- CRM197 trivalente en mujeres sanas no embarazadas. Se estudiaron dos formulaciones de vacunas diferentes, cada una combinando los tres sacaridos en proporciones iguales. Se sometieron a ensayo dos dosis diferentes (5 |jg y 20 jg, medidas como masa de cada sacarido, en 0,5 ml) con y sin coadyuvante de alum. El estudio tambien evaluo los esquemas de 1 y 2 inyecciones intramusculares (con 30 dfas de diferencia) para cada formulacion. La vacuna tambien incluyo 4,5 mg de cloruro de sodio, 0,34 mg de dihidrogenofosfato de potasio y 7,5 mg de manitol. Los grupos de estudio se resumen en la Tabla 18 a continuacion. Tambien se sometio a ensayo un grupo de placebo (dos inyecciones de solucion salina al 0,9%, con 30 dfas de diferencia) con 20 sujetos.
Tabla 18: Grupos de estudio para el estudio de vacuna de producto conjugado de sacarido capsular de serotipo la, Ib y Ill de GBS-CRM197 trivalente
Variables
1 inyeccion 2 inyecciones
5/5/5 jg
20/20/20 jg 5/5/5 jg 20/20/20 jg
Sin alum.
N = 40 N = 39 N = 40 N = 40
Alum.
N = 40 N = 39 N = 40 N = 40
Se extrajo sangre de cada sujeto en el escrutinio y un mes despues de la primera inyeccion para el analisis de inmunogenicidad mediante ELISA. Los grupos de 2 inyecciones recibieron la segunda inyeccion despues de la extraccion de sangre en el punto temporal de un mes. Tambien se extrajo sangre de todos los grupos a los 3 meses del estudio. En la tabla 19 a continuacion, se proporciona un resumen de la concentracion media geometrica de anticuerpos anti-Ia, Ib y III para cada grupo (ajustado para las concentraciones en el momento inicial de anticuerpos y excluyendo el grupo de placebo).
5 na 5+ sc 20 sc 20+ sc 5 coad. 5+ coad. 20 coad. 20+ coad.
N=40 N=40 N=38 N=39 N=40 N=40 N=39 N=39
Escrutinio 0,71 0,65 0,48 0,49 0,57 0,71 0,59 0,45
(0,41- (0,37- (0,27- (0,28- (0,32- (0,4- (0,33- (0,26-
1,21) 1,16) 0,85) 0,87) 1,01) 1,27) 1,05) 0,79)
N=35 N=35 N=37 N=36 N=35 N=35 N=37
Dia 31 13 12 20 18 16 8,26 12 8,88
(7,06-25) (5,99-23) (10-41) (9,41-36) (8,02-30) (4,19-16) (6,12-24) (4,57-17)
re w m o
N=39
Dia 31 hasta
23 20 34 31 27 14 21 15
el Escrutinio
(12-44) (10-40) (17-66) (16-61) (14-52) (7,32-28) (11-41) (7,62-28)
N=35 N=34 N=36 N=36 N=35 N=35 N=37
Dia 61 16 15 18 23 18 12 13 11
(9,34-28) (8,63-27) (10-33) (13-40) (10-32) (6,79-22) (7,3-23) (6,01-19)
N=38
Dia 61 hasta 28 26 31 39 31 20 23 18
el Escrutinio (16-47) (15-47) (17-55) (22-69) (18-55) (11-36) (13-40) (10-32)
N=35 N=34 N=36 N=36 N=35 N=35 N=36
N=39 N=40 N=38 N=39 N=40 N=40 N=39 N=37
Escrutinio 0,15 0,12 0,1 0,12 0,14 0,11 0,12 0,081
(0,091- (0,072- (0,063- (0,072- (0,082- (0,068- (0,074- (0,048-
0,25) 0,2) 0,17) 0,2) 0,22) 0,19) 0,21) 0,14)
N=37 N=34 N=36 N=37 N=37 N=34 N=34 N=34
Dia 31 4,92 4,21 4,59 4,12 3,94 3,25 3,31 2,87
(2,67- (2,24- (2,51- (2,23-7,6) (2,15- (1,73-6,1) (1,74- (1,48-5,6)
n w m o
9,06) 7,91) 8,41) N=35 7,23) N=39 6,28) N=36
N=38 N=39 N=39 N=37
Dia 31 hasta
45 35 35 33 34 27 30 19
el Escrutinio
(24-85) (18-69) (19-67) (17-63) (18-64) (14-53) (15-59) (9,43-37)
N=36 N=33 N=36 N=35 N=36 N=33 N=32) N=31
Dia 61 5,17 5,29 4,69 5,35 4,1 4,09 3,74 3,39
(3,17- (3,19- (2,84- (3,26- (2,52- (2,47- (2,26- (1,98-5,8)
8,45) 8,78) 7,73) 8,76) 6,68) 6,79) 6,22)
Dia 61 hasta 47 46 38 45 35 35 33 24
el Escrutinio (29-78) (27-77) (23-64) (27-75) (21-59) (21-59) (20-56) (14-41)
N=37 N=34 N=35 N=36 N=37 N=34 N=34 N=32
N=34 N=36 N=38 N=36 N=35 N=36 N=35 N=36
Escrutinio 0,3 0,16 0,17 0,14 0,18 0,38 0,15 0,24
(0,16- (0,088- (0,096- (0,078- (0,1- (0,21- (0,082- (0,13-
0,54) 0,29) 0,3) 0,25) 0,34) 0,69) 0,27) 0,43)
N=34 N=34
Dia 31 7,82 5,48 8,13 8,31 5,5 5,36 8,51 6,03
(4,24-14) (3,03- (4,66-14) (4,47-15) (3-10) (2,88-10) (4,45-16) (3,41-11)
i iiisao
9,91) N=37 N=34 N=34 N=34 N=31
Dia 31 hasta
34 25 36 34 26 24 35 29
el Escrutinio
(19-63) (14-45) (21-64) (19-62) (14-47) (14-44) (19-66) (16-51)
N=31 N=32 N=36 N=31 N=30 N=32 N=28 N=34
Dia 61 7,5 8,71 8,48 9,59 5,35 7,75 8,23 7,79
(4,43-13) (5,31-14) (5,26-14) (5,72-16) (3,2-8,93) (4,58-13) (4,77-14) (4,74-13)
N=33 N=37 N=35 N=32 N=35
Dia 61 hasta 33 43 39 43 26 33 38 38
el Escrutinio (20-55) (26-70) (25-64) (26-71) (15-43) (20-54) (22-64) (23-62)
N=31 N=34 N=36 N=33 N=31 N=33 N=29 N=33
+
- dos inyecciones
sc
- sin coadyuvante
coad. - con coadyuvante
La vacuna fue inmunogenica, induciendo en un porcentaje entre 80% y 100% de los sujetos al menos un aumento 5 de anticuerpos espedficos de GBS de 2 veces a traves de los diferentes serotipos. Una comparacion de las GMC de los ocho grupos no revelo: a) ninguna contribucion de una segunda inyeccion en comparacion con una sola inyeccion; b) ninguna contribucion de la inclusion de coadyuvante de alum. en comparacion con la ausencia de coadyuvante; y c) ninguna contribucion de la dosis mas alta de 20/20/20 |jg frente a 5/5/5 |jg.
Mas espedficamente, no hubo un aumento constante de la respuesta de anticuerpos entre sujetos que recibieron 10 dos inyecciones de vacuna en comparacion con aquellos que recibieron solo una inyeccion de vacuna contra cualquiera de los serotipos de GBS (la, Ib o III). Esta falta de contribucion de la segunda inyeccion de vacuna se
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
observo independientemente de la dosis (5/5/5 o 20/20/20 |jg) o la formulacion (sin coadyuvante de alum. o con coadyuvante de alum.). Para GBS Ia, las mediciones de GMC para cada uno de los ocho grupos oscilaron entre 7 y 20 jg/ml el d^a 61 del estudio. A partir de estos resultados, no se observo contribucion de dos inyecciones (intervalo de GMC [7-16 jg/ml]) en comparacion con una inyeccion (intervalo GMC [9-20 jg/ml] (todas las CI del 95% solapantes)). Ademas, la razon de una frente a dos inyecciones fue de 1,2 [CI del 95% (0,7, 2,0)]. Este resultado indica la equivalencia practica de una inyeccion frente a dos (valor p = 0,5). Para GBS Ib, las mediciones de GMC para cada uno de los ocho grupos oscilaron entre 2 y 7 jg/ml el dfa 61 del estudio. No se observo ninguna contribucion de dos inyecciones (intervalo de GMC [2-5 jg/ml]) en comparacion con una inyeccion (intervalo de GMC [4-7 jg/ml] (todas las CI del 95% solapantes)). Esta vez, la razon de una frente a dos inyecciones fue de 1,2 [CI del 95% (0,7, 2,0)]. Una vez mas, este resultado indica equivalencia practica (valor p = 0,5). Para GBS III, las mediciones para cada uno de los ocho grupos oscilaron entre 5 y 13 jg/ml el dfa 61 del estudio. No se observo ninguna contribucion de dos inyecciones (intervalo de GMC [5-11 jg/ml]) en comparacion con una inyeccion (intervalo de GMC [5-13 jg/ml] (todas las CI del 95% solapantes)). La razon de una frente a dos inyecciones fue de 0,94 [CI del 95% (0,55, 1,66], lo que indica equivalencia (valor p = 0,8).
Del mismo modo, no hubo una contribucion adicional a la GMC a partir de la inclusion de alum. en comparacion con la ausencia de alum. Esta falta de contribucion del coadyuvante de alum. se observo independientemente de la dosis (5/5/5 o 20/20/20 jg) o el numero de inyecciones y se observo en los tres serotipos (Ia, Ib y III). Para GBS Ia, la GMC en los ocho grupos oscilo entre7 y 20 jg/ml el dfa 61 del estudio y no mostro contribucion del alum. (intervalo de GMC [7-15 jg/ml] en comparacion con la ausencia de alum. (intervalo de GMC [13-16 jg/ml] (todas las CI del 95% solapantes)). La razon de GMC del grupo para el grupo sin alum. en comparacion con el grupo con alum. fue de 1,6 [CI del 95% (0,9, 2,6)], lo que sugiere que la respuesta sin alum. es potencialmente mayor con respecto a la formulacion de vacuna con alum. (valor p = 0,11). Para GBS Ib, la GMC oscilo entre 2-7 jg/ml el dfa 61 del estudio y no mostro contribucion del alum. (intervalo de GMC [2-4] jg/ml] en comparacion con la ausencia de alum. (intervalo de GMC [4-7 jg/ml] (todas las CI del 95% solapantes)). La razon de GMC del grupo para el grupo sin alum. en comparacion con el grupo con alum. fue de 1,4 [CI del 95% (0,8, 2,4)], lo que implica una equivalencia cercana en los valores de GMC (valor p = 0,2). Para GBS III, GMC oscilo entre 5 y 13 jg/ml el dfa 61 del estudio y no mostro contribucion del alum. (intervalo de GMC [5-11 jg/ml] en comparacion con la ausencia de alum. (intervalo de GMC [5-13 jg/ml] (todas las CI del 95% solapantes)). La razon de GMC del grupo para el grupo sin alum. en comparacion con el grupo con alum. fue de 1,09 [CI del 95% (0,6, 1,9)], lo que implica una equivalencia cercana en los valores de GMC (valor p = 0,7).
Finalmente, los datos permiten una evaluacion de las dos dosis (5 frente a 20 jg de cada uno de los tres sacaridos en los productos conjugados). Los resultados sugieren que la dosis mas alta (20 jg) no induce una respuesta de anticuerpos mas alta. En particular, las razones de GMC para sujetos que reciben 5 jg (en todos los grupos) y los sujetos que reciben 20 jg (en todos los grupos) son 1,2 [CI del 95% (0,7, 2,1)] para GBS Ia; 0,7 [CI del 95% (0,4, 1,2)] para GBS Ib y 1,4 [CI del 95% (0,9, 2,5)] para GBS III. Estas razones son cercanas a 1 y los valores p de la prueba estadfstica para la igualdad a 1, son >0,15 para los tres serotipos, lo que sugiere que no hay diferencias discernibles en el nivel de anticuerpos inducidos entre los dos regfmenes de dosificacion.
La seguridad se midio mediante la incidencia de reactogenicidad local y sistemica, los eventos adversos y los eventos adversos graves, asf como los resultados de laboratorio clmico. Se encontro que la vacuna trivalente contra GBS era segura y bien tolerada en los ocho grupos de estudio de la vacuna en comparacion con el placebo. La seguridad fue evaluada mediante: porcentajes de sujetos con reacciones locales recabadas (es decir dolor en el sitio de inyeccion, equimosis, eritema, induracion e hinchazon) y reacciones sistemicas recabadas (es decir escalofnos, nauseas, malestar general, mialgia, cefalea, fatiga, artralgia, erupcion cutanea, fiebre [definida como temperatura axilar > 38°C], y otras reacciones que ocurren durante los 7 dfas posteriores a cada vacunacion junto con la gravedad de las reacciones; todos los otros eventos adversos referidos desde el dfa 1 hasta el dfa 23 despues de cada vacunacion; porcentajes de sujetos con eventos adversos graves y/o eventos adversos referidos que dieron como resultado el abandono del estudio, por grupo de vacunas hasta el Dfa 61.
Estudio en seres humanos (4)
Las respuestas de los sujetos con niveles de anticuerpos (Ab) por debajo de la deteccion al ingreso al estudio (0,4, 0,084 y 0,068 jg/ml para los serotipos Ia, Ib y III, respectivamente) fueron de particular interes. Este subconjunto de analisis se llevo a cabo sobre los datos del Estudio en seres humano (3) anterior. Para cada serotipo, los datos se evaluaron como:
(a) GMC para cada grupo de inyeccion/formulacion/dosis, y CI del 95% correspondiente
(b) GMC sobre todos los sujetos que recibieron (i) 1 inyeccion independientemente de una asignacion grupal y esto se comparo con la GMC de todos los sujetos que recibieron 2 inyecciones. De forma similar, la GmC de los sujetos que no recibieron coadyuvante en comparacion con la GMC de los sujetos que recibieron alum., asf como la GMC de los que recibieron dosis de 5/5/5 jg en comparacion con la GMC de todos los sujetos que recibieron 20/20/20 jg. La evaluacion se baso en la razon de GMC, junto con la CI del 95% bilateral en torno a la razon calculada.
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(c) Proporcion de sujetos con un cambio de al menos 4 veces desde el valor basal, suponiendo la mitad del nivel mas bajo de deteccion (lld).
En general, aproximadamente 25% y 50% de las mujeres presentaron niveles de Ab por debajo del lfmite de deteccion para los serotipos III y la/Ib, respectivamente. El porcentaje de sujetos en este subconjunto que logran un aumento >4 veces en el nivel de Ab el dfa 61 en comparacion con el valor basal (donde el valor basal se asigna a la mitad de lld) oscila entre 64 y 95% (serotipo la), 80-100% (serotipo Ill) y 81-100% (serotipo lb).
De forma similar a los resultados de la cohorte de estudio completa, los sujetos con niveles indetectables de Ab en el ingreso al estudio tampoco muestran el beneficio adicional de 2 inyecciones (frente a 1 inyeccion), de una dosis mas alta (versus dosis mas baja) o de la inclusion de alum. (frente a la ausencia de coadyuvante). La razon de GMC (el dfa 61) para todos los sujetos que recibieron una inyeccion frente a los sujetos que recibieron 2 inyecciones fue de 1,1 (0,6-1,8; serotipo la), 0,7 (0,3-1,5; serotipo Ill) y 0,9 (0,5-1,4; serotipo lb); para todos los sujetos que recibieron una dosificacion de 5 |jg frente a todos los que recibieron 20 |jg fue de 1,3 (0,8-2,1; serotipo la), 1,4 (0,7-2,8; serotipo Ill) y 1,4 (0,9-2,3; serotipo lb); para todos los sujetos que no recibieron coadyuvante frente a todos los sujetos que recibieron alum. fue de 1,4 (0,8-2,4; serotipo la), 1 (0,5-2,0; serotipo Ill) y 1,7 (1,1-2,7; serotipo lb)
Estudio con ratones (15)
Los ratones se cebaron con CRM197 y coadyuvante de hidroxido de aluminio o coadyuvante de hidroxido de aluminio solo el dfa 0 y a continuacion se inmunizaron con un producto conjugado de serotipo Ill de GBS/CRM197 con coadyuvante o sin coadyuvante de hidroxido de aluminio los dfas 21 y 35. Se extrajo sangre el dfa 0 y antes la vacunacion los dfas 21 y 35. Se midieron los tftulos sericos de IgG/IgM del polisacarido de serotipo Ill de GBS y la protema portadora CRM197 a partir de las muestras de sangre.
Como se muestra en la Figura 4, el cebado con el portador CRM197 dio como resultado una respuesta de anticuerpos lgG significativamente mayor al portador despues de una y dos dosis de la vacuna (con o sin coadyuvante) en comparacion con los ratones no cebados (P <0,0002). El cebado tambien dio como resultado una buena respuesta de anticuerpos contra el polisacarido de serotipo Ill de GBS despues de dos dosis de vacuna (con o sin coadyuvante). Los ratones no cebados necesitaron el coadyuvante para alcanzar un titulo de anticuerpo anti- polisacarido comparable al observado en ratones cebados. En ratones no cebados, cuando la vacuna de producto glicoconjugado se administro sin coadyuvante, el titulo de anticuerpos fue significativamente menor que en los otros grupos (P <0,03).
Por lo tanto, el cebado con CRM197 parece tener una influencia positiva en la posterior respuesta de anticuerpos al componente de sacarido capsular de GBS del producto conjugado, incluso cuando se administra sin un coadyuvante.
Estudios en ratas y conejos
Se llevaron a cabo estudios para evaluar la posible toxicidad reproductiva y para desarrollo de la vacuna de producto conjugado de sacarido capsular de serotipo la, lb y Ill de GBS-CRM197 trivalente en ratas y conejos.
El estudio en ratas se llevo a cabo de acuerdo con la tabla 20 a continuacion:
Tabla 20: Estudio en ratas
Tratamiento
Dosis de cada antfgeno1 (pg) Volumen de dosis SC (mL) Dias de dosificacion con respecto al apareamiento el Dia 0 Numero de animales
Seccion C (gestacion dia 21)
Parto natural
Control (solucion salina)
0/0/0 0,5 -35, -21, -7, 6, 12, 17 24 24
Vacuna GBS
20/20/20 0,5 24 24
Vacuna GBS
20/20/20 0,5 6, 12, 17 24 24
Vacuna de GBS + alum*
20/20/20 0,5 -35, -21, -7, 6, 12, 17 24 24
Vacuna de GBS + alum*
20/20/20 0,5 6, 12, 17 24 24
± para serotipo la/lb/lll * hidroxido de aluminio, 2 mg/ml
La administracion subcutanea de la vacuna trivalente a ratas hembra los d^as de estudio 1, 15 y 29 (penodo de preapareamiento) y/o los d^as de gestacion 6, 12 y 17 a una dosis de 20 |jg con o sin hidroxido de aluminio no ocasiono toxicidad materna o efectos sobre la funcion reproductiva o desarrollo embriofetal. No se observaron diferencias entre los grupos tratados con tres o seis inyecciones de la vacuna trivalente con o sin coadyuvante de 5 hidroxido de aluminio. Ademas, no hubo ningun efecto sobre la supervivencia, el estado clmico o el peso corporal o la capacidad reproductiva de las cnas de la generacion F1.
El estudio en conejos se llevo a cabo de acuerdo con la tabla 21 a continuacion:
Tabla 21: Estudio en conejos
Tratamiento
Dosis de cada antfgeno1 (pg) Volumen de dosis de IM (mL) Dias de dosificacion con respecto al apareamiento el Dia 0 Numero de animales
Seccion C (dia de gestacion 29)
Parto natural
Control (solucion salina)
0/0/0 0,5 -35, -21, -7, 7, 20 23 25
Vacuna de GBS + alum*
20/20/20 0,5 -35, -21, -7, 7, 20 23 25
Vacuna GBS + alum.
20/20/20 0,5 7, 20 23 25
± para serotipo Ia/Ib/III * hidroxido de aluminio, 2 mg/ml
10 La administracion intramuscular de la vacuna trivalente mas hidroxido de aluminio a conejos hembra, a una dosis de 20 jg los dfas de estudio 1, 15 y 29 (penodo de preapareamiento) y/o los dfas de gestacion 7 y 20, no produjo toxicidad materna, efectos sobre el apareamiento ni evidencia de embrioletalgia, fetotoxicidad o teratogenicidad. No hubo diferencias entre la generacion F1 de adultos control y la tratada con vacuna.
Estos estudios demostraron que la vacuna trivalente era inmunogenica y no tema ningun efecto prenatal o postnatal 15 sobre ratas o conejos prenados o su descendencia.
Estudio de estabilidad
La estabilidad de la vacuna de producto conjugado de sacarido capsular con serotipo la, Ib y III de GBS-CRM197 trivalente se midio durante 1 mes de almacenamiento a dos temperaturas diferentes. La vacuna se formulo reuniendo los tres productos glicoconjugados, cada uno presente a 80 jg de sacarido/ml en KH2PO4 10 mM y 20 manitol al 3%. Se cargaron viales de una sola dosis de 3 ml con 0,3 ml de solucion, se taparon parcialmente con un tapon de goma siliconado con bromobutililo y se sometieron a un ciclo de liofilizacion. Una vez que finalizo el procedimiento de liofilizacion, los viales se almacenaron a 2-8°C o 36-38°C. Se detecto un ligero aumento en el contenido de sacarido libre (utilizando HPAEC-PAD) tras el almacenamiento a 36-38°C. Sin embargo, en general, la vacuna trivalente fue estable durante el almacenamiento hasta un mes a 2-8°C y a 36-38°C.
25 Se entendera que la invencion se ha descrito unicamente a modo de ejemplo y se pueden hacer modificaciones.
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Claims (14)

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    1. Una composicion inmunogenica que comprende: (a) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ia del Grupo B de Streptococcus conjugado con una protema portadora; (b) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo Ib del Grupo B de Streptococcus conjugado con una protema portadora; y (c) un producto conjugado que es un polisacarido capsular de serotipo III del Grupo B de Streptococcus conjugado con una protema portadora en donde (i) cada sacarido capsular de gBs esta presente en una cantidad de aproximadamente 5 |jg, 10 |jg o 20 |jg por dosis unitaria, (ii) la protema portadora en (a), (b) y (c) es toxoide difterico o CRM197 y (iii) la composicion inmunogenica no contiene un coadyuvante de sal de aluminio.
  2. 2. La composicion inmunogenica de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde las cantidades de sacaridos capsulares de serotipo Ia, Ib y III del Grupo B de Streptococcus por dosis unitaria son aproximadamente 5 jig, 5 jig y 5 jg.
  3. 3. La composicion inmunogenica de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde la razon de las masas de los sacaridos capsulares de serotipo Ia, Ib y III del Grupo B de Streptococcus es 1:1:1.
  4. 4. La composicion inmunogenica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende adicionalmente:
    d) un producto conjugado que es un sacarido capsular de serotipo V del Grupo B de Streptococcus conjugado con una protema portadora.
  5. 5. La composicion inmunogenica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la composicion es para administracion en una dosis unitaria.
  6. 6. La composicion inmunogenica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el producto o los productos conjugados se pueden obtener por aminacion reductiva de grupos aldetndo generados antes de la conjugacion mediante oxidacion de entre 10 y 30% de los restos de acido sialico de los sacaridos.
  7. 7. La composicion inmunogenica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el sacarido o los sacaridos capsulares del grupo B de Streptococcus no tienen sustancialmente O-acetilacion de restos de acido sialico en las posiciones 7, 8 y/o 9.
  8. 8. La composicion inmunogenica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composicion es para administracion intramuscular.
  9. 9. La composicion inmunogenica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composicion comprende adicionalmente: (a) un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre SEQ ID NO 1 a 3, y/o (b) un polipeptido que comprende (i) un secuencia de aminoacidos que tiene 90% de identidad de secuencia o mas con uno o mas de SEQ ID NO 1 a 3 y/o (ii) un fragmento de SEQ ID No 1 a 3.
  10. 10. La composicion inmunogenica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composicion comprende manitol para estabilizar el producto o los productos conjugados.
  11. 11. La composicion inmunogenica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso como medicamento.
  12. 12. La composicion inmunogenica de acuerdo con las reivindicaciones 1-10 o para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde la composicion es una vacuna para su uso en la prevencion y/o tratamiento de una enfermedad causada por S. agalactiae.
  13. 13. La composicion inmunogenica de acuerdo con las reivindicaciones 1-10 o para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 11 o 12, en donde la composicion es para su administracion a seres humanos seleccionados entre mujeres en edad fertil, mujeres embarazadas y pacientes de edad avanzada.
  14. 14. La composicion inmunogenica de acuerdo con las reivindicaciones 1-10 o para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 11-13, en donde la composicion es para su administracion a un paciente que ha sido preinmunizado con un toxoide difterico o un derivado del mismo.
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