ES2608048T3 - Vacunas polipeptídicas para protección amplia contra linajes meningocócicos hipervirulentos - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende cinco antígenos meningocócicos: (1) una proteína NadA que es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; (2) una proteína 741 que tiene >=85% de identidad con la SEQ ID NO: 3; (3) una proteína 936 que tiene >=85% de identidad con la SEQ ID NO: 4; (4) una proteína 953 que tiene >=85% de identidad con la SEQ ID NO: 5; y (5) una proteína 287 que tiene >=85% de identidad con la SEQ ID NO: 6.

Description

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anticuerpo, se obtienen mediante expresión recombinante en un anfitrión no Neisseriano. De este modo, los inmunógenos en las composiciones de la invención son preferiblemente inmunógenos recombinantes. De este modo se pueden preferir las composiciones que no incluyen preparaciones de OMV.

Composiciones y medicamentos inmunogénicos

Las composiciones de la invención son inmunogénicas, y son más preferiblemente composiciones de vacuna. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser ya sea profilácticas (es decir para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir para tratar la invención), pero normalmente serán profilácticas.

El pH de la composición está preferiblemente entre 6 y 8, preferiblemente aproximadamente 7. Se puede mantener el pH estable mediante el uso de un regulador. Cuando una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, se prefiere utilizar un regulador de histidina [26]. La composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los humanos.

Se pueden presentar las composiciones en viales, o se pueden presentar en jeringas llenas listas para uso. Las jeringas se pueden suministrar con o sin agujas. Una jeringa incluirá una dosis simple de la composición, mientras que un vial puede incluir una dosis simple o dosis múltiples. Las composiciones inyectables usualmente serán soluciones o suspensiones líquidas. Alternativamente, se pueden presentar en forma sólida (por ejemplo liofilizadas) para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de inyección.

Las composiciones de la invención se pueden empacar en forma de dosis unitaria o en forma de dosis múltiple. Para las formas de dosis múltiple, se prefieren los viales a las jeringas prellenadas. Los volúmenes de dosificación efectivos se pueden establecer rutinariamente, pero una dosis típica humana de la composición para inyección tiene un volumen de 0,5 ml.

Cuando se va a preparar una composición de la invención extemporáneamente antes del uso (por ejemplo cuando un componente se presenta en forma liofilizada) y se presenta como un conjunto, el conjunto puede comprender dos viales, o puede comprender una jeringa llena y lista para uso y un vial, con los contenidos de la jeringa que se utilizan para reactivar los contenidos del vial antes de inyección.

La invención también proporciona una composición de la invención para uso como un medicamento. El medicamento es preferiblemente capaz de producir una respuesta inmunitaria en un mamífero (es decir es una composición inmunogénica) y es más preferiblemente una vacuna.

La invención también proporciona el uso de una composición de la invención en la fabricación de un medicamento para aumentar una respuesta inmunitaria en un mamífero. También se divulga el uso de una proteína ‘NadA’, una proteína ‘741’, una proteína ‘936’, una proteína ‘953’, y una proteína ‘287’ (y otros antígenos opcionales) en la fabricación de un medicamento para aumentar una respuesta inmunitaria en un mamífero. El medicamento es preferiblemente una vacuna.

También se divulga un método para aumentar una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de una composición de la invención. La respuesta inmunitaria es preferiblemente protectora y preferiblemente involucra anticuerpos. El método puede aumentar una respuesta de refuerzo.

El mamífero es preferiblemente un humano. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el humano es preferiblemente un niño (por ejemplo un bebé que empieza a andar o un infante); cuando la vacuna es para uso terapéutico, el humano es preferiblemente un adulto. Una vacuna destinada para niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.

Estos usos y métodos son preferiblemente para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad provocada por una Neisseria (por ejemplo meningitis, septicemia, bacteriemia, gonorrea, etc.). se prefiere la prevención y/o tratamiento de la meningitis bacteriana o meningocócica.

Una manera de verificar la eficacia del tratamiento terapéutico involucra monitorizar infección por Neisseria después de administración de la composición de la invención. Una manera de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico involucra monitorizar las respuestas inmunitarias contra los cinco antígenos básicos después de administración de la composición. Se puede determinar la inmunogenicidad de las composiciones de la invención al administrarlas a sujetos de prueba (por ejemplo niños de 12 a 16 meses de edad, o modelos animales [27]) y luego determinar los parámetros estándares, que incluyen los anticuerpos bactericidas en suero (SBA) y los títulos de ELISA (GMT) de IgG anti-cápsula, total y de alta avidez. En general se determinarán estas respuestas inmunitarias alrededor de 4 semanas después de administración de la composición, y se compararán con los valores determinados antes de administración de la composición. Se prefiere un incremento en SBA de por lo menos 4 veces u 8 veces. Cuando se

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administra más de una dosis de la composición, se puede realizar más de una determinación posterior a la administración.

Las composiciones preferidas de la invención pueden conferir un título de anticuerpo en un paciente, que es superior al criterio para la seroprotección para cada componente de antígeno para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Los antígenos con un título de anticuerpo asociado anteriores cuyo anfitrión se considera seroconvertido contra el antígeno, son bien conocidos, y dichos títulos son publicados por organizaciones tales como WHO. Preferiblemente se seroconvierte más del 80% de una muestra estadísticamente significativa de los sujetos, más preferiblemente más del 90%, todavía más preferiblemente más del 93% y lo más preferiblemente 96 a 100%.

En general se administrarán las composiciones de la invención directamente a un paciente. El suministro directo puede ser logrado mediante inyección parenteral (por ejemplo por vía subcutánea, por vía intraperitoneal, por vía intravenosa, por vía intramuscular, o en el espacio intersticial de un tejido), o mediante administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración por mucosa. Se prefiere administración intramuscular en el muslo o en la parte superior del brazo. La invención puede ser por medio de una aguja (por ejemplo una aguja hipodérmica), pero se puede utilizar alternativamente inyección sin aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0,5 ml.

Se puede utilizar la invención para provocar inmunidad sistémica y/o por mucosa.

El tratamiento de dosis puede ser un esquema de dosis simple o un esquema de dosis múltiples. Se pueden utilizar dosis múltiples en un esquema de inmunización primaria y/o en un esquema de inmunización de refuerzo. Un esquema de dosis primario puede ser seguido por un esquema de dosis de refuerzo. Se puede determinar rutinariamente la sincronización adecuada entre las dosis de carga (por ejemplo entre 4-16 semanas), y entre dosis de carga y refuerzo.

Las infecciones por Neisseria afectan diversas áreas del cuerpo y por consiguiente se pueden preparar las composiciones de la invención en diversas formas. Por ejemplo, se pueden preparar las composiciones como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de inyección (por ejemplo una composición liofilizada). Se puede preparar la composición para administración tópica, por ejemplo como un ungüento, crema o polvo. La composición se va a preparar para administración oral, por ejemplo como un comprimido o cápsula, o como un jarabe (opcionalmente saborizado). Se puede preparar la composición para administración pulmonar, por ejemplo como un inhalador, utilizando un polvo fino o una pulverización. Se puede preparar la composición como un supositorio o pesario. Se puede preparar la composición para administración nasal, aural u ocular, por ejemplo como pulverizaciones, gotas, gel o polvo [por ejemplo referencias 28 y 29]. Se ha reportado éxito con la administración nasal de los sacáridos neumocócicos [30, 31], polipéptidos neumocócicos [32], sacáridos Hib [33], sacáridos MenC [34], y mezclas de conjugados sacáridos Hib y MenC [35].

Las composiciones inmunogénicas utilizadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de antígenos, así como cualesquiera otros componentes, como sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente efectiva" se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis simple o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo que se va a tratar, edad, grupo taxonómico del individuo que se va a tratar (por ejemplo primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseada, la fórmulación de la vacuna, la evaluación del médico acerca de la situación médica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá en un rango relativamente alto que se puede determinar a través de ensayos de rutina, y una cantidad típica de cada antígeno de sacárido de meningococo por dosis, está entre 1 μg y 20 μg, por ejemplo aproximadamente 1 μg, aproximadamente 2,5 μg, aproximadamente 4 μg, aproximadamente 5 μg, o aproximadamente 10 μg (expresado como sacárido).

Componentes no antigénicos adicionales de la composición

La composición de la invención, normalmente, además de los componentes anteriormente mencionados, comprenderá uno o más "portadores farmacéuticamente aceptables" los cuales incluyen cualquier portador que por sí mismo no induce la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son normalmente macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarosas [36], trehalosa [37], lactosa, y agregados de lípidos (tales como gotitas o liposomas). Dichos portadores son bien conocidos por aquellos con experiencia común en la técnica. Las vacunas también pueden contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias reguladoras de pH, y similares. La solución salina fisiológica estéril, libre de pirógenos, regulada con fosfato, es un portador típico. Una discusión exhaustiva de los excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en la referencia 38.

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Las composiciones de la invención pueden incluir un antimicrobiano, particularmente cuando se empaca en el formato de dosis múltiples.

Las composiciones de la invención pueden comprender detergente, por ejemplo un Tween (polisorbato), tal como Tween 80. En general los detergentes están presentes a bajos niveles, por ejemplo <0,01%.

Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo cloruro de sodio) para dar tonicidad. Una concentración de 10±2 mg/ml de cloruro de sodio es típica.

Las composiciones de la invención incluirán en general un regulador. Es típico un regulador de fosfato.

Las composiciones de la invención pueden comprender un alcohol de azúcar (por ejemplo manitol) o un disacárido (por ejemplo sacarosa o trehalosa) por ejemplo alrededor de 15 a 30 mg/ml (por ejemplo 25 mg/ml), particularmente si estas van a ser liofilizadas o si incluyen material que ha sido reconstituido del material liofilizado. El pH de una composición para la liofilización se puede ajustar alrededor de 6,1 antes de la liofilización.

Se pueden administrar las vacunas de la invención en conjunto con otros agentes inmunorreguladores. En particular, las composiciones incluirán usualmente un adyuvante. Los adyuvantes que se pueden utilizar en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a:

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales, adecuadas para uso como adyuvantes en la invención, incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. [por ejemplo véase Capítulos 8 y 9 de la referencia 391, o mezclas de diferentes compuestos minerales, con los compuestos que toman cualquier forma adecuada (por ejemplo gel, cristalina, amorfa, etc.), y con la adsorción que es la preferida. También se pueden formular composiciones que contienen minerales como una partícula de sal de metal [40].

Se prefieren particularmente fosfatos de aluminio, particularmente en composiciones que incluyen un antígeno de sacárido de H. influenzae, y un adyuvante típico es al hidroxifosfato de aluminio amorfo con relación molar PO4/Al entre 0,84 y 0,92, incluido a 0,6 mg de Al3+/ml. Se puede utilizar adsorción con una dosis baja de fosfato de aluminio, por ejemplo, entre 50 y 100 μg de A13+ por conjugado por dosis. Cuando existe más de un conjugado en una composición, no todos los conjugados necesitan ser adsorbidos.

B. Emulsiones en Aceite

Las composiciones de emulsión en aceite adecuadas para uso como adyuvantes en la invención, incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 [Capítulo 10 de la referencia 39; véase también referencia 41] (5% de escualeno, 0,5% de Tween 80, y 0,5% de Span 85, formulados en partículas submicrónicas utilizando un microfluidizador). También se pueden utilizar adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA).

C. Formulaciones con saponina [Capítulo 22 de la referencia 39]

También se pueden utilizar las formulaciones con saponina como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterólogo de glucósidos de estero1 y glucósidos de triterpenoide que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso flores de un amplio rango de especies vegetales. Se ha utilizado ampliamente la saponina proveniente de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina como adyuvante. La saponina también se puede obtener comercialmente de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia), y Saponaria officianalis (raíz d jabonera). Las formulaciones adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones lipídicas, tales como ISCOMSs. El QS21 es comercializada como Stimulon™.

Se han purificado las composiciones de saponina utilizando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado las fracciones purificadas específicas utilizando estas técnicas, que incluyen QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferiblemente, la saponina es QS21. Un método de producción de QS21 se describe en la referencia 42. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol [43].

Se pueden utilizar las combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas individuales llamadas complejos inmunoestimuladores (ISCOMs) [Capítulo 23 de la referencia 391. Los ISCOM también incluyen normalmente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina O fosfatidilcolina. Se puede utilizar cualquier saponina conocida en ISCOMs. Preferiblemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM adicionalmente se describen en las referencias 43 a 45. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de detergente adicional [46].

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Los inmunomoduladores humanos adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen citoquinas, tales como interleuquinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [88], etc.) [89], interferones (por ejemplo interferón-γ), factor de estimulación de colonias de macrófagos, y factor de necrosis tumoral.

G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos

También se pueden utilizar bioadhesivos y mucoadhesivos como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificado [90] o mucoadhesivos tales como derivados entrecruzados de poli(ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. También se pueden utilizar quitosano y derivados del mismo como adyuvantes en la invención [91].

H. Micropartículas

También se pueden utilizar micropartículas como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (por ejemplo una partícula de ~100 nm a ~150 μm de diámetro, más preferiblemente ~200 nm a ~30 μm de diámetro, y lo más preferiblemente ~500 nm a ~10 μm de diámetro) formadas de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo un poli(ácido α-hidroxi), use prefieren un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(lactida-co-glicólido), opcionalmente tratados para tener una superficie negativamente cargada (por ejemplo con SDS) o una superficie positivamente cargada (por ejemplo con un detergente catiónico, tal como CTAB).

I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de la referencia 39]

Los ejemplos de formulaciones de liposomas, adecuados para uso como adyuvantes, se describen en las referencias 92 a 94.

J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno

Los adyuvantes adecuados para uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [95]. Dichas formulaciones incluyen adicionalmente surfactantes de éster de polioxietilensorbitán, en combinación con un octoxinol [96] así como surfactantes de éteres o ésteres de alquilo de polioxietileno en combinación con por lo menos un surfactante no iónico adicional tal como un octoxinol [97]. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: éter de polioxietileno-9-laurilo (laureth 9), éter de polioxietileno-9-steorilo, éter de polioxiteileno-8-esteorilo, éter de polioxietileno-4-laurilo, éter de polioxietileno-35-laurilo, y éter de polioxietileno-23laurilo.

K. Polifosfazeno (PCPP)

Se describen las formulaciones de PCPP, por ejemplo, en las referencias 98 y 99.

L. Péptidos de muramilo

Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para uso como adyuvantes en la invención, incluyen Nacetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), Y Nacetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanin-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-tiaina MTP-PE).

M. Compuestos de Imidazoquinolona

Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para uso como adyuvantes en la invención, incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo "Resiquimod 3M") descritos adicionalmente en las referencias 100 y 101.

La invención también puede comprender las combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, se pueden utilizar las siguientes composiciones adyuvantes en la invención: (1) una saponina y una emulsión aceite en agua [102]; (2) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) [103]; (3) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo QS21) t 3dMPL t IL-12 (opcionalmente

+ un ésterol) [104]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones aceite en agua [105]; (6) SAF, que contiene 10% de escualeno, 0,4% de Tween 80™, 5% de polímero en bloque plurónico L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrónica o agitado en centrífuga para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande. (7) sistema de adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene 2% de escualeno, 0,2% de Tween 80, y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de pared celular (CWS), preferiblemente MPL

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Los antígenos de proteína tóxicos se pueden destoxificar cuando sea necesario (por ejemplo destoxificación de la toxina de tos ferina por medios químicos y/o genéticos [115]).

Como una alternativa al uso de los antígenos de proteína en la composición de la invención, el ácido nucleico que codifica para el antígeno se puede utilizar [por ejemplo referencias 121 a 129]. Los componentes de proteína de las composiciones de la invención de este modo se pueden reemplazar por ácido nucleico (preferiblemente ADN, por ejemplo en la forma de un plásmido) que codifica la proteína. Similarmente, las composiciones de la invención pueden comprender proteínas que imitan los antígenos de sacáridos por ejemplo mimotopos [130] o anticuerpos antiidiotipo. Estos pueden reemplazar los componentes de sacáridos individuales, o pueden complementarlos. Como un ejemplo, la vacuna puede comprender un mimético de péptido del polisacárido capsular MenC [131] o MenA

[132] en lugar del sacárido en sí mismo.

Composiciones particularmente preferidas de la invención incluyen uno, dos o tres de: (a) antígenos de sacáridos de serogrupos Y, W135, C de y (opcionalmente) A de meningococos; (b) un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae tipo B; y/o (c) un antígeno de Streptococcus pneumoniae. Una composición que comprende los antígenos del serogrupo B yse prefiere particularmente un conjugado de Hib.

Serogrupos Y, W135, C y (opcionalmente) A de Meningococos

Como se mencionó anteriormente, se han conocido por muchos años las vacunas de polisacáridos contra los serogrupos A, C, W135 e Y. Estas vacunas (MENCEVAX ACWY™ y MENOMUNE™) se basan en polisacáridos capsulares de los organismos y, aunque son efectivas en adolescentes y adultos, dan una pobre respuesta inmunitaria y corta duración de protección, y no se pueden utilizar en infantes.

En contraste a los antígenos de polisacáridos no conjugados en estas vacunas, las vacunas del serogrupo C recientemente aprobadas (Menjugate™ [133,107], Meningitec™ y NeisVac-C™ incluyen sacáridos conjugados. Menjugate™ y Meningitec™ tienen antígenos de oligosacáridos conjugados con un portador CRM197, mientras que NeisVac-C™ utiliza el polisacárido completo (des-O-acetilado) conjugado a un portador del toxoide tetánico.

Las composiciones de la presente invención incluyen preferiblemente antígenos de sacáridos capsulares de uno o más los serogrupos Y, W135, C y (opcionalmente) A de meningococos, en los que los antígenos se conjugan a proteínas portadoras y/o son oligosacáridos.

Una cantidad típica de cada antígeno de sacárido neumocócico por dosis, está entre 1 μg y 20 μg, por ejemplo aproximadamente 1 μg, aproximadamente 2,5 μg, aproximadamente 4 μg, aproximadamente 5 μg, o aproximadamente 10 μg (expresado como sacárido).

Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares de ambos serogrupos A y C, la relación (peso/peso) del sacárido MenA: sacárido MenC puede ser mayor de 1 (por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor). Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares del serogrupo Y, y uno o ambos de los serogrupos C y W135, la relación (peso/peso) del sacárido MenY:sacárido MenW135 puede ser mayor de 1 (por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor) y/o que la relación (peso/peso) del sacárido MenY:sacárido MenC puede ser menor de 1 (por ejemplo 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 o menor). Las relaciones preferidas (peso/peso) para los sacáridos de los serogrupos A:C:W135:Y son: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; y 2:2:2:1. Las relaciones preferidas (peso/peso) para los sacáridos de los serogrupos C:W135:Y son: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; y 2:1:1. Se prefiere utilizar una masa sustancialmente igual de cada sacárido.

Los sacáridos capsulares serán utilizados en general en la forma de oligosacáridos. Estos se forman convenientemente formados mediante fragmentación del polisacárido capsular purificado (por ejemplo mediante hidrólisis), que usualmente será seguida por purificación de los fragmentos del tamaño deseado.

La fragmentación de los polisacáridos preferiblemente se realiza para dar un grado promedio final de polimerización (DP) en el oligosacárido menor de 30 (por ejemplo entre 10 y 20, preferiblemente alrededor de 10 para el serogrupo A; entre 15 y 25 para los serogrupos W135 e Y, preferiblemente alrededor de 15 a 20; entre 12 y 22 para el serogrupo C; etc.). DP puede ser convenientemente medida mediante cromatografía de intercambio iónico o mediante ensayos colorimétricos [134].

Si se realiza la hidrólisis, el hidrolizado en general se ajustará a tamaño con el fin del iminar los oligosacáridos de longitud corta [135]. Esto se puede lograr de diversas maneras, tal como la ultrafiltración, seguida por cromatografía de intercambio iónico. Los oligosacáridos con un grado de polimerización menor que o igual a aproximadamente 6 preferiblemente se eliminan para el serogrupo A, y aquellos menores de alrededor de 4 preferiblemente se eliminan para los serogrupos W135 e Y.

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cada grupo Z se selecciona independientemente de OH o un grupo bloqueador como se definió anteriormente; y cada grupo Q se selecciona independientemente de OH o un grupo bloqueador como se definió anteriormente;

Y se selecciona de OH o un grupo bloqueador como se definió anteriormente;

E es H o un grupo protector de nitrógeno;

y en el que más de aproximadamente 7% (por ejemplo 8%, 9%, 10% o más) de los grupos Q son grupos bloqueadores.

Cada uno de los grupos n+2Z puede ser el mismo o diferente uno del otro. De igual modo, cada uno de los grupos n+2Q puede ser el mismo o diferente uno del otro. Todos los grupos Z pueden ser OH. Alternativamente, por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o 60% de los grupos Z pueden ser OAc. Preferiblemente, aproximadamente 70% de los grupos Z son OAc, con el resto de los grupos Z que son OH o grupos bloqueadores, como se definió anteriormente. Por lo menos aproximadamente 7% de los grupos Q son grupos bloqueadores. Preferiblemente, por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 99% o incluso 100% de los grupos Q son grupos bloqueadores.

Las composiciones preferidas de la invención pueden ser almacenadas durante 28 días a 37º C y, después de ese periodo, menos de f% de la cantidad total inicial del sacárido MenA conjugado, estará no conjugada, donde f es 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o menos.

Los polisacáridos capsulares de meningococos normalmente se preparan mediante un procedimiento que comprende las etapas de precipitación del polisacárido (por ejemplo utilizando un detergente catiónico), fraccionamiento con etanol, extracción con fenol frío (para eliminar la proteína) y ultracentrifugación (para eliminar LPS) [por ejemplo referencia 138]. Sin embargo, un procedimiento más preferido [108], involucra la precipitación del polisacárido, seguido por solubilización del polisacárido precipitado, utilizando un alcohol inferior. La precipitación se puede lograr utilizando un detergente catiónico tal como sales de tetrabutilamonio y de cetiltrimetilamonio (por ejemplo las sales de bromuro), o las sales de bromuro de hexadimetrina y de miristiltrimetilamonio. Particularmente se prefiere el bromuro de cetiltrimetilamonio (‘CTAB’) [139]. Se puede lograr la solubilización del material precipitado utilizando un alcohol inferior tal como metanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2-metil-propan-2-ol, dioles, etc., pero el etanol es particularmente adecuado para solubilizar los complejos CTABpolisacárido. El etanol preferiblemente se agrega al polisacárido precipitado para dar una concentración final (con base en el contenido total de etanol y agua) de entre 50% y 95%.

Después de la resolubilización, el polisacárido se puede tratar adicionalmente para eliminar los contaminantes. Esto es particularmente importante en situaciones donde incluso la contaminación menor no es aceptable (por ejemplo para la producción de vacunas humanas). Esto involucrará normalmente una o más etapas de filtración, por ejemplo filtración profunda, filtración a través de carbono activado, filtración por tamaño y/o ultrafiltración. Una vez filtrado para eliminar contaminantes, se puede precipitar el polisacárido para tratamiento y/o procesamiento posteriores. Esto se puede lograr convenientemente mediante intercambio de cationes (por ejemplo mediante la adición de sales de calcio o de sodio).

Como una alternativa a la purificación, los sacáridos capsulares de la presente invención se pueden obtener mediante síntesis total o parcial, por ejemplo la síntesis de Hib se describe en la referencia 140, y la síntesis de MenA en la referencia 141.

Las composiciones de la invención comprenden sacáridos capsulares de por lo menos dos serogrupos de N. meningitidis. Los sacáridos preferiblemente se preparan de manera separada (que incluyen cualquier fragmentación, conjugación, modificación, etc.) y luego se mezclan para dar una composición de la invención.

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En algunas realizaciones, la composición puede incluir antígenos de sacáridos y de polipéptidos de neumococos. Estos se pueden utilizar en mezcla simple, o el antígeno de sacárido neumocócico se puede conjugar a una proteína neumocócica. Las proteínas portadoras adecuadas para dichas realizaciones incluyen los antígenos enumerados en el párrafo previo [168].

Se pueden liofilizar los antígenos de neumococo, por ejemplo junto con antígenos de meningococo y/o Hib.

Conjugación covalente

Los sacáridos capsulares en las composiciones de la invención usualmente se conjugarán a una o varias proteínas portadoras. En general, la conjugación aumenta la inmunogenicidad de los sacáridos ya que los convierte de antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, permitiendo de este modo la entrada para la memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida [por ejemplo revisado en las referencias 169 y 142-150].

Las proteínas portadoras preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoide de difteria o toxoide del tétanos. Se prefiere particularmente el toxoide de difteria CRM197[170-172]. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen la proteína de la membrana externa de N. meningitidis [173], péptidos sintéticos [174, 175], proteínas de choque térmico [176, 177], proteínas de tos ferina [178, 179], citoquinas [180], linfocinas [180], hormonas [180], factores de crecimiento [180], proteínas artificiales que comprenden epítopos de células T CD4+ humanas múltiples, de diversos antígenos derivados de patógenos [181], proteína D de H. influenzae [182, 183], proteína PspA de superficie del neumococo [184], proteínas de captación de hierro [185], toxina A o B de C. difficile [186], etc. Los portadores preferidos son toxoides de la difteria, toxoide del tétanos, proteína D de H. influenzae y CRM197.

Dentro de una composición de la invención, es posible utilizar más de una proteína portadora, por ejemplo para reducir el riesgo de supresión de portador. De este modo, se pueden utilizar diferentes proteínas portadoras para diferentes serogrupos, por ejemplo se pueden conjugar sacáridos del serogrupo A a CRM197, mientras que los sacáridos del serogrupo C se pueden conjugar al toxoide tetánico. También es posible utilizar más de una proteína portadora para un antígeno de sacárido particular, por ejemplo sacáridos del serogrupo A pueden estar en dos grupos, con algunos conjugados a CRM197y otros conjugados al toxoide tetánico. Sin embargo, en general se prefiere utilizar la misma proteína portadora para todos los sacáridos.

Una proteína portadora simple puede llevar más de un antígeno de sacárido [187]. Por ejemplo, una proteína portadora simple puede tener conjugados a esta los sacáridos de los serogrupos A y C. Para lograr esta meta, los sacáridos pueden ser mezclados antes de la reacción de conjugación. Sin embargo, en general se prefiere tener conjugados separados para cada serogrupo.

Se prefieren los conjugados con una relación sacárido: proteína (peso/peso) de entre 1:5 (por ejemplo proteína en exceso) y 5:1 (es decir sacárido en exceso). Se prefieren las relaciones entre 1:2 y 5:1 son las preferidas, y son más preferidas las relaciones entre 1:1,25 y 1:2,5. Se puede preferir la proteína portadora en exceso para MenA y MenC.

Los conjugados se pueden utilizar en conjunto con la proteína portadora libre [188]. Cuando una proteína portadora dada está presente en forma libre y conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada es preferiblemente no mayor de 5% de la cantidad total de la proteína portadora en la composición como un todo, y más preferiblemente a menos de 2% en peso.

Cualquier reacción de conjugación adecuada se puede utilizar, con cualquier ligador adecuado, cuando sea necesario. El sacárido será normalmente activado o funcionalizado antes de la conjugación. La activación puede involucrar, por ejemplo, reactivos de cianilación tales como CDAP (por ejemplo tetrafluoroborato de 1-ciano-4dimetilamino-piridinio [189, 190, etc.]). Otras técnicas adecuadas utilizan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU; véase también la introducción a la referencia 148).

Los enlaces a través de un grupo ligador pueden ser realizados utilizando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 191 y 192. Un tipo de enlace involucra la aminación reductora del polisacárido, el acoplamiento del grupo amino resultante con un extremo de un grupo ligador de ácido adípico, y luego acoplar una proteína al otro extremo del grupo ligador de ácido adípico [146, 193, 194]. Otros ligadores incluyen B-propionamido [195], nitrofenil-etilamina [196], haluros de haloacilo [197], enlaces glucosídicos [198], ácido 6-aminocaproico [199], ADH [200], unidades estructurales de C4 a 12 [201], etc. Como una alternativa a utilizar un ligador, se puede utilizar un enlace directo. Los enlaces directos a la proteína pueden comprender la oxidación del polisacárido, seguido por la aminación reductora con la proteína, como se describe en, por ejemplo, las referencias 202 y 203.

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Se prefiere un procedimiento que involucra la introducción de grupos amino dentro del sacárido (por ejemplo al reemplazar los grupos =O terminales con -NH2) seguido por derivación con un diéster adípico (por ejemplo el diéster de N-hidroxisuccinimido del ácido adípico) y reacción con la proteína portadora. Otra reacción preferida utiliza la activación de CDAP con un portador de proteína D por ejemplo para MenA y MenC.

Después de la conjugación, se pueden separar los sacáridos libres y conjugados. Pueden existir muchos métodos adecuados, que incluyen cromatografía hidrófoba, ultrafiltración tangencial, diafiltración etc. [véase también las referencias 204 y 205, etc.].

Cuando la composición de la invención incluye un oligosacárido conjugado, se prefiere que la preparación del oligosacárido preceda a la conjugación.

Antígenos de polipéptidos del serogrupo B adicionales y alternativos

La invención proporciona una composición como se define en las reivindicaciones, la cual, después de administración a un sujeto, es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo en ese sujeto, en donde la respuesta de anticuerpo es bactericida contra dos o tres de los linajes hipervirulentos A4, ET-5 y el linaje 3 de serogrupo B de N. meningitidis.

Aunque NadA, 741, 936, 953 y 287 son antígenos preferidos para lograr esta amplia protección, otros antígenos de polipéptidos MenB que se pueden incluir en las composiciones de la invención (en combinación con los cinco antígenos básicos que se definen en las reivindicaciones) incluyen aquellos que comprenden una de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO:650 de la referencia 8; SEQ ID NO:878 de la referencia 8; SEQ ID NO:884 de la referencia 8; SEQ ID NO:4 de la referencia 9; SEQ ID NO:598 de la referencia 10; SEQ ID NO:818 de la referencia 10; SEQ ID NO:864 de la referencia 10; SEQ ID NO:866 de la referencia 10; SEQ ID NO:1196 de la referencia 10; SEQ ID NO:1272 de la referencia 10; SEQ ID NO:1274 de la referencia 10; SEQ ID NO:1640 de la referencia 10; SEQ ID NO:1788 de la referencia 10; SEQ ID NO:2288 de la referencia 10; SEQ ID NO:2466 de la referencia 10; SEQ ID NO:2554 de la referencia 10; SEQ ID NO:2576 de la referencia 10; SEQ ID NO:2606 de la referencia 10; SEQ ID NO:2608 de la referencia 10; SEQ ID NO:2616 de la referencia 10; SEQ ID NO:2668 de la referencia 10; SEQ ID NO:2780 de la referencia 10; SEQ ID NO:2932 de la referencia 10; SEQ ID NO:2958 de la referencia 10; SEQ ID NO:2970 de la referencia 10; SEQ ID NO:2988 de la referencia 10, o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que : (a) tiene 50% o más de identidad (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) con dichas secuencias; y/o (b) comprende un fragmento de por lo menos n aminoácidos consecutivos de dichas secuencias, en el que n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos para (b) comprenden un epítopo de la secuencia relevante. Se puede incluir más de uno (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6) de estos polipéptidos.

General

El término "que comprende" significa "que incluye" así como "que consiste" por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y.

El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x significa, por ejemplo, x±10%.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, se puede omitir la palabra “sustancialmente" de la definición de la invención.

Las referencias a una identidad de secuencia porcentual entre dos secuencias de aminoácidos significan que, cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos es el mismo en comparación con las dos secuencias. Este alineamiento y la homología porcentual o la identidad de secuencia se pueden determinar utilizando los programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo aquellos descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 206. Un alineamiento preferido se determina por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman utilizando una búsqueda de espacios afines con una penalidad de espacio abierto de 12 y una penalidad por extensión de espacio de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se muestra en la referencia 207.

El término "alquilo" se refiere a los grupos alquilo en las formas lineal o ramificada. El grupo alquilo se puede interrumpir con 1, 2 o 3 heteroátomos seleccionados de O-, -NH-o -S-. El grupo alquilo también se puede interrumpir por 1, 2 o 3 dobles y/o triples enlaces. Sin embargo, el término "alquilo" usualmente se refiere a grupos alquilo que no tienen interrupciones de heteroátomo o interrupciones de doble o triple enlace. Cuando se hace referencia a alquilo C1-12, se entiende que el grupo alquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 1 y 12 (por ejemplo C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12). Similarmente, cuando se hace referencia a alquilo C1-6, se

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entiende que el grupo alquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 1 y 6 (por ejemplo C1, C2, C3, C4, C5, C6).

El término “cicloalquilo" incluye los grupos cicloalquilo, policicloalquilo y cicloalquenilo, así como las combinaciones de estos con grupos alquilo, tales como los grupos cicloalquilalquilo. El grupo cicloalquilo se puede interrumpir con 1, 2 o 3 heteroátomos, seleccionados de -O-, -NH-o -S-. Sin embargo, el término "cicloalquilo" usualmente se refiere a los grupos cicloalquilo que no tienen interrupciones de heteroátomos. Ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, ciclohexilmetilo y adamantilo. Cuando se hace referencia a cicloalquilo C3-12, se entiende que el grupo cicloalquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 3 y 12 (por ejemplo C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12).

El término "arilo" se refiere a un grupo aromático, tal como fenilo o naftilo. Cuando se hace referencia al arilo C5-12, se entiende que el grupo arilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 5 y 12 (por ejemplo C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12).

El término "arilo C5-12-alquilo C1-6" se refiere a los grupos tales como bencilo, feniletilo y naftilmetilo.

Los grupos protectores de nitrógeno incluyen grupos sililo (tales como TMS, TES, TBS, TIPS), derivados de acilo (tales como ftalimidas, trifluoroacetamidas, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo (Boc), benciloxicarbonilo (Z o Cbz), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), 2-(trimetilsilil)etoxicarbonilo, 2,2,2tricloroetoxicarbonilo (Troc)), derivados de sulfonilo (tales como β-trimetilsililetansuafonilo (SES)), derivados de sulfenilo, alquilo C1-12, bencilo, benzhidrilo, tritilo, 9-fenilfluorenilo, etc. Un grupo protector de nitrógeno preferido, es Fmoc.

Las secuencias incluidas para facilitar la clonación o purificación, etc., no necesariamente contribuyen a la invención y se pueden omitir o eliminar.

Se apreciará que los anillos de azúcar puedan existir en la forma abierta y cerrada y que, mientras que se muestran las formas cerradas en las fórmulas estructurales aquí, las formas abiertas también son abarcadas por la invención.

Modos de llevar a cabo la invención

Proteína híbrida ΔG287-953

El ADN que codifica la proteína 287 de la cepa 394/98 del serogrupo B de meningococo, y la proteína 953 de la cepa 2996 del serogrupo B de meningococo, se digirieron y ligaron, junto con una secuencia ligadora corta, para dar un plásmido que codifica una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7. El plásmido se transfectó dentro de E. coli y las bacterias se desarrollaron para expresar la proteína.

Después del crecimiento adecuado, las bacterias se cosecharon y se purificó la proteína. A partir del cultivo, las bacterias se centrifugaron y el sedimento se homogenizó en presencia de regulador de acetato 50 mM (pH 5) con una relación en volumen de sedimento: regulador de 1:8. La lisis se realizó utilizando un homogeneizador de alta presión (AVESTIN, 4 ciclos a 1400 psi). Después de lisis, se agregó urea a una concentración final de 5 M, seguido por agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. El pH se redujo de 6 a 5 utilizando regulador de acetato 200 mM (pH 4) + urea 5 M. La mezcla se centrifugó a 16800 g durante 60 minutos a 2-8º C. El sobrenadante se recolectó y se filtró por SARTOBRAN P (0,45-0,22 μm SARTORIUS).

La proteína en el sobrenadante filtrado se estableció durante ≥ 30 días a -20º C y durante ≤ 15 días a 2-8º C.

La proteína adicionalmente se purificó sobre una columna de intercambio catiónico (SPFF, Amersham Biosciences) con elución utilizando NaCl 350 mM + acetato 50 mM + urea 5 M pH 5,00. La mayoría de las impurezas estuvieron presentes en el flujo continuo. Un lavado de preelución utilizando una menor concentración de NaCl (180 mM) eliminó ventajosamente dos proteínas de E. coli contaminantes.

El material eluido se ajustó a pH 8 (utilizando TRIS 200 mM/HCl + urea 5 M, pH 9) y posteriormente se purificó sobre una columna Q Sepharose HP (Amersham) con elución utilizando NaCl 150 mM + TRIS 20 mM/HCl pH 8,00 en urea 5 M. Nuevamente, un lavado de preelución con sal reducida (90 mM) fue útil para eliminar las impurezas.

El material eluido y filtrado de la columna de Q HP se diluyó 1:2 utilizando PBS pH 7,00 (NaCl 150 mM + fosfato de potasio 10 mM, pH 7,00) y luego se diafiltró contra 10 volúmenes de PBS pH 7,00 mediante ultrafiltración tangencial. Al final de la diafiltración el material se concentró 1,6 veces hasta aproximadamente 1,2 mg/ml de proteínas totales. Utilizando una membrana de corte de 30.000 Da (membrana de celulosa regenerada de 50 cm2, Millipore PLCTK 30) fue posible dializar el material con un rendimiento de aproximadamente 90%.

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(f)

OMVs preparados a partir de la cepa 394/98 (Nueva Zelanda)

(g)

Una mezcla de ΔG287 y (e)

(h)

Una mezcla de (d) y (e)

(i)

Una mezcla de (d) y (f) Se utilizó SEAM-3 como un control positivo. Los resultados fueron como sigue, expresados como el porcentaje de cepas en el linaje hipervirulento indicado

donde el título bactericida en suero excedió 1024:

# Cepas

(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) S-3

A4

4 50 50 0 100 25 25 25 100 100 +

ET-5

8 25 75 88 100 71 14 71 100 100 +

Linaje 3

13 0 75 15 93 8 85 8 92 93 +

ET-37

4 11 22 0 33 0 0 0 22 25 +

Contra cepas de referencia particular, los títulos bactericidas fueron como sigue:

Cepa

(a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) S-3

A4

961-5945 128 2048 <8 2048 262144 8192 262144 262144 4096 8192

ET-5

44/76 <4 2048 32768 131072 524288 8192 524288 524288 524288 16384

Linaje 3

394/98 <4 1024 32 4096 <4 16384 256 16384 16384 16384

ET-37

LPN17592 2048 1024 256 4096 <8 <8 512 16384 65536 1024

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Por lo tanto, LAS composiciones (d), (h) e (i) inducen respuestas de anticuerpo bactericidas contra una amplia variedad de cepas del serogrupo B de meningococo dentro de linajes hipervirulentos A4, ET-5 y el linaje 3. Los títulos utilizando las composiciones (h) e (i) fueron en general más altos que con (d), pero la cobertura de las cepas dentro de los linajes hipervirulentos A4, ET-5 y linaje 3 no fueron mejores.

15 La cobertura de las cepas no tipificadas también fue alta con las composiciones (d), (h) e (i).

Análisis del dominio N terminal de NadA

Se sabe que la proteína NadA de N. meningitidis, purificada, se une a células epiteliales humanas [17] (por ejemplo células Chang, células HeLa, células Hep-2), y E. coli recombinante que expresa NadA muestra un fenotipo adherente [181. Estas E. coli son capaces de invadir las células epiteliales, y se pueden detectar las E. coli NadA+ve

20 en células Chang mediante inmunofluorescencia (después de permeabilización de membrana) y mediante microscopia electrónica. De este modo, se considera que el NadA funciona como una adhesina y una invasina para células epiteliales.

Con base en el análisis de la estructura secundaria, la NadA madura se ha subdividido en tres dominios putativos: un dominio globular N terminal (aa 24-87), una región interna de α-hélice (aa 88-350) con alta propensión al

25 enrollamiento, y un ancla de membrana C terminal (aa 351-405). Se investigó la función del dominio globular N terminal en la interacción de célula anfitriona.

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Un gen nadA truncado que codifica una proteína desprovista de los aminoácidos 30-87 se clonó dentro del vector pET-21 (PET-NadAΔ30-87) y se expresó en la cepa de E. coli BL21 (DE3). Los aminoácidos 24-29 fueron retenidos para permitir el procesamiento del péptido líder y la maduración correcta de la proteína. El análisis de transferencia de Western y de FACS confirmó que NadAΔ30-87 se expresó y formó oligómeros sobre la superficie de las células de E. coli, es decir la supresión del dominio N terminal no interfiere con la expresión, exportación y localización de la membrana de NadA. Sin embargo, la cepa de E. coli recombinante perdió completamente la capacidad para adherirse a las células epiteliales Chang. El dominio N terminal está implicado de este modo en la actividad de la adhesina.

Para investigar adicionalmente cual parte del dominio N terminal esta involucrada en la interacción, la región fue adicionalmente dividida en tres subdominios putativos: los aminoácidos 24-42, que contienen una región de α-hélice predicha con residuos hidrófobos; los aminoácidos 43-70, la parte interna sin una estructura secundaria definida, predicha; y los aminoácidos 71-87 que contienen otra estructura de α-hélice predicha. Las tres construcciones, cada una que codifica una proteína suprimida de un subdominio simple, se generaron y luego se introdujo dentro de E. coli BL21(DE3), obteniendo la siguiente cepa: BL21(DE3)/pET-NadAΔ24-42, BL21(DE3)/pET-NadAΔ43-70 y BL21(DE3)/pET-NadAΔ71-87 La localización superficial de los oligómeros se confirmó por transferencia de Western y análisis de FACS, pero la adhesión a las células epiteliales Chang no fue mejor que la cepa de control de E. coli BL21(DE3)/pET. Estos resultados, confirmados también utilizando el análisis de microscopia de inmunofluorescencia, indican que el dominio N terminal globular completo de NadA, es importante en la interacción con células humanas.

Combinación con conjugados meningocócicos y/o Hib

La composición de MenB triple se combina con una mezcla de conjugados de oligosacáridos para los serogrupos C, W135 e Y, para dar una vacuna que contiene los siguientes antígenos:

Componente

Cantidad por 0,5 ml de dosis

Conjugado de serogrupo C

10 μg de sacárido + 12,5-25 μg de CRM197

Conjugado de serogrupo W135

10 μg de sacárido + 6,6-20 μg de CRM197

Conjugado de serogrupo Y

10 μg de sacárido + 6,6-20 μg de CRM197

ΔG287-953

20 μg de polipéptido

936-ΔG741

20 μg de polipéptido

NadA

20 μg de polipéptido

Se prepara una vacuna similar, que incluye el conjugado de MenA (10 μg de sacárido + 12,5-33 μg de CRMlg7) y/o un conjugado HbOC Hib (10 μg del sacárido + 2-5 μg de CRM197)

Uso del sacárido MenA modificado

El polisacárido capsular se purificó de MenA y se hidrolizó para dar el oligosacárido MenA. Se hidrolizaron 2 g del polisacárido a 50º C en regulador de acetato de sodio 50 mM, pH 4,75, a una concentración de polisacárido de 10 mg/mL durante aproximadamente 4 horas [135]. Después de hidrólisis, la solución se secó mediante evaporación rotatoria.

El oligosacárido se activó utilizando el siguiente Esquema de Reacción:

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El oligosacárido se disolvió en DMSO para dar una concentración de sacárido de 10 mg/mL. De acuerdo con una relación molar del oligosacárido: CDI es 1:20, 21,262 g de CDI luego se agregaron y la mezcla de reacción se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. El compuesto MenA-CDI resultante fue purificado mediante precipitación

5 selectiva en una mezcla de acetona:DMSO 80:20 (v/v) seguido por centrifugación. La eficiencia de la reacción de activación se calculó como de aproximadamente 67,9% al determinar la relación del imidazol libre con el imidazol unido.

En la segunda etapa de reacción, el oligosacárido MenA-CDI se utilizó en DMSO a una concentración de sacárido de aproximadamente 10 mg/mL. De acuerdo con una relación molar de la unidad MenA-CD1:DMA es de 1:100, se

10 agregaron 36,288 g de clorhidrato de dimetilamina al 99% (es decir R1 y R2 = Me) y la mezcla de reacción se agitó por 16 horas a temperatura ambiente. El producto de reacción se liofilizó y resolubiliz en 10 mg/mL de solución acuosa.

Para eliminar el agente de reacción de bajo peso molecular (en particular la dimetilamina (DMA)) de la preparación de oligosacárido, se realizó una etapa de diálisis a través de una membrana MWCO de 3.5 kDa (Spectra/por™.) Se

15 llevaron a cabo cuatro etapas de diálisis: (i) 16 horas contra 2 L de cloruro de sodio 1 M (factor de diálisis 1:20), (ii) 16 horas contra 2 litros de cloruro de sodio 0,5 M (factor de diálisis 1,20), (iii) y (iv) 16 horas contra 2 litros de WFI (factor de diálisis 1:20). Para mejorar la purificación también se realizó una etapa de diafiltración a través de una membrana MWCO de 1 kDa (Centricon™).

El producto Mes-CDI-DMA. Se regulo a pH 6,5 en L-histidina 25 mM (Fluka™).

20 Para preparar los conjugados del sacárido MenA modificado (MenA-CDI-DMA), el procedimiento completo fue como sigue:

-hidrólisis del polisacárido para dar fragmentos de oligosacáridos

-clasificación por tamaño de los fragmentos oligosacáridos

-aminación reductora de los grupos aldehído terminales sobre los oligosacáridos clasificados por tamaño

25 -protección de los grupos –NH2 terminales por el grupo Fmoc antes de la reacción de CDI

-desprotección intrínseca de los grupos -NH2 durante la reacción de DMA

-activación de los grupos -NH2 terminales por SIDEA (ácido N-hidroxisuccinimido-adípico)

-unión covalente a la proteína CRM197

El conjugado del oligosacárido MenA modificado es mucho más resistente a la hidrólisis que su contraparte natural a 30 temperaturas elevadas. Después de 28 días a 37º C, por ejemplo, el porcentaje de sacárido liberado es de 6 -4%

para el oligosacárido modificado versus 23,5% para el antígeno natural. Más aún, los títulos inducidos por los oligosacáridos modificados no son significativamente menores que aquellos obtenidos utilizando las estructuras de azúcar nativas.

El conjugado de MenA modificado se combina con los conjugados de MenC, MenW135 y MenY como un sustituto 5 para el conjugado del oligosacárido no modificado. Esta mezcla tetravalente se combina con los tres polipéptidos MenB para dar una vacuna efectiva contra los serogrupos A, B, C, W135 e Y de N. meningitidis en una dosis simple.

Combinaciones de neumococos

Las tres proteínas MenB combinadas se mezclan con los conjugados del sacárido neumocócico para dar una concentración final de 2 μg/dosis de cada uno de los serotipos neumocócicos (doble para el serotipo 6B). La vacuna 10 reconstituida contiene de este modo los siguientes antígenos:

Componente

Cantidad por 0.5 ml de dosis

Conjugado de serogrupo A

5 µg de sacárido + 6,25-16,5 mg CRM197

Conjugado de serogrupo C

5 µg de sacárido + 6,25-12,5 mg CRM197

Conjugado de serogrupo W135

5 µg de sacárido + 3,3-10 mg CRM197

Conjugado de serogrupo Y

5 µg de sacárido + 3,3-10 mg CRM197

Conjugado de serotipo de neumococo 4

2 µg de sacárido + 2,5 mg CRM197

Conjugado de serotipo de neumococo 9V

2 µg de sacárido + 2,5 mg CRM197

Conjugado de serotipo de neumococo 14

2 µg de sacárido + 2,5 mg CRM197

Conjugado de serotipo de neumococo 18C

2 µg de sacárido + 2,5 mg CRM197

Conjugado de serotipo de neumococo 19F

2 µg de sacárido + 2,5 mg CRM197

Conjugado de serotipo de neumococo 23F

2 µg de sacárido + 2,5 mg CRM197

Conjugado de serotipo de neumococo 6B

4 µg de sacárido + 5 mg CRM197

Se entenderá que se ha descrito la invención solo a modo de ejemplo y se pueden realizar modificaciones mientras que permanezcan dentro del alcance de las reivindicaciones.

REFERENCIAS

15 1] Maiden et al. (1998) PNAS USA 95:3140-3145.

[2] Armand et al. (1982) J. Biol. Stand. 10:335-339.

[3] Cadoz et al. (1985) Vaccine 3:340-342.

[4] Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775):1093-96

[5] Parkhill et al. (2000) Nature 404:502-506. 20 [6] Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815.

[7] WO00/66791.

[8] WO99/24578.

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Claims (1)

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