MXPA05003863A - Vacunas polipeptidicas para amplia proteccion contra lineas hipervirulentas de meningococos. - Google Patents

Abstract

Un numero pequeno de antigenos definidos pueden proporcionar proteccion amplia contra la infeccion por meningococos, y la invencion proporciona una composicion la cual, despues de la administracion a un sujeto, es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo en ese sujeto, en donde la respuesta de anticuerpo es bactericida contra dos o tres de las lineas hipervirulentas A4, ET-5 y la linea 3 de N. meningitidis serogrupo B. En vez de consistir de un antigeno unico, la composicion comprende una mezcla de 10o menos antigenos purificados, y no debe incluir mezclas complejas o indefinidas de antigenos tales como las vesiculas de la membrana externa. Son utilizados cinco antigenos proteicos en particular: (1) una proteina "NadA"; (2) una proteina "741"; (3) una proteina "936"; (4) una proteina "953"; y (5) una proteina "287".

Description

VACUNAS POLIPEPTIDICAS PARA AMPLIA PROTECCION CONTRA LINEAS HIPERVIRULENTAS DE MENINGOCOCOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención está en los campos de la inmunología y la vacunologia. En particular, ésta se refiere a los antígenos de Neisseria meningitidis (meningococos) y a su uso en inmunización.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION N. meningitidis es un patógeno humano Gram-negativo no móvil, que coloniza la faringe y que provoca la meningitis (y, ocasionalmente, septicemia en ausencia de meningitis) . Este provoca enfermedad endémica y epidémica. Después de la introducción de la vacuna conjugada contra Haemophilus influenzae, N. meningitidis es la causa principal de meningitis bacteriana en los Estados Unidos. Con base en el polisacárido capsular del organismo, han sido identificados diversos serogrupos de N. meningitidis. El serogrupo A es el patógeno más frecuentemente implicado en la enfermedad epidémica en África sub-Sahara. Los serogrupos B y C son responsables de la gran mayoría de casos en los Estados Unidos y en la mayoría de los REF: 163382 países desarrollados. Los serogrupos W135 e Y son responsables del resto de los casos en los Estados Unidos y en los países desarrollados. Después del serogrupo, la clasificación incluye serotipo, serosubtipo y luego inmunotipo, y la nomenclatura estándar lista el serogrupo, serotipo, serosubtipo, e inmunotipo, cada uno separado por "dos puntos y seguido" por ejemplo, B : 4 : Pl .15 :L3 , 7 , 9. Dentro del serogrupo B, algunas líneas provocan enfermedad frecuentemente (hiperinvasoras) , algunas líneas provocan formas más severas de la enfermedad que otras (hipervirulentas) y otras raramente provocan del todo la enfermedad. Son reconocidas varias líneas hipervirulentas, a saber los subgrupos I, III y IV-1, el complejo ET-5, el complejo ET-37, un grupo A4 y la línea 3. Estos han sido definidos por electroforesis enzimática multilocus ( LEE) , pero la tipificación secuencial por multilocus (MLST) ha sido también utilizada para clasificar meningococus [ref . 1] . Una vacuna polisacárida contra los serogrupos ?, C, W135 e Y ha sido conocida por muchos años [2, 3] pero una vacuna contra el serogrupo B ha probado ser elusiva. Las vacunas basadas en las vesículas de la membrana exterior han sido probadas [por ejemplo ver la ref. 4], pero la protección proporcionada por estas vacunas está típicamente restringida a la cepa utilizada para elaborar la vacuna. Sigue existiendo una necesidad, por lo tanto, para una vacuna del serogrupo B ampliamente efectiva. Las secuencias genómicas para los serogrupos A [5] y B [6, 7] de los meningococos han sido reportadas, y la secuencia del serogrupo B ha sido estudiada para identificar antígenos de vacuna [por ejemplo refs. 8 a 13] . Los antígenos candidatos han sido manipulados para mejorar la expresión heteróloga [refs. 14 a 16] . Un objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones adicionales y mejoradas para proporcionar inmunidad contra la enfermedad y/o la infección por meningococos, y en particular para proporcionar amplia inmunidad contra meningococos del serogrupo B .

DESCRIPCION DE LA INVENCION Las vacunas contra patógenos, tales como el virus de la hepatitis B, difteria y tétanos típicamente contienen un antígeno proteico simple (por ejemplo, el antígeno de la superficie del HBV, o un toxoide tetánico) . En contraste, las vacunas acelulares contra la tos ferina típicamente contienen al menos tres proteínas de B. pertussis y la vacuna neumocócica Prevenarffi contiene siete antígenos sacáridos conjugados, separados. Otras vacunas tales como las vacunas celulares de pertussis, la vacuna contra el sarampión, la vacuna inactivada contra la polio (IPV) y las vacunas OMV meningocócicas son por su naturaleza, mezclas complejas de un gran número de antlgenos . Si la protección puede ser promovida por un antígeno simple, un número pequeño de antlgenos definidos, o una mezcla compleja de antlgenos no definidos, esto depende por lo tanto del patógeno en cuestión. La invención está basada en el descubrimiento de que un pequeño número de antlgenos definidos es capaz de proporcionar protección amplia contra la infección por meningococos , y la invención proporciona una composición la cual, después de la administración a un sujeto, es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo en ese sujeto, en donde la respuesta de anticuerpo es bactericida contra dos o más (por ejemplo 2 ó 3) de las líneas hipervirulentas A4 , ET-5 y la línea 3 de N. meningitidis serogrupo B. En vez de consistir de un antígeno simple, se prefiere que la composición de la invención comprenda una mezcla de 10 o menos (por ejemplo, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) antlgenos purificados, y se prefiere particularmente que la composición no deba incluir mezclas complejas o indefinidas de antlgenos, por ejemplo, se prefiere no incluir vesículas de la membrana externa en la composición. Para meningococos serogrupo B, se ha encontrado que una mezcla de cinco antlgenos proteicos definidos promueve una buena respuesta inmune protectora. La invención proporciona de este modo una composición que comprende los siguientes cinco antigenos proteicos de meningococos: (1) una proteína "NadA"; (2) una proteína "741"; (3) una proteína "936"; (4) una proteína "953"; y (5) una proteína "287". Estos antígenos son denominados en la presente como los "cinco antígenos básicos" .

Proteína NadA "NadA" (adhesina Neiseriana A) del serogrupo B de N. meningitidis es descrita como proteína "961" en la referencia 10 (SEQ ID NOs : 2943 y 2944) y como "NMB1994" en la referencia 6 (ver también GenBank números de acceso: 11352904 y 7227256) . Una descripción detallada de la proteína puede ser encontrada en la referencia 17. No existe proteína correspondiente en el serogrupo A [5, 17] . Cuando se utiliza de acuerdo a la presente invención, NadA puede tomar diversas formas. Las formas preferidas de NadA son las variantes de truncamiento o supresión, tales como aquellas descritas en las referencias 14 a 16. En particular, NadA sin su ancla membranal C-terminal es preferida (por ejemplo supresión de los residuos 351-405 para la cepa 2996 [SEQ ID NO: 1], la cual es algunas veces distinguida en la presente por el uso de un supraíndice "C", por ejemplo NaDa(c> . La expresión de NadA sin su dominio de ancla membranal (por ejemplo SEQ ID NO: 1) en E. coli da como resultado la secreción de la proteína hacia el sobrenadante de cultivo con la eliminación concomitante de su péptido guía 23mer (por ejemplo para dejar un 327mer para la cepa 2996 [SEQ ID NO: 2] . Los polipéptidos sin sus péptidos guía son algunas veces distinguidos en la presente por el uso del supraíndice "NL" , por ejemplo NadA(NL) o NadA(c) (NL) . Las secuencias de NadA preferidas tienen 50% o más de identidad (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a la SEQ ID NO: 2. Esta incluye variantes de NadA (por ejemplo variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.). Las formas alélicas de NadA son mostradas en la Figura 9 de la referencia 18. Otras secuencias preferidas de NadA comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1, en donde n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos comprenden un epitopo de NadA. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o el extremo N de la SEQ ID NO: 1 (por ejemplo NadA(c), NadA(NL), NadAíc) (NL) ) . Donde los residuos del extremo N están suprimidos, se prefiere que la supresión no debe eliminar la habilidad de NadA para adherirse a las células epiteliales humanas. Un fragmento preferido de la SEQ ID NO: 1 es la SEQ ID NO : 2.

NadA secretada puede ser convenientemente preparada en forma altamente pura a partir del sobrenadante del cultivo mediante un proceso que comprende los pasos de: la concentración y la diafiltración contra un amortiguador mediante ultrafiltración; cromatografía de columna aniónica; cromatografía de columna hidrofóbica; cromatografía en columna de cerámica de hidroxilapatita; diafiltración contra un amortiguador; y esterilización por filtración. Los detalles adicionales del proceso se dan en los ejemplos. NadA es preferentemente utilizada en una forma oligomérica (por ejemplo en forma trimérica) .

Proteína 741 La proteína "741" del serogrupo B es descrita en la referencia 10 (SEQ ID NOs : 2535 y 2536) y como "NB B1870" en la referencia 6 (ver también GenBank acceso número GI -.7227128). La proteína correspondiente en el serogrupo A [5] tiene GenBank número de acceso 7379322. 741 es naturalmente una lipoproteína . Cuando se utiliza de acuerdo a la presente invención, la proteína 741 puede tomar varias formas. Las formas preferidas de 741 son las variantes de truncamiento o de supresión, tales como aquellas descritas en las referencias 14 a 16. En particular, el extremo N de 741 puede ser suprimido hasta e incluyendo su secuencia de poliglicina (por ejemplo supresión de los residuos 1 a 72 para la cepa MC58 [SEQ ID NO: 3] ) , que es algunas veces distinguida en la presente por el uso de un prefijo "?T" . Esta supresión puede aumentar la expresión. La supresión también elimina el sitio de lipidacion de 741. Las secuencias 741 preferidas tienen 50% o más de identidad (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a la SEQ ID NO: 3. Esta incluye las variantes de 741 (por ejemplo variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc.) . Las formas alélicas de 741 pueden ser encontradas en las SEQ ID NOs : 1 a 22 de la referencia 16, y en la SEQ ID NO: 1 a 23 de la referencia 19. Las SEQ ID NOs : 1-299 de la referencia 20 dan las secuencias adicionales de 741. Otras secuencias preferidas de 741 comprenden al menos los n aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO : 3, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos comprenden un epitopo de 741. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o el extremo N de la SEQ ID NO: 3. La proteina 741 es un antigeno extremadamente efectivo para promover respuestas de anticuerpo anti-meningococos , y es expresada a través de todos los serogrupos meningocócicos . El análisis filogenético muestra que la proteina se divide en dos grupos, y que uno de estos grupos se divide nuevamente para dar tres variantes en total [21] , y mientras el suero producido contra una variante dada es bactericida dentro del mismo grupo variante, éste no es activo contra las cepas que expresan una de las otras dos variantes, por ejemplo, existe protección cruzada intra-variante, pero no protección cruzada inter-variantes . Para la eficiencia máxima de cepa cruzada, por lo tanto, se prefiere que una composición deba incluir más de una variante de la proteína 741. Una secuencia ejemplar proveniente de cada variante se da en la SEQ ID NO: 10, 11, y 12 en la presente, comenzando con un residuo de cisterna N-terminal al cual puede ser covalentemente enlazado un lípido en la forma de lipoproteína de 741. Se prefiere por lo tanto que la composición deba incluir al menos dos de: (1) una primera proteína, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos a.% de identidad secuencia a la SEQ ID NO: 10 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 10; (2) una segunda proteina, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos bf- de identidad secuencial a la SEQ ID NO: 11, y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 11; y (3) una tercera proteína, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos c de identidad secuencial a la SEQ ID NO: 12 y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 12. El valor de a es al menos 85, por ejemplo 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5 o más. El valor de b es al menos 85 por ejemplo 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5 o más. El valor de c es al menos 85 por ejemplo 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5 o más. Los valores de a, ¿ y e no están intrínsecamente relacionados uno con el otro. El valor de x. es al menos 7 por ejemplo 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . El valor de y es al menos 7 por ejemplo 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . El valor de z es al menos 7 por ejemplo 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) . Los valores de x, y y z no están intrínsecamente relacionados uno con el otro .

Se prefiere que cualquier secuencia dada de aminoácidos de 741 no caerá dentro de más de una de las categorías (1) , (2) y (3) . Cualquier secuencia de 741 dada caerá de este modo únicamente dentro de una de las categorías (1), (2) y (3) . Se prefiere de este modo que: la proteína (1) tenga menos de i% de identidad secuencial a la proteína (2) ; la proteína (1) tenga menos de j% de identidad secuencial a proteína (3) ; y la proteína (2) tenga menos de k% de identidad secuencial a la proteína (3) . El valor de i es 60 o más (por ejemplo 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, etc.) y es a lo más a. El valor de j es 60 o más (por ejemplo 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, etc.) y es a lo más b. El valor de k es 60 o más (por ejemplo 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, etc.) y es a lo más c. Los valores de i, j y k no están intrínsecamente relacionadas uno con el otro.

Proteína. 936 La proteína "936" del serogrupo B es descrita en la referencia 10 (SEQ ID NOs : 2883 y 2884) y como "NMB2091" en la referencia 6 (ver también GenBank acceso número GI: 7227353) . El gen correspondiente en el serogrupo A [5] tiene el número de acceso de GenBank 7379093. Cuando se utiliza de acuerdo a la presente invención, la proteína 936 puede tomar diversas formas. Las formas preferidas de 936 son las variantes de truncamiento o de supresión, tales como aquellas descritas en las referencias 14 a 16. En particular, el péptido guía del extremo N de 936 puede ser suprimido (por ejemplo, la supresión de los residuos 1 al 23 para la cepa MC58 [SEQ ID NO: 4]) para dar 936(WL). Las secuencias preferidas de 936 tienen 50% o más de identidad (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a la SEQ ID NO: 4. Esta incluye las variantes (por ejemplo variantes alélicas, homologas, ortólogas, parálogas, imitantes, etc.) . Otras secuencias 936 preferidas comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 4, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos que comprenden un epitopo de 936. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o del extremo N de la SEQ ID NO: 4.

Proteína 953 La protelna "953" del serogrupo B es descrita en la referencia 10 (SEQ ID NOs : 2917 y 2918) y como "NMB1030" en la referencia 6 (ver también GenBank acceso número GI:7226269). El gen correspondiente en el serogrupo A [5] tiene el número de acceso de GenBank 7380108. Cuando se utiliza de acuerdo a la presente invención, la proteína 953 puede tomar diversas formas. Las formas preferidas de 953 son las variantes de truncamiento o de supresión, tales como aquellas descritas en las referencias 14 a 16. En particular, el péptido guía del extremo N de 953 puede ser suprimido (por ejemplo, la supresión de los residuos 1 al 19 para la cepa MC58 [SEQ ID NO: 5]) para dar 953(NL). Las secuencias 953 preferidas tienen 50% o más de identidad (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a la SEQ ID NO: 5. Esta incluye las variantes de 953 (por ejemplo variantes alélicas, homologas, ortólogas, parálogas, imitantes, etc.). Las formas alélicas de 953 pueden ser observadas en la Figura 19 de la referencia 12. Otras secuencias preferidas de 953 comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 5, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos comprenden un epitopo de 953. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o del extremo N de la SEQ ID NO : 5.

Profceína 287 La proteína "287" del serogrupo B es descrita en la referencia 10 (SEQ ID NOs : 3103 y 3104) como "NMB2132" en la referencia 6 y como "GNA2132" en la referencia 13 (ver también GenBank acceso número GI ¡7227388). La proteína correspondiente en el serogrupo A [5] tiene el número de acceso de GenBank 7379057. Cuando se utiliza de acuerdo a la presente invención, la proteína 287 puede tomar diversas formas. Las formas preferidas de 287 son las variantes de truncamiento o de supresión, tales como aquellas descritas en las referencias 14 a 16. En particular, el extremo N de 287 puede ser suprimido hasta o incluyendo su secuencia de poliglicina (por ejemplo, la supresión de los residuos 1 al 24 para la cepa MC58 [SEQ ID NO: 6]), que es algunas veces distinguida en la presente para el uso de un prefijo "AG" . Esta supresión puede aumentar la expresión. Las secuencias 287 preferidas tienen 50% o más de identidad (por ejemplo 60&, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a la SEQ ID NO: 6. Esta incluye 287 variantes (por ejemplo alélicas, homologas, ortólogas, parálogas, mutantes, etc.). Las formas alélicas de 287 pueden ser observadas en las Figuras 5 y 15 de la referencia 12, y en el Ejemplo 13 y la Figura 21 de la referencia 10 (SEQ ID NOs : 3179 a 3184) . Otras secuencias 287 preferidas comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos comprenden un epitopo de 287. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o del extremo N de la SEQ ID NO: 6.

Proteínas de fusión Los cinco antígenos pueden estar presentes en la composición como cinco proteínas separadas, pero se prefiere que al menos dos de los antígenos sean expresados como una cadena polipeptídica simple (una proteína "híbrida" [ref. 14 a 16] ) por ejemplo, tal que cinco antígenos forman menos de cinco polipéptidos . Las proteínas híbridas ofrecen dos ventajas principales: primeramente, una proteína que puede ser inestable o pobremente expresada por sí sola puede ser ayudada por la adición de un socio híbrido adecuado que supera el problema; en segundo lugar, la fabricación comercial se simplifica, ya que únicamente necesita ser empleada una expresión y purificación con el fin de producir dos proteínas separadamente útiles.

Una proteína híbrida incluida en una composición de la invención puede comprender dos o más (por ejemplo 2, 3, 4 ó 5) de los cinco antigenos básicos. Los híbridos que consisten de dos de los cinco antígenos básicos, son preferidos . Dentro de la combinación de cinco antígenos básicos, un antígeno puede estar presente en más de una proteína híbrida y/o como una proteína no híbrida. Se prefiere, no obstante, que esté presente un antígeno ya sea como un híbrido o como un no híbrido, pero no como ambos, aunque puede ser útil incluir la proteína 741 como un híbrido y un antígeno no híbrido (preferentemente lipoproteína) , particularmente donde se utilizan más de una variante de 741. Los híbridos de dos antígenos para el uso en la invención comprenden: NadA y 741; NadA y 936; NadA y 953; NadA y 287; 741 y 936; 741 y 953; 741 y 287; 936 y 953; 936 y 287; 953 y 287. Los híbridos preferidos de dos antígenos comprenden: 741 y 936; 953 y 287. Las proteínas híbridas pueden ser representadas por la fórmula NH2-A- [-X-L-] nB-C00H, en donde: X es una secuencia de aminoácidos de uno de los cinco antígenos básicos; L es una secuencia de aminoácidos ligadora, opcional; A es una secuencia de aminoácidos N-terminal, opcional; B es una secuencia de aminoácidos C-terminal, opcional; y n es 2, 3, 4 ó 5.

Si una porción -X- tiene una secuencia de péptido guia en su forma de tipo silvestre, ésta puede ser incluida u omitida en la proteína híbrida. En algunas modalidades, los péptidos guía serán suprimidos, excepto para aquel de la porción -X- localizada en el extremo N de la proteína híbrida, por ejemplo el péptido guía de i será conservado, pero los péptidos guía de X2...Xn serán omitidos. Esto es equivalente a suprimir todos los péptidos guía y utilizar el péptido guía de Xx como la porción -A- . Para cada n casos de [-X-L-] , la secuencia de aminoácidos ligadora -L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n=2 el híbrido puede ser NH2-Xi-Li-X2-L2-COOH, NHa-Xi-Xz-COOH, H2-Xi-Li-X2-COOH, H2-Xi-X2-L2-COOH, etc. La o las secuencias de aminoácidos ligadoras -L- serán típicamente cortas (por ejemplo 20 o menos aminoácidos, por ejemplo 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos comprenden secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación, los ligadores de poliglicina (por ejemplo que comprenden Glyn donde n=2 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) , y marcadores de histidina (por ejemplo Hisn, donde n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) . Otras secuencias de aminoácidos ligadoras, adecuadas, serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. Un ligador útil es GSGGGG (SEQ ID NO: 9) , con el dipéptido Gly-Ser que es formado a partir de un sitio de restricción BairiHI, ayudando de este modo a la clonación y a la manipulación, y el tetrapéptido (Gly)4 que es un ligador de poli-glicina típico. Si Xn+i es una proteína AG y Ln es un ligador de glicina, esto puede ser equivalente a Xn+1 que no es una proteína AG y Ln que está ausente . -A- es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional. Esta será típicamente corta (por ejemplo 40 o menos aminoácidos por ejemplo 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen las secuencias guía para dirigir el tráfico de proteínas, o las secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o la purificación (por ejemplo marcadores de histidina, por ejemplo Hisn donde n=3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) . Otras secuencias de aminoácidos N-terminales adecuadas serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. Si Xx carece de su propia metionina N-terminal, -A- es preferentemente un oligopéptido (por ejemplo con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos) ; que proporciona la metionina N-terminal. -B- es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional. Esta será típicamente corta (por ejemplo 40 o menos aminoácidos por ejemplo 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22/ 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias peptidicas cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo que comprenden marcadores de istidina, por ejemplo Hisn donde n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) , o las secuencias que aumentan la estabilidad de la proteína. Otras secuencias de aminoácidos C-terminales adecuadas serán aparentes para aquellos expertos en la técnica. Lo más preferentemente, n es 2. Dos proteínas preferidas de este tipo son: ?? es un 936 y X2 es un 741; Xi es un 287 y 2 es un 953. Dos proteínas híbridas particularmente preferidas de la invención son como sigue: Estas dos proteínas pueden ser utilizadas en combinación con NadA (particularmente con la SEQ ID NO: 2) . El híbrido 936-AG741 puede ser convenientemente preparado en forma altamente pura a partir de la expresión en E. coli mediante un proceso que comprende los pasos de: la homogeneización; centrifugación; cromatografía de columna catiónica; cromatografía de columna aniónica, cromatografía de columna hidrofóbica; diafiltracion contra un amortiguador; y esterilización por filtración. Los detalles adicionales del proceso se dan en los ejemplos.

Secuencias La invención proporciona un polipeptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NOs : 1 a 8. Esta proporciona también los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con identidad secuencial a una secuencia de aminoácidos, seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1 a 8. Como se describió anteriormente, el grado de identidad secuencial es preferentemente mayor de 50% (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) . La invención también proporciona un polipéptido que comprende un fragmento de una secuencia NadA de N. meningitidis, en donde dicho fragmento conserva la habilidad de NadA para adherirse a las células epiteliales humanas. Los fragmentos que conservan los aminoácidos 24-87 de la NadA de longitud completa, son de este modo preferidos. Los fragmentos preferidos carecen del péptido guía N-terminal de NadA y/o el dominio de ancla membranal C-terminal de NadA. Esta invención no incluye dentro de su alcance ninguno de los fragmentos de NadA descritos en la técnica anterior, por ejemplo en las referencias 6 a 18. Con referencia a NadA de longitud completa [17] , la SEQ ID NO: 1 carece del dominio de ancla membranal, y la SEQ ID NO: 2 carece del péptido guía. La invención también proporciona el ácido nucleico que codifica para tales polipéptidos . Además, la invención proporciona el ácido nucleico que puede hibridarse a este ácido nucleico, preferentemente bajo condiciones de "alta exigencia" (por ejemplo 65°C en un O.lxSSC, solución de SDS al 0.5%) . Los polipéptidos de la invención pueden ser preparados mediante diversos medios (por ejemplo expresión recombinante, purificación a partir del cultivo celular, síntesis química (al menos en parte) , etc) , y en diversas formas (por ejemplo nativos, fusiones, no glucosilados, lipidados, etc.) . Estos son preferentemente preparados en forma sustancialmente pura (por ejemplo sustancialmente libres de otras proteínas de N. meningitidis o de la célula hospedera) . El ácido nucleico de acuerdo a la invención puede ser preparado de muchas maneras (por ejemplo mediante síntesis química (al menos en parte) , a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc, a partir del organismo mismo, etc.) y puede tomar diversas formas (por ejemplo de una sola hebra, de doble hebra, vectores, sondas, etc.) . Estos son preferentemente preparados en forma sustancialmente pura (por ejemplo, sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos de N. menincfitidis o de la célula hospedera) . El término "ácido nucleico" incluye ADN y ARN, y también sus análogos, tales como aquellos que contienen cadenas principales modificadas (por ejemplo, fosforotioatos, etc.), y también ácidos nucleicos peptídicos (???) , etc. La invención incluye el ácido nucleico que comprende las secuencias complementarias a aquellas descritas anteriormente (por ejemplo para fines anti-sentido o de sondeo) . La invención también proporciona un proceso para producir un polipéptido de la invención, que comprende el paso de cultivar una célula hospedera transformada con el ácido nucleico de la invención, bajo condiciones que inducen la expresión del polipéptido. La invención proporciona un proceso para producir un polipéptido de la invención, que comprende el paso de sintetizar al menos parte del polipéptido por medios químicos . La invención proporciona un proceso para producir el ácido nucleico de la invención, que comprende el paso de amplificar el ácido nucleico utilizando un método de amplificación basado en cebador (por ejemplo PCR) . La invención proporciona un proceso para producir ácido nucleico de la invención, que comprende el paso de sintetizar al menos parte del ácido nucleico por medios químicos .

Cepas Las proteínas preferidas de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos encontrada en N. meningitidis serogrupo B. Dentro el serogrupo B, las cepas preferidas son 2996, MC58, 95N477 y 394/98. La cepa 394/98 es algunas veces denominada en la presente como "NZ" ya que ésta es una cepa de Nueva Zelanda. La proteína 287 es preferentemente de la cepa 2996 o, más preferentemente, de la cepa 394/98. La proteína 741 es preferentemente del serogrupo B cepas MC58, 2996, 394/98 o 95N477, o del serogrupo C cepa 90/18311. La cepa MC58 es más preferida. Las proteínas 936, 953 y NadA son preferentemente de la cepa 2996. Las cepas pueden ser indicadas como un subíndice, por ejemplo 741MC58 es la proteína 741 de la cepa MC58. A no ser que se establezca de otro modo, las proteínas mencionadas en la presente (por ejemplo, sin subíndice) son de N. meningitidis cepa 2996, la cual puede ser tomada como una cepa de "referencia". No obstante, se apreciará que la invención no está en general limitada por cepas. Como se mencionó anteriormente, las referencias generales a una proteina (por ejemplo "287", "919", etc.) puede ser tomada para incluir aquella proteína proveniente de alguna cepa. Esta tendrá típicamente identidad de secuencia a 2996 de 90% o más (por ejemplo 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más) . Donde una composición incluye un antígeno proteico particular (por ejemplo 741 ó 287) , la composición puede incluir ese antígeno en más de una forma variante, por ejemplo, la misma proteína, pero proveniente de más de una cepa. Estas proteínas pueden ser incluidas como proteínas en tándem o separadas . Donde se utilizan proteínas híbridas, los antígenos individuales dentro del híbrido (por ejemplo, porciones individuales -X-) pueden ser de una o más cepas. Donde n=2, por ejemplo, X2 puede ser de la misma cepa que x o de una cepa diferente. Donde n=3 , las cepas pueden ser (i) Xi=X2=X3 (ii) etc.

Líneas hipervirulentas y respuestas de anticuerpo bactericida En general, las composiciones de la invención son capaces de inducir respuestas de anticuerpo bactericida en suero después de ser administradas a un sujeto. Estas respuestas son convenientemente medidas en ratones y son un indicador estándar de la eficacia de la vacuna [por ejemplo nota final 14 de la referencia 13] . La actividad bactericida en suero (SBA) mide la muerte bacteriana mediada por el complemento, y puede ser evaluada utilizando complemento de humano o de conejo bebé. Los estándares HO requieren una vacuna para inducir al menos una elevación 4 veces en SBA en más de 90% de los pacientes o sujetos. En vez de ofrecer protección estrecha, las composiciones de la invención pueden inducir respuestas de anticuerpo bactericida contra más de una linea hipervirulenta del serogrupo B. En particular, éstas pueden inducir respuestas bactericidas contra dos o tres de las siguientes tres lineas hipervirulentas : (i) el grupo A4 ; (ii) complejo ET5; y (iii) línea 3. Estas pueden además inducir respuestas de anticuerpo bactericida contra una o más lineas hipervirulentas del subgrupo I, subgrupo III, subgrupo IV-1 o el complejo ET37, y contra otras líneas, por ejemplo líneas hiperinvasoras . Esto no necesariamente significa que la composición pueda inducir anticuerpos bactericidas contra todas y cada una de las cepas de meningococos del serogrupo B dentro de estas líneas hipervirulentas, por ejemplo, más bien, para cualquier grupo dado de cuatro o más cepas de meningococos del serogrupo B, dentro de una línea hipervirulenta particular, los anticuerpos inducidos por la composición son bactericidas contra al menos 50% (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90% o más) del grupo. Los grupos preferidos de las cepas incluirán unas cepas aisladas en al menos cuatro de los siguientes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR y CU. El suero tiene preferentemente un titulo bactericida de al menos 1024 (por ejemplo 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 o mayor, preferentemente al menos 214) por ejemplo, el suero es capaz de matar al menos 50% de las bacterias de prueba de una cepa particular, cuando se diluye 1/1024, como se describe en la referencia 13. Las composiciones preferidas pueden inducir respuestas bactericidas contra las siguientes cepas del meningococo de los serogrupo B: (i) del grupo A4, cepa 961-5945 (B:2b:P1.21, 16) y/o cepa G2136 (B : -) ; (ii) del complejo ET-5, cepa MC58 (B : 15 :P1.7 , 16b) y/o cepa 44/76 (B:15:P1.7, 16); (iii) de la línea 3, cepa 394/98 (B:4:P1.4) y/o cepa BZ198 (B:NT:~). Las composiciones más preferidas pueden inducir respuestas bactericidas contra las cepas 961-5945, 44/76 y 394/98. Las cepas 961-5945 y G2136 son ambas cepas de referencia de Neisseria MLST [ids 638 y 1002 en ref . 22] . La cepa MC58 es ampliamente disponible (por ejemplo ATCC BAA-335) y fue la cepa secuenciada en la referencia 6. La cepa 44/76 ha sido ampliamente utilizada y caracterizada (por ejemplo ref. 23) y es una de las cepas de referencia de Neissería MLST [id 237 en la ref . 22; hilera 32 de la Tabla 2 en la ref .1] . La cepa 394/98 fue originalmente aislada en Nueva Zelanda en 1998, y han existido varios estudios publicados que utilizan esta cepa (por ejemplo refs. 24 y 25) . La cepa BZ198 es otra cepa de referencia de MLST [id 409 en la ref. 22; hilera 41 de la Tabla 2 en la ref. 1] . La composición puede inducir adicionalmente una respuesta bactericida contra el serogrupo W135 cepa LNP17592 ( 135 :2a :P1.5 , 2), del complejo ET-37. Esta es una cepa Haji aislada en Francia en 2000.

Hospedero heterologo Mientras que la expresión de las proteínas de la invención puede tener lugar en Neissería, la presente invención utiliza preferentemente un hospedero heterologo.

El hospedero heterologo puede ser procariótico (por ejemplo una bacteria) o eucariótico. Este es preferentemente E. coli, pero otros hospederos adecuados incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhímurium, Neisseria lactomica, neissería cinérea, Mycobactería (por ejemplo, M. tuberculosis) , levadura, etc. De este modo, la invención proporciona una composición la cual, después de la administración a un sujeto, es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo en ese sujeto, en donde la respuesta de anticuerpo es bactericida contra dos o más (por ejemplo 2 ó 3) de las lineas hipervirulentas ?4, ET-5 y la línea 3 de jV. meningitidis serogrupo B, y en donde los inmunógenos en la composición que dan origen a la respuesta de anticuerpo, son obtenidos mediante expresión recombinante en un hospedero no Neisseriano. De este modo, los inmunógenos en las composiciones de la invención son preferentemente inmunógenos recombinantes . Las composiciones que no incluyen preparaciones de OMV pueden ser de este modo preferidas.

Composiciones y medicamentos inmunogénicos Las composiciones de la invención son inmunogénicas , y son más preferentemente composiciones de vacuna. Las vacunas de acuerdo a la invención pueden ser ya sea profilácticas (por ejemplo para prevenir la infección) o terapéuticas (por ejemplo para tratar la invención) , . pero típicamente serán profilácticas. El pH de la composición está preferentemente entre 6 y 8, preferentemente aproximadamente 7. El pH estable puede ser mantenido mediante el uso de un amortiguador. Donde una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, se prefiere utilizar un amortiguador de histidina [26] . La composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los humanos. Las composiciones pueden ser presentadas en frascos, o éstas pueden ser presentadas en jeringas llenas listas para utilizarse. Las jeringas pueden ser suministradas con o sin agujas. Una jeringa incluirá una dosis simple de la composición, mientras que un frasco puede incluir una dosis simple o dosis múltiples. Las composiciones inyectables usualmente serán soluciones o suspensiones líquidas. Alternativamente, éstas pueden ser presentadas en forma sólida (por ejemplo liofilizadas) para la solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. Las composiciones de la invención pueden ser envasadas en forma de dosis unitaria o en forma de dosis múltiple. Para las formas de dosis múltiple, los frascos son preferidos a las jeringas pre-llenadas . Los volúmenes de dosificación efectivos pueden ser rutinariamente establecidos, pero una dosis típica humana de la composición para inyección tiene un volumen de 0.5 mi. Donde una composición de la invención va a ser preparada extemporáneamente antes del uso (por ejemplo donde un componente es presentado en forma liofilizada) y es presentado como un equipo, el equipo puede comprender dos frascos, o puede comprender una jeringa llena y lista para utilizarse y un frasco, con los contenidos de la jeringa que son utilizados para reactivar los contenidos del frasco antes de la inyección. La invención también proporciona una composición de la invención para el uso como un medicamento. El medicamento es preferentemente capaz de producir una respuesta inmune en un mamífero (por ejemplo ésta es una composición inmunogénica) y es más preferentemente una vacuna. La invención también proporciona el uso de una composición de la invención en la fabricación de un medicamento para producir una respuesta inmune en un mamífero. Esta también proporciona el uso de una proteína "NadA" , una proteína "741", una proteína "936", una proteína "953", y una proteína "287" (y otros antígenos opcionales) en la fabricación de un medicamento para dar origen a una respuesta inmune en un mamífero. El medicamento es preferentemente una vacuna. La invención también proporciona un método para producir una respuesta inmune en un mamífero, que comprende el paso de administrar una cantidad efectiva de una composición de la invención. La respuesta inmune es preferentemente protectora y preferentemente involucra anticuerpos . El método puede dar origen a una respuesta reforzadora . El mamífero es preferentemente un humano. Donde la vacuna es para el uso profiláctico, el humano es preferentemente un niño (por ejemplo un bebé que empieza a andar o un infante) ; donde la vacuna es para uso terapéutico, el humano es preferentemente un adulto. Una vacuna destinada para niños puede también ser administrada a adultos, por ejemplo para evaluar la seguridad, la dosificación, la inmunogenicidad, etc. Estos usos y métodos son preferentemente para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad provocada por una Neisseria (por ejemplo meningitis, septicemia, bacteremia, gonorrea, etc.). La prevención y/o el tratamiento de la meningitis bacteriana o meningocócica, es preferida . Una manera de verificar la eficacia del tratamiento terapéutico involucra el monitoreo de la infección por Neisseria. después de la administración de la composición de la invención. Una manera de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico involucra el monitoreo de las respuestas inmunes contra los cinco antígenos básicos después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la invención puede ser determinada al administrarlas a sujetos de prueba (por ejemplo niños de 12 a 16 meses de edad, o modelos animales [27] ) y luego determinando los parámetros estándares, incluyendo los anticuerpos bactericidas en suero (SBA) y los títulos de ELISA (GMT) de la IgG anti-cápsula, total y de alta avidez. Estas respuestas inmunes en general serán determinadas alrededor de 4 semanas después de la administración de la composición, y comparadas a los valores determinados antes de la administración de la composición. Un incremento en SBA de al menos 4 veces u 8 veces es preferido. Donde más de una dosis de la composición es administrada, puede ser realizada más de una determinación post-administración. Las composiciones preferidas de la invención pueden conferir un título de anticuerpo en un paciente, que es superior al criterio para la seroprotección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de los sujetos humanos. Los antígenos con un titulo de anticuerpo asociado por arriba del cual se considera que un hospedero es seroconvertido contra el antigeno, son bien conocidos, y tales títulos son publicados por organizaciones tales como WHO. Preferentemente más de 80% de una muestra estadísticamente significativa del sujeto es seroconvertida, más preferentemente más de 90%, todavía más preferentemente más de 93% y lo más preferentemente 96-100%. Las composiciones de la invención en general serán administradas directamente a un paciente. La distribución directa puede ser lograda mediante inyección parenteral (por ejemplo subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, o al espacio intersticial de un tejido), o mediante administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración mucosal . La administración intramuscular al muslo o a la parte superior del brazo, es la preferida. La invención puede ser por medio de una aguja (por ejemplo una aguja ipodérmica) , pero la inyección libre de aguja puede ser alternativamente utilizada. Una dosis intramuscular típica es de 0.5 mi. La invención puede ser utilizada para promover la inmunidad sistémica y/o mucosal . El tratamiento de dosis puede ser un esquema de dosis simple o un esquema de dosis múltiples. Las dosis múltiples pueden ser utilizadas en un esquema de inmunización primaria y/o en un esquema de inmunización de refuerzo. Un esquema de dosis primaria puede ser seguido por un esquema de dosis de refuerzo. La sincronización adecuada entre las dosis de aprestamiento (por ejemplo entre 4-16 semanas), y entre el aprestamiento y el refuerzo, puede ser rutinariamente determinada. Las infecciones por Neisseria afectan diversas áreas del cuerpo y así pues las composiciones de la invención pueden ser preparadas en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden ser preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para la solución en, o la suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección, pueden ser también preparadas (por ejemplo una composición liofilizada) . La composición puede ser preparada para la administración tópica, por ejemplo como un ungüento, crema o polvo. La composición es preparada para la administración oral, por ejemplo como una tableta o cápsula, o como un jarabe (opcionalmente saborizado) . La composición puede ser preparada para la administración pulmonar, por ejemplo como un inhalador, utilizando un polvo fino o un rocío. La composición puede ser preparada como un supositorio o pesario. La composición puede ser preparada para la administración nasal, aural u ocular, por ejemplo como rocíos, gotas, gel o polvo [por ejemplo referencias 28 y 29] . Ha sido reportado el éxito con la administración nasal de los sacáridos neumocócicos [30, 31] , polipéptidos neumocócicos [32] , sacáridos de Hib [33] , sacáridos MenC [34] , y mezclas de conjugados sacáridos Hib y MenC [35] . Las composiciones inmunogénicas utilizadas como vacunas comprenden una cantidad i munológicamente efectiva de uno o varios antígenos, así como cualesquiera otros componentes, como sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente efectiva" se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis simple o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y la condición física del individuo que va a ser tratado, de la edad, del grupo taxonómico del individuo que va a ser tratado (por ejemplo primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseada, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica del médico que trata, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caerá en un intervalo relativamente alto que puede ser determinado a través de pruebas rutinarias, y una cantidad típica de cada antígeno sacárido de meningococo por dosis, está entre 1 µg y 20 \i<$, por ejemplo aproximadamente 1 µ<3, aproximadamente 2.5 µg, aproximadamente 4 µg, aproximadamente 5 µg, o aproximadamente 10 µg (expresado como sacárido) .

Componentes no antigénicos adicionales de la composición La composición de la invención, típicamente además de los componentes anteriormente mencionados, comprenderá uno o más portadores farmacéuticamente aceptables" los cuales incluyen cualquier portador que por sí mismo no induce la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son típicamente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos , ácidos polilácticos , ácidos poliglicoles , aminoácidos poliméricos, copol meros de aminoácidos, sucrosas [36] , trehalosa [37] , lactosa, y agregados lipidíeos (tales como gotitas o liposomas) . Tales portadores son bien conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Las vacunas pueden también contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etc. Además, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes , sustancias amortiguadoras del pH, y similares. La solución salina fisiológica estéril, libre de pirógenos, amortiguada con fosfato, es un portado típico. Una discusión completa de los excipientes farmacéuticamente aceptables es disponible en la referencia 38. Las composiciones de la invención pueden incluir un antimicrobiano, particularmente cuando se envasa en el formato de dosis múltiples. Las composiciones de la invención pueden comprender detergente, por ejemplo un Tween (polisorbato) , tal como Tween 80. Los detergentes están en general presentes a bajos niveles, por ejemplo <0.01%. Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo cloruro de sodio) para dar tonicidad. Una concentración de 10±2 mg/ml de cloruro de sodio es típica. Las composiciones de la invención incluirán en general un amortiguador. Es típico un amortiguador de fosfato . Las composiciones de la invención pueden comprender un alcohol de azúcar (por ejemplo manitol) o un disacárido (por ejemplo sucrosa o trehalosa) por ejemplo alrededor de 15-30 mg/ml (por ejemplo 25 mg/ml) , particularmente si éstas van a ser liofilizadas o si incluyen material que ha sido reconstituido a partir del material liofilizado. El pH de una composición para la liofilización puede ser ajustado alrededor de 6.1 antes de la liofilización. Las vacunas de la invención pueden ser administradas en conjunto con otros agentes inmunorreguladores . En particular, las composiciones incluirán usualmente un adyuvante . Los adyuvantes que pueden ser utilizados en las composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados a: A. Composiciones que contienen minerales Las composiciones que contienen minerales, adecuadas para el uso como adyuvantes en la invención, incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye las sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo oxihidróxidos) , fosfatos (por ejemplo hidroxifosfatos, ortofosf tos) , sulfatos, etc. [por ejemplo ver Capítulos 8 y 9 de la ref. 39] , o mezclas de diferentes compuestos minerales, con los compuestos que toman cualquier forma adecuada (por ejemplo gel, cristalino, amorfo, etc.) , y con la adsorción que es la preferida. Las composiciones que contienen minerales pueden ser también formuladas como una partícula de sal metálica [40] . Los fosfatos de aluminio son particularmente preferidos, particularmente en composiciones que incluyen un antígeno de sacárido de H. influenzae, y un adyuvante típico es el hidroxifosf to de aluminio amorfo con proporción molar P04/A1 entre 0.84 y 0.92, incluido a 0.6 mg de Al3+/ml . La adsorción con una dosis baja de fosfato de aluminio puede ser utilizada, por ejemplo, entre 50 y 100 µg de Al3+ por conjugado por dosis. Donde existe más de un conjugado en una composición, no todos los conjugados necesitan ser adsorbidos .

B. Emulsiones en Aceite Las composiciones de emulsión en aceite adecuadas para el uso como adyuvantes en la invención, incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 [Capítulo 10 de la ref. 39; ver también ref . 41] (5% de escualeno, 0.5% de Tween 80, y 0.5% de Span 85, formulados en partículas submicrónicas utilizando un microfluidizador) . El adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA) pueden ser también utilizados.

C. Formulaciones de saponina [Capítulo 22 de la ref. 39] Las formulaciones de saponina pueden ser también utilizadas como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterologo de glucósidos de esterol y glucósidos de triterpenoide que son encontrados en la corteza, hojas, tallos, raices e incluso las flores de una amplia gama de especies vegetales . La saponina proveniente de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina ha sido ampliamente utilizada como adyuvante. La saponina puede también ser comercialmente obtenida a partir de Smilax ornata (zarzaparrilla) , Gypsophilla paniculata (velo de novia) , y Saponaria officionalis (raiz de jabón) . Las formulaciones adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, asi como formulaciones lipídicas, tales como ISCOMSs. QS21 es comercializada como StimulonMR. Las composiciones de saponina han sido purificadas utilizando HPLC y P-HPLC. Las fracciones purificadas específicas utilizando estas técnicas han sido identificadas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Un método de producción de QS21 es descrito en la ref. 42. Las formulaciones de saponina pueden también comprender un esterol, tal como colesterol [43] . Las combinaciones de saponinas y colesteroles pueden ser utilizadas para formar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimuladores (ISCOMs) [Capítulo 23 de la ref . 39] . Los ISCOMs incluyen también típicamente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina . Cualquier saponina conocida puede ser utilizada en ISCOMs. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOMs son además descritos en las refs. 43-45. Opcionalmente, los ISCOMs pueden estar desprovistos de detergente adicional [46] . Una revisión del desarrollo de los adyuvantes basados en saponina puede ser encontrada en las refs. 47 y 48.

D. Virosomas y partículas similares a virus Los virosomas y partículas similares a virus (VLPs) pueden también ser utilizadas como adyuvantes en la invención. Estas estructuras contienen en general una o más proteínas provenientes de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. Estos son en general no patógenos, no replicantes y en general no contienen nada del genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden ser recombinantemente producidas o aisladas de virus enteros. Estas proteínas virales , adecuadas para el uso en virosomas o VLPs, incluyen proteínas derivadas del virus de la influenza (tal como HA o NA) , virus de la hepatitis B (tal como las proteínas de núcleo o de cápside) , virus de la hepatitis E, virus del sarampión, virus Sindbis, rotavirus, virus de la enfermedad Pie y Boca, retrovirus, virus Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, ARN-fagos, fago ?)ß (tal como proteínas de recubrimiento) , fago GA, fago fr, fago AP205, y Ty (tal como la proteína pl del retrotransposón Ty) . Los VLPs son discutidos además en las refs. 49-54. Los virosomas son discutidos además en, por ejemplo, la ref. 55.

E. Derivados bacterianos o microbianos Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) , derivados de lípido A, oligonucleótidos inmunoestimuladores y toxinas de ribosilación de ADP y derivados destoxificados de los mismos. Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil-lípido A (MPL) y PL 3-O-desacilado (3dMPL) . 3dMPL es una mezcla de monofosforil-lípido A 3 -des-O-acilado, con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. Una "partícula pequeña" preferida proveniente del monofosforil-lípido A 3-0-des-acilado, se describe en la ref. 56. Tales "partículas pequeñas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas para ser esterilizadas por filtración a través de una membrana de 0.22 µ?? [56] . Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen monofosforil-lípido A, miméticos, tales como derivados de aminoalquil-glucosamidina-fosfato por ejemplo RC-529 [57, 58] . Los derivados del lípido A incluyen derivados del Lípido A provenientes de Escherichia col! tales como OM-174. OM-174 es descrito por ejemplo en las refs. 59 y 60. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen una porción CpG (una secuencia dinucleotídica que contiene una citocina no metilada enlazada por un enlace fosfato a una guanosina) . Los AR s de doble hebra y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli (dG) , han sido también mostrados como inmunoestimuladores . Los CpG's pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble hebra o de una sola hebra. Las referencias 61, 62 y 63 describen las posibles sustituciones con análogos, por ejemplo reemplazo de guanosina con 2'-desoxi-7-desazaguanosina . El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG es además discutido en las refs. 64-69. La secuencia de CpG puede ser dirigida a TLR9, tal como la porción GTCGTT o TTCGTT [70] . La secuencia CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune de Thl, tal como un ODN de CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tal como ODN de CpG-B. Las ODNs de CpG-A y CpG-B son discutidas en las refs. 71-73. Preferentemente, la CpG es una ODN CpG-A. Preferentemente, el oligonucleotido CpG es construido de modo que el extremo 5' es accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleotido CpG pueden ser enlazadas en sus extremos 3' para formar "inmunómeros" . Ver, por ejemplo, refs. 70 y 74-76. Las toxinas de ribosilación de ADP, bacterianas y los derivados destoxificados de las mismas, pueden ser utilizados como adyuvantes en la invención. Preferentemente, la proteína es derivada de E. coli (enterotoxina "LT" lábil al calor E. coli), cólera ("CT") o pertussis ("PT"). El uso de las toxinas de ribosilación de ADP destoxificadas , como adyuvantes mucosales, se describe en la ref . 77 y como adyuvantes parenterales en la ref. 78. La toxina o toxoide está preferentemente en la forma de una holotoxina, que comprende las subunidades A y B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación destoxificante; preferentemente la subunidad B no es mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante LT destoxificado, tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de las toxinas de ribosilación de ADP y los derivados destoxificados de las mismas, particularmente LT-K53 y LT-R72, como adyuvantes puede ser encontrado en las referencias 79-8S. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos está preferentemente basada en los alineamientos de las unidades A y B de las toxinas de ribosilación de ADP descritas en la ref. 87, específicamente incorporada en la presente por referencia, en su totalidad.

F. Inmunomoduladores humanos Los inmunomoduladores humanos adecuados para el uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [88], etc.) [89], interferones (por ejemplo interferón ?) , factor de estimulación de colonias de macrófagos, y factor de necrosis tumoral .

G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos Los bioadhesivos y mucoadhesivos pueden ser también utilizados como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificado [90] o mucoadhesi os tales como derivados reticulados de poli (ácido acrílico) , alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa . El quitosano y los derivados del mismo pueden ser también utilizados como adyuvantes en la invención [91] .

H. Micropartxculas Las micropartxculas pueden ser también utilizadas como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (por ejemplo una partícula de aproximadamen e 100 nm a aproximadamente 150 µt? de diámetro, más preferentemente aproximadamente 200 nm a aproximadamente 30 µp? de diámetro, y lo más preferentemente aproximadamente 500 nm a aproximadamente 10 µp? de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo un poli (ácido -hidroxi) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli (láctido-co-glicólido) son preferidos, opcionalmente tratados para tener una superficie negativamente cargada (por ejemplo con SDS) o una superficie positivamente cargada (por ejemplo con un detergente catiónico, tal como CTAB) .

I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de la ref. 39) Los ejemplos de formulaciones de liposomas, adecuados para el uso como adyuvantes, se describen en las refs. 92-94.

J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno Los adyuvantes adecuados para el uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ásteres de polioxietileno [95] . Tales formulaciones incluyen además surfactantes de éster de polioxietilensorbitan, en combinación con un octoxinol [96] asi como los surfactantes de éteres o ésteres alquílicos de polioxietileno en combinación con al menos un surfactante no iónico adicional tal como un octoxinol [97] . Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: éter 9-laurílico de polioxietileno (laureth 9) , éter 9-esteorílico de polioxietileno, éter 8-esteorílico de polioxietileno, éter 4-laurílico de polioxietileno, éter 35-laurílico de polioxietileno, y éter 23-laurílico de polioxietileno.

K. Polífosfazeno (PCPP) Las formulaciones de PCPP son descritas, por ejemplo, en las referencias 98 y 99.

L. Péptidos de Muramilo Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para el uso como adyuvantes en la invención, incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) , y N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanin-2- (1 ' -2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina MTP-PE) .

M. Compuestos de Imidazoquinolona Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para el uso como adyuvantes en la invención, incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo "Resiquimod 3M" ) descrito además en las referencias 100 y 101. La invención puede también comprender las combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, las siguientes composiciones adyuvantes pueden ser utilizadas en la invención: (1) una saponina y una emulsión aceite en agua [102]; (2) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) [103] ; (3) una saponina (por ejemplo QS21) + un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [104] ; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones aceite en agua [105] ; (6) SAF, que contiene 10% de escualeno, 0.4% de Tween 80^, 5% de polímero en bloque pluronic L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizadas en una emulsión submicrónica o agitadas en torbellino para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande. (7) sistema adyuvante Ribi"11 (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene 2% de escualeno, 0.2% de Tween 80, y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste de monofosforilipido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) , y esqueleto de pared celular (CWS) , preferentemente MPL + CWS (Detox*) ; y (8) una o más sales minerales (tales como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL) . Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores se describen en el Capítulo 7 de la ref. 39. El uso de un adyuvante de hidroxido de aluminio o de fosfato de aluminio es particularmente preferido, y los antígenos son en general adsorbidos a estas sales. El hidróxido de aluminio es preferentemente evitado como un adyuvante si la composición incluye un antigeno Hib. Donde se utiliza un fosfato de aluminio y se desea no absorber un antígeno hacia el adyuvante, esto es favorecido por la inclusión de iones fosfato libres en solución (mediante el uso de un amortiguador de fosfato) . La prevención de la adsorción puede ser también lograda mediante la selección del pH correcto durante el mezclado del antigeno/adyuvante, un adyuvante con un punto de carga cero apropiado, y un orden apropiado de mezclado para los diferentes antígenos en una composición [106] . El fosfato de calcio es otro adyuvante preferido.

Antígenos adicionales Las composiciones de la invención contienen cinco antígenos proteicos meningocócicos básicos . Estos pueden también incluir antígenos adicionales, aunque puede no contener antígenos proteicos meningocócicos diferentes de los cinco antígeno básicos. Los antígenos adicionales para la inclusión pueden ser por ejemplo: un antígeno sacárido proveniente de Haemophilus influenzae B . un antígeno sacárido proveniente de N. meningitidis serogrupo A, C, W135 y/o Y, tal como el oligosacárido descrito en la referencia 107 del serogrupo C o los oligosacáridos de la ref. 108. un antigeno sacárido proveniente de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo 155, 156, 157] . un antígeno proveniente del virus de la hepatitis A, tal como el virus inactivado [por ejemplo 109, 110] . un antígeno proveniente del virus de la hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o de núcleo [por ejemplo 110, 111] . un antígeno de la difteria, tal como el toxoide de la difteria [por ejemplo Capítulo 3 de la ref. 112] por ejemplo el mutante CRMi97 [por ejemplo 113] . un antígeno del tétanos, tal como un toxoide tetánico [por ejemplo Capítulo 4 de la ref. 112] . un antígeno proveniente de Bordetella pertussis, tal como la holotoxina de pertussis (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo refs. 114 y 115] . El antígeno de pertussis celular puede también ser utilizado. una preparación de vesículas de la membrana externa (OMV) de N. meningitidis serogrupo B, tales como aquellas descritas en las refs. 4, 116, 117, 118, etc. uno o varios antígenos de la polio [por ejemplo 119, 120] tal como OPV o preferentemente IPV.

La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales . Los antígenos típicamente estarán presentes a una concentración de al menos 1 g/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para promover una respuesta inmune contra ese antígeno. Se prefiere que la eficacia protectora de los antígenos sacáridos individuales no sea eliminada al combinarlos, aunque puede ser reducida la inmunogenicidad efectiva (por ejemplo los títulos de ELISA) . Donde es incluido un antígeno de la difteria en la composición, se prefiere también incluir antígenos de tétanos y antígeno de pertussis. Similarmente, donde es incluido un antígeno de tétanos se prefiere también incluir antígenos de la difteria y antigenos de pertussis. Similarmente, donde un antígeno de pertussis es incluido, se prefiere también incluir antígenos de la difteria y del tétanos. Tales combinaciones de DTP pueden ser utilizadas para reconstituir los conjugados liofilizados . Donde un antígeno sacárido o carbohidrato es utilizado, éste es preferentemente conjugado a una proteína portadora con el fin de aumentar la inmunogenicidad (ver más adelante) . Los antígenos proteicos tóxicos pueden ser destoxificados donde sea necesario (por ejemplo la destoxificación de la toxina de pertussis por medios químicos y/o genéticos [115]) . Como una alternativa al uso de los antígenos proteicos en la composición de la invención, el ácido nucleico que codifica para el antigeno puede ser utilizado [por ejemplo refs . 121 a 129) . Los componentes proteicos de las composiciones de la invención pueden de este modo ser reemplazados por ácido nucleico (preferentemente ADN, por ejemplo en la forma de un plásmido) que codifica para la proteína. Similarmente, las composiciones de la invención pueden comprender proteínas que imitan los antígenos sacáridos por ejemplo mimotopos [130] o anticuerpos anti-idiotipo. Estos pueden reemplazar los componentes sacáridos individuales, o pueden suplementarios. Como un ejemplo, la vacuna puede comprender un mimético peptídico del polisacárido capsular MenC [131] o MenA [132] en lugar del sacárido mismo. Las composiciones particularmente preferidas de la invención incluyen uno, dos o tres de: (a) antígenos sacáridos de meningococos serogrupos Y, W135, C y (opcionalmente) A; (b) un antígeno sacárido proveniente de Haemophilus influenzae tipo B; y/o (c) un antígeno de Streptococcus pneumoniae. Una composición que comprende los antígenos del serogrupo B y un conjugado de Hib es particularmente preferida.

Meningococos serogrupos Y, W135, C y (opcio almezite) A Como se mencionó anteriormente, las vacunas de polisacáridos contra los serogrupos A, C, W135 e Y han sido conocidas por muchos años. Estas vacunas (MENCEVAX ACWYMR y MENO UNE^) están basadas en polisacáridos capsulares de los organismos y, aunque son efectivas en adolescentes y adultos, éstas dan una pobre respuesta inmune y corta duración de protección, y no pueden ser utilizadas en infantes. En contraste a los antígenos polisacáridos no conjugados en estas vacunas, las vacunas del serogrupo C recientemente aprobadas (MenjugateMR [133, 107] , Meningitec™ y NeisVac-C101) incluyen sacáridos conjugados. MenjugateMR y eningitec^ tienen antigenos oligosacáridos conjugados a un portador CRM197, mientras que NcisVac-CMR utiliza el polisacárido completo (des-O-acetilado) conjugado a un portador del toxoide tetánico. Las composiciones de la presente invención incluyen preferentemente antígenos sacáridos capsulares provenientes de uno o más meningococos de los serogrupos Y, W135, C y (opcionalmente) A, en donde los antígenos son conjugados a una o varias proteínas portadoras y/o son oligosacáridos. Una cantidad típica de cada antígeno sacárido meningocócico por dosis, está entre 1 \ig y 20 µg, por ejemplo aproximadamente 1 µg, aproximadamente 2.5 µ , aproximadamente 4 µg/ aproximadamente 5 µg, o aproximadamente 10 µg (expresado como sacárido) . Donde una mezcla comprende sacáridos capsulares de ambos serogrupos A y C, la proporción (peso/peso) del sacárido MenA: sacárido MenC puede ser mayor de 1 (por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor). Donde una mezcla comprende sacáridos capsulares del serogrupo Y, y uno o ambos de los serogrupos C y W135, la proporción (peso/peso) del sacárido MenY: sacárido MenW135 puede ser mayor de 1 (por ejemplo 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor) y/o que la proporción (peso/peso) del sacárido MenY : sacárido MenC puede ser menor de 1 (por ejemplo 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 o menor). Las proporciones preferidas (peso/peso) para los sacáridos provenientes de los serogrupos A:C:W135:Y son: 1:1:1:1; 1.1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; y 2:2:2:1. Las proporciones preferidas (peso/peso) para los sacáridos de los serogrupos C:W135:Y son: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; y 2:1:1. Se prefiere el uso de una masa sustancialmente igual de cada sacárido. Los sacáridos capsulares serán utilizados en general en la forma de oligosacáridos . Estos son convenientemente formados mediante fragmentación del polisacárido capsular purificado (por ejemplo mediante hidrólisis) , que usualmente será seguido por purificación de los fragmentos del tamaño deseado. La fragmentación de los polisac ridos es preferentemente realizada para dar un grado promedio final de polimerización (DP) en el oligosacárido menor de 30 (por ejemplo entre 10 y 20, preferentemente alrededor de 10 para el serogrupo A; entre 15 y 25 para los serogrupos 135 e Y, preferentemente alrededor de 15-20; entre 12 y 22 para el serogrupo C; etc.). DP puede ser convenientemente medida mediante cromatografía de intercambio iónico o mediante ensayos colorimétricos [134] . Si la hidrólisis es realizada, el hidrolizado será en general ajustado a tamaño con el fin de eliminar los oligosacáridos de longitud corta [135] . Esto puede ser logrado de diversas maneras, tal como la ultrafiltración, seguida por cromatografía de intercambio iónico. Los oligosacáridos con un grado de polimerización menor que o igual a aproximadamente 6 son preferentemente eliminados para el serogrupo A, y aquellos menores de alrededor de 4 son preferentemente removidos para los serogrupos W135 e Y. Los antígenos de sacárido MenC preferidos son descritos en la referencia 133, como se utiliza en Menjugate . El antígeno sacárido puede ser químicamente modificado. Esto es particularmente útil para reducir la hidrólisis para el serogrupo A [136; ver más adelante] . La des-O-acetilación de los sacáridos meningocócicos puede ser realizada. Para los oligosacáridos, la modificación puede tener lugar antes o después de la despolimerización. Donde una composición de la invención incluye un antígeno del sacárido MenA, el antígeno es preferentemente un sacárido modificado en el cual uno o más de los grupos hidroxilo sobre el sacárido nativo han sido reemplazados por un grupo bloqueador [136] . Esta modificación mejora la resistencia a la hidrólisis, y significa que el antígeno del serogrupo A puede ser almacenado y utilizado en una formulación líquida en vez de requerir liofilización. El número de unidades monosacáridas que tienen grupos bloqueadores puede variar. Por ejemplo, todas o sustancialmente todas las unidades monosacáridas pueden tener grupos bloqueadores. Alternativamente, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% de las unidades monosacáridas pueden tener grupos bloqueadores. Al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 unidades monosacáridas pueden tener grupos bloqueadores . De igual modo, el número de grupos bloqueadores sobre una unidad monosacárida puede variar. Por ejemplo, el número de grupos bloqueadores sobre una unidad monosacárida puede ser de 1 ó 2. El grupo bloqueador en general estará en la posición 4 y/o en la posición 3 de las unidades monosacáridas . La unidad monosacárida terminal puede o no tener un grupo bloqueador en vez de su hidroxilo nativo. Se prefiere conservar un grupo hidroxilo anomérico libre sobre una unidad monosacárida terminal, con el fin de proporcionar una palanca para reacciones posteriores (por ejemplo conjugación) . Los grupos hidroxilo anoméricos pueden ser convertidos a grupos amino (-NH2 o - H-E, donde E es un grupo protector de nitrógeno) mediante aminación reductiva (utilizando por ejemplo, NaBH3CN/NH4Cl) , y pueden ser luego regenerados después de que otros grupos hidroxilo han sido convertidos a grupos bloqueadores. Los grupos bloqueadores para reemplazar los grupos hidroxilo pueden ser directamente accesibles por medio de reacción de derivatización del grupo hidroxilo, por ejemplo mediante el reemplazo del átomo de hidrógeno del grupo hidroxilo, con otro grupo. Los derivados adecuados de los grupos hidroxilo que actúan como grupos bloqueadores son, por ejemplo, carbamatos, sulfonatos, carbonatos, esteres, éteres (por ejemplo éteres de sililo o éteres de alquilo) y acétales. Algunos ejemplos específicos de tales grupos bloqueadores son alilo, Aloe, bencilo, BOM, t-butilo, tritilo, TBS, TBDPS, TES, TMS, TIPS, PMB, MEM, MOM, MTM, THP, etc . Otros grupos bloqueadores que no son directamente accesibles y que reemplazan completamente el grupo hidroxilo incluyen alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, alquilo de 3 a 12 átomos de carbono, arilo de 5 a 12 átomos de carbono, (aril de 5 a 12 átomos de carbono) (alquilo de 1 a 6 átomos de carbono) , NRXR2 (R1 y R2 son definidos en el siguiente párrafo), H, F, Cl, Br, C02H, C02 (alquilo de 1 a 6 átomos de carbono) , CN, CF3/ CC13, etc. Los grupos bloqueadores preferidos son grupos que retienen electrones. Los grupos bloqueadores preferidos son de la fórmula: -O-X-Y o -OR3 en donde: X es C (O) , S (0) o S02; Y es alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 12 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono, arilo de 5 a 12 átomos de carbono o (aril de 5 a 12 átomos de carbono) (alquilo de 1 a 6 átomos de carbono) , cada uno de los cuales puede ser opcionalmente sustituido con 1, 2 6 3 grupos independientemente seleccionados de F, Cl, Br, C02H, C02 (alquilo de 1 a 6 átomos de carbono), CN, CF3 o CC13; o Y es NR1R ; R1 y R2 son independientemente seleccionados de hidrógeno, alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono, arilo de 5 a 12 átomos de carbono, (aril de 5 a 12 átomos de carbono) (alquilo de 1 a 6 átomos de carbono) ; o R1 y R2 pueden ser unidos para formar un grupo heterocíclico saturado de 3 a 12 átomos de carbono; R3 es alquilo de 1 a 12 átomos de carbono o cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono, cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos independientemente seleccionados de F, Cl , Br, C02 (alquilo de 1 a 6 átomos de carbono) , CN, CF3 o CCl3; o R3 es arilo de 5 a 12 átomos de carbono o (aril de 5 a 12 átomos de carbono) (alquilo de 1 a 6 átomos de carbono) , cada uno de los cuales puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2, 3, 4 ó 5 grupos seleccionados de F, Cl, Br, C02H, C02 (alquilo de 1 a 6 átomos de carbono) , CN, CF3 o CC13. Cuando R3 es alquilo de 1 a 12 átomos de carbono o cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono, éste está típicamente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos como se definieron anteriormente. Donde R1 y R2 están unidos para formar un grupo heterocíclico saturado de 3 a 12 átomos de carbono, se entiende que R1 y R2 conjuntamente con el átomo de nitrógeno forman un grupo heterocíclico saturado que contiene cualquier número de átomos de carbono entre 3 y 12 (por ejemplo C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, Cu, Ci2) . El grupo heterocíclico puede contener 1 o 2 heteroátomos (tales como nitrógeno oxígeno o azufre) diferentes del átomo de nitrógeno. Los ejemplos de grupos heterocíclicos saturados de 3 a 12 átomos de carbono son pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, piperazinilo, imidazolidinilo, azetidinilo y aziridinilo . Los grupos bloqueadores -O-X-Y y -OR3 pueden ser preparados a partir de los grupos -OH mediante procedimientos de derivatización estándares, tales como reacción del grupo hidroxilo con un haluro de acilo, haluro de alquilo, haluro de sulfonilo, etc. Por lo tanto, el átomo de oxígeno en -0-X-Y es preferentemente el átomo de oxigeno del grupo hidroxilo, mientras el grupo -X-Y en -0-X-Y preferentemente reemplaza el átomo hidrógeno del grupo hidroxilo. Alternativamente, los grupos bloqueadores pueden ser accesibles vía una reacción de sustitución, tal como una sustitución tipo Mitsunobu. Estos y otros métodos para preparar los grupos bloqueadores a partir de los grupos hidroxilo, son bien conocidos. Más preferentemente, el grupo bloqueador es -0C(0)CF3 [137], o un grupo carba ato -0C(0)N 1R2, donde R1 y R2 son independientemente seleccionados de alquilo de 1 a 6 átomos de carbono. Más preferentemente, R1 y R2 son ambos metilo, por ejemplo el grupo bloqueador es -0C(0)NMe2. Los grupos bloqueadores de carbamato tienen un efecto estabilizador sobre el enlace glucosídico, y pueden ser preparados bajo condiciones suaves. Los sacáridos MenA modificados, preferidos, contienen n unidades monosacáridas , donde al menos el h% de las unidades monosacáridas no tienen grupos -OH en ambas posiciones 3 y 4. El valor de h es 24 o mayor (por ejemplo 25, 26,27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 98, 99 ó 100) y es preferentemente 50 o mayor.

Los grupos -OH ausentes son preferentemente grupos bloqueadores como se definieron anteriormente. Otros sacáridos MenA modificados, preferidos , comprenden las unidades monosacáridas , en donde al menos s de las unidades monosacáridas no tienen -OH en la posición 3 y no tienen -OH en la posición 4. El valor de s es al menos 1 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90). Los grupos -OH ausentes son preferentemente grupos bloqueadores como se definieron anteriormente . Los sacáridos MenA modificados adecuados para el uso con la invención, tienen la fórmula: en donde n es un número entero de 1 a 100 (preferentemente un número entero de 15 a 25) ; T es de la fórmula (A) o (B) : cada grupo Z es independientemente seleccionado de OH o un grupo bloqueador como se definió anteriormente; y cada grupo Q es independientemente seleccionado de OH o un grupo bloqueador como se definió anteriormente; Y se selecciona de OH o un grupo bloqueador como se definió anteriormente ; E es H o un grupo protector de nitrógeno; y en donde más de aproximadamente 7% (por ejemplo 8%, 9%, 10% o más) de los grupos son grupos bloqueadores. Cada uno de los grupos n+2Z puede ser el mismo o diferente uno del otro. De igual modo, cada uno de los grupos n+2Q puede ser el mismo o diferente uno del otro. Todos los grupos Z pueden ser OH. Alternativamente, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o 60% de los grupos Z pueden ser OAc. Preferentemente, aproximadamente 70% de los grupos Z son OAc, con el resto de los grupos Z que son OH o grupos bloqueadores, como se definieron anteriormente. Al menos aproximadamente 7% de los grupos Q son grupos bloqueadores. Preferentemente, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 99% o incluso 100% de los grupos Q son grupos bloqueadores . Las composiciones preferidas de la invención pueden ser almacenadas por 28 días a 37°C y, después de ese periodo, menos de f% de la cantidad total inicial del sacárido MenA conjugado, estará no conjugada, donde f es 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o menor. Los polisacáridos capsulares de meningococos son típicamente preparados mediante un proceso que comprende los pasos de la precipitación del polisacárido (por ejemplo utilizando un detergente cationico) , el fraccionamiento con etanol, la extracción con fenol frío (para eliminar la proteina) y ultracentrifugación (para eliminar LPS) [por ejemplo ref . 138]. , Un proceso más preferido [108], no obstante, involucra la precipitación del polisacárido, seguido por solubilización del polisacárido precipitado, utilizando un alcohol inferior. La precipitación puede ser lograda utilizando un detergente cationico tal como sales de tetrabuti1amonio y de cetiltrimetilamonio (por ejemplo las sales de bromuro) , o las sales de bromuro de hexadimetina y de miristiltrimetilamonio . El bromuro de cetiltrimetilamonio ("CTAB") es particularmente preferido [139]. La solubilización del material precipitado puede ser lograda utilizando un alcohol inferior un alcohol inferior tal como metanol, propan-l-ol, propan-2-ol, butan-l-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-l-ol , 2-metil-propan-2 -ol , dioles, etc., pero el etanol es particularmente adecuado para solubilizar los complejos CTAB-polisacárido . El etanol es preferentemente agregado al polisacárido precipitado para dar una concentración final (con base en el contenido total del etanol y del agua) de entre 50% y 95%. Después de la re-solubilización, el polisacárido puede ser además tratado para eliminar los contaminantes. Esto es particularmente importante en situaciones donde incluso la contaminación menor no es aceptable (por ejemplo para la producción de vacunas humanas) . Esto involucrará típicamente uno o más pasos de filtración, por ejemplo filtración profunda, filtración a través de carbón activado, filtración por tamaño y/o ultrafiltración . Una vez filtrado para eliminar los contaminantes, el polisacárido puede ser precipitado para el tratamiento y/o procesamiento posteriores . Esto puede ser convenientemente logrado mediante intercambio de cationes (por ejemplo mediante la adición de sales de calcio o de sodio) . Como una alternativa a la purificación, los sacáridos capsulares de la presente invención pueden ser obtenidos mediante síntesis total o parcial, por ejemplo la síntesis de Hib es descrita en la ref. 140, y la síntesis de MenA en la ref 141. Las composiciones de la invención comprenden sacáridos capsulares de al menos dos serogrupos de N. meningitidis. Los sacáridos son preferentemente preparados de manera separada (incluyendo cualquier fragmentación, conjugación, modificación, etc.) y luego mezclados para dar una composición de la invención. Donde la composición comprende un sacárido capsular del serogrupo A, no obstante, se prefiere que el sacárido del serogrupo A no se combine con el o los otros sacáridos hasta poco antes del uso, con el fin de reducir al mínimo el potencial para la hidrólisis. Esto puede ser convenientemente logrado al tener el componente del serogrupo A (típicamente junto con excipientes apropiados) en forma liofilizada y el o los otros componentes del serogrupo en forma líquida (también con excipientes apropiados) , con los componentes líquidos que son utilizados para reconstituir el componente MenA liofilizado, cuando está listo para utilizarse. Donde se utiliza un adyuvante de sal de aluminio, se prefiere incluir el adyuvante en el frasco que contiene la vacuna líquida, y liofilizar el componente MenA sin adyuvante. Una composición de la invención puede ser preparada de este modo a partir de un equipo que comprende: (a) sacárido capsular de N. eningitidis serogrupo A, en forma liofilizada y (b) los antigenos adicionales proveniente de la composición, en forma líquida. La invención proporciona también un método para preparar una composición de la invención, que comprende mezclar un sacárido capsular liofilizado de N. meningitidis serogrupo A con los antígenos adicionales, en donde dichos antigenos adicionales están en forma liquida. La invención proporciona también un equipo que comprende: (a) un primer recipiente que contiene sacáridos capsulares de dos o más de N. meningitidis serogrupos C, W135 e Y, todos en forma liofilizada; y (b) un segundo recipiente que contiene en forma líquida (i) una composición la cual, después de la administración a un sujeto, es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo en ese sujeto, en donde la respuesta de anticuerpo es bactericida contra dos o más (por ejemplo 2 ó 3) de las líneas hipervirulentas A , ET-5 y la línea 3 de N. meningitidis serogrupo B, (ii) sacáridos capsulares de ninguno o uno de N. meningitidis serogrupos C, 135 e Y, y opcionalmente (iii) antígenos adicionales (ver más adelante) que no incluyen sacáridos capsulares de mengococos, en donde, la reconstitución de los contenidos del recipiente (a) por el contenido del recipiente (b) , proporciona una composición de la invención.

Dentro de cada dosis, la cantidad de un antigeno sacárido individual estará en general entre 1-50 µg (medido como masa de sacárido), con aproximadamente 2.5 µg, 5 µg o 10 µg de cada uno, que es lo preferido. Con proporciones en peso A:C:W135:Y de 1:1:1:1, 1:1:1:2, 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4.2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; y 2:2:2:1, por lo tanto, la cantidad representada por la Figura 1 es preferentemente de aproximadamente 2.5 µ?, 5 µg o 10 µg. Para una composición A:C:W:Y con proporción de 1:1:1:1 y 10 µg por sacárido, por lo tanto, se administran 40 µg de sacárido por dosis. Las composiciones preferidas tienen aproximadamente el siguiente sacárido en µg por dosis: Las composiciones preferidas de la invención comprenden menos de 50 µg de sacárido meningococo por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden < 40 µg de sacárido de meningococo por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <30 x.q de sacárido de meningococo por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <25 µg de sacárido de meningococo por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <20 µg de sacárido de meningococo por dosis. Otras composiciones preferidas comprenden <10 µg de sacárido de meningococo por dosis pero, idealmente, las composiciones de la invención comprenden al menos 10 µg de sacárido de meningococo por dosis. Los conjugados de MenC, MenjugateMR y NeisVacMR, utilizan un adyuvante de hidróxido, mientras que eningitecMR utiliza un fosfato. Es posible, en las composiciones de la invención, adsorber algunos antigenos hacia un hidróxido de aluminio, pero para tener otros antigenos en asociación con un fosfato de aluminio. Para combinaciones de serogrupo tetravalente, por ejemplo, están disponibles las siguientes permutaciones : Serogrupo Sal de aluminio (H=un hidróxido; P= un fosfato) A P H P H H H P P P H H H P P P H C P H H P H H P H H P P H P H P P W135 P H H H P H H P H H P P P P H P Y P H H H H P H H P P H P H P P P Para combinaciones del serogrupo trivalente de meningitidis, son disponibles las siguientes permutaciones Haemophilus influenzae tipo B Donde la composición incluye un antigeno H. influenzae tipo B, éste típicamente será un antigeno sacárido capsular Hib. Los antígenos sacáridos provenientes de H. influenzae b son bien conocidos. Ventajosamente, el sacárido Hib está covalentemente conjugado a una proteina portadora, con el fin de aumentar su inmunogenicidad, especialmente en niños. La preparación de los conjugados polisacáridos en general, y del polisacárido capsular Hib en particular, está bien documentado [por ejemplo referencias 142 a 150, etc.]. La invención puede utilizar cualquier conjugado de Hib adecuado. Las proteínas portadoras adecuadas son descritas más adelante, y los portadores preferidos para los sacáridos Hib son CRMi97 ("HbOC"), toxoide tetánico ("PRP-T") y el complejo de la membrana externa de N. meningitidis ("PRP-OMP") . La porción sacárida del conjugado puede ser un polisacárido (por ejemplo el fosfato de polirribosilribitol de longitud completa (PRP) ) , pero se prefiere idrolizar los polisacáridos para formar oligosacáridos (por ejemplo peso molecular de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 kDa) . Un conjugado preferido comprende un oligosacárido Hib covalentemente enlazado a CRMx97 via un enlazador de ácido adípico [151, 152] . El toxoide tetánico es también un portador preferido. La administración del antígeno Hib preferentemente, da como resultado una concentración de anticuerpo anti-PRP 0.15 µg/ml, y más preferentemente _>1 µg/ml. Las composiciones de la invención pueden comprender más de un antígeno Hib. Donde una composición incluye un antígeno de sacárido Hib, se prefiere que ésta tampoco incluya un adyuvante de hidróxido de aluminio. Si la composición incluye un adyuvante de fosfato de aluminio, entonces el antígeno Hib puede ser adsorbido al adyuvante [153] o éste puede ser no adsorbido [154] . Los antígenos Hib pueden ser liofilizados, por ejemplo junto con los antígenos de meningococo .

Streptococcus pneumoniae Donde la composición incluye un antígeno de S. pneumoniae, éste típicamente será un antígeno sacárido capsular, el cual está preferentemente conjugado a una proteína portadora [por ejemplo refs. 155 a 157] . Se prefiere incluir los sacáridos provenientes de más de un serotipo de S. pneumoniae. Por ejemplo, las mezclas de polisacáridos de 23 diferentes serotipos son ampliamente utilizadas, como lo son las vacunas conjugadas con polisacáridos de entre 5 y 11 diferentes serotipos [158] . Por ejemplo, PrevNar™1 [159] contiene los antígenos de siete serotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F y 23F) con cada sacárido individualmente conjugado a CRMiS7 mediante aminación reductiva, con 2 < de cada sacárido por 0.5 mi de dosis (4 µ9 de serotipo 6B) , y con conjugados adsorbidos sobre un adyuvante de fosfato de aluminio. Las composiciones de la invención incluyen preferentemente al menos los serotipos 6B, 14, 19F y 23F. Los conjugados pueden ser adsorbidos sobre un fosfato de aluminio. Como una alternativa al uso de los antígenos sacáridos provenientes de neumococos, la composición puede incluir uno o más antígenos polipeptídicos . Las secuencias genómicas para varias cepas de neumococos son disponibles [160, 161], y pueden ser sometidas a vacunología inversa [162-165] para identificar los antigenos polipeptídicos adecuados [166, 167]}. Por ejemplo, la composición puede incluir uno o más de los siguientes antígenos: PhtA, PhtD, PhtB, P tE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl, Spl28, Spl30 y Spl30, como se define en la referencia 168. La composición puede incluir más de uno (por ejemplo 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ó 14) de estos antígenos. En algunas modalidades, la composición puede incluir antígenos sacaridos y polipeptídicos provenientes de neumococos. Estos pueden ser utilizados en mezcla simple, o el antígeno sacárido neumocócico puede ser conjugado a una proteína de neumococo. Las proteínas portadoras adecuadas para tales modalidades incluyen los antígenos listados en el párrafo previo [168] . Los antígenos de neumococo pueden ser liofilizados, por ejemplo junto con antígenos de meningococo y/o Hib.

Conjugación covalente Los sacáridos capsulares en las composiciones de la invención usualmente serán conjugados a una o varias proteínas portadoras. En general, la conjugación aumenta la inmunogenicidad de los sacáridos ya que ésta los convierte de antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, permitiendo de este modo el aprestamiento para la memoria inmunológica . La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas y es una técnica bien conocida [por ejemplo revisado en las referencias 169 y 142-150] . Las proteínas portadoras preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoide de la difteria o el toxoide del tétanos. El toxoide de la difteria CR 197 [170-172] es particularmente preferido. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen la proteína de la membrana exterior de N. meningitidis [173], péptidos sintéticos [174, 175] , proteínas de choque térmico [176, 177] , proteínas de pertussis [178, 179] , citocinas [180] , linfocinas [180], hormonas [180] , factores de crecimiento [180] , proteínas artificiales que comprenden epitopos de células T CD4+ humanas, múltiples, provenientes de diversos antígenos derivados de patógenos [181] , proteína D de H. influenzae [182, 183], proteína PspA de la superficie del neumococo [184] , proteínas de captación de hierro [185] , toxina A o B de C. difficile [186] , etc. Los portadores preferidos son toxoides de la difteria, toxoide del tétanos, proteína D de H. Influenzas y CRMi97. Dentro de una composición de la invención, es posible utilizar más de una proteína portadora, por ejemplo para reducir el riesgo de supresión del portador. De este modo, pueden ser utilizadas diferentes proteínas portadoras para diferentes serogrupos, por ejemplo sacáridos del serogrupo A pueden ser conjugados a CRM197, mientras que los sacáridos del serogrupo C pueden ser conjugados al toxoide tetánico. Es también posible utilizar más de una proteína portadora para un antígeno sacárido particular, por ejemplo sacáridos del serogrupo A pueden estar en dos grupos, con algunos conjugados a CRM197 y otros conjugados al toxoide tetánico. En general, no obstante, se prefiere utilizar la misma proteína portadora para todos los sacáridos. Una proteína portadora simple puede llevar más de un antígeno sacárido [187] . Por ejemplo, una proteína portadora simple puede tener conjugados a ésta los sacáridos de los serogrupos A y C. Para lograr esta meta, los sacáridos pueden ser mezclados antes de la reacción de conjugación. En general, no obstante, se prefiere tener conjugados separados para cada serogrupo. Los conjugados con una proporción sacárido :proteína (peso/peso) de entre 1:5 (por ejemplo proteína en exceso) y 5:1 (por ejemplo sacárido en exceso) son preferidos. Las proporciones entre 1:2 y 5:1 son las preferidas, y son más preferidas las proporciones entre 1:1.25 y 1:2.5. La protelna portadora en exceso puede ser preferida para MenA y MenC. Los conjugados pueden ser utilizados en conjunto con la proteína portadora libre [188] . Cuando una proteína portadora dada está presente en forma libre y conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada es preferentemente no mayor de 5% de la cantidad total de la proteína portadora en la composición como un todo, y más preferentemente a menos de 2% en peso. Cualquier reacción de conjugación adecuada puede ser utilizada, con cualquier ligador adecuado, donde sea necesario . El sacárido será típicamente activado o funcionalizado antes de la conjugación. La activación puede involucrar, por ejemplo, reactivos de cianilación tales como CDAP (por ejemplo tetrafluoroborato de l-ciano-4-dimetilamino-piridinio [189, 190, etc.]). Otras técnicas adecuadas utilizan carbodiimidas , hidrazidas, esteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S- HS, EDC, TSTU; ver también la introducción a la referencia 148) . Los enlaces vía un grupo enlazador pueden ser realizados utilizando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 191 y 192. Un tipo de enlace involucra la aminación reductiva del polisacárido, el acoplamiento del grupo amino resultante con un extremo de un grupo ligador de ácido adípico, y luego acoplando una proteína al otro extremo del grupo ligador de ácido adípico [146, 193, 194] . Otros ligadores incluyen B-propionamido [195] , nitrofenil-etilamina [196] , haluros de haloacilo [197] , enlaces glucosídicos [198] , ácido 6-aminocaproico [199] , ADH [200] , porciones de 4 a 12 átomos de carbono [201], etc. Como una alternativa al uso de un ligador, puede ser utilizado un enlace directo. Los enlaces directos a la proteina pueden comprender la oxidación del polisacárido, seguido por la aminación reductiva con la proteína, como se describe en, por ejemplo, las referencias 202 y 203. Se prefiere un proceso que involucra la introducción de grupos amino dentro del sacárido (por ejemplo mediante el reemplazo de los grupos =0 terminales con -NH2) seguido por derivatización con un diéster adípico (por ejemplo el diéster de N-hidroxisuccinimido del ácido adípico) y la reacción con la proteína portadora. Otra reacción preferida utiliza la activación de CDAP con un portador de proteína D, por ejemplo para MenA y MenC. Después de la conjugación, pueden ser separados los sacáridos libres y conjugados. Pueden existir muchos métodos adecuados, incluyendo la cromatografía hidrofóbica, ultrafiltración tangencial, diafiltración etc. [ver también las referencias 204 y 205, etc.] . Donde la composición de la invención incluye un oligosacárido conjugado, se prefiere que la preparación del oligosacárido preceda la conjugación.

Antígenos polipeptídicos del serogrupo B adicional alternativos La invención proporciona una composición en la cual, después de la administración a un sujeto, es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo en ese sujeto, en donde la respuesta de anticuerpo es bactericida contra dos o tres de las líneas hipervirulentas A4, ET-5 y la línea 3 de N. meningitidis serogrupo B. Aunque NadA, 741, 936, 953 y 287 son antígenos preferidos para lograr esta amplia protección, otros antígenos polipeptidicos MenB que pueden ser incluidos en las composiciones de la invención (opcionaluiente en combinación con uno o más de los cinco antígenos básicos) incluyen aquellos que comprenden una de las siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 650 de la ref . 8; SEQ ID NO: 878 de la ref. 8; SEQ ID NO: 884 de la ref. 8; SEQ ID NO : 4 de la ref. 9; SEQ ID NO: 598 de la ref. 10; SEQ ID NO: 818 de la ref. 10; SEQ ID NO: 864 de la ref. 10; SEQ ID NO: 866 de la ref. 10; SEQ ID NO: 1196 de la ref. 10; SEQ ID NO: 1272 de la ref. 10; SEQ ID NO: 1274 de la ref. 10; SEQ ID NO: 1640 de la ref. 10, SEQ ID NO: 1788 de la ref. 10; SEQ ID NO: 2288 de la ref. 10; SEQ ID NO: 2456 de la ref. 10; SEQ ID NO: 2554 de la ref. 10; SEQ ID NO: 2576 de la ref. 10; SEQ ID NO: 2606 de la ref. 10; SEQ ID NO: 2608 de la ref. 10; SEQ ID NO: 2616 de la ref. 10; SEQ ID NO: 2668 de la ref . 10; SEQ ID NO: 2780 de la ref. 10; SEQ ID NO: 2932 de la ref. 10; SEQ ID NO: 2958 de la ref. 10; SEQ ID NO: 2970 de la ref. 10; SEQ ID NO: 2988 de la ref. 10, o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos la cual: (a) tiene 50% o más de identidad (por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a dichas secuencias; y/o (b) comprende un fragmento de al menos n aminoácidos consecutivos provenientes de dichas secuencias, en donde n es 7 o más (por ejemplo 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos preferidos para (b) comprenden un epitopo proveniente de la secuencia relevante. Más de uno (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6) de estos polipeptidos pueden ser incluidos .

General El término "que comprende" significa "incluye" así como "que consiste" por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y. El término "aproximadamente" en relación a un valor numérico x significa, por ejemplo, x±10%. La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente" por ejemplo una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Donde sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención. Las referencias a una identidad porcentual de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos es el mismo en comparación a las dos secuencias. Este alineamiento y la homología porcentual o la identidad secuencial pueden ser determinados utilizando los programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo aquellos descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 206. Un alineamiento preferido es determinado por el . lgoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman utilizando una búsqueda de espacio vacío afín con una penalidad por espacio abierto de 12 y una penalidad por extensión de espacio vacío de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman es mostrado en la referencia 207. El término "alquilo" se refiere a los grupos alquilo en las formas lineal o ramificada. El grupo alquilo puede estar interrumpido con 1, 2 ó 3 heteroátomos seleccionados de -O-, -NH- o -S-. El grupo alquilo puede estar también interrumpido por 1, 2 ó 3 dobles y/o triples enlaces. No obstante, el término "alquilo" usualmente se refiere a los grupos alquilo que no tienen interrupciones de heteroátomo o interrupciones de doble o triple enlace. Donde se hace referencia a alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, se entiende que el grupo alquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 1 y 12 (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 átomos de carbono) . Similarmente , donde se hace referencia a alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, se entiende que el grupo alquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 1 y 6 (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6 átomos de carbono) . El término "cicloalquilo" incluye los grupos cicloalquilo, policicloalquilo y cicloalquenilo , asi como las combinaciones de éstos con grupos alquilo, tales como los grupos cicloalquilalquilo . El grupo cicloalquilo puede estar interrumpido con 1, 2 6 3 heteroátomos , seleccionados de -O-, -NH- o -S- . No obstante, el término "cicloalquilo" usualmente se refiere a los grupos cicloalquilo que no tienen interrupciones de heteroátomos. Los ejemplos de grupos cicloalquilo incluyen ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, ciclohexilmetilo y adamantilo. Donde se hace referencia a cicloalquilo de 3 a 12 átomos de carbono, se entiende que el grupo cicloalquilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 3 y 12 (por ejemplo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 átomos de carbono).. El término "arilo" se refiere a un grupo aromático, tal como fenilo o naftilo. Donde se hace referencia al arilo de 5 a 12 , se entiende que el grupo arilo puede contener cualquier número de átomos de carbono entre 5 y 12 (por ejemplo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 átomos de carbono) . El término " (aril de 5 a 12 átomos de carbono) (alquilo de 1 a 6 átomos de carbono) " se refiere a los grupos tales como bencilo, feniletilo y naftilmetilo . Los grupos protectores de nitrógeno incluyen los grupos sililo (tales como TMS, TES, TBS, TIPS) , derivados de acilo (tales como ftalimidas, trifluoroacetamidas , metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, t-butoxicarbonilo (Boc) , benciloxicarbonilo (Z o Cbz) , 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) , 2- (trimetilsilil) etoxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo (Troc) ) , derivados de sulfonilo (tales como ß-trimetilsililetansulfonilo (SES) ) , derivados de sulfenilo, alquilo de 1-12 átomos de carbono, bencilo, benzhidrilo, tritilo, 9-fenilfluorenilo, etc. Un grupo protector de nitrógeno preferido, es Fmoc. Las secuencias incluidas para facilitar la clonación o purificación, etc., no necesariamente contribuyen a la invención y pueden ser omitidas o eliminadas. Se apreciará que los anillos de azúcar pueden existir en la forma abierta y cerrada y que, mientras que son mostradas las formas cerradas en las fórmulas estructurales en la presente, las formas abiertas son también abarcadas por la invención.

MODALIDADES PARA LLEVAR A CABO LA INVENCION Proteína híbrida AG287-953 El ADN que codifica para la proteína 287 de la cepa 394/98 de meningococo del serogrupo B, y la proteína 953 de la cepa 2996 de meningococo del serogrupo B, fueron digeridas y ligadas, junto con una secuencia ligadora corta, para dar un plásmido que codifica para una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7. El plásmido fue transfectado dentro de E. coli y las bacterias se desarrollaron para expresar la proteína. Después del crecimiento adecuado, las bacterias fueron cosechadas y la proteína fue purificada. A partir del cultivo, las bacterias fueron centrifugadas y el botón celular fue homogeneizado en presencia de amortiguador de acetato 50 mM (pH 5) con una proporción en volumen de botón: amortiguador de 1:8. La lisis fue realizada utilizando un homogeneizador de alta presión (AVESTIN, 4 ciclos a 984.2 kg/cm2 (1400 psi) ) . Después de la lisis, fue agregada urea a una concentración final de 5 M, seguido por agitación por 1 hora a temperatura ambiente . El pH fue reducido de 6 a 5 utilizando amortiguador de acetato 200 mM (pH 4) + urea 5 M. La mezcla se centrifugó a 16800 g por 60 minutos a 2-8°C. El sobrenadante se recolectó y se filtró por SARTOBRAN P (0.45-0.22 µ??? SA TO IUS) . La proteína en el sobrenadante filtrado fue estable por >30 días a -20°C y por >15 días a 2-8°C. La proteína fue además purificada sobre una columna de intercambio catiónico (SPFF, Amersham Biosciences) con elución utilizando cloruro de sodio 350 mM + acetato 50 mM + urea 5 M pH 5.00. La mayoría de las impurezas estuvieron presentes en el flujo de lado a lado. Un lavado de pre-elución utilizando una menor concentración de cloruro de sodio (180 mM) eliminó ventajosamente dos proteínas de E. coli contaminantes . El material eluido fue ajustado a pH 8 (utilizando TRIS/HCl 200 mM + urea 5 M, pH 9) y posteriormente purificado sobre una columna de Q Sepharose HP (Amersham) con elución utilizando cloruro de sodio 150 mM + TRIS 20 mM/HCl pH 8.00 en urea 5 M. Nuevamente, el lavado de pre-elución con sal reducida (90 mM) fue útil para eliminar las impurezas. El material eluido y filtrado proveniente de la columna de Q HP fue diluido 1:2 utilizando PBS pH 7.00 (cloruro de sodio 150 mM + fosfato de potasio 10 mM, pH 7.00) y luego se diafiltró contra 10 volúmenes de PBS pH 7.00 mediante ultrafiltración tangencial. Al final de la diafiltración el material fue concentrado 1.6 veces hasta aproximadamente 1.2 mg/ml de proteínas totales. Utilizando una membrana de corte de 30,000 Da (membrana de celulosa regenerada de 50 cm2, Millipore PLCTK 30) fue posible dializar el material con un rendimiento de aproximadamente 90%.

Protexna híbrida 936-ÁG741 El ADN que codifica para la proteína 936 de la cepa 2996 de meningococo del serogrupo B y la proteína 741 de la cepa MC58 de meningococo del serogrupo B se digirió y se ligó, junto con una secuencia ligadora corta, para dar un plásmido que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8. El plásmido fue transfectado dentro de E. coli y las bacterias se desarrollaron para expresar la proteína. La proteína recombinante no fue secretada, pero permaneció soluble dentro de la bacteria. Después del desarrollo adecuado, las bacterias se centrifugaron para dar una pasta húmeda y se trataron como sigue : Homogeneización mediante el sistema de alta presión en presencia de fosfato de sodio 20 mM pH 7.00. Centrifugación y clarificación mediante filtración ortogonal . Cromatografía de columna catiónica (SP Sepharose Fast Flow) , con elución por cloruro de sodio 150 mM en fosfato de sodio 20 mM pH 7.00.

Cromatografía de columna aniónica (Q Sepharose XL) con cosecha de flujo de lado a lado. Cromatografía de columna hidrofóbica (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub) con elución por fosfato de sodio 20 mM, pH 7.00. Diafiltracion contra PBS pH 7.4 con un corte de 10 Kd. Esterilización por filtración final y almacenamiento a -20°C. La proteína en el material final fue estable por al menos 3 meses a -20°C y a 2-8°C.

Proteína NadA(NL)(c) El ADN que codifica para la proteína NadA proveniente de la cepa 2996 de meningococo del serogrupo B fue digerida para eliminar la secuencia que codifica para su extremo C, para dar un plásmido que codifica para la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1. El plásmido fue transfectado dentro de E. coli y las bacterias se desarrollaron para expresar la proteína. La proteína recombinante fue secretada hacia el medio de cultivo, y el péptido guía estuvo ausente en la proteína secretada (SEQ ID NO: 2) . El sobrenadante fue tratado como sigue: Concentración 7X y diafiltracion contra amortiguador TRIS 20 mM/HCl pH 7.6 por flujo cruzado UF (Corte de 30 Kd) . Cromatografía en columna aniónica (Q Sepharose XL) , con elución por cloruro de sodio 400 m en TRIS 20 mM/HCl pH 7.6. - Paso de cromatografía de columna hidrofóbica (Phenyl Sepharose 6 Fast Flow High Sub) , con elución por cloruro de sodio 50 mM en TRIS/HC1 pH 7.6. Cromatografía en columna de cerámica de hidroxilapatita (HA Macro. Prep) con elución por fosfato de sodio 200 mM pH 7.4. Diafiltración (corte de 30 Kd) contra PBS pH 7.4. Esterilización por filtración final y almacenamiento a -20°C. La proteína en el material final fue estable por al menos 6 meses a -20°C y a 2-8°C. La proteína NadA es susceptible a la degradación, y las formas truncadas de NadA pueden ser detectadas mediante transferencia de Western o mediante espectrometría de masa (por ejemplo mediante MALDI-TOF) indicando una pérdida de peso molecular de hasta 10 kDa. Los productos de degradación pueden ser separados de la NadA nativa mediante filtración en gel (por ejemplo utilizando la columna TSK 300SWXL, precolumna TSKSWXL, TOSOHAAS) . Tal filtración da tres picos: (i) un primer pico con tiempo de retención de 12.637 minutos y peso molecular aparente de 885.036 Da; (ii) tiempo de retención 13.871 minutos y peso molecular aparente de 530.388 Da; (iii) tiempo de retención de 13.871 minutos y peso molecular aparente de 530.388 Da. El análisis de dispersión de los tres picos revela valores de peso molecular reales de (i) 208500 Da, (ii) 98460 Da, (iii) 78760 Da. De este modo, el primer pico contiene agregados de NadA, y el tercer pico contiene productos de degradación. Ya que el peso molecular predicho de NadA(NL) (c) es de 34.113 Da, el pico (ii) contiene una proteina trimérica, la cual es el antigeno deseado.

Combinaciones antigénlcas Los ratones fueron inmunizados con una composición que comprende las tres proteínas y un adyuvante de hidróxido de aluminio. Para fines de comparación, las tres proteínas fueron también probadas de manera simple. Se utilizaron diez ratones por grupo. La mezcla fue capaz de inducir altos títulos bactericidas contra diversas cepas: Mezcla 32000 32000 65000 16000 260000 65000 >65000 8000 "-" indica que esta cepa no contiene el gen NadA Atendiendo a ratones individuales, la mezcla triple indujo títulos bactericidas altos y consistentes contra las tres cepas del serogrupo B de las cuales se derivan los antigenos individuales : Combinación y comparación con OMVs En experimentos adicionales, los antígenos con adyuvante (20 µg de cada antígeno por dosis) fueron administrados en combinación con 10 µg de OMVs preparados ya sea a partir de la cepa H44/76 (Noruega) o la cepa 394/98 (Nueva Zelanda) . Los controles positivos fueron el anticuerpo monoclonal anticapsular SEAM-3 para el serogrupo B o los sacáridos capsulares conjugados a CRM197 para otras cepas. Los resultados (títulos bactericidas) son mostrados en la Tabla 1. La mezcla casi siempre da mejores títulos que los OMVs simples y, además, la adición de la mezcla a los OMVs casi siempre aumenta significativamente la eficacia de los OMVs. Además, en muchos casos la mezcla de antígenos concuerda o excede con la respuesta observada con el control positivo .

Pruebas de línea hipervirulenta Los siguientes antígenos fueron probados contra una variedad de cepas del serogrupo B de una variedad de líneas hipervirulentas : (a) NadA(NL) (c) (b) AG287-953 (c) 936-AG741 (d) una mezcla de (a) , (b) y (c) (e) OMVs preparados a partir de la cepa H44/76 (Noruega) (f) OMVs preparados a partir de la cepa 394/98 (Nueva Zelanda) (g) Una mezcla de AG287 y (e) ( ) Una mezcla de (d) y (e) (i) Una mezcla de (d) y (f) Se utilizo SEAM-3 como un control positivo.

Los resultados fueron como sigue, expresados como el porcentaje de las cepas en la línea hipervirulenta indicada donde el título bactericida en suero excedió 1024: Contra cepas de referencia particular, los títulos bactericidas fueron como sigue: Las composiciones (d) , (h) e (i) por lo tanto inducen respuestas de anticuerpo bactericida contra una amplia variedad de cepas de meningococo del serogrupo B de dentro de las líneas hipervirulentas A4, ET-5 y la línea 3. Los títulos utilizando las composiciones (h) e (i) fueron en general más altos que con (d) , pero la cobertura de las cepas dentro de las líneas hipervirulentas A4, ET-5 y línea 3 no fueron mejores.

La cobertura de las cepas no tipificadas fue también alta con las composiciones (d) , (h) e (i) .

Análisis del dominio del extremo N de NadA La proteína NadA de N. meníngitidis, purificada, se sabe que se enlaza a las células epiteliales humanas [17] (por ejemplo células Chang, células HeLa, células Hep-2) , y E. coli recombinante que expresa NadA muestra un fenotipo adherente [18] . Estas E. coli son capaces de invadir las células epiteliales, y las E. coli de NadA+VB intracelular pueden ser detectadas en células Chang por inmunofluorescencia (después de la permeabilización de la membrana) y por microscopía electrónica. De este modo, se cree que NadA funciona como una adhesina y una invasina para células epiteliales. Con base en el análisis de la estructura secundaria, NadA madura ha sido subdividida en tres dominios putativos: un dominio globular N-terminal (aa 24-87), una región interna de hélice (aa 88-350) con alta propensión al enrollamiento, y un ancla de membrana C-terminal (aa 351-405) . El papel del dominio globular N-terminal en la interacción hospedero-célula fue investigado. Un gen nadA truncado que codifica para una proteína desprovista de los aminoácidos 30-87 fue clonado dentro del vector pET-21 (pET-NadAA30-87) y expresado en la cepa de E. coli BL21(DE3). Los aminoácidos 24-29 fueron retenidos para permitir el procesamiento del péptido guía y la maduración correcta de la proteína. El análisis de transferencia de Western y de FACS confirmó que NadAA30-87 fue expresado y formó oligómeros sobre la superficie de las células de E. coli, por ejemplo la supresión del dominio N-terminal no interfiere con la expresión, exportación y localización de la membrana de NadA. No obstante, la cepa de E. coli recombinante perdió completamente la capacidad para adherirse a las células epiteliales C ang. El dominio N-terminal está implicado de este modo en la actividad de la adhesina. Para investigar adicionalmente cuál parte del dominio N-terminal está involucrado en la interacción, la región fue adicionalmente dividida en tres sub-dominios putativos: los aminoácidos 24-42, que contienen una región de hélice predicha con residuos hidrofóbicos ; los aminoácidos 43-70, la parte interna sin una estructura secundaria definida, predicha; y los aminoácidos 71-87 que contienen otra estructura de hélice a predicha. Tres construcciones, cada codificando para una proteína suprimida de un sub-dominio simple, fueron generadas y luego introducidas dentro de E. coli BL21(DE3), obteniendo la siguiente cepa: BL21 (DE3 ) /pET-NadAÁ24-42 , BL21 (DE3) /pET-NadAA43-70 y BL21 (DE3) /pET-NadAA71-87. La localización superficial de los oligómeros fue confirmada por transferencia de Western y análisis de F7ACS, pero la adhesión a las células epiteliales Chang no fue mejor que la cepa control de E. coli BL21 (DE3 ) /pE . Estos resultados, confirmados también utilizando el análisis de microscopía de inmunofluorescencia, indican que el dominio N-terminal globular completo de NadA, es importante en la interacción con las células humanas .

Combinación con conjugados menlngocócicos y/o Hib La composición de MenB triple es combinada con una mezcla de conjugados de oligosacáridos para los serogrupos C, W135 e Y, para dar una vacuna que contiene los siguientes antigenos : Componente Cantidad por dosis de 0.5 mi Conjugado del serognipo C 10 µg de sacárido+ 12.5-24 µg de CRM197 Conjugado del serogrupo W135 10 µg de sacando + 6.6-20 µg de CRM197 Conjugado del serogrupo Y 10 µg de sacando + 6.6-20 µg CRM197 AG287-953 20 g del polipéptido 936-AG741 20 µg del polipéptido NadA 20 µg del polipéptido Se prepara una vacuna similar, incluyendo el conjugado de MenA (10 µg de sacárido + 12.5-33 µg de CRMi97) y/o un conjugado HbOC Hib (10 µg del sacárido + 2-5 g CRM197) .

Uso del sacárido MenA modificado El polisacárido capsular fue purificado a partir de MenA y fue hidrolizado para dar el oligosacárido MenA. Se hidrolizaron 2 g del polisacárido a 50 °C en amortiguador de acetato de sodio 50 rriM, pH 4.75, a una concentración del polisacárido de 10 mg/ml por aproximadamente 4 horas [135] .

Después de la hidrólisis, la solución se secó mediante evaporación rotatoria. El oligosacárido fue activado utilizando el siguiente Esquema de Reacción : El oligosacarido fue disuelto en D SO para dar una concentración de sacárido de 10 mg/ml. De acuerdo a una proporción molar del oligosacárido : siendo CDI 1:20, 21.262 g de CDI fueron luego agregados y la mezcla de reacción se agitó por 16 horas a temperatura ambiente. El compuesto MenA-CDI resultante fue purificado mediante precipitación selectiva en una mezcla de acetona:DMSO 80:20 (v/v) seguido por centrifugación. La eficiencia de la reacción de activación fue calculada como de aproximadamente 67.9% al determinar la proporción del imidazol libre al imidazol enlazado . En el segundo paso de reacción, el oligosacárido MenA-CDI fue solubilizado en DMSO a una concentración de sacárido de aproximadamente 10 mg/ml. De acuerdo a una proporción molar de la unidad MenA-CDI :DMA que es de 1:100, se agregaron 36.288 g de clorhidrato de dimetilamina 99% (por ejemplo R1 y 2 = Me) y la mezcla de reacción se agitó por 16 horas a temperatura ambiente . El producto de reacción fue liofilizado y resolubilizado en 10 mg/ml de solución acuosa. Para eliminar el agente de reacción de bajo peso molecular (en particular la dimetilamina (DMA) ) de la preparación de oligosacárido, se realizó un paso de diálisis a través de una membrana MWCO de 3.5 kDa (Spectra/Por^) . Se llevaron a cabo cuatro pasos de diálisis: (i) 16 horas contra 2 litros de cloruro de sodio 1 M (factor de diálisis 1:20), (ii) 16 horas contra 2 litros de cloruro de sodio 0.5 M (factor de diálisis 1.20), (iii) y (iv) 16 horas contra 2 litros de WFI (factor de diálisis 1:20). Para mejorar la purificación se realizó también un paso de diafiltración a través de una membrana MWCO de 1 kDa (centricon1) . El producto MenA-CDI-DMA purificado fue amortiguado a pH 6.5 en L-histidina 25 mM (Fluka^) . Para preparar los conjugados del sacárido MenA modificado (MenA-CDI-DMA) , el proceso completo fue como sigue: hidrólisis del polisacárido para dar fragmentos de oligosacáridos clasificación por tamaño de los fragmentos oligosacáridos - aminación reductiva de los grupos aldehido terminales sobre los oligosacáridos clasificados por tamaño protección de los grupos - H2 terminales por el grupo Fmoc antes de la reacción de CDI desprotección intrínseca de los grupos - ¾ durante la reacción de DMA activación de los grupos -NH2 terminales por SIDEA (ácido N-hidroxisuccinimido-adípico) enlace covalente a la proteína CBM1S7 El conjugado del oligosacárido MenA modificado es mucho más resistente a la hidrólisis que su contraparte natural a temperaturas elevadas. Después de 28 días a 37°C, por ejemplo, el porcentaje de sacárido liberado es de 6.4% para el oligosacárido modificado versus 23.5% para el antígeno natural. Además, los títulos inducidos por los oligosacáridos modificados no son significativamente menores que aquellos obtenidos utilizando las estructuras de azúcar nativa . El conjugado de enA modificado es combinado con los conjugados de MenC, MenW135 y MenY como un sustituto para el conjugado del oligosacárido no modificado. Esta mezcla tetravalente es mezclada con los tres polipéptidos MenB para dar una vacuna efectiva contra los serogrupos A, B, C, W135 e Y de N. meningitidis en una dosis simple.

Combinaciones de neumococos Las tres proteínas MenB combinadas son mezcladas con los conjugados del sacárido neumocócico para dar una concentración final de 2 µg/dosis de cada uno de los serotipos neumocócicos (doble para el serotipo 6B) . La vacuna reconstituida contiene de este modo los siguientes antígenos : Componente Cantidad por dosis de 0.5 mi Conjugado del serogrupo A 5 µg de sacárido + 6.25-16.5 µg de CRM197 Conjugado del serogrupo C 5 µg de sacárido+6.25-12.5 µg de CRM197 Conjugado del serogrupo W135 5 µg de sacárido + 3.3-10 µg CRM197 Conjugado del serogrupo Y 5 µg de sacárido + 3.3-10 ag CRM1 7 Conjugado de pneumococcus serotipo 4 2 µg de sacárido + 2.5 µg CRM197 Conjugado de pneumococcus serotipo 9V 2 µg de sacárido + 2.5 µg CRM197 Conjugado de pneumococcus serotipo 14 2 µg de sacárido + 2.5 µg CRM19 Conjugado de pneumococcus serotipo 18C 2 µg de sacárido + 2.5 µg CRM197 Conjugado de pneumococcus serotipo 19F 2 % de sacárido + 2.5 µg CRMi97 Conjugado de pneumococcus serotipo 23F 2 µg de sacárido + 2.5 µg CRM197 Conjugado de pneumococcus serotipo 6B 4 µg de sacárido + 5 µg CRM197 Se entenderá que la invención ha sido descrita por medio del ejemplo únicamente y pueden ser realizadas modificaciones mientras que se permanezca dentro del alcance y espíritu de la invención.

TABLA 1 REFERENCIAS (los contenidos de las cuales son incorporados por referencia en la presente) [I] Maiden et al. (1998) PNAS USA 95:3140-3145. [2] Armand etal . (1982) J. Biol . Stand. 10:335-339. [3] Cadoz et al. (1985) Vaccine 3:340-342. [4] Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775) : 1093-96 [5] Parkhill et al. (2000) Nature 404:502-506. [6] Tettelin et al (2000) Science 287:1809-1815. [7] WO00/66791. [8] W099/24578. [9] W099/36544. [10] WO99/57280. [II] WO00/22430. [12] WO00/66741. [13] Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820. [14] WO01/64920. [15] WO01/64922. [16] WO03/020756. [17] Comanducci et al. (2002) J. Exp. Med 195:1445-1454. [18] WO03/010194. [19] solicitud de patente del Reino Unido 0227346.4. [20] WO03/063766. [21] Masignani et al. (2003) J" Exp Med 197:789-799. [22] http: //neisseria . org/nm/typing/mlst/ [23] Pettersson et al. (1994) Microb Pathog 17 (6) :395-408. [24] Welsch et al . (2002) Thirteenth International Pathogenic Neisseria Conference, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Noruega; Sept . 1-6, 2002. Genome-derived antigen (GNA) 2132 elicits protective serum antibodies to groups B and C Neisseria meningitidis strains . [25] Santos et al. (2002) Thirteenth International Pathogenic Neisseria Conference, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norway; Sept. 1-6, 2002. Serum bactericidal responses in rhesus macaques immunized with novel vaccines containing recombinant proteins derived from the geno e of N. meningitidis . [26] WO03/009869. [27] WO01/30390. [28] Almeida & Alpar (1996) J. Drug Targeting 3:455-467. [29] Agarwal & Mishra (1999) Indian J Exp Biol37: 6-16. [30] WOOO/53221. [31] Jakobsen et al. (2002) Infect Im un 70:1443-1452. [32] Wu et al. (1997) J Infect Dis 175:839-846. [33] Bergquist et al. (1998) APMS 106:800-806. [34] Baudner et al. (2002) Jnfect Immun 70:4785-4790. [35] Ugozzoli eta . (2002) J Infect Dis 186:1358-1361. [36] Paoletti et al. (2001) Vaccine 19:2118-2126. [37] WO00/56365. [38] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472. [39] Vaccine Design. (1995) eds . Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plermm. [40] O00/23105. [41] W090/14837. [42] Patente de los Estados Unidos 5,057,540. [43] 096/33739. [44] EP-A-0109942. [45] 096/11711. [46] WO00/07621. [47] Barret di. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271. [48] Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338. [49] Niikura et al. (2002) Virology 293 :273-280. [50] Lenzetal. (2001) J Inm ol 166:5346-5355. [51] Pinto et al. (2003) J Infect Dis 188:327-338. [52] Gerber et al. (2001) Viro! 75:4752-4760. [53] O03/024480 [54] O03/024481 [55] Gluck et al. (2002) Vaccine 20:B10-B16. [56] ??-?-0689454. [57] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278. [58] Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229. [59] Meraldi et al. (2003) Vaccine 11:2485-2491. [60] Pajak et al. (2003) Vaccine 21:836-842. [61] Kandimalla et al. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400. [62] WO02/26757. [63] W099/62923. [64] Krieg (2003) Nature Medicine 9 : 831-835. [65] McCluskie et al (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185. [66] WO98/40100. [67] Patente de los Estados Unidos 6,207,646. [68] Patente de los Estados Unidos 6,239,116. [69] Patente de los Estados Unidos 6,429,199. [70] Kandimalla et al (2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3) : 654-658. [71] Blackwell et al. (2003) J Immunol 170:4061-4068. [72] Krieg (2002) Trends Immumol 23:64-65. [73] W001/95935. [74] Kandimalla et al (2003) BBRC 306 : 948-953. [75] Bhagat et al. (2003) BBRC 300:853-861. [76] WO03/035836. [77] W095/17211. [78 W098/42375. [79 Beignon etal . (2002) Infect Immun 70:3012-3019. [80 Pizza etal. (2001) Vaccine 19:2534-2541. [81 Pizza et al (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461. [82 Scharton-Kersten etal. (2000) Infect Immun 68:5306-53 [83 Ryan et al (1999) Infect I mun 67:6270-6280. [84 Partidos et al . (1999) JmmunolLett 67:209-216. [85 Peppoloni et al (2003) Expert Rev Vaccines 2:285-293. [86 Pine et al (2002) J" Control Reléase 85:263-270. [87 Domenighini et al (1995) MolMicrobiol 15:1165-1167. [88 W099/40936. [89 W099/44636. [90] Singh et al (2001) J Cont Reléase 70:267-276. [91] WO99/27960. [92] Patente de los Estados Unidos 6,090,406 [93] Patente de los Estados Unidos 5,916,588 [94] EP-A-0626169. [95] W099/52549. [96] W001/21207. [97] WO01/21152. [98] Andrianov et al. (1998) Biomaterials 19:109-115. [99] Payne et al (1998) Adv Drug Delivery Review 31 : 185-196 , [100] Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27 : 571-577. [101] Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218. [102] W099/11241. [103] O94/00153. [104] W098/57659. [105] Solicitudes de patente Europeas 0835318, 0735898 y 0761231. [106] W096/37222; Patente de los Estados Unidos 6,333,036.. [107] Costantino et al (1992) Vaccine 10:691-698. [108] WO03/007985. [109] Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188. [110] I arson (1995) APMS 103:321-326. [111] Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 & 79-80. [112] Vaccines (1988) eds . Plotkin & ortimer. ISBN 0-7216-1946-0. [113] Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70. [114] Gustafsson et al (1996) N. Engl J. Med. 334:349-355. [115] Rappuoli etal . (1991) 27572079:232-238. [116] O01/52885. [117] Fukasawa et al (1999) Vaccine 17:2951-2958. [118] Rosenqvist et al. (1998) Dev. Biol Stand. 92:323-333. [119] Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308. [120] Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126. [121] Robinson & Torres (1997) Seminare in Immunology 9:271-283. [122] Donnelly efc al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648. [123] Scott-Taylor & Dalgleish (2000) Expert Opin Investig Drugs 9:471-480. [124] Apostolopoulos & Plebanski (2000) Curr Opin Mol Ther 2:441-447. [125] lian (1999) Curr Opin Mol Ther 1:116-120. [126] Dubensky et al (2000) Mol Med 6:723-732. [127] Robinson & Pertmer (2000) Adv Virus Res 55:1-74. [128] Donnelly et al. (2000) Am J Respir Crit Care Med 162 {4 Pt 2) :S190-193. [129] Davis (1999) M. Sinai J. Med. 66:84-90. [130] Charalambous & Feavers (2001) J Med Microbiol 50:937-939. [131] Westerink (2001) Int Rev Immunol 20:251-261. [132] Grothaus et al. (2000) Vaccine 18:1253-1263. [133] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49. [134] Ravenscroft et al (1999) Vaccine 17:2802-2816. [135] Costantino et al (1999) Vaccine 17:1251-1263. [136] 003/080678. [137] Nilsson & Svensson (1979) Carbohydrate Research 69: 292-296) [138] Frash (1990) p.123-145 of Advances in Biotechnological Processes vol . 13 (eds. Mizrahi & Van Wezel) [139] Inzana (1987) Infect. Immun. 55:1573-1579. [140] Kandil et al (1997) Glycoconj J 14:13-17. [141] Berkin at al. (2002) Chemistry 8:4424-4433. [142] Lindberg (1999) Face/we 17 Suppl 2:828-36. [143] Buttery & Moxon (2000) J R Coll Physicians Land 34:163-168. [144] Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-33, vii. [145] Goldblatt (1998) J. Med Microbiol. 47:563-567. [146] Patente Europea 0477508. [147] Patente de los Estados Unidos 5 ,30 , 492. [148] W098/42721. [149] Dick et al. in Con úgate Vaccines (eds . Cruse et al.) Karger, Basel, 1989, 10:48-114. [150] Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) ISBN: 0123423368. [151] Kanra et al. (1999) The Turkish Journal of Paediatrics 42 :421-427. [152] Ravenscroft et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103: 35-47. [153] WO97/00697. [154] WO02/00249. [155] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332. [156] Rubín (2000) Pediatr Clin North Am 47 : 269-285 , v. [157] Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207. [158] Zielen et al. (2000) Infect. Immun. 68:1435-1440. [159] Darkes & Plosker (2002) Paediatr Drugs 4:609-630. [160] Tettelin et al. (2001) Science 293:498-506. [161] Hoskins et al (2001) J Bacterial 183:5709-5717. [162] Rappuoli (2000) Curr Opin Microbiol 3:445-450 [163] Rappuoli (2001) Vaccine 19:2688-2691. [164] Masignani et al. (2002) Expert Opin Biol Ther 2:895-905. [165] Mora et al. (2003) Drug Discov Today 8:459-464. [166] Wizemann et al. (2001) Infect Iitsmun 69:1593-1598. [167] Rigden et al. (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:143-168. [168] O02/22167. [169] Ramsay et al. (2001) Lancet 357 (9251) : 195-196. [170] Anonymous (Jan 2002) Research Disclosure, 453077. [171] Anderson (1983) Infect Immun 39 (1) :233-238. [172] Anderson et al. (1985) J Clin Invest 76 (1) :52-59. [173] EP-A-0372501. [174] EP-A-0378881. [175] EP-A-0427347. [176] W093/17712 [177] WO94/03208. [178] 098/58668. [179] EP-A-0471177. [180] WO91/01146 [181] Falugi et al. (2001) Eur J Immmol 31:3816-3X24. [182] EP-A-0594610. [183] WOOO/56360. [186] WOOO/61761. [187] O99/42130 [188] WO96/40242 [189] Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198. [190] O95/08348. [191] Patente de los Estados Unidos 4,882,317 [192] Patente de los Estados Unidos 4,695,624 [193] Porro et al. (1985) Mol Imwmol 22: 907-919. s [194] EP-A-0208375 [195] WOOO/10599 [196] Gever et al. ed. Microbiol . Immunol, 165: 171-288 (1979) . [197] Patente de los Estados Unidos 4,057,685. [198] Patente de los Estados Unidos 4,673,574; 4,761,283; 4,808,700. [199] Patente de los Estados Unidos 4,459,286. [200] Patente de los Estados Unidos 4,965,338 [201] Patente de los Estados Unidos 4,663,160. [202] Patente de los Estados Unidos 4,761,283 [203] Patente de los Estados Unidos 4,356,170 [204] Lei et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103:259-264. [205] WOOO/38711; Patente de los Estados Unidos 6,146,902. [206] Current Protocols ?? Molecular Biology (F.M. Ausubel et al, eds., 1987) Supplement 30. [207] Smith & Waterman (1981) Adv. Appl . Math 2: 482-489.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (31)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una composición la cual, después de la administración a un sujeto, es capaz de inducir una respuesta de anticuerpo en ese sujeto, caracterizada porgue la respuesta de anticuerpos es bactericida contra dos o más líneas hipervirulentas A4, ET-5 y la línea 3 de N. meningitidis serogrupo B.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende de 2 a 10 polipéptidos, cada uno teniendo diferentes secuencias de aminoácidos .

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada porque los componentes que dan origen a la respuesta de anticuerpo bactericida son obtenidos mediante expresión recombinante .

4. Una composición, caracterizada porque comprende cinco antígenos meningocócicos : (1) una proteína "MadA" ; (2) una proteína "741"; (3) una proteína "93S"; (4) una proteína "953"; y (5) una proteína "287".

5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la proteína NadA tiene 85% o más de identidad a la SEQ ID NO : 2.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la proteina NadA comprende la SEQ ID NO: 2.

7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a la 6, caracterizada porque la proteína 741 tiene 85% o más de identidad a la SEQ ID NO: 3.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la proteína 741 comprende la SEQ ID NO:3.

9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, caracterizada porque la proteína 936 tiene 85% o más de identidad a la SEQ ID NO: 4.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la proteína 936 comprende la SEQ ID NO: 4.

11. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, caracterizada porque la proteína 953 tiene 85% o más de identidad a la SEQ ID NO: 5.

12. La composición de · conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la proteína 953 comprende la SEQ ID NO: 5.

13. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, caracterizada porque la proteína 287 tiene 85% o más de identidad a la SEQ ID WO: 6.

14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la proteina 287 comprende la SEQ ID NO: 6.

15. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, caracterizada porque al menos dos de los antígenos (1) al (5) son expresados como una cadena polipeptídica simple .

16. La composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la composición comprende un polipéptido que incluye un par de antígenos dentro de una cadena polipeptídica simple seleccionados del grupo que consiste de: NadA y 741; NadA y 936; NadA y 953; NadA y 287; 741 y 936; 741 y 953; 741 y 287; 936 y 953; 936 y 287; 953 y 287.

17. La composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque la composición comprende un polipéptido de la fórmula NH2-A- [-X-L-]n-B-COOH, en donde: X es una secuencia de aminoácidos de uno de los cinco antígenos (1) al (5) ; L es una secuencia de aminoácidos ligadora opcional; A es una secuencia de aminoácidos N-terminal, opcional; B es una secuencia de aminoácidos C-terminal; y n es 2, 3, 4 ó 5.

18. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque n es 2 , Xx es una proteína 936 y X2 es una proteína 741.

19. La composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque n es 2, x es una proteína 287 y X2 es una proteína 953.

20. La composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende una proteína que comprende la SEQ ID NO: 7.

21. La composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende una proteína que comprende la SEQ ID NO: 8.

22. La composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende además los antígenos sacáridos provenientes de los serogrupos Y, W135, C y (opcionalmente) A de meningococcus.

23. La composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende además un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae tipo B.

24. La composición de conformidad con la reivindicación 22 o la reivindicación 23, caracterizada porque el antígeno sacárido es conjugado a un portador seleccionado de: toxoide de la difteria, toxoide tetánico, CRM197 o proteína D de H. influenzae.

25. La composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende además un antígeno de Streptococcus pneumoniae.

26. La composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque es para uso como un medicamento.

27. El uso de una composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad provocada por una Neisseria.

28. Un método para producir una respuesta de anticuerpo en un mamífero, caracterizado el método porque comprende el paso de administrar una cantidad efectiva de una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26.

29. Un polipéptido, caracterizado porque tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs : 1 a 8.

30. U proceso para purificar NadA soluble a partir de un medio de cultivo, caracterizado el proceso porque comprende los pasos de: la concentración y diafiltración contra un amortiguador mediante ultrafiltración; cromatografía de columna aniónica; cromatografía de columna hidrofóbica; cromatografía de columna de cerámica de hidroxiapatita; diafiltración contra un amortiguador; y esterilización por filtración.

31. Un proceso para purificar una proteína híbrida 936-ÁG741 a partir de una bacteria, caracterizado el proceso porque comprende los pasos de: homogeneización; centrifugación; cromatografía de columna catiónica; cromatografía de columna aniónica; cromatografía de columna hidrofóbica; diafiltración contra un amortiguador; y esterilización por filtración.