CN1198937C - 利用辅助肽制造肽的方法 - Google Patents

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Abstract

在通过基因重组制造具有生物学活性的目的肽过程中，其特征是在目的肽上附加了辅助肽后使其表达。通过这样操作调整了等电点，可以防止回收和纯化工序中的凝集，提高离子交换层析的回收率，提高在使目的肽在以与其它肽形成的融合蛋白形式表达的情况下通过酶裂解使目的肽游离之际酶反应时的该融合蛋白的溶解度，提高在目的肽必须通过酶修饰的情况下酶反应时的该肽的溶解度，这样以来可以使目的肽的纯化效率以及收率提高。

Description

利用辅助肽制造肽的方法
技术领域
本发明涉及利用基因重组技术的肽的制造方法。
背景技术
许多生理活性肽都可以利用基因重组技术以微生物或动物细胞等作为宿主来生产。作为目的肽的生产方法已知有使目的肽分泌到细胞外的方法，有在细胞内从目的肽的N末端开始使其表达的所谓直接表达法，以及在目的肽的N末端或C末端附加了保护肽的融合蛋白表达方法等。目的肽可以通过上述等方法在细胞内外表达，经化学裂解或酶裂解以及修饰，使目的肽生成，再通过纯化工序纯化，得到目的肽的方法制造。
一般来说，在生产低分子量的肽时，为了避免存在于细胞内的蛋白水解酶水解目的肽，可以使用上述的融合蛋白表达法。这种情况下，都是通过如下方法实施的，即在目的肽和保护肽之间附加上一个设计成利用化学裂解或酶裂解可以使目的肽切去的断裂部位区，然后使这样的融合蛋白在细胞内表达，再利用化学裂解或酶裂解将目的肽从融合蛋白上切下来，经沉淀和层析工序对目的肽进行分离纯化。
象降(血)钙素那样的C末端被酰胺化了的肽作为目的肽时，将该肽氨基酸序列的C末端部位附加了甘氨酸的肽作为融合蛋白的一部分使其表达，通过蛋白水解酶使附加了甘氨酸的目的肽从融合蛋白中切出后，再使作为修饰酶的酰胺化酶作用，生成酰胺化肽，经纯化工序就可生产出酰胺化目的肽。
然而，按照工业规模希望生产各种各样的肽时，有时在各种裂解以及修饰反应条件下会出现目的肽的溶解性和凝胶化问题，以及在柱层析过程中添加到柱子上的样品浓度、以及样品从柱子上洗脱出来的条件和洗脱后的稳定性等有关的问题，其原因大多是由目的肽的物理化学上的诸性质引起的。
例如，作为目的肽可以举出象类似人的胰高血糖素样肽-1(Glucagon-Like Peptide-1，Bell GI等，自然(Nature)，Vol.304，p368-371，1983，以下称之GLP-1)以及具有促胰岛素释放活性的GLP-1的衍生物(以下称之GLP-1衍生物)。GLP-1是由来自前胰高血糖素原的37个氨基酸残基组成的肽，前胰高血糖素原经加工后，合成了GLP-1的N末端的6个氨基酸缺失的GLP-1(7-37)以及GLP-1(7-36)的C末端被酰胺物质修饰的GLP-1(7-36)NH2(Mojsow，S.等临床研究杂志(J.Clin.Invest.)Vol.79，p616-619，1987)。这些肽激素(即GLP-1和GLP-1衍生物)由于具有作用于胰脏的β细胞促进胰岛素分泌的作用等，近年来从它的药理作用显示出作为糖尿病治疗药的可能性(Gutniak MK，等新英格兰医学(New England Medicine)，Vol.326，p1316-1322，1992，Nathan DM，等糖尿病治疗(Diabetes Care)，Vol.15，p270-275，1992)。
作为上述肽的制造方法可以考虑通过基于上述那样的以往技术，大肠杆菌等作为宿主的融合表达法来制造的方法。例如GLP-1(7-37)，可以使其作为借助能从融合蛋白中利用化学裂解或酶裂解将GLP-1(7-37)切出来的断裂部位区在GLP-1(7-37)的N末端或C末端部位附加了保护肽的融合蛋白表达，然后利用化学裂解或酶裂解将GLP-1(7-37)从融合蛋白中切出来的方法制造。而GLP-1(7-36)NH2可以通过在上述制造工序中加上修饰反应工序就可以制造了。即为了进行酰胺化反应，作为酰胺化酶的底物的GLP-1(7-37)可以象上述那样作为融合蛋白表达(此时GLP-1(7-37)可以看作是GLP-1(7-36)NH2制造过程中的中间肽)，然后利用化学裂解或酶裂解将GLP-1(7-37)从融合蛋白中切出来，利用酰胺化酶对得到的GLP-1(7-37)进行酰胺化修饰，可以制造出目的GLP-1(7-36)NH2。
然而，利用上述方法，在制造作为目的肽的具有促进胰岛素释放活性的GLP-1衍生物时也由于在制造过程中出现不令人满意的问题，因此在工业水平上还未确立产品能够廉价供给的制造方法，人们期待着其制造方法的确立。
例如作为目的肽GLP-1(7-37)的制造方法，可以象已叙述的那样利用常规方法使保护肽与GLP-1(7-37)构成的融合蛋白表达，然后从该融合蛋白中直接将GLP-1(7-37)切出的方法制造，该制造方法的纯化工序可以利用(1)通过酶将GLP-1(7-37)从融合蛋白中切出，(2)层析工序的方法。然而由于GLP-1(7-37)在纯化中容易发生凝胶化或凝集，有时会出现回收率非常低，树脂不能再生等由于物理化学性质引起的制造工序上的问题。一旦发生凝胶化时，虽然也可以在pH10以上溶化后进行纯化，但会出现令人不满意的修饰物或立体结构变化那样的问题(Senderoff RI，等，药物科学杂志(J PharmSci)，Vol.87，p183-189，1998)。
而酰胺化肽GLP-1(7-36)NH2作为目的肽时，有时会出现与酰胺化修饰反应有关的问题。即酰胺化酶反应的最适pH虽然是弱酸性到中性附近，但GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2的理论上的等电点却分别是pI＝5.5和pI＝7.5。因此在酰胺化酶的最适pH条件下，对GLP-1(7-37)进行酶反应时，由于反应液的pH接近作为底物的GLP-1(7-37)的等电点，所以人们认为容易形成GLP-1(7-37)的等电点沉淀。
而且因GLP-1(7-37)沉淀，生成的GLP-1(7-36)NH2也共沉淀，也存在着酶反应不能充分进行的可能性，出现制造工序上的问题。而GLP-1(7-36)也是在进行处理(handling)过程中的柱层析工序中发生凝集，容易在柱子中发生凝胶化的肽，所以纯化上有时也出现问题。即即使GLP-1衍生物也要考虑上述由于物理化学的性质引起的制造上的问题。
象上述那样的问题，当工业规模制造GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)NH2和GLP-1衍生物时，由于该目的肽本身的物理化学的性质会发生工业制造上的问题，成为回收率以及工程管理进而制造成本上等方面中的非常严重的问题。
发明的公开
本发明的目的在于提供在利用基因重组技术工业规模高效生产目的肽时，改善由于目的肽本身具有的物理化学性质而产生的问题(例如该肽的生产工序中由于化学反应或酶促反应的处理而出现的问题或纯化过程中出现的低溶解性和凝胶化问题)，有效生产目的肽的方法。
而所谓本发明涉及的目的肽不仅是指最终希望得到的肽，也包括其制造过程中的必需的制造过程的中间肽。
本发明人为了避免先前叙述的问题，通过在目的肽附加上辅助肽来消除目的肽具有的问题，找出了更有效制造目的肽的方法。即，本发明涉及的肽的制造方法是制造具有生物学活性的目的肽的方法，是包括如下一些工序的制造方法(图1)。
工序(1)：利用具有编码附加了辅助肽的目的肽或者编码在附加了辅助肽的目的肽基础上又进一步附加了保护肽的融合蛋白的碱基序列的表达载体转化细胞，然后培养该转化细胞，从该培养物中获得附加了上述辅助肽的目的肽或上述融合蛋白的工序，在(a)所述辅助肽与目的肽之间、以及(b)保护肽、与构成附加了辅助肽的目的肽的该辅助肽或该目的肽之间存在断裂位点；
工序(2)：当从工序(1)中得到融合蛋白时，从该融合蛋白中切出分离附加了辅助肽的目的肽与保护肽，按照要求进一步进行纯化的工序；
工序(3)：是在对目的肽必须修饰时，对工序(1)或工序(2)得到的附加了辅助肽的目的肽实施修饰反应的工序；
工序(4)：从工序(1)、工序(2)或工序(3)得到的附加了辅助肽的目的肽中将辅助肽和目的肽切开，按照需要进一步进行纯化的工序，以及
工序(5)：对工序(4)中得到的目的肽进行纯化的工序。
本发明的另一个目的是提供一种糖尿病治疗用医药组合物，其以通过上述方法得到的具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物作为有效成分。
本发明进一步提供了含有编码在附加了辅助肽的目的肽基础上又进一步附加了保护肽的融合蛋白的碱基序列的表达载体，其中所述融合蛋白在保护肽和辅助肽之间具有断裂位点，在辅助肽和目的肽之间具有断裂位点。
本发明进一步提供了被含有编码在附加了辅助肽的目的肽基础上进一步附加了保护肽的融合蛋白的碱基序列的表达载体转化了的原核细胞或真核宿主细胞。
附图的简单说明
图1是表示利用辅助肽的目的肽的制造方法的梗概图。
图2是表示pG117S4HR6GLP-1的制备方法的图。
图3是表示pGP117S4HompRHKR的制备方法的图。
图4是表示pGP117S4HompRHPR的制备方法的图。
图5是表示pGP97ompPR的制备方法的图。
图6是表示在pGP97ompPR的制备中利用的寡核苷酸和引物的图。
图7是表示被pGP97ompPR编码的融合蛋白(pG97ompPR)的氨基酸序列图。下划线表示来自GLP-1(7-37)的氨基酸序列，双下划线表示辅助肽的序列。↓表示可被大肠杆菌0mpT蛋白酶裂解部位，双下划线后的箭头表示可被Kex2蛋白酶裂解的部位。
图8是表示被pG97ompPR编码的融合蛋白(G97ompPR)的DNA碱基序列图，从第1个碱基A到第462个碱基T之间的区域是编码与GLP-1(7-37)有关的融合蛋白的区域。Lac PO表示大肠杆菌乳糖操纵子的启动子/操纵基因区。
图9是表示生产菌的培养和融合蛋白(G97ompPR)的表达的电泳图的照片，图中给出了培养过程中采集的a到e样品的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。图中的箭头指示融合蛋白带。
图10是表示利用包涵体内在的大肠杆菌0mpT蛋白酶裂解融合蛋白的分析结果的图。
图11是表示pG117S4HR6GLP-1编码的融合蛋白的氨基酸序列图。图中下划线表示来自GLP-1(7-37)的氨基酸序列，双下划线表示来自辅助肽的氨基酸序列。
图12是表示pGP117S4HompRHKR编码的融合蛋白的氨基酸序列图。图中下划线表示来自GLP-1(7-37)的氨基酸序列，双下划线表示来自辅助肽的氨基酸序列。
图13是表示pGP117S4HompRHPR编码的融合蛋白的氨基酸序列图。图中下划线表示来自GLP-1(7-37)的氨基酸序列，双下划线表示来自辅助肽的氨基酸序列。
图14表示从SP琼脂糖大颗粒柱洗脱出RHHGP[G]的洗脱图，洗脱开始位置用↓表示，图中给出了合并收集的级分。吸光度在280nm测定。
图15是表示通过Kex2蛋白酶从RHHGP[G]切出GLP-1(7-37)的工序中的各个纯化工序的分析图，A表示Kex2蛋白酶裂解前，B表示Kex2蛋白酶裂解后，C表示PorosR2后的反相合并收集级分，1代表RHHGP[G]，2代表GLP-1(7-37)。
图16表示RHHGP[G]的酰胺化反应与pH的依赖关系图。
图17是在酰胺化反应中，通过离子交换HPLC测定的RHHGP[G]转换为RHHGP-1随时间的变化过程图，1代表RHHGP[G]，2代表RHHGP-1。吸光度在280nm测定。分析条件如下所示。
柱子：Poros S/H 4.6mm I.D.×50mm
流速：1.6ml/min
溶液A：30mM BR缓冲液pH6.0
溶液B：30mM BR缓冲液pH9.0
平衡液：溶液A
洗脱：溶液B 0％→100％直线pH梯度
图18是表示RHHGP-1作为底物的Kex2蛋白酶加工反应依赖于pH的关系图。
图19是表示利用microprep High-S纯化GLP-1(7-36)NH2时的洗脱图以及形成的pH梯度。吸光度在280nm测定。
图20是表示利用microprep High-S除去杂质时的示意图，A表示向柱子加样，B表示洗脱后的HPLC分析图，1代表GLP-1(7-37)，2代表GLP-1(7-36)NH2。吸光度在280nm测定。
图21表示经过OmpT第1次裂解，Kex2蛋白酶的第2次裂解后制造GLP-1(7-36)NH2时的各个纯化工序标准样品的HPLC分析图的归纳图。A表示OmpT反应后，B表示SP sepharose后，C表示Kex2反应后，D表示microprep High-S后，E表示PorosR2后的反相HPLC图，而1代表GP97ompPR，2代表保护肽，3代表RHHGP[G]，4代表RHHGP-1，5代表GLP-1(7-36)NH2。吸光度在280nm测定。
分析条件如下所示。
柱子：YMC Protein RP 4.6mm I.D.×150mm
流速：1.0ml/min
溶液A：0.1％TFA/10％乙腈
溶液B：0.1％TFA/60％乙腈
平衡液：溶液A
洗脱：溶液B 44％→74％/12分钟
图22是表示RHHGP[G]，RHHGP-1，GLP-1(7-36)和GLP-1(7-36)NH2的溶解度依赖于pH的关系图。
图23是表示Tween 80对RHHGP[G]，RHHGP-1和GLP-1(7-36)NH2的凝集抑制效果图，A表示Tween 80对RHHGP[G]和RHHGP-1的凝集抑制，B表示Tween 80对GLP-1(7-36)NH2的凝集抑制。
图24表示NaCl和温度对GLP-1(7-36)NH2的凝集抑制效果图，C表示NaCl对GLP-1[G]凝集抑制，D表示温度对对GLP-1(7-36)NH2的凝集抑制。
发明的实施方案
本发明涉及的辅助肽是为了避免由于目的肽本身的物理化学的性质产生的工业制造上的问题而采用的肽。在由于目的肽本身的物理化学的性质产生的工业制造上的问题之中，该肽的制造工序中的化学反应或酶促反应的处理以及纯化上的问题，例如各种裂解和修饰反应条件下的目的肽的溶解性和凝胶化问题，还有柱层析工序中的加到柱子上的样品浓度、柱子的洗脱条件和洗脱后的稳定性等有关问题特别引入注目。
该辅助肽可以根据目的肽具有的物理化学的性质适当地制备，例如目的肽的等电点为中性～弱酸性，而且制造工序中的最适pH也是中性～弱酸性，若是在这样的pH条件下，目的肽的溶解度过低时，希望设计辅助肽以便使附加了辅助肽的目的肽的等电点(pI)处于8～12范围内，最好在设计辅助肽后使等电点处于9～11(该辅助肽无论附加在目的肽的N末端还是C末端都可以)。该辅助肽的长度(大小)最好是具有5～50个氨基酸残基的片段，更理想的是含有5～30个氨基酸残基以下的片段，但至少含有一个以上的碱性氨基酸或酸性氨基酸。
利用本发明可以生产的目的肽并没有特别限定，除了上述的GLP-1衍生物以外也非常适合作为含有200个氨基酸残基以下的氨基酸序列的肽的制造方法。象那样的肽的例子可以举出如下一些：促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic hormone)、肾上腺髓质素(Adrenomedullin)、支链淀粉(Amylin)、血管紧张素(Angiotensin)I、血管紧张素(Angiotensin)II、血管紧张素(Angiotensin)III、A型钠尿肽(A-type NatriureticPeptide)、B型钠尿肽(B-type Natriuretic Peptide)、缓激肽(Bradykinin)、大胃泌素(Big Gastrin)、降钙素基因关连肽(Calcitonin gene related peptide)、缩胆囊素(Cholecystokinin)、促皮质素释放因子(CorticotropinReleasing Factor)、皮质抑素(Cortistatin)、C型钠尿肽(C-type Natriuretic Peptide)、防卫素(Defesin)1、Δ·睡眠诱导肽(Delta Sleep-Inducing Peptide)，强啡肽(Dynorphin)、快反应型弹性蛋白酶抑制肽(Elafin)、α-内啡肽(α-Endorphin)、β-内啡肽(β-Endorphin)、γ-内啡肽(γ-Endorphin)、内皮素-1(Endothelin-1)、内皮素-2(Endothelin-2)、内皮素-3(Endothelin-3)、大内皮素-1(Big Endothelin-1)、大内皮素-2(Big Endothelin-2)、大内皮素-3(Big Endothelin-3)、脑啡肽(Enkephalin)、促生长激素神经肽(Galanin)、大胃泌素(Big Gastrin)、胃泌素(Gastrin)、GIP(抑胃多肽GastricInhibitory Polypeptide)、胃泌素释放多肽(Gastrin ReleasingPetide)、胰高血糖素(Glucagon)、类胰高血糖素样肽-2(Glucagon-like Peptide-2)，生长激素释放因子(GrowthHormone Releasing Factor)、生长激素(Growth Hormone)、鸟苷蛋白(Guanylin)、尿鸟苷蛋白(Uroguanylin)、Histatin 5、胰岛素(Insulin)、交联肽(Joining Peptide)、黄体激素释放激素(Luteinizing Hormone Releasing Hormone)、黑色细胞刺激激素(Melanocyte Stimulating Hormone)、Midkine、胃动素(Motilin)、神经激肽A(Neurokinin A)、神经激肽B(Neurokinin B)、神经调节肽B(Neuromedin B)、神经调节肽C(Neuromedin C)、神经肽Y(Neuropeptide Y)、神经紧张素(Neurotensin)、催产素(Oxytocin)、前肾上腺髓质素N-末端20肽(Proadrenomedullin N-terminal 20 Peptide)、嗜铬粒蛋白A(Cromogranin A)、甲状旁腺激素(Parathyroid Hormone，PTH)、PTH相关肽(PTH related peptide)、肽组氨酸-蛋氨酸-27(Peptide Histidine-Methionin-27)、脑下垂体腺苷酸环化酶激活多肽38(Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide38)、血小板因子-4(Platelet Factor-4)、肽T(Peptide T)、促胰液素(Secretin)、血清胸腺因子(Serum Thymic Factor)、生长抑素(Somatostatin)、物质P(Substance P)、促甲状腺素释放激素(Thyrotropin Releasing Hormone)、尿皮质素(Urocortin)、血管作用肠肽(Vasoactive Intestinal Peptide)、血管加压素(Vasopressin)以及它们的衍生物等。
而作为GLP-1的衍生物除了上述的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2以外，还有从由GLP-1的37个氨基酸残基组成的肽进行了氨基酸残基的置换、附加、缺失后形成的具有促进胰岛素释放活性的肽、该肽中的氨基酸进一步被修饰的具有促进胰岛素释放活性的肽(例如酰胺体)、以及通过这些联合加工得到的具有促进胰岛素释放活性的肽。
另外，作为特别适合利用本发明制造方法制造的GLP-1衍生物，希望是等电点处于4.5到9.0范围的GLP-1衍生物。理想的是等电点处于5.5到7.5范围的GLP-1衍生物。。
作为GLP-1衍生物的具体例子除了本发明实施例记载的以外还可以举出以下一些例子。
·GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、GLP-1(7-34)NH2、GLP-1(7-35)NH2和GLP-1(7-37)NH2，
·GLP-1(7-37)-Arg、GLP-1(7-37)-Arg-Arg、GLP-1(7-37)-Lys、GLP-1(7-37)-Lys-Lys、GLP(7-37)-Lys-Arg以及GLP-1(7-37)-Arg-Lys和它们的C末端酰胺体，
·GLP-1的第8位氨基酸Ala被Thr、Gly或Ser置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第26位氨基酸Lys被Arg置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第34位氨基酸Lys被Arg置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第36位氨基酸Arg被Lys置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第8位氨基酸Ala被Thr、Gly或Ser置换，第26位氨基酸Lys被Arg置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第8位氨基酸Ala被Thr、Gly或Ser置换，第34位氨基酸Lys被Arg置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第8位氨基酸Ala被Thr、Gly或Ser置换，第36位氨基酸Arg被Lys置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第26位氨基酸Lys被Arg置换，第34位氨基酸Lys被Arg置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第26位氨基酸Lys被Arg置换，第36位氨基酸Arg被Lys置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第34位氨基酸Lys被Arg置换，第36位氨基酸Arg被Lys置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第8位氨基酸Ala被Thr、Gly或Ser置换，第26位氨基酸Lys被Arg置换，第34位氨基酸Lys被Arg置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第8位氨基酸Ala被Thr、Gly或Ser置换，第26位氨基酸Lys被Arg置换，第36位氨基酸Arg被Lys置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第8位氨基酸Ala被Thr、Gly或Ser置换，第34位氨基酸Lys被Arg置换，第36位氨基酸Arg被Lys置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第26位氨基酸Lys被Arg置换，第34位氨基酸Lys被Arg置换，第36位氨基酸Arg被Lys置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2，
·GLP-1的第8位氨基酸Ala被Thr、Gly或Ser置换，第26位氨基酸Lys被Arg置换，第34位氨基酸Lys被Arg置换，第36位氨基酸Arg被Lys置换的GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2。
作为目的肽如果以GLP-1(7-37)为例，为了解决纯化工序上的问题，例如起因于GLP-1(7-37)的凝胶化、溶解性等问题，可以在GLP-1(7-37)上附加上含有碱性氨基酸的辅助肽后用于GLP-1(7-37)的生产。即通过将该辅助肽附加到GLP-1(7-37)上，可以使GLP-1(7-37)的等电点(pI＝5.5)移动到碱性一侧，通过增加亲水性可以避免作为纯化工序中柱子中的凝集性(凝胶化)等问题。而且，通过将该辅助肽附加到GLP-1(7-37)上，在最初的柱层析工序以非常高纯度而且高收率分离出由辅助肽和GLP-1(7-37)构成的多肽已经成为可能，由于GLP-1(7-37)的回收率增加，所以在该工序中使用辅助肽是非常有用的。
而作为目的肽如果以GLP-1(7-36)NH2为例，由于该物质是酰胺化肽，所以首先需要将GLP-1(7-36)NH2的制造中间体作为目的肽来获得，具体来说这一目的肽是GLP-1(7-37)。即GLP-1(7-37)上附加了含有碱性氨基酸的辅助肽后可以用于GLP-1(7-36)NH2的生产上。通过将含有碱性氨基酸的辅助肽附加到GLP-1(7-37)上，可以使GLP-1(7-37)的等电点移向碱性一侧，在进行以后的酰胺化修饰反应时，在酰胺化酶反应液的pH下，由于辅助肽附加在GLP-1(7-37)上形成的肽的溶解性增加了，沉淀的生成被抑制，可以使收率和产量增加。另外，通过附加含有碱性氨基酸的亲水性的辅助肽，可以使目的肽的溶解度上升，还可以避免在酰胺化修饰反应中作为底物的GLP-1(7-37)和作为生成物的GLP-1(7-36)NH2带来的凝集性，所以附加辅助肽在酰胺化酶反应后的纯化工序中是非常有用的。
无论在上述哪一种情况下，都希望辅助肽附加在GLP-1(7-37)上形成的肽的等电点处于8～12之间，该肽经阳离子交换树脂纯化，可以以高收率(98％)获得该肽。
为了从附加了辅助肽的肽中得到目的肽，在辅助肽和目的肽之间导入化学或酶可以裂解的断裂部位区。在该断裂部位区可以根据目的肽具有的物理化学性质设定裂解效率高的断裂部位区。作为酶裂解和化学裂解方法也可以使用 酶学方法(Methods in ENZYMOLOGY)185卷，基因表达技术(Gene Expressinon Technology(David V.Goeddel编辑，出版社ACADEMIC PRESS，INC))记载的方法。
作为化学裂解方法有用溴化氰裂解蛋氨酸的C末端的方法(D.V.Goeddel等，美国国家科学院学报，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.76，p106-110，1979)，有用甲酸裂解-Asp-Pro-序列之间的键的裂解方法(生物化学和生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，Vol.40，p1173，1970)，有用羟胺裂解-Asn-Gly-序列之间的键的方法和用BNPS-甲基吲哚或N-氯琥珀酰亚胺裂解色氨酸的C末端一侧键的方法。例如，目的肽的氨基酸序列中不含有蛋氨酸时，在与目的肽邻接的断裂部位区的末端导入蛋氨酸，经过溴化氰处理可以进行在断裂部位区的化学裂解。
作为酶裂解方法如果能设定一个能被裂解处理用的酶特异识别的断裂部位区作为底物那是最好了。例如，用胶原酶(Collagenase)可以裂解X-Gly或Pro-X-Gly-Pro序列的-X-Gly间的键(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.81，p4692-4696，1984)，用肠激酶(Enterokinase)可以裂解-Asp-Asp-Asp-Lys-序列(序列号：1)的Lys的C末端一侧键，用凝血因子Xa(blood coagulation factorXa)(特开昭61-135591)可以裂解-Ile-Glu-Gly-Arg-序列(序列号：2)的Arg的C末端一侧键，用凝血酶(Thrombin)可以裂解-Gly-Pro-Arg-序列的Arg的C末端一侧键(特开昭62-135500)，用胰蛋白酶(Trypsin)或梭菌蛋白酶(Clostripain)可以裂解Arg的C末端一侧键，用内切蛋白酶(endoprotease)Arg-C(自然(Nature)，Vol.285，p456-461，1980)可以裂解Arg或Lys的C末端一侧键，用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae Kex2蛋白酶和它的衍生物(Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.144，p807-814，1987、特开平1-199578)可以裂解Lys-Arg、Arg-Arg或Pro-Arg序列的C末端一侧键，用赖氨酰内肽酶(lyslendopeptidase)或内肽酶(endopeptidase)Lys-C(特开昭61-275222)可以裂解Lys一侧键，用金黄色葡萄球菌S.aureusV8蛋白酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.69，p3506-3509，1972)可以裂解Asp或Glu的C末端一侧键；用激肽释放酶(Kallikrein)(特开昭62-248489)可以裂解-Phe-Arg-序列的C末端一侧键；用肾素(renin)可以裂解-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr序列(序列号：3)的-Leu-Leu-之间的键(特开昭60-262595)；用尿激酶(Urokinase)(特开平2-100685)可以裂解-Glu-Gly-Arg-序列的C末端一侧键，用肠肽酶(entero-peptidase)(生物技术Biotechnology，Vol.6，p1204-1210，1988)可以裂解Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列(序列号：4)的C末端一侧键，用溶葡萄球菌素(lysostaphin)(特开平1-160496)可以裂解poly-Gly序列的C末端一侧键，用乳酸克鲁维酵母Kluverromyceslactis(特开平1-124390)可以裂解Lys-Arg、Arg-Arg或Pro-Arg等C末端一侧键等。
例如，在本发明的实施例中，将Kex2蛋白酶可以识别的氨基酸序列(Lys-Arg、Arg-Arg或Pro-Arg序列)导入了断裂部位区，利用该蛋白酶可以将目的肽从辅助肽上切下来。
因此，考虑到裂解处理中使用的酶的底物特异性以及目的肽的氨基酸序列，最好是在断裂部位区的氨基酸序列中存在着一个以上的蛋氨酸、色氨酸、脯氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
而为了获得最终的目的肽需要修饰时(例如，酰胺化肽)，可以在该目的肽从附加了辅助肽的目的肽(此时，该肽是最终目的肽的制造中间体肽)切出前或切出后进行修饰反应(例如，通过酰胺化酶进行酰胺化修饰反应)。希望更有效地进行修饰反应时，可以在切出目的肽前对附加了辅助肽的目的肽进行修饰反应(例如，酰胺化修饰反应)，得到附加了辅助肽的最终的目的肽，然后通过裂解处于辅助肽和最终目的肽之间的断裂部位区，可以得到最终的目的肽。
如果使附加了辅助肽的目的肽高效表达，获得高收率的高纯度目的肽是有可能的，为了获得更大量的目的肽，也可以象以前的融合蛋白法中所进行的那样进一步附加保护肽，使融合蛋白表达而制造大量的目的肽。即也可以对附加了辅助肽的目的肽再附加保护肽构成融合蛋白，以这样的融合蛋白在宿主细胞内高效表达，大量制造目的肽(保护肽无论附加在目的肽的N末端还是C末端都可以)。
本发明的制造方法中可以用的保护肽并没有特别限定，以往方法中利用的保护肽进行适当修饰之后就可以用。例如可以利用特开昭54-145289中作为保护肽的含有来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶相关氨基酸序列片段。该酶相关氨基酸序列对于本领域技术人员来说是众所周知的，来自β-半乳糖苷酶的氨基酸序列片段被本领域技术人员广泛用作融合蛋白法中的保护肽。在本发明的制造方法中在考虑到附加了辅助肽的目的肽的特性之后，可以将β-半乳糖苷酶相关氨基酸序列进行适当修饰后的肽片段作为保护肽来用。而且对编码保护肽有关的氨基酸序列的DNA碱基序列进行化学合成也是可能的。
就含有保护肽的融合蛋白来说，为了提高裂解处理反应后层析工序中的片段分离能力，最好是想办法使得构成该融合蛋白的保护肽或附加了辅助肽的目的肽以及该融合蛋白本身的各个等电点都不一样那样地设定。辅助肽和目的肽也同样设定。
象上述那样附加保护肽时，在附加了辅助肽的目的肽和保护肽之间也设定断裂部位区是有必要的，根据上述设定方针可以设定非常恰当的裂解效率高的断裂部位区。也就是说在由含有保护肽的融合蛋白经附加了辅助肽的目的肽获得目的肽时，由于设定了多个断裂部位区，就需要在各部位进行多阶段的融合蛋白的裂解方法。这种情况下，首先在附加了辅助肽的目的肽和保护肽之间的断裂部位区进行裂解处理，然后在辅助肽和目的肽之间的断裂部位区进行裂解处理，可以得到目的肽。
为了确认上述制造方法具有普遍性，就化学上或酶学上对各断裂部位区进行裂解的方法进行研究，确认了无论利用哪一种裂解处理方法都是可以实施的。作为象这样的对断裂部位区有关的肽链部位特异的裂解方法的代表例子可以举出以下一些。
(1)利用保护肽以及目的肽它们序列中不含有半胱氨酸残基的特点，将半胱氨酸插入到附加了辅助肽的目的肽和保护肽之间，通过氰化、碱处理在该部位对融合蛋白进行特异裂解的方法，
(2)在各个断裂部位区的裂解可以共用同一个酶进行，通过利用在酶识别部位处不同的氨基酸序列，一个断裂部位区的反应条件不会引起另一个断裂部位区裂解的那样的方法，以及
(3)在各个断裂部位区的裂解可以共用同一个酶进行，通过对存在于辅助肽和目的肽之间的断裂部位区(断裂部位2)的氨基酸进行修饰，在附加了辅助肽的目的肽和保护肽之间的断裂部位区(断裂部位区1)裂解的反应条件下，断裂部位区2的裂解不会发生，而断裂部位区1裂解后，进行附加了辅助肽的目的肽的纯化，对已修饰的氨基酸再度修饰，使得用上述酶裂解断裂部位区2成为可能的方法。
另外，本发明中用的宿主细胞并没有特别限定，对使用以往的方法中已经使用的原核细胞或真核细胞，例如大肠杆菌等微生物细胞、酵母或动物细胞等进行适当选择，使用可以使对附加了辅助肽的目的肽进行编码的碱基序列，通过含有该序列的载体能很好表达的细胞。另外，有关高表达所需要的其它要素，例如启动子、终止子、连接部位等也可以适当选用以往方法中已经知道的。
在本发明的目的肽的制造方法中，以下对目的肽为GLP-1(7-37)以及GLP-1(7-36)NH2的情况进行说明。
GLP-1(7-37)表达质粒(以下称pGP97ompPR)编码的融合蛋白(以下称GP97ompPR)具有在GLP-1(7-37)的N末端侧附加了包含碱性肽区的辅助肽的肽(以下称RHHGP[G])，以及在RHHGP[G]的N末端侧附加了作为保护肽的大肠杆菌β-半乳糖苷酶衍生物(β-gal97S)的融合蛋白。于该保护肽和RHHGP[G]之间以及与RHHGP[G]有关的辅助肽和GLP-1(7-37)之间导入各个断裂部位区。该各个导入区含有在一个断裂部位区内被来自大肠杆菌的内在的OmpT蛋白酶裂解，而在另一个断裂部位区中是被Kex2蛋白酶(特许2643968号，特开平10-229884等)裂解那样与底物特异性有关的氨基酸序列。
就GP97ompPR来说，为了提高裂解处理后层析工序中的片段分离能力，想办法使得构成GP97ompPR的β-gal97S或RHHGP[G]以及GP97ompPR本身的各个等电点不一样那样地设定。例如，在后面叙述的实施例中，使GP97ompPR的等电点为5.95，β-gal97S的等电点为4.60，RHHGP[G]为10.09那样设定。
接下来，培养通过pGP97ompPR转化的大肠杆菌(W3110/pGP97ompPR)进行GP97ompPR的表达。GP97ompPR在菌体内以不溶性蛋白被高效表达，被积蓄在包涵体内。最终菌体的浓度是OD660nm＝180。
菌体破碎后，使用尿素使GP97ompPR溶解，通过包涵体内含有的内源性Omp蛋白酶裂解存在于GP97ompPR中的保护肽β-gal97S和附加了辅助肽的目的肽RHHGP[G]之间的断裂部位区。Omp蛋白酶特异裂解该断裂部位区，裂解效率是85％。
然后，为了分离β-gal97S和RHHGP[G]，以及为了除去尿素进行阳离子交换层析。由于未被裂解的GP97ompPR(pI＝5.95)和β-gal97S(pI＝4.60)的等电点处于酸性一侧，所以未被该柱子吸附，但RHHGP[G](pI＝10.09)被吸附，然后被洗脱出来。仅仅通过这一个工序的柱层析处理就可得到纯度99％的RHHGP[G]。在生产工序的最初柱层析工序得到这样高纯度、高收率的RHHGP[G]在工业的大量生产上是非常有用的。
利用Kex2蛋白酶裂解存在于RHHGP[G](1.0g)中的辅助肽和目的肽之间的断裂部位区。在后叙的实施例中有关的反应条件下以裂解效率95％进行裂解。回收率是90％。
之后，为了进一步纯化GLP-1(7-37)，进行反相层析。该工序的回收率是80％，全部工序的总收率大约是64％，可以得到纯度为98％的GLP-1(7-37)0.7g。纯化中使用的培养液相当于0.36升，每升培养液大约应当得到2.0g。该收率和产量都非常高，可以证实使用了辅助肽的本发明中有关的制造方法的有用性。即，本发明的制造方法是可以实施工业规模化充分制造目的肽的方法。
有关利用本发明制造方法的GLP-1(7-37)的制造，各个工序中的收率在后叙的表2-B中给出了。
就象表2-B表明的那样，各工序的回收率非常高，最终的回收率显示为64％，非常高。
当目的肽定为GLP-1(7-36)NH2时，由于该肽是酰胺化肽，所以必需要进行酰胺化修饰反应。例如该肽可以按下述那样操纵得到。
使用酰胺化酶(B.B.R.C，Vol.150，p1275-1281，1988，EP299790A等)对象上述那样得到的RHHGP[G]进行酰胺化修饰。在后叙实施例给出的条件下，作为酶底物的RHHGP[G]以及作为反应生成物的酰胺化的附加了辅助肽的GLP-1(7-36)NH2(以下称之RHHGP-1)的凝集和凝胶化都没有发生，而且可以以98％的高反应率(回收率95％)生成RHHGP-1。由这些结果可以证实以RHHGP[G]作为底物进行酰胺化酶反应时辅助肽的有用性。
酰胺化修饰反应后，利用Kex2蛋白酶裂解存在于RHHG-1中的辅助肽和目的肽之间的断裂部位区。在后叙的实施例中有关的反应条件下以95％以上(回收率90％)裂解效率进行反应。
下一步，为了进一步纯化GLP-1(7-36)NH2，在进行了阳离子交换层析后，进行疏水层析。全部工序的最终回收率大约是50％，可以得到纯度为98％的GLP-1(7-36)NH2 13.5g。纯化中使用的培养液相当于8升，每升培养液大约应当得到1.68g。该收率和产量都非常高，可以证实使用了辅助肽的本发明中有关的制造方法的有用性。即，本发明有关的制造方法是可以实施工业规模化充分制造目的肽的方法。
作为与GLP-1(7-36)NH2的制造有关的本发明的意图之一是途经由附加了辅助肽的构成的肽可以象上述那样改善在酰胺化酶那样的修饰酶等反应时的凝集性以及提高溶解度。因此为了进一步探讨是否具有有用性，纯化了RHHGP[G]、RHHGP-1、GLP-1(7-37)以及GLP-1(7-36)NH2，研究各个肽的溶解度对pH的依赖性。结果表明GLP-1(7-37)象预想的那样在pH5.0至pH7.0范围内溶解度低，而RHHGP[G]在pH4.0至pH6.0附近溶解度高。由于酰胺化酶反应是在弱酸性区进行，所以通过这一结果可以确认作为酶底物可以用含有辅助肽的RHHGP[G]取代GLP-1(7-37)的有用性。
在研究各个肽的溶解度对pH的依赖性的实验中，RHHGP[G]和RHHGP-1的溶解度分别在pH6.0和pH6.4附近急剧下降。而GLP-1(7-36)NH2随时间的推移形成沉淀或微结晶。因此如果存在提高RHHGP[G]和RHHGP-1在中性至弱碱性区的溶解度的物质，以及维持目的肽在弱酸性至弱碱性区的溶解度的物质在生产工序上是非常有用的。
为此，对那样的物质进行了锐意研究，结果发现若是RHHGP[G]和RHHGP-1时，通过向反应液添加表面活性剂(例如添加0.1％Tween80)，若是GLP-1(7-36)NH2时通过添加表面活性剂(例如添加0.3％以上Tween80)和/或盐(例如添加100mM以上的NaCl)可以有效地防止凝集，引入本发明有关的制造工序中也可证实其有用性。
表1汇总了关于使用了本发明有关制造方法的GLP-1(7-36)NH2的制造工序纯化10g规模的GLP-1(7-36)NH2的各个工序收率(培养20升生产菌W3110/pGP97ompPR，其中相当于8升的培养液用于纯化)。
                                                           表1
                                           GLP-1(7-36)NH 2 生产工序的汇总
   工序  GLP-1(7-37)/GLP-1(7-36)NH2量(g)   单个工序收率(％) 总收率(％)
    培养(相当8L培养液)     26.87     100     100
    OmpT反应     22.95     85.4     85.4
    SP-sepharose层析     20.22     98.8     76.2
    酰胺化酶反应     20.70     100     77.0
    Kex2酶反应     18.70     90.4     69.6
    MacroPreP HS层析     16.78     93.7     62.4
    Poros R2层析     13.48     80.4     50.2
从培养到酰胺化酶反应工序用GLP-1(7-37)的量表示，从Kex2工序到Poros R2层析工序用GLP-1(7-36)NH2的量表示。GLP-1(7-37)/GLP-1(7-36)NH2的量从HPLC的峰面积和氨基酸数比的换算值求出。
就象表1所表明的那样各个工序的收率都非常高，最终的总收率也非常高，大约为50％。因此，本发明有关的肽的制造方法可能适用于GLP-1(7-36)NH2的制造，而且表明扩大到工业生产水平的规模是有可能的。而且由于在用OmpT蛋白酶和Kex2蛋白酶进行裂解处理反应的工序中各工序的收率分别是85％和90.4％，也确认了在设定的各断裂部位区内使用了非常适合酶裂解处理反应的氨基酸。
如上所述，在本发明中以具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物的制造方法为例，通过利用辅助肽可以改善由于目的肽本身具有的物理化学性质带来的制造工序上的问题已得到证实。作为具体例子给出的GLP-1(7-37)以及GLP-1(7-36)NH2所代表的GLP-1衍生物所具有的物理化学性质引起的问题通过本发明的有关制造方法是有可能克服的，不用说本发明在该GLP-1衍生物的制造中也是有用的。
另外在上述GLP-1衍生物的制造中也可以利用附加了保护肽的融合蛋白的制造方法进行，从该融合蛋白经附加了辅助肽的目的肽获得目的肽时，由于设计了多个断裂部位区，所以需要在各区域内的多阶段的融合蛋白的裂解方法。
因此就有关通过化学裂解或酶裂解各断裂部位区的裂解方法进行研究，特别是确认了通过后叙的实施例中已确认的大肠杆菌OmpT蛋白酶裂解方法以外的方法进行裂解也是可能的。象这样的与断裂部位区有关的肽链部位特异的裂解方法的代表例子有以下一些。
(1)利用保护肽以及目的肽它们序列中不含有半胱氨酸残基的特点，将半胱氨酸插入到保护肽的C末端，通过氰化、碱处理在该部位特异裂解融合蛋白的方法，
(2)在各个断裂部位区的裂解可以共用Kex2蛋白酶进行，通过利用在酶识别部位处不同的氨基酸序列，在一个断裂部位区的反应条件下不会引起另一个断裂部位区裂解的那样的方法，以及
(3)在各个断裂部位区的裂解可以共用Kex2蛋白酶进行，通过对存在于辅助肽和目的肽之间的一个断裂部位区(断裂部位2)的氨基酸进行修饰，在存在于附加了辅助肽的目的肽和保护肽之间的另外一个断裂部位区(断裂部位区1)裂解的反应条件下，断裂部位区2的裂解不会发生，而在断裂部位区1裂解后，对附加了辅助肽的目的肽进行纯化，对已修饰的氨基酸再度修饰后，使得用Kex2蛋白酶裂解前者的断裂部位区(断裂部位区2)成为可能的方法。
实施例
以下以GLP-1作为目的肽，通过具体的实施例更详细地说明本发明。
首先作为以GLP-1(7-37)为目的肽时的制造方法就象已经叙述的那样，利用常规方法使由保护肽和GLP-1(7-37)组成的融合蛋白表达，虽然可以通过从该融合蛋白直接切出GLP-1(7-37)来制造，但在纯化工序中出现了由于GLP-1(7-37)的物理化学的性质上、纯化过程中会引起凝胶化或凝集，使得回收率极端地低，而且树脂再生也变得不可能。因此通过附加辅助肽使GLP-1(7-37)的物理化学性质改变，可以避免上述的缺点。以下具体地说明该肽的制造方法。
实施例1.质粒的构建
编码为了生产GLP-1(7-37)而设计的融合蛋白(GP97ompPR)的GP97ompPR表达质粒是经过以下4个阶段的步骤制备的。而限制酶处理、连接反应、5′末端的磷酸化、PCR的条件依据常规方法进行。
(1)步骤1 pG 117S4HR6GLP-1的制备
以设计可被大肠杆菌OmpT蛋白酶裂解的GP97ompPR为目的，将编码含有作为OmpT蛋白酶识别序列的Arg-Arg序列的氨基酸序列R6(参照图2)的R6合成DNA(参照图6)插入pG117S4HGP(参照特开平9-296000)的StuI部位，制备pG117S4HR6GLP-1。
(2)步骤2 pGP117S4HompRHKR的制备
为了进一步提高大肠杆菌OmpT蛋白酶裂解的效率，使R6部分序列改变。将用Nsi I以及Hind III裂解pG117S4HR6GLP-1得到的3.2kb片段(片段A)、BamH以及Hind III裂解pG117S4HR6GLP-1得到的0.2kb片段(片段B)以及编码含有作为OmpT蛋白酶识别序列的Arg-Arg序列的氨基酸序列L1(参照图3)的一部分的L1合成DNA(参照图6)连接，制备pGP117S4HompRHKR(图3)。
(3)步骤3 pGP117S4HompRHPR的制备
为了将断裂部位区内的大肠杆菌OmpT蛋白酶识别序列和Kex2蛋白酶识别序列作成不同的序列，将Kex2蛋白酶识别序列由Lys-Arg置换为Pro-Arg。合成P1及P2引物(参照图6)，以pGP117S4HompRHKR为模板进行PCR，制备0.1kb片段。得到的DNA片段用Bgl II和Sph I处理后，与用Bgl II及Hind III裂解pGP117S4HompRHKR得到的3.2kb片段(片段C)和用Sph I及Hind III裂解pGP117S4HompRHKR得到的片段0.2kb片段(片段D)连接，制备pGP117S4HompRHPR(图4)。
(4)步骤4 pGP97ompPR的制备(图5)
为了进一步缩小保护肽部分，制备了pGP97ompPR。合成P3及P4引物(参照图6)，以pGP117S4HompRHPR为模板进行PCR，制备DNA片段。得到的DNA片段用Pvu Il和Nsi I处理后，与用Pvu Il和Nsi I裂解pGP117S4HompRHPR得到的3.2kb片段连接，制备pGP97ompPR。
图7给出了制备的质粒pGP97ompPR编码的融合蛋白(GP97ompPR)的氨基酸序列，图8给出了编码该氨基酸序列的DNA序列。
实施例2.融合蛋白(GP97ompPR)的表达
使用30升发酵罐，于含有4g/l K2HPO4、4g/l KH2PO4、2.7g/l Na2HPO4、0.2g/l NH4Cl、1.2g/l(NH4)2SO4、4g/l酵母提取液、2g/lMgSO4·7H2O、40mg/l CaCl2·2H2O、40mg/l FeSO4·7H2O、10mg/lMnSO4·nH2O、10mg/l AlCl3·6H2O、4mg/l CoCl2·6H2O、2mg/lZnSO4·7H2O、2mg/l Na2MoO4·2H2O、1mg/l CuCl2·2H2O、0.5mg/lH3BO4、10mg/l四环素的培养基(20L、pH7.0)，培养温度在12小时前为32℃，之后为37℃，一边添加葡萄糖一边对含有pGP97ompPR的大肠杆菌W3110进行24小时培养。培养基pH通过添加28％氨液控制在pH7.0。图9是利用16％SDS-PAGE考察菌体浓度(OD660)随时间的变化和在各样品采样时刻的融合蛋白(GP97ompPR)的表达结果。GP97ompPR以包涵体形式表达，培养结束时占总菌体蛋白质的30％以上。
培养后，使用Manton-Gaulin匀浆器(15M-8TA)于500Kg/cm2的条件下对培养液进行匀浆处理，利用离心机回收沉淀部分(包涵体)。为了洗净得到的沉淀，添加与培养液等量的去离子水，悬浊后，再次进行离心，回收沉淀。再重复进行一次该洗净操作，将最后得到的沉淀悬浮于适量的去离子水中。
实施例3.大肠杆菌OmpT蛋白酶对GP97ompPR的加工
将得到的包涵体悬浊液稀释到OD660的值为1000后，取其中1000ml，然后添加250ml的未调pH的1M Tris-HCl、10ml 0.5M EDTA(pH8.0)、1200g粉末尿素，最后加去离子水使最终容量达5000ml。用盐酸将pH调整到7.5，于37℃加温2小时。通过该操作使存在于包涵体中的大肠杆菌OmpT蛋白酶起作用，裂解GP97ompPR，使RHHGP[G]游离出来。图10是通过反相HPLC分析从GP97ompPR切出RHHGP[G]的结果。分析用YMC PROTEIN-PR柱，溶液A用含有0.1％三氟乙酸的10％乙腈溶液，溶液B用含有0.095％三氟乙酸的70％乙腈溶液，流速为1ml/min，用溶液B进行44％至70％的直线梯度洗脱，时间为13分钟。通过本操作85％的GP97ompPR被裂解，反应结束后的样品中，得到了相当于RHHGP[G]的峰(图21A)。
通过使用大肠杆菌OmpT蛋白酶进行裂解处理使得附加了辅助肽的GLP-1(7-37)从融合蛋白的切出并不限于来自pGP97ompPR的融合蛋白，同样在来自实施例1制备的pG117S4HR6GLP-1、GP117S4HompRHKR以及pGP117S4HompRHPR的融合蛋白也是可能的。图11、图12和图13给出了来自这些质粒的融合蛋白的氨基酸序列。
实施例4.RHHGP[G]的纯化
大肠杆菌OmpT蛋白酶反应后，添加尿素、Tween 80使之浓度分别为7M、0.1％，用NaOH将pH调至8.0。然后进行离心分离，得到上清。首先用100mM Tris HCl(pH8.0)，然后用20mM Tris HCl(pH8.0)/5M尿素/0.1％Tween 80平衡充填了SP-Sepharose BigBeads(Amersham Pharmacia Biotechnology公司)的柱子。将上述的得到的上清加到已平衡的柱子上，用同样的平衡液洗，然后再用0.2MNaCl/20mM Tris HCl(pH8.0)/0.1％Tween 80洗，用0.5M NaCl/20mMTris HCl(pH8.0)/0.1％Tween 80洗脱(图14)。
洗脱出来的溶液中的RHHGP[G]的纯度非常高，达到98％。附加辅助肽以及利用所谓的从低压层析的洗脱步骤的简便工序获得这样高纯度的肽的原因是在设计辅助肽时，考虑了导入亲水性氨基酸和等电点可以用离子交换柱层析进行纯化。实施例5表明了以上结果对本工序以后的纯化工序的简化有很大的贡献。
实施例5.GLP-1(7-37)从RHHGP[G]的切出和纯化
将实施例4中纯化的RHHGP[G]作为如下给出的反应液成分，利用Kex2蛋白酶进行加工。反应液组成：5.0mg/ml RHHGP[G]，20mM TrisHCl，0.1％Tween 80，0.3M NaCl，pH8.0，2.0mM CaCl2，8000unit/ml Kex2蛋白酶(大约1.0mg/L)。经1小时反应得到95％的反应率(图15-B)。本反应中，没有观察到GLP-1(7-37)沉淀形成。
酶反应后，立刻向反应液中加入醋酸铵，使最终浓度为10mM，用盐酸将pH调到pH4.5。向用10mM的醋酸铵(pH4.5)平衡过的PorosR2柱子加样，达到10mg GLP-1(7-37)/1ml树脂，在用平衡液洗后再用0.2％醋酸/10％乙腈洗净，再用0.2％醋酸/40％乙腈洗脱。除去乙腈后，得到冷冻干燥样品。GLP-1(7-37)的回收率是80％，而纯度为99％(图15-C)。
表2给出了从由保护肽和目的肽构成的融合蛋白中直接切出GLP-1(7-37)的方法(例如，参照特开平9-296000)和本发明方法的比较。
                                                               表2
                                                  GLP-1(7-37)生产工序的比较
A
    工序   纯度(％)   单个工序收率(％)   总收率(％)
  Kex2酶反应     15     -     100
  酸沉淀     -     68     68
  过滤     75     88     60
  阳离子交换层析     95     95     57
  反相层析     99     72     41
B
    工序   纯度(％)   单个工序收率(％)   总收率(％)
  OmpT反应     24     -     100
  过滤     24     90     90
  阳离子交换层析     99     99     89
  Kex2酶反应     96     90     80
  反相层析     98     80     64
A是来自从由保护肽和目的肽构成的融合蛋白中直接切出GLP-1(7-37)的方法的结果。B是来自从在附加了辅助肽的目的肽上进一步附加了保护肽的融合蛋白中切出GLP-1(7-37)的方法的结果。
通过以RHHGP[G]为中间体可以简便而且高收率地获得纯度达99％的GLP-1(7-37)。由于在本纯化方法中没有使用HPLC，不用说扩大工业生产规模是很容易的。
以下给出了对目的肽需要修饰的例子。由于GLP-1(7-36)NH2是酰胺化肽，所以需要进行酰胺化修饰反应。
实施例6.附加了辅助肽的GLP-1(7-37)的酰胺化修饰反应
利用酰胺化酶将实施例4得到的RHHGP[G]转变为RHHGP-1。为了确定RHHGP[G]作为底物时的反应条件，在0.5ml的反应容积中，使pH、温度、硫酸铜浓度、过氧化氢酶浓度、底物浓度、L-抗坏血酸、以及酰胺化酶浓度达最适化。而RHHGP[G]和RHHGP-1的分离分析是用离子交换HPLC柱(Poros S/H、パ-セプテイプバイオシステム公司)，在除去巴比妥的30mM Britton-Bobinson缓冲液(以下，BR缓冲液)存在下，进行pH梯度(6.0～9.0)洗脱。
本反应条件下的最适pH是5.0～5.5(图16)。最适反应条件是：10mM醋酸钠(pH5.0)、5.0μM硫酸铜、0.5g/l L-抗坏血酸、1μM/ml过氧化氢酶、5.0mg/ml RHHGP[G]、温度32℃、1500unit/ml酰胺化酶。在本条件中添加了如后述的实施例11中表明具有抑制凝集效果的Tween 80(0.1％)，在上述条件下使5升RHHGP[G]进行酰胺化反应，用EDTA终止反应。在本条件下的反应结果是RHHGP[G]在1小时内以98％以上的反应率转化为RHHGP-1(图17)。
实施例7.利用Kex2蛋白酶从RHHGP-1中切出GLP-1(7-36)NH2
使用Kex2蛋白酶的加工反应显示出成为底物的部分序列对pH的依赖性和活性变化(EP794255A)。在此，在0.5ml反应容量中进行pH、氯化钙浓度以及添加酶量的最适化。若是RHHGP-1，在pH8.0表现出最大活性(图18)。RHHGP-1为底物时的最适反应条件为10mM TrisHCl(pH8.0)、1mM氯化钙、8,000units/ml Kex2蛋白酶、温度30～32℃。由后述的实施例11的结果看出通过将反应溶液中的NaCl浓度定为0.1M以上，再向反应液中添加0.1％Tween 80，是可以避免凝集现象的。
实施例6的酰胺化反应后的样品溶液在本条件下于30℃反应2小时，得到95％以上的反应率(图21C)。在本反应中，没有看到GLP-1(7-36)NH2沉淀的形成。
实施例8.GLP-1(7-36)NH2的纯化
为了除去微量的杂质，使用阳离子交换树脂(MacroPrep High-S、BioRad公司)，通过pH梯度洗脱可以分离出GLP-1(7-36)NH2。用20mM BR缓冲液(pH4.5)/20mM NaCl/0.3％Tween 80平衡。样品溶液的组成设定为0.3M NaCl/0.3％Tween 80、pH4.5。该样品溶液加到柱子上后，用平衡液洗。使用平衡液(A液)和洗脱液(B液；组成与平衡液相同，pH7.0)，利用从50％B液到100％B液的线性梯度洗脱，进行GLP-1(7-36)NH2的洗脱(图19)。杂质的比例不到0.5％(图20)。通过本工序除去了大部分实施例7之前添加的各个试剂、未反应物以及微量的杂质(图21D)，得到纯度98％以上的LPG-1(7-36)NH2。合并收集的溶液于pH4.5、4℃下保存。
实施例9.GLP-1(7-36)NH2的最终纯化
在上述实施例8中得到了纯度在98％以上的GLP-1(7-36)NH2。但是作为医药品使用时，当然要求目的肽的纯度，也必须避免非肽类的内毒素的混入。因此使用肽类药品最终纯化中频繁使用的分取反相HPLC柱，尝试除去内毒素等，但有时在柱子内会发生GLP-1(7-36)NH2的凝集/或凝胶化。预料GLP-1(7-36)NH2的易凝集性在规模化生产时会成为大的危险因子。
另外疏水性层析树脂与反相层析树脂一样，利用物质的疏水性使物质吸附，但其官能团的密度一般都比较低，吸附容量是5-15mg/ml树脂。但是，载体的种类、官能团的种类丰富，即使是象GLP-1(7-36)NH2那样的具有易凝集性的肽，选择能给出高回收率的树脂是有可能的。因此对各种疏水性层析树脂研究的结果表明由带有丁基、异丁基、己基或苯基的亲水性载体构成的树脂，或Poros R2所代表的聚苯乙烯系树脂是适用的树脂。以下给出了作为象上述那样的树脂之一的Poros R2(パ-セプテイプバイオシステム公司)树脂例子。
本树脂对GLP-1(7-36)NH2的最大吸附容量大约为12mg/ml树脂，比其它疏水性层析用树脂高，洗脱时GLP-1(7-36)NH2的浓度增高，表明适合于冷冻干燥。
用10mM醋酸铵(pH4.5)平衡800ml的柱子，添加实施例8中的样品溶液，用平衡液洗净后，进一步用0.2％醋酸洗净，用0.2％醋酸/40％乙腈洗脱。GLP-1(7-36)NH2的回收率是80％，纯度为98％(图21E)。该标准样品只是含有低浓度的挥发性的酸，除去乙腈后，很容易进行冷冻干燥。通过将冷冻干燥样品再溶解，利用凝胶化法(リムルES-IIテスト、和光纯药公司)测定内毒素，结果表明内毒素处于检测极限以下(0.03u/mg以下)。通过上述方法中给出的柱层析操作高收率而且高纯度的GLP-1(7-36)NH2可以纯化，由于可以用能冷冻干燥的溶剂洗脱不用说在产业上是很有用的。
实施例10.通过使用辅助肽缓解凝集性
在利用辅助肽的本发明的制造方法中，目的之一是改善在以往制造方法中成为问题的由于目的肽的物理化学性质引起的凝集性，所以有必要进行有无改善效果的检测。因此在本实施例中，通过比较由辅助肽和GLP-1(7-37)构成的肽以及酰胺化的由辅助肽和GLP-1(7-36)NH2构成的肽引起的凝集性来检测是否有改善的效果。
首先，纯化RHHGP[G]，在考查它的凝集性与GLP-1(7-37)相比是否有改善的同时，进行抑制凝集物质的检索。各个肽的样品：RHHGP[G]是用SP-Sepharose BigBeads层析纯化的样品，RHHGP-1是纯化的RHHGP[G]经酰胺化的样品，GLP-1(7-37)是纯化的RHHGP[G]经Kex2蛋白酶裂解的样品，GLP-1(7-36)NH2是RHHGP-1经Kex2蛋白酶裂解的样品，上述各个样品分别使用Poros R2柱，通过乙腈梯度洗脱纯化使纯度达到98％，最后进行冷冻干燥。
考虑到凝集性与各个肽的溶解性有密切关系，所以研究了各个肽的溶解度对pH的依赖性。图22和图23给出了研究结果。GLP-1(7-37)从pH5.5至pH6.5，即若是在作为酰胺化酶反应条件最适pH的弱酸性到中性pH条件下溶解度低，表明作为制造中间体是不合适的。
另外，虽然RHHGP[G]和RHHGP-1从pH6.2附近开始溶解度降低，但至少从pH5至pH6可以保持充分的溶解性，所以可以确认即使在酰胺化酶反应条件下也可以进行充分有效的反应。
实施例11.具有抑制凝集的物质的筛选
在用利用了辅助肽的本发明有关的制造方法的GLP-1(7-36)NH2的工业水平的制造方法的确立中，如果有在中性到弱碱性范围内使RHHGP[G]和RHHGP-1的溶解度提高的物质，以及在弱酸性至弱碱性范围内可以维持GLP-1(7-36)NH2溶解性的物质更好(在图22表示的实验中虽然GLP-1(7-36)NH2比GLP-1(7-37)慢，但很清楚在从pH5.3至pH8.0的很宽的范围内随时间的推移会形成沉淀或形成微结晶)。
作为添加到各肽溶液中的物质(它们能够维持上述各肽的溶解性)可以考虑使用表面活性剂、糖类、盐、有机溶剂等。因此作为表面活性剂可以用Tween 80、Triton X-100，作为糖类可以用葡萄糖、甘露醇和蔗糖，作为盐可以用NaCl，作为有机溶剂可以用乙醇、甘油和DMSO，就它们的抑制凝集的能力进行了研究。
制备10mg/ml的RHHGP[G]、RHHGP-1以及GLP-1(7-36)NH2水溶液，向事先加入了0.1ml的300mM BR缓冲液(pH7.9)以及0.1ml的10倍浓度的被检测物质溶液的塑料试管中加0.8ml各肽溶液，将各管的pH调到容易引起凝集的范围，RHHGP[G]调到pH7.5-8.5、RHHGP-1调到pH8.0、GLP-1(7-36)NH2调到pH6.5，然后测定随时间推移的浊度(660nm的吸光度)。得到的结果中，Tween 80、NaCl和温度抑制凝集的效果表示在图23和图24中。
对于RHHGP[G]、RHHGP-1用0.1％Tween 80可以强烈抑制沉淀形成(图23A)，而对于GLP-1(7-36)NH2可以用0.3％以上的Tween 80(图23B)、100mM以上的NaCl(图24C)和/或低温(图24D)抑制凝集已被证实。
通过上述结果，在有关实际生产体系中的pH条件下，使用本发明有关的肽的制造方法时，证实了向反应液中添加盐和表面活性剂对于目的肽的凝集抑制是有用的，表明可以以高纯度、高产率生产目的肽。
实施例12.对断裂部位区的裂解方法
就在断裂部位区进行裂解处理使用的裂解方法进行了研究。即就(1)断裂部位区1：氰化/碱化，断裂部位区2：Kex2蛋白酶，(2)断裂部位区1：Kex2蛋白酶，断裂部位区2：Kex2蛋白酶，以及(3)断裂部位区1：附加DTNB(5，5′-ditiobis-(2-nitrobenzoicacid))/Kex2蛋白酶，断裂部位区2：还原/Kex2蛋白酶的各个裂解方法，目的肽为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2时进行研究时，表明在使用本发明有关的制造方法中在利用含有保护肽的融合蛋白时，通过化学的或酶学上的处理是可以实施经多阶段裂解反应进行的裂解。
以下给出了与各个方法有关的结果。为了使由裂解反应后生成的辅助肽和GLP-1(7-37)构成的多肽的亲水性增加，改善在中性附近的溶解性，在整个的辅助肽中导入了4个连续的组氨酸序列。
A.经由使用(1)的方法在半胱氨酸处进行特异裂解的GLP-1(7-37)的制造方法
本方法是当目的肽不含有半胱氨酸时，对一个断裂部位区中(断裂部位区1)的半胱氨酸进行化学裂解的方法，例如在得到表达的融合蛋白后，确认用CADP(四氟硼酸1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓盐1-cyano-4-dimethylamino-pyridinium tetrafluoroborate)对半胱氨酸进行氰化后，通过碱处理(NaOH)可以在断裂部位区的半胱氨酸的N-末端侧进行特异裂解。
即首先选择PGGRPSRHKR(序列号：6)作为与GCHHHH(序列号：5)(作为辅助肽)氨基酸序列邻接的断裂部位区1的氨基酸序列，导入融合蛋白中。将该融合蛋白以30mg/ml的浓度溶解于50mM Tris·HCl(pH8.2)、5M尿素、10mM DTT(dithiothreitol)中，在30℃的恒温槽中保温30分钟使半胱氨酸完全还原。然后通过经10mM Tris·HCl(pH8.2)、5M尿素平衡过的凝胶过滤柱(Pharmacia公司制造PD10柱)除去DTT。
为了对半胱氨酸进行氰化，加醋酸到最终浓度为0.1M，再加入是半胱氨酸4倍摩尔量的CADP，于30℃反应1小时。用DTNB定量残存的SH，验证氰化反应。
用经10mM Tris·HCl(pH8.2)、5M尿素平衡过的PD10柱除去过量的试剂，添加NaOH到最终浓度为50mM，于室温放置30分钟，在氰化的半胱氨酸部位对上述融合蛋白进行特异裂解。裂解率大约为50-70％。
关于另一个断裂部位区(断裂部位区2)用与实施例7同样的方法进行裂解处理。
B.利用(2)方法的Kex2蛋白酶对断裂部位区的裂解
虽然各个断裂部位区含有Kex2蛋白酶裂解部位区，但要使得一个断裂部位区(断裂部位区2)的氨基酸序列在另一个断裂部位区被裂解的反应条件下几乎不被裂解那样设计。
在使得Kex2蛋白酶对断裂部位区的裂解识别序列的最适化中，人们已经了解到除了P1、P2部位外，P4部位的氨基酸残基中的电荷对Kex2蛋白酶的活性有很大影响，特别是如果P4部位存在酸性氨基酸时，在一定条件下融合蛋白完全不能被裂解(特开平9-296000)。利用这一特点，例如将与由辅助肽HRHKRSHHHH(序列号：7)构成的氨基酸序列相邻接的断裂部位区2的氨基酸序列设计成SDHKR(序列号：8)，在P4部位处导入天冬氨酸(D)时，如果用融合蛋白中的断裂部位区1相关的Kex2蛋白酶进行裂解，裂解可达90％以上，而断裂部位区2被保护没有被裂解。这一结果表明通过在P4部位处导入天冬氨酸，断裂部位区1可以被特异裂解。
为了分离得到的附加了辅助肽的GLP-1(7-37)，在进行具有离子交换和凝胶过滤功能的柱层析(例如Cellulofine C-200柱层析)时，附加了辅助肽的目的肽GLP-1(7-37)被特异吸附。虽然一部分未反应的融合蛋白也被吸附了，但通过盐浓度梯度洗脱可以很容易被分离。回收率是94％。该柱层析也适用于其它附加了辅助肽的GLP-1(7-36)NH2。
在进行了酰胺化修饰反应后，为了从附加了辅助肽的GLP-1(7-36)NH2中切出GLP-1(7-36)NH2，通过Kex2蛋白酶在断裂部位区2进行裂解处理。在所谓的存在尿素(变性剂)、以及碱性的首要条件下，Kex2蛋白酶虽然不能裂解断裂部位区2，但如果在没有尿素的状态下，通过选择合适的pH，Kex2蛋白酶可以识别断裂部位区2，这已被证实。最适pH为6.5-7.3，这表明在pH8.2的裂解反应条件下，在断裂部位区1难于进行裂解。
这是由于附加了上述辅助肽的GLP-1(7-36)NH2与在此基础上进一步附加了保护肽的融合蛋白不同，前者即使没有尿素存在，它在很宽的pH范围内都是可溶性的。因此可以使Kex2蛋白酶反应，通过反相HPLC对肽进行分离定量，最后可以达到98％以上的裂解效果。本反应系统由于反应液中不含尿素，所以几乎不会引起Kex2蛋白酶的失活。其优点是反应必需的Kex2蛋白酶量与底物的摩尔比可以少到1∶20000～1∶40000，这样微量的酶也已够用了。
对象上述那样在有关各个断裂部位的裂解处理中能够证实通过使用同一个酶可以生产GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)NH2。
C.利用使用(3)方法对半胱氨酸特异修饰的裂解方法
本方法虽然是与B.(2)方法大致相同的方法，但本方法是在目的肽中不存在半胱氨酸残基时，对导入有关断裂部位区(断裂部位区2)的P4部位的半胱氨酸残基进行修饰，即通过用DTNB(dithionitriobenzoic acid)对半胱氨酸的侧链进行处理，可以保护另一个断裂部位区(断裂部位区1)不被Kex2蛋白酶裂解，在得到由附加了辅助肽的GLP-1(7-37)构成的肽之后进行还原，用Kex2蛋白酶对断裂部位区2进行裂解的方法。作为这样的反应中的代表例子可以举出通过磺酸化、DTNB引起的非对称二硫键的例子，如果有使半胱氨酸侧链带上电荷的方法更好，这并没有特别限定。例如将与由辅助肽HRHKRSHHHH(序列号：7)构成的氨基酸序列相邻接的断裂部位区2的氨基酸序列设计成SCHKR(序列号：24)导入融合蛋白。
使上述那样设计的融合蛋白表达，对得到的融合蛋白进行DTNB处理，将半胱氨酸作成非对称二硫键。在确认半胱氨酸完全被修饰后，利用Kex2蛋白酶进行裂解处理，确认定量地得到了由附加了辅助肽的GLP-1(7-37)构成的肽。即在断裂部位区2中Kex2蛋白酶的氨基酸识别部位的P4部位作成半胱氨酸，通过在它的侧链特异地导入负电荷，在Kex2蛋白酶于断裂部位区1进行裂解时，可以保护断裂部位区2不被裂解。
接下来与上述B同样进行纯化和酰胺化反应，加入DTT后使附加了辅助肽的GLP-1(7-36)NH2还原，利用疏水性柱层析纯化到纯度达98％，进行冷冻干燥。本品以5mg/ml的浓度溶解于20mM BisTris(pH7.0)，2mM氯化钙中，加入1000unit/ml的Kex2蛋白酶，于30℃下使其反应时，附加了辅助肽的GLP-1(7-36)NH2被特异地裂解，生成了GLP-1(7-36)NH2。
在本实施例中虽然是在还原状态对断裂部位区2进行处理的，但不用说进行使其带有正电荷那样的修饰后，使其对Kex2蛋白酶的反应性改变也是可能的。
本发明提供在工业规模上有效而且便宜地制造生理活性肽的方法。具体来说就象本说明书的实施例中记载的那样，表明可以以高纯度、而且高产量生产到目前为止工业规模生产困难的GLP-1衍生物。本发明有关制造方法可以用于GLP-1衍生物以外的生理活性肽的有效制造中，产业上的有用性非常高。
                                序列表
<110>Suntory Limited
<120>利用辅助肽生产肽的过程
<130>F962
<150>JP 10-032272
<151>1998-01-30
<160>24
<210>1
<211>4
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>附加到肠激酶裂解部位的氨基酸序列
<400>1
Asp Asp Asp Lys
  1
<210>2
<211>4
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>附加到可被血液凝固因子Xa断裂部位的氨基酸序列
<400>2
Ile Glu Gly Arg
  1
<210>3
<211>7
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>含有一个肾素断裂部位的氨基酸序列
<400>3
Pro Phe His Leu Leu Val Tyr
  1               5
<210>4
<211>6
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>
<400>4
Val Asp Asp Asp Asp Lys
  1               5
<210>5
<211>6
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>辅助肽的氨基酸序列
<400>5
Gly Cys His His His His
  1               5
<210>6
<211>10
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>含有一个化学断裂部位的氨基酸序列
<400>6
Pro Gly Gly Arg Pro Ser Arg His Lys Arg
  1               5                  10
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>辅助肽氨基酸序列
<400>7
His Arg His Lys Arg Ser His His His His
  1               5                  10
<210>8
<211>5
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>含有一个Kex2蛋白酶裂解部位的氨基酸序列
<400>8
Ser Asp His Lys Arg
  1               5
<210>9
<211>23
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>含有一个OmpT断裂部位的氨基酸序列
<400>9
Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His
  1             5                   10                 15
Arg Trp Gly Arg Ser Gly Ser
             20
<210>10
<211>20
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>含有一个OmpT断裂部位的氨基酸序列
<400>10
Gln Met His Gly Tyr Asp A1a Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His
  1             5                  10                   15
Gly Ser Gly Ser
             20
<210>11
<211>69
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>编码含有一个OmpT断裂部位的氨基酸序列的核苷酸序列
<400>11
cag atg cat ggt tat gac gcg gag ctc cgg ctg tat cgc cgt cat cac     48
Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His
  1             5                  10                  15
cgg tgg ggt cgt tcc gga tcc                                         69
Arg Trp Gly Arg Ser Gly Ser
             20
<210>12
<211>23
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>含有一个OmpT断裂部位的氨基酸序列
<400>12
Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His
  1               5                  10                  15
Arg Trp Gly Arg Ser Gly Ser
             20
<210>13
<211>47
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>编码含有一个OmpT断裂部位的氨基酸序列的核苷酸序列
<400>13
tggttatgac gcggagctcc gcctgtatcg ccgtcatcac ggttccg                 47
<210>14
<211>55
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>编码含有一个OmpT断裂部位的氨基酸序列的核苷酸序列
<400>14
gatccggaac cgtgatgacg gcgatacagg cggagctccg cgtcataacc atgca        55
<210>15
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>引物
<400>15
gactcagatc ttcctgaggc cgat                                          24
<210>16
<211>36
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>引物
<400>16
aaaggtacct tccgcatgcc gcggatgtcg agaagg                             36
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>引物
<400>17
aggccaggaa ccgtaaaaag                                               20
<210>18
<211>29
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>引物
<400>18
aaaatgcatc gcatcgtaac cgtgcatct                                     29
<210>19
<211>627
<212>DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>编码由GLP-1、辅助肽和β-半乳糖苷酶保护肽组成的融合蛋白的核苷酸序列
<400>19
cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac   60
aatttcacac aggaaacagc t atg acc atg att acg gat tca ctg gcc gtc    111
                        Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val
                          1               5                  10
gtt tta caa cgt aaa gac tgg gat aac cct ggc gtt acc caa ctt aat    159
Val Leu Gln Arg Lys Asp Trp Asp Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn
                 15                  20                  25
cgc ctt gca gca cat ccc cct ttc gcc agc tgg cgt aat agc gac gac    207
Arg Leu Ala Ala His Pro Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp
             30                  35                  40
gcc cgc acc gat cgc cct tcc caa cag ttg cgc agc ctg aat ggc gaa    255
Ala Arg Thr Asp Arg Pro Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu
         45                  50                  55
tgg cgc ttt gcc tgg ttt ccg gca cca gaa gcg gtg ccg gca agc ttg    303
Trp Arg Phe Ala Trp Phe Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Ala Ser Leu
     60                  65                  70
ctg gag tca gat ctt cct gag gcc gat act gtc gtc gtc ccc tca aac    351
Leu Glu Ser Asp Leu Pro Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn
 75                  80                  85                  90
tgg cag atg cac ggt tac gat gcg atg cat ggt tat gac gcg gag ctc    399
Trp Gln Met His Gly Tyr Asp Ala Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu
                 95                 100                 105
cgc ctg tat cgc cgt cat cac ggt tcc gga tcc cct tct cga cat ccg    447
Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Pro
            110                 115                 120
cgg cat gcg gaa ggt acc ttt acc agc gat gtg agc tcg tat ctg gaa    495
Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
        125                 130                 135
ggt cag gcg gca aaa gaa ttc atc gcg tgg ctg gtg aaa ggc cgt ggt    543
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
    140                 145                 150
taagtcgaca gcccgcctaa tgagcgggct tttttttctc ggaattaatt ctcatgtttg  603
acagcttatc atcgataagc ttta                                         627
<210>20
<211>154
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>由GLP-1、辅助肽和β-半乳糖苷酶保护肽组成的融合蛋白的氨基酸序列
<400>20
Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp
  1               5                  10                  15
Trp Asp Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro
             20                  25                  30
Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro
         35                  40                  45
Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe
     50                  55                  60
Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Ala Ser Leu Leu Glu Ser Asp Leu Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr
                 85                  90                   95
Asp Ala Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His
            100                 105                 110
His Gly Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr
        115                 120                 125
Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu
    130                 135                 140
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
145                 150
<210>21
<211>187
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>由GLP-1、辅助肽和β-半乳糖苷酶保护肽组成的融合蛋白的氨基酸序列
<400>21
Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp
  1               5                  10                  15
Trp Asp Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro
             20                  25                  30
Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro
         35                  40                  45
Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe
     50                  55                  60
Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Ala Ser Leu Leu Glu Ser Asp Leu Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr
                 85                  90                  95
Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro
            100                 105                 110
Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His His Gly Gly Arg Gln
        115                 120                 125
Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Arg
    130                 135                 140
Trp Gly Arg Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Lys Arg His Ala Glu Gly
145                 150                 155                 160
Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys
                165                 170                 175
Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            180                 185
<210>22
<21l>184
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>由GLP-1、辅助肽和β-半乳糖苷酶保护肽组成的融合蛋白的氨基酸序列
<400>22
Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp
  1               5                  10                  15
Trp Asp Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro
             20                  25                  30
Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro
         35                  40                  45
Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe
     50                  55                  60
Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Ala Ser Leu Leu Glu Ser Asp Leu Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr
                 85                  90                  95
Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro
            100                 105                 110
Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His His Gly Gly Arg Gln
        115                 120                 125
Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly
    130                 135                 140
Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Lys Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
145                 150                 155                 160
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
                165                 170                 175
Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            180
<210>23
<211>184
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>由GLP-1、辅助肽和β-半乳糖苷酶保护肽组成的融合蛋白的氨基酸序列
<400>23
Met Thr Met Ile Thr Asp Ser Leu Ala Val Val Leu Gln Arg Lys Asp
  1               5                  10                  15
Trp Asp Asn Pro Gly Val Thr Gln Leu Asn Arg Leu Ala Ala His Pro
             20                  25                  30
Pro Phe Ala Ser Trp Arg Asn Ser Asp Asp Ala Arg Thr Asp Arg Pro
         35                  40                  45
Ser Gln Gln Leu Arg Ser Leu Asn Gly Glu Trp Arg Phe Ala Trp Phe
     50                  55                  60
Pro Ala Pro Glu Ala Val Pro Ala Ser Leu Leu Glu Ser Asp Leu Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Ala Asp Thr Val Val Val Pro Ser Asn Trp Gln Met His Gly Tyr
                 85                  90                  95
Asp Ala Pro Ile Tyr Thr Asn Val Thr Tyr Pro Ile Thr Val Asn Pro
            100                 105                 110
Pro Phe Val Pro Thr Glu Pro His His His His His Gly Gly Arg Gln
        115                 120                 125
Met His Gly Tyr Asp Ala Glu Leu Arg Leu Tyr Arg Arg His His Gly
    130                 135                 140
Ser Gly Ser Pro Ser Arg His Pro Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr
145                 150                 155                 160
Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile
                165                 170                 175
Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            180
<210>24
<211>5
<212>PRT
<213>人工合成序列
<220>
<223>含有一个蛋白酶裂解部位的氨基酸序列
<400>24
Ser Cys His Lys Arg
  1               5

Claims (28)

1.具有所需生物学活性的肽的制造方法，该方法包括如下工序：
工序(1)：利用含有编码在附加了辅助肽的目的肽基础上又进一步附加了保护肽的融合蛋白的碱基序列的表达载体转化细胞，然后培养该转化细胞，从该培养物中收集上述融合蛋白；
这里，在(a)所述辅助肽与目的肽之间、以及(b)保护肽与构成附加了辅助肽的目的肽的该辅助肽或该目的肽之间存在断裂位点，
工序(2)：从该融合蛋白中裂解分离附加了辅助肽的目的肽与保护肽，按照要求纯化附加了辅助肽的目的肽；
工序(3)：从工序(1)或工序(2)得到的附加了辅助肽的目的肽中裂解分离辅助肽与目的肽，按照需要纯化目的肽，以及
工序(4)：对在工序(3)中得到的目的肽进行纯化。
2.权利要求1记载的制造方法，其特征是：上述辅助肽含有5～50个氨基酸残基。
3.根据权利要求1的制造方法，其中在权利要求1的工序(2)和(3)之间含有一个附加工序，该附加工序包括对在工序(2)中得到的附加了辅助肽的目的肽进行修饰反应。
4.权利要求1记载的制造方法，其特征是：附加了上述辅助肽的目的肽的等电点为8～12。
5.权利要求1记载的制造方法，其特征是：上述目的肽含有200个以下的氨基酸残基。
6.权利要求1记载的制造方法，其特征是：上述保护肽含有30～200个氨基酸残基。
7.权利要求1记载的制造方法，其特征是：在纯化工序中使用了离子交换树脂。
8.权利要求7记载的制造方法，其特征是：离子交换树脂是阳离子交换树脂。
9.权利要求1记载的制造方法，其特征是：在纯化工序中使用了反相或疏水性层析。
10.权利要求1记载的制造方法，其特征是：为了维持目的肽的溶解性，在工序(1)～(5)中至少有一个工序添加了表面活性剂和/或盐。
11.权利要求1记载的制造方法，其特征是：宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
12.权利要求11记载的制造方法，其特征是：宿主细胞是大肠杆菌。
13.权利要求1或3记载的制造方法，其特征是：目的肽是酰胺化肽。
14.权利要求13记载的制造方法，其特征是：目的肽是具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物。
15.权利要求14记载的制造方法，其特征是：附加了辅助肽的具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物的等电点为8～12。
16.权利要求14或15记载的制造方法，其特征是：具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物的等电点为4.5～9.0。
17.权利要求14或15记载的制造方法，其特征是：具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物的等电点为5.5～7.5。
18.权利要求13记载的制造方法，其特征是：在纯化工序中使用了离子交换树脂。
19.权利要求18记载的制造方法，其特征是：离子交换树脂是阳离子交换树脂。
20.权利要求13记载的制造方法，其特征是：在纯化工序中使用了反相或疏水性层析。
21.权利要求13记载的制造方法，其特征是：为了维持目的肽的溶解性，添加了表面活性剂和/或盐。
22.权利要求14记载的制造方法，其特征是：得到的具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物的纯度在98％以上。
23.权利要求1或13记载的制造方法，其特征是：在最终纯化物中内毒素的含量在0.03unit/mg以下。
24.糖尿病治疗用医药组合物，是以通过权利要求1记载的制造方法得到的具有促胰岛素释放活性的GLP-1衍生物作为有效成分的。
25.含有编码在附加了辅助肽的目的肽基础上又进一步附加了保护肽的融合蛋白的碱基序列的表达载体，其中所述融合蛋白在(a)所述辅助肽与目的肽之间、以及(b)保护肽与构成附加了辅助肽的目的肽的该辅助肽或该目的肽之间存在断裂位点。
26.根据权利要求25的载体，其是质粒pGP97ompPR。
27.被含有编码在附加了辅助肽的目的肽基础上又进一步附加了保护肽的融合蛋白的碱基序列的表达载体转化了的原核细胞或真核宿主细胞，其中所述融合蛋白在(a)所述辅助肽与目的肽之间、以及(b)保护肽与构成附加了辅助肽的目的肽的该辅助肽或该目的肽之间存在断裂位点。
28.权利要求27记载的宿主细胞，其特征是：宿主细胞是大肠杆菌。
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