CN1030999C - 胰蛋白酶抑制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一个肽，它基本上具有胰分泌性胰蛋白酶抑制剂(PSTI)的氨基酸结构。本发明涉及这个肽中其原始顺序中的一个或几个氨基酸被其它氨基酸替换所产生的各种变异体。这些肽在它们的抑制作用中表现出经改良的特异性。同时也描述了一种这些肽的制备方法及其药用方法。

Description

胰蛋白酶抑制剂的制备方法
本发明涉及一个微生物产生的肽，这个肽基本上具有人胰腺分泌性胰蛋白酶抑制剂(h-PSTI)的氨基酸序列。本发明还涉及这个肽中其原始顺序中的一个或几个氨基酸被其它氨基酸替换所产生的各种变异体。这些肽在它们的抑制作用中具有一种改良的特异性。本发明也描述了这些肽的制备方法和它们在药物学上的应用。
多形核粒细胞的溶酶体弹性蛋白酶(白细胞弹性蛋白酶)是一种强力的细胞内蛋白酶，它贮存在溶酶体中，在吞噬溶酶体中发挥其细胞内降解蛋白的生理力能。(J.G.Bieth1986，P.217-320，in Regulation of Matrix Accumulation，Mecham ed.，AcademicPress，Orlando)。溶酶体蛋白酶(弹性蛋白酶，组织蛋白酶G等)的主要功能是降解吞入的机体本身的物质(如代谢产物，损伤组织)或侵入机体的生物(细菌，病毒，霉菌等)，(H.Fritzet al(1984)，in Selected Topics in Clinical Enzymology，Goldberg and Wernered.，Walter de Gruyter，Berlin Vol.2，P305-328)。
弹性蛋白酶一旦释放到细胞外(血液或组织液)，即迅速被内源性强抑制剂如血浆中的α1-PI(α1-蛋白酶抑制剂；J，Travis and G.S.Salvesen，(1983)，Ann.Rev.Biochem P.655-709)和/或粘液分泌物中的抗白细胞蛋白酶(又名HUSI-I，人类精液蛋白酶抑制剂)所结合(H.Schiessler et al(1978)P.195-207，in Neutral Proteases of Human PolymorphonuclearLeukocytes，Havemann and Janoff ed.，Urban and Schwarzenberg，Baltimore)。
由于遗传性α1-PI缺乏症(J.B.Bieth，1986)或作为弹性蛋白酶大量释放于细胞外的结果(急慢性炎症，多处创伤或休克；H.Fritz et al，1984)，机体利用天然蛋白酶抑制剂保护弹性蛋白酶不被降解的作用相对不足。由于(ⅰ)和弹性蛋白酶形成复合物，(ⅱ)被各种溶酶体蛋白酶水解失活。尤其是(ⅲ)被氧化失活(α1-PI)，内源性蛋白酶抑制剂过度地有时甚至局部性全部地被消耗了(J.B.Bieth(1986)；H.Fritz et al(1984)；J.Travis andG.S.Salvesen(1983)；见上)
其结果是，由于弹性蛋白酶和其他溶酶体蛋白酶(如组织蛋白酶G)引起结缔组织和体液蛋白(包括凝固蛋白，纤溶蛋白，补体成份)的广泛的蛋白降解，导致严重的临床症状如肺气肿，休克肺，成人呼吸窘迫综合症，血凝固症，肝肾衰竭等等(除了上述参考文献以外，还可补充：Neue Wege in der Entzündungsdiagnostik，PMN Elastase；M.Jochum etal(ed)，(1985)，GIT                                     Verlag，Darmstadt；C.T.Leeetal，(1981)，N.Engl.J.Med.，304，192-196；W.W.McGuire et al，(1982)，J.Clin.Invest.69，543)。
弹性蛋白酶也在风湿性关节炎的局部炎症发生过程中起作用，如降解结缔组织成分(K.Kleesiek et al(1985)in Neue Wege in der Entzündungsdiagnostik，PMNElastase，P.71-82)。
在严重创伤后或在某些疾病如败血性休克，休克肺等中，弹性蛋白酶的胞外释放可利用酶免疫测定法进行常规监测(S.Neumann and M.Jochum，(1984)，P.184-195 in Methods ofEnzymatic Analysis，Bergmeyer(ed)，Verlag Chemie，Weinheim)。
在败血症和肺气肿的实验模型中，合成的弹性蛋白酶抑制剂(J.C.Powers，Am.Rev.Respir.Dis.，(1983)，127，554 558)和动物来源的天然抑制剂如eglinC(H.P.Schneblic et al，(1985)，Eur.J.Respir.Dis.66，Suppl.139 P.66 70)已被证明是有治疗作用的。为了避免有毒副作用，尤其是需要长期治疗时(如在α1-PI缺乏症(肺气肿)的治疗过程中)的过敏反应，应用人来源的蛋白酶抑制剂将是更可取的。
由于人α1-PI是高分子量的糖蛋白，所以在不久的将来用基因工程方法来大量生产是很难实现的。
抗白细胞蛋白酶或HUSI-I(H.Schiessler et al，1978，and U.Seemüller et al(1986)FEBSLetters199，43-48)的分子量为14,000道尔顿，它有二个活性区，一个针对弹性蛋白酶，另一个针对胰蛋白酶。因此，这类抑制剂的选择性比较低，不是弹性蛋白酶的特异性抑制剂。对胰蛋白酶或其类似酶的抑制，通常在上述治疗中不是我们所期望的。
人胰腺分泌PSTI，一种低分子量(6.2千道尔顿)的蛋白酶抑制剂。它能特异性地抑制胰蛋白酶，即它对某一特定类型的蛋白酶具有高选择性。
本发明的一个优点是利用DNA重组技术，替换PSTI中的仅仅一个(或很少几个)氨基酸，使产生的PSTI变异体表现为对白细胞弹性蛋白酶具有高度特异性的高效蛋白酶抑制剂。况且，由于它的相对较低的分子量，弹性蛋白酶PSTI衍生的复合物应同样能通过肾脏。因此，释放于细胞外的弹性蛋白酶可以高效率地被清除。借助于人来源的PSTI和其低分子量的事实，可以预期PSTI衍生物的临床应用将避免因这些物质被免疫系统识别为外来蛋白而引起的并发症。
与α1-PI和抗白细胞蛋白酶相比，PSTI的另一个主要优点是，当炎症过程中有强氧化剂产生并释放到细胞外时，PSTI对氧化失活不敏感。所以，和α1-PI或抗白细胞蛋白酶相比，较低剂量的PSTI衍生物就足以达到类似的保护作用。
所以，本发明的一个目的是提供具有蛋白酶抑制活性的药用肽，最好具有更高的特异性和/或更强的抑制效率。所述的肽即是指具有胰分泌性胰蛋白酶抑制剂(PSTI)序列的肽，而其变异体是经DNA重组技术所产生。“变异体”这个术语是指亲本肽中一个或多个氨基酸被其他天然存在的氨基酸所替换。将人胰腺胰蛋白酶抑制剂(h－PSTI＝PSTI0)的序列用作亲本序列。肽中氨基酸被替换的优选位置是第17，18，19，20，21，29，32及36位。更特殊地，本发明所涉及的肽，除了结合体：Leu13-Asn14-Thr17-Lys18-Ile19-Tyr20-Asn21-Asp29-Pro32-Val36        和Leu13-Asn14-Thr17-Lys18-Ile19-Tyr20-Asn21-Asp29-Pro32-Val36外，基本上具有PSTI0的序列(L.J.Greene，1976，Methods Enzymol.，45,813-825)，包括下列氨基酸：
第13位：Glu，Asp或Leu，
第14位：Glu，Asp或Asn，
第17位：Thr，Pro，Ser，Arg，Leu或Met；
第18位：Leu，Met，Val，Gln，Ser，Ala，Thr，Ile，Tyr，Phe，Arg，Trp或Lys；
第19位：Glu，Asp，Leu或Ile；
第20位：Tyr，Phe，Asp，Asn，Leu，Glu，Gln，His或Arg；
第21位：Glu，Arg，Met，Phe，Lys，Val，Thr，Gln，Leu，Asp或Asn；
第29位：Lys，Glu，Ile，Gln，Asp或Asn；
第32位：Pro，Gly，Ser，Asn，Ala，Asp，Val，Arg或His；
第36位：Asn，Asp，Ala，Ser，Gly，Tyr，Val或Glu。
下文的表I是关于一些变异体的，如果第32及36位氨基酸分别为脯氨酸和缬氨酸，那么，PSTI O即为亲本序列。
表1中公开的变异体在其32位及36位上可以用上面列出的氨基酸作进一步的改变。
本发明也涉及这样一些肽，它们具有上述序列，而且在它们的-1位有一个甲硫氨酸或者一个前导肽。本发明中所用的术语“前导肽”不仅是指促进表达产物分泌的信号序列(S.D.Emr et al.J.of Cell Biol.，1980，86，P，701-711)，而且也指包含一个信号序列和一个连在PSTI序列前的联结序列的肽。
表I：各种PSTI变异体
      位置     17     18     19     20     21     29
    PSTI  0    Thr    Lys    Ile    Tyr    Asn    Asp
    PSTI  1    Thr    Leu    Ile    Tyr    Asn    Asp
    PSTI  2    Thr    Leu    Ile    Tyr    Asp    Asn
    PSTI  3    Thr    Tyr    Glu    Tyr    Arg    Asp
    PSTI  4    Thr    Leu    Glu    Tyr    Arg    Asp
    PSTI  5    Thr    Val    Glu    Tyr    Arg    Asp
    PSTI  6    Thr    Leu    Glu    Tyr    Asn    Asp
    PSTI  7    Thr    Leu    Ile    Tyr    Arg    Asp
    PSTI  8    Thr    Val    Glu    Leu    Asn    Asp
    PSTI  9    Thr    Val    Glu    Leu    Arg    Asp
    PSTI 10    Pro    Lys    Ile    Tyr    Asp    Asn
    PSTI 11    Pro    Leu    Glu    Tyr    Arg    Asp
    PSTI 12    Pro    Val    Glu    Tyr    Arg    Asp
    PSTI 13    Thr    Ile    Glu    Tyr    Asn    Asp
    PSTI 14    Thr    Arlg   Glu    Tyr    Asn    Asp
    PSTI 15    Thr    Phe    Glu    Tyr    Asn    Asp
    PSTI 16    Thr    Ala    Glu    Tyr    Asn    Asp
    PSTI 17    Thr    Val    Ile    Tyr    Asn    Asp
    PSTI 18    Thr    Ile    Ile    Tyr    Asn    Asp
    PSTI 19    Thr    Val    Ile    Tyr    Asn    Asn
    PSTI 20    Thr    Ile    Ile    Tyr    Asn    Asn
    PSTI 21    Thr    Ile    Glu    Tyr    Arg    Asp
    PSTI 22    Thr    Tyr    Ile    Tyr    Asn    Asp
    PSTI 23    Thr    Phe    Ile    Tyr    Asn    Asp
    PSTI 24    Thr    Lys    Glu    Tyr    Arg    Asp
本发明也涉及编码所述肽的DNA。本发明尤其涉及下文称为“主导基因”的一段DNA，它有一定的下列序列及其功能等效序列。
Figure C8810014600061
“功能等效序列”是指，上述DNA序列的衍生物也可用来表达同样的蛋白。本领域技术人员知道，在某些密码中，可以有一个，二个或三个碱基可被其他碱基取代而不影响一个特定蛋白质中所掺入的氨基酸。为了得到肽的变异体，用DNA技术来修饰主导基因，即用其他氨基酸的密码子取代特定位置的氨基酸的密码子。为获得编码一种根据本发明的肽变异体的DNA，可将下列各位置的氨基酸的密码子用其他密码子代替。这些位置是：17，18，19，20，21，29，32和36。
发生这种替换的较好的密码子是编码前面所列出的氨基酸的密码子。根据所采用的表达系统，本发明的DNA也可以是编码上述肽之一的DNA，该DNA在其上游还带有一个编码前导肽的序列。
本发明的另一个目的是一种表达载体，也叫作质粒，它含有编码本发明中某一肽的DNA。质粒被用于寄主生物的转化作用。本发明也涉及这种转化的微生物。本领域技术人员知道，许多种微生物都适于进行转化。质粒的性质主要取决于所用的宿主生物。
用含本发明的DNA的质粒转化的宿主生物用于生产上述肽及其变异体。生产过程包括以下步骤：
a)适宜条件下培养宿主生物
b)从培养物中回收肽
c)纯化所得的肽
肽的纯化可以用已知的蛋白质化学方法，例如沉淀、层析和电泳来达到。前面所提到过的连接肽可以是一个很有用的纯化工具，因为它可以方便地用作纯化把手(handle)。例如，如果连接肽主要包括碱性或酸性氨基酸，那么在表达产物的纯化过程中，离子交换层析可能是很有效的。
本发明也涉及到含有上述肽的药用组合物和制剂，以及在药用组合物的制备过程中上述肽的用途。这些药用组合物在上述治疗中是很有效的。
这种药用制剂除了含有无毒、填性的适于药用的赋形剂以外，还含有一种或多种根据本发明的化合物，或者，该制剂由一种或多种有活性的根据本发明的化合物组成。
本发明也包括药用制剂的剂量单位。就是说这些制剂是以几种不同的剂型存在的，例如片剂，包裹片剂，胶囊，药丸，栓剂和针剂，不同剂型中活性化合物的含量与个体剂量的分数或倍数是相应的。例如，剂量单位可包括1倍，2倍，3倍或4倍的个体剂量或1/2，1/3，1/4或1个个体剂量。一个个体剂量所含活性化合物的量最好是一次内服量，而且常常相应于1，1/2，1/3或1/4的日剂量。
无毒、惰性、恰当的赋形剂，一般认为有所有种类的固体、半固体或液体稀释剂、慎充剂和成形辅助剂。
片剂，包裹片剂，胶囊，丸剂，粒剂，栓剂，溶液，悬浮和乳剂，糊剂，软膏，凝胶体，油膏，洗剂，粉剂和喷雾剂，都可提出来作为优选的药用制剂。
片剂，包裹片剂，胶囊，丸剂和粒剂，可含有活性化合物或掺有常用赋形剂的化合物，这些赋形剂如(a)填充剂和膨胀剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅石；(b)结合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮；(c)致湿剂，如甘油；(d)崩解剂，如琼脂琼脂、碳酸钙和碳酸钠；(e)溶液阻滞剂，石蜡；(f)促吸收剂，如季铵化合物；(g)湿润剂，如鲸蜡醇、甘油单硬脂酸酯；(h)吸附剂，如高岭土和皂土；(i)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙和硬脂酸镁、固体聚乙二醇；或者上面(a)-(i)中所列物质的混合物。
片剂、包裹片剂、胶囊、丸剂和粒剂可以用常规包衣和外壳制得，可随意含有浑浊剂。它们也可以是这样一种组合物，即它随意地以迟缓释放的形式在肠道的一定部位只优先释放这种活性化合物，可使用的包埋组合物的例子是聚合物和蜡。
任意与一种或多种上述赋形剂混合的活性化合物，也可以是微胶囊的形式。
除了活性化合物，栓剂还可含有常规的水溶性或水不溶性赋形剂，如聚乙二醇、脂肪，如可可豆脂肪和高级酯(如C16脂肪酸与C14醇形成的脂)，或这些物质的混合物。
除了活性化合物，软膏、糊剂、油剂和凝胶还可含有常规赋形剂，如动植物脂肪、蜡、石蜡、淀粉、西黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、皂土、硅石、滑石和氧化锌，或这些物质的混合物。
粉剂和喷雾剂除了活性化合物外，还可含有常规赋形剂，例如乳糖、滑石、硅石、氢氧化铝，硅酸钙，聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂还可以含有常规推进剂，如氯氟烃。
溶液和乳剂除了含有活性化合物外，还可含有常规赋形剂，例如溶剂、促溶剂和乳化剂，如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类、尤其是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油，甘油、甲缩醛甘油、四氢糖醇、聚乙二醇和脱水山梨醇的脂肪酸酯，或这些物质的混合物。
对非肠道使用来说，溶液和乳剂也可以是无菌的、与血液等渗的形式。
悬液除了含有活性化合物外，还可含有常规赋形剂，例如，液体稀释剂如水、乙醇、丙二醇，悬浮剂如乙氧基化的异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨醇和脱水山梨醇的酯、微晶纤维素、金属氢氧化铝、皂土、琼脂琼脂和西黄蓍胶，或这些物质的混合物。
上述配方形式还可含有染料、保护剂和各种改善气味和味道的添加剂，如薄荷油和桉树油，以及甜味剂如糖精。
在上述药物制剂中，具有治疗活性的化合物的浓度应最好为约0.1～99.5，最好是约0.5-95(占混合物总重量的百分比)。
上述药物制剂除了含有根据本发明的化合物外，还可包括其他的药用活性化合物。
上述药用制剂按照已知的通用方法制备，比如，将活性化合物与赋形剂混合。
这些活性化合物或者药用制剂可以局部使用、口服、非肠道途径给予，腹腔内注射和/或直肠给药，最好是口服或非肠道给药，如静脉注射或肌肉注射。
一般来说，为了达到预期的疗效，根据本发明的活性化合物用药总量为每24小时每千克体重约0.5～约500mg，最好是5～100mg。这个剂量在人和牲畜中已证明是有利的，而且可随意采用几次给药形式。一次给药所含的根据本发明的活性化合物的量，最好是约1-约250mg/kg体重，尤其是3-60mg/kg体重。然而，考虑到治疗对象的性质和体重、疾病的性质和严重程度、制剂的性质和给药途径，给药的时间或间隙等因素，可能有必要对上述剂量进行修正。
这样，在某些情况下低于上述剂量的活性化合物即足以达到疗效，而另一些情况下必须超过上述剂量才能达到疗效。本领域任何专业人员能根据自己的专门知识，轻而易举地决定特定需要的活性化合物的最适剂量及其引入途径。
PSTI可以从胰腺中分离，但是不能大量得到，尤其是人的PSTI。
由此可以看出，重组DNA及其有关技术的应用将会有效地提供数量大、质量高的h-PSTI以及这类肽的各种变异体。根据在许多情况中已知的不稳定现象，一个外来蛋白在重组细菌中的产生并非容易(B.E.ButterworthandB.D.Kovant：J.Virol.，14，(1984)，282-291，D.V.Goeddel                                        etal：Proc.Natn.Acad.Sci.，USA，76，(1979)，106-110，M.Inouye et al in“The future in nucleic acidresearch”，I.Watanabe ed.，(Tokyo，Academic Press)，(1983))。在链长相对较短的肽的表达中，不稳定尤其是一个难题。
人类胰腺所分泌的低分子量(6.2千道尔顿)蛋白酶抑制剂PSTI，能特异性地抑制胰蛋白酶，即它对一种特定类型的蛋白酶具有高选择性。
本发明的一个优点是，通过重组DNA技术使PSTI中仅仅一个(或少数几个)氨基酸发生替换，产生PSTI变异体，这种变异体是一种对白细胞弹性蛋白酶具有高度特异性的高效蛋白酶抑制剂。而且，由于它的分子量相对较低，弹性蛋白酶和PSTI衍生物的复合物也可通过肾脏。所以，可以高效地清除细胞外释放的弹性蛋白酶。根据PSTI是来源于人而且分子量较低的事实，可以预见，PSTI衍生物的临床应用，将避免因这些物质被免疫系统识别为外来蛋白而引起的并发症。
和α1-PI及抗白细胞蛋白酶相比，PSTI的另一个主要优点是对炎症过程中产生并释放于细胞外的强氧化剂所引起的氧化失活不敏感。结果，与α1-PI或抗白细胞蛋白酶相比，较低剂量的PSTI衍生物即足以达到类似的保护效果。
基因序列
利用在高度表达的大肠杆菌(E.Coli)基因中最常出现的那些密码子，将h-PSTI的氨基酸序列反翻译成DNA主导基因序列(Gouy，M.and Gautier，C.，(1982)，Nucleic AcidsRes.，10，7055-7074)，见图1。对于PSTI变异体的氨基酸替换(表1)，则在主导基因中变换相应的密码子(见下文表2)。
表2中带有星号的密码子是通用的，但有下面一些例外：Thr26(ACC)存在于所有基因中，在位置72-77产生一个KpnI位点。
Lys18(AAG)存在于PSTI-0和PSTI-10中，在位置53-58产生一个BgIII位点。
Gly28(GGC)存在于PSTI-2，-10，-19，-20中，达到相应寡核苷酸片段的适当杂交(见下文)。
Pro17(CCT)存在于PSTI-11中，在位置51～56产生一个
+Leu18(CTA)XbaI位点。
基因的5′末端：第一个密码子，含有HincII位点的后半部分GTP yPuAc。
基因的3′末端：终止密码子TGA与EcoRI位点(170-175)重叠，后面是一个HindIII位点(176～181)和一个NCoI粘性末端(182-186)。
                    表2：密码子使用表
Ala    Arg    Asp    Asn    Cys    Glu    Gln    Gly    His    Ile
GCA    AGA    GAC*   AAC*   UGC*   GAA*   CAA    GGA    CAC    AUA
GCC    AGG     GAU    AAU    UGU    GAG   CAG*   GGC    CAU    AUC*
GCG    CGA                                       GGG           AUU
GCU*   CGC                                       GGU*
       CGG
       CGU*Leu      Lys      Met    Phe     Pro    Ser    Thr   Trp    Tyr    Val     终止UUA      AAA*     AUG    UUC*    CCA    AGC    ACA   UGG     UAC*  GUA     UAAUUG       AAG            UUU     CCC    AGU    ACC           UAU   GUC     UAGCUA                              CCG*   UCA    ACG                 GUG     UGA*CUC                              CCU    UCC    ACU*                GUU*CUG*                                    UCGCUU                                     UCU*
简单说来，PSTI基因的构建如下：
1.合成25个短的寡核苷酸链(就每条互补链而言，而别为12和13个)，
   2    ………………    22        24
—      —           —        —
1       3………………23        25
由此对一些变异体合成一些特异性片段(见下文表3)，经离子交换高效液相层析(HPLC)纯化大小合适的片段。
2.连接这些片段，形成一个具有成熟PSTI(氨基酸1-56)编码区的双链分子，这个分子在其氨基末端编码末端是一个“钝”末端，在其羧基末端的编码末端有一个GATC单链5′伸展尾。为了减少错误的连接产物，重要的是在这一步合成最适寡核苷酸序列。
3.在各种载体如PUC8、PGV451、M13mp18中进行克隆以进行序列分析(见“方法”部分)。
4.用特异的合成寡核苷酸在M13噬菌体载体中进行单链突变，产生进一步的变异体。
表3
数字的意义：
第1栏：片段号码(见图I)
第2、3栏：该片段在主导基因序列中第1个和最后1个核苷酸的位置(5′→3′)
第4栏：片段的核苷酸序列(5′→3′)
黑点表示不同于主导基因序列的片段，而且这些片断是构建基因变异体所必需的。
PSTI0(区段I)-主导基因
列出片段1-11：
1    7   1  GAGAGTC
2    1   13 GACTCTCTGGGTC
3    23  8  TTAGCTTCACGACCCA
4    14  30 GTGAAGCTAAATGCTAC
5    39  24 CAGTTCGTTGTAGCAT
6    31  47 AACGAACTGAACGGTTG
7    54  40 CTTAGTGCAACCGTT
8    48  60 CACTAAGATCTAC
9    66  55 CGGGTTGTAGAT
10   61  74 AACCCGGTTTGCGG
11   81  67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI0(区段II)-主导基因
列出片段12-25：
12  75  89  TACCGACGGTGACAC
13  97  82  TCGGGTAAGTGTCACC
14  90  105 TTACCCGAACGAATGC
15  113 98  CACAGAACGCATTCGT
16  106 121 GTTCTGTGCTTCGAAA
17  129 114 TTTACGGTTTTCGAAG
18  122 137 ACCGTAAACGTCAGAC
19  145 130 GGATAGAAGTCTGACG
20  138 152 TTCTATCCTGATCCA
21  160 146 CAGATTTCTGGATCA
22  153 167 GAAATCTGGTCCGTG
23  174 161 AATTCAGCACGGAC
24  168 182 CTGAATTCAACCTTC
25  186 175 CATGGAAGCTTG
PSTI1(区段1)
列出片段1-11：
 1     7   1  GAGAGTC
 2     1  13  GACTCTCTGGGTC
 3    23   8  TTAGCTTCACGACCCA
 4    14  30  GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39  24  CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31  47  AACGAACTGAACGGTTG
*7    54  40  CAGAGTGCAACCGTT
*8    48  60  CACTCTGATCTAC
 9    66  55  CGGGTTGTAGAT
10    61  74  AACCCGGTTTGCGG
11    81  67  GTCGGTACCGCAAAC
PSTI2(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGACTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3    23    8 TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40 CAGAGTGCAACCGTT
*8    48   60 CACTCTGATCTAC
*9    66   55 CGGGTCGTAGAT
*10   61   74 GACCCGGTTTGCGG
11    81   67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI3(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGAGTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3    23    8 TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40 GTAAGTGCAACCGTT
*8    48   60 CACTTACGAATAC
*9    66   55 CGGACGGTATTC
*10   61   74 CGTCCGGTTTGCGG
11    81   67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI4(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGAGTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3   23    8  TTAGCTTCACGACCCA
 4   14   30  GTGAAGCTAAATGCTAC
 5   39   24  CAGTTCGTTGTAGCAT
 6   31   47  AACGAACTGAACGGTTG
*7   54   40  CAGAGTGCAACCGTT
*8   48   60  CACTCTGGAATAC
*9   66   55  CGGACGGTATTC
*10  61   74  CGTCCGGTTTGCGG
11   81   67  GTCGGTACCGCAAAC
PSTI5(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGAGTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3    23    8 TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40 AACAGTGCAACCGTT
*8    48   60 CACTGTTGAATAC
*9    66   55 CGGACGGTATTC
*10   61   74 CGTCCGGTTTGCGG
11    81   67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI6(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGACTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3    23    8 TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40 CAGAGTGCAACCGTT
*8    48   60 CACTCTGGAATAC
*9    66   55 CGGGTTGTATTC
10    61   74 AACCCGGTTTGCGG
11    81   67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI7(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGAGTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3    23    8 TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7   54  40   CAGAGTGCAACCGTT
*8   48  60   CACTCTGATCTAC
*9   66  55   CGGACGGTAGAT
*10  61  74   CGTCCGGTTTGCGG
11   81  67   GTCGGTACCGCAAAC
PSTI13(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGAGTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3    23    8 TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40 GATAGTGCAACCGTT
*8    48   60 CACTATCGAATAC
*9    66   55 CGGGTTGTATTC
10    61   74 AACCCGGTTTGCGG
11    81   67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI14(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGAGTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3    23    8 TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40 ACGAGTGCAACCGTT
*8    48   60 CACTCGTGAATAC
*9    66   55 CGGGTTGTATTC
10    61   74 AACCCGGTTTGCGG
11    81   67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI15(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGAGTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3    23    8 TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40 GAAAGTGCAACCGTT
*8    48   60 CACTTTCGAATAC
*9    66   55 CGGGTTGTATTC
10    61   74 AACCCGGTTTGCGG
11    81   67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI16(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGAGTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3    23    8 TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40 AGCAGTGCAACCGTT
*8    48   60 CACTGCTGAATAC
*9    66   55 CGGGTTGTATTC
10    61   74 AACCCGGTTTGCGG
11    81   67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI17(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGAGTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3    23    8 TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40 AACAGTGCAACCGTT
*8    48   60 CACTGTTATCTAC
 9    66   55 CGGGTTGTAGAT
10    61   74 AACCCGGTTTGCGG
11    81   67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI18(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGAGTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3    23    8 TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40 GATAGTGCAACCGTT
*8    48   60 CACTATCATCTAC
 9    66   55 CGGGTTGTAGAT
10    61   74 AACCCGGTTTGCGG
11    81   67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI19(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGAGTC
 2     1  13  GACTCTCTGGGTC
 3    23   8  TTAGCTTCACGACCCA
 4    14  30  GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39  24  CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31  47  AACGAACTGAACGGTTG
*7    54  40  AACAGTGCAACCGTT
*8    48  60  CACTGTTATCTAC
*9    66  55  CGGGTCGTAGAT
*10   61  74  GACCCGGTTTGCGG
11    81  67  GTCGGTACCGCAAAC
PSTI20(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGAGTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3    23    8 TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40 GATAGTGCAACCGTT
*8    48   60 CACTATCATCTAC
*9    66   55 CGGGTCGTAGAT
*10   61   74 GACCCGGTTTGCGG
11    81   67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI-A(区段II)
列出片段12-25：
 12   75   89 TACCGACGGTGACAC
*13   97   82 TAGCGTAAGTGTCACC
*14   90  105 TTACGCTAACGAATGC
 15  113   98 CACAGAACGCATTCGT
 16  106  121 GTTCTGTGCTTCGAAA
 17  129  114 TTTACGGTTTTCGAAG
 18  122  137 ACCGTAAACGTCAGAC
 19  145  130 GGATAGAAGTCTGACG
 20  138  152 TTCTATCCTGATCCA
 21  160  146 CAGATTTCTGGATCA
 22  153  167 GAAATCTGGTCCGTG
 23  174  161 AATTCAGCACGGAC
 24  168  182 CTGAATTCAAGCTTC
 25  186  175 CATGGAAGCTTG
 PSTI-S(区段II)
列出片段12-25：
 12   75   89 TACCGACGGTGACAC
*13   97   82 TAGAGTAAGTGTCACC
 *14   90  105 TTACTCTAACGAATGC
 15   113   98 CACAGAACGCATTCGT
 16   106  121 GTTCTGTGCTTCGAAA
 17   129  114 TTTACGGTTTTCGAAG
 18   122  137 ACCGTAAACGTCAGAC
 19   145  130 GGATAGAAGTCTGACG
 20   138  152 TTCTATCCTGATCCA
 21   160  146 CAGATTTCTGGATCA
 22   153  167 GAAATCTGGTCCGTG
 23   174  161 AATTCAGCACGGAC
 24   168  182 CTGAATTCAAGCTTC
 25   186  175 CATGGAAGCTTG
 PSTI2，10，19，20(区段II)
列出片段12-25：
 *12   75   89 TACCGACGGCAACAC
 *13   97   82 TCGGGTAAGTGTTGCC
 14    90  105 TTACCCGAACGAATGC
 15   113   98 CACAGAACGCATTCGT
 16   106  121 GTTCTGTGCTTCGAAA
 17   129  114 TTTACGGTTTTCGAAG
 18   122  137 ACCGTAAACGTCAGAC
 19   145  130 GGATAGAAGTCTGACG
 20   138  152 TTCTATCCTGATCCA
 21   160  146 CAGATTTCTGGATCA
 22   153  167 GAAATCTGGTCCGTG
 23   174  161 AATTCAGCACGGAC
 24   168  182 CTGAATTCAACCTTC
 25   186  175 CATGGAAGCTTG
PSTI21(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1  GAGAGTC
 2     1   13  GACTCTCTGGGTC
 3    23    8  TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30  GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24  CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47  AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40  GATAGTGCAACCGTT
*8    48   60  CACTATCGAATAC
*9    66   55  CGGACGGTATTC
*10   61   74  CGTCCGGTTTGCGG
 11   81   67  GTCGGTACCGCAAAC
PSTI22(区段1)
列出片段1-11：
 1     7    1 GAGAGTC
 2     1   13 GACTCTCTGGGTC
 3    23    8 TTAGCTTCACGACCCA
 4    14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
 5    39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
 6    31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40 CTAAGTGCAACCGTT
*8    48   60 CACTTACATCTAC
 9    66   55 CGGGTTGTAGAT
10    61   74 AACCCGGTTTGCGG
11    81   67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI23(区段1)
列出片段1-11：
  1    7    1 GAGAGTC
  2    1   13 GACTCTCTGGGTC
  3   23    8 TTAGCTTCACGACCCA
  4   14   30 GTGAAGCTAAATGCTAC
  5   39   24 CAGTTCGTTGTAGCAT
  6   31   47 AACGAACTGAACGGTTG
*7    54   40 GAAAGTGCAACCGTT
*8    48   60 CACTTTCATCTAC
 9    66   55 CGGGTTGTAGAT
10    61   74 AACCCGGTTTGCGG
11    81   67 GTCGGTACCGCAAAC
PSTI24(区段1)
列出片段1-11：
  1    7    1 GAGAGTC
  2    1   13 GACTCTCTGGGTC
  3    23   8 TTAGCTTCACGACCCA
  4    14  30 GTGAAGCTAAATGCTAC
  5    39  24 CAGTTCGTTGTAGCAT
  6    31  47 AACGAACTGAACGGTTG
*7     54  40 TTTAGTGCAACCGTT
*8     48  60 CACTAAAGAATAC
*9     66  55 CGGACGGTATTC
*10    61  74 CGTCCGGTTTGCGG
 11    81  67 GTCGGTACCGCAAAC
基因构建
所设计的基因序列被分割成许多寡核苷酸片段(图I)。这些片段都有独特的重叠，以保证在多成分反应中DNA双链准确地酶促装配。
构建PSTI基因变异体的基本策略包括分别组装基因的二个区段：
区段I从片段1到11，包括了17-21位的可变氨基酸位置；
区段II从片段12到25，包括了29和32位的可变氨基酸位置。
表3给出了用于组装不同的区段I和II的寡核苷酸片段的各种组合。黑点表示不同于主导基因的片段。
区段I和区段II的相应配对物的酶促连接可产生所期望的完整基因变异体。同时，在区段I的5′-末端进行平末端连接，在区段II的3′-末端进行粘末端连接，可首先产生基因多体。利用HincII和HindIII、EcoRI和NCoI三者中任一种即可将单体基因从多体中切下来。
方法
寡核苷酸片段的化学合成
所有必需的寡聚脱氧核糖核苷酸是经已建立的磷酸三酯化学法合成的。反应在作为分段载体的纤维素板上进行(Frank et al.(1983)Nucleic Acids Res.，11，4365-4377)。利用离子交换HPLC，在Whatman Partisil SAX-10柱上用在60％甲酰胺水溶液中的磷酸三乙铵(PH6.3)进行梯度洗脱，从而纯化这些寡核苷酸片段。
寡核苷酸片段连接成区段I和IIDNA双链
将等摩尔量(50pmol)的每种寡核苷酸片段(见表3)合并在硅化的塑料管中(A管：含有上链的片段；B管：含有下链的片段)。不能磷酸化的(例如作为双链的末端)片段1，11，12，25合并在另一个管中(C管)，然后干燥。在A管和B管中加入过量3倍的[γ-32-P]ATP(约2ci/mmol)，使寡核苷酸于37℃下在其5′-羟基末端进行磷酸化反应，持续30分钟，10μl的反应混合物中含有60mM Tris-HCl(PH8)，6mM MgCl2，10mM DTE和2个单位的T4PNK。定量磷酸化反应后，加热A管和B管到95℃，维持2分钟，使T4PNK失活，然后将其内容物转移到C管，加入10mM DTE、0.2mMATP和2单位的T4DNA连接酶，将该混合物置于40℃下保温1小时。冷却到37℃后，再加入2单位的T4DNA连接酶，然后继续在37℃保温1小时，30℃3小时，15℃过夜。然后取各等分混合物置于0.04×20×40cm、不致变性的10％聚丙烯酰胺凝胶上(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺-29∶1，50mM Tris硼酸盐(pH8.3)，1mM EDTA)进行电泳分析，在恒温25℃下，于1000V进行电泳，直到BPB移动25cm为止。凝胶电泳的样品以含0.05％XC、0.05％BPB、10mM EDTA和4M尿素的混合液上样，上样前不加热。最初的反应混合物贮存在-20℃，直到凝胶电泳的结果表明反应产物已达到所期望的长度。
接着，于65℃下加热15分钟使DNA连接酶失活。于上述条件下，在1mm厚凝胶上进行制备凝胶电泳，将连接产物从反应混合物中分离出来。
完整PSTI基因变异体的组装
将10pmol相应的区段I和IIDNA合并，在37℃下进行磷酸化反应30分钟，20μl的反应混合物中含有60pmol[γ-32P]ATP(200ci/mmol)，60mM Tris·HCl(pH8)，6mMMgCl2，10mMDTE，2单位T4PNK。接着，加入2μl1mMATP和2单位T4DNA连接酶，然后在15℃下保温过夜。调整反应混合物至限制性内切酶发挥消化作用所需的合适缓冲条件，同时，混合液也被释释到50/μl。
例如PSTI基因变异体
PSTI-1-Ala-32(-1A)，
PSTI 3-Pro-32-(-3P)
PSTI 6-Ser-32(-4A)和PSTI 5-Pro-32(5P)
都是按照上述方案构建的。
PSTI变异体基因的克隆
策略
如上述基因合成是从具有各种序列的合成基因片段上编码氨基酸17、18、19、20、21、29、32的那些位置起始的。PSTI-0到PSTI-24的命名(见表1)就是根据氨基酸17～21区域的特殊编码顺序，以及在32位上，密码是A(代表丙氨酸)，S(代表丝氨酸)，G(代表甘氨酸)，或P(代表脯氨酸)。
基因构建是这样设计的，即在位置72-76(图I)的KpnI位点断开后，区段I的变异体可以和区段II的变异体(如32位的变异体)进行重组。
更多的变异体可利用合成的寡核苷酸对克隆在M13mp单链噬菌体载体中的基因片段进行点特异性突变而得到，也可如上所述通过基因全合成而得到。
克隆
将5′端为平末端(氨基端编码端)，3′末端有一个HindIII位点的PSTI变异体基因(如PSTI-1A和PSTI-3P)克隆到HincII，HindIII限制质粒PUC8中(PUC-PSTI-1A和PUC-PSTI-3P)。
在NH2末端有一个额外甲硫氨酸的PSTI变异体(如Met-1-PSTI-4A)同样克隆到PUC8-NCoI(在HincII位点引入NCoI连接物CCCATGGG)中。PUC8-NCoI先用NCoI进行限制性酶解，在DNA聚合酶I(大片段)存在下用dNTP填充，再进一步用HindIII进行限制性酶解。将PSTI-4A变异体基因克隆进这个载体后，重新构成NCoI限制位点(PUC-Met-PSTI-4A)Maniatis，T.，Fritsch，E.G.，and Sambrook，J.，Molecular clon-ing，Cold Spring Harbor Publictions，Cold Spring Harbor，1982一书中描述了限制性酶切、连接、转化和β半乳糖苷酶活性“插入失活”的筛选等方法。
为了作进一步分析和某些变异体的DNA顺序，根据厂家(Boehringer Mannheim)说明书，将HincII-HindIII处理的PSTI片段克隆到M13mp(-8，9，18，19)载体中。
通过重组制备其它变异体
限制性核酸内切酶KpnI在所有构建PSTI基因的上链第76碱基后和下链第72碱基后切断，在3′末端产生4bp单链突出端(GTAC)。
PUC8-PSTI杂交分子的KpnI、ScaI双重切割后，得到二个片段，一个片段含有氨基酸残基17-21的变异体顺序，它是在基因的5′末端；另一个片段含有氨基酸29和32的变异，是在基因的3′末端。来源于不同质粒的片段的重新连接，可以产生具有变换了5′和3′区的新的PUC8-PSTI变异重组体(如从PSTI-OP和PSTI-1A开始，可以得到PSTI-OA和PSTI-1P)。大肠杆菌(Es ch eri ch ia coli)K-12菌株ΔM15和DH1常被用作重组PUC8-PSTI变异体的受体宿主(见ATCC31343和33625)。
通过点特异性突变制备其它变异体
根据Messing，J.and Viera，J，(1982)Gene，19，269-276的方法，该突变程序的起始物质是M13mp9-PSTI克隆，它是将HincII-HindIII处理PUC8-PSTI变异体得到的PSTI片段克隆到双链M13mp9噬菌体中而得到的。分离单链杂交噬菌体，使之与噬菌体M13mp9反转录线性负链杂交。然后将在突变点含有新变异体顺序的合成寡核苷酸与这个所谓的“缺口双链”(gapped duplex)杂交，经聚合酶I(klenow片段，Boehringer Mannheim)和DNA连接酶连续作用使之延长并连接，形成一个闭环双螺旋，在其突变点有碱基错配。将该DNA转化到缺乏错配修复能力的大肠杆菌Muts株BMH71-18中，产生高频率的M13mp9反转录PSTI变异体，这个变异体含有可用合成的“突变引物”来测定的新序列，而这个引物又可被大肠杆菌Sa-株(缺乏琥珀突变形抑制因子株)MK30-3所筛选。实验方案遵循Kramer，w.et al.，Nucl.Acids Res.，12(1984)所述方法。按照该方法构建PSTI 8P、-9P、-10P、-11P、-12P、-15P、-17P、-18P、-19P。
DNA测序
DNA测序按Sanger，F.etal.(1977)Proc.Natn.Acad.Sci.U.S.A.74，5463-5467所述，使用双脱氧方法在单链M13mp8、M13mp9、M13mp18、M13mp9(反转录)-PSTI分子上进行，对PGV451结构也可以按照Vockaert G.etal.，(1984)，Gene Analysis Techniques，1，52-59描述的特异末端标记和化学降解法进行。
在表达载体中克隆
将基因克隆到含有α-淀粉酶(枯草杆菌)或青霉素酰基转移酶(大肠杆菌)信号序列的大肠杆菌分泌性载体中，实现PSTI-变异体肽的生产。利用大肠杆菌分泌性载体来表达人类象PSTI那样的分泌性肽的优点是，一个融合的信号肽可以带着基因产物穿过细胞质膜进入外周胞质间隙，同时伴随着信号肽的加工(G.Kreil，(1981)，Ann.Rev.Biochem.，50，317-348)，并且以其成熟天然形式或作为一个在其氨基末端含有一个少数氨基酸组成的连接肽的融合产物，释放活性PSTI。
T.Maniatis et al.Molecular Cloning，Cold Spring Harbor，(1982)描述了限制性酶解的方法：在DNA聚合酶I(大片段)存在下用dNTP填充5′突出端，用S1核酸酶消化，进行DNA的凝胶电泳，分离DNA片段，连接并转化。
α淀粉酶分泌性载体PCH233和PCH2331的构建
将染色体DNA的部分Sau3A消化产物克隆到pMK3(M.A.Sullivan etal.，Gene(1984)29，21-26)的BamHI位点上，就可从枯草杆菌DSM704中得到枯草杆菌的α-淀粉酶信号序列(Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen，G_ttingen)。α-淀粉酶结构基因的部分缺失，使一个含3KbDNA片段(带有α-淀粉酶基因)的克隆株变为PALK1。PALK1的DNA序列揭示了一个可能的核糖体结合位点(RBS)和在一个230bpEcoRI-BstEII片段上的信号序列，而这个片段和枯草杆菌1A289的α-淀粉酶具有广泛的同源性(比较图2中的DNA序列与M.Yang et al.，Nucleic AcidResearch(1983)，237-249)。因为枯草杆菌中α-淀粉酶信号序列的加工预计发生在氨基酸第41位(见图2)，所以信号序列融合到PSTI读码上是在BstE-II位点进行的。为了这个目的，我们从pALK1中分离出一个230bp的片段，这个片段包含可能的Shine-Dalgano位点和α-淀粉酶的信号序列(图3A中的片段A)。包含Met-PSTI-1A或Met-PSTI-4的读码的B片段是从PUC-Met-PSTI-1A或PUC-Met-PSTI-4A中分离出来的(见“PSTI变异体基因的克隆”)。片段A平末端和片段B的平末端连接，使α-淀粉酶信号序列的读码融合到Met-PSTI-1A或(Met-PSTI-4A)的读码上，因此重新构成了BstEII和NcoI限制性位点(图3B)。A-B片段与Lacz启动子(见图3A)的正确取向使PSTI前体基因处在Laczpo控制下，位于LacZ′读码的后面，它应终止于TAA终止密码(在A片段DNA序列的-58/-56位，图2)。在同一mRNA上蛋白质合成的重新起始，应该发生在核糖体与α-淀粉酶上可能的Shine-Dalgano位点结合之后，这个位点在-10位的终止密码下游约50个碱基处(见图2)。
用PCH233(PSTI-1A)或PCH2331(PSTI-4A)转化的大肠杆菌ΔM15的PSTI产物，经蛋白纯化和氨基酸顺序分析后发现，在PSTI分子的氨基端融合了13个氨基酸(见实例1和3)。这些以asn-ala-glu-thr起始的额外氨基酸，与图3B中从氨基酸第32位开始的α-淀粉酶信号序列相同，提示大肠杆菌信号肽酶对PSTI前体的加工发生在枯草杆菌α-淀粉酶信号序列中的氨基酸序列…pro-ala29-ala-ala31↓之后。
青霉素酰基转移酶分泌性载体pCH2361，pCH2362，
PCH2363的构建
PSTI变异体产物的另一个信号序列来源于大肠杆菌青霉素酰基转移酶(PENAC)，一个来源于大肠杆菌ATCC11105的外周胞质酶。
根据青霉素酰基转移酶基因的DNA序列(W.Bruns et al.，(1985)，J.of Mol.andAppl.Genetics，3，36-44)，合成一个DNA片段，该片段含有Shine-Dalgano位点和PENAC信号序列，在Shine-Dalgano位点的上游引入一个EcoRI位点，在Shine-Dalgano位点的下游引入一个EcoRV位点，在该顺序的40位引入一个BalI位点，如此修饰后，使原始PENAC信号序列中的第9位氨基酸由缬氨酸变为甲硫氨酸。在PENAC信号序列第26位氨基酸的加工位点上引入一个NheI位点。按照对PSTI基因所描述的方法，PENAC-DNA片段由4个DNA片段(区段1-4，图4)组装而成，并且克隆到已用EcoRI和Nhe-I限制性酶切的PBR322中(pPENAC1，图5)。DNA片段1-4的寡核苷酸的合成是按照厂家说明在Applied Biosystems Model380DNA合成仪上进行的。然后，在Lacz po的控制下，通过将pPENAC1中的EcoRI-BamHI片段克隆到PUC8中除去pENAC信号序列(pCH236，图5)。
为了构建PSTI-5P(pCH2361)和PSTI-3P(pCH2362)基因的PENAC表达载体，将pCH236在其Nhe-I位点进行限制性酶切和修饰(见图5A)，并进一步用HindIII进行限制性切割。将PSTI-5P(或PSTI-3P)基因连接入所制备的pCH236，导致PENAC信号序列与PSTI读码融合，产生了pCH2361(或pCH2362)表达载体。再者，如前面对pCH233中所描述的，在此LacZ′读码应终止在PENAC的Shine-Dalgano位点之前的TAG密码上(7-9位，图4)。
为了产生Met-PSTI-4A(实例4)，可通过类似于上述方法制备pCH236来构建pCH2363。Met-PSTI-4A基因是从PUC-Met-PSTI-4A中分离得到的(图5A)。
pCH233、2331、2361、2362及2363转化到大肠杆菌RR1ΔM15或DH1中
采用常规操作程序(T.Maniatis et al.，1982，Molec-ular Cloning-A LaboratoryManual；Cold Spring Harbor，N.Y.)，用pCH233、2331、2361-2363转化感受态的大肠杆菌DH1或RR1ΔM15。在选择性培养基上(含有50μg/ml氨苄青霉素的琼脂平板)接种，进行单克隆质粒DNA的微量制备和限制性分析。对基因区段或表达载体上的限制性位点进行筛选。然后按前面对合成基因所述的方法，测定插入的DNA片段的DNA顺序。
经pCH233、2331、2361、2362和2363转化的大肠杆菌RR1ΔM15的发酵和诱导
将经pCH233、2331、2361、2362和2363转化的ΔM15菌株培养过夜。培养基含有3％牛肉膏(Gibco)，1.5％酵母抽提物(Gibco)和0.5％K2HPO4蒸馏水溶液(pH7.0)，以及50μg/ml氨苄青霉素。注意将培养物培养在装有100ml培养基的1000ml锥形瓶中，使其有良好的通气。
在28℃或37℃，将锥形瓶置于Kühner RC-6-U上以190rpm振摇。
为生产PSTI变异体，将过夜培养物在37℃下以1∶100的比例稀释到新鲜培养基中，培养约3小时以达到光密度为1.5A550nm。将1mM异丙基硫代半乳糖苷加入到培养物内，可以完成Lac启动子的诱导。继续发酵20小时达到约4-6A550，以8000rpm离心收集细胞(10分钟，4℃，转头A6.14，Kontron Centrikon H401)。
抑制剂的分离和定性
酶
人白细胞弹性蛋白酶(HLE)和猪胰弹性蛋白酶(PPE)来自Elastin Products Compa-ny，Inc.P.O.Box147，Pacific.Miss.63039/USA。
牛α-胰凝乳蛋白酶(CHT)来自E.Merck，Darmstadt。
底物
底物：MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA(HLE)，Ac-Ala-Ala-Pro-Ala-pNA和Suc-Ala-Ala-Ala-pNA(PPE)和Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(CHT)来自Bachem，Bubendorf/Switzerland。
用于层析的物质
Sephandes_G-25；Sephadex_G-50；Sepharose_4B-Cl；SP-Sephadex C-25来自Deutsche pharmacia，Freiburg。疏水树脂LGP4429为Bayer AG，Leverkusen产品。
方法
利用G.B.Roger et al.(1975)，Biochem.Biophys.Res.Commun.164，478-484的方法，用过碘酸钠氧化载体，然后还原胰凝乳蛋白酶与Na[CNBH2]形成的席夫碱，从而使胰凝乳蛋白酶固定于Sepharose_4B-Cl柱上。
用合适的柱子进行HPLC。这些在文中和/或相应附图的说明中都有描述。
氨基酸顺序测定
将约0.5-2nmol蛋白溶于30μl TFA中。将样品加入用3mg polybrene预处理的玻璃纤维滤器中。按照Hewick的方法(R.M.Hewick，M.W.Hunkapillar，L.E.Hood，W.Dreger1981，J.Biol.Chem.256，7990-7997)，利用APPLIED BIOSYSTEMS Inc.，USA的气相蛋白序列分析仪进行序列分析。利用氰基-HPLC柱(Dupont)和Beyreuther叙述的分离系统(K.Beyreuther，B.Biesler，J.Bowens，R.Dildrop，K.Neufer，K.Stüber，S.Zais，R.Ehring，P.Zabel，1983，Modern Methods in Protein Chemistry，P.303-325，Walter de Gruyter＋Cc.，Berlin)，对每一步释放出来的氨基酸乙内酰苯硫脲衍生物进行分析。使用了WATERS HPLC系统，包括一个M510泵，一个WISP710B自动进样器，一个LC一分光光度计M481，和一个SHIMADZU积分仪CR3A。
酸水解和氨基酸分析
将约1nmol蛋白质加入派热克斯玻璃管中，向其中加入200μl含0.05％2-疏基乙醇的6M HCl(I.T.Potts Jr.1969，Anal.Biochem.B1，1-15)。真空封管，在110℃下保温22小时。迅速干燥水解液。再溶解于150μl0.2M柠檬酸钠缓冲液pH2.2中，并过滤。氨基酸分析是在一个带有荧光检测器和SHIMADZU C-R2AX积分仪的BIOTRONIC LC5000氨基酸分析仪上进行的。基本按照Benson所述的方法(J.R.Benson.P.E.Hare，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，619-622)，在与邻苯二醛反应后对氨基酸进行定量。
在培养物滤液中进行酶试验和抑制活性测定
培养物滤液处理如下：
将10μl吐温80溶液(0.5％)和50μl高氯酸(70％)加入1ml培养物滤液中。20分钟后，离心样品，在清彻的上清中加225μl的Tris碱饱和溶液中和。取该溶液的各等份试样测定抑制活性。
表4给出了酶测定的条件。一般说来，先用适当体积的缓冲液稀释样品，然后再加入酶。一定时间的预保温后，再加入底物(底物溶解在0.1M DMSO中，并用缓冲液稀释到贮液浓度)。
在405nm处测定底物中对硝基苯胺的释放，测定可以连续进行，也可以在加入乙酸停止反应后进行。用不加抑制剂的样品测得的数值定为100％。用下列公式计算抑制百分率：
只有得到少量纯化的物质后，抑制剂的绝对量才可由校正曲线计算出来。
本申请中实例3和6的微生物分别以NCIB12365和NCIB12364的登记号储存于TheNational Collection of Industrial Bacteria(NCIB)，Torry Research Station，P.O.Box 31，135Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，Scotland，United Kingdon。
实例1
分离Asn-13-Ala-12-Glu--11-Thr-10-Ala-9-His-8-Lys-7-Ser-6-Asn-5-Glu-4-Val-3-Thr-2-Met-1-Leu18-Glu19-Arg21-Ala32-PSTI(PSTI-4A[微融合])
10升ΔM15/pCH2331发酵培养基用350ml高氯酸(70％)处理。离心除去沉淀。上清液用8NKOH溶液中和。4℃下静置后，用布氏漏斗抽滤除去KClO4沉淀。
于4℃下，使滤液通过胰凝胶蛋白酶-Sepharose4B-Cl结合物的凝胶床(7×9cm)。用水洗涤凝胶直到流出物在280nm处的光密度达到0。进一步用500ml0.2M醋酸盐缓冲液(pH5)和500ml水洗涤凝胶。最后，用以HCl调pH到2.0的0.2M醋酸洗脱凝胶。图6给出了洗脱图谱。合并活性组分(根据白细胞弹性蛋白酶抑制测定的测定结果)，加入醋酸钠固体调pH到4，利用旋转蒸发进行浓缩。盐类和少量杂质在最后在RP-318柱上利用制备性HPLC除去。图7给出洗脱图谱。用分析型HPLC检查每个组分的纯度。根据这些结果，合并42-44管，45-46管，47-49管，经冷冻干燥后，分别得到6mg，12mg，6mg。中间组分纯度最高，其分析型HPLC图谱在图8中给出。
表5-7给出了关于氨基酸组成、序列分析和抑制谱的数据。
实例2
利用BrCN-断裂法从微融合蛋白中制备Leu18-Glu19-Arg21-Ala32-PSTI(PSTI-4A)
将2.93mg(0.46μMol)PSTI-4A微融合产物(实例1)溶于1ml70％甲酸。加入3mg溴化氰，于室温下在氮气氛中保温18小时，将其断裂。用10ml水稀释来终止反应。用冰冻干燥法去除水和挥发性副产物。在含有1％甲酸的Sephadex_G50(超细粒)柱上(2.5×90cm)进行凝胶层析，将Leu18-Glu19-Arg21-Ala32-PSTI(PSTI-4A)从副产物和未断裂的融合蛋白中分离出来。根据它们在Biorad RP-318(4.6×250mm)大孔柱上的保留时间合并各组分，溶液A：0.1％TFA；溶液B：0.1％TFA/60％乙腈，流速1ml/min，室温，210nm处检测；梯度：0-60％B。
冷冻干燥各组分，并在同样条件下同样柱子上再进行层析纯化。收集活性组分并冷冻干燥。如实例1所述，用分析型HPLC检查Leu18-Glu19-Arg21-Ala32-PSTI(PSTI-4A)的纯度。如表5-7中所示，用氨基酸分析、N-末端序列测定、HPLC和弹性蛋白酶抑制试验等来定性抑制性。
实例3
分离Asn-13-Als-12-Glu-11-Thr-10-Ala-9-His-8-Lys-7-Ser-6-Asn-5-Glu-4-Val-3-Thr-2-Met-1，Leu18-Ala32-PSTI(PSTI-1A[微融合])
将4升ΔM15/pCH233的发酵培养物用120ml高氯酸(70％)处理，所形成的沉淀通过离心(30min，4℃，4000rpm，Beckman J-6)去除。上清液用8N NaOH调pH至8.6，并过胰凝乳蛋白酶-Sepharose 4B-Cl结合物柱(8×10cm)。用0.2MTRIS-HCl缓冲液(pH8.6)洗凝胶直到流出物在280nm处的光密度达到基线水平。然后，用水和经HCl调pH到2的0.1M醋酸洗脱凝胶。
合并有抑制活性(用白细胞弹性蛋白酶测定)的组合，用8N NaOH溶液调pH到2.7，加到预先用0.15％三氟乙酸(用NaOH溶液调pH到2.7)平衡的SP-SephadexC-25(2.5×35cm)上。
先用起始缓冲液洗，然后用配在起始缓冲液中的0～1M NaCl线性梯度进行洗脱。根据它们的抑制活性和分析型HPLC(RP-318，BIO-RAD)结果合并各组分。合并物用UM2膜超滤浓缩，最后的纯化是经过制备型HPLC的RP318柱(含0.15％三氟乙酸的0-60％乙腈梯度洗脱，60分钟)完成的。形成二个合并物，冷冻干燥之，得到8.7mg均一物质和1.9mg含有少量杂质的物质。表5-7给出了分析数据(氨基酸分析，序列分析和抑制活性)。
PSTI-1A微融合蛋白的溴化氰断裂过程是如实例2所述进行的，产生Leu18-Ala32-PSTI(PSTI-1A)。
实例4
分离Met-1-Leu18-Glu19-Arg21-Ala32-PSTI(Met-PSTI-4A)
如实例1所述，将1升ΔM15/pCH2363发酵培养物用高氯酸处理，离心，并中和，最后过胰凝乳蛋白酶-Sepharose 4BC1结合物(2.5×10cm)。如实例1所述，用水，乙酸盐缓冲液和水洗涤凝胶。用0.2M，pH2(用HCl调)的乙酸洗脱，解吸抑制剂。合并含有抑制剂的组分，加NaOH溶液调pH到4，利用旋转蒸发浓缩到5ml。最后的纯化在制备型HPLC的RP-318柱上进行，用含有0.15％三氟乙酸的0-60％乙腈梯度洗脱。
所汇集的活性组分经冷冻干燥产生1.8mg物质。表5-7给出了更详细的数据(氨基酸组成，序列分析和抑制活性)。
实例5
分离Tyr18-Glu19-Arg21-PSTI(PSTI-3P)
将750mlΔM15/pCH2362的发酵培养物用25ml高氯酸处理，30分钟后离心。加4NKOH溶液中和上清液，6小时后过滤除去KClO4。滤液加到胰凝乳蛋白酶-Sepharose4B-Cl柱上(2.5×7cm)，然后用水和0.2M乙酸洗。抑制剂用0.2M乙酸(用HCl调pH到1.8)解吸。合并活性组分，用NaOH溶液调pH到3.5，并利用旋转蒸发浓缩。离心除去少许沉淀物，上清液通过RP-8进行制备型HPLC。活性组分经冰冻干燥得到约0.8mg抑制剂，在分析型HPLC中是均一的。表5-7给出了分析数据(氨基酸分析，序列分析和抑制活性)。
实例6
分离VaC18-Glu19-Arg21-PSTI(PSTI-5P)
将100ml高氯酸(70％)加到3升ΔM15/pCH2361发酵培养物中，30分钟后过滤除去沉淀，上清液用8N NaOH溶液调pH到7。然后，通过预先用0.1NHCl、甲醇和水洗过的疏水树脂(Lewapol LGP4429，Bayer AG)(φ：3cm，柱床高40cm)。树脂先用水洗，接着用0-70％的甲醇线性梯度洗脱。测定每一组分中的抑制活性(蒸发除去甲醇后测白细胞弹性蛋白酶抑制)。合并活性组分，利用真空蒸发而浓缩。浓缩液加三氟乙酸酸化到pH2.7，并加到预先用0.15％三氟乙酸(用NaOH调pH到2.7)平衡的SP Sephadex-G-25(2.5×10cm)上。
用含0-1M NaCl的起始缓冲液线性梯度洗脱柱子。将有抑制活性的组分合并，中和，浓缩，并在Sephadex G-25上用0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.0)作洗脱液脱盐。调节活性组分的pH到2.7，再一次在SP-Sephadex-G25柱层析，用含有0.1-0.5M NaClpH2.7的线性梯度洗脱。
将活性流出液调pH到4.0，浓缩，使其通过分析型HPLC的RP-318柱而进一步纯化。重复这一步骤一次。在Pharmacia的Mono-S柱上进行制备性HPLC，接着在RP-318柱上再层析以完成最后的纯化(图9)。纯化产物的分析型HPLC图见图10。表5-7给出了进一步的分析数据(氨基酸组成，序列，抑制活性)。(表4、表5、表6、表7见文后)
附图说明
图1：PSTI主导基因的核苷酸及其相应氨基酸的序列。括号和数字指用以组装该基因的合成寡核苷酸。虚线表示基因分成区段I(第一部分)和区段II(第二部分)。
图2：pALK1的EcoRI-BstEII片段的DNA序列，共230个bp，可能含有在-10位附近的Shine Dalgano位点(SD)以及α-淀粉酶的信号序列(划下线的氨基酸序列，从1位开始)。指出了胞外酶可能的加工位点在信号肽的41位氨基酸。
图3A：用BstEII切割质粒，在DNA聚合酶I(大片段)的存在下加入dNTP，由此将片段A从PACK1中分离出来。DNA用酚抽提，乙醇沉淀，并进一步用EcoRI限制性酶解。在2％琼脂糖凝胶上分离后，分离出230bpDNA片段(A)。同样，通过用NcoI限制性酶切，加dNTP，乙醇沉淀，进一步用EcoRI限制性酶切，便可从PUC-Met-PSTI-1A(或从用于构建PCH2331的PUC-Met-PSTI-4A)中分离出180bp的片段B。片段A和B都被连接到一个经EcoRI限制酶解的PUC8中。
图3B：图3B显示了α-淀粉酶信号序列(片段A)和为Met-PSTI-1A或-4A编码的Met-PSTI基因(片段B)之间的连接序列。大肠杆菌中信号序列的加工发生在氨基酸31和32位之间(见实例1)。
图4：图4显示了合成的EcoRI-NheIDNA片段(PENAC)，它含有可能的ShineDalgano位点(在10位附近)以及修饰的大肠杆菌青霉素酰基转移酶的信号序列，加I位点在氨基酸Ala26处。
图5A：合成的PENAC序列(96bp的EcoRI-NheI片段，与图4比较)被克隆到已用EcoRI和NheI限制酶解的pBR322中，以产生ppENACT。ppENAC1用EcoRI和BamHI限制酶处理，将含有一个Shine Dalgano位点和pENAC信号序列的250bpDNA片段连接到已用EcoRI和BamHI限制性酶处理的PUC8上，以产生pCH236。
为了构建pCH2361(或pCH2362)，将pCH236用NheI限制酶处理，在DNA聚合酶I(大片段)存在下，加入dCTP和dTTP。DNA用酚提取，乙醇沉淀，并进行S1核酸酶反应，以在PENAC信号序列(与图4比较)的信号肽酶断裂位点产生一个为Ala26编码的平末端密码。DNA沉淀后，pCH236进一步用HindIII限制性酶解，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳后分离出载体。用HincII和HindIII限制性酶解pUC-PSTI-5P，分离出PSTI-5P基因，在2％琼脂糖凝胶上电泳后分离180bp片段。类似地，从PUC-PSTI-3p中分离PSTI-30基因。来自pUC-PSTI-5P(或PUC-PSTI-3)的180bp的HincII-HindIII片段与pCH236连接，产生pCH2361(或PCH2362)。
图5B：将pCH236用NheI限制酶处理，在DNA聚合酶I(大片段)存在下加入dCTP。DNA沉淀后用S1核酸酶处理以产生一个平末端。载体进一步用HindIII处理，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳后被分离出来。用NcoI限制酶处理PUC-Met-PSTI-4A，继而加入dNTP，即可从中分离出Met-PSTI-4A基因。乙醇沉淀后，DNA进一步用HindIII限制酶处理，在2％琼脂糖凝胶上电泳后分离出180bp的片段。
图6：用固定化胰凝乳蛋白酶柱(7×9cm)，在4℃下进行亲和层析分离PSTI-4A(微融合)。以11ml为一管收集各组分。横坐标表示管号，纵坐标则给出280nm处的光吸收。柱子先用水洗(到40管)，然后用pH5.0，0.2M乙酸盐缓冲液洗(到70管)，再用蒸馏水洗(到85管)。最后用H2.0，0.2M乙酸-盐酸洗脱。抑制剂在92-108管之间流出。
图7：将含有PSTI-4A[微融合]的胰凝乳蛋白酶亲和层析柱流出液(92-108管)在RP-318柱上(250-4.6mm)(BIO-RAD)进行制备性HPLC。用0.15％三氟乙酸和含0.15％三氟乙酸的60％乙腈线性梯度进行洗脱(2h)。流速：150巴下1ml/分；220nm处检测，纵坐标给出220nm处的光吸收，横坐标给出管号。抑制剂在44-50管流出。
图8：PSTI-4A(微融合)在带有前置柱(75×7.5mm，LKB)的Ultra-pak TSP SP-5PW柱上进行分析性HPLC。
条件：
A溶剂＝0.15％三氟乙酸和0.1M Na2SO4，10％甲醇pH2.7
B溶剂＝0.15％三氟乙酸；0.6M Na2SO4，10％甲醇pH2.7
梯度：0-5分    5％B
      5-30分   15％～100％B
      30-33分  100～15％B
      33-40分  15％B
流速：20巴压力下1.5ml/min
检测：215nm。
图9：在RP-318(250×4.6mm)(BIO-RAD)柱上进行制备性HPLC，最后纯化PSTI-5P。用0.15％三氟乙酸和含0.15％三氟乙酸的60％乙腈线性梯度洗脱2小时。流速：150巴压力下1ml/min，280nm处检测。抑制剂在20-27管流出。
图10：用BiO-Sil_TSK CM-3-SW柱(75×7.5mm)(BIO-RAD)进行PSTI-5P的分析性HPLC。
条件：
A溶剂：0.15％三氟乙酸，10％甲醇，0.1M Na2SO4
B溶剂：0.15％三氟乙酸，10％甲醇，0.6M Na2SO4
梯度：0-5分    15％B
      5-30分   15-100％B
      30-32分  100-15％B
      32-40分  15％B
流速：22巴压力下1.5ml/min
检测：215nm。
表4
白细胞弹性蛋白酶(人) 胰弹性蛋白酶(猪) α-胰凝乳蛋白酶(牛)
缓冲液 0.2M Tris，pH8+0.1％吐温80 0.2M Tris，pH8+0.1％吐温80+0.05％迭氮化钠 0.2M Tris，pH8+0.05％吐温80
总体积(加入底物后) 0.65ml 0.65ml 0.60ml
每次试验的酶量 50ng 25-50ng 50ng
预保温时间、温度 30分，室温 30-150分，室温 30分，室温
底物结构贮液每次试验的量引文 MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA0.065M0.1ml1) Ac-Ala-Ala-Pro-Ala-pNA0.065M0.1ml2) Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA0.005M0.04ml3)
保温温度 30℃ 30℃ 室温
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表5几个抑制剂的氨基酸分析
氨基酸 PSTI-4A  PSTI-4A(微融合) PSTI-1A  PSTI-1A(微融合) Met-PSTI-4A PSTI-5P PSTI-3P
 AspThrSerGluGlyAlaValMetIleLeuTyrPheHisLysArg 6.45(7)3.66(4)2.83(3)6.83(7)4.91(5)2.08(2)2.08(2)-   (0)1.80(2)4.60(5)2.66(3)1.00(1)-   (0)2.91(3)3.60(4) 8.46(9)5.48(6)3.70(4)9.45(9)5.50(5)3.70(4)3.02(3)0.88(1)1.78(2)3.13(5)3.13(3)1.14(1)0.88(1)4.25(4)4.11(4) 8.09(8)4.00(4)2.79(3)6.65(6)5.37(5)2.20(2)2.00(2)-2.73(3)4.62(5)2.95(3)1.22(1)2.84(3)3.20(3) 9.95(10)5.50(6)3.82(4)8.61(8)5.75(5)4.0 (4)3.19(3)0.85(1)3.01(3)5.03(5)2.65(3)1.25(1)1.15(1)3.65(4)3.22(3) 6.91(7)3.71(4)3.24(3)7.09(7)5.52(5)2.21(2)2.00(2)1.14(1)1.86(2)5.26(5)2.50(3)0.76(1)-3.42(3)6.00(4) 7.23(7)3.67(4)3.38(3)7.79(7)5.55(5)1.19(1)2.83(3)-1.91(2)4.00(4)3.01(3)1.35(1)3.21(3)4.22(4) 6.70(7)3.61(4)2.47(3)7.14(7)4.94(5)1.06(1)1.92(2)-   (0)1.70(2)3.47(4)3.50(4)1.00(1)-   (0)2.67(3)3.60(4)
过邻苯二甲醛衍生柱后测定氨基酸，Cys和Pro未测。
表6表5中PSTI变异体N-末端氨基酸序列分析
衍生物 PSTI-4A  PSTI-4A微融合 PSTI-1A  PSTI-1A微融合 Met-1-PSTI-4A  PSTI-5P  PSTI-3P
位置  1     Asp     Asn     Asp     Asn     Met     Asp     Asp
 2     Ser     Ala     Ser     Ala     Asp     Ser     Ser
 3     Leu     Glu     Leu     Glu     Ser     Leu     Leu
 4     Gly     Thr     Gly     Thr     Leu     Gly     Gly
 5     Arg     Ala     Arg     Ala     Gly     Arg     Arg
 6     Glu     His     Glu     His     Arg     Glu     Glu
 7     Ala     Lys     Ala     Lys     Glu     Ala     Ala
 8     Lys     Ser     Lys     Ser     Ala     Lys     Lys
 9     Cys     Aan     Cys     Asn     Lys     Cys     Cys
 10     Tyr     Glu     Tyr     Glu     Cys     Tyr     Tyr
 11     Asn     Val     Asn     Val     Tyr     Asn     Asn
 12     Glu     Thr     Glu     Thr     Asn     Glu     Glu
 13     Leu     Met     Leu     Met     Glu     Leu     leu
 14     Asn     Asp     Asn     Asp     Leu     Asn     Asn
 15     Gly     Ser     Gly     Ser     Asn     Gly     Gly
 16     Cys     Leu     Cys     Leu     Gly     Cys     Cys
 17     Yhr     Gly     Thr     Gly     Cys     Thr     Thr
 18     Leu     Arg     Leu     Arg     Thr     Val     Tyr
 19     Glu     Glu     Ile     Glu     Leu     Glu     Glu
 20     Tyr     Ala     Thr     Ala     Glu     Tyr     Tyr
 21     Arg     Lys     Asn     Lys     Tyr     Arg     Arg
 22     Pro     Cys     Pro     Cys     Arg     Pro     Pro
表7根据本发明的PSTI变异体的抑制活性给出达到50％抑制的抑制剂量
酶抑制剂 α-胰凝乳蛋白酶(牛)(50ng/试验) 粒细胞弹性蛋白酶(人)(120ng/试验) 胰弹性蛋白酶(猪)(500ng/试验)
PSTI-4A(微融合)实例1后PSTI-4A实例2后PSTI-1A实例3后Met-PSTI-4A实例4后PSTI-3P实例5后PSTI-5P实例6后 6ng7ng100ng8ng7ng100ng 15ng17ng18ng16ng)5000ng15ng 68ng75ng1200ng73ng-70ng

Claims (3)

1.一种制备选自以下一组具有胰分泌性胰蛋白酶抑制剂(PSTI)之氨基酸结构的肽的方法，
    PSTI  1 Thr-17    Leu-18    Ile-19    Tyr-20    Asn-21    Asp-29
    PSTI  2 Thr-17    Leu-18    Ile-19    Tyr-20    Asp-21    Asn-29
    PSTI  3 Thr-17    Tyr-18    Glu-19    Tyr-20    Arg-21    Asp-29
    PSTI  4 Thr-17    Leu-18    Glu-19    Tyr-20    Arg-21    Asp-29
    PSTI  5 Thr-17    Val-18    Glu-19    Tyr-20    Arg-21    Asp-29
    PSTI  6 Thr-17    Leu-18    Glu-19    Tyr-20    Asn-21    Asp-29
    PSTI  7 Thr-17    Leu-18    Ile-19    Tyr-20    Arg-21    Asp-29
    PSTI  8 Thr-17    Val-18    Glu-19    Leu-20    Asn-21    Asp-29
    PSTI  9 Thr-17    Val-18    Glu-19    Leu-20    Arg-21    Asp-29
    PSTI 10 Pro-17    Lys-18    Ile-19    Tyr-20    Asp-21    Asn-29
    PSTI 11 Pro-17    Leu-18    Glu-19    Tyr-20    Arg-21    Asp-29
    PSTI 12 Pro-17    Val-18    Glu-19    Tyr-20    Arg-21    Asp-29
    PSTI 13 Thr-17    Ile-18    Glu-19    Tyr-20    Asn-21    Asp-29
    PSTI 14 Thr-17    Arg-18    Glu-19    Tyr-20    Asn-21    Asp-29
    PSTI 15 Thr-17    Phe-18    Glu-19    Tyr-20    Asn-21    Asp-29
    PSTI 16 Thr-17    Ala-18    Glu-19    Tyr-20    Asn-21    Asp-29
    PSTI 17 Thr-17    Val-18    Ile-19    Tyr-20    Asn-21    Asp-29
    PSTI 18 Thr-17    Ile-18    Ile-19    Tyr-20    Asn-21    Asp-29
    PSTI 19 Thr-17    Val-18    Ile-19    Tyr-20    Asp-21    Asn-29
    PSTI 20 Thr-17    Ile-18    Ile-19    Tyr-20    Asp-21    Asn-29
    PSTI 21 Thr-17    Ile-18    Glu-19    Tyr-20    Arg-21    Asp-29
    PSTI 22 Thr-17    Tyr-18    Ile-19    Tyr-20    Asn-21    Asp-29
    PSTI 23 Thr-17    Phe-18    Ile-19    Tyr-20    Asn-21    Asp-29
    PSTI 24 Thr-17    Lys-18    Glu-19    Tyr-20    Arg-21    Asp-29
该方法包括下列步骤：
a)在合适条件下培养宿主生物体；
b)从培养物中回收肽；
c)纯化该肽。
2.根据权利要求1的方法，其中所述宿主生物体是用表达载体来转化的，所述表达载体包括一种编码权利要求1的肽的DNA。
3.根据权利要求1的方法，其中所述宿主生物体是用表达载体来转化的，所述表达载体包括一种具有下列顺序的DNA及其变异体，所述变异体编码权利要求1的肽。
Figure C8810014600031
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