KR960013466B1 - 단백질의 신규제법 - Google Patents

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Description

단백질의 신규제법

제1도는 APH 유전자의 DNA 배열 및 상기 DNA 배열로 부터 추정되는 아미노산 배열을 나타낸다.

제2도는 사람 PSTI의 DNA 배열 및 아미노산 배열을 나타낸다.

제3도는 실시예에서 사용한 합성 사람 PSTI 유전자의 DNA 배열 및 대응하는 아미노산 배열 및 상기 DNA 배열의 합성 방법을 나타낸다.

제4도는 APH 유전자 근변의 제한 효소지도를 나타낸다.

제5도는 pUCKMFPSTI 구축의 개략도이다.

제6도는 pUCKMF 구축의 개략도이다.

제7도는 토끼 골격근 액틴 유전자 DNA 배열 및 상기 DNA 배열로 부터 추정되는 아미노산 배열을 나타낸다.

제8도는 pUCACT 구축의 개략도이다.

제9도는 pUCKMFACT 구축의 개략도이다.

제10도는 pUCKMF1 구축의 개략도이다.

제11도는 pUCKMFACT1 구축의 개략도이다.

제12도는 pUCKMACT 구축의 개략도이다.

제13도는 pUCKMACT 구축시의 합성 올리고누클레오티드 배열이 삽입된 부근의 DNA 배열을 나타낸다.

제14도는 본 발명의 실시예에서 발현된 APH와 토끼 골격근 액틴의 융합 단백질의 개략도이다.

제15도는 토끼 골격근 액틴에 융합시킨 펩티드의 길이와 발현량과의 관계를 나타낸다.

본 발명은 목적하는 단백질 APH와의 융합 단백질로서 발현시킬 수 있는 벡타를 이용하여 미생물을 형질전환시키고, 상기 융합 단백질을 생성시킴으로써 목적하는 단백질을 얻는 것을 특징으로 하는 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

최근 유전자 공학의 급속한 발전에 수반하여, 각종 유용한 펩티드가 미생물내에서 생성되고 있다. 그 중에서도 비교적 단쇄의 펩티드, 예를들면 사람 인슐린, 사람 성장 호르몬 등의 미생물내에서 생성될 경우 프로테아제에 의해 쉽게 분해되는 등의 이유에 의해 생성 효율이 낮아, 다른 단백질과의 융합 단백질로서 미생물내에서 생성시키는 방법이 취해지고 있다(예를들면 일본국 특개소 54-92696호). 또한, 생성물이 숙주에 대하여 치사적이거나 증식을 저해하여 생성 효율이 낮을 경우 융합단백질로서 생성물 본래의 활성을 잃게함으로써 생성효율을 높일 수도 있다.

트랜스포죤 Tn5는 네오마이신이나 가나마이신에 대한 약제내성을 미생물에게 부여하는 APH(아미노 글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라아제Ⅱ)를 코오딩하는 유전자를 함유하고 있다.

트랜스포죤 Tn5중의 상기 유전자의 염기 배열은 이미 알려져 있으며(Gene 19, 327, 1982) 상기 염기 배열을 함유하는 플라스미드가 시판되고 있다(예.pNEO(파마시아)).

상기 염기 배열과 그것으로부터 추정되는 APH의 아미노산 배열을 제1도에 나타낸다.

췌장에 유래하는 트립신·인히버터에는 췌분비성 트립신·인히비터(pancreatic secretory trypsin inhibitor, 이후는 PATI으로 약칭함)와 염기성 췌트립신·인히비터(basic panceratic trypsin inhibitor)의 2종류가 있다. 전자는 포유동물에 존재하고 췌장외에 신장, 폐장, 비장, 간장, 뇌 등의 장기에도 분포한다. 후자는 반추 동물의 췌장외에 각종 장기에 분포하나 사람을 비롯한 다른 포유동물에는 존재하지 않는다. 푸볼스 등(Pubols, J. Biol. Chem. 249, 2235, 1974) 및 파인스타인 등(Feinstenin, Eur. J. Biochem. 43, 569, 1974) 이 각각 사람의 췌액중에서 사람의 PSTI을 분리정제하고, 그리인(Greene, Methods Enzymol, 45, 813, 1976)에 의해 그 구조가 명백히 밝혀졌다. (그러나 그리인이 보고한 PSTI의 아미노산 배열은 제2도에 나타낸 아미노산 배열과 21, 29번째가 상이하다). 사람의 PSTI은 제2도에 나타낸 바와 같이 56개의 아미노산으로 이루어진 펩티드로서 분자량은 6242이다. 또한, Cys의 SH기가 아미노산 배열 9와 38번째, 16과 35번째, 24와 56번째에 존재하며 각각 S-S- 결합을 형성하며, 유리 SH기는 존재하지 않는다.

에델란드 등(Eddeland, Hoppe-Seyler's Z. Physiol Chem. 359, 671, 1978) 및 기따하라 등(Biomed. J. 3, 1119, 1979)은 각각 췌액중에서 수득한 사람 PSTI을 항원으로 이용한 라디오 이뮤노어세이계를 확립하여 혈중 PSTI의 측정을 가능케 하였다. 야마모또 등(Biochem, Biophys. Res. Commun. 132, 605, 1985)은 사람 PSTI의 DNA 배열을 명백히 밝혀냈다(제2도 참조).

급성 췌염의 자기 소화는 단백 분해 효소에 의하여 야기된다. 어떤 원인으로 활성화된 소량의 트립신이 트립시노오겐을 비롯하여 다른 지모겐의 인쇄 반응적 활성화를 수행하기 위한 것이라고 말하고 있다. 췌선방 세포에 존재하는 PSTI은 췌효소와 함께 췌액중에 분비되어 췌관내에서 일어나는 트립신의 활성화를 저지한다. 또 PSTI의 일부는 일탈 인히버터로서 혈중에 이행하여 유리 상태로 존재한다(담과 췌, 2, 231, 1981), 혈중 PSTI은 췌질환, 특히 급성 췌질환에서 큰 변동을 나타내고, 높은 레벨의 유지기간도 아밀라에제에 비하여 장기간이다. 또한, 프로테아아제 인히비터와는 무관하게 혈중 PSTI의 변동은 췌침습을 예민하게 반영한다(담과 췌, 3, 383, 1982). 따라서 혈중 PSTI를 측정함으로써 췌질환의 진단과 경과 관찰이 가능케 되었다.

쥐 액틴은 쥐의 골격근을 형성하는 단백질로서 이 액틴을 코오딩하는 유전자는 이미 크롤닝되어 있다(생물 물리 25권, Supplement, ppS78, 1985)(제5도 참조).

사람 PSTI 및 쥐 액틴이 유전자 공학을 이용하여 생성된 예는 없으나 사람 PSTI과 같은 비교적 단쇄의 펩티드를 미생물내에 발현시키기 위한 목적으로 β-갈락토시다제와의 융합 단백질로서 사람 인슐린, 사람 성장호르몬 등을 발현시키고자 하는 시도가 수행되고 있다(상기). 그러나 이 계에 있어서 여하한 펩티드도 발현 가능하다고 말할 수는 없다.

따라서 목적하는 펩티드를 융합 단백질로서 발현시키는 다른계를 개발시키는 것이 각종 펩티드를 미생물내에서 생성시키는데 있어서 유의할 점이다.

APH를 코오딩하는 유전자는 트랜스포존 Tn5중에 함유되어 시판되고 있으나 APH와의 융합단백으로서 목적하는 펩티드를 미생물에서 발현시키고자 하는 시도는 전혀 행해지고 있지 않았다.

또한, 췌질환의 진단 및 경과 관찰을 위하여 RIA에 의한 PSTI의 측정이 널리 채용되고 있으나 이 측정에 있어서는 표준 시약등으로서 사람 PSTI이 필수적이나 이것은 사람의 췌액중에서 분리 정제되므로 양이 한정되어 대량으로 얻는 것이 불가능하였다.

쥐 액틴을 코오딩하는 DNA는 상술한 바와 같이 이미 클로닝되어 있으나 본 발명자들의 실험(실시예 참조)에 따르면 쥐 액틴을 융합시키지 않고 대장균내에서 발현 시켰을 경우에는 쥐 액틴이 거의 생성되지 않았다.

본 발명자들은 APH 유전자를 적당한 프로모우터의 하류에 위치시킬 경우, 미생물내에서 대량의 APH가 생성되는 것을 발견하였으며, 또한 이 APH의 높은 발현 등을 이용하여 사람 PSTI과 쥐 액틴이 APH의 융합 단백질로서 미생물내에서 발현될 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 APH 유전자에 사람 PSTI, 쥐 액틴 등 목적하는 단백질을 코오딩하는 유전자를 접속하여 이 융합 유전자를 적당한 프로모우터의 하류에 배치한 벡타를 숙주로 도입하여 융합 단백질을 생성시킴으로써 상기 융합 단백질로부터 목적하는 단백질을 채집하는 단백질의 제조방법을 제공한다. 본 제조방법은 상기한 사람 PSTI, 쥐 액틴 등에 한하지 않고 그외의 단백질의 생성에도 응용가능하다.

상기 APH 유전자는 APH를 코오딩하는 구조 유전자뿐만 아니라 그 프로모우터나 리보소옴 결합 배열을 포함하고 있어도 무방하다. APH 프로모우터를 함유하는 APH 유전자와 목적하는 단백질을 코오딩하는 유전자의 융합 유전자를 강력한 프로모우터, 예를 들면 lac계 프로모우터, Trp계 프로모우터, Tac계 프로모우터등의 제어하에 배치하여도 좋고, APH 프로모우터를 함유하지 않은 APH의 리보소옴 결합 배열 및 구조 유전자와 목적하는 단백질을 코오딩하는 유전자의 융합 유전자를 이들 프로모우터의 제어하에 배치하여도 좋다.

상기 APH의 리보소옴 결합 배열 부근을 다른 적당한 리보소옴 결합 배열과 치환하는 것도 가능하다고 생각된다. 또한, APH 유전자 APH 구조 유전자를 전부 함유하고 있을 필요는 없고, N 말단으로부터 13개 이상의 아미노산 배열을 코오딩하고 있는 것으로서 좋고 바람직하기로는 24개 이상의 아미노산 배열을 코오딩하고 있는 것이 좋다. 즉 본 발명의 발현효율의 높고 낮음은 mRNA로부터 단백질에 대한 번역 효율의 양호함이 요인이 되어 좌우한다고 생각되며, 번역 개시에 관여하는 APH 유전자의 리보소옴 결합 배열 근처로 부터 APH의 N말단으로부터 수십개의 아미노산 배열을 코오딩하는 배열 까지가 중요하다고 생각된다. 예컨대 pNEO(파마시아)의 HindⅢ, TaqⅠ 제한 단면(APH 프로모우터와 APH의 N말단으로 부터 82번째까지의 아미노산 배열을 코오딩하는 유전자, 제1도중의 -350~246번째의 DNA 배열에 대응)에 합성 사람 PSTI 유전자를 접속하여 pUCl3(다까라 슈죠오)의 lac 프로모우터의 제어하에 배치하면 APH와 사람 PSTI과의 융합 단백질을 발현하는 벡타를 구축할 수 있다. 본 발명의 APH 유전자는 제1도에 나타낸 배열 뿐만아니라 다소의 염기가 치환, 이탈 또는 삽입된 것도 동등한 발현능을 발휘하며, 그와 같은 변이 APH 유전자를 이용한 제조방법도 본 발명의 범위내라고 생각하여야 할 것이다.

이 경우 당연히 APH의 아미노산 배열이 크게 변화되는 것이 예상되나 DNA 레벨이 유사할 경우, 그와 같은 변이 APH와 중합시키는 제조방법도 본 발명의 범위내에 포함된다.

상기한 APH와 목적하는 단백질의 융합 유전자를 운반할 벡타로서는 pUCl3, p, β-gall3C, pOP203-13, pUC9, pUC8, pEA300, ptrpL1, pBN70, pWT111, pWT121, pWT131, pKK223-3, pDR540, pDR720, pYEJ001, pPL-lambda, pKC30, pKC31, pAS1, pLC24, pHUB4, pIN-Ⅰ, pIN-Ⅱ, pLN-Ⅲ, pC194, pC221, pUB112, pT127, pSA0503, pE194 등을 들 수 있으나 이것들에 한정되지 않으며, 이 융합 유전자를 운반하여 미생물중에서 발현할 수 있는 것이면 좋고 당업자가 일반적으로 형질 전환 등에 시용하는 벡타는 모두 사용할 수 있다. 이들 벡타를 숙주에 따라 적당히 선택하여 상기 융합 유전자를 적절한 프로모우터의 제어하에 배열하면 APH와 목적하는 단백질의 융합 단백질 발현 시킬 수가 있다.

숙주로서는 대장균등을 사용하면 목적하는 단백질을 효율적으로 생성할 수 있다.

상기 융합 단백질로부터 목적하는 단백질을 채집할 때에 있어서, APH와 목적하는 단백질의 사이에 적당한 결합 배열, 특히 Met 또는 Met을 함유하는 배열을 삽입해 두면, 브롬화시 안으로 용이하게 목적하는 단백질을 분리할 수 있다.

상기 방법이외에도, 양단백질간에 Cys을 삽입하여 2-니트로-5-티오시아노벤조산으로 절단하는 방법, Asn-Gly을 삽입하여 히드록실아민으로 절단하는 방법, Trp를 삽입하여 2-(2-니트로페닐술페닐)-3-메틸-3-브로모인돌로 절단하는 방법, Lys 또는 Arg을 삽입하여 트립신으로 절단하는 방법, -Ile-Glu-Gly-Arg을 삽입하여 혈액 응고인자 Xa로 절단하는 방법들이 일반적으로 이용되고 있으며, 목적하는 단백질의 아미노산 배열을 고려하여 이들 방법을 적절하게 이용하는 것이 가능하다.

또한, 이들의 절단 목적 뿐만 아니라 벡타의 구축상 부드이 소수의 결합 배열이 삽입되는 경우가 있으나 목적하는 단백질의 생성 효율에 미치는 영향은 적다.

융합 단백질로 부터 절단된 목적하는 단백질은 통상적인 방법대로 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 원심 분리 조작등을 적당히 조합하여 정제할 수 있다.

사람 PSTI을 코오딩하는 유전자는 이미 야마모또(상기한)에 의해 사람 췌장 세포로 부터 클로닝되어 그 배열도 명백히 밝혀져 있으며, 비교적 단쇄이기 때문에 합성 사람 PSTI 유전자를 사용하는 것이 유리하다. 물론 통상 방법에 따라 야마모또 등(상기)라 동일하게 하여 사람 췌장 세포로부터 조제하여도 좋다. 이 배열은 천연의 DNA 배열, 제2도에 나타낸 배열은 물론, 제2도에 나타낸 사람 PSTI의 아미노산 배열을 코오딩하는 배열이면 좋다. 이 유전자의 5' 말단에 Met을 코오딩하는 배열(ATG)를 배치하여 APH 유전자와 접속한다. 즉, APH와 사람 PSTI의 사이에 Met을 배치하는 융합 단백질을 코오딩하도록 구축하면 융합 단백질로부터 사람 PSTI를 채집할 때에 브롬화시안으로 처리하여 용이하게 채집할 수 있으므로 편리하다.

쥐 액틴은 융합시키지 않고 성숙형 액틴으로서 발현시킬 경우 거의 생성되지 않으나, APH의 아미노 말단 13 잔기 이상과 융합시켜 발현시키면 효율적으로 생성된다. 다른 단백질의 발현에 있어서도 같은 정도의 길이를 갖는 APH와 융합시키면 고수율로 발현된다고 생각된다.

본 발명은 APH 유전자와 고 발현능, 즉, mRNA로의 전사, mRNA로부터 펩티드로의 번역 효율의 양호함을 이용하여 목적하는 단백질을 제조하는 것이며, 또한 비교적 단쇄의 목적하는 단백질을 발현 시킬 경우, 강쇄의 APH와의 융합 단백질로서 발현시키므로 균체내에서의 프로데아제에 의한 분해를 면할 수가 있다. 또한, 융합 시킴으로써 목적하는 단백질이 갖는 유해한 활성을 잃케할 수도 있다. 본 발명의 높은 효율은 주로 mRNA로부터 펩티드로의 번역 효율의 개선에 의한 것이라고 생각되며, 상기 요인에 의해 발현효율이 낮았던 펩티드의 발현에 특히 유효하다고 생각된다.

이하의 실시예에서는 본 발명의 제조방법을 사람 PSTI 및 쥐액틴을 예로들어 상세히 설명하고자 하며, 단 본 발명을 한정하지는 않는다.

[실시예 1]

사람 PSTI의 제조

사람 PSTI 유전자의 핵산 염기 배열은 야마모또 등에 의해서 결정된 배열(Biochem. Biophs. Res. Commun., 132, 605(1985))에 따라 성숙형 단백질의 구조 유전자의 암호쇄의 바로 앞에 Met을 코오딩하는 ATG를 바로뒤에 종시 코오든 TGA를 결합시켰다. 또 상기 배열의 5' 말단에는 제한 효소 AccⅠ의 인식 배열을 및 3' 말단에 제한효소 BamHⅠ의 인식 배열을 갖도록 염기 배열을 부가하여, 쇄걸이 179 및 181의 2개쇄를 형성하도롤 설계하였다.

적절한 배열 순서로 결합시켜 PSTI의 아미노산 배열을 코오딩하는 염기 배열을 함유하는 DNA 쇄 및 암호쇄에 상보적인 DNA 쇄를 각각 형성하는 2군의 단쇄 DNA 단편 20종의 화학 합성 하였다. 이들 단편은 모든 종류를 혼합할 경우, 서로 상보적 부분에서 수소 결합을 형성하고 제한 효소의 인식 부위로 되는 점착 말단을 갖는 2개쇄 구조를 형성시킬 수 있는 것이다(제3도).

제3도에 나타낸 U-1~U-10 및 L-1~L-10의 합계 20종의 단편을 핵산 자동 합성기 GENET A-Ⅱ(니혼제홈(주)제)를 사용하여 조제하였다. 수득된 각 단편은 세파덱스 G-50을 사용한 겔 크로마토그래피와, 역상계 실리카겔 컬럼(Nucleosil 1OC18, 10×250mm)을 사용하는 고속 액체 크로마토그래피로 정제하였다.

합성된 올리고누클레오티드는 5' 말단에 인한 잔기를 갖지 않으므로 그대로 T4DNA 리가아제에 의한 연결 반응을 행할 수는 없다. 상술한 20종의 합성 올리고누클레오티드 중 U-1과 L-10 이외의 18종의 합성 올리고누클레오티드에 대하여 5' 말단에 인산기의 효소 부가 반응을 행한다. 인산기 부가 반응은 T4 폴리누클레오티드키나아제(다까라 슈죠오)를 사용하여 행한다. 각 올리고누클레오티드 약 300pmol을 약 25μl의 키나아제 반응 용액(50mM 트리스 염산 완충액, 10mM 염화마그네슘, 10mM2 -메르캅토에탄올, ATP 약 1000pmol, pH 7.6)에 용해시키고, 3단위의 효소를 반응 용액에 가하여 반응을 개시하였다. 반응은 37℃에서1시간 진행시킨다.

열처리(65℃, 20분간)하여 T4 폴리누클레오티드 키나아제의 활성을 잃게한 후, 그대로 연결 반응에 사용한다. 인산기가 부가된 U-2 내지 U-10, L-1 내지 L-9의 18종의 합성 올리고누클레오티드와 인산기 부가처리를 실시하지 않은 U-1, L-10의 합성 올리고누클레오티드를 각각 50pmol씩 혼합하여 연결 반응 용액을 조제한다. 연결 반응용액을 먼저 80℃에서 2분간 처리하고, 20℃까지 서서히 냉각시킨다. 이어서, 디티오트레이톨, ATP, T4DNA 리가아제를 가하여, 연결 반응을 행한다. 최종적으로 연결 반응 용액(200μl)은 66mM 트리스 염산 완충액, 6.6mM 염화마그네슘, 10mM 디티오트레이톨, 1mMATP, 700 단위 T4DNA 리가아제(다까라슈죠오)를 함유하며, 연결 반응은 4℃에서 5일간 실시한다. 이들은 기본적으로 Nucleic Acids Res. 13, 2959.(1985)에 기재된 방법에 따르는 것이다.

연결반응에 있어서 페놀 추출, 에탄올 침전을 통상적인 방법으로 실시한 후, 트리스-붕산완충액의 폴리아크릴아미드 겔전기 영동으로 분리하여 목적하는 180bp 부근의 DNA 단편을 DEAD- 막을 사용하여 전기영동적으로 회수한다. 겔상에서 분리된 DNA를 에티듐 브로마이드로 염색하여 목적하는 DNA 밴드의 근처에 DEAE- 막(Schlleicher Schuell 사)을 겔에 삽입한 후 전기 영동적으로 DNA 밴드를 DEAE- 막에 흡착시킨다. DNA 밴드의 이행이 끝난후, 1.0M 염화나트륨-10mM 트리스 염산완충액(pH8.0)-1mM EDTA로 DNA를 DEAE- 막으로부터 용출시키고, 에탄올 침전으로 DNA를 회수한다(이 방법은 일반적인 방법으로서, 예를들면 Molecular cloning (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982)에 상세히 기술되어 있다). 회수된 DNA 단편은 염기 배열을 조사하기 위하여 M13 파아지게 벡타에 삽입한다.

M13mp10 벡타(다까라 슈죠오)를 제한효소 AccⅠ, BamHⅠ으로 절단한다. 이 직쇄상화한 mp10 벡타와 회수된 DNA 단편을 T4DNA 리가아제를 사용하여 연결한다. 연결반응은 상술한 합성 올리고누클로오티드의 연결 반응과 거의 같은 조건으로 실시하나, 반응온도 및 시간만 12℃와 16시간으로 한다. 연결 반응후의 DNA는 Molecular cloning(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 250-251, 1982)에 기재된 방법에 따라 형질 전환에 사용된다. 대수 증식기의 대장균 K-12주 JM103 배양액을 0℃에서 염화칼슘 처리하여 얻어지는 DNA 수용군과 연결 반응후의 DNA를 혼합하여 얼음속에서 인큐베이트하고, 그후 42℃에서 2분간 처리하여 형질전환 처리를 행하였다. M13의 감염된 대장균은 생육속도가 지연되기 때문에 플라크로서 출현한다. DNA를 취입한 JM103 균체를 100mM 이소프로필 -β-D-티오갈락토시드 20μl, 2% 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토시드 50μl, JM103균의 대수 증식기의 균체액 0.2ml, 및 연한천액(0.6% 한천액) 3ml에 가하여 미리 고화시켜 둔 1.5% 평판한천상에 첨가한다. 여기서 사용한 한천에는 TY배지(트립톤 8g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨 5g을 물 1ℓ에 용해시킨 것)가 함유되어 있다. 37℃에서 하룻밤 배양후, 형질 전환균은 플라크를 형성한다. M13mp10에 의해 형질 전환된 균은 청색의 플라크를 형성하나 DNA 단편이 결실 삽입된 M13 파아지는 무색의 플라크를 형성한다. 멧싱의 방법(Methods Enzymol. 101, 20-28(1983)에 따라 상기 플라크로부터 1 본쇄 파아지 DNA를 이하와 같이 하여 조제한다.

대장균-12주 JM103의 하룻밤 배양액 1ml를 2×TY 배치 100ml(2×TY 배지 ; 16g 박토트립톤, 10g 효모 추출물, 5g 염화나트륨/L)에 식균하고, 37℃에서 2시간 진탕 배양하였다. 상기 배양액을 5ml씩 분주하여 배양액에 플라크가 형성된 한천을 모세관 피펫으로 절단하여 접종하였다.

그후 다시 배양액을 37℃에서 5시간 배양하여 M13 파아지의감염 배지로의 방출을 행하게 한다. 이 배양액의 균체는 복제형 2개쇄 DNA의 조제에 사용하여 균체를 제거한 배지 상층액은 1 개쇄 파아지 DNA의 조제에 사용하였다. 배지 상충액(4ml)에 20% 폴리에틸렌글리콜, 2.5M 염화나트륨의 용액을 800μl가하고, 원심분리하여 파아지를 수거한다. 이 파아지를 500μl의 10mM 트리스염산 완충액 -1mM 에틸렌디아민사초산(pH8.0)에 용해시키고, 페놀추출에탄올 침전으로 1개쇄 파아지 DNA를 회수하였다. 복제형 2개쇄 환상 DNA의 파아지 감염군으로부터의 조제는 통상적인 수산화나트륨-도데실황산나트륨(SDS) 법(Necleic Acids Res. 7, 1513-1523(1979))으로 행한다. 5ml의 배양액으로부터 얻은 균체를 100μl의 50mM 글루코오스, 25mM트리스 염산(pH8.0), 10mMEDTA, 리조자임 1mg/ml에 현탁시키고, 실온에서 5분간 방치하였다. 여기에 200μl의 0.2M 수산화나트륨-1% SDS를 가하고, 천천히 혼합하여 얼음속에서 5분간 방치한다. 그후 150μl의 5M 초산 칼륨용액(pH5.2)을 가하여 혼합하여 얼음속에서 5분간 방치한다. 원심분리후, 상층액에 2배체적의 에탄올을 가하여 침전물을 회수하였다. 침전물을 용해시킨후, 다시한번 에탄올 침전을 실시한다. 상술한 방법으로, 무색의 플라크로부터 복제형 2개쇄 DNA를 조제하고, AccⅠ, BamHⅠ로 2중 절단하여 약 180bp의 DNA 단편이 생성되는 것을 확인하였다. 이어서, 같은 플라크로부터 조정한 1개쇄 파아지 DNA를 디데옥시법(Science 214, 1205-1210(1981))에 의해 DNA 염기 배열 결정에 사용하였다.

염기 배열의 결정은 M13 시퀀싱키트(다까라 슈죠오)를 사용하여 행하였다. 이와 같이하여 얻은 클로온이 목적하는 PSTI의 구조 유전자의 전역을 함유하고 있는 것이 확인되었다.

염기 배열이 확인된 복제형 2개쇄 DNA는 이하에 기재하는 발현 플라스미드의 구축에 이용하였다.

DNA의 발현 플라스미드는 하기 3단편의 연결 반응을 이용하여 구축한다.

1) 상술한 합성 올리고누클레오티드의 연결 반응에 의해 얻어진, 염기 배열이 확인된 약 180bp의 Acci-BamHⅠ 단편

2) pUCl3(다까라 슈죠오)의 HindⅢ-BamHⅠ 절단후의 약 2.8Kbp의 DNA 단편

3) pNE0(Tn5의 APH 유전자를 함유함, 파마시아)를 HindⅢ 소화하고 또 TaqⅠ의 소화에 의해 얻어지는 약 600bp의 DNA 단편(제2도 중의 -350~246번째의 DNA 배열에 상응함, 제4도 참조)

이들의 단편중, 1) 및 3)은 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 분리하여 DEAE막을 사용하여 회수한후, 연결반응에 사용한다.

2)의 단편은 2중 절단을 확인한 후 페놀추출 에탄올 침전을 실시하여 연결 반응에 사용하였다. 이 3단편의 연결 반응에 의해 얻어지는 발현 플라스미드는 트랜스포존 Tn5 중에 코오딩되는 APH의 아미노 말단 82잔기의 하류에 PSTI이 융합된 융합 단백질을 발현시킨다. 상기 3단편의 연결 반응도 상기한 경우와 마찬가지로 T4DNA 리가아제를 사용하여 행하였다. 연결 반응후의 DNA는 모레쿨러클로닝(상기)에 기재된 방법에 따라 형질 전환에 사용하였다. 대장군 K-12 주 C600 또는 AG-1을 DNA 수용군으로 이용하여 수행하였다.

형질 전환균은 암피실린에 대한 저항성을 획득하므로, 암피실린 함유한천 평판(LB 배지 ; 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 염화나트륨 5g을 1L중에 함유한다. 위에서 콜로니를 형성하였다.

출현한 콜로니중의 12개를 암피실린 40μg/ml를 함유하는 LB 배지 5ml에 백금 이를 사용하여 식균하고, 37℃에서 16시간 배양하였다. 그후 균체를 원심 분리하여 모으고 앞서 설명한 수산화나트륨 -SDS 법으로 플라스미드의 분석을 행하였다. 목적하는 플라스미드는 HindⅢ, BamH1, PatⅠ에 대한 절단부위를 각각 1개씩 밖에 함유하지 않았다. 따라서 각각의 제한효소 소화로 직쇄상의 약 3.6Kb의 DNA 밴드로하여 관찰되는 것이 목적하는 플라스미드 pUCKMFPSTI이다(제5도 참조). pUCKMFPSTI을 갖는 클로닝을 다음의 발현에 사용하였다.

목적으로 하는 플라스미드를 갖는 것이 확인된 클로온은 LB 배지(암피실린 40μg/ml를 함유함)에서 배양후 50% 글리세린 존재하의 -70℃에서 보존하였다. 이 균체 보존액 10μg를 5ml의 암피실린을 함유하는 LB 배지에 가하고, 37℃에서 8시간 배양하였다. 이 배양액 100μl를 암피실린을 함유하는 5ml의 M9배지(M9배지 ; 이산수소이나트륨 6g, 인산이수소칼륨 3g, 염화나트륨 0.5g, 염화암모늄 1g을 1L에 용해시켜서 멸균처리후, 황산마그네슘, 염화칼슘을 각각 최종 농도가 2mM, 0.1mM로 되도록 가하였다.

또 암피실린 40μg/ml 글루코오스 0.5%, 카스아미노산 0.5%를 함유한다)에 가하고 37℃에서 24시간 배양을 계속하였다. 배양 종료후 원심분리하여 균체를 모으고 아래의 분석을 실시하였다.

소량의 균체를 취하여 SDS 존재하의 폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)으로 분석하기 위한 시료로 이용하였다. 균체 단백질은 0.1M 트리스 염산 완충액(pH6.8) 1% SDS, 1% 2-메르캅토에탄올, 20% 글리세린을 사용하여 가용화 추출시킨후, 겔 전기 영동으로 분석하였다.

이 단계에서 PSTI을 함유하는 융합 단백질은 예상되는 분자량 1500에 대응하는 위치에 주요 벤드의 하나로서 출현하고 대장균에서 발현되고 있는 것을 알 수 있다. 또한, 대장균을 초음파 처리등으로 파괴하여 가용성 단백질 분획과 불용성 단백질 분획에 대하여 원심분리 조작을 실시함으로써 분획하여 SDS-PAGE로 조사한 결과, 이 융합 단백질은 불용성 단백질 분획에 주로 존재하는 것을 알 수 있었다.

상기 균체 6g을 20ml의 5mM EDTA를 함유하는 0.1M 트리스염산(pH7.0)에 현탁시키고, 12000g로 10분간 원심분리하였다. 동일한 조작을 반복한후, 15ml의 5mM EDTA, 50mM 벤즈아미딘, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드를 함유하는 0.1M 트리스 염산(pH 7.0)에 현탁시키고, 프렌치 프레스를 사용하여 400kg/cm²압력으로 3회 파쇄하였다. 23000g로 20분간 원심분리하여 얻은 펠릿 1.05g을 20mM 디티오트레이톨(DTT), 단백질 변성제를 함유하는 0.1M 인산나트륨(pH 7.0) 10ml에 용해시키고, 세파크릴 S-200(2.6×79cm)의 컬럼으로 겔 여과를 실시하였다.

겔 여과시 용출에는 1mMDTT, 7M 요소를 함유하는 0.1M트리스 염산(pH 7.2)을 사용하였다. 분자량 약 17000의 획분을 모아 증류수로 투석한 후, 동결 건조시키고, 다시 160mg의 브롬화시안을 함유하는 2ml의 70% 포름산을 가하여 실온에서 6시간 반응시킨후, 증류수 18ml를 가하고 동결 건조시켰다. 동결 건조물을 2ml 2mM EDTA, 6M 구아니딘 염산을 함유하는 0.5M 트리스염산(pH 8.1)에 용해시키고, 100μl의 2-메르캅토에탄올을 가하여 질소기류하의 37℃에서 4시간 반응시킨후 증류수로 투석하였다. 10000g로 1분간 원심분리하여 얻은 상층액 6ml에 식염 172mg, 1M 트리스염산(pH 8.0) 320μl를 가하여 소트립신-CH-세팔로스-4B의 친화도 컬럼(2×3cm)에 흡착시켰다.

0.5M 식염을 함유하는 0.05M 트리스 염산(pH 8.0) 이어서 증류수로 차례대로 컬럼을 세정한 후 10mM 염산으로 PSTI을 용출시켜 동결건조시킴으로써 정제품 1.55mg을 얻었다.

수득된 사람 PSTI(12μg)을 시험관(10×90mm)에 담아 4M 메탄술폰산(0.2% 3-(2-아미노에틸)인돌함유) 50μl를 가하고, 감압하의 110℃ 온도에서 24시간 가수분해하였다. 아미노산 분속계로는 히다찌 835형 아미노산 분석계를 사용하였다. 수득된 PSTI의 아미노산 조성은 이하의 표1에 나타내는 바와같이 사람 PSTI과 완전히 일치하였다.

이어서, N말단으로부터 3잔기의 아미노산 배열을 Edman(Iwanaga등의 변법, Eur. J. Biochem. 8, 189-199, 1969)으로 조사한 결과 Asp-Ser-Leu로 밝혀졌으며, 이는 천연의 사람 PSTI과 일치한다. 또한 수득된 사람 PSTI은 소 트립프신을 1 : 1의 몰비로 화학량론적으로 저해하며, 천연사람 PSTI의 항체(토끼 항혈청 폴리클로날)와의 면역 반응성도 그 희석곡선이 천연사람 PSTI의 양태와 일치하였다.

[실시예 2]

쥐 액틴의 제조

융합화 단백질의 발현 플라스미드를 구축하기 위한 목적으로 몇 개의 벡타를 예비적으로 구축한다. 우선 pUCl3(다까라 슈죠오)의 HindⅢ-SalⅠ 부위에 트래스 포존 Tn5(Pharmacia, pNE0 유래)의 HindⅢ-SalⅠ을 도입한다(제6도 참조). 상기 DNA는 트랜스포존 Tn5의 APH유전자를 완전히 포함하고 있으므로, 목적하는 DNA가 도입된 대장균은 가나마이신에 대하여 저항성을 획득하게 되며, 이를 이용하여 형질전환된 대장균을 선택할 수 있 있다. pUCl3을 HindⅢ, SalⅠ 제한 효소로 2중 절단한다. 각 효소 소화조건은 효소의 공급원 지시에 따른다. 같은 방법으로 pUCl3를 HindⅢ, SalⅠ으로 2중 절단하고, 얻어진 약 1.5Kb의 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동을 실시하여 분리한후, DEAE 막 Schleicher Schuell)을 사용하여 회수한다.

겔중의 DNA는 에티듐브로마이드에 의하여 형광 염색하고, 이어서 DNA 밴드의 근방에 DEAE막을 삽입한 다음, 전기 영동을 실시하여 DNA 밴드를 DEAE막에 이행시킨다. DEAE막에 흡착된 DNA는 1M 염화나트륨-10mM 트리스 염산 완충액(pH8.0)-1mM에틸렌디아민 4아세트산(EDTA)을 사용하여 65℃에서 용출시키고 에탄올 침전으로 탈염, 농축시킨다. 이상의 방법은 통상적인 방법으로서 이하의 문헌에 상세히 기술되어 있다(Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory(1982)).

2단편의 연결반응에서는, T4DNA 리가아제(다까라 슈죠오)를 사용하고, 66mM 트리스 염산 완충액(pH7.6)-6.6mM 염화마그네슘-10mM 디티오트레톨-1mM 아데노신 3인산의 용액중에서12℃로 15시간 반응시킨다. DNA 수용균으로서는, 대장균 K-12 주 JM103을 사용한다. JM103은, 가령 파마시아의 pDR540 따위를 구입하면 동시에 입수가 가능하며, 극히 일반적인 균주이다. 형질전환에 사용되는 균은, 대수 중식기의 배양액을 0℃에서 염화탈슘처리함으로써 얻어진다.

이렇게해서 얻은 DNA 감수성 군을, 연결 반응후의 DMA 시료와 혼합하고, 얼음속에 20분간 정치시킨다. 그후, 42℃에서 2분간 및 25℃에서 10분간 보온하고, 평판 한천상에서 형질 전환균을 선택한다. 평판한 천은 항생물질 가나마이신(50μg/ml), 암피실린(100μg/ml)을 함유하는 1.5% 한천(LB/배지(10g 트립톤, 5g 효모추출물, 5g 염화나트륨 1L당에 함유)을 포함한다)으로 이루어진다. 상기 클로닝에 있어서는, 생육한 콜로니는 대부분 목적하는 플라스미드를 가질 것이나, 플라스미드를 각 콜로니로부터 조제하여 분석한다.

평판한천상의 콜로니 5개를 5ml의 LB 배지에 식균하고, 37℃에서 하룻밤 배양한다. 이 균체로부터 알칼리-도데실 황산나트륨(SDS)법에 따라 플라스미드를 조제하고(Birnboim, H.C. Doly, J.(1979) Nucl. Acis|ds Res. 7, 1513-1523), 클로닝에 사용한 HindⅢ 부위와 pUCl3의 EcoRⅠ 부위에서 플라스미드를 2중 절단한후 약 1.5Kb의 단편이 생기는 것을 확인한다. 이와같이하여 얻어진 플라스미드 (pUCKM)를 PstⅠ으로 소화하고, DNA를 아가로스 전기영동으로 분리하여 얻어진 큰 단편만을 전술한 방법으로 겔로부터 회수하여 T4DNA 리가아제를 이용하여 환화시킨다. 형질전환된 균은 암피실린(100μg/ml)을 함유하는 평판한천상(1.5% 한천, LB 배지)에서 선택하고, 출현한 클로니가 유지하고 있는 플라스미드를 전술한 방법과 같이해서 조제하고 분석한다. HindⅢ, PstⅠ의 2중 절단으로 2개의 DNA 밴드가 출현하며, 그 크기가 2.7Kb, 0.6Kb에 대응함을 아가로스겔 전기영동으로 확인한다. 이 클로닝으로부터 얻은 목적하는 플라스미드(pUCKMF)는, 융합 단백질의 일반적인 발현 플라스미드가 된다. 상기 플라스미드의 SalⅠ부위의 하류에는 pUCl3의 멀티클로닝 부위가 그대로 남아 있으므로, 융합 단백질화하는 목적 단백질의 유전자를 삽입할 때에 편리하다. 또, SalⅠ부위는 동시에 AccⅠ, HincⅡ의 절단부위이기도 하므로, 이 3종의 제한 효소의 절단양식 차이와 이에 따르는 폴리머타제에 의한 수복반응을 이용하면, 융합화 할때의 APH 유전자와의 목적 유전자의 단백질 판독틀을 합치시키는 것도 용의하다.

액틴과의 융합단백질의 구축에 있어서, 성숙 액틴을 코오팅하는 DNA 배열(제7도 참조)의 공여 플라스미드로서 pUCACT를 사용한다.(오히라 오사무, 다마끼 미끼오, 쓰루다 유끼지, 데라오까 히로시, 일본생물 물리학회 제23회 년회 예고집)(제8도 참조). 우선, 토끼 후족근으로부터 SDS 페놀법을 이용하여 mRNA를 조제하고(Brawerman, G.(1974) Method in Enzymology 30, 605-612) 오까야마 버그법에 따라 cDNA 라이브러리를 구축한다(Okayama, H. Berg. P. (1982) Mol. Cell Biol. 2, 161-170). 상기 라이브러리로부터 콜로니 하이브리다이제이숀(Grunstein, M. Hongness, D. S. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A 72, 3961-3965)을 이용하여 토끼 골격근 액틴 cDNA를 갖는 클로온을 선택한다. 스크리닝에 사용한 탐침은, β-액틴유전자(와꼬오 순약 공업(주))이다. 이 스크리닝에 의하여 얻어진 크로온으로부터 알칼리-SDS법에 의하여 플라스미드를 조제하고, 기지의 토끼 골격근 액틴 염색체 유전자의 염기 배열을 기초로 하여 cDNA의 구조를 주정하고 (Natrue, 298, 857-859(1982)), 얻어진 클로온의 cDNA 염기배열과 비교한다. 염기배열의 결정은, 다까라 슈조오의 M13 시퀀스·키트를 사용해서 실시한다. 그 결과, 이렇게 해서 얻어진 cDNA가, 완전 길이의 토끼 골격근 액틴 cDNA임을 확인하고, 이것을 기초로 하여 pUCACT를 구축한다. 성숙 액틴을 코오딩하는 염기배열을 얻기 위하여는, 프라이머 신장법을 사용한다.

* 액틴 cDNA를 PstⅠ 단편(약 1.4Kb)으로 잘라내고, 아가로스겔 전기영동에 의하여 전술한 방법에 따라 회수한다.

이 단편과 M13 파아지 mp10 벡타 PstⅠ 소화물을 전술한 바와 같이 T4DNA 리가아제를 사용해서 연결 반응을 시킨다.

이 연결반응물에 의하여 JM103균을 형질전환시키고, 형질 전환체는 10mM 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 40μl, 2% 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토시드(디메틸포름아미드 용액) 40μl, JM103 배양액(LB 배지) 250μl와 혼합한 후, 다시 42℃에 용해·보온한 후 0.6% 한천(TY 배지 : 8g 트립톤, 5g 효모추출물, 5g염화나트륨/L)에 가하고, 사전에 고화시켜 두었던 1.5% 평판한천(TY배지)상에 주입한다. 상층한천이 고화된 후, 37℃에서 하룻밤 보온한다. M13 파아지가 감염된 균은 생육속도가 늦어지고 플라크로서 나타나고, DNA 단편이 삽입된 조합 치환 파아지는 무색의 플라크로서, 또한 M13mp10 유래의 파아지는 청색의 플라크로서 출현하므로, 무색의 플라크를 선택하면 된다.

대장균 JM103의 하룻밤 배양액 1ml를 100ml의 2×TY배지(16g 트립톤, 10g 효모 추출물, 5g 염화나트륨/L)에 식균하고, 2시간 배양한 후, 5ml식 시험관에 분할 주입한다.

각 시험관에, 무색의 플라크를 함유하는 한천을 모세관 피펫으로 뚫고 접종한다. 이어서 5시간 37℃로 배양을 계속하고, 원심분리하여 상층액과 균체를 분리한다. 균체로부터는, 전술한 알칼리 SDS법으로 복제형 2개 쇄 DNA가 조재되며, 상층액으로 부터 1개쇄 DNA가 조제된다.

상층액에 20% 폴리에틸렌글리콜 6000, 2.5M 염화나트륨 약 800μl를 가하고, 원심분리하여 파아지를 침전시킨다. 파아지를 10mM 트리스염산 완충액(pH8.0)-1mM EDTA에 현탁시키고, 페놀 추출-에탄올 침전으로 1개 쇄 DNA를 조제한다.

무색의 플라크로부터 제조한 2개쇄 DNA를 BamHⅠ으로 소화시키면, 액틴 cDNA중에 BamHⅠ 부위가 있기 때문에, 약 1000bp 혹은 약 400bp의 단편이 아가로스겔 전기영동으로 관찰된다.

이것은, 클로닝에 있어서 액틴 cDNA의 삽입방향으로 두가지 방법이 가능하기 때문에 생기는 것이며, 목적으로 하는 것은 약 1000bp의 단편을 만드는 파아지 DNA이다. 상기 해석에서 목적물로 간수되는 파아지 DNA를 갖는 클로온으로부터 조제되는 한개 쇄 파아지 DNA를 pUCACT의 구축에 사용한다.

성숙형 액틴의 아미노 말단 5잔기를 코오딩하는 염기 배열을 갖는 올리고누클레오티드를 포스포트리에스테르법으로 합성한다(Nucl. Acid Res. 8, 5507-5517(1980)).

올리고누클레오티드 15-mer은 5°GACGAGGACGAGACC3'의 배열을 갖는다. 상기 올리고 누클레오티드와 전술한 클로닝에서 얻은 1개 쇄인 파아지 DNA를 혼합하고, 대장균 폴리머라제 Ⅰ 클레노우 단편을 이용하여 1개 쇄 파아지 DNA를 주형으로 하여 신장 합성반응을 행한다. 신장 합성반응은, 10mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5), 7mM 염화마그네슘, 20mM 염화나트륨, 4dNTP 각 0.2mM중에서 37℃로 2시간 반응시킨다. 반응 후, DNA를 페놀추출 에탄올 침전으로 회수한 후, 누클레아제 S1을 사용하여, 1개 쇄에서 남아 있는 부분을 소화 한다. DNA를 페놀 추출, 에탄올 침전으로 회수한 후, 다시 대장균 폴리머타제 Ⅰ 클레노우 단편을 이용하여 말단이 평활만단이 되도록 수복반응을 행한다. 수복반응은, 신장합성 반응과 같은 조건에서 행한다. 반응 후에 시료는 65℃로 20분간 처리하고, 클레노우 단편을 실활시킨다. 염화나트륨을 최종 농도가 100mM이 되도록 반응용액에 가하고, PstⅠ소화를 행한다.

소화물은, 아가로스겔 전기영동으로 분리하고, 약 1.2Kb의 DNA 밴드를 EDAE막을 사용하여 회수한다. pUCl3을 HincⅡ-PstⅠ으로 2중 소화한 것과, 앞서말한 DNA 단편을 혼합하고, T4DNA 리가아제를 사용해서 연결 반응을 수행한다.

전술한 바와같이 평판한천(1.5% 한천, LB 배지, 암피실린 100μg/ml)상에서 형질 전환균을 선택하고, 9개의 임의의 콜로니로부터 알칼리-SDS법을 이용하여 플라스미드를 조제한다.

HindⅢ와 EcoRⅠ의 2중 소화를 실시하여 약 1.2Kb의 DNA 밴드를 수득하는 것이 목적하는 플라스미드이다.

상기 분석에 의하여, 목적하는 플라스미드로 인정하는 것은, 클로닝에 사용된 HincⅡ 부위도 PstⅠ부위도 회복하고 있다.

또 HincⅡ 소화를 이용하여 성숙 액틴을 코오딩하는 염기 배열의 첫번째 염기로부터 시작하는 DNA 단편을 조제할 수가 있다. 상기 플라스미드를 HindⅢ으로 소화하고, 대장균 폴리머라제 Ⅲ 클레노우 단편으로 수복하여 평활말단으로 만든 후, SalⅠ 소화하여 얻어지는 약 1.2Kb의 DNA단편을 아가로스겔로부터 회수한다. pUCl3의 SalⅠ-SmaⅠ 소화물과 상술한 DNA 단편을 T4DNA 리가아제를 사용하여 연결시킨다.

전술한 바와 같이 형질 전환균으로부터 플라스미드를 조제하고 EcoRⅠ-HincⅡ의 2중 소화로부터 약 1.2Kb의 DNA단편을 수득하는 것이, 목적하는 pUCACT 플라스미드이다.

pUCKMF를 HindⅢ-HincⅡ로 2중 소화하여 얻어지는 약 600pb의 단편과, pUCACT를 HindⅢ-HincⅡ소화하여 얻어지는 약 3.9Kb의 DNA단편을 아가로스겔로부터 회수하고, T4DNA 리가아제를 사용해서 연결시킨다. 전술한 바와 같이 형질 전환균(JM103)을 암피실린을 함유하는 평탄 한천상에서 선택하고, 약 10개의 콜로니로부터 플라스미드를 조제한 후, HindⅢ-EcoRⅠ으로 2중 소화시켜 생성되는 약 1.5Kb의 단편이 목적하는 플라스미드이다. 수득된 목적하는 플라스미드(pUCKMFACT)는 아미노말단에 APH 유래의 61 아미노산 잔기와 트랜스포존 Tn5 유래의 10 아미노산 잔기를 가지며, 이하에 액틴의 375잔기를 갖는 합계 446잔기의 폴리펩티드 쇄를 코오딩한다(제9도 참조).

융합액틴을 발현시키기 위하여 우선 상술한 pUCKMACT를 보유하는 대장균을 임피실린 40μg/ml를 함유하는 LB 배지에서 37℃로 14시간 배양한다. 이 배양액을 M9배지(NaHPO4 6g, KHPO3g, NaCl 0.5g, NHCl 1g/L, 2mM MgSO, 0.1mM CaCl, 0.5% 글리세롤, 0.5% 카스아미노산, 암피실린 40μg/ml) 5ml~100μl에 가하고, 37℃에서 10시간 배양한다. 배양 2기간 후에 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드를 1mM이 되도록 가하고, 유도를 한다. 배양후의 균은, 원심분리하여 집균 후, 10% 글리세린-0.1M 트리스염산 완충액-1% SDS-1% 2-메르캅토에 탄올에 현탁시키고, 초음파처리, 100℃에서 2분간 열처리 후, Laemmli등의 방법(Nature 227, 680-685 (1970))에 따라, SDS 존재하에 폴리아크릴아미드겔 전기영동 실시하여 분석한다.

SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동의 패턴으로부터, 목적하는 융합 액틴의 분자량에 대략 상당하는 위치에서 명확한 밴드가 관찰된다(전균체 단백질의 약 15%) 이 밴드가 목적물임은 이 밴드중의 단백질에 액틴에 대한 모노클로날 항체(아마샴·인터내쇼널)가 결합될 수 있다는 것에서 확인되었다.

HindⅢ-HaeⅢ의 2중 절단으로 얻어지는 pUCKMF 유래의 약 400bp의 DNA 단편을, pUCACT를 SalⅠ으로 소화하고 대장균 폴리머타제 Ⅰ 클레노우 단편처리 한 후, 이어서 HindⅢ 소화하여 얻어지는 DNA와 연결시킴으로써 APH의 아미노 말단 12잔기와 접속부 1잔기의 합계 13잔기를 액틴에 융합시킨 융합화 액틴의 발현 플라스미드 PUCKMFACT4를 얻는다.

이 플라스미드를 갖는 대장균을 사용하여 상술한 바와 같이 융합단백질을 발현시켰던 바, 겔상에서 명확한 밴드가 발견되지 않았다(전균체 단백질 1% 이하).

성숙 액틴의 pUC계 벡타를 사용한 발현 플라스미드는, Schoner 등이 보고하고 있는 two-cistron Construction의 원리에 따라 구축하였다(proc. Natl. Acad. Sci USA 81, 5403-5407(1984))(제9, 10, 11도 참조). 상기 원리에 의한 구축에서는, APH의 아미노 말단 60잔기를 함유하는 코오드 영역과 액틴 유전자 사이에, 번역중지 코오든 TAA와 다음 액틴 유전자의 번역개시를 위한 리보소움 결합 배열 및 번역 개시 코오돈 ATG를 삽입하고 있다. 상류의 APH 유전자 유래의 구조가 갖는 높은 번역효율을 손상함이 없이, 성숙형 액틴을 발현시키고자 하는 경우에 있어서, 같은 방법으로 몇개의 유전자 발현에 성공하고 있음이 보고되고 있다(Ep-154539).

pUCKMF를 PstⅠ소화하고, 또한 대장균 폴리머타제 Ⅰ 클레노우 단편을 이용하여 평활말단으로 만든다. 이 평활말단으로한 부분에 시판중인 XbaⅠ 링커(파마시아, 5-인산링커-5'-CTCTAGAG-3')를 T4 DNA 리가아제를 사용하여 통상적인 방법으로 연결한다(Molecular Cloning, Cold Sring Harbor Laboratory, New Yor(1982)).

XbaⅠ링커가 부가된 DNA를 XbaⅠ으로 소화한다.

XbaⅠ소화후, DNA를 페놀 추출, 에탄올 침전으로 회수한다. 수득된 직선상 DNA를 T4DNA리가아제를 사용해서, 환상 DNA가 되도록 자체의 양단을 연결한다. 연결 반응후의 DNA를 전술한 바와 같이 대장균 JM103에 도입하고, 얻어진 형질 전환균으로부터 플라스미드를 조제하고 HindⅢ, XbaⅠ 소화에 의하여 약 600bp의 삽입 단편이 잘라짐과, PstⅠ절단점이 없어졌음을 확인한다. 이 플라스미드 pUCKMF1은 2-시스트론 구축(two-cistron Construcion)의 발현 플라스미드 이외에, 융합 액틴의 발현 플라스미드의 구축에도 이용 가능하다(제10도 참조).

상기 pUCKMF1을 XbaⅠ 소화클레노우 단편 처리후, 다시 EcoRⅠ으로 소화한다. 이와같이하여 얻어진 DNA 단편을, pUCACT의 SalⅠ소화 클레노우 단편 처리 후 EcoRⅠ 소화로 잘라지는 약 1.2Kb의 액틴 코오드 영역을 포함하는 DNA 단편과 T4DNA 리가아제로 연결하며, 융합 액틴의 발현 플라스미드가 된다. 이 융합 액틴 발현 플라스미드(pUCKMFACT1)는 APH의 아미노 말단 60잔기와 접속부 3아미노산 잔기를 포함하는 융합 액틴을 발현한다(제11도 참조).

2-시스트론 구축(two-cistron Construction)의 성숙 액틴 발현 플라스미드를 구축하기 위하여, 앞서의 XbaⅠ링커를 부가한 APH유전자의 부분을 포함하는 pUC 벡타의 XbaⅠ-SstⅠ부분에서 합성 올리고누클레오티드를 삽입하고, 제13도에 표시하는 바와 같은 염기 배열을 APH 유전자 유래의 염기배열의 하류에 포함되도록 한다. 이와같이하여 얻어진 벡타는, 나시(Nishi) 등의 보고에서 나타난 ATC 벡타로서 사용할 수 있다(DNA 2, 265-273(19833)). 적당한 효소처리를 실시하여, 번역개시 코오돈을 포함하는 프로모터, 번역 개시부위에 필요한 염기배열의 공여 벡타로서 사용할 수 있다. 이 벡타를 SetⅠ소화 클레노우 단편으로 평활 말단화 시킨후, EcoRⅠ으로 소화한다. 이 DNA와, pUCACT의 HineⅡ-EcoRⅠ 소화로 얻어지는 약 1.2Kb의 액틴의 코오드 영역을 포함하는 DNA 단편을 T4DNA 리가아제를 사용해서 연결하면, 2-시스트론 구축(two-cistron Construction)에 따르는 성숙 액틴의 발현 플라스미드 pECKMACT가 작성된다(제12도 참조). 목적하는 플라스미드 여부의 확인은, 형질 전환균으로부터 얻어진 플라스미드가 HindⅢ-EcoRⅠ 소화로 약 1.8Kb의 단편을 생성한다는 사실과, 액틴의 번역개시 코오돈 ATG 부근의 염기배열을 다까라 슈죠오의 시쿼스키트를 사용해서 확인함으로써 이루어진다.

APH 유전자 길이에 따른 생산량의 변화

융합에 사용되는 APH의 아미노 말단의 하잔기가 높은 발현에 필수적인가 하는 여부를 pECKMACT의 HincⅡ 부위로 부터 엑소누클레아제 BAL31을 사용하여 APH의융합부분을 단축시켜가며 발현량을 조사한 결과, 적어도 25잔기의 APH의 아미노 말단을 융합시키면 융합 액틴의 전균체 단백질의 약 10% 이상 발현될 수 있음이 판명되었다.

pUCKMF를 SalⅠ 절단한 플라스미드를, 엑소누클레아제 BAL31로 소화된다. BAL31의 소화조건은, 20mM트리스 염산 완충액 pH 8.0, 12mM 염화칼슘, 12mM 염화마그네슘, 0.6M 염화나트륨이며, EDTA를 최종 농도가 50mM이 되도록 첨가하여 반응을 정지시킨다. BAL31 처리후의 단축되는 길이는 소화시간에 따라 조절된다. BAL31 처리후, DNA를 대장균 폴리머타제 Ⅰ 클레노우 단편으로 다시 처리하고, 말단을 평활말단으로 정리한 후, HindⅢ로 절단하고, 아가로스겔로부터 약 400~600bp의 단편을 회수한다. pUCACT를 SalⅠ 소화하 후, 대장균 폴리머타제 Ⅰ 클레노우 단편 처리하고, 다시 HindⅢ 소화한 플라스미드와 상술한 BAL31처리 DNA단편을 T4DNA 리가아제를 사용해서 연결한다. 연결 반응 후의 DNA로 전술한 바와 같이 대장균 JM103을 형질 전환시키고, 형질 전환균은 암피실린을 함유하는 평판 한천상에서 선택한다.

각 콜로니를 배양하고, 약 40주의 콜로니로부터 플라스미드를 조제한후 BalⅡ 소화로부터 얻어지는 DNA 단편의 크기로부터 BAL31에 의하여 단축된 DNA 길이를 계산한다. 목적하는 DNA의 단축길이를 갖는 클로온을 선택하고, 액틴과 APH 유전자의 접속부에 해당하는 염기 배열을 다까라 슈죠오의 시퀀스키트를 사용하여 결정한다. 이리하여 액틴의 코오딩영역과 같은 판독틀을 가지며, 단축된 APH 영역을 갖는 액틴의 발현 플라스미드를 단리할 수가 있다. APH44 아미노산 잔기, 결합배열 1 아미노산 잔기, 이하에 쥐 액틴을 발현하는 pUCKMFACT2, APH24 아미노산 잔기, 결합 배열 1 아미노산 잔기, 이하에 쥐 액틴을 발현하는 pUCKMFACT3을 얻었다.

상술한 바와 같이하여 수득된 벡타 pUCKMFACT, pUCKMFACT1, pUCKMFACT2, pUCFMFACT3, pUCKMFACT4, pUCKMACT가 발현하는 융합 단백질(단, pUCKMACT는 성숙 쥐 액틴을 발현한다)의 개략도를 제14도에 나타낸다.

제15도는 각 플라스미드를 보유하는 대장균을 배양한 후, 도데실 황산나트륨 존재하에서 파괴하고, 추출가용화된 단백질을 도데실 황산나트륨 존재하에 폴리아크릴 아미드겔 전기영동으로 각 융합 단백질의 생산량을 분석한 결과를 나타낸다. 각 융합 단백질의 양은, 코마시-브릴리언트블루-R250을 이용한 염색 밴드, 또는 니트로셀룰로오즈막에 전사시킨 후 모노클로날 항액틴 항체의 융합 액틴으로의 결합량으로부터 구하였다.

APH의 융합분이 25잔기에서 13잔기 아미노산으로 감소함(실제로는, 접속부로서 1아미노산잔기를 함유하므로, APH의 아미노 말단 잔기수로서는, 24잔기 및 12잔기)과 동시에, 발현량의 대폭적인 감소가 인지된다. 상기 발현량이 저하된 융합 액틴의 pUCKMACT에 의해서 생산되는 성숙형 액틴의 발현량과 비교하면 5~10배의 발현량이다.

Claims (3)

1. 사람 PST1 또는 쥐 액틴을 APH와의 융합단백질로서 대장균과 같은 미생물내에서 발현시킬 수 있고 융합 단백질의 APH와 사람 PSTI 또는 쥐 액틴 사이에서 단수 또는 복수개의 결합 배열을 갖는 벡터를 상기 미생물내에 도입하여 융합단백질을 생성하고, 상기 결합 배열을 절단하여 사람 PSTI 또는 쥐 액틴 단백질을 얻는 것을 특징으로 하는 단백질의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, APH가 제1도의 APH의 아미노산 배열의 N 말단으로부터 13개 이상의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 결합 배열이 메티오닌 또는 메티오닌을 함유하는 배열인 것을 특징으로 하는 단백질의 제조방법.

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