KR960015745B1

KR960015745B1 - 변형된 인간-psti

Info

Publication number: KR960015745B1
Application number: KR1019890010227A
Authority: KR
Inventors: 노브오 요시다; 노리히사 기구찌; 마사루 신; 데라오까히로시
Original assignee: 시오노기 세이야꾸 가부시기가이샤; 요시가가 이찌오
Priority date: 1988-07-19
Filing date: 1989-07-19
Publication date: 1996-11-20
Also published as: AU612865B2; EP0352089B1; JPH07102137B2; KR900001853A; DE68913090T2; JPH02150282A; ES2062006T3; DE68913090D1; EP0352089A2; CA1339875C; AU3797889A; EP0352089A3; US5122594A

Abstract

내용없음

Description

변형된 인간-PSTI

제1도는 본 발명의 변형된 인간 PSTI Gln(42)-PSTI의 아미노산 서열과 이를 암호화하는 DNA를 나타낸 도면이고,

제2도는 본 발명의 변형된 인간 PSTI Ser(44)-PSTI의 아미노산 서열과 이를 암호화하는 DNA를 나타낸 도면이고,

제3도는 원래의 인간 PSTI 및 본 발명의 변형된 3종의 인간 PSTI(Ser(44)-PSTI, Thr(43)-PSTI 및 Gln(42)-PSTI)를 pH 7.0에서 트립신 처리시의 안정성에 대한 비교치를 나타낸 그래프이고,

제4도는 원래의 인간 PSTI 및 본 발명의 변형된 3종의 인간 PSTI(Ser(44)-PSTI, Thr(43)-PSTI및 Gln(42)-PSTI)를 pH 8.0에서 트립신 처리시의 안정성에 대한 비교치를 나타낸 그래프이고,

제5도는 원래의 인간 PSTI의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 DNA를 나타낸 도면이고,

제6도는 APH 유전자의 DNA 서열과 이 DNA 서열로부터 추정된 아미노산 서열을 나타낸 도면이고,

제7도는 본 발명에서 사용하는 합성된 인간 PSTI 유전자의 DNA 서열과 이 DNA 서열에 상응하는 아미노산 서열을 나타낸 도면이고,

제8도는 APH 유전자내, 그리고 부근의 각종 제한효소의 인식부위를 나타낸 제한 엔도뉴클리아제 지도이고,

제9도는 본 발명에서 사용되는, APH와 원래의 인간 PSTI의 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 함유한 발현 플라스미드 PUC 13-PSTI를 제조하는 과정을 도식적으로 표시한 공정도이다.

본 발명의 각종의 변형된 인간 PSTI 및 이를 암호화하는 DNA 서열에 관한 것이다.

취장으로부터 유도된, 2종류의 트립신 저해제, 즉 췌장 분배 트립신 저해제(PSTI) 및 염기성 췌장 트립신 저해제(BPTI)가 공지되어 있다. PSTI 는 모든 표유동물에 존재하며, 췌장 뿐만 아니라 신장, 폐, 비장, 간, 뇌 및 다른 기관에 분포되어 있다. BPTI는 소와 다른 반추동물의 내장에 분포되어 있으며, 사람이나 다른 표유동물에는 존재하지 않는다. 푸볼 등(Pubols et al., J. Biol. Chem. 249, 2235, 1974)과 파인스타인 등(Feinstein et al., Eur. J. Biochem. 43, 569, 1974)은 인간의 췌장액으로부터 이를 분리 및 정제하였으며, 그린 등(Greene et al., Methods Enzymol. 45, 813, 1976)이 이 물질의 구조를 확정하였다. 또한 야마모토 등(Biochem, Biophys. Res. Commun, 132, 605, 1985)은 PSTI 에 상응하는 DNA 서열을 확정하였다(제5도).

제5도에서 보는 바와 같이, 인간 PSTI 는 분자량이 6242 달톤인, 56개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드이다. 시스테인 잔기가 9 및 38, 16 및 35 또한 24 및 56 위치에서 디설피드 결합에 의해 연결되어 있기 때문에, 설피드릴 그룹이 PSTI 에 존재하지 않는다는 것은 알려져 있다.

상기에 기술한 트립신 저해제는 췌장의 선세포에 존재하며, 정상의 인간에 있어서는 각종의 췌장 효소와 함께 췌장액내에서 분비되어 대췌관내에서 트립신을 저해한다. 그러나, 급성 췌장염의 경우, 어떤 이유로 인하여 트립신이 활성화된 후, 트립시노겐과 다른효소 전구체가 연쇄반응에서 활성화되는데, 이것은 췌장의 자기소화를 초래하는 것으로 추정된다. 트립신 저해제의 투여는 이러한 형태의 급성 췌장염을 치료하는데 효과적이다. 이러한 목적으로 현재 사용되는 트립신 저해제는 상기 한 소췌장 BPTI 와 합성 저해제 등이다. 그 기원을 고려해보면, 인간 PSTI 는 이러한 종류의 치료에 사용되는 가장 적절한 트립신 저해제인 것으로 보인다. 그러나, 이러한 형태의 PSTI 는 현재까지 인간 췌장액으로부터 분리 및 정제하여 제조해 왔기 때문에 치료용도로 사용하는 데 충분할 정도로 다량으로 얻을 수는 없으므로, 지금까지는 인간 PSTI를 임상에는 사용하지 못했다. 이러한 대량 생산의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명자들은 재조합 DNA 기술을 적용하여 인간 PSTI를 대량으로 수득하는 방법을 개발하였다(일본국 특허출원 공개 제62-253437호). 이 방법에 따르면, 인간 PSTI 는 APH(아미노-글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제 Ⅱ)와의 융합 단백질로서 발현된다. 이 인간 PSTI 융합 단백질은 미생물 숙주내에서 대량으로 생산할 수 있으며, 이 융합 단백질을 브롬화시아노겐으로 분해한 후, 인간 PSTI만을 분리 및 정제한다. 이 방법으로 수득한 인간 PSTI는 원래의 인간 PSTI와 동일한 아미노산 서열을 지니며, 따라서 임상적용에 있어서 원래의 PSTI로 얻을 수 있는 것과 동일한 정도의 치료효과를 기대할 수 있다. 그러나, PSTI 는 또한 펩티드이므로, 시간이 경과함에 따라, 점차로 트립신과 같은 단백질 분해효소에 의해 분해된다. 이러한 결점때문에 적절히 지속되는 트립신-저해효과를 달성하기 위해서는 시간의 경과에 따라 분해되는 PSTI의 양을 측정하여 그만큼의 새로운 물질을 대체 투여해야 하는데, 이것은 곤란한 실험실적 테스크와 다른 부수적인 절차를 요구하는 단점이 있다.

본 발명자들은 인간 PSTI를 암호화하는 유전자에 부위-특이적 돌연변이를 유발시킴으로써 자연적으로 발생하는 PSTI(원래의 PSTI)와 다른 특성을 지닌 인간 PSTI 변종(변형된 PSTI)을 수득할 수 있게 되어 본 발명을 완성하는데 성공하였다.

상기한 많은 단점과 선행기술의 미비점을 해소한, 본 발명의 변형된 인간 PSTI는 원래의 인간 PSTI의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 42번째 및/또는 44번째 위치의 알기닌이 글루타민 및/또는 세린으로 치환된 것을 제외하고는 원래의 인간 PSTI와 동일하다.

본 발명의 DNA 서열은 원래의 PSTI의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 42 및 /또는 44번 위치의 알기닌을 글루타민 및/또는 세린으로 치환함으로써 유도되는, 상기한 변형된 인간 PSTI를 암호한다.

본 발명의 다른 변형된 인간 PSTI는 원래의 인간 PSTI의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 42 또는 44번째 위치의 알기닌이 각기 글루타민 또는 세린으로 치환된 것 이외는 원래의 인간 PSTI와 동일하다.

본 발명의 DNA 서열은 원래의 PSTI의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 42 또는 44번 위치의 알기닌을 각기 글루타민 또는 세린으로 치환함으로써 유도된, 상기한 변형된 인간 PSTI를 암호한다.

따라서, 본 발명은 트립신 및 다른 단백질 분해효소에 의한 분해에 대해 원래의 인간 PSTI 보다 더 내성을 가진, 변형된 각종의 인간 PSTI를 제공하고, 재조합 DNA 기술을 적용하여 상기에 언급한 유익한 특성을 지닌 변형된 인간 PSTI를 암호화하는 DNA 서열을 제공하는 목적을 달성할 수 있다.

본 발명의 변형된 인간 PSTI를 암호화하는 DNA 서열은 예를 들면, 재조합 DNA 기술을 사용하여, 특히 적절한 프로모터로부터 하류로 원래의 인간 PSTI(본 발명자들의 일본국 특허출원 공개 제62-253437호의 방법에 의해 수득)를 암호화하는 인자를 가진 발현 벡터를 제조하고, 그후 이 벡터내의 인간 PSTI 유전자에 부위-특이적 돌연변이를 유발시킴으로써 수득할 수 있다. 인간 PSTI의 아미노산 서열은 비교적 짧기 때문에, 원하는 변형된 PSTI 변종은 직접 화학적 합성에 의해 수득할 수도 있다. 그러나, 일단 인간 PSTI를 암호화하는 유전자를 지닌 재조합체가 제조되면, 원하는 변형 PSTI를 암호화하는 유전자를 얻기 위해 이 벡터로 부위-특이적 돌연변이를 유발시키는 것을 용이하게 수행할 수 있기 때문에, 이 방법은 이러한 목적에 아주 적절하다. 인간 PSTI를 암호화하는 유전자는 상기한 야마모토 등에 의해 인간 췌장 세포로부터 이미 클로운되고 이 유전자의 DNA 서열도 확정되었다. 이 DNA는 야마모토 등의 방법에 따라 인간 췌장 세포로부터 제조할 수 있으나, 이 서열이 비교적 짧기 때문에, 합성인간 PSTI 유전자를 사용하는 것이 유리하다. 원래의 인간 PSTI의 DNA 서열은 제5도에 나타낸 바와 같다. 본 발명에 있어서, 제5도에 표시한 인간 PSTI의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열 어느것이나 사용할 수 있다. 이 인간 PSTI 유전자는 적합한 프로모터의 제어하에 고수준의 발현 능력을 지닌 다른 유전자와 함께 융합 유전자로 전환시킨다. 예를 들면, 이러한 전환은 상기한 일본국 특허출원 공개 제62-253427호의 방법에 따라 APH 유전자와 융합 유전자를 형성시킴으로써 적절히 달성할 수 있다. 여기에서 APH 유전자는 APH(아미노-글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제 Ⅱ)를 암호화하는 구조 유전자를 함유하는 것을 말하며, 프로모터 등을 함유할 수도 있다. APH 유전자는 미생물에 네오마이신 및 가나마이신에 대한 내약품성을 부여한다.

이 APH 유전자의 염기 서열은 이미 공지되어 있다(Gene, 19, 327, 1982). 이 염기 서열 및 이 염기 서열로부터 유도된 아미노산 서열은 제6도에 표시한 바와 같다. 이 염기 서열을 함유하는 트랜스포손 Tn5 및 플라스미드(예, pNEO(Pharmacia)는 시판되고 있으며, APH유전자는 이들로부터 절제하여 수득할 수 있다. 이들 APH 유전자는 원래의 APH 에 대한 완전한 구조 유전자를 함유할 필요는 없으며, N-말단에 수개의 아미노산을 암호화화하는 것만이 필요하다. 예를 들면 Hind Ⅲ 및 Tag Ⅰ에 의해 소화된 pNEO(Pharmacia)의 제한 단편(APH 프로모터와 제6도에서 -350 내지 246 위치의 DNA 서열에 상응하는, APH의 N-말단에서 82번째 아미노산까지의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 함유)을 사용할 수 있다. 또한, 제6도에 표시된 서열 뿐만 아니라, 어떤 뉴클레오티드의 치환, 삭제 또는 삽입에 의해 이 서열로부터 유도된 변형 APH 서열을 사용할 수 있다.

본 발명의 변형된 인간 PSTI를 암호화하는 유전자를 얻기 위해서는, 예를 들면, 먼저 인간 PSTI를 암호화하는 DNA 서열을 합성한다. 이러한 DNA 서열은, 예를 들면, 제7도에 표시한 20형태의 단편(U-1 내지 U-10 및 L-1 내지 L-10)을 자동 핵산 합성기를 사용하여 합성한 다음, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 같은 크로마토그래피 기술에 의해 이들 생산물을 정제하고 U-1 및 L-10을 제외하고는 이들 모든 단편에 인산염 잔기를 부착시킨 후, 이들 단편을 DNA 리가제로 적절히 연결시킴으로써 합성할 수 있다. 이러한 방법은 관련 문헌[Nucleic Acids Res. 13, 2959(1985)]에 기술되어 있다. 연결후, DNA를 페놀추출 및 에탄올 침전에 의해 통상적으로 회수한 후, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 통상적 방법으로 분획화한다. 폴리아크릴아미드 겔로부터의 원하는 DNA 분획의 회수는 예를 들면 DEAE-C 막을 사용하여 흡착 및 용출에 의해 달성할 수 있다[참조; Molecular Cloning"(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982)].

회수된 DNA 단편의 염기 서열을 측정하기 위해서는, 예를 들면, 이들 DNA 단편을 M13 파지 벡터로 삽입하고, 이것을 사용하여 적합한 숙주를 형질 전환시킨 다음 선별 과정을 거친다. 이 목적에 적합한 M13 파지 벡터는 M13mp10(Takara Shuzo Co. 제품)이다. 이 파지 벡터를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 분리시키고, 분리된 벡터를 T4 DNA 리가제를 사용하여 상기한 DNA 단편에 연결시켜서 인간 PSTI를 암호화하는 DNA가 삽입된, 재조합 파지 M13-PSTI를 제조한다. 이 M13-PSTI 파지는 적절한 숙주세포로 도입한다. 이 과정은 상기 문헌["Molecular Cloning"(p. 250-251)]에 기술된 방법으로 수행한다. 이 목적에 적합한 숙주세포는 에스케리키아 콜리 K-12주 JM103이다. M13mp10에 도입된 박테리아는 청색 프라크를 형성하는데 비해, M13-PSTI의 도입에 의해 형질 전환된 박테리아는 무색 플라크를 형성한다. E.Coli가 무색 플라크로부터 얻어진 파지 DNA에 의해 트랜스팩트된 경우, 이 파지 DNA는 박테리아 배양에서 증식되며, 단일-가닥 파지 DNA를 배지의 상등액으로부터 얻게 되는 반면, 이중-가닥 파지 DNA는 박테리아 세포체로부터 얻을 수 있다. 이 단일-가닥 DNA는 메싱의 방법(Messing, Methods Enzymol. 101. 20-28(1983)]으로 제조할 수 있다. 염기 서열화의 디데옥시 방법[Science 214, 1205-1210(1981)]을 단일-가닥 DNA에 적용함으로써 인간 PSTI에 대해 원하는 완전한 구조인자가 삽입되어 있는지의 여부를 측정할 수 있다. 이것은 일반적인 방법이며, 특히 시판되고 있는 M13 시

싱 키트(Sequencing kit, Takara Shuzo Co. 제품)을 사용할 수 있다. 박테리아 체세포로부터의 이중-가닥 DNA의 제조는 통상의 수산화나트륨-도데실 황산나트륨(SDS) 방법을 사용하여 달성할 수 있다[Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523(1979)]. 이 방법으로 수득한 이중가닥 DNA는 발현 플라스미드의 제조에 사용된다.

PSTI 유전자는 이 방법으로 수득한 M13 파지 제조합체로부터 절제한 다음, 이 유전자를 상기한 pNEO 또는 다른 벡터로부터 절제한 APH 유전자와 함께 적절한 플라스미드 벡터로 삽입시켜 원하는 PSTI 발현 플라스미드를 생성시킨다. 이와 같이 할때, 상기한 인간 PSTI 유전자 서열의 5' 말단에 메티오닌에 대한 코돈(즉, ATG)이 존재하는 것이 바람직하다. APH와 인간 PSTI 잔기 사이에 위치한 메티오닌을 가진 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 이러한 방법으로 제조하는 경우, APH와 PSTI간의 결합은 발현된 융합 단백질을 브롬화 시아노겐으로 처리함으로써 절단할 수 있으며, 이로써 인간 PSTI의 분리가 용이하게 된다.

발현 플라스미드(uUC13-PSTI )는 예를 들면, 1) 상기한 이중-가닥 DNA를 AccI 및 BamHI로 절단하여 얻은 180bp DNA 단편, 2) pUC13의 Hind Ⅲ-BamHI에 의한 절단에 의해 수득된 대략 2.8Kbp DNA단편과, 3) pNEO(Tn5의 APH 유전자 함유)의 소화에 의해 수득한 대략 600bp DNA 단편을 Hind Ⅲ 및 TaqI(pUC13-PSTI)로 결합시킴으로써 제조할 수 있다. 상기 2)에 언급한 pUC-13 이외에, 이 제조에 사용할 수 있는 다른 플라스미드 벡터는 pβ-ga113c, pOP203-13, pUC9, pUC8, pEA300, ptrpL1, pBN70, pWT111, pWt121, pWT131, pKK223-3, pDR540, pDR720, pYEJ001, pPL-lambda, pKC30, pKC31, pAS1, pLC24, pHUB4, pIN-Ⅰ, pIN-Ⅱ, pIN-Ⅲ, pC194, pC221, pUB112, pT127, pSA0503, pE194 등이다.

그러나, 사용 가능성은 여기에 열거한 것에 한정되는 것은 아니다. 실제로, 상기한 인간 PSTI와 APH 융합 유전자가 벡터에 의해 운반될 수 있고, 어떤 미생물에서 발현될 수 있는 한, 유전공학 분야에 통상의 지식을 가진 사람은 형질전환에 일반적으로 사용되는 벡터 어느것이나 본 목적에 사용할 수 있다. 숙주용으로 적합한 벡터를 선택하고 적절한 프로모터의 제어하에 상기한 융합 유전자를 도입함으로써 요구되는 APH-인간 PSTI 융합 단백질을 발현할 수 있는 제조합체를 제조할 수 있다. APH 유전자용 프로모터는 pNEO의 소화에 의해 얻어진, 상기 3)에서 언급된 DNA 단편에 함유된다. 그러나, 이 프로모터는 다른 프로모터로 바꿀 수 있거나, 또한 APH 유전자를 더욱 강한 프로모터로부터 하류에 위치시킬 수 있다. 본 목적에 사용할 수 있는 프로모터는 lac, Trp, Tac 프로모터계 등이다.

상기한 DNA 단편 1),2) 및 3)으로부터 얻은 발현 플라스미드는 적합한 숙주로 도입하고, PSTI의 생산에 대해 검사할 수 있다. 예를 들면 APH와이 융합 단백질로서의 PSTI 의 발현은 상기한 문헌("Molecular Cloning")에 기술된 방법에 따라 상기한 발현 플라스미드 pUC13-PSTI 의 도입을 통해 적합한 숙주 세포를 형질전환시킴으로써 확인할 수 있다. E. Coli(예, K-12주 JM103, C600, AG-1등)또는 B. Subtilis와 같은 숙주 세포를 사용할 경우, PSTI를 높은 효율로 생산할 수 있다. 원래의 인간 PSTI 는 슈가 체인이 없기 때문에, 원래의 형태와 동일한 타입의 인간 PSTI는 원핵생물 세포에서 생산할 수 있다. 형질전환된 세포는 암피실린 내성에 대해 선택된다. 이들 세포에 함유된 플라스미드는 Hind Ⅲ, BamHI 및 PSTI 로 절단한 다음, 수산화나트륨-SDS법으로 분석하고 대략 3.6Kbp DNA 밴드로서 수득된 플라스미드를 선택한다. 이러한 방법으로 선택한 플라스미드를 함유하는 숙주 세포는 암피실린 존재하에 배양하고, 박테리아 세포체를 모으고, 융해한 후 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석하고, 분자량이 15000달톤인 PSTI -APH 융합 단백질에 상응하는 밴드를 검색하여 숙주세포에 이 융합 단백질 유전자가 발현된 것을 확인한다. 융합 단백질로부터 인간 PSTI를 얻기 위해서는 메티오닌이 상기한 두 단백질 사이에 삽입되었기 때문에, 인간 PSTI 는 브롬화 시아노겐으로 처리함으로써 쉽게 분리된다. 이 분리에 통상적으로 사용할 수 있는 다른 방법은 두 단백질 사이에 시스테인을 삽입하고 이어서 2-니트로-5-티오시아노벤조산으로 절단한 후, 이 사이에 아스파라긴-글리신을 삽입하고, 히드록실아민으로 후속 절단하고 그 사이에 트립토판을 삽입하고, 2-(2-니트로페닐설페닐)-3-메틸-3-브로모인돌로 후속 절단하고, 그 사이에 리신 또는 알기닌을 삽입하고 트립신으로 후속 절단하고, 그 사이에 이소루이신-글루탐산-글리신-알기닌 서열을 삽입하고 혈액응고인자 Xa로 후속 절단하는 것인데, 인간 PSTI의 아미노산 서열을 고려하여, 이들 여러방법을 적절한 상황하에 사용할 수 있다.

융합 단백질로부터 절단된 인간 PSTI는 겔 여과 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 방법 및 원심분리등을 적절히 조합하는 통상적인 방법으로 정제할 수 있다. 정제된 PSTI의 아미노산 분석에서 생성물의 아미노산 조성이 원래의 인간 PSTI와 완전히 동일한 것으로 확인되었다(실시예1, 표1).

본 발명의 변형된 인간 PSTI를 수득하기 위해서는, 상기한 발현 플라스미드 pUC13-PSTI를 사용하여 PSTI 유전자로 부위-특이적 돌연변이를 유발시킨다. 이와 같은 방법으로, 원하는 변형된 인간 PSTI를 암호화하는 DNA를 함유한 재조합체를 얻는다. 이 부위-특이적 돌연변이는 DNA 합성에 대한 화학적 방법과 DNA 복제의 효소적 반응을 적절히 조합하여 수행한다. 이 방법을 실시하는데 있어서, 먼저 화학적 방법을 사용하여 올리고뉴클레오티드(짧은 DNA 단편)를 합성하여 DNA 서열에서 표적위치의 염기만이 변경되고 나머지 염기는 목적하는 DNA 서열의 염기에 상보적이 되도록 한다. 이들 DNA 단편은 DNA와 짝을 지어 돌연변이를 일으키게 한다(단일가닥 형태로 미리 제조). 그후 이들 단편을 DNA 폴리머라제 작용을 받게 함으로써 변경된 염기 서열을 가진, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드를 함유하고 다른 모든 위치에서 원래의 DNA에 상보적인, DNA가 합성된다. 즉, 원하는 위치에 돌연변이가 유발된 DNA 분자이면 어느것이나 이 방법으로 합성할 수 있다. 상술하면, 상기한 부위-특이적 돌연변이 유발법에 의해 변형된 인간 PSTI를 암호화하는 DNA를 함유한 제조합체를 제조하기 위해서는, 예를 들면, 먼저 pUC13-PSTI를 Hind Ⅲ 및 BamHI와 같은 제한 엔도뉴클리아제로 절단하여 인간 PSTI 및 APH의 융합 유전자를 얻는다. 이것을 M13 파지 벡터 M13mp10에 결찰시켜 재조합체 파지 M13-APH/PSTI를 제조한다. 이와 달리, 자동핵산 합성기를 사용하여 하기의 식(1) 내지 (3)으로 표시한 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 합성한다.

합성된 올리고뉴클레오티드(1) 내지 (3) 각각을 겔 여과, 고성능 액체 크로마토그래피 등과 같은 크로마토그래피적 방법을 적절히 조합하여 정제한다. 이들 정제된 합성 올리고뉴클레오티드는 그후 인산화하고, 상기한 재조합체 M13-APH/PSTI(단일-가닥 형태로 이미 제조한)로 어닐링한다. 이 어닐링된 히브리드 DNA로부터, 이중-가닥 DNA를 클레노프 단편(Klenow enzyme) 및 DNA 리가제를 사용하여 제조하고, 미반응된 단일-가닥 DNA는 니트로셀루로스 여과기 등으로 제거한다. 이와 같은 방법으로 얻은 이중가닥 DNA로부터, 변형된 인간 PSTI(Ser(44)-PSTI, Gln(42)-PSTI 또는 Thr(43)-PSTI)를 암호화하는 DNA를 함유한 재조합체를 제조할 수 있다.

이들 재조합체에 함유된 변형된 PSTI 유전자의 DNA 서열을 측정하기 위해, 디데옥시법을 사용함으로써 원하는 변형된 인간 PSTI에 대한 구조 유전자의 전체 서열이 포함된 것을 확인할 수 있다. 이 방법을 사용하여 본 발명자들은 다음과 같은 DNA 서열(a)-(c)를 성공적으로 수득하였다.

(a) 5' 말단으로부터 125번 위치의 구아닌 잔기가 아데닌으로 치환된 것 이외는, 인간 PSTI를 암호화하는 것과 동일한 DNA 서열(N-말단으로부터 42번째 위치의 알기닌을 글루타민으로 치환함으로써 PSTI로부터 유도된 펩티드 Gln(42)-PSTI에 상응).

(b) 5' 말단으로부터 130번 위치의 시토신 잔기가 아데닌으로 치환된 것 이외는, 인간 PSTI를 암호화하는 것과 동일한 DNA 서열(N-말단으로부터 44번째 위치의 알기닌을 세린으로 치환함으로써 PSTI로부터 유도된 펩티드 Ser(44)-PSTI에 상응).

(c) 5' 말단으로부터 128번 위치의 구아닌 잔기가 시토신으로 치환된 것 이외는, 인간 PSTI를 암호화하는 것과 동일한 DNA 서열(N-말단으로부터 43번째 위치의 리신을 트레오닌으로 치환함으로써 PSTI로부터 유도된 펩티드 Thr(43)-PSTI에 상응).

이들 두 생산물, 즉 Gln(42)-PSTI 및 Ser(44)-PSTI의 염기 서열 및 상응하는 아미노산 서열은 제1도 및 제2도에 각각 표시한 바와 같다.

다음으로, 상기 방법에 의해 수득된 변형된 인간 PSTI를 발현시키기 위해 발현 플라스미드를 제조한다.

이를 달성하기 위해, 먼저 APH 및 변형된 인간 PSTI를 암호화하는 융합 유전자를 함유하는 상기 재조합체를 제한 효소 EcoRI 및 Hind Ⅲ로 처리하여 상기 융합 유전자를 절제한다. 이 DNA 단편을 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동과 같은 방법으로 분리시키고, 적합한 플라스미드 벡터로 삽입한다. 인간 PSTI의 발현 벡터로서 사용된 전술한 플라스미드 어느것이나 본 목적에 사용할 수도 있으며, 여기에서는 pUC13이 특히 적합하다.

변형된 인간 PSTI 및 APH의 융합 단백질은 이 방법으로 제조한 발현 플라스미드를, 변형안된 인간 PSTI를 제조하는데 있어서 언급된 방법에서와 같이, 적절한 미생물 숙주로 도입함으로써 제조될 수 있다. 따라서, 변형된 인간 PSTI 단백질이 융합 단백질 형태로 발현되기 때문에, 숙주 미생물에 의해 생산되는 단백질 분해효소에 의한 소화는 피한다.

상기 방법으로 수득한 융합 단백질은 상술한 적절한 방법중 한 방법에 의해 절단하여 변형된 인간 PSTI를 생산한다. 이와 같이 수득한 변형된 인간 PSTI(Ser)-(44)-PSTI, Thr(43)-PSTI 및 Gln(42)-PSTI)의 아미노산 분석에서는 이들 각 생산물내의 각각의 아미노산 잔기의 수가 예상했던 바와 같이 원래의 PSTI와 상이함을 나타내었다(실시예 2, 표 2)

변형된 인간 PSTI의 각 변종의 트립신-저해 활성을 조사한 결과, 원래의 인간 PSTI의 경우에 나타나는 일시적인 트립신 저해는 감소되었으며, 실제로, 트립신에 대한 저해 효과의 지속은 원래의 인간 PSTI의 경우와 비교해 볼때, 장기간 지속되었다(실시예 2, 제3도 및 제4도). 이것으로 본 발명이 우수한 특성을 지닌 변형된 인간 PSTI를 제공하는 것이 입증되었다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조함으로써 그 목적과 이점을 더욱 잘 이해할 수 있을 것이다.

다음 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 이를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1

원래의 인간 PSTI를 암호화하는 DNA의 제조 및 발현

야마모토 등[Biochem. Biophys. Res. Commun., 132, 605, (1985)]에 의해 확정된 원래의 인간 PSTI의 DNA 서열을 가정했다. 인간 PSTI의 이 숙성 단백질을 암호화하는 구조 유전자의 DNA 서열을 합성하고, 메티오닌 코돈 ATG를 이 서열의 5' 말단에 결찰시키고, 말단 코돈 TAG를 3' 말단에 결찰시켰다. 그후, 이 개시 및 정지 코돈을 가진 DNA 서열을, 얻어지는 서열이 5'a 말단에 제한효소 Accl에 대한 인식부위와 3' 말단에 제한효소 BamHI에 대한 인식부위를 지닐 수 있도록 염기 서열을 부가하여 증가시키는데, 이때 염기 길이 179 및 181의 단일가닥을 가진 이중가닥 분자가 형성되도록 구성시켰다.

상기 DNA 단편을 제조하기 위해, 본 발명자들은 다음 두 그룹, 즉 적절한 순서로 결찰할 경우, 인간 PSTI의 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 포함한 DNA 체인( U-1 내지 U-10, 제7도)을 형성하는 한 그룹과, 적절하게 결찰된 경우, 이 DNA 체인(L-1 내지 L-10, 제7도)에 대한 상보적 서열을 형성하는 또 하나의 그룹으로 이루어진 20개의 단쇄 DNA 단편을 화학적으로 합성하였다. 이들 단편들은 모두 변형물을 함께 혼합할 경우, 수소결합에 의해 연결되고 상술한 바와 같이 제한 엔도뉴클리아제에 대한 인식부위를 구성하는 점착성 말단이 있는 상호 상보적 단편들을 가진 이중가닥 구조를 형성할 수 있다(제7도).

자동핵산 합성기(GENE TOA-Ⅱ, Nippon Zeon Co. 제품)를 사용하여 상기한 20종의 단쇄 DNA 단편(U-1 내지 U-10 및 L-1 내지 L-10)을 제조하였다. 이와 같이 얻은 각 단편들을 세파덱스 G-50을 사용하는 겔 크로마토그래피와 실리카겔 컬럼(Nucleosil 10C18, 10㎛, 10×250mm)을 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제한다.

이 방법으로 합성한 20개의 올리고뉴클레오티드는 5' 말단에 인산염 그룹을 함유하지 않기 때문에, 이들은 T4 DNA 리가제에 의해서는 이들이 존재하는 그 자체로 결합할 수 없다. 따라서, 효소적 부가반응을 이용하여, 인산염 그룹을 이들 합성 올리고뉴클레오티드 20 변형물 중 U-1 및 L-10을 제외하고는 18개의 5' 말단에 부착시켰다. 이 인산화 반응은 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(Takara Shuzo Co. 제품)로 수행하였다. 각 올리고뉴클레오티드 대략 300pmol을 키나제 반응용액(50mM 트리스 염산염 완충액, 10mM 염화마그네슘, 10mM 2-머캅토에탄올, 약 1000pmol ATP, pH 7.6) 25㎕에 용해한 다음, T4 폴리뉴클레오티드 키나제 3단위로 이 용액을 가하여 반응을 개시하고, 37℃에서 1시간 동안 유지시켰다. 그후, T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 불활성화 하기 위해, 65℃에서 20분간 반응액을 열처리한 후, 용액을 결찰화 반응에 직접 사용하였다. 인산화 합성 올리고뉴클레오티드 U-2 내지 U-10 및 L-1 내지 L-9 18 변형물 및 비인산화 합성 올리고뉴클레오티드 U-1 및 L-10 각 50pmol을 혼합하여 결찰을 위한 반응액을 제조한 후, 먼저 80℃에서 2분간 열처리하고, 서서히 20℃까지 냉각시켰다. 그후, 디티오트레이톨, STP 및 T4 DNA 리가제를 가하고, 4℃에서 5일간 결찰반응을 수행하였다. 이 결찰반응액(200㎕)의 최종 조성분은 66mM 트리스 염산염 완충액, 66mM 염화마그네슘, 10mM 디티오트레이톨, 1mM ATP 및 700단위 T4 DNA 리가제(Takara Shuzo Co.)이었다. 이들 조작은 기본적으로 문헌(Nucleic Acids Res. 13, 2959(1985)]에 기술한 방법에 따라 실시하였다. 결찰반응 후, 페놀 추출 및 에탄올 침전을 통상의 방법으로 수행하고, 약 180 염기쌍을 가진 원하는 DNA 단편을 트리스 붕산염 완충액을 사용하여 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 겔 상에 분획화된 DNA를 브롬화 에티디움으로 착색한 다음, DEAE 막(Schlleicher and Schuell Co.)을 표적 DNA 밴드 부근의 겔에 삽입하였다. 다음에 DEAE 막에 DNA 밴드를 전기영동적으로 흡착시켜 상기 DNA를 회수하였다. DEAE 막으로 DNA 밴드가 완전히 이동하면, 0.1M 염화나트룸, 10mM 트리스 염산염 완충액(pH 8.0) 및 1.0mM EDTA를 함유한 용액을 사용하여 상기 막으로부터 DNA를 용출시키고, 에탄올 침전에 의해 용출물로부터 회수하였다. 여기에서 사용된 방법은 일반적인 방법이며, 이 방법은 예를 들면, 문헌["Molecular Cloning"(Cold Spring Harbor Laboratory New York, 250-251, 1982)]에 상세히 기술되어 있다.

DNA 서열화를 위해서, 회수된 DNA 단편들을 M13 파지 벡터에 삽입하였다. 이를 달성하기 위해, 먼저 M13mp10 파지 벡터(Takara Shuzo Co.)를 제한효소 AccI 및 BamHI로 절단하여 선상 체인을 형성시킨 다음, T4 DNA 리가제를 사용하여, 이것을 상기에서 회수한 DNA 단편에 결합시켰다. 반응온도 및 시간을 각기 12℃ 및 16시간으로 하는 것 이외는, 합성 올리고뉴클레오티드를 결찰시키기 위해 상기에서 수행한 바와 동일한 조건하에 결찰반응을 수행하였다. 결찰후, 처리된 DNA는 문헌["Molecular Cloning"(Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 250-251, 1982)]에 기술된 방법에 따라 E. Coli 숙주의 형질전환에 사용하였다.

0℃에서 염화칼슘으로 처리하여 로그성장상의 E. Coli K-12주 JM103의 배양물로부터 얻은 DNA 수용체 박테리아를 상술한 반응에 의해 결찰된 DNA와 혼합하고, 혼합물을 얼음중에서 배양시키고, 42℃에서 2분간 열처리하여 형질전환을 일으켰다. M13mp10 파지로 트랜스팩트된 E. Coli 세포를 다음 방법에 의해 플라크로서 검색한 바, 먼저 JM103 박테리아를 100mM 이소프로필-β-D-티오갈락토시드 20㎕, 2% 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토시드 50㎕, 로그 성장상내의 JM103 현탁액 0.2ml 및 소프트아가(0.6% 액체아가) 3ml의 혼합물에 가하고, 이것을 1.5% 아가플레이트로 부었다. 여기에서 사용된 아가는 TY 배양배지(트립톤 8g, 이스트 추출물 5g 및 염화나트륨 5g을 물 1ℓ에 용해함)를 함유한 것이다. 37℃에서 하룻밤 배양후, 형질전환된 박테리아는 플라크를 형성하였다. 원하는 DNA 단편이 삽입된 M13mp10 파지에 의해 형질전환된 박테리아(이하, M13-PSTI라 칭함)는 무색 플라크를 형성하는데 비해, 원하는 DNA 삽입물이 없이 M13mp10으로 형질전환된 박테리아는 청색플라크를 형성하였다.

단일 가닥 파지 DNA는 메싱[Messing, Methods Enzymol. 101, 20-29(1983)]의 방법에 따라, 상기한 무색 플라크로부터 다음과 같은 과정으로 제조하였다. 하룻밤 동안 배양한 E. Coli K-12주 JM103을 함유한 배양액 1ml를 2xTY 배지(박토트립톤 16g, 이스트 추출물 10g, 염화나트륨 5g을 물 1ℓ에 용해함) 100ml에 넣고, 37℃에서 2시간 동안 진탕 배양하였다. 이 배양액을 5ml 분취액으로 나누고, 플라크가 형성된 아가를 모세관 피펫으로 취하여 상기 배양액에 접종하였다. 그후, 배양액을 37℃에서 5시간 동안 더 배양하여 M13-PSTI 및 파지의 방출에 의한 감염을 배지에 유발시켰다. 배양액중의 미감염 박테리아 세포는 이중가닥 DNA 의 제조에 사용되고, 박테리아 세포가 제거된 배지의 상등액은 단일가닥 파지 DNA의 제조에 사용하였다.

20% 폴리에틸렌글리콜을 함유하는 2.5M 염화나트륨용액 800㎕를 배지의 상등액 4ml에 가하고, 파지를 원심분리에 의해 모았다. 이 파지를 10mM 트리스염산 완충액(pH 8.0) 및 1mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)으로 이루어진 용액 500㎕에 용해한 후, 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 단일가닥 DNA를 회수하였다. 통상의 수산화나트륨-도데실 황산나트륨(SDS)법[Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523(1979)]에 따라 다음과 같은 과정을 거쳐 파지-감염된 박테리아로부터 복제 가능한 이중가닥 원형 DNA를 제조하였다. 먼저, 배양액 5ml로부터 수득한 박테리아 세포를 25mM 트리스 염산염 (pH 8.0, 50mM 글루코스, 10mM EDTA 및 4mg/ml 리소자임을 함유함) 100㎕에 현탁시킨 다음, 실온에서 5분간 방치하였다. 여기에 1% SDS 함유 0.2M 수산화나트륨 용액 200㎕를 가하고, 온화하게 혼합한 후, 현탁액을 5분간 얼음내에 방치해 두었다. 그후, 5M 칼륨 아세테이트 용액(pH 5.2) 150㎕를 가하고, 혼합한 후, 현탁액을 얼음에 적어도 5분간 다시 방치하였다. 원심분리 후, 상등액 1용적에 에탄올 2용적을 가하고 침전물을 회수하였다. 이 침전물을 70% 에탄올로 세정하고, 다시 원심분리하여 회수하였다. 이와 같이 하여 복제 가능한 이중가닥 DNA를 무색 플라크로부터 제조하였다. 이 DNA를 Acc I 및 BamH I 에의해 2 부위에서 절단하고, 대략 180 염기쌍을 가진 DNA 단편이 형성된 것을 확인하였다. 동일 플라크로부터 제조한 단일 가닥 파지 DNA를 디데옥시법으로 염기 서열 결정에 사용했다[Science 214, 1205-1210(1981)]. 염기 서열결정은 M13 시

싱키트(Takara Shuzo Co.)로 실시하였다. 이와 같이 하여 수득한 클로운된 DNA는 원하는 PSTI에 대한 완전 구조 유전자를 포함하는 것이 확인되었다. 염기 서열의 확인 후, 복제 가능한 이중가닥 DNA를 다음과 같이, PSTI 발현 플라스미드의 제조에 사용하였다.

PSTI 발현 플라스미드는 다음 세 단편을 결합하여 제조하였다.

(1)상기한 합성 올리고뉴클레오티드의 결찰반응에 의해 수득한 확인된 염기서열을 가지는 대략 180bp의 Acc I-BamH I 단편,

(2)HindⅢ 및 BamH I에 의한 pUC13(Takara Shuzo Co.)의 절단에 의해 얻은 대략 2.8Kbp DNA 단편,

(3)pNEO(Tn5의 APH 유전자 함유; Pharmacia Co.)를 HindⅢ로 소화시키고, 이어서 Taq Ⅰ(제6도의 -350 위치에서 246 위치까지의 DNA 서열에 상응 ; 제8도 참조)로 소화하여 얻는 대략 600bp DNA 단편.

이들중 DNA 단편 1) 및 3)을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하고 DEAE 막을 사용하여 회수한 후, 후속 결찰 반응에 사용하였다. 상기한 단편 2)는 두 특정 부위에서 절단된 것을 확인한 후, 페놀추출 및 에탄올 침전에 의해 회수하고 결찰반응에 사용하였다. 이들 세단편의 결찰에 의해 얻은 PSTI 발현 플라스미드(pUC13-PSTI)는 트랜스포손 Tn5 내에서 암호화하는 APH의 아미노 말단으로부터 하류의 82번째 잔기부위에 결합된 PSTI로 구성된 융합단백질을 발현한다. 상술한 경우에서와 같이, T4 DNA 리가제를 이들 세 단편의 결찰에 사용하였다. 결찰반응에 의해 수득된 DNA는 상기한 문헌("Molecular Cloning")에 기술된 방법에 따라 형질 전환하는데 사용하였다. 형질 전환은 DNA 수용체로서 사용된 E. Coli K-12주 C600 또는 AG-1을 사용하여 수행하였다. 형질 전환된 박테리아는 암피실린 내성이 얻어지므로, 암피실린 함유 아가 플레이트상에서의 콜로니 형성에 대한 표현적 선별을 실시했다(LB 배지, 트립톤 10g, 이스트 추출물 5g 및 염화나트륨 5g을 물 1ℓ에 용해하여 사용). 백금 루프를 사용하여 형성된 12개의 콜로니를 40㎍/ml 암피실린을 함유시킨 LB 배지 5ml에 이식하고 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 그후, 박테리아를 원심분리에 의해 모으고, 상술한 수산화나트륨-SDS법에 의해 플라스미드를 분석하였다. 표적 플라스미드(pUC13-PSTI)는 각 제한효소 HindⅢ, BamH I 및 PSTI에 하나의 인식부위를 함유하기 때문에, 이 플라스미드는 이들 각 효소를 사용하여 소화시킴에 따라 형성하는 대략 3.6Kb DNA 밴드로써 검색할 수 있다.

원하는 플라스미드를 함유하는 것으로 확인된 콜로니를 LB 배지(40㎍/ml 암피실린 함유)에서 배양하고 50% 글리세롤 존재하에 -70℃에서 보존하였다. 그 후, 이 박테리아 저장액 10μl를 암피실린을 함유한 LB 배지 5ml에 가하고 37℃에서 8시간 동안 배양시켰다. 이 배양액 100㎕를 암피실린을 함유한 M9 배지 5ml에 가하고 (M9 배지는 인산수소이나트륨 6g, 인산이수소칼륨 3g, 염화나트륨 0.5g 및 염화암모늄 1g을 물 1ℓ에 용해하고, 멸균후, 황산마그네슘 및 염화칼슘을 최종 농도가 각기 2mM 및 0.1mM이 되는 양으로 가하여 제조하는데, 이밖에도 이 배지는 40㎍/ml의 암피실린, 0.5% 글루코스 및 0.5% 카스아미노산이 함유됨), 37℃에서 24시간 동안 배양시켰다. 배양을 마친후, 박테리아를 원심분리하여 모으고, 다음의 분석과정에 사용하였다.

소량의 박테리아를 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분석용 시료로서 채취하였다. 박테리아 단백질은 0.1M 트리스 염산염 완충액(pH 6.8), 1% SDS, 1% 2-머캅토에탄올 및 20% 글리세롤로 이루어진 액체에 용해하고, 추출한 후 겔 전기영동 분석을 하였다. PSTI를 함유한 융합단백질은 예상된 분자량 15,000에 상응하는 위치에서 주밴드로서 나타났으며, 이로써 이들 형질 전환된 E.Coli에 융합 단백질이 발현된 것이 확인되었다. 이 밖에도, 이들 형질 전환된 E.Coli의 시료를 초음파와 같은 방법으로 용균시키고, 박테리아에 함유된 단백질을 원심분리에 의해 가용성 및 불용성 분획물로부터 분리하여 이들 분획물을 SDS-PAGE 분석한 결과, 상기 융합 단백질은 주로 불용성 단백질 분획중에 존재하는 것이 나타났다.

그후, 이들 박테리아를 0.1M 트리스 염산염 용액(pH 7.0, 5mM EDTA 함유) 20ml에 현탁시키고, 12000×g에서 10분간 원심분리한다. 동일한 조작을 반복한 후, 박테리아를 다시 0.1M 트리스 염산염 용액(pH 7.0, 5mM EDTA, 50mM 벤즈아미딘 및 1mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)에 현탁시키고, 프렌치 프레스를 사용하여 400kg/㎠의 압력하에 3회 압착한 다음, 23,000×g에서의 20분간의 원심분리에 의해 수득한 펠렛 1.05g을 0.1M 인산나트륨(pH 7.0, 20mM 디티오트레이톨(DTT) 및 단백질 변성화제 함유)10ml에 용해하고, 이것은 세파크릴 S-200 컬럼(2.6×79cm)상에서 겔 여과를 한 다음, 0.1M 트리스 염산염(pH 7.2, 1mM DTT 및 7M 요소함유)으로 용출시켰다. 분자량 대얄 17,000 달톤의 분획을 모으고 증류수에 대해 투석하고 동결 건조하였다. 이 동결 건조물에 브롬화 시아노겐 160mg을 함유한 70% 포름산 용액 2ml를 가하고, 혼합물을 실온에서 6시간 동안 반응하도록 방치하였다. 증류수 18ml를 여기에 가하고, 시료를 다시 동결 건조시켰다. 얻어진 동결건조물을 0.5M 트리스 염산염(pH 8.1, 2mM EDTA 및 6M 구아니딘 염산염 함유) 2ml에 용해하고 2-머캅토에탄올 100㎕를 가하였다. 질소기류하에 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 후, 혼합물을 증류수에 대해 투석하였다. 시료를 10,000×g에서 1분간 원심분리하고, 얻어진 상등액 6ml에 염화나트륨 172mg 및 1M 트리스 염산염(pH 8.0) 320㎕를 가한다음, 시료를 소 트립신-CH-세파로스 4B를 넣은 친화성 컬러(2×3cm)에 흡착시켰다. 이 컬럼을 0.5M 염화나트륨을 함유한 0.05M 트리스 염산염(pH 8.0) 및 증류수로 연속하여 세척하고, PSTI를 10mM 염산으로 용출시킨 후, 이어서 동결건조하여 정제된 물질 1.55mg을 얻었다.

그후, 수득한 인간 PSTI 12㎍을 시험관(10×90mm)에 넣고, 4M 메탄설폰산(3-(2-아미노에틸)인돌 0.2% 함유) 50㎕를 가하고, 시료를 감압하에 110℃ 내에서 24시간 동안 가수분해 하였다. 이 가수분해물을 히다찌 모델 835 아미노산 분석기를 사용하여 아미노산 분석을 한다. 얻어진 결과는 표 1과 같다. 이 분석에서 상술한 방법으로 수득한 PSTI의 아미노산 조성은 천연 PSTI(이론치)와 완전히 일치하였다. 또한, 에드만 법(lwanaga 등의 방법을 변형, Eur. J. Biochem, 8, 189-199,1969)에 의해 N-말단의 3개의 잔기의 아미노산 서열을 조사한 결과, 이것은 Asp-Ser-Leu, 즉 원래의 인간 PSTI와 동일한 서열을 가진 것으로 나타났다. 또한, 본 발명에 의해 수득한 인간 PSTI는 화학량론 몰비 1:1로 소의 트립신을 억제하고, 원래의 인간 PSTI에 대해 만들어진 항체(토끼의 항혈청 폴리클로날 항체)와의 면역반응에서는 원래의 인간 PSTI의 경우에서 관찰된 것과 동일한 결과가 나타났다(예를 들면 희석곡선의 작용은 원래의 인간 PSTI와 동일하였다).

[표 1]

실시예 2

변형된 인간 PSTI를 암호화하는 DNA 서열의 제조:

에스케리키아 콜리에 의한 상기 변형된 인간 PSTI의 발현 및 이의 정제

1. Ser(44)-PSTI의 제조

이 변형된 인간 PSTI(Ser(44)-PSTI)의 제조는 템플레이트로서, APH와 PSTI의 융합 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 단일가닥 재조합 M13-APH/PSTI를 제조한 다음, 여기에 프라이머로서 후술하는 합성 DNA 올리고머를 사용하여 부위-특이적 돌연변이를 유발시킴으로써 수행되었다. 이들 조작은 아머샴의 올리고뉴클레오티드-디렉티드 시험관내 돌연변이 유발계에 대한 매뉴얼에 기재된 방법에 따라 실시하였다.

a) APH와 PSTI의 융합 단백질에 대한 암호유전자를 함유하는 단일가닥 DNA의 제조

실시예 1에 기술한 방법으로 수득한 PSTI 발현 플라스미드 pUC13-PSTI로 형질 전환시킨 E. Coli의 배양물을 함유한 액상 LB 배지 5ml를 원심분리하여 박테리아를 모으고, 상기 플라스미드를 수산화나트륨-SDS법으로 회수하였다. 이들 pUC13-PSTI 플라스미드를 10mM 트리스 염산염(pH 8.0, 1mM EDTA 함유) 20㎕에 용해하고, 제한효소 HindⅢ 및 BamH I와 37℃에서 1.5시간 동안 반응시켜 절단하였다. 얻어진 DNA 단편을 아가로스 전기영동에 의해 분리하고 DEAE막을 사용하여 회수하였다. T4 DNA 리가제를 사용하여, 이들 DNA 단편을 Hind Ⅲ 및 BamHI로 절단한 파지 M13mp10에 연결시켜 APH-PSTI융합 단백질을 암호하는 DNA를 수반한 재조합체(M13-APH/PSTI )를 제조하였다. 이 재조합체를 사용하여 0℃에서 처리후, 42℃에서 열처리 기간을 1.5분으로 하는 것 이외는, 상기 실시예1에서와 동일한 조건하에 E. Coli K-12주 JM103 세포를 형질 전환시켰다. M13-APH/PSTI가 도입된 JM103 박테리아를 실시예 1에서와 같은 방법으로 37℃에서 아가 플레이트 상에서 하룻밤 배양시키고, 이 배양액 2ml를 사용하여, 무색 플라크가 형성된 박테리아로부터 단일 가닥 DNA를 제조하였다.

b)프라이머의 합성

다음 염기서열(1)로 표시되는 DNA 단편을 부위-특이적 돌연변이 유발의 프라이머로서 사용하기 위해 GENETA-Ⅱ 자동핵산 합성기(Nippon Zeon Co.)로 합성하였다. 이 DNA 단편은 원래의 인간 PSTI 의 44 위치의 알기닌이 세린으로 치환된, 변형 인간 PSTI의 잔기 41번째에서 46번째의 아미노산 서열을 암호하는 서열을 포함한다.

얻어진 DNA 단편은 세파덱스 G-50을 사용하는 겔 크로마토그래피와 실리카 겔을 사용하는 역상 고성능 크로마토그래피(Nucleosil C18 ; 10㎛, 10×250mm)에 의해 정제하였다.

c)생체내 부위-특이적 돌연변이 유발

먼저, 상기 b)에서 정제한 DNA 단편(1)200pmol을 100mM 트리스 염산염 완충액(pH 7.6, 10mM 염화마그네슘, 10mM DTT 및 0.5mM ATP 함유)에 용해하고, T4 폴리뉴클레오티드 키나제(PL biochemical)10단위와 37℃에서 1시간 반응시켜 인산화하였다. 그후, T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 65℃에서 10분간 열처리하여 불활성화시킨 다음, 5배 희석한 완충액 1(Amersham) 17㎕중에, 이 인산화된 DNA 단편 5pmol을 상기 a)에서 수득한 단일가닥 재조합체(M13-APH/PSTI ) 1.5pmol과 어닐링 시켰다. 이 반응은 70℃에서 10분간 가열하고, 37℃에서 30분간 배양함으로써 수행되었다. 이 어닐링된 혼합물 17㎕에 100mM 염화 마그네슘 5㎕, 완충액 1(Amersham)을 혼합한 뉴클레오티드 19㎕, 물 6㎕, DNA 폴리머라제 I-클레노프 단편(3.8 단위/㎕) 1.6㎕ 및 T4 DNA 리가제(2.5단위/㎕) 2.4㎕를 가한 다음, 이 혼합물을 하룻밤(19521시간) 16℃에서 반응하도록 방치하여 이중가닥 DNA를 합성하였다. 이중가닥으로 전환되지 않은, 이 혼합물에 잔류한 단일가닥 DNA는 니트로셀룰로스 여과기로써 제거하였다. 그후, 3M 암모늄 아세테이트 0.1 용적과 에탄올 2.5 용적을 이중가닥 DNA를 함유한 용액에 가하고 침전된 DNA를 완충액 2(Amersham) 25㎕에 용해하고, 이 용액 10㎕에 완충액 3(Amersham) 65㎕ 및 제한효소 Nci I (8 단위/㎕) 0.7㎕를 가하고, 혼합물을 37℃에서 90분간 반응하도록 방치하였다. 그후, 이 반응혼합물 65.7㎕에 500mM 염화나트륨 12㎕, 완충액 4(Amersham) 10㎕ 및 엑소뉴클레아제 Ⅲ(25 단위/㎕) 2㎕를 가하고, 혼합물을 37℃에서 28분간 반응하도록 방치한 다음, 70℃에서 15분간 열처리하여 효소 반응을 종결시켰다. 다음에, 100mM 염화 마그네슘 5㎕, 뉴클레오티드 믹스 213㎕, DNA 포리머라제 I (3.5 단위/㎕) 0.86㎕ 및 T4 DNA 리가아제 0.8㎕를 가하고 반응을 16℃에서 4시간 수행하였다. 이와 같이 하여 Ser(44)-PSTI에 대한 유전자를 함유하는 이중가닥 DNA를 제조하여 다음 형질 전환에 사용하였다.

로그 성장단계의 E. Coli K-12주 JM103의 배양액을 0℃에서 염화칼슘 처리로 얻은 DNA 수용체를 상기한 Ser(44)-PSTI 유전자를 수반한 이중가닥 DNA와 혼합하였다. 이 혼합물을 0℃에서 20분간 배양하고, 42℃에서 1.5분간 열처리하여 박테리아의 형질 전환을 일으켰다.

상기한 DNA가 도입된 JM103 박테리아를 아가 플레이트 상에서 배양하고, 상기 실시예 1에 기술한 바와 같은 방법으로 무색콜로니를 생성한 박테리아로부터 단일 가닥 DNA를 제조하였다. 파지-감염된 박테리아로부터 복제 가능한 이중가닥 원형 DNA를 제조하는 것은 실시예 1에서와 같은 방법으로 수산화나트륨-SDS법에 의해 수행하였다. 즉, 배양액 4ml로부터 얻은 박테리아를 25mM 트리스 염산염(pH 8.0, 50mM 글루코스, 10mM EDTA 및 4mg/ml 리소자임 함유) 100㎕에 현탁시키고, 이 시료를 실온에서 5분간 방치하였다. 그후, 1% SDS를 함유한 0.2M 수산화나트륨 200ml를 가하고, 온화하게 혼합한 후, 시료를 얼음내에서 5분간 방치하였다. 그후 5M 칼륨 아세테이트 용액(pH 5.2) 150ml를 가하고, 혼합한 후, 시료를 얼음내에서 적어도 10분간 방치하였다. 원심분리 후, 복제가능한 이중가닥 DNA를 페놀 추출에 이어 에탄올 침전에 의해 상등액으로부터 회수하였다. 동일 플라크로부터 제조한 단일가닥 파지 DNA는 상기 실시예 1에 기재한 방법으로 디데옥시법으로 DNA 염기 서열결정을 하였다. 이 서열결정 결과로 본 방법에 의해 수득한 클로운이 원하는 변형된 PSTI(Ser(44)-PSTI)에 대한 구조 유전자의 완전한 염기서열을 함유한다는 것이 확인되었다. 이 방법에서 염기서열이 확인된, 복제 가능한 이중가닥 DNA는 다음 발현 플라스미드를 제조하는데 사용하였다.

d)발현 플라스미드의 제조

상기 c)에서 수득한 복제 가능한 이중가닥 DNA 약 3.5㎍을 제한 엔도뉴클리아제 EcoR I 및 HindⅢ으로 절단하고 EcoR I / HindⅢ 단편을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하고 DEAE 막으로 회수하였다. T4 리가제를 사용하여, 이 DNA 단편(원하는 APH/Ser(44)-PSTI 융합단백질을 암호화하는 유전자 약 700bp 함유)을 EcoR I 및 HindⅢ으로 절단한 플라스미드 pUC13(Takara Shuzo Co.)와 결찰시켜서, 발현 플라스미드 pUC13(Ser(44)-PSTI )를 제조하였다. 이 플라스미드를 사용하여, 상기 문헌("Molecular Cloning")에 기재된 방법으로 E. Coli 수용체를 형질 전환시켰다.

e) Ser(44)-PSTI 의 발현

DNA 수용체로서 E. Coli k-12주 C600 또는 AG-1을 사용하여 형질 전환을 실시하였다. 형질 전환된 박테리아는 암피실린 내성을 갖기 때문에 암피실린 함유 아가 플레이트(LB 배지사용, 트립톤 10g, 이스트 추출물 5g 및 염화나트륨 5g을 물 1ℓ에 용해)상에서 콜로니의 형성으로 표현적 선별을 하였다. 멸균한 대꼬치를 사용하여 형성된 콜로니 8개를 100㎍/ml 암피실린 함유 LB 배지 5ml에 이식하고 37℃에서 18시간 배양하였다. 그후 박테리아를 원심 분리하여 모으고, 플라스미드를 상기 c)에 기술된 방법으로 회수하였다.

원하는 플라스미드 pUC13(Ser(44)-PSTI )을 함유하는 것으로 확인된 클로운을 50% 글리세롤 존재하에 -70℃에서 보관하였다. 이 박테리아 저장액 0.1ml를 100g/ml 암피실린을 함유한 LB 배지 100ml에 가하고 이 배양물을 37℃에서 하룻밤 배양시켰다. 다음에 이 배양물 37.5ml를 100㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지 1.5ℓ에 가하고 37℃에서 하룻밤 다시 배양시켰다. 이 배양이 완결된 후, 박테리아를 원심 분리하여 모으고 -20℃에서 저장하였다.

f) Ser(44)-PSTI 의 정제

상기 d)에서 수득한 박테리아 2.2g을 0.1M 트리스 염산염(pH 7.0, 5mM EDTA 함유) 10ml에 현탁시키고, 현탁액을 12,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 동일한 조작을 반복한 후, 박테리아를 0.1M 트리스 염산염(pH 7.0, 50mM 벤즈아미딘 및 1mM PMSF 함유) 10ml에 현탁시키고, 이 현탁액을 프렌치 프레스를 사용하여 400kg/㎠의 압력하에 3번 압착하였다. 그후 이 시료를 23,00×g에서 30분간 원심분리하여 얻은 펠릿 0.44g을 0.1M 인산나트륨(pH 7.0, 8M 구아니딘 염산염 및 20mM DTT 함유) 10ml에 용해하고, 이것을 세파크릴 S-200 컬럼(2.6×79cm)으로 겔 여과하고 0.1M 트리스 염산염(pH 7.2 1mM DTT 및 7M 요소함유)으로 용출시켰다. 원하는 APH/PSTI 융합 단백질에 상응하는 분자량 대략 17,000달톤(35ml)의 획분을 모으고 이 획분 20ml를 증류수에 대해 투석하고, 동결 건조시켰다. 이 동결 건조물을 70% 포름산 0.3ml에 용해한 후, 브롬화 시아노겐(200㎍/ml) 200㎕를 가하고 혼합물을 실온에서 6시간 반응하도록 방치하였다. 그후, 증류수를 용적으로 10배(18ml) 가하고 이 혼합물을 동결 건조하였다. 얻은 동결 건조물을 0.05 M 트리스 염산염(pH 8.0, 0.5M 염화나트륨 함유) 2ml에 용해하고, 10,000×g에서 1분간 원심분리한 다음, 이 상등액을 소 트립신-CH-세파로스 4B를 충전한 친화성 컬럼(1×3cm)에 흡착시켰다. 이 컬럼을 0.05M 트리스 염산염(pH 8.0) 및 증류수로 연속하여 세척한 후, 변형된 PSTI를 12mM 염산으로 용출시키고 동결 건조하여 정제된 물질 415㎍을 수득하였다.

2. Gln(42)- PSTI 및 THR(43)- PSTI의 제조

Gln(42)- PSTI 및 THR(43)- PSTI를 프라이머로서 각기 다음 일반식(2) 및 (3)에 기술된 합성 DNA 올리고머를 사용하여 Ser(44)- PSTI의 제조에서 사용된 방법과 유사하게 제조하였다.

3. 변형된 인간 PSTI의 세변형물 각각의 특성

a)아미노산 조성

상술한 변형된 각각의 인간 PSTI(Ser(44)- PSTI, Gln(42)- PSTI 및 THR(43)- PSTI) 약 10㎍을 시험관(10×90mm)에 넣고 여기에 4M 메탄설폰산(3-(2-아미노에틸)인돌 0.2% 함유) 50㎕를 가한 다음, 이 혼합물을 110℃에서 24시간 동안 감압하에 가수분해 하였다. 이 시료를 히다찌 모델 835 아미노산 분석기를 사용하여 아미노산 분석을 하였다. 각각의 변형된 PSTI의 아미노산 조성과 원래의 인간 PSTI의 이론치를 표 2에 표시하였다. 이 표에서 보는 바와 같이, 변형된 인간 PSTI의 각 세변형물의 각 아미노산 잔기의 수는 이론적으로 예상되는 바와 같이 원래의 인간 PSTI의 아미노산 잔기의 수와 상이하였다. 따라서 변형된 인간 PSTI의 원하는 변형물은 상술한 방법에 의해 얻어진다는 것이 확인되었다.

[표 2]

b)변형된 PSTI의 트립신 저해작용

변형된 PSTI의 각 변형물의 저해작용을 조사한 결과, PSTI 각 변형물은 인간 트립신을 화학량론량 몰비 1:1로 저해하는 것으로 나타났다. 다음에, 저해 효과의 일과성을 각각의 변형된 PSTI에 대해 조사하였다. 여기에서 사용된 일과성이란 말은 PSTI가 처음으로 인간 트립신을 억제하나, 시간이 경과함에 따라 트립신 작용이 회복되어 PSTI가 불활성화하는 것을 의미한다. 이 현상은 원래의 PSTI의 경우에 발생되는 것으로 알려져 있다.

먼저, 인간 트립신 1nmol을 37℃에서 0.1M 트리스 염산염(pH 7.0 또는 8.0, 20mM 염화칼슘 및 0.004% 트리톤 X-100 함유) 200㎕중에서 2nmol의 원래의 인간 PSTI 또는 상술한 방법에 의해 수득한 변형된 PSTI 세변형물 중 하나와 함께 배양하였다. 소정 시간에서 혼합물의 20㎕ 분취액을 취하여 0.5M 트리스 염산염(pH 8.0) 150㎕, 5nM 베조일-L-알기닌 p-니트로아닐리드 200㎕ 및 증류수 500㎕를 함유한 시험관에 넣고, 37℃에서 5분간 배양한 후, 30% 아세트산 500㎕를 가하여 반응을 종결시키고 410nm에서 흡광도를 측정하여 트립신-저해 작용을 계산하였다. pH 7.0 및 pH 8.0의 경우에서의 실험결과를 각기 제 3도 및 제4도에 표시하였다.

pH 7.0 및 pH 8.0의 경우를 나타낸 제3도 및 제4도에서 명백히 알 수 있는 바와 같이, 일시적인 억제 효과는 원래의 인간 PSTI와 비교하여, 42번째 위치에서 Arg이 Gln으로 치환된, Gln(42)- PSTI와 44번째 위치에서 Arg이 Sere로 치환된, Ser(44)- PSTI 모두에서 현저하게 감소하였다. 따라서, 트립신 저해제로서의 작용의 지속성은 이들의 치환에 의해 실제로 향상되었다. 특히, pH 7.0에서 Gln(42)- PSTI는 반응 개시후 24시간까지 트립신-저해 작용을 유지하였다. 이와 반대로, 43번째 위치에서 Lys이 Thr으로 치환된, Thr(43)- PSTI는 pH 7.0에서 원래의 인간 PSTI와 동일한 저해 일과성을 나타내는데 비해, pH 8.0에서 이 변형된 PSTI는 원래의 형태보다 트립신-저해 효과의 지속성이 더 낮았다.

따라서, 본 발명은 원래의 인간 PSTI와 비교하여 트립신과 같은 단백분해 효소에 의한 분해에 대해 민감성이 감소된, 탁월한 안정성을 지닌 변형된 각종의 인간 PSTI를 암화화하는 DNA 서열과 이 DNA 서열의 발현에 의해 수득된 변형된 각종의 인간 PSTI를 제공하는 것이다. 이들 변형된 각종의 인간 PSTI는 재조합 DNA 기술에 의해 생산하기 때문에, 저렴한 비용으로 이들 물질을 대량 생산할 수 있다. 더욱이, 이들 물질의 아미노산 서열이 단지 한 위치만 원래의 인간 PSTI의 서열과 상이하기 때문에, 이들 물질의 임상적 적용에서, 소의 생산물 BPTI과 현재까지 트립신 저해제로서 임상적으로 사용해온 화학적으로 합성된 물질과 비교하여, 알레르기성 반응의 위험이 실제로 일어나지 않는다. 또한 변형된 인간 PSTI의 상기한 변형물은 원래의 인간 PSTI와 비교하여, 트립신과 같은 단백분해 효소에 의한 분해에 대해 민감성이 덜하고 더욱 안정하며, 트립신 저해 작용이 지속되기 때문에, 이들 신규의 변형물은 췌장염을 치료하는데 있어서 임상적 실용성이 밝은 전망을 갖게 해준다.

당해 기술분야의 종사자는 본 발명의 범주를 이탈하지 않고 다른 여러 변형을 용이하게 수행할 수 있음을 잘 알 수 있을 것이다. 따라서, 첨부된 특허청구의 범위는 여기에 기술된 내용에 한정시키기 위함이 아니라, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람에세 균등물로서 취급될 수 있는 특징을 포함하여 본 발명에 내재하는 특허가능한 신규성의 모든 특징을 포괄적으로 기술한 것임을 알아야 한다.

Claims

원래의 인간 PSTI의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 42번째, 44번째 또는 42번째 및 44번째 위치의 알기닌이 글루타민, 세린 또는 글루타민 및 세린으로 치환된 변형된 인간 PSTI .
제1항에 따른 변형된 인간 PSTI를 암호화하는 DNA 서열.
원래의 인간 PSTI 의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 42번째 또는 44번째 위치의 알기닌이 각기 글루타민 또는 세린으로 치환된 변형된 인간 PSTI .
제3항에 따른 변형된 인간 PSTI를 암호화하는 DNA 서열.