JPS63267289A - 蛋白質の新規製法 - Google Patents

Abstract

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め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 星！上皇五月±１ 本発明は、目的の蛋白質をＡＰＨとの融合蛋白質として
発現し得るベクターによって微生物を形質転換し該融合
蛋白質を産生させ目的の蛋白質を得ることを特徴とする
蛋白質の製造方法に関する。

従）しυ友虫 最近の遺伝子工学の急速な発展に伴い、様々な有用なペ
プチドが微生物中で産生されている。その中でも、比較
的短鎖のペプチド、例えばヒトインスリン、ヒト成長ホ
ルモンなどは、微生物中に産生きれると容易にプロテア
ーゼによって分解される等の理由により産生効率が低く
、他の蛋白質との融合蛋白質として微生物中に産生きせ
る方法がとられている（例えば、特開昭５４−９２６９
６）。また、産生物が宿主に対して致死的であったり増
殖を阻害して産生効率が低い様な場合、融合蛋白質とし
て産生物本来の活性を失わせることによって産生効率を
上げることも可能である。

トランスボゾンＴｎ５はネオマイシンやカナマイシンに
対する薬剤耐性を微生物に与えるＡＰＨ（アミノグリフ
シト　３゛−ホスホトランスフェラーゼ■）をフードす
る遺伝子を含んでいる。トランスボゾンＴｎ５中のこの
遺伝子の塩基配列は既知であり　（Ｇｅｎｅ　１９．３
２７．１９８２＞　、この塩基配列を含むプラスミドは
市販きれている（例えば、ｐＮＥＯ（ファルマシア））
、その塩基配列とそれから推定きれるＡＰＨのアミノ酸
配列を第１図に示す。

膵臓に由来するトリプシン・インヒビターには、膵分泌
性トリプシン・インヒビター（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　
５ｅｃｒｅｔａｒｙ　ｔｒｙｐｓｉｎ　１ｎｈｉｂｉｔ
ｏｒ、以下ＰＳＴＩと略記）と塩基性膵トリプシン・イ
ンヒビター（ｂａｓｉｃ　ｐａｎｃｒａａｔｉｃ　ｔｒ
ｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　）の２種類がある。前
者は哺乳動物に存在し、膵臓の他、腎臓、肺臓、膵臓、
肝臓、脳などの臓器にも分布する。後者は反斜動物の膵
臓の他、各種臓器に分布するがヒトをはじめとする他の
哺乳動物には存在しない、　Ｐｕｂｏｌｓら（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈａｍ、　２４９．２２３５．１９７４
＞およびＦｅ１ｎｓｔｅｉｎら（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　４３．５６９．１９７４）はそれぞれヒ
ト膵液中からヒトＰＳＴＩを分離精製し、Ｇｒｅｅｎｅ
ら　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　４５．　
８１３．　１９７６）　によりその構造が明らかにされ
た（但し、Ｇｒｅｅｎｅらの報告したＰＳＴＩのアミノ
酸配列は、第２図に示すアミノ酸配列と２１．２９番目
が異なる）。

ヒトＰＳＴＩは第２図に示すとおり５６個のアミノ酸か
らなるペプチドで、分子量は６２４２である。またＣｙ
ｓのＳＨ基はアミノ酸配列９と３８番目、１６と３５番
目、２４と５６番目で、それぞれＳ−５結合をしており
、遊離ＳＨ基は存在しない、　Ｅｄｄｅｌａｎｄら（Ｈ
ｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　３５９．６７１．１９７８＞および北原ら
（Ｂｉｏｍｅｄ。

Ｊ、　３．　ＨＩ３．１９７９＞はそれぞれ膵液中から
得たヒトＰＳＴＩを抗原としたラジオイムノアッセイ系
を確立し、血中ＰＳＴＩの測定を可能にした。出来ら（
Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ
ｍｕｎ、　１３２゜６０５、１９８５）はヒトＰＳＴＩ
のＤＮＡ配列を明らかにした（第２図参照）。

急性膵炎の自己消化は蛋白分解酵素によって惹起される
。何らかの原因で活性化した少量のトリプシンがトリプ
シノーゲンをはじめ他のｚｙｔｎｏｇｅｎの連鎖反応的
活性化を行なうためと言われている。膵腺房細胞に存在
するＰＳＴＩは、膵酵素とともに膵液中に分泌されて、
膵管内で起こったトリプシンの活性化を阻止する。更に
、ＰＳＴＩの一部は逸脱インヒビターとして血中に移行
してｆｒｅｅな状態で存在する（胆と膵、２．２３１．
１９１Ｈ）。

血中ＰＳＴＩは膵疾患、特に急性膵疾患で大きな変動を
示し、高値維持期間もアミラーゼに比し長期間である。

またプロテアーゼインヒビターとは無関係に、血中ＰＳ
ＴＩの変動は膵侵襲を鋭敏に反映する（胆と膵、互、　
３８３．１９８２）　、従って、血中ＰＳＴＩを測定す
ることにより、膵疾患の診断と経過観察が可能になる。

ラットアクチンはラットの骨格筋を形成する蛋白質であ
り、該アクチンをコードする遺伝子は既にクローニング
されている（生物物理、２５巻、５ｕｐｐｌｅｒｎｅｎ
ｔ、　ｐｐＳ７８．１９８５）　（第５図参照）。

−明が解決しようとする−　、。

ヒトＰＳＴＩおよびラットアクチンが遺伝子工学を利用
して産生きれた例は無いが、ヒトＰＳＴＩのような比較
的短鎖のペプチドを微生物中で発現するために、β−ガ
ラクトシダーゼとの融合蛋白質としてヒトインスリン、
ヒト成長ホルモンなどを発現させる試みが成きれている
（上記）。しかし、この系において、いかなるペプチド
も発現可能と言うわけではない。よって、目的のペプチ
ドを融合蛋白質として発現させるその他の系を開発する
ことは、様々なペプチドを微生物中で産生させる上で有
意義である。

ＡＰＨをコードする遺伝子はトランスポゾンＴｎ５中に
含まれ市販されているが、ＡＰＨとの融合蛋白として目
的のペプチドを微生物中で発現するという試みは全く成
されていなかった。

また、膵疾患の診断および経過観察の為に、ＲＩＡによ
るＰＳＴＩの測定が広く採用されているが、この測定に
際しては標準試薬等としてヒトＰＳＴＩが必須であり、
これはヒト膵液中から分離精製されているため、量が限
られ、大量に得ることは不可能であった。

ラットアクチンをフードするＤＮＡは上記の様に既にク
ローニングされているが、本発明者らの実験（実施例参
照）によれば、ラットアクチンを融合化せずに大腸菌内
で発現させた場合には、はとんどラットアクチンは産生
されなかった。

間　点を解決するための手段 本発明者らは、ＡＰＨ遺伝子を適当なプロモーターの下
流におくと、微生物中で大量のＡＰＨが産生きれること
を見出し、さらにこのＡＰＨの高発現能を利用して、ヒ
トＰＳＴＩやラットアクチンがＡＰＨとの融合蛋白質と
して微生物中で発現され得ることを見出し、本発明を完
成するに至った。

本発明は、ＡＰＨ遺伝子にヒトＰＳＴＩ、ラットアクチ
ンなど目的の蛋白質をコードする遺伝子を接続し、該融
合遺伝子を適当なプロモーターの下流に配したベクター
を宿主に導入し融合蛋白質を産生させ、該融合蛋白質か
ら目的の蛋白質を採集する、蛋白質の製造方法を提供す
る０本製造方法は上記のヒトＰＳＴＩ、ラットアクチン
などに限らず、その他の蛋白質の産生にも応用可能であ
る。

該ＡＰＨ遺伝子は、ＡＰＨをコードする構造遺伝子のみ
ならずそのプロモーターやリポソーム結合配列を含んで
いてもよい、ＡＰＨプロモーターを含むＡＰＨ遺伝子と
目的の蛋白質をコードする遺伝子の融合遺伝子を、強力
なプロモーター、例えばＩａｃ系プロモーター、Ｔｒｐ
系プロモーター、Ｔａｃ系プロモーターなどの制御下に
配してもよいし、ＡＰＨプロモーターを含まないＡＰＨ
のリポソーム結合配列および構造遺伝子と目的の蛋白質
をコードする遺伝子の融合遺伝子を、これらプロモータ
ーの制御下に配してもよい。上記ＡＰＨのリポソーム結
合配列近辺は他の適当なリポソーム結合配列と置換する
ことも可能であると考えられる。また、ＡＰＨ遺伝子は
ＡＰＨ構造遺伝子を全て含んでいる必要はなく、Ｎ末端
から１３個以上のアミノ酸配列をコードしているもので
良く、好ましくは２４個以上のアミノ酸配列をフードし
ているものが良い、即ち、本発明の発現効率の高きは、
ｍＲＮＡから蛋白質への翻訳効率の良さが】因七考えら
れ、翻訳開始に係わるＡＰＨ遺伝子のリポソーム結合配
列近辺からＡＰＨのＮ末端から数十個のアミノ酸配列を
コードする配列までが重要であると考えられる０例えば
、ｐＮＥｏ　（ファルマシア）のＨｉｎｄ　ｌ［、Ｔａ
ｑ　Ｉ制限断片（ＡＰＨプロモーターとＡＰＨのＮ末端
から８２番目までのアミノ酸配列をコードする遺伝子、
第１図中の＝３５０〜２４６番目のＤＮＡ配列に対応）
に合成ヒトＰＳＴＩ遺伝子を接続し、ｐＵｃ１３（宝酒
造）のＩａｃブローモーターの制御下に配すれば、ＡＰ
ＨとヒトＰＳＴＩとの融合蛋白質を発現するベクターを
構築できる。本発明のＡＰＨ遺伝子は、第１図に示す配
列のみならず、多少の塩基が置換、脱離または挿入され
たものも同等の発現能を有するので、そのような変異Ａ
ＰＨ遺伝子を用いた製造方法も本発明の範囲内と考える
べきである。この場合、当然ＡＰＨのアミノ酸配列が大
きく変化することが予想されるが、ＤＮＡレベルで類似
していれば、上記のような変異ＡＰＨと融合化する製造
方法も本発明の範囲内である。

上記のＡＰＩと目的の蛋白質の融合遺伝子を運搬するベ
クターとしては、ｐＵｃ１３、ｐβ−ｇａｌ１３ｃ、　
ｐＯＰ２０３−１３、ｐＵｃ９、ｐＵｃ８、ｐＥＡ３０
０．　ｐｔｒｐＬｌ、ｐＢＮ７０、ｐ賢Ｔ１１１、ｐＷ
１１２１、ｐ賀Ｔ１３１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５
４０、ｐＤＲ７２０、ｐＹＥＪＯＯｌ、ｐＰＬ−１ａｍ
ｂｄａ、　ｐＫｃ３０．　ｐＫＣ３１、ｐＡｓＬ、ｐＬ
Ｃ２４、ｐＨｔＪＢ４、ｐＩＮ−Ｉ、　ｐＩＮ−Ｉｆ、
ｐＩＮ−■、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＵＢ１１２、
ｐ１１２７、ｐＳＡＯ５０３、ｐＥ１９４などが挙げら
れるが、これらに限定されるものではなく、該融合遺伝
子を運搬し微生物中で発現し得るものであれば良く、当
業者が一般に形質転換などに用いるベクターは全て使用
できる。これらのベクターを、宿主に応じて適当に選択
し、上記融合遺伝子を適切なプロモーターの制御下に配
すれば、ＡＰＨと目的の蛋白質の融合蛋白質を発現させ
ることができる。

宿主としては、大腸菌などを用いれば目的の蛋白質を効
率よく産生できる。

該融合蛋白質から目的の蛋白質を採集するに際しては、
ＡＰＨと目的の蛋白質の間に適当な結合配列、特にＭ　
ｅ　ｔまたはＭｅｔを含む配列を挿入しておけば、臭化
シアンで容易に目的の蛋白質を分離できる。この方法以
外にも、両蛋白質問につＳを挿入し２−ニトロ−５−チ
オシアノ安息香酸で切断する方法、Ａｓｎ−Ｇｌｙを挿
入しヒドロキシルアミンで切断する方法、Ｔｒｐを挿入
し２−（２−二トロフェニルスルフェニル）−３−メチ
ル−３−ブロモインドールで切断する方法、ｌｙｓまた
はＡｒｇを挿入しトリプシンで切断する方法、−１１ｅ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−を挿入し血液凝固因子Ｘａ
で切断する方法等が一般的に用いられており、目的の蛋
白質のアミノ酸配列を考慮して、これらの方法を適宜用
いることが可能である。

また、これらの切断の目的のみならず、ベクターの構築
上やむなく少数の結合配列が挿入される場合があるが、
目的の蛋白質の産生効率への影響は少ない。

融合蛋白質から切断された目的の蛋白質は、常法通り、
クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、遠心分離操作などを適当に組み合わせて精製できる
。

ヒトＰＳ’ＴＩをフードする遺伝子は、既に白木ら（前
記）によりヒト膵臓細胞よりクローニングきれその配列
も明らかになっており、比較的短鎖であるため、合成ヒ
トＰＳＴＩ遺伝子を用いるのが有利である。もちろん、
常法に従って、白木ら（前記）と同様にしてヒト膵臓細
胞より調製しても良い、この配列は、天然のＤＮＡ配列
、第２図に示す配列はもちろんのこと、第２図に示すヒ
トＰＳＴＩのアミノ酸配列をコードする配列であればよ
い、該遺伝子の５゛末端にＭ　ｅ　ｔをコードする配列
（ＡＴＧ）を配してＡＰＨ遺伝子と接続する、すなわち
、ＡＰＨとヒトＰＳＴＩの間にＭｅｔを配する融合蛋白
質をコードするように構築すれば、融合蛋白質からヒト
ＰＳＴＩを採集するときに臭化シアンで処理すれば容易
に採集でき好都合である。

ラットアクチンは、融合化せずに成熟型アクチンとして
発現許せた場合、はとんど産生きれないが、ＡＰＨのア
ミノ末端１３残基以上と融合化させ発現きせると効率よ
く産生される。他の蛋白質の発現に於ても、同程度の長
さのＡＰＨと融合化すれば高収率で発現きれると考えら
れる。

正月 本発明は、ＡＰＨ遺伝子の高発現能、すなわちｍＲＮＡ
への転写、ｍＲＮＡからペプチドへの翻訳の効率の良さ
を利用して目的の蛋白質を製造するものであり、かつ、
比較的短鎖の目的の蛋白質を発現させる場合、長鎖のＡ
ＰＨとの動台蛋白質として発現させるので、菌体内での
プロテアーゼによる分解を免れることができる。また、
融合化により目的の蛋白質の有する有害な活性を失わせ
ることも可能である。本発明の高効率は、主にｍＲＮＡ
からペプチドへの翻訳の効率の改善によるものと考えら
れ、該要因によって発現効率の低かったペプチドの発現
に、特に有効であると考えられる。

（以下余白） 実施例 以下の実施例に於て、本発明の製造方法を、ヒトＰＳＴ
Ｉおよびラットアクチンを例に挙げて詳細に説明するが
、何ら本発明を限定するものではない。

施例１　ヒトＰＳＴＩの製造 ヒトのＰＳＴＩ遺伝子の核酸塩基配列は、出来らによっ
て決定された配列（Ｂｉｏｃｈａｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ
。

Ｒａｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　１３２．６０５　（１９
８５））に従い、この成熟型蛋白質の構造遺伝子の暗号
鎖の直前にＭａｔをフードするＡＴＧを、直後に終始コ
ドンＴＧＡを結合させた。更に、この配列の５°末端に
制限酵素Ａｃｃ　Ｉの認識配列を、３′末端に制限酵素
ＢａＩ！ＩＨ１の認識配列を有するように塩基配列を付
加し、鎖長１７９と１８１の２本鎖を形成するように設
計した。

適切な配列順序で結合させた場合、ＰＳＴＩのアミノ酸
配列をフードする塩基配列を含むＤＮＡ鎖およびこの暗
号鎖に相補的なりＮＡ鎖をそれぞれ形成する２群の短鎖
ＤＮＡフラグメント２０種を化学合成した。これらのフ
ラグメントは、全種類を混合した場合、互いに相補的部
分で水素結合を形成し、制限酵素の認識部位となる粘着
末端を有する２本鎖構造を形成せしめうるものである（
第３図）。

第３図に示したＵ−１〜Ｕ−１０およびＬ−１〜Ｌ−１
０の合計２０種のフラグメントを核酸自動合成Ｉ！ＧＥ
ＮＥＴ　Ａ−１［（日木ゼオン株式会社製）を用いて調
製した。得られた各フラグメントは、セファデックスＧ
−５０を用いるゲルクロマトグラフィーと、逆相系シリ
カゲルカラム（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　１０Ｑ８．１０　
×２５０＋ｎｏ＋）を用いる高速液体クロマトグラフィ
ーで精製した。

合成きれたオリゴヌクレオチドは、５′末端にリン酸残
基をもたないので、そのままＴ４ＤＮＡリガーゼによる
連結反応を行なうことはできない、前述の２０種の合成
オリゴヌクレオチドのうち、Ｕ−１とＬ−１０以外の１
８種の合成オリゴヌクレオチドに対して５′末端へリン
酸基の酵素付加反応を行なう、リン酸基付加反応はＴ４
ボリタクレオチドキナーゼ（宝酒造）を用いて行なう、
各オリゴヌクレオチド約３００　ｐｍｏｌを２５μｍの
キナーゼ反応溶液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、１０ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、１０ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル、ＡＴＰ約１０００ｐｍｏｌ、ｐＨ７，６）に溶かし
、３ユニツトの酵素を反応溶液へ加えて反応を開始する
０反応は３７℃で１時間行なう。熱処理（６５°Ｃ５２
０分間）によりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活さ
せた後、そのまま連結反応へ用いる。リン酸基を付加き
れたＵ−２〜Ｕ−１０、Ｌ−１〜Ｌ−９の１８種の合成
オリゴヌクレオチドとリン酸基付加を行なっていないＵ
−１、Ｌ−１０の合成オリゴヌクレオチドを各５０ｐｍ
ｏｌずつ混合し、連結反応溶液を調製する。連結反応溶
液をまず８０℃２分間処理し、２０℃まで徐冷する。そ
の後、ジチオスレイトール、ＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを加え、連結反応を行なう。最終的に連結反応溶液（
２００μｌ）は６６ｍＭトリス塩酸緩衝液、６．６ｍＭ
塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、１　
ｍＭＡＴＰ、７００ユニツトＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造）を含み、連結反応は４°Ｃで５日間行なう、これら
は基本的に、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
Ｌ３、２９５９．　（１９８５）に記載の方法に従うも
のである。連結反応後、フェノール抽出、エタノール沈
澱を常法により行なった後、トリス−ホウ酸緩衝液中の
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、目的と
する１ｓｏｂｐ付近のＤＮＡ断片をＤＥＡＥ−メンブレ
ンを用いて電気泳動的に回収する。ゲル上で分離された
ＤＮＡはエチジウムブロマイドにより染色し、目的とす
るＤＮＡバンドの近傍にＤＥＡＥ−メンブレン（５ｃｈ
ｌｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌ１社）をゲルへ挿入
した後、電気泳動的にＤＮＡバンドをＤＥＡＥ−メンブ
レンへ吸着させる。ＤＮＡバンドの移行が終了後、１．
０Ｍ塩化ナトリウム−１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０）−１ｍＭＥＤＴＡでＤＮＡをＤＥＡＥ−メンブ
レンより溶出し、エタノール沈澱によりＤＮＡを回収す
る。（この方法は一般的であり、例えばＭｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ、　１９８２）に詳細に記述されている）。この回収
したＤＮＡ断片は塩基配列決定のために、Ｍ１３ファー
ジ系ベクターへ挿入する。Ｍ１３ｍｐｌＯベクター（宝
酒造）を制限酵素ＡｃｃＩ　、　ＢａｍＨＩで切断する
。この直鎖状化したｍｐｌｏベクターと回収したＤＮＡ
断片を７４ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。連結反応
は前述の合成オリゴヌクレオチドの連結反応とほぼ同じ
条件で行ない、反応温度及び時間のみ１２°Ｃと１６時
間とする。連結反応後のＤＮＡは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　２
５０−２５１．１９８２）に記載の方法に従って、形質
転換に用いる。対数増殖期の大腸菌に一１２株ＪＭＩ　
Ｏ３培養液を０℃で塩化カルシウム処理して得られるＤ
ＮＡ受容菌と連結反応後のＤＮＡとを混合し水中でイン
キュベートし、その後４２°Ｃ２分間処理して形質転換
を行なった６Ｍ１３フアージの感染した大腸菌は生育速
度が遅くなるため、プラークとして出現する。ＤＮＡを
取り込んだＪＭ１０３菌体を１００ｍＭイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド２０μｌ。

２％５−プロモー４−クロロ−３−インドリル−β−ガ
ラクトシド５０μＩ、ＪＭ１０３菌の対数増殖期の菌体
液０．２ｍｌ、および軟寒天液（０，６％寒天液）３ｍ
ｌに加え、あらかじめ固化しておいた１、５％平板寒天
上に添加する。ここで使用した寒天にはＴＹ培地（トリ
プトン８ｇ１酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを水
ＩＬに溶かしたもの）が含まれている。−晩３７℃で培
養後、形質転換菌はプラークを形成する。Ｍ１３ｍｐｌ
ｏにより形質転換された菌は青色のプラークを形成する
が、ＤＮＡ断片を欠失挿入されたＭ１３ファージは無色
のプラークを形成する。メッシングの方法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１．２０−２８　（１９
８３）　’）に従い、このプラークから一本鎖ファージ
ＤＮＡを以下のようにして調製する。大腸菌に一１２株
ＪＭ１０３の一晩培養液１ｍｌを、２×ＴＹ培地１００
ｍ１（２ＸＴＹ培地；１６ｇバタトトリブトン、１０ｇ
酵母エキス、５ｇ塩化ナトリウム／Ｌ）に植菌し、３７
°Ｃで２時間振とう培養する。この培養液を５ｍｌずつ
分注し、この培養液へプラークが形成された寒天をキャ
ピラリーピペットで切りだし接種する。その後、更に培
養液を３７℃で５時間培養し、Ｍ１３ファージの感染、
培地への放出を行なわせる。この培養液の菌体は、複製
型二本鎖ＤＮＡの調製に用い、菌体を除去した培地上清
は一本鎖ファージＤＮＡの調製に用いる。培地上清（４
ｍｌ）へ２０％ポリエチレングリコール、２．５Ｍ塩化
ナトリウムの溶液を８００μｌ加え、遠心操作によりフ
ァージを集める。このファージを５００μｌの１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液−１ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸
Ｈ８，０）へ溶かし、フェノール抽出、エタノール沈殿
により一本鎖ファージＤＮＡを回収する。複製型二本鎖
環状ＤＮＡのファージ感染菌よりの調製は、常法の水酸
化ナトリウム−ドデシル硫酸ナトリウム（５ＤＳ）法（
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　７．１５１３−
１５２３　（１９７９）　）により行なう、５ｍｌの培
養液から得た菌体を１００μｍの５０ｍＭグルコース、
２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）、１０ｍＭＥＤＴＡ
、　　リゾチーム１ｍｇ／ｍｔに懸濁し、室温で５分間
放置する。これに２００μ！の０．２Ｍ水酸化ナトリウ
ム−１％ＳＤＳを加′え、穏やかに混合し水中で５分間
放置する。その後、１５０μｌの５Ｍ酢酸カリウム溶液
（ｐＨ５，２）を加え混合し水中で５分間以上放置する
。遠心後、上清へ２倍体積のエタノールを加え、沈澱を
回収する。沈澱を溶解後、もう一度エタノール沈澱を行
なう、この方法により、無色のプラークから複製型二本
鎖ＤＮＡを調製し、Ａ■Ｉ　、　ＢａｍＨＩで二重切断
し、約１８０ｂｐのＤＮＡ断片が生じることを確認する
。その後、その同じプラークより調整した一本鎖ファー
ジＤＮＡをジデオキシ法（５ｃｉｅｎｃｅ　２１４．１
２０５−１２１０　（１９８１）　）によりＤＮＡ塩基
配列決定に用いる。塩基配列の決定は、Ｍ１３シーケン
シングキット（宝酒造）を用いて行なう、これにより、
得たクローンが目的とするＰＳＴＩの構造遺伝子の全域
を含んでいることが確認できた。塩基配列の確認された
複製型二本鎖ＤＮＡは次の発現プラスミドの構築へ利用
する。

ＰＳＴＩの発現プラスミドは以下の三断片の連結反応に
より構築する。

１）前述の合成オリゴヌクレオチドの連結反応により得
られ、塩基配列の確認された約１８０ｂｐのＡｃｃ　Ｉ
　−ＢａｍＨＩ断片 ２）ｐＵｃ１３（宝酒造）のＨｉｎｄ　ｍ−ＢａｍＨＩ
切断後の約２．８ＫｂｐのＤＮＡ断片 ３）ｐＮＥｏ（Ｔｎ５のＡＰＨ遺伝子を含む、ファルマ
シア）をＨｉｎｄ　ｍ消化し、さらにＩａｑ　Ｉの消化
により得られる約６００ｂｐのＤＮＡ断片（第２図中の
一３５０〜２４６番目のＤＮＡ配列に相当、第４図参照
） これらの断片のうち、１）および３）はポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分離しＤＥＡＥメンブレンを用
いて回収し連結反応に用いる。２）の断片は、二重切断
を確認後、フェノール抽出、エタノール沈澱し、連結反
応に用いる。この三断片の連結反応により得られる発現
プラスミドは、トランスポゾンＴｎ５中にコードされる
ＡＰＨのアミン末端８２残基の下流にＰＳＴＩが融合化
きれた融合蛋白質を発現する。この三断片の連結反応も
前述の場合と同様に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて行な
う、連結反応後のＤＮＡは、モレキュラークローニング
（前記）に記載の方法に従い、形質転換に用いる。大腸
菌に一１２株Ｃ６００またはＡＧ−１をＤＮＡ受容菌と
して行なう。形質転換菌はアンピシリンに対する抵抗性
を獲得するので、アンピシリン含有寒天平板（ＬＢ培地
；トリプトン１０ｇ１酵母工キス５ｇ１塩化ナトリウム
５ｇをＩＬ中に含む）上でコロニーを形成する。出現し
たコロニーの中の１２個を、アンピーシリン４０μｇ　
／　ｍ　ｌを含むＩ、Ｂ培地５ｍｌへ白金耳により植菌
し、３７°Ｃで１６時間培養する。その後、菌体を遠心
操作により集め、先に述べた水酸化ナトリウム−５ＤＳ
法によりプラスミドの分析を行なう、目的とするプラス
ミドは、Ｈｉｎｄ　ｍ、ＢａｍＨＩ、Ｐｓｔ　Ｉに対す
る切断部位を各々−ケ所ずつしか含まない。よって、各
制限酵素消化で直鎖状の約３．６ＫｂのＤＮＡバンドと
して観察されるものが目的のプラスミドｐＵＣＫＭＦＰ
ＳＴＩである（第５図参照）、ｐＵＣＫＭＦＰＳＴＩを
有するクローンを次の発現へ用いる。

目的とするプラスミドを持つことが確認されたクローン
は、ＬＢ培地（アンピシリン４０μｇ／ｍｌを含む）で
培養後、５０％グリセリン存在下−７０°Ｃで保存する
。この菌体保存液１０μｌを５ｍｌのアンピシリンを含
むＬＢ培地へ加え、３７°Ｃ８時間培養する。この培養
液１００μｍをアンピシリンを含む５ｍｌのＭ９培地（
Ｍ９培地ニリン酸水素二ナトリウム６ｇ１リン酸二水素
カリウム３ｇ１塩化ナトリウム０．５ｇ、塩化アンモニ
ウム１ｇをＩＬに溶かし、滅菌後、硫酸マグネシウム、
塩化カルシウムを各々最終濃度が２ｍＭ、０．１ｍＭと
なるように加える。更に、アンピシリン４０μｇ　／　
ｍ　１　、グルコース０゜５％、カザミノ酸０．５％を
含む）へ加え、３７℃２４時間培養を続ける。培養終了
後、遠心操作により菌体を集め、以下の分析に用いる。

少量の菌体をとり、ＳＤＳ存在下のポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析するための試
料とする。菌体蛋白質は、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（
ｐＨ６，８）、１％ＳＤＳ、１％２−メルカブトエタノ
ーノ１２０％グリセリンにより可溶化、抽出の後、ゲル
電気泳動で分析する。この段階で、ＰＳＴＩを含む融合
蛋白質は予想される分子量１５０００に対応する位置に
主要バンドの一つとして出現し、大腸菌中で発現されて
いることが判る。更に、大腸菌を超音波処理などで破壊
し、可溶性蛋白質分画と不溶性蛋白質分画へ遠心操作に
より分画し、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより調べると、この融
合蛋白質は不溶性蛋白質分画に主に存在することが判っ
た。

上記菌体６ｇを２０ｍ１の５ｍＭＥＤＴＡを含む０．１
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，０）に懸濁し１２０００［，１
０分遠心した。同様の操作を繰り返した後、１５ｍ１の
５ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭベンズアミジン、１ｍＭフェ
ニルメチルスルホニルフルオリドを含むＯ，１Ｍトリス
塩酸（ｐＨ７，０）に懸濁し、フレンチプレスを用い、
４０Ｏｋｇ／ａｍ”の圧力で３回破砕した。２３０００
ｇ、２０分遠心して得たペレット１．０５ｇを２０ｍＭ
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、タンパク変成剤を含む
０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）１０ｍｌに溶
解しセファクリルＳ−２００（２，６Ｘ７９ｃｍ）のカ
ラムでゲル濾過を行なった。ゲル濾過の溶出には１ｍＭ
ＤＴＴ、７Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ７，
２）を用いた０分子量約１７０００の両分を集め蒸留水
で透析後凍結乾燥し、さらに１６０ｍｇの臭化シアンを
含む２ｍｌの７０％ギ酸を加え室温で６時間反応させた
後、蒸留水１８ｍ１を加え凍結乾燥した。凍結乾燥物を
２ｍｌの２ｍＭＥＤＴＡ、６Ｍグアニジン塩酸を含む０
．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，１）に溶解し、１００μｌ
の２−メツしカプトエタノールを加え窒素気流下、３７
℃、４時間反応させた後、蒸留水で透析した。１０００
０ｇ、１分の遠心で得た上清６ｍｌに食塩１７２ｍｇ、
１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０）３２０μｌを加え牛トリ
プシンーＣＨ−セファロース４Ｂのアフィニティーカラ
ム（２ｘ３　ａｍ）に吸着させた。０．５Ｍ食塩を含む
０．０５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０）、さらに蒸留水で
順次カラムを洗浄した後１０ｍＭ塩酸でＰＳＴＩを溶出
させ凍結乾燥し精製品１．５５ｍｇを得た。

得られたヒトＰＳＴＩ（１２ｇｇ）を試験管（ｔｏｘ９
ｏｍｍ）にとり、４Ｍメタンスルホン酸（０，２％３−
（２−アミノエテル）インドール含有）５０μｍを加え
、減圧下、１１０℃、２４時間加水分解した。アミノ酸
分析計は日立８３５型アミノ酸分析計を用いた。得られ
たＰＳＴＩのアミノ酸組成は表１の様になり天然のヒト
ＰＳＴｌと完全に一致した。

（以下余白） 表１ アミノ酸　　　　実験値　　　　　理論値ＡＳｐａｒｔ
ｉｃ　ａｃｉｄ　　　７　、８　　　　　　８Ｔｈｒｅ
ｏｎｉｎｅ　　　　　３　、８　　　　　　４Ｓｅｒｉ
ｎｅ　　　　　　２　、８　　　　　　３Ｇｌｕｔａｍ
ｉｃ　ａｃｉｄ　　　６　、２　　　　　　６Ｐｒｏｌ
ｉｎｅ　　　　　　２　、９　　　　　　３Ｇｌｙｃｉ
ｎｅ　　　　　　５　、２　　　　　　５Ａｌａｎｉｎ
ｅ　　　　　　１　、４　　　　　　１Ｃｙｓゎｉｎｅ
　　　　　　２　、５　　　　　　３Ｖａｌｉｎｅ　　
　　　　２　、０　　　　　　２Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ
　　　　０　、　Ｏ０Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ　　　　２
　、８　　　　　　３Ｌｅｕｃｉｎｅ　　　　　　４　
、０　　　　　　４Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　　　　　２　、
９　　　　　　３Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　　　１
．２　　　　　　１Ｌｙｓｉｎｅ　　　　　　３　、８
　　　　　　４Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　　　　　０　、０
　　　　　　０Ｉｒｙｐｔｏｐｈａｎ　　　　Ｏ、ＯＯ
Ａｒｇｉｎｉｎｅ　　　　　３　、０　　　　　　３ま
たＮ末端から３残基のアミノ酸配列をＥｄｍａｎ法（Ｉ
ｗａｎａｇａらの変法、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　８．１８９−１９９．１９６９）で調べたところ
、Ａｓｐ−５ａｒ−Ｌｅｕとなり天然のヒトＰＳＴＩに
一致した。さらに得られたヒトＰＳＴＩは牛トリプシン
を１：１のモル比で化学量論的に阻害し、天然ヒトＰＳ
ＴＩの抗体（ウサギ抗血清ポリクローナル）との免疫反
応性も、その希釈曲線が天然ヒトＰＳＴＩの挙動に一致
した。

施例２　ラットアクチンの製造 融合化蛋白質の発現プラスミドを構築するために、いく
つかのベクターを予備的に構築する。まずｐＵｃ１３（
宝酒造）のＨｉｎｄ　Ｉ［［−５ａｌ　Ｉ部位へトラン
スポゾンＴ　ｎ　５　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ｐＮＥｏ
由来）のＨｉｎｄ　Ｉ［［−５ａｌ　Ｉ断片を導入する
（第６図参照）。このＤＮＡはトランスボゾンＴｎ５の
ＡＰＨ遺伝子を完全に含んでいるので、目的とするＤＮ
Ａを導入された大腸菌はカナマイシンに対して抵抗性を
獲得し、このことを利用して形質転換した大腸菌を選択
し得る。ｐＵｃ１３をＨｉｎｄｌ［［，５ａｌＩの制限
酵素で二重切断を行なう、各酵素消化条件は酵素の供給
元の指示に従う。同様にｐＮＥＯをＨｉｎｄ■、５ａｌ
ｌで二重切断し、得られた約１　、５ＫｂのＤＮＡ断片
をアガロースゲル電気泳動により分離し、ＤＥＡＥ膜（
５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ　）を用い
て回収する。ゲル中のＤＮＡは、エチジウムブロマイド
により螢光染色し、その後ＤＮＡバンドの近傍にＤＥＡ
Ｅ膜を差し込み、その後電気泳動的にＤＮＡバンドをＤ
ＥＡＥ膜へ移行させる。ＤＥＡＥ膜に吸着したＤＮＡは
、１Ｍ塩化ナトリウム−１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）−１ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸ＤＴＡ
）により６５℃で溶出し、エタノール沈殿により脱塩、
濃縮する。以上の方法は常法であり、以下の文献に詳細
に記述されている。　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　１．　。

Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、　Ｆ、、　＆　Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ、、Ｊ、　”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”　
Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　（１９８２））、二断片の連結反応には、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を用い、６６ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，６）−６，６ｍＭ塩化マグネシウム
−１０ｍＭジチオスレイトール−１ｍＭアデノシン三リ
シリン酸液中で１２℃１５時間反応きせる。

ＤＮＡ受容菌としては、大腸菌に一１２株ＪＭＩ０３を
用いる。ＪＭ１０３は、例えばファルマシアのｐＤＲ５
４０などを購入すれば同時に入手することができ、極め
て一般的な菌株である。形質転換に用いる菌は、対数増
殖期の培養液をＯ′Ｃで塩化カルシウム処理して得られ
る。こうして得たＤＮＡ感受性菌を、連結反応後のＤＮ
Ａ試料と混合し、水中に２０分間静置する。その後、４
２℃ン分間、２５°ＣＩＯ分間保温し、平板寒天上で形
質転換菌を選択する。平板寒天は、抗生物質カナマイシ
ン（５０μｇ　／　ｍ　１　）、アンピシリン（１００
μｇ／ｍｌ）を含む１．５％寒天（ＬＢ培地（１０ｇト
リプトン、５ｇ酵母エキストラクト、５ｇ塩化ナトリウ
ムをＩＬ当りに含む）を含む）よりなる、このクローニ
ングにおいては、生育したコロニーはほとんど目的のプ
ラスミドを有するはずであるが、プラスミドを各コロニ
ーより調製し分析する。平板寒天上のコロニー５個をＳ
ａｌのＬＢ培地へ植菌し、３７℃で一晩培養する。この
菌体よりアルカリ−ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
法によりプラスミドを調製しくＢｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ
，Ｃ，＆　Ｄｏｌｙ、　Ｊ、　（１９７９）　Ｎｕｃｌ
。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．１５１３（５２３）、クロ
ーニングに用いたＨｉｎｄ［部位とｐＵｃ１３のＥｃｏ
ＲＩ部位でプラスミドを二重切断し、約１．５Ｋｂの断
片が生じることを確認する。　こうして得られたプラス
ミド（ｐＵＣＫＭ）をｐｓｔ　Ｉで消化し、ＤＮＡをア
ガロース電気泳動で分離し、得られた大きな断片のみを
前述の方法でゲルより回収し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用
いて環化する。形質転換した菌はアンピシリン（１００
μｇ／ｍ＋）を含む平板寒天上（１，５％寒天、ＬＢ培
地）で選択し、出現したコロニーの保持しているプラス
ミドを前述の方法と同様に調製し分析する。ＨｉｎｄＩ
Ｉ［、Ｐｓｔ　Ｉの二重切断で二本のＤＮＡバンドが出
現し、その大きさが２．７Ｋｂ、０．６Ｋｂに対応する
ことをアガロースゲル電気泳動で確認する。このクロー
ニングで得た目的のプラスミド（ｐＵＣＫＭＦ）は、融
合蛋白質の一般的な発現プラスミドとなる。このプラス
ミドのＳａｌ　Ｉ部位の下流にはｐＵＣ１３のマルチク
ローニング部位がそのまま残っているので、融合蛋白質
化する目的蛋白質の遺伝子を挿入する際に便利である。

また、Ｓａｌ　Ｉ部位は同時にＡｃｃＩ　、　Ｈｉｎｃ
ｌ［の切断部位でもあるので、この三種の制限酵素の切
断様式の違いとそれに続くポリメラーゼによる修復反応
を利用すれば、融合化する際のＡＰＨ遺伝子と目的遺伝
子の蛋白質の読み取り枠を合わすことも容易である。

アクチンとの融合蛋白質の構築において、成熟アクチン
をコードするＤＮＡ配列（第７図参照）の供与プラスミ
ドとしてｐＵＣＡＣＴを用いる（小原収、玉木幹男、鶴
田裕次、寺岡宏、日本生物物理学会第２３回年会予稿集
）（第８図参照）。

まず、ラット後足筋よりＳＤＳフェノール法によりｍ　
ＲＮ　Ａを調製しくＢｒａｗｅｒｍａｎ％Ｇ、　（１９
７４）Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　３
０．６０５−６１２　）、岡山−バーブ法によりｃＤＮ
Ａライブラリーを構築する（　Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，
＆　Ｂｅｒｇ、　Ｐ、　（１９８２）　Ｍｏ１．　Ｃｅ
ｌｌＢｉｏｌ、　ｇ、　１６１−１７０　）　−このラ
イブラリーよりコロニーハイプリダイゼイション（Ｇｒ
ｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、　＆Ｈｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、　
Ｓ、　（１９７５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、荏、　３９６１−３９６５）により、
ラット骨格筋アクチンｃＤＮＡを有するクローンを選択
する。スクリーニングに用いたプローブは、β−アクチ
ン遺伝子（和光紬薬工業＠）である、このスクリーニン
グにより得られたクローンからアルカリ−３ＤＳ法によ
りプラスミドを調製し、既知のラット骨格筋アクチン染
色体遺伝子の塩基配列を基にしてｃＤＮＡの構造を推定
しく　Ｎａｔｕｒｅ　２９８．８５７−８５９　（１９
８２））、得たクローンのｃＤＮＡ塩基配列と比較する
。塩基配列の決定は、宝酒造のＭ１３シーケンス・キッ
トを用いて行なう、その結果、こうして得られたｃＤＮ
Ａが、完全長のラット骨格筋アクチンｃＤＮＡであるこ
とを確認し、これを基にし工ｐＵＣＡＣＴを構築する。

成熟アクチンをコードする塩基配列を得るためには、ブ
ライマー伸長法を用いる。ラットアクチンｃＤＮＡをＰ
ｓｔＩ断片（約ｘ、４Ｋｂ）として切り出し、アガロー
スゲル電気泳動により前述の方法に従い回収する。この
断片とＭ１３ファージｍｐｌｏベクターｐｓｔ　Ｉ消化
物を前述の様に７４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応を
行なわせる。この連結反応物によりＪＭ１０３菌を形質
転換し、形質転換体は、１００ｍＭインプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド４０μｌ、２％５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトシド（ジ
メチルホルムアミド溶液）４０μｍ、ＪＭ１０３培養液
（ＬＢ培地）２５０μｌと混合し、更に４２℃に溶解・
保温しておいた０、６％寒天（ＴＹ培地：８ｇトリプト
ン、５ｇ酵母エキストラクト、５ｇ塩化ナトリウム／Ｌ
）へ加え、予め固化しておいた１、５％平板寒天（ＴＹ
培地）上へ注ぎ込む、上着寒天が固化した後、３７℃で
一晩保温する０Ｍ１３フアージが感染した菌は成育速度
が遅くなりプラークとして現れ、ＤＮＡ断片の挿入きれ
た組換え体ファージは無色のプラークとして、またＭ１
３ｍｐｌＯ由来のファージは青色のプラークとして出現
するので、無色のプラークを選択すればよい、大腸菌Ｊ
Ｍ１０３の一夜培養液１ｍｌを１００ｍ１の２ＸＴＹ培
地（１６ｇトリプトン、１０ｇ酵母エキストラクト、５
ｇ塩化ナトリウム／Ｌ）へ植菌し、２時間培養後５ｍｌ
ずつ試験管へ分注する。各試験管へ無色のプラークを含
む寒天をキルピラリ−ピペットで打ち抜き接種する。き
らに５時間３７℃で培養を続け、遠心により上清と菌体
を分離する。菌体からは、前述のアルカＩＪ−８Ｄ　Ｓ
法で複製型二本鎖ＤＮＡが調製きれるし、上清よりファ
ージ−末鎖ＤＮＡが調製できる。上清へ２０％ポリエチ
レングリコール６０００．２．５Ｍ塩化ナトリウム約８
００μｌ加え、遠心によりファージを沈殿させる。ファ
ージを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）−１ｍ
ＭＥＤＴＡへ懸濁し、フェノール抽出・エタノール沈殿
により一本鎖ＤＮＡを調製する。無色のプラークより調
製した二本鎖ＤＮＡを１３ａｍＨＩで消化すると、アク
チンｃＤＮＡ中にＢａｍＨＩ部位があるために、約１０
００ｂｐもしくは約４００ｂｐの断片がアガロースゲル
電気泳動で観察きれる。

これは、このクローニングにおいてアクチンｃＤＮＡの
挿入方向に２通りが可能なために生じ、目的とするもの
は約１０００ｂｐの断片を生じるファージＤＮＡである
。この解析で目的物とみなされるファージＤＮＡを持つ
クローンから調製きれる一本鎖ファージＤＮＡをｐ’Ｕ
ＣＡＣＴの構築に用いる。成熟型アクチンのアミン末端
５残基をフードする塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドをホスホトリエステル法で合成する（　Ｎｕｃｌ、　
Ａｃ１ｄＲｅｓ、　９．５５０７−５５１７　（１９８
０））　、オリゴヌクレオチドｉ５−ｍｅｒは５　’Ｇ
ＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＡＣＣ３’の配列を有する。こ
のオリゴヌクレオチドと前述のクローニングで得た一本
鎖ファージＤＮＡを混合し、大腸菌ポリメラーゼ■クレ
ノー断片により、−末鎖ファージＤＮＡを鋳型として伸
長合成反応を行なう。伸長合成反応は、１０ｍＭｈ’Ｊ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、７ｍＭ塩化マグネシウム
、２０ｍＭ塩化ナトリウム、４ｄＮＴＰ各０．２ｍＭ中
で３７℃２時間反応させる。反応後、ＤＮＡをフェノー
ル抽出、エタノール沈殿により回収した後、ヌクレアー
ゼＳ１を用いて、−末鎖で残っている部分を消化する。

ＤＮＡをフェノール抽出、エタノール沈殿で回収後、更
に大腸菌ポリメラーゼ■クレノー断片により、末端が平
滑末端となるように修復反応を行なう、修復反応は、伸
長合成反応と同じ条件で行なう０反応後に、試料は６５
”Ｃ２０分間処理し、クレノー断片を失活させる。

塩化ナトリウムを最終濃度が１００ｍＭとなるように反
応溶液へ加え、Ｐｓｔ　Ｉによる消化を行なう。

消化物は、アガロースゲル電気泳動により分離し、約１
．２ＫｂのＤＮＡバンドをＤＥＡＥ膜を用いて回収する
。ｐＵＣ１３をＨｉｎｃ　Ｉ［−Ｐｓｔ　Ｉで二重消化
したものと、先に述べたＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結反応を行なう。前述と同様に平
板寒天（１，５％寒天、ＬＢ培地、アンピシリン１００
μｇ／ｍｌ）上で形質転換菌を選択し、９個の任意のコ
ロニーよりアルカリ−５ＤＳ法によりプラスミドを調製
する。ＨｌｎｄＩ［［とＥｃｏＲＩの二重消化により、
約１．２ＫｂのＤＮＡバンドを生じるものが目的のプラ
スミドである。この分析により、目的のプラスミドと認
められたものは、クローニングに用いたＨｉｎｃ　ＩＩ
部位もｐｓｔ　Ｉ部位も回復している。またＨｉｎｃｌ
［消化により成熟アクチンをコードする塩基配列の一番
目の塩基から始まるＤＮＡ断片を調製することができる
。このプラスミドをＨｉｎｄ　ｍ消化し、大腸菌ポリメ
ラーゼ■クレノー断片で修復し平滑末端とし、その後Ｓ
ａｌ　Ｉ消化して得られる約１　、２ＫｂのＤＮＡ断片
をアガロースゲルより回収する。ｐＵＣ１３のＳａｌ　
Ｉ　−５ｍａ　Ｉ消化物と上述のＤＮＡ断片を、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて連結する。前述と同様に形質転換
菌よりプラスミドを調製し、ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｃ　Ｉ
［の二重消化で約１．２ＫｂのＤＮＡ断片を生じるもの
が、目的とするｐＵＣＡＣＴプラスミドである。

ｐＵＣＫＭＦをＨｉｎｄ　ｍ　−Ｈｌｎｃ　Ｉ［で二重
消化して得られる約６００ｂｐの断片と、ｐＵＣＡＣＴ
をＨｉｎｄ　Ｉ［［−Ｈｌｎｃ　ＩＩ消化して得られる
約３．９ＫｂのＤＮＡ断片をアガロースゲルより回収し
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させる。前述と同様
に形質転換菌（ＪＭＩ　ｏ　ａ　）をアンピシリンを含
む平板寒天上で選択し、約１０個のコロニーよりプラス
ミドを調製し、Ｈｉｎｄ　ｍ−ＥｃｏＲＩの二重消化に
より約１．５Ｋｂの断片を生じるものが目的のプラスミ
ドである。得られた目的のプラスミド（ｐＵＣＫＭＦＡ
ＣＴ）はアミノ末端にＡＰＨ由来の６１アミノ酸残基と
トランスボゾンＴｎ５由来の１０アミノ酸残基を持ち、
以下にアクチンの３７５残基を有する合計４４６残基の
ポリペプチド鎖をフードする（第９図参照）。

融合アクチンの発現のために、まず上述のｐＵＣＫＭＡ
ＣＴを保持する大腸菌をアンピシリン４０μｇ／ｍｌを
含むＬＢ培地で３７°Ｃ１４時間培養する。この培養液
をＭ９培地（ＮａｔＨＰＯ４６ｇ、　Ｋｌ！Ｐ０４３ｇ
、　ＮａＣ１０，５ｇ、　ＮＨｔＣｌ　１ｇ／　Ｌ、２
ｍＭＭｇ５Ｏａ、０．１ｍＭＣａＣ１！、　０．５％グ
リセロール、０．５ｚカザミノ酸、アンピシリン４０μ
ｇ／ｍｌ）５ｍｌへ１００μｍ加え、３７°Ｃ１０時間
培養する。培養２時間後にイソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトピラノシドを１ｍＭとなるように加え、誘導を
かける。培養後の菌は、遠心により集菌後、１０％グリ
セリン−０，１Ｍトリス塩酸緩衝液−１％５ＤＳ−１％
２−メルカプトエタノールに懸濁し、超音波処理、１０
０℃２分間熱処理をした後、Ｌａｅｍｍｌｉらの方法（
Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０−６８５　（１９７０）
）に従って、ＳＤＳ存在下のポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分析する。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のパターンより
、目的とする融合アクチンの分子量にほぼ相当する位置
に明確なバンドが観察きれる（全菌体蛋白質の約１５％
）、このバンドが目的物であることは、このバンド中の
蛋白質が、アクチンに対するモノクローナル抗体（アマ
ジャム・インターナショナル）が結合し得ることから確
認できた。

Ｈｉｎｄ　ｍ　−Ｈａｅ　Ｉ［［の二重切断で得られる
ｐＵＣＫＭＦ由来の約４００ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐ　
ＵＣＡＣＴをＳａｌ　Ｉ消化し大腸菌ポリメラーゼ■ク
レノー断片処理し更にＨｉｎｄｌ［［消化して得られる
ＤＮＡと連結して、ＡＰＨのアミノ末端１２残基と接続
部１残基の計１３残基をアクチンに融合化した融合化ア
クチンの発現プラスミドｐＵＣＫＭＦＡＣＴ４を得る。

このプラスミドを有する大腸菌を用いて上記と同様に融
合蛋白質を発現させたところ、ゲル上で明確なバンドは
見られなかった（全菌体蛋白質の１％以下）。

成熟アクチンのｐＵＣ系ベクターを用いた発現プラスミ
ドは、５ｃｈｏｎｅｒらが報告しているｔｗｏ−ｃｉｓ
ｔｒｏｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎの原理に従い、構
築した（Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８
１．５４０３−５４０７　（１９８４））（第９．１０
．１１図参照）、この原理による構築では、ＡＰＨのア
ミノ末端６０残基を含むコード領域とアクチン遺伝子の
間に、翻訳終止コドンＴＡＡと次のアクチン遺伝子の翻
訳開始のためのリポソーム結合配列および翻訳開始コド
ンＡＴＧを挿入しである。上流のＡＰＨ遺伝子由来の構
造の持つ高い翻訳効率を損なうことなく、成熟型アクチ
ンを発現きせようとするもので、同様の方法でいくつか
の遺伝子発現に成功していることが報告されている（Ｅ
Ｐ−１５４５３９）。

ｐＵＣＫＭＦをＰｓｔ　Ｉ消化し、更に大腸菌ポリメラ
ーゼＩクレノー断片により平滑末端とする。

この平滑末端とした部分へ市販のＸｂａ　Ｉリンカ−（
ファルマシア、５゛−リン酸リンカ−５’　−ＣＴＣＴ
ＡＧＡＧ−３’）をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、常法
に従い連結する（　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８２）　
）　、　Ｘｂａ　Ｉリンカ−を付加きれたＤＮＡを）（
ｂａ　Ｉで消化する。ＸｂａＩ消化後のＤＮＡは、フェ
ノール抽出、エタノール沈澱により回収する。得られた
直線状ＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、環状Ｄ
ＮＡとなるように自己の両端を連結する。連結反応後の
ＤＮＡを、前述と同様に大腸菌ＪＭ１０３へ導入し、得
られた形質転換菌よりプラスミドを調製し１ｉｎｄＩＩ
Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ消化により約６００ｂｐの挿入断片が切
り出されること、Ｐｓｔ　Ｉ切断点が無くなっているこ
とを確認する。このプラスミドｐ　ＵＣＫＭＦＩはｔｗ
ｏ−ｃｉｓｔｒｏｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎの発現
プラスミド以外に、融合アクチンの発現プラスミドの構
築にも利用できる（第１１図参照Ａ）。

上記ｐＵｃＫＭＦ１をＸｂａ　Ｉ消化クレノー断片処理
後、更にＥｃｏＲＩ消化する。こうして得たＤＮＡ断片
を、ｐＵＣＡＣＴのＳａｌ　Ｉ消化クレノー断片処理後
ＥｃｏＲＩ消化で切り出きれる約１　、２Ｋｂのアクチ
ンコード領域を含むＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼで
連結すると、融合アクチンの発現プラスミドとなる。こ
の融合アクチン発現プラスミド（ｐＵｃＫＭＦＡｃＴｌ
　）は、ＡＰＨのアミノ末端６０残基と接続部３アミノ
酸残基を含む融合アクチンを発現する（第１１図参照）
。

ｔｗｏ−ｃｉｓｔｒｏｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎの
成熟アクチン発現プラスミドの構築のために、先のＸｂ
ａ　Ｉリンカ−を付加したＡＰＨ遺伝子の部分を含むｐ
ＵＣベクターのＸｂａ　Ｉ　−５ｓｔ　Ｉ部位へ合成オ
リゴヌクレオチドを挿入し、第１３図に示すような塩基
配列をＡＰＨ遺伝子由来の塩基配列の下流へ含むように
する。こうして得られるベクターは、Ｎ１５ｈｉらの報
告に見られるＡＴＧベクターとして用いることができる
（　ＤＮＡ　ｇ、　２６５−２７３　（１９８３）　）
　、すなわち、適当な酵素処理により、翻訳開始コドン
を含むプロモーター、翻訳開始部位に必要な塩基配列の
供与ベクターとして用いることができる。このベクター
をＳｓｔ　Ｉ消化しクレノー断片で平滑末端化後、Ｅｃ
ｏＲＩ消化する。このＤＮＡと、ｐＵＣＡＣＴの）ｌｉ
ｎｅ　Ｉ［−ＥｃｏＲＩ消化で得られる約１．２Ｋｂの
アクチンのコード領域を含むＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結すれば、情ｏ−ｃｉｓｔｒ。

ｎ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎに従う成熟アクチンの発
現プラスミドｐＵＣＫＭＡＣＴが作成される（第１２図
参照）。目的のプラスミドであることの確認は、形質転
換菌より得られたプラスミドがＨｉｎｄ　ｍ　−Ｅｃｏ
ＲＩ消化で約１．８Ｋｂの断片を生じることと、アクチ
ンの翻訳開始コドンＡＴＧ付近の塩基配列を宝酒造のシ
ーケンスキットを用いて確認することで行なう。

ＡＰＨ遺伝子　による生産量の変化 融合に用いるＡＰＨのアミノ末端の何残基が高発現に必
須であるかを、ｐＵＣＫＭＡＣＴのＨｉｒｌｃ■部位よ
りエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１を用いてＡＰＨの融合
部分を短縮して行き発現量を調べたところ、少なくとも
２５残基のＡＰＨのアミノ末端を融合化すれば融合アク
チンは全菌体蛋白質の約１０％以上発現しうろことが判
った。

ｐＵＣＫＭＦを５ａｌｌ切断したプラスミドを、エキソ
ヌクレアーゼＢＡＬ３１で消化する。ＢＡＬ３１の消化
条件は、２０ｍＭｈリス塩酸緩衝液ｐＨ８。

０．１２ｍＭ塩化カルシウム、１２ｍＭ塩化マグネシウ
ム、０．６Ｍ塩化ナトリウムであり、ＥＤＴＡを最終濃
度が５０ｍＭとなるように加えて反応を停止する。　Ｂ
ＡＬ３１処理後の短縮される長さは、消化時間により調
節する。　ＢＡＬ３１処理後のＤＮＡは大腸菌ポリメラ
ーゼ■クレノー断片で更に処理し末端を平滑末端として
整えた後、）ｌｉｎｄＩ［ｒにより切断し、アガロース
ゲルから約４００〜６００ｂｐの断片を回収する。ｐＵ
ｃＡｃＴｅｓａｌＩ消化した後、大腸菌ポリメラーゼＩ
クレノー断片処理し、更にＨｉｎｄｌｌｒ消化したプラ
スミドと上述のＢＡＬ３１処理ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて連結する。連結反応後のＤＮＡで前述
と同様に大腸菌ＪＭＩ　Ｏ３を形質転換し、形質転換菌
はアンピシリンを含む平板寒天上で選択する。各コロニ
ーを培養し、約４０株のコロニーよりプラスミドを調製
し、Ｂｇｌ　Ｉ［消化により得られるＤＮＡ断片の大き
さからＢＡＬ３１により短縮されたＤＮＡ長を概算する
。目的とするＤＮＡの短縮長を持つクローンを選び、ア
クチンとＡＰＨ遺伝子の接続部にあたる塩基配列を、全
酒造のシーケンスキットを用いて決定する。こうして、
アクチンのコーディング領域と同じ読み取り枠を持ち、
短縮きれたＡＰＨ領域を持つアクチンの発現プラスミド
を単離することかできる。ＡＰＩ４４アミノ酸残基、結
合配列１アミノ酸残基、以下にラットアクチンを発現す
るｐＵＣＫＭＦＡＣＴ２、ＡＰＨ２４アミノ酸残基、結
合配列１アミノ酸残基、以下にラットアクチンを発現す
るｐＵＣＫＭＦＡＣＴ３を得た。

上記によって得られたベクターｐＵＣＫＭＦＡＣＴ、ｐ
ＵｃＫＭＦＡｃＴ１、ｐＵＣＫＭＦＡＣＴ２、ｐＵＣＫ
ＭＦＡＣＴ３、ｐＵＣＫＭＦＡＣＴ４、ｐＵＣＫＭＡＣ
Ｔが発現する融合蛋白質（但し、ｐＵＣＫＭＡＣＴは成
熟ラットアクチンを発現する）の概略図を第１４図に示
す。

第１５図は、各プラスミドを保持する大腸菌を培養後、
ドデシル硫酸ナトリウム存在下で破壊し、抽出可溶化き
れた蛋白質をドデシル硫酸ナトリウム存在下のポリアク
リルアミドゲル電気泳動で各融合蛋白質の産生量を分析
した結果を示す。

各融合蛋白質の量は、クーマジーブリリアントブルーＲ
２５０による染色バンド、またはニトロセルロース膜へ
転写後モノクローナル抗アクチン抗体の融合アクチンへ
の結合量から求めた。

ＡＰＨの融合部分が２５残基から１３残基アミノ酸へ減
少する（実際には、接続部として１アミノ酸残基を含む
ので、ＡＰＨのアミノ末端残基数としては、２４残基お
よび１２残基）とともに、発現量の大幅な減少が見られ
る。この発現量が低下した融合アクチンは、ｐＵＣＫＭ
ＡＣＴにより産生される成熟型アクチンの発現量と比較
すれば５〜１０倍の発現量である。

【図面の簡単な説明】

第１図はＡＰＨ遺伝子のＤＮＡ配列および該ＤＮＡ配列
から推定されるアミノ酸配列を示す、第２図はヒトＰＳ
ＴＩのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。第３図は
実施例で使用した合成ヒトＰＳＴＩ遺伝子のＤＮＡ配列
、および対応するアミノ酸配列および該ＤＮＡ配列の合
成方法を示す。第４図はＡＰＨ遺伝子近辺の制限酵素地
図を示す。第５図はｐＵｃＫＭＦＰｓＴＩ構築の概略図
である。第６図はｐＵＣＫＭＦ構築の概略図である。第
７図はラット骨格筋アクチン遺伝子のＤＮＡ配列および
該ＤＮＡ配列から推定きれるアミノ酸配列を示す、第８
図はｐＵＣＡＣＴ構築の概略図である。第９図はｐＵＣ
ＫＭＦＡＣＴ構築の概略図である。第１０図はｐＵｃＫ
ＭＦ１構築の概略図である。第１１図はｐＵＣＫＭＦＡ
ＣＴ１構築の概略図である。第１２図はｐＵＣＫＭＡＣ
Ｔ構築の概略図である。第１３図はｐＵＣＫＭＡＣＴの
構築の際の合成オリゴヌクレオチド配列が挿入された付
近のＤＮＡ配列を示す。第１４図は本実施例で発現きれ
たＡＰＨとラット骨格筋アクチンの融合蛋白質の概略図
である。第１５図はラット骨格筋アクチンに融合させた
ペプチドの長さと発現量の関係を示す。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）目的の蛋白質をＡＰＨとの融合蛋白質として微生
   物中で発現し得るベクターを該微生物中に導入し該融合
   蛋白質を産生させ、該目的の蛋白質を得ることを特徴と
   する蛋白質の製造方法。
2. （２）該ＡＰＨが、ＡＰＨのアミノ酸配列のＮ末端から
   １３個以上のアミノ酸を有することを特徴とする特許請
   求の範囲第１項に記載の製造方法。
3. （３）該融合蛋白質のＡＰＨと目的の蛋白質の間に単数
   または複数個の結合配列を有することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項に記載の製造方法。
4. （４）該結合配列がメチオニンまたはメチオニンを含む
   配列であることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記
   載の製造方法。
5. （５）該目的の蛋白質がヒトＰＳＴＩまたはラットアク
   チンであることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
   載の製造方法。
6. （６）該微生物が大腸菌であることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項に記載の製造方法。