JPS62158487A - 突然変異体コ−デイング配列 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、変異アルファ−１−抗トリプシンの発現の水
準を増加させる突然変異体アルファ−１−抗トリプシン
コーディング配列を有するイー・コ！Ｊ　（Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　）発現ベクターに関する。

免丑ム宜且 アルファ−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）は、血清および
他の種々の体液に存在するアルファ−１−グロプリンで
ある。肝臓にて合成された時、成熟ＡＡＴは、約５（１
６）（１６）〜５５（１６）０ダルトンの分子量を有す
る糖タンパク質である。ＡＡＴによって抑制されるタン
パク質分解酵素は、トリプシン、キモトリプシン、膵臓
エラスターゼ、皮膚コラーゲン、レニンおよびクロキナ
ーゼならびに多形核リンパ球のプロテアーゼを包含する
。遺伝的に獲得されたヒトのＡＡＴの欠失は、種々の病
理学的症状、特に、肺気腫および肝疾患に関係している
。

例工ば、モース、ニュー・イングランド・ジャーナル・
オブ・メデイシン（Ｍｏｒｓｅ、　Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ　。

Ｍｅｄ、　　）　、　２９９（１９）、１０４５〜１０
４８（１９７８）および２９９（２０）、１（１８）９
〜１１０５（１９７８）ｉトビンら、アルキブズ・オブ
・インターナル・メデイシン（Ｔｏｂｉｎ　ｅｔ　ａｔ
、　、Ａｒｃｈ、　Ｉｎｔ、　Ｍｅｄ、）＋１４３（７
）　、　１３４２〜１３４８（１９８２）　ｉおよびカ
レルら、ネイチャー（Ｃａｒｒｅｌｌ　　ｅｔ　　α１
、、Ｎａｔｕｒｅ）。

２９８（５８７２）、３２９〜３３４（１９８２）参照
。

エラスターゼは、肺組織を分解するプロテア−ゼである
。抑制されなければ、その活性により肺気腫を生じつる
。例えば、ガデツクら、アメリカン・レビュー・オブ・
レスピラトリー・デイズイーズ（Ｇａｄｅｋ　ｅｔ　α
１　、　、　Ａｍ、　Ｒｅｖ＋Ｒｅ５ｐｉｒ。

Ｄｉｓ、）、　１２７．５４５（１９８３）　およびグ
レイサーら、アメリカン・レビュー・オブ・レスピラト
リー・デイズイーズ（Ｇｌａｓｅｒ　ｅｔ　α１、、Ａ
ｍ、Ｒｅｖ。

Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、）、１２７．５４５〜５５３
（１９８３）は、ＡＡＴが肺気腫の治療に有用でありう
ることを示している。

その治療的有用性のゆえに、および遺伝的なＡＡＴの欠
失患者の補欠治療法のようなある種の徴候に対して比較
的多量を必要とするため、研究者は、ＡＡＴを多量に製
造する方法を探索してきた。従来、そのような方法とし
ては、血漿からのＡ　Ａ　Ｔの精製があった。例えば、
コーンら（Ｃｏａｎｅｔ　ａｔ、　）、米国特許第４３
７９０８７号参照。

カートニーら（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　ｅｔ　α１、　）、
ヨーロッパ特許出願第１１４７７７号は、イー・コリに
おけるＡＡＴ融合タンパク質の発現、ＡＡＴのＮ−末端
グルタミン酸残基の欠失を開示している。カートニーら
（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　ｅｔ　α１、　）は、イー−コリ
における未融合ＡＡＴの発現か非常に低いことを報告し
ている。

カートニーら、ネイチャー（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　ｅｔ　
α１、。

Ｎａｔｕｒｅ　）、３１３，１４９（１９８５）は、イ
ー−コリにおける活性部位突然変異を有する変異ＡＡＴ
の合成を報告している。

ボレンら（Ｂｏｌｌｅｎ　ｅｔ　ａｔ、）、ベルイー特
許第８９５９６１号は、ｐＢＲ３２２のＰｓｔ　Ｉ部位
中にクローンしたヒト肝臓細胞に由来するポＩＪＡ−Ｒ
ＮＡから逆転写したｃＤＮＡの１．４キロ塩基対（ｋｂ
）フラグメントからなるプラスミド、ｐＵＬＢ　１５２
３　に関するイー・コリにおけるＡＡＴのクローニング
を開示している。ボレンら（Ｂｏｌｌｅｎ　ｅｔ’ａ１
．　）は、ｃＤＮＡフラグメントが本来の翻訳開始コド
ンを包含する全ＡＡＴ遺伝子を含むことを開示している
。

ポレンら、デー・エヌ・ニー（Ｂｏｌｌｅｎ　ｅｔ　α
１、。

ＤＮＡ）、ヱ、　２５５（１９８３）は、イー・コリに
おけるベータ・ラクタマーゼ・ＡＡＴ融合タンパク質の
発現を生じさせる発現ベクター、ｐＵＬＢ１５２３およ
びｐＫＴ２８７を開示している。

ボレンら、エフ・イー・ビー・ニス・レターズ（Ｂｏｌ
ｌｅｎ　ｅｔ　α１、、ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔｅｒｓ）
、１１６（１）。

６７〜７。（１９８４）は、ラムダプロモーター、ＰＲ
を用いたイー・コリにおけるＡＡＴの発現を報告し、イ
ー・コリ由来ＡＡＴの生物活性を明らかにする試みか不
成功に終ったことを報告している。

パーカーら（Ｐａｒｋｅｒ　ｅｔ　α１、　）　、オー
ストラリア特許出願３１８０１／８４は、イー・コリに
おけるＡＡＴの発現を開示している。

マンソンら、ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカ
ル・メソッズ（Ｍｕｎｓｏｎ　ｅｔ　α１、、　Ｊ−Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、）、１７７．６６３〜６８３（１９
８４）　　は、ベーターガラクトシダーゼの発現を増大
させるイー・コ！ＪｌａｃＺ遺伝子の突然変異を報告し
ている。

メイヤーズら、サイエンス（Ｍｙｅｒｓ　ｅｔ　α１−
＋５ｃｉｅｎｃｅ　）　、　２２９　、２４２（１９８
５）は、表現型選択を入く突然変異体ＤＮＡ分子を同定
するための電気泳動法を報告している。

発明の要約 １つの態様において、本発明は、突然変異かコドン１〜
１５の範囲内のＡＡＴコーディング配列の変化からなり
、ただし、該突然変異が本来のコーディング配列の第１
コドンのコドンＡＴＧへの置換以外またはその追加であ
る突然変異体ＡＡＴコーディング配列を含有することを
特徴とする組替え型ＤＮＡ分子に関する。

もう１つの態様において、本発明は、その中に活動的に
挿入したＤＮＡ分子を有するイー・コリ発現ベクターお
よび本発明の発現ベクターにて形質転換したイー・コリ
に関する。本発明は、また、許容条件下、本発明の形質
転換イー・コリを培養し、かつ、そのようにして産生じ
たＡＡＴを単離することを特徴とするＡＡＴの生物活性
、すなわち、抗トリプシンおよび抗エラスターゼ活性を
有するポリペプチドの製造法に関する。

もう１つの態様において、本発明は、ＡＡＴの生物活性
を有し、かつ、１〜１５位の範囲内の変化したアミノ酸
配列を有するが、ただし、該変化が成熟ＡＡＴの第１位
のグルタミン酸残基の置換以外またはその追加である変
異ＡＡＴタンパク質；該変異ＡＡＴタンパク質および医
薬上許容される担体からなることを特徴とするヒトを含
む動物の肺のエラスターゼ活性を抑制する医薬組成物；
該動物に抗エラスターゼ有効量の該変異ＡＡＴタンパク
質を内用投与することを特徴とする、ヒトを含む動物の
肺のエラスターゼ活性の抑制方法に関する。

さらにもう１つの態様において、本発明は、（ｉ）本来
のコーディング配列の全部または一部を選択できる表現
型のコーディング配列に結合し、それにて適当な宿主を
形質転換し、生じた翻訳融合の発現を定量し、（１１）
問題のポリペプチドのコーディング配列の全部または一
部を突然変異誘発させ、＋＊；ｒ）もとの翻訳融合の発
現以上に増加した突然変異翻訳融合の発現を検定し、ａ
ｖ）（ｉｉｉ）において、発現の増加を示した融合にお
ける問題のポリペプチドのコーディング配列の突然変異
体部位のヌクレオチド配列を決定し、問題のポリペプチ
ドのコーディング配列中に突然変異を有する融合を選択
し、ｆＶｌそれが該突然変異体コーディング配列と同じ
１または２以上の突然変異を含む以外は問題の生成物の
本来のコーディング配列と同じコーディング配列を調製
し、それにて適当な宿主を形質転換し、位）該突然変異
体コーディング配列が本来のコーディング配列より多く
の量にて転写され、翻訳される（Ｖ）からの形質転換体
のクローンを選択することを特徴とする本来のコーディ
ング配列より多くの量にて転写され、翻訳される問題の
ポリペプチドの突然変異体コーディング配列の同定法か
らなる。

発明の詳説 該タンパク質の生物活性を損うことなく、すなわち、該
タンパク質によるプロテイナーゼ、特に、エラスターゼ
抑制を損うことなく成熟ＡＡＴのＮ−末端のコーディン
グ配列を変化させることにより、細菌の活性ＡＡＴの発
現を顕著に、かつ、予期できない程改善できることが今
回判明した。本発明の組替え型ＤＮＡ分子を用いると、
細菌中にて、抗トリプシンおよび抗エラスターゼ活性を
有する変異ＡＡＴタンパク質を本来のＡ　Ａ　Ｔの債よ
り２倍またはそれ以上多くの量にて発現させることがで
きる。本発明の好ましい具体例において、発現した変異
ＡＡＴの量を本来のＡＡＴより１（１６）倍またはそれ
以−ヒとすることができる。本明細書にて用いる本来の
ＡＡＴまたはＡＡＴは、Ｎ−末端アミノ酸としてＧｌｕ
　−Ａｓｐ　−ＰｒｏならびにＧｌｕおよびＡｓｐ間の
Ｂａｍ　ＨＩにて本来のコーディング配列を開裂させる
ことにより得られたＭｅｔ　−Ａｓｐ−Ｐｒ。

構成体を有する後記第１表に示した成熟ＡＡＴを意味す
る。後記実施例２参照。本明細書にて用いる変異ＡＡＴ
は、本来のＡＡＴの主要アミノ酸配列と異る主要アミノ
酸配列を有する。突然変異体ＡＡＴコーディング配列は
、後記第１表に示した本来のＡＡＴに対するコーディン
グ配列と異るコーディング配列である。したがって、本
発明の組替え型ＤＮＡ分子は、例えば、クローニングま
たは発現ベクターのような単離された、あるいはより大
きなりＮＡ分子の内部にあるいずれかの突然変異体コー
ディング配列である。本発明の組替え型ＤＮＡ分子は、
本明細書にて説明したように標準合成法もしくは遺伝子
工学法またはその両者の組合せによって製造される。

本発明の組替え型ＤＮＡ分子の範囲内に含まれるコーデ
ィング配列は、アミノ酸配列に影響しない１または２以
上の塩基対の置換および／または最初の１５コドンの範
囲内の置換、付加または１もしくは２以上のコドンの二
べ失からなる。本明細書にて例示している本発明の典型
的な組替え型ＤＮＡ分子内の変異ＡＡＴコーディング配
列、その製造および使用を比較のため本来のＡＡＴの最
初の２０コドンと同様に後記第１表に示す。変異塩基対
ζこは下線を引いている。

本発明の組替え型ＤＮＡ分子によって、イー・コリにて
発現したＡＡＴまたは変異ＡＡＴの量を全細胞タンパク
質の百分率に換算して以下の第２表に示す。名称ｎ　ｃ
ｒｏ　ｎを有するプラスミド発現ベクターを除く記載し
た全てのプラスミド発現ベクターは、ラムダおよびｃ■
リポソーム結合部位の左方プロモーター（ＰＬ）を用い
る。ＣｒＯベクターはＰＬおよびｃｒｏ　’）ボソーム
結合部位を用いる。該プラスミド製造を後記実施例に記
載する。

報告した代表的な発現データはナリジキシン酸誘発また
は括弧内のデータの場合は熱誘発により得られた。モッ
トら、プロシーディンゲス・オブ・ナンヨナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンシーズ・ニー・ニス・ニー（Ｍｏ
ｔｔ　ｅｔ　α１、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａａ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）、　８２
　、８８（１９８５）参照。

第２表は、また、それぞれのベクターの産生物の名称を
示している。

第　　　２　　　表 熱誘発を用いる場合（例えば、エム・ローゼンベルグら
、メソッズ・オブ・エンディモロジー（Ｍ、　Ｒｏｓｅ
ｎｂｅｒｇ　ｅｔ　α１、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ、）、１０１゜１２３〜１３８（１９８３）参照）
、ＡＡＴ産生は、ナリジキシン酸誘発により達成された
産生の約１／３である。例えば、ｐＯＴｓｃｔＩＢｃｌ
を用いた場合、変であった。

前記の組替え型ＤＮＡ分子は例示にすぎない。

塩基対の別の置換または追加の置換およびコドンの欠失
は、分子遺伝学の分野の公知方法により行なうことがで
きる。細菌の発現水準に対するそのような突然変異の効
果は、例えば、ボレンら、ディー・エヌ・ニー（Ｂｏｌ
ｌｅｎ　ｅｔ　α１　＋　ＤＮＡ）＋　２　＋２５５（
１９８３）により開示されているようなＥＬ　Ｉ　ＳＡ
によるような公知方法によって容易に決定できる。

生じたタンパク質の活性は、カートニーら（Ｃｏｕｒｔ
ｎｅｙ　ｅｔ　α１、　）、ヨーロッパ特許出願第１１
４７７７号；カワサキら（Ｋａｗａｓａｋｉ　ｅｔ　α
１、）、ヨーロッパ特許出願第１０３４（１８）号およ
びトラビスら、米国特許第４４９３８９１号に開示され
ているようなエラスターゼおよびトリプシン抑制に対す
るような公知のスクリーニングにて容易に検定できる。

本発明の他の代表的ＤＮＡ分子は、該突然変異体コーデ
ィング配列が、ＡＡＴのアミノ酸配列の変化の原因とな
る１または２以上の塩基対の置換によって、本来のＡＡ
Ｔのそれと異るような分子である。

該ＡＡＴコーディング配列が、ＡＡＴコーディング配列
の５′末端における突然変異に追加する突然変異である
組替え型Ｄ　Ｎ　Ａ分子も本発明の範囲内である。例え
ば、該コーディング配列をｐＨＪｃｔ□−２および−４
におけるようなＮ−末端Ｍｅｔ融合のような１または２
以上の追加のアミノ酸もしくはポリペプチド、またはカ
ートニーら（Ｃｏｕｒｔｎｅｙｅｔ　α１、）、ヨーロ
ッパ特許出願第１１４７７７号またはボレンら、ディー
・エヌ・ニー（Ｂｏｌｌｅｎ　ｅｔａｔ、、ＤＮＡ）、
２，２５５（１９８３）に開示されているような融合な
どのコーディング配列の５′および／または３′末端に
融合することかできる。標品ＡＡＴに対するインフルエ
ンザ・クイルスＮＳＩコーディング配列のＮ−末端部分
の融合は、ＡＡＴＩＸイブリッドの発現を増加させる。

該コーディング配列は、また、該５′−末端以外のコー
ディング配列の領域内の塩基対の置換またはコドンの欠
失からなりうる。本来のコーディング配列にて得られる
発現水準、例えば、イー・コリにおいて全細胞タンパク
質の約０．３％以下の発現以上に発現水準を低下させる
かまたは活性を妨害するフレームシフト突然変異、ナン
センス突然変異または活性部位突然変異のような生じた
タンパク質の生物活性を減少させる突然変異は、当然本
発明から除外される。許容できる活性部位突然変異の例
としては、カートニーら、ネイチャー（Ｃｏｕｒｔｎｅ
ｙ　ｅｔ　α１、。

Ｎａｔｕｒｅ　）、３１３，１４９（１９８５）および
ニス・ローゼンベルグら、ネイチャー（Ｓ、　Ｒｏｓｅ
ｎｂｅｒｇ　ｅｔα１、、　Ｎａｔｕｒｅ　）　、　３
１２．１（１９８４）に開示されているように、３５８
位におけるメチオニンアミノ酸のベリン残基への変化か
挙げられる。本発明の変異ＡＡＴは、また、例えば、ミ
トラ（Ｍｉｔｒａ）、米国特許第４４９６６８９号に開
示されているような他の分子と結合または複合させるこ
とができる。

前記のごとく、該ＡＡＴコーディング配列の５′末端な
らびに他の部位に対する突然変異は、公知の方法によっ
て行なうことができる。ある種のそのような有効な方法
の報告に関しては、景トシュタインら、サイエンス（Ｂ
ｏｔｓｔｅｉｎ　ｅｔ　α１、。

Ｓｃ’１ｅｎｃｅ　）ｔ　２２９，１１９３（１９８５
）参照。これらは、例えば、制限エンドヌクレアーゼに
て、該コーディング配列を処理し、所望により、ついで
、エクソスクレアーゼ、例えば、Ｂａ１３１またはマン
グビーン（ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ　）ヌクレアーゼにて処
理することによるコドンのニベ失を包含する。そのよう
な欠失後、合成配列を挿入して、該欠失部位の全部また
は一部を置換する。また、化学的突然変異誘発剤または
放射線照射を用いたＡＡＴコーディング配列を保有する
形質転換体の処理によって突然変異を誘発させることが
できる。ＡＡＴの発現および最初の２０フドンのヌクレ
オチド配列付けによって、５′部位の変化した突然変異
体を選択することができる。そのような突然変異誘発実
験は、好都合ζこは、例えば、４５塩基対ＢａｍＨＩ　
−Ｂｃｌ　ＩフラグメントなどのＮ−末端ＡＡＴコーデ
ィング配列、例えば、ガラクトキナーゼおよびベータ・
ガラクトシダーゼなどの選択できる表現型の遺伝子の上
流の融合およびアップ−ミューチージョン、すなわち、
選択できる表現型の遺伝子の発現の水準の増加を示す突
然変異体のスクリーニングによって行なわれる。

かくして、本発明のもう１つの態様は、本来のコーディ
ング配列より高い水準にて突然変異体を転写し、翻訳す
る問題とするいずれものポリペプチドのコーディング配
列の突然変異体の同定法に関する。この方法は、問題の
産生物の本来のコーディング配列の全部または一部を容
易に選択できる機能のコーディング配列の５′または３
′末端に結合することにより行なうことができる。好ま
しくは、本来のコーディング配列の一部は、該５′末端
からの一部、例えば、選択できる機能のコーディング配
列の５′末端に融合している４５塩基対である。

選択できる機能は、選択できる表現型を与えるいずれも
の機能および、好ましくは、その発現を相対的に定量で
きる機能である。例えば、相対的発現を指示板、例えば
、マツコンキー（Ｍａｃ−（、ｏｎｋｅｙ　）ガラクト
ース（Ｄｉｒｃｏ　）上にて色変化により定量できるの
で、選択できる機能をガラクトキナーゼ活性とすること
ができる。ガラクトキナーゼ翻訳融合は、例えば、ホイ
ステルスプＵイトら、ディー゛エヌ“ニー（Ｈｅｕｓｔ
ｅｒｓｐｒｅｕｔｅｅｔ　α１、、　ＤＮＡ）、　３．
３７７〜３８６（１９８４）に記載されている。他の例
としては、Ｘ　−Ｇα１または０ＮＰＧを含有する栄養
寒天からなる指示板（例えば、ジエイ・エッチ・ミラー
、エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・バイオロジ
ー、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、
ニューヨーク（Ｊ、Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉ
ｍｅｎｔｓ　　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）、　１９７２
　＃照）上の色変化によって相対的に定量できるベータ
ガラクトシダーゼが挙げられる。

ついで、そのような翻訳融合を、例えば、突然変異誘発
遺伝子株に継代することにより、または、マンソンら、
ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカル・メソツズ
（Ｍｕｎｓｏｎ　ｅｔ　α１、、　Ｊ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）、　１７７、６６３〜６８３　
（１９８４）に開示されているようなヒドロキシルアミ
ンなどの突然変異誘発剤にてｌｎ　　ｖｉ　ｔｒｏで処
理することにより突然変異を誘発させる。ジエイ・エッ
チ・ミラー、エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・
バイオロジー、コールド・スフリング・ハーバ−・ラボ
ラトリ−、ニューヨーク（Ｊ−Ｈ，Ｍｉ　ｔｉｅｒ　。

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）
　＋１９７２　も参照。選択できる機能の発現を増大さ
せるために、突然変異形質転換体または突然変異誘発し
たプラスミドにて形質転換した宿主をクローニングおよ
びスクリーニングする。ついて、そのような発現の増加
を示すクローンからのプラスミドを単離し、問題のポリ
ペプチドの部分コーディングのＤＮＡ配列によって分析
する。これらの−プラスミドのいくつかを間頭の産生物
のコーディング配列にて突然変異誘発させる。ついで、
この部分の突然変異を標準合成／組替え型ＤＮＡ法によ
る問題の産生物の全コーディング配列中に挿入する。そ
のような突然変異体コーディング配列を発現ベクターに
挿入し、宿主細胞に導入する。該形質転換体をクローン
し、問題のポリペプチドの発現を検定する。ある場合に
は、異るプラスミドの無関係な突然変異が発現の増加を
引き起すことか見い出される。そのような突然変異は、
ｐＨＪａ□−７の場合におけるように単一の変異コーデ
ィング配列に結合しつる。後記実施例９逐照。

本発明のベクターを調製するため該突然変異体ＡＡＴコ
ーディング配列を挿入する発現ベクターは、当該分野に
おいて公知であり、入手可能な多数の細菌発現ベクター
のいずれかとすることができる。調節可能な発現ベクタ
ーが好ましい。「調節可能」なる語は、挿入したコーデ
ィング配列の転写は構成要素では々いが、例えば、変異
誘発剤の該培養培地への添加または加熱によって誘発で
きることを意味する。イー・コリ発現ベクターの例トし
ては、特に、ポレンら、エフ・イー・ビー・ニス・レタ
ーズ（Ｂｏｌｌｅｎ　ｅｔ　α１、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅ
ｔｔ、）。

１６６．６７（１９８４）に記載されているｐＣＱＶ２
およびエム・ローゼンベルグら、メソッズ・オブ・エン
ザイモロジー（Ｍ、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　α１
、。

Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、）、　１０１　、１２３〜１
３８（１９８３）に記載されているｐＡＳ　１か挙げら
れる。ｐＡｓｌは、複製のｐＢＲ３２２ｉ、抗アンピシ
リンマーカーおよび調節部位、すなわち、ラムダの左方
プロモーター（ＰＬ）、Ｎ−抗終止機能認識部位（Ｎｕ
ｔＬおよびＮｕｔ　Ｒ）、ｒｈｏ依存転写終止信号（ｔ
Ｒｌ）および以下のとおり ＊ ５’　、、、、、　ＣＡＴＡＴＧ　ＧＡＴＣＣ，、、、
、，３’〔式中、＊はＢａｍＨＩについての開裂部位を
表わす〕のＢａｍＨＩ　開裂部位によってそのＧ残基を
直ちに生じるｃ［［翻訳開始部位を含むｃ■リポソーム
結合部位からなるラムダからの一連のフラグメントを有
する。

ｐＡｓｌは、ｐＫｃ３０ｃ［［のｃｌｌ−ｐＢＲ３２２
結合においてＢａｍ　ＨＩ部位からくクレオチドを入夫
させてｃＩＩＡＴＧとし、かつ、該分子を再結合してＡ
ＴＧの直ぐ下流のＢａｍＨ１部位を再生することにより
ｐＫｃ３０ｃＵ　　から誘導できる。ｐＫｃ３０ｃＩｌ
は、ｃ■遺伝子を有するラムダからの１．３　ｋｂ　Ｈ
ａｅ■フラグメントをｐＫｃ３０のＨｐａ　Ｉに挿入す
ることによって製造される。シャツラマンら、「エクス
ペリメンタル・マニピユレーション・オブ・ジーン・エ
クスプレッション」、エム・イノクエ編、アカデミツク
・プレス、ニューヨーク（Ｓｈａｔｚｍａｎｅｔ　α１
、、　ｉｎ　／′Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔα１　Ｍａｎｉ
ｐｕｌａｔｉｏｎｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ、′’　　Ｅｄｉｔ、　ｂｙ　Ｍ、Ｉｎｏｕｙｅ＋Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　
）（１９８３）およびエム・ローゼンベルグら（Ｍ、　
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　ｅｔα１、　）前記文献を参照。

ｐＫｃ３０は、シミタケら、ネイチャー（Ｓｈｉｍｉｔ
ａｋｅ　ｅｔ　α１、、　Ｎａｔｕｒｅ　）　。

２９２．１２８（１９８１）に記載されている。それは
、ｐＢＲ３２２のｔｅｔ　Ｒ遺伝子のＨ４ｎｄ　［１お
よびＢａｍＨ１部位の間に挿入されたラムダの２．４　
ｋｂ　Ｈ４ｎｄＩＩＩ　−ＢａｍＨＩ　フラグメントを
有するｐＢＲ３２２誘導体である。ｐＡＳ　１に類似す
る構造が、カートニーら、ネイチャー（Ｃｏｕｒｔｎｅ
ｙ　ｅｔ　α１、、Ｎａｔｕｒｅ）。

３１３．１４９（１９８５）　　およびコテビイツら、
ジーン（Ｋｏｔｅｗｉｃｚ　ｅｔ　α１、、Ｇｅｎｅ）
、３５，２４９（１９８５）に記載されている。該コー
ディング配列は、その中に、例えば、調節成分に対して
正確な配置および適正な解読フレームにて標準方法によ
って活動的に挿入される。

他のクローニングおよび発現系が、他の細菌、例えば、
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）　、ストレプトミセス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　、コリネバクテリウム
（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）およびその他に
おいて本発明の突然変異体ＡＡＴコーｒイング配列を発
現させることか知られており、利用できる。

天然に生成する多形球核のいずれかを本発明の実施のた
めの出発物質として用いることかできる成熟した本来の
ＡＡＴのコーディング配列は、例えば、ボレンら（Ｂｏ
ｌｌｅｎ　ｅｔ　α１、）、ベルイー特許＄８９５９６
１号；ボレンら、ディー・エヌ・ニー（Ｂｏｌ　ｆｅｎ
　ｅｔ　α１、、　ＤＮＡ）、　３．２５５（１９８３
）　逼カートニーら（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　ｅｔ　ａｔ、
）、ヨーロッパ特許出願第１１４７７７号；カワサキら
、「ザ・モレキュラー・バイオロジー・オブ・イースト
」、１９８３年８月１６〜２１日、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｋａｗａｓａｋｉ　ｅ″
ｔａ１．。

”Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ
　Ｙｅａｓｔ、”Ａｕｇｕｓｔ１６〜２１．１９８３　
、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ；ロングら、ストラフチャー・アンド・オー
ガンゼーンヨン・オブ・ジーンズ■、アブストラクト陽
２５　（Ｌｏｎｇ　ｅｔ　α１、、　５ｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ　ａｎｄ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆ　Ｇｅ、ｎ
ｅｓ　１．　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ、２５　）　（１
９８３）　；クーら、「フロム・ジーン・トクー・プロ
ティン：トランスレーション・インドクー・バイオテク
ノロジー」、アームドら編、アカデミツク・プレス、ニ
ューヨーク（Ｗｏｏ　ｅｔ　α１、、　”Ｆｒｏｍ　Ｇ
ｅｎｅ　ｔ。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　：　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　１ｎｔ
ｏ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＋”ｅｄｉｔ−ｂｙ　
Ａｈｍｅｄ　ｅｔ　α１、、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）（１９８２）　；クラチら
、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンンーズ・ニー・ニス・ニー（Ｋｕｒａ
ｃｈｉ　ｅｔα１、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ−３ｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）、　７８　＋６８２６（
１９８１）ｉパーカーら（Ｐａｒｋｅｒ　ｅｔ　ａｔ、
）、オーストラリア特許出願第３１８０１／８４号；お
よびコスタンツオら、イー・エム・ビー・オー・ジャー
ナル（Ｃｏ５ｔａｎｚｏ　ｅｔ　α１、、ＥＭＢＯＪ−
）、２゜５７（１９８３）に記載されているような肝臓
細胞からの選択したメツセンジャーＲＮＡ群の逆転写に
よって標準的方法により得ることができる。

変異ＡＡＴは、許容条件下、本発明の発現ベクターにて
形質転換した微生物または細胞を培養することによって
本発明の方法に従って産生される。

「許容条件」なる語は、その条件下にてＡＡＴの発現を
誘発する培養条件、例えば、分解物、代謝産物、他の培
地成分および温度を意味する。代表的には、形質転換し
たイー・コリは、誘発以前の対数期増殖（Ａ６５０　約
０．４〜０．６）まで、ついで、該ポリペプチドの回収
可能量が発現されるまで誘発後さらに１．５〜５時間、
通気しつつ選択した圧力下、同化できる炭素および窒素
源を含有する栄養培地にて培養される。

イー・コリまたは他の微生物にて発現される本発明の変
異ＡＡＴは、標準的タンパク質単離法により産生培養か
ら単離される。代表的には、精製法は、１）細胞の粉砕
、２）該細胞抽出物の清澄化、３）該変異ＡＡＴ分子の
分離、および４）残留ポリペプチド、炭水化物、核酸お
よび／またはリポ多糖類を含む残留不純物を除去するた
めの最終精製からなる。

第１工程は、例えば、リゾチームまたは他の溶解または
透水剤の添加によりまたは機械的もしくは超音波粉砕に
より行なうことができる。該タンパク質の外部化の他の
手段としては、アクア−バッハおよびローゼンベルグ（
Ａｕｅｒｂａｃｈ　ａｎｄＲｏｓｅｎｂｅｒｇ　）　、
ヨーロッパ特許出願第０１４０８６４号に開示されてい
るような温度感受性溶菌細菌の使用が挙げられる。該ポ
リペプチドを該細胞抽出物の中に沈殿させる場合、変性
剤を加えてそれを再溶解することができる。そのような
方法はよく知られている。これらのいくつかは、ビルダ
ーら（Ｂｕｉｌｄｅｒ　ｅｔ　α１、）、ヨーロッパ特
許出願第１１４５０６号に報告されている。特に本明細
書に示されている変異ＡＡＴ分子は、ＡＡＴＤ１５を除
いて標準イー・コリ抽出物に可溶である。

ついで、溶液中の変異ＡＡＴ分子を標準方法により分離
する。これらの方法としては、例えば、硫酸アンモニウ
ムの添加（飽和の６０〜８０％）、ついで再溶解などに
よる変異ＡＡＴの選択的沈殿か挙げられる。ついで、該
変異ＡＡＴ含有溶液をＤＥＡＥ−セルロース、コンカナ
バリンＡセファロース、フェニルセファロース、ジスル
フィド結合リガンド、逆相ＨＰＬＣおよびその調製がレ
イズら、ネイチャー（Ｌａｔｈｅ　ｅｔ　α１、、　Ｎ
ａｔｕｒｅ　）　、　２８４゜４７３〜４７４（１９８
０）によって開示されている抗ＡＡＴ抗体使用アフイニ
テイカラムなどを用いる一連の１または２以上のクロマ
トグラフィ一工程に付すことができる。投与用の医薬上
許容される希釈物に再溶解する前に精製した変異ＡＡＴ
を凍結乾燥することができる。

該変異ＡＡＴ分子は、ｐＨ約５．５以下にて不安定な傾
向にある。該タンパク質は、室温にて１〜２日間、４℃
にて相当長期間安定である。精製したＡＡＴの貯蔵には
、代表的には、リン酸ナトリクム緩衝液（ｐＨ８）が用
いられる。

好ましい精製法は、本発明の変異ＡＡＴタンパク質の不
純溶液と予め不溶性担体マ）　ＩＪッ□クスにカップリ
ングしたカッパ（Ｋ）−鎖を接触させることからなる置
換クロマトグラフィー法である。ローレルラ、ヨーロピ
アン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｌａｕ
ｒｅｌｌ　　ｅｔ　α１、、　Ｅｕｒ、　　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、５７．１０７〜１１３（１９７５
）；　ローレル、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィ
ツク・サイエンス（Ｌａｕｒｅｌｌ、　Ｊ、　Ｃｈｒｏ
ｍａｔ、　）、　１５９．２５〜３１（１９７８）ｉ　
ローレル、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィツク・
サイエンス（Ｌａｕｒｅｌｌ。

Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔ、）、２７８．５３〜６１（１９８
３）参照。

Ｋ−鎖は骨髄腫患者の尿から誘導でき、公知の方法−に
より適当な担体マトリックスに結合できる。

担体マトリックスとしては、例えば、アガロース、アフ
イーゲル■、デキストラン、セルロース、ポリスチレン
、ポリアクリルアミド、シリカ、ナイロン、アクリル酸
共重合体およびポリエステルが挙げられる。

本発明の変異ＡＡＴはプロテアーゼ抑制剤として有用で
あり、不十分なＡＡＴ活性により引き起される肺気腫の
治療に用いることができる。そのような不全症は、喫煙
などによるＡＡＴの酸化またはＡＡＴ産生の遺伝子入夫
により生じつる。例えば、ガデツクら、アメリカン・レ
ビュー・オブ・レスピラトリー・デイズイーズ（Ｇａｄ
ｅｋ　ｅｔ　α１、。

Ａｍ、Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、）、　１２
７　、５４５（１９８３）は、同型接合ＡＡＴ入失入着
患者経口置換療法におけるＡＡＴの有用性を示した。該
変異ＡＡＴの他の用途としては、抗体産生、種々のタン
パク質のクロマトグラフィー精製における結合剤として
の用途および混合物または溶液に含有されているタンパ
ク質のプロテアーゼ抑制が挙げられる。さらに他の用途
としては、肝臓炎および大傷の治療（シュルツ；　（５
ｃｈｕｌｔｚｅ　ｅｔ　α１、）、米国特許第３２９３
２３６号参照）および血清ＡＡＴ入失患者の診断に用い
る抗体の産生用が挙げられる。そのような使用は、それ
ぞれの分野における当業者に公知の方法によって行なう
ことができる。

本発明の変異ＡＡＴはＡＡＴ活性を有し、免疫学的にＡ
ＡＴと密接に関連している。したがって、それはＡＡＴ
と同じ方法にて用いることができる。

特に、該変異ＡＡＴは、医薬上許容される担体への溶解
、内用投与、典型的には静脈投与用の標嘔方法などによ
って処方できる。医薬上許容される担体は公知である。

静脈投与に適したそのような担体としては、例えば、塩
化ナトリウム、酢酸塩、グルコース、マンニトールおよ
びアルブミンの溶液が挙げられる。該変異ＡＡＴは、ま
た、ミトラ（Ｍｉｔｒａ）、米国特許第４４９６６８９
号に開示されているような医薬上許容される賦形剤と複
合体を形成しつる。投与する用量および回数は、疾患の
性質および程度ならびに用いる特定の変異分子の活性に
より変化する。同型接合ＡＡＴ入失入着患者合、投与す
る用量および回数は、血清ＡＡＴ活性を標準の少なくと
も３５％に近づける濃度に維持するように選択される。

典型的には、投与量は、ＡＡＴに匹敵する活性を有する
変異ＡＡＴを１週間につき１〜１５ｇ、好ましくは２〜
１０ｇ、静脈注入する。活性部位のような該タンパク質
の他の部位の突然変異によるより安定した活性を示す変
異分子は、より低用量および／またはより少ない回数に
て投与することができる。

実施例 以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

全ての制限エンドヌクレアーゼは商業源から入手し、実
質的に販売者の指示に従って使用した。

実施例１ ｐ　ＯＴＳ、Ｉ　Ｂｃ　１ ｃＤＮＡクローンｐＵＬＢ　１５２３　（ニー・ボレン
（Ａ、　Ｂｏｌｌｅｎ　）　、ベルイー特許第８９５９
６１号から入手）からヒ）ＡＡＴ遺伝子を単離した。全
ｃＤＮＡクローンを包含するＰｓｔ　Ｉフラグメントに
関する遺伝子を得た。

ｐＵＣ９（ペテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ゲイ
ザースブルグ、メリーランド（ＢｅｔｌｅｓｄａＲｅｓ
ｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　Ｇａｉ
ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　）から入手した複数の特異的部位を
有するＭｌ　３からのフラグメントを含有するｐＢＲ３
２２ベクター）の特異的Ｐｓｔ　Ｉ部位中に該ＰｓｔＩ
フラグメントを挿入した。この析規逐ベクターをエンド
ヌクレアーゼＳａｔ　Ｉにて消化し、Ｐｓｔ　Ｉ部位の
下流側の１０　ｂｐをｃＤＮＡフラグメントの３′末端
に配置した特異的切断を得た。該線形ベクターをエンド
ヌクレアーゼＢａ１３１で処理して、該ＡＡＴ遺伝子の
３′末端に続＜ＧＣ尾部を除去した。条件は以下に示す
とおりである。全容＠２（１６）ｍＱ中にＣａＣｌ２０
．４　ｍＭ　、　ＭｇＣｌ２０．４　ｍＭ　、　ＮａＣ
１４０ｍＭ、　　ト　リ　ス　（ｐＨ８）　　２４　ｍ
Ｍ　％　ＥＤＴＡ　０．２ｍＭおよびＤＮＡ４０ｍｇｏ
該反応物を３０℃にて２分間インキュベートし、２０弔
位のエンドヌクレアーゼＢａ１３１（ベテスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ、ゲイザースブルグ、メリーランド
から入手）を加えた。１５秒ごとに該混合物から２５ｍ
Ｑずつ除去し、５０ｍＭの最終濃縮物にＥＤＴＡを加え
て反応を止めた。１分の時点のＤＮＡの分析から、該Ｇ
Ｃ尾部が該ＡＡＴ遺伝子の３′末端から除去され、該遺
伝子はＡＡＴの停止コドンの下流４０塩基対を保有して
いることが判明した。

クレノーＤＮＡポリメラーゼ（マニアテイスら、モレキ
ュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル
、１９８２、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラ
トリ−、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨー
ク（Ｍａｎｉａ’ｓ　ｅｔ　α１、　。

Ｍｂｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｊｎｇ：　Ａ　　１ａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａＪ。

１１８２、　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）を用いて該ＤＮＡを
充填して平滑末端分子を形成し、コルラボラテイブ・リ
サーチ・ラボラトリーズ、レキシントン、マサチューセ
ッツ（Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｌｅｘｉｎｇｔｉｏｎ、
　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手したＸｈｏ　
Ｉリンカ−を挿入して（マニアテイスら（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　ｅｔ　ａｔ、）　）　、構造ｐＵｃ、１−２を得
た。

Ｘｈｏ　ｒおよびＢｃｌＩベルト切断にてＡＡＴ遺伝子
の５′末端における開始コドンの下流側の４５ｂｐを消
化することによってｐＵＣ，−２からＡＡＴ遺伝子を単
離した。標準結合方法（マニアテイスら（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　ｅｔ　α１、）　）を用いてＢａｍ　ＨＩおよび
ＸｈｏＩにて消化した発現ベクターｐＯＴＳＶ中に該ｃ
ｌ 遺伝子を挿入した。生じた構成体ｐＯＴＳｃｔ工は、本
発明の発現ベクターである。それは、該遺伝子の成熟５
′末端の最初の１５アミノ酸を除く全ＡＡＴをコードす
る変異ＡＡＴ遺伝子を含有する。

転写ターミネータ−を保有する１８９塩基対フラグメン
ト、ＯＯＰターミネータ−をｐＡｓｌのＢａｍ　ＨＩ部
位の下流側のＮｒｕ　Ｉ部位に挿入することにより、お
よび合成リンカ−（Ｘｂａ　Ｉ、ＸｈｏＩ。

５ａｃＩ）をＢａｍ　Ｈ１部位および加えたターミネー
タ−の間のＳα１　Ｉ部位に挿入することによりｐＡｓ
　ＩからｐＯＴＳＶ（デバレら、セル（Ｄｅｖａｒｅ　
ｅｔ　α１、。

Ｃｅ１ｌ）、３６．４３〜４９（１９８４））を誘導し
た。

イー・コリの溶原性ｈｔｐ　Ｒ１６５株（クーパーら、
モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテイツクス
（Ｃｏｏｐｅｒ　ｅｔ　α１、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、
　Ｇｅｎｅｔ、）。

１３９．１６７（１９７５）ｉベーカーら、プロシーデ
ィンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ
エンシーズ・ニー・ニス・ニー（Ｂａｋｅｒ　ｅｔα１
、　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）　ｓ＋ ８１．６７７９（１９８４））および野生型ｃＩ欠失に
１２溶原菌を標準方法（マニアティスら（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓｅｔ　ａｔ、））によりｐＯＴｓｃｔＩＢｃｌにて
形質転換した。

形質転換体を熱誘発（エム・ローゼンベルグら、メソツ
ズ・オブ・エンサイモロジー（Ｍ、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ
＠ｔ　α１、、　Ｉ’４ｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、）　、　
１０１，１２３（１９８３））またはナリジキシン酸誘
発（セットら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・ニー・ニス・ニ
ー（Ｍｏｔｔｅｔα１、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）＋８２゜８８（
１９８５））前に対数期まで増殖させた。

該誘発期間後、遠心分離により細胞を集め、リゾチーム
溶液（Ｉｇ＃胞／１０ｍＮｍ液）（５０ｍＭトリス（ｐ
Ｈ８）、０．１ｍＭエチレンジアミン四酢酸酢酸塩ＤＴ
Ａ　）、０．１　ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、
０．１％−ｙ’ｔキシコール酸塩（ＤＯＣ）およびリゾ
チーム０．５　ｇ　／ｍＱ　）に加えて溶解した。該懸
濁液を音波処理して粉砕し、ついで、少なくとも４時間
攪拌した。ついで、該懸濁液を２０分間低速（１（１６
）（１６）ｒｐｍ）遠心分離して分離した。該ペレット
を予め尿素を加え４Ｍの最終濃度としたトリス緩衝液に
再懸濁した。この懸濁液を音波処理し、室温にて一夜攪
拌した。ついで、該懸濁液を２０分間低速遠心分離する
ことにより分離した。

上清を集め、緩衝液（５０ｍＭ）リス（ｐＨ８）、２５
ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭＤＴＴ）に透析する。ついで、
該溶液をジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−トリスア
クリルカラムに付し、２５〜５（１６）ｍＭＮａＣ１４
度勾配法にて溶出した。ピークフラクションを緩衝液（
５０ｍＭ）リス（ｐＨ８）、２５ｍＭＮａＣ１）に透析
し、タンパク質ａ縮物および抗トリプシンおよび抗エラ
スターゼ活性を検定した。

１５０〜２５０ｍＭ　ＮａＣｌに集めたフラクションは
、約９０％の純度にてＡＡＴＤ１５を含有していた。

トリプシンおよびエラスタービ検定において、ＡＡＴＤ
１５は、ヒト血清由来のＡＡＴ（シグマ・ケミカルズ、
セント・ルイス、ミズーリ（Ｓ　ｉｇｍａＣｈｅｍｉｃ
α１ｓ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）
　）および酵母由来のＡＡＴ（Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ
　）の活性の１０〜１５％を示した。この活性の減少は
、アルカリ条件下尿素の使用および他の場合チオシアネ
ートの使用から生じたものと考えられる。該トリプシン
検定は、トラビス、メソッズ・オブ・エンザイモロジー
（Ｔｒａｖｉｓ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、）　、　
８０．７５５〜７６５（１９８１）の方法により行なわ
れた。１（１６）ｍＱのトリプシン（１５ｑ）、２（１
６）ｍｆｆ１のトリス（１０ｍＭ　、ｐＨ８）および１
０ｍＭリン酸ナトリクム（ｐＨ７，６）中のＡＡＴＤ１
５（３０’９）２（１６）ｍＱの反応混合物を室温にて
１５分間インキュベートした。

ついで、緩衝液（１０ｍＭ）リス、ｐＨ８）中の基１（
ｐ−）シルーＬ−アルギニンメチルエステル（１，３Ｗ
／ｍＱ　）　）　２．５　ｍｆｆ１を加える。２５３ｎ
ｍにおける吸収を５分間に亘って１分毎にプロットした
。

エステラーゼ検定は、また、トラビスの方法によって行
なわれた。４５■のＮ−スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ
−アラニル−Ｌ−アラニン−ｐ−二トロアニリド（シグ
マ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス、ミズーリ
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃα１Ｃｏ−＋　Ｓｔ、　Ｌ
ｏｕｉｓ、　ＭＯ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ
）５ｍＱに加えることにより貯蔵基質溶液（２０ｍＭ）
を調製した。ブタ膵臓からのエステーゼ（シグマ・ケミ
カル・カンパニー、セントルイス、ミズ−ＩＪ　）０．
３■を加えることにより酵素溶液を調製した。キュベツ
ト中の該酵素浴液２５０ｍＱに緩衝液（２（１６）ｍＭ
　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８）０．２ｍＱを加えた。当モ
ル量のＡＡＴＤ１５を該溶液に加え、該溶液を室温にて
１分間インキュベートした。脱イオン水を加えて最終容
積を２９５０ｍＱにした。ついで、該基質溶液５０ｕ＋
Ｑを加え、溶液を混合した。４１０ｎｍの吸収を５分間
観察した。

実施例２ ｐＨＪα１−２ ＰＬプロモーターの上流側の約９（１６）　ｂｐのＥｃ
ｏＲＩ　−Ｂａ　ｌ　Ｉフラグメントを欠失させること
によりｐｏ’ｒｓｖから９ＭＧ２７Ｎ（グロスら、モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｇｒｏｓ
ｓｅｔ　ａｔ、　、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ
、）、５　、１０１５（１９８５））を誘導し、該ベク
ターの４　Ｎｄｅ　Ｉ部位の３の欠失を生じさせた。ｐ
ＵＬＢ１５２３からのＡＡＴコー１イング配列のＢａｍ
ＨＩ−Ｘｈｏ　Ｉ　　（末端充填）フラグメント（Ｂａ
ｍＨＩは第１および第２コドン間のコーディング配列を
切断する）を９ＭＧ２７ＮのＢａｍＨＩおよび５α１Ｉ
部位の間に挿入した。

該方法は、実質的に前記マニアテイスら（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓｅｔ　α１、　）と同様にして行なわれた。このベ
クタｐ　ＨＪ　ａ□−１は、全細胞タンパク質の約０．
１〜０．３％より少ない成熟した本来のＡＡＴ（第１ア
ミノ酸としてＧｌｕの代わりにＭｅｔを有する）を発現
した。。ｃＩＩＡＴＧの下流側のＢａｍ　ＨＩ部位が保
持されていた。

Ｎｄｅ　ＩおよびＢｃＩＩにてｐＨＪ、ｚｌ−１を消化
して２〜１６までのコドンを欠失させた。このフラグメ
ントを第１表に示した合成オリゴヌクレオチドリンカー
吉代替し、ｐＨＪα１　−２を調製した。プラスミドお
よびオリゴヌクレオチド比１：５０および標準結合方法
を用いて該フラグメントを挿入した。クーマシー・ブリ
リアント・ブルーにて染色したポリアクリルアミドゲル
を精密検査するこシ とにより評価しながら、熱またはナリジキン酸誘へ 発後ｐＨＪα１−１からのＡＡＴより約２倍多量にて該
変異ＡＡＴタンパク質、ＨＪ２を発現させた。

実施例３ ｐＯＴｓα１−３ ＢａｍＨＩおよびＸｈｏ　Ｉにて消化することによりｐ
ＵＣα１−２から全ＡＡＴ遺伝子を単離した。該フラグ
メントをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ切断ｐｏ’ｒ　Ｓ　
Ｖベクターに結合し、ｐＯＴＳα１を得た。ｐＯＴｓ４
戸よ、受託番号第５３２８２号のもとにジ・アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メ
リーランド、ニー・ニス・ニー（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃ
ａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ
、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ）に寄託した。

ついで、該成熟タンパク質の最初の１５アミノ酸を含有
するん■゛のＮ−末端からのＤＮＡフラグメントを削除
するＢａｍ　ＨＩおよびＢｃｌＩにてこの新規ベクター
を消化した。前記第１表に示したようなこれらの１５ア
ミノ酸をコードする合成りＮＡ（例えば、２種の部分的
に重複しているオリゴヌクレオチドリンカ−）によりこ
のフラグメントを置換した。このベクターｐｏ’ｒｓ、
□−ａは、Ｉ）ＨＪα１−２により産生される変異ＡＡ
Ｔと同じ水準にてＡＡＴを発現した。

実施例４ Ｓｙｎ　７ もとのＡＡＴｃＤＮＡクローンからのＢａｍＨＩ−ＰＳ
ｔ　Ｉ　（末端充填）フラグメント、ｐＵＬＢ　１５２
３をＢａｍ　ＨＩおよびＳα１　Ｉ　（末端充填）にて
消化したｐＡｓｌ中に挿入した。挿入したＡＡＴフラグ
メントは、その３′末端にＧＣ尾部を包含する。ＡＡＴ
遺伝子の５′末端におけるＢａｍＨＩ　−Ｆｎｕ　４Ｈ
Ｉフラグメントを、第３位コドン変化を３コドン中に導
入する合成オリゴヌクレオチドリンカーにて置換した。

この構造は、前記第１表に示したようなＮ−末端アミノ
酸配列がＭｅｔ　−Ａｓｐ−Ｐ、ｒｏ−である全ＡＡＴ
をコードしている。該ＤＮＡ配列を分析すると、第７コ
ドンが製造の間に欠失したことが判明した。したがって
、第３位コドン変化に加えて、このＡＡＴ構成体は、ア
ミノ酸７を欠失している。

硫酸アンモニウム沈殿によりＳｙｎ　７タンパク質を精
製した。特に、遠心分離により形質転換体を集め、０℃
にて３０分間、ｏ、ｓｑ／ｍρのリゾチームおよび１０
ｍ９／ｍＱのＤ　Ｎ　Ａｓｅを追加した１４０容のＴＥ
Ｓ緩衝液（５０ｍＭ）リス（ｐＨ８）、５ｍＭ　ＥＤＴ
Ａおよび２５％ショ糖）中に溶解した。

ついで、最終濃度が０．１％になるまでトリトンＸ１（
１６）を加えた。該懸濁液を０℃にて１５分間インキュ
ベートし、ついでＩ　Ｍ　ＭｇＣ１２を加えて８０十＋ ｍＭ　Ｍｇ　　にした。この懸濁液を２５℃にて５分間
インキュベートした。１５（１６）０　ｒｐｍにて１０
分間遠心分離した後上清を集めた。硫酸アンモニウムを
該上清に加え、該溶液を１（１６）（１６）　ｒｐｍに
て１０分間遠心分離した。５０〜７５％硫酸アンモニウ
ムフラクション中にＳｙｎ７タンパク質を検出した。

この沈殿を緩衝液（５０ｍＭｈリス（ｐＨ８）、３ｍＭ
　Ｎａ　Ｃ１）に再溶解し、同一緩衝液に透析した。

該溶液をＤＥＡＥ−トリスアクリルカラムに付し、緩衝
液（５０ｍＭ　）リス（ｐＨ８））中の２５〜５（１６
）ｍＭＮａｃＩ濃度勾配法にて溶出した。フラクション
を緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０　ｍＭＮ
ａＣｌ　）に透析し、タンパク質濃縮物および抗トリプ
シンおよび抗エラスターゼ活性を前記実施例１と実質的
に同様にして検定した。Ｓｙｎ７タンパク質は、純度２
５％以下で１５０〜２５０　ｍＭ　ＮａＣｌフラクショ
ン中に見出された。それは、血清由来および酵母由来の
ＡＡＴと同じ水準の抗エラスターゼおよび抗トリプシン
活性を有していた。Ｓｙｎ７構成体は、ｐＨＪα１　−
１より約７倍多くのタンパク質を産生じた。

別の実験において、実質的にローレルら、ジャーナル・
オブ・クロマトグラフィツク・サイエンス（Ｌａｕｒｅ
ｌｌ　ｅｔ　α１、＋　Ｊ＋Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ、）、
２７８゜５３〜６１（１９８１）の方法によりＳｙｎ　
７を９５％以上に精製した。ローレルら、ヨーロピアン
・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｌａｕｒｅ
ｌｌｅｔ　α１、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、）　＋５７　、１０７〜１１３（１９７５）　　およ
びＵ−レル、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィツク
・サイエンス（Ｌａｕｒｅｌｌ、。

Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ−）、１５９，２５〜３１（１
９７８）も参照。実質的にパーガードら、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｂｅｒｇｇａｒ
ｄ　ｅｔα１、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、
２４４．４２９９〜４３０７（１９６９）の方法によっ
て骨髄腫の患者の尿から分離した単量体カッパ鎖を実質
的にローレルら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー（Ｌａｕｒｅｌｌ　　ｅｔ　ａｔ、、
　Ｅｕｒ、　　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）。

ΣＬ１０７〜１１３（１９７５）の方法によりブロムシ
アンセファロース４Ｂ（ファルマシア、ビス力タクエイ
、ニューシャーシー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＋Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ＋　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ））にカップリン
グさせた。硫酸アンモニウム沈殿によって細胞溶解物か
ら部分的に精製したＳｙｎ　７の緩衝溶液（５０ｍＭト
ロメタミン）をベータ・メルカプトエタノールを加える
ことにより２０　ｍＭの最終濃度に減じた。

ついで、該溶液をバイオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ　）　Ｐ３
０モレキュラー・シーブに付した。ついで、該溶液をに
一鎖／セファロースカラムに通し、ｌ”？／ｍＱのジチ
オビスニトロ安息香酸およびｏ、２５〜／ｍＱのジチオ
スレイトールを加えて修正した同じ緩衝液にて溶出させ
た。β−メルカプトエタノールを加えて２０　ｍＭの最
終濃度に該溶出液を減じ、透析するかまたはリン酸ナト
リクム緩衝液（１０ｍＭ。

ｐＨ７，５、０，１５Ｍ　ＮａＣ！　）中バイオゲルＰ
　１５０モレキユラー・シーブに付した。

実施例５ ｐＳｙｎ　７Ｒ 前記実施例４と同様にしてｐＳｙｎ７Ｒを製造した。こ
の構造は、該Ｎ−末端アミノ酸配列が第１表に示したよ
うなＭｅｔ　−Ａｓｐ　−Ｐｒｏ−である全ＡＡＴをコ
ードしていることが続いて行なった分析により確認され
た。ｐＳｙｎ　７ＲからのＡＡＴの発現はＳｙｎ　７に
ついてとほぼ同様であった。

実施例６ ｐＨＪα１−５およびｐｏＴＳＣ１□−５ＡＡＴのＮ−
末端の最初の１５アミノ酸からなるフラグメントを入夫
しているＮｄｅ　ｉおよびＢｃｌ　　　−■にてｐＨＪ
ヶ１−１を消化した。このフラグメントをこれらのアミ
ノ酸の最後の５個をコードする合成りＮＡ配列にて置換
した。最終構造は、成熟遺伝子の５′−末端の最初の１
０アミノ酸を除く全ＡＡＴをコードしていた。本明細書
にてＡＡＴＤＩＯと称するタンパク質は、実質的に前記
実施例４と同様にして精製した。それは前記実施例１と
同様のトリプシンおよびエラスターゼ検定において１（
１６）％活性であることが判明し、ｐＨＪα１　−１か
らの割より約２（１６）〜２５０倍以上の量にて発現さ
れた。

このベクターからのＢｇｌ■−ＸｈｏＩ７ラグメントは
、Ｂｇｌ　Ｕ　−Ｘｈｏ　Ｉと構成体ｐｏ’ｒｓｃｔ１
−５の間のｐ　ＯＴ　Ｓ　α１中にクローンされた。

実施例７ ｐＨＪ工□−６ ＡＡＴＤ５　を発現するｐＨＪ　Ｊ−６を製造し、それ
から該タンパク質を実質的に前記実施例６と同様にして
精製した。ＡＡＴＤ５の量は、ｐＨＪヶ□−１により発
現された量の約１５０〜２（１６）倍であった。実質的
に前記実施例４と同様にしてトリプシン検定にてＡＡＴ
Ｄ５を試験し、１（１６）％活性であることが判明した
。Ｂｇｌ　ＩＩ　−Ｘｈｏ　Ｉフラグメントを実施例６
と同様にｐＯＴＳ（ｔ□に挿入してｐｏＴ〜□−６を製
造した。

実施例８ ｐＨＪｃｔ□−４ 実質的に前記実施例２と同様にして第１表に示したＩ）
ＨＪα１−４を製造し、全細胞タンパク質の０．５〜１
％のＨＪ２を産生ずることが判明した。

実施例９ ｐα１−Ａ ｐＡＳＫは、ＰＬプロモーターおよびｃｌＩ　リポソー
ム結合部位を含有するイー・コリ・ガラクトキナ−Ｍ（
ｇα１Ｋ）の遺伝子を含むプラスミドである。それは、
ＡＴＧとｇα１Ｋコーディング配列の第２コドンの間に
ＢａｍＨＩｉンカーを挿入したｇα１Ｋコーディング配
列に隣接してｐＡＳ　１のｃＩＩリポソーム結合部位を
配置することにより製造された。イー−コリＣ６（１６
）（ｃＩ８５７）　の形質転換は、マツコンキー（Ｍａ
ｃ　Ｃｏｎｋｙ）ガラクトースからなる指示板上に平板
塗布した場合、形質転換体の周囲の寒天の赤変させる形
質転換体を生じた。

本来のＡＡＴコーディング配列からの４５塩基対Ｂａｍ
ＨＩ　−Ｂｃｌ　ＩフラグメントをＢａｍＨＩ部位に挿
入し、ＡＡＴＮ−末端およびｇα１Ｋコーディング配列
の翻訳融合を得た。イー・コＩＪ　Ｃ６（１６）（ｃＩ
８５７　）に形質転換したこのプラスミド、ｐＡＡＴｇ
α１Ｋは、該指示板を赤変させない。そのような形質転
換体は、ｐＡＳＫにて形質転換した細胞により発現され
たｇα１Ｋの世の約０．３〜０．５％に等しい量のハイ
ブリッド・タンパク質を産生することがクエスタン・プ
ロット分析により確認された。

突然変異体を発生させるために、ｐＡＡＴｇα１　’ｉ
Δ ｉｌ　ｖｉｔｒｏにてヒドロキシルアミンにて処理し、
別の実験において、突然変異誘発遺伝子細胞ライン、す
なわち、ｍｕｔＴまたはｍｕｔＤ（ミラー編、エクスペ
リメンツ・イン・モレキュラー・ジエネテイツクス（Ｍ
ｉｌｌｅｒ、　ｅｄ、、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉ
ｎＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　）診照）
に通した。イー・コ’Ｊ　Ｃ６（１６）（ｃＩ８５７）
を突然変異誘発条件に付したプラスミドにて形質転換し
、指示板上に平面塗布した。いくつかの赤色コロニーを
単離し、ＡＡＴ−ｇα１Ｋハイブリッドタンパク質の水
準をクエスタンプロット分析により分析した。あるア１
フミエー斤イショシ”は、もとのｐＡＡＴｇα１Ｋ　形
質転換体より約１０〜２０倍多くの量のハイブリッドを
産生じた。この遺伝子の塩基配列決定を行なうと、一点
突然変異が第２コドンにて生じ、該コドンをＧＡＴ（ア
スパラギン酸）からＡＡＴ（アスパラギン）に変化させ
ていることが判明した。

ついで、プラスミドｐｃｔ１−Ａは、合成オリゴヌクレ
オチド（前記第１表参照）をｐＨＪα１−１およ、び実
質的に前記実施例６と同様にしてｐＯＴＳｃｔ工に挿入
することにより製造された。ｐユ１−Ａにて形質転換し
たイー・コリＣ６（１６）（ｃＩ　８５７　）は、ｐＨ
Ｊα１−１からのＡＡＴの量より約１０倍多い変異ＡＡ
Ｔを産生じた。

実施例１０ ｐＨＪヶ１−７ １箇所の又クレオチドが変化したｐα１−Ａ　および３
箇所が変化したｐＳＹＮ７Ｒを含有する合成オリゴヌク
レオチドをｐＨＪ（ｔニー１に挿入した。得られた変異
ＡＡＴＨＪ　７の発現をウェスタン・プロット分析によ
り測定し、Ｓｙｎ７より５〜１０倍およびｐＨＪヶ１−
１　からより約３０〜５０倍多いことが判明した。

実施例１１ ｐｏ’ｒｓ、−７ ５′突然変異の下流側のＡＡＴコーディング配列の一部
を通って変異ＡＡＴコーディング配列の上流側の部位を
含むｐＨＪα１　　７のＢｓｔＸＩフラグメントをｐｏ
’ｒｓ、１中のＢｓｔＸＩフラグメントの代わりに挿入
した。両方のベクターの該部位は。

ＡＡＴ遺伝子に関して同一の場所に存在する。生じた構
成体ｐｏ’ｒｓｃｔ１−７をイー・コリ株ＡＲ］２０に
形質転換した。誘発により全細胞タンパク質の約１５％
に等しい量のＨＪ７の発現またはｐＨＪα１−１により
発現したＡＡＴより約１５０〜２（１６）倍多い発現を
生じた。

実施例１２ ｐ　α１−ＡＧ ｐ工１−Ａに存在する１箇所のヌクレオチド変化および
第３コドン（プロリン）の第３位のＣからＧへの変化（
第１表参照）を含む合成オリゴヌクレオチドを前記実施
例９と同様にしてｐｏＴＳα１に挿入した。ｐα１−Ａ
Ｇ、にて形質転換したイー・コリ（ｃ６（１６）ｃＩ８
５７）は、ｐＨＪα１　−１から産生じたＡＡＴの量よ
り約２０倍多量の変異ＡＡ’Ｔ、ＨＪ７を産生した。

実施例１３ ｐヶ１−ＡＧｏ、。

以下のようにして発現ベクターｐＲＤＮＳを製造した。

ベクターｐＭＧ２７Ｎ　　（実施例２参照）をＡｖａ■
にて制限し、　ｐｏ’ｒｓからの４２３塩基対ＡｖａＩ
−Ｘｈｏｌおよび７７４塩基対ＸｈｏＩ　−Ａｖａ■フ
ラグメントを挿入した。生じたベクターｐＭＧ２７Ｎ−
３をＢａｍＨＩ　　にて切断し、ＮＳＩ　　遺伝子（ヤ
ングら一プロシーディンゲス・オブ・＋シヨナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス・ニー・ニス・ニー（Ｙｏｕ
ｎｇ　ｅｔ　α１、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’　ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）　、　６０　、６１
０５〜６１（１８）（１９８３））を含有するｐＡｓ１
△ＥＨ８０１から（７）ＢａｍＨＩ　　フラグメントに
て結合した。

このベクターｐＭＧ２７Ｎ−３ＮＳＩをその特異的Ｎｄ
ｅ１　　部位にて切断し、マングビーン・ヌクレアーゼ
にて処理し、再結合した。このベクターｐＭＧ２７Ｎ−
３ＮＳ１−ＭＢを５α１ＩおよびＮｃｏＩ　　にて切断
した。突然変異体ＣｒＯリポソーム結合部位（ｒｂｓ）
をコードする合成オリゴヌクレオチドをこれらの部位の
間に挿入した。

このｒｂｓに導入した突然変異（ＡＴＧに関してそれぞ
れ−３および一２位にてＴＧの代わりにＣＡ）により、
本発明者らは、ＡＴＧに隣接する特異的ＮｄｅＩ　　お
よび５α１Ｉ　　部位の導入が可能となった。シャイン
ーダルガーノ配列および該ＡＴＧに対する距離は、野生
型ｃｒｏ　ｒｂｓ　　のそれらと同一である。該野生型
ＡＡＴ配列をｐＨＪα１　−１からｐＲＤＮＳに移動し
、ＰＬ調節およびｃｒｏリボソーム結合部位のコーディ
ング配列を配置した。ついで、該プラスミドからのＢｓ
ｔＸＩフラグメントを実施例１１におけるようにＢｓｔ
ＸＩ切断ｐｏ’ｒｓヶ、の間に挿入した。生じたプラス
ミドｐＲＤＮＳヶ１−１は、たとえ該遺伝子コーディン
グ配列中に何ら変化が生じなかったとしてもプラスミド
ｐｏ’ｒｓｃｔ１−１より３倍の水準にてＡＡＴを発現
させる。

Ｐα１−ＡＧからの変異ＡＡＴコーディング配列をｐＲ
ＤＮＳに挿入し、ＰＬの調節およびｃｒｏ’Ｊボソーム
結合部位のコーディング配列を配置した。

ＢｓｔＸＩフラグメントを前記のｐｏ”ｒｓヶ、中にク
ローンした。生じたプラスミドはＰα１−ＡＧｏｒ。

であった。このプラスミドに含有されているイー・コリ
形質転換体は、　ｐα１−ＡＧを用いた形質転換体より
３倍の量にておよびｐＨＪ　　　　１からのα１− ＡＡＴの量より約６０倍の量にて変異ＡＡＴを産生ずる
。

実施例１４ ｐα１−Ａｃｒ。

Ｐα１−Ａからの変異ＡＡＴコーディング配列をｐＲＤ
ＮＳ　　Ｋ挿入し、ＰＬの調節およびｃｒｏ’）ボソー
ム結合部位のコーディング配列を配置した。

ｐＯＴＳα１を用いで、再度ＢｓｔＸＩフラグメント変
換を行なった。このプラスミドを用いたイー・コリ形質
転換体は、ｐｃｔニーＡを用いた形質転換体より約３倍
の量にてＨＪ７を産生じた。

特肝出願人　スミスクライン・ベックマン・コーポレイ
ション

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. （１）突然変異がコドン１〜１５の範囲内のＡＡＴコー
   ディング配列の変化からなり、ただし、該突然変異が本
   来のコーディング配列の第１コドンのコドンＡＴＧへの
   置換以外またはその追加である突然変異体アルファ−１
   −抗トリプシン（ＡＡＴ）コーディング配列を含むこと
   を特徴とするＤＮＡ分子。
2. （２）該突然変異が、それによつて発現された変異ＡＡ
   Ｔの主要構造に影響を及ぼさない第３塩基対位の置換、
   １または２以上の欠失またはその両方からなる前記第（
   １）項のＤＮＡ分子。
3. （３）該コーディング配列がコドン１〜１０の範囲内に
   て変化している前記第（２）項のＤＮＡ分子。
4. （４）該コーディング配列がｐＨＪ＿α＿１−２、ｐＨ
   Ｊ＿α＿１−３、ｐＯＴＳ＿α＿１Ｂｃｌ、ｐＨＪ＿α
   ＿１−４、ｐＨＪ＿α＿１−５、ｐＨＪ＿α＿１−６、
   ｐＳｙｎ７、ｐＳｙｎ７Ｒ、ｐ＿α＿１−ＡまたはｐＨ
   Ｊ＿α＿１−７に存在するＮ−末端変化を含む前記第（
   ２）項のＤＮＡ分子。
5. （５）ｐＨＪ＿α＿１−２、ｐＯＴＳ＿α＿１−３、ｐ
   ＨＪ＿α＿１−４、ｐＨＪ＿α＿１−５、ｐＨＪ＿α＿
   １−６、ｐＯＴＳ＿α＿１Ｂｃｌ、ｐＳｙｎ７、ｐＳｙ
   ｎ７Ｒ、ｐ＿α＿１−Ａ、ｐＨＪ＿α＿１−７、ｐＯＴ
   Ｓ＿α＿１−７、ｐ＿α＿１−Ａｃｒｏ、ｐ＿α＿１−
   ＡＧ、ｐ＿α＿１−ＡＧｃｒｏ、ｐＯＴＳ＿α＿１−５
   またはｐＯＴＳ＿α＿１−６である前記第（２）項のＤ
   ＮＡ分子。
6. （６）該突然変異が、本来のＡＡＴの最初の約１０コド
   ンの欠失または本来のＡＡＴの最初の約５コドンの欠失
   からなる前記第（２）項のＤＮＡ分子。
7. （７）ｐＨＪ＿α＿１−６またはｐＨＪ＿α＿１−７で
   ある前記第（６）項のＤＮＡ分子。
8. （８）その中に活動的に挿入された突然変異体アルファ
   −１−抗トリプシンコーディング配列を有する細菌発現
   ベクターである前記第（１）、（２）、（３）、（４）
   または（６）項のＤＮＡ分子。
9. （９）イー・コリ発現ベクターである前記第（８）項の
   ＤＮＡ分子。
10. （１０）該発現ベクターがｐＡＳ１、ｐＣＶＱ２または
    ｐＲＤＮＳの調節領域からなる前記第（９）項のＤＮＡ
    分子。
11. （１１）１〜１５位の範囲内で変化したアミノ酸配列か
    らなり、ただし、該突然変異が本来のＡＡＴの第１位の
    メチオニン残基の置換以外またはその追加であることを
    特徴とする抗トリプシンおよび抗エラスターゼ活性を有
    する変異ＡＡＴタンパク質。
12. （１２）最初の１５アミノ酸または最初の１０アミノ酸
    または最初の５アミノ酸を欠失している前記第（１１）
    項の変異ＡＡＴ。
13. （１３）ＡＡＴＤ１５、ＡＡＴＤ１０またはＡＡＴＤ５
    である前記第（１１）項の変異ＡＡＴ。
14. （１４）ＡＡＴＤ５である前記第（１１）項の変異ＡＡ
    Ｔ。
15. （１５）ＨＪ２、ＨＪ７またはＳｙｎ７である前記第（
    １１）項の変異ＡＡＴ。
16. （１６）前記第（１）〜（７）項のいずれかのＤＮＡ分
    子にて形質転換された細菌。
17. （１７）イー・コリである前記第（１６）項の細菌。
18. （１８）前記第（８）項のＤＮＡ分子にて形質転換され
    た細菌。
19. （１９）イー・コリである前記第（１８）項の細菌。
20. （２０）前記第（９）項のＤＮＡ分子にて形質転換され
    たイー・コリ。
21. （２１）前記第（１０）項のＤＮＡ分子にて形質転換さ
    れたイー・コリ。
22. （２２）ポリペプチドが回収可能量にて発現されるよう
    な許容条件下、前記第（１６）項の細菌を培養し、該ポ
    リペプチドを該培養から単離することを特徴とするＡＡ
    Ｔの抗トリプシンおよび抗エラスターゼ活性を有するポ
    リペプチドの製造法。
23. （２３）該細菌がイー・コリである前記第（２２）項の
    方法。
24. （２４）ポリペプチドが回収可能量にて発現されるよう
    な許容条件下、前記第（１８）項の細菌を培養し、該ポ
    リペプチドを該培養から単離することを特徴とするＡＡ
    Ｔの抗トリプシンおよび抗エラスターゼ活性を有するポ
    リペプチドの製造法。
25. （２５）該細菌がイー・コリである前記第（２４）項の
    方法。
26. （２６）ポリペプチドが回収可能量にて発現されるよう
    な許容条件下、前記第（２０）項のイー・コリを培養し
    、かつ、該ポリペプチドを該培養から単離することを特
    徴とするＡＡＴの抗トリプシンおよび抗エラスターゼ活
    性を有するポリペプチドの製造法。
27. （２７）ポリペプチドが回収可能量にて発現されるよう
    な許容条件下、前記第（２１）項のイー・コリを培養し
    、かつ、該ポリペプチドを該培養から単離することを特
    徴とするＡＡＴの抗トリプシンおよび抗エラスターゼ活
    性を有するポリペプチドの製造法。
28. （２８）前記第（１１）、（１２）、（１３）、（１４
    ）または（１５）項の変異ＡＡＴタンパク質および医薬
    上許容される担体からなることを特徴とする動物の肺の
    エラスターゼ活性抑制用医薬組成物。
29. （２９）静脈投与用の前記第（２８）項の医薬組成物。
30. （３０）（ｉ）本来のコーディング配列の全部または一
    部を、選択できる表現型のコーディング配列に結合させ
    、それで適当な宿主を形質転換し、生じた翻訳融合の発
    現を定量し、（ｉｉ）問題とするポリペプチドのコーデ
    ィング配列の全部または一部を突然変異誘発させ、（ｉ
    ｉｉ）もとの翻訳融合の発現以上に増加した突然変異翻
    訳融合の発現を検定し、（ｉＶ）（ｉｉｉ）において、
    発現の増加を示した融合における問題のポリペプチドの
    コーディング配列の突然変異体部位のヌクレオチド配列
    を決定し、問題のポリペプチドのコーディング配列中に
    突然変異を有する融合を選択し、（Ｖ）それが該突然変
    異体コーディング配列と同じ１または２以上の突然変異
    を含む以外は問題の生成物の本来のコーディング配列と
    同じコーディング配列を調製し、それで適当な宿主を形
    質転換し、（Ｖ I ）該突然変異体コーディング配列が
    本来のコーディング配列より多くの量にて転写され、翻
    訳される（Ｖ）からの形質転換体のクローンを選択する
    ことを特徴とする本来のコーディング配列より多くの量
    にて転写され、かつ、翻訳される問題のポリペプチドの
    突然変異体コーディング配列の同定法。
31. （３１）工程（ｉ）にて用いられる本来のコーディング
    配列の全部または一部がＮ−末端アミノ酸の部分コーデ
    ィングであり、かつ、選択できる表現型のコーディング
    配列の上流に結合される前記第（３０）項の方法。
32. （３２）該本来のコーディング配列がヒト・アルファ−
    １−抗トリプシンであり、かつ、該宿主がイー・コリで
    ある前記第（３１）項の方法。
33. （３３）工程（ｉ）において、ＡＡＴの最初の１５アミ
    ノ酸をコードするＡＡＴコーディング配列の一部をガラ
    クトキナーゼまたはベータ・ガラクトシダーゼのコーデ
    ィング配列である選択できる表現型のコーディング配列
    に結合させ、増加した発現の検定が指示板上の該形質転
    換体の培養からなる前記第（３２）項の方法。