JPS63296689A - ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びその製造方法 - Google Patents

ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びその製造方法

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JPS63296689A
JPS63296689A JP63090433A JP9043388A JPS63296689A JP S63296689 A JPS63296689 A JP S63296689A JP 63090433 A JP63090433 A JP 63090433A JP 9043388 A JP9043388 A JP 9043388A JP S63296689 A JPS63296689 A JP S63296689A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、蛋白質の、特にウロキナーゼ型のセリンプ
ロテアーゼの新規な製造方法に関する。
この方法は遺伝子操作された酵母株を用いる。この発明
はさらに、新規なウロキナーゼ型蛋白質、該蛋白質をコ
ードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するハイブリドベクタ
ー、前記遺伝子操作された酵母株、並びに該ＤＮＡ、ハ
イブリドベクター及び酵母株の製造方法に関する。
以下余白 〔従来の技術〕 ウロキナーゼ又はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性
化因子（以後、“ｕ−ＰＡ”と称する）は蛋白質分解的
開裂によりプラスミノーゲンをプラスミンに活性化する
セリンプロ゛テアーゼである。プラスミンは血凝物のフ
ィブリンネットワークを分解して可溶性の分解生成物を
生成せしめることができる強力なプロテアーゼである。
ｕ−ＰＡは最初人尿から単離され、そして培養された腎
細胞及び若干の腫瘍セルラインから分泌されることが知
られている。これはまず単鎖分子（以後、“ｓｃｕ−Ｐ
Ａ”と称する）として生産され、そしてプラスミンの作
用により蛋白質分解的に二本鎖形（以後、“ｔｃｕ　−
ＰＡ”と称する）に転換されることができ、この場合こ
の２本の鎖はジスルフィド橋により相互に連結されたま
まである。　ｕ−ＰＡはＡｓｎ３０２部位にユニークグ
リコシル化部位を有する。
ｓｃｕ−ＰＡは低分子量の合成ペプチドに対してわずか
なアミド分解活性しか有しないため、このものは最近ま
で活性な酵素ｔｃｕ−ＰＡの真の蛋白質分解的に不活性
な前駆体であると考えられていた。しかしながら、最も
最近の結果は、ｓｃｕ−ＰＡが効率的にプラスミノーゲ
ンをプラスミンに活性化し、そしてフィブリンに対して
ｔｃｕ−ＰＡよりもかなり高い選択性を有することを証
明したＣ）１．Ｒ，Ｌｉｊｎｅｎ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ、　　２６ユ、１２５３（１９８６）　　）　　
、　ｓｃｕ−ＰＡの驚くべきフィブリン分解活性及び凝
血特異性が研究された（Ｌｉｊｎｅｎ等、前掲ＨＤ、Ｃ
ｏ１１ｅｎ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。
皿、１２５９（１９８６）　）　、　ｓｃｕ−ＰＡは不
活性なチモーゲン（ｚｙｍｏｇｅｎ）ではなく、あらか
じめｔｃｕ−Ｎに転換されることなくプラスミノーゲン
を活性化することが証明された。ｔｃｕ−ＰＡとは異り
、ｓｃｕ−ＰＡ今まで知られていない血漿成分により阻
害され、この阻害はフィブリン又はフィブリン断片によ
り、すなわち凝血において逆転されることが証明された
。
従って、生体内条件下で血中を循環する間ｓｃｕ−ＰＡ
プラスミノーゲンを活性化しない。そのフィブリン分解
活性はその適切な標的に限定されたままである。他方、
ｔｃｕ−ＰＡは循環系のすべての点においてプラスミノ
ーゲンを活性化することができ、これにより出血のごと
き不所望の副作用を導く、これらの性質がｓｃｕ−ＰＡ
を好ましいウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子
にしている。
組換ＤＮＡ技法の出現に伴い、今やｓｃｕ−ＰＡのごと
き蛋白質を工業的規模で製造することが可能である。ゲ
ノムｕ−ＰＡ　ＤＮＡ　（Ａ、Ｒｉｃｃｉｏ等、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ　１３．２７５
９（１９８５）　）及びｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡ（Ｗ、Ｅ、
Ｈｏｌｍｂｓ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３．　震
１９８５）　）の既知の配列に基き、組換ＤＮＡ技法を
用いるｓｃｕ−ＰＡの製造方法が文献に記載されている
。すなわち、Ｅ、ｃｏｌｉにおける発現力＜Ｗ、Ｅ、Ｆ
Ｉｏｌｍｅｓ等（前掲）；Ｐ、Ｊａｃｏｂｓ等（ＤＮＡ
土、１３９（１９８５））　　；Ｍ、Ｅ、Ｗｉｎｋｌｅ
ｒ等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５＋４０４１（１
９８６）　）　；Ｍ、Ｎａｇａｉ等（Ｇｅｎｅ　　３６
１８３（１９８５））により達成された。ベルギー特許
隘９００．８２６：日本特許阻６１１８１３５５；及び
ヨーロッパ特許出願Ｎ１９２，１８２を参照のこと。動
物細胞におけるｓｃｕ−ＰＡの発現がヨーロッパ特許出
願Ｎ１１９２１８２及び１ｋ１５４．２７２に記載され
ている。しかしながら、これら既知方法のすべてが重大
な欠点を有する。細胞により生産される蛋白質の安価で
有利な製造のための前提条件である動物細胞の大規模増
殖が回能なことが証明されている。動物細胞の世代時間
は微生物のそれよりかなり長（、従って十分に高い細胞
濃度を得るには長い発酵時間が必要である。従って、動
物細胞の培養により得られる細胞濃度は、微生物の大規
模培養により一般に達成される細胞密度よりかなり低い
。さらに、微生物に比べて、株の改良を達成することが
困難である。他方、Ｅ、コリ　（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）か
らの蛋白質調製物中には汚染エンドトキシンが見出され
る。
これらは高価で時間のかかる精製段階により除去されな
ければならない。Ｅ、コリは蛋白質分子の適切な部位に
炭水化物鎖を付加するための酵素系を欠くため、Ｅ、コ
リにより生産された蛋白質は必然的にグリコシル化され
ていない。従って、Ｅ、コリにより生産される場合、組
換ｓｃｕ−ＰＡは天然ｓｃｕ−ＰＡと異り、グリコシル
化されない。Ｅ、コリ株により生産されたｓｃｕ−ＰＡ
は、ジスルフィド橋の不完全な配列のため及び蛋白質の
正しくない折りたたみのため、不定形の不溶性ポリマー
として存在することが報告された。従って、生物学的に
活性な蛋白質を得るためには、多量の溶剤を用いる少な
くとも１つの再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）段階が必要で
ある（Ｍ、Ｅ、Ｗｉｎｋｌｅｒ等、前掲）。
〔発明が解決しようとする課題〕
既知方法の前記の欠点を考慮して、生物学的に活性なｓ
ｃｕ−ＰＡの大規模製造を可能にする改良された方法の
必要性が常に存在する。この様な方法を提供するのが本
発明の目的である。
〔課題を解決するための手段〕
驚（べきことに、酵母遺伝子のシグナル配列に付加され
たヒトｕ−ＰＡコード配列を担持するハイブリドベクタ
ーにより形質転換された酵母細胞が、天然ｓｃｕ−ＰＡ
と同等の生物学的活性を有しそして酵母特異的グリコシ
ル化されたｓｃｕ−ＰＡを生産することが見出された。
なんらの生体外再生（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）手順を必要
としないで酵母ｓｃｕ−ＰＡが完全に活性であることは
注目すべきことである。
従ってこの発明は、ヒト単鎖ウロキナーゼ型プラスミノ
ーゲン活性化因子又はその変異体の製造方法に関し、こ
の方法は、酵母発現制御配列、成熟プロウロキナーゼ型
プラスミノーゲン活性化因子又はその変異体をコードす
る第二ＤＮＡ配列及び該ＤＮＡ配列とリーディングフレ
ームが整合しており且つその上流にあるシグナルペプチ
ドをコードする第一ＤＮＡ配列から成り前記発現制御配
列の転写制御のもとにあるＤＮＡセグメント、並びに酵
母遺伝子の転写停止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列を
含有するハイブリドベクターにより形質転換された酵母
株を適切な栄養条件下で培養し、そして前記プロウロキ
ナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子又はその変異体を
単離することを含んで成る。
〔具体的な説明〕
“成熟ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をコ
ードするＤＮＡ″なる語は、ヒトゲノムに存在すること
が知られており、又はそれから単離することができるｕ
−ＰＡのすべての対立遺伝子形を包含する。これらのＤ
ＮＡ配列はいかなるプレー及び／又はブロー配列も含有
しない。
ｓｃｕ−ＰＡの変異体は特に、蛋白質をプロテアーゼ耐
性にする変異体である。これらのｓｃｕ−ＰＡ変異体は
スロンビン又はプラスミンのごとき血中に存在するプロ
テアーゼにより蛋白質分解の部位において共有結合的に
変形されており、その結果これらはもはやそれらの位置
でのプロテアーゼ加水分解に対して感受性ではない、標
的部位はＬｙｓ１３５−Ｌｙｓ１３６　（この部位での
開裂はいわゆる低分子量形のｓｃｕ−ＰＡ又はＬＵＫを
生じさせる；第２図を参照のこと）　、Ａｒｇ１５６−
Ｐｈｅ１５７　（スロンビンの攻撃に対して感受性であ
る）、及びＬｙｓ１５８−１１ｅ１５９　（プラスミン
によるこの部位での開裂がｔｃｕ−ＰＡを生じさせる）
を包含する。適当なｓｃｕ−ＰＡ変異体は１又は複数の
これらの標的部位でのアミノ酸残基の部位特異的置換、
挿入又は欠失を有する。標的部位を形成する１個のアミ
ノ酸残基又は両アミノ酸残基が除去されているか、又は
これらのアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸
残基により置換されており、その結果生ずる変異体が蛋
白質分解的攻撃に対して耐性であるような変異株が特に
好ましい。
ｓｃｕ−ＰＡの他の変異体においては、Ａｓｎ＋０２に
存在するユニークＮ−グリコシル化部位（Ａｓ、％（１
！−３ｅｒ−Ｔｈｒ）が変形されていて、この部位にお
いてグリコシル化が起こり得ない。哺乳類細胞における
Ｎ一連結グリコシル化のための前提条件がトリペプチド
配列−Ａｓｎ−Ｌ−Ｔｈｒ（又は５ｅｔ）７（式中Ａｓ
ｎがアクセプターであり、そしてＬはグリコシル化を妨
げるアスパラギン酸又はプロリン以外の２０種類の遺伝
子によりコードされるアミノ酸のいずれであってもよい
）゛の存在であることはよく確立されている。
この明細書において使用する場合、’　ｓｃｕ−ＰＡ蛋
白質”なる語はｓｃｕ−ＰＡ及びその変異体を包含する
ことが、意図される。
この発明は特に、次の式（■）： 以下余白 Ｓ＠ｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ　Ｖ
ａｌＰｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｍ
　Ｌｅｕ　Ａｊｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃｙｔｒ
　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓ、ｎＬｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｉ　
Ｓｉｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｈｌｓ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ａ
ｓｎ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ＰｈｅＧｌｙ
　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｈｌｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ工１ｅ　Ａ
ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　Ｃｙｍ　Ｔｙ
ｒ　ＧｌｕＧｌｙ　Ａｇｎ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　
Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒτｈ
ｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　ＭｅｔＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　
Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａ
ｌａ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎτｈｒ
　Ｔｙｒ　Ｈｌｓ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　
Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌ
ａｕ　ＧｌｙＬｙｅ　　Ｈｌｓ　　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　
　Ｃｙｓ　　Ａｒｇ　　Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｐ　
　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　
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ｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ
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ＹＩ　　ＹＩＹ３　　ＩＩｓ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ
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ｓｎ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　ＴｒｐＰｈｓ　ＡＩＪＩ　Ａｌ
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ｌｕ　Ａｍｐ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｍａｌτｙｒ　Ｌａｕ
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Ｓｉｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｍ
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Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＡｌａＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ａｌ
ａ　Ｈｌｓ　Ｈｌｍ　Ａｇｎ　Ａｓｐ　ＩＩｓ　Ａｌｅ
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ｒ工ｌｅ　Ｃｙｍ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓ＠ｒ　Ｍａｔ　
Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｇ
ｌｙ　Ｔｈｒ　５ｅｒＣｙｓ　Ｇｌｕ工１＠　Ｔｈｒ　
Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　ＧＬｕ　ＺＩ　Ｓｅ
ｒ　Ｚａ−Ａｓｐ　Ｔｙｒ　ＬａｕＴｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇ
ｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　ｖａ
ｉ　Ｖａｌ’　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ＩＩｓ　Ｓｉｒ　Ｈｌ
ｓＡｒｇ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　
Ｈｌｓ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｍ
ａｌ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＬｙｅ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ
　Ａｌａ　Ａｌａ　ＡＩＩＰ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ
　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ＣｙｓＧｉｎ　Ｇ
ｌｙ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅ
ｕ　Ｖ５ＬＩ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌ
ｙ　ＡｒｇＭｅｔ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　
Ｈｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌ
ｙ　Ｃｙｓ　ＡＩＪＩＬｅｕＬｙｓ　　Ａ＋ｐ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　Ｔｈ
ｒ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｈｌｓ　　Ｐｈ
ｅ　　Ｌａｕ　　Ｐｒ。
Ｔｒｐ　Ｉｃｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｈｌｓ　Ｔｈｒ　Ｌ
ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌ
ａ　Ｌｅｕ（式中、ＸＩ及びＸ２は相互に独立にＬｙＳ
、塩基性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基又は化学結合
を表わし；Ｙ、はＡｒｇ、塩基性アミノ酸残はＬｙＳ、
塩基性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基又は化学結合で
ありｉＺＩは酵母−特異的にグリコシル化されるＡｓｎ
であるか又は他のアミノ酸残基であり；そしてＺ２はＴ
ｈｒであるか、又はＳｅｒ以外の他のアミノ酸残基であ
る）で表わされるｓｃｕ−陥蛋白質の製造方法に関する
。
“アミノ酸残基”なる語は、遺伝的にコードされるすべ
てのアミノ酸、例えば酸性アミノ酸の残基、例えばグル
タミン酸及びアスパラギン酸の残基、塩基性アミノ酸の
残基、例えばアルギニン、リジン及びヒスチジンの残基
、並びに中性アミノ酸の残基、例えばアスパラギン、グ
）レタミン、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイ
シン、セリン、スレオニン、チロシン又はプロリンの残
基を包含することが意図される。
Ｎ−グリコシル化部位におけるグリコシル化を防止する
ためには、Ｎ−グリコシル化のためのシグナルとして認
識されるトリペプチド配列が変更されなければならない
。上記トリペプチド配列中のＡｓｎ（Ｚ＋）及び／又は
Ｔｈｒ　（ｈ）残基の他のアミノ酸による置換がこの部
位におけるグリコシド連結の形成を廃止するであろう。
便宜上、Ｎ−グリコシル化部位の変更は蛋白質レベルに
おいては行われない。これに対して、ｓｃｕ−ＰＡをコ
ードする遺伝子を変形して、該変形された遺伝子の宿主
による発現の際に、Ｎ−グリコシル化部位が該部位にお
いてグリコシル化が起こり得ないように変更された変異
体ｓｃｕ−ＰＡが生産されるようにするのが有利である
。特に、アスパラギンがバリン、ロイシン、イソロイシ
ン、アラニン、又は特にグルタミンにより置換され、そ
してスレオニンがバリン、メチオニン、又は特にアラニ
ンにより置換される。
好ましい具体例において、この発明は、ＸｌがＬｙｓ　
、　Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ２がＬｙｓであり、Ｙ
ｌがＡｒｇであり、Ｙ２がＰｈｅ　、　Ａｓｐ又はＧｌ
ｕであり、Ｙ３がＬｙｓであり、Ｚ＋がＡｓｎ又はＧｉ
ｎであり、そしてＺ２がＴｈｒである式（１）の化合物
の製造方法に関する。
特にこの発明は、ｓｃｕ−ＰＡ、　　〔Ｇｌｙ１３５）
　−ｓｃｕ−ＰＡ　。
〔Ｓｅｒ１３５）　−ｓｃｕ−ＰＡ　、　　〔Ａｓｐ１
５７）　−ｓｃｕ−ＰＡ　。
〔Ｓｅｒ１３５，Ａｓｐ１５７）−ｓｃｕ−ＰＡ及び〔
Ｇｌｙ１３５．　Ａｓｐ１５７）−ｓｃｕ−ＰＡ（式中
、Ａｓｎ３０ｇは酵母−特異的にグリコシル化される）
、そしてさらにＣＧ１ｎ３０２）　−ｓｃｕ−ＰＡ　。
〔Ｇｌｙ１３５，Ａｓｐ１５７，Ｇ１ｎ３０２）　−ｓ
ｃｕ−ＰＡ　、及び〔Ｓｅｒ１３５，Ａｓｐ１５７，Ｇ
１ｎ３０２）−ｓｃｕ−ＰＡに関する。
この発明の形質転換された宿主は資化性の炭素源、窒素
源及び無機塩基を含有する液体培地中で培養される。
種々の炭素源が使用可能である。好ましい炭素源の例と
して資化性炭水化物、例えばグリコース、マルトース、
マンニトール又はラクトース、あるいは酢酸塩、例えば
酢酸ナトリウムが挙げられ、これらは単独で又は適当な
混合物として使用される。適当な窒素源には、例えばア
ミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプチド及び蛋白質、及び
これらの分解生成物、例えばトリプトン、ペプトン又は
肉エキス、さらに酵母エキス、マルトエキス、コーンス
チーブリカー、並びにアンモニウム塩、例えば塩化アン
モニウム、硫酸アンモニウム又は硝酸アンモニウムが包
含され、これらは単独で、又は適当な混合物として使用
することができる。使用することができる無機塩には、
ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの
硫酸塩、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩が含まれる。さら
に、栄養基地は増殖促進物質を含有することができる。
増殖を促進する物質には、例えば微量元素、例えば鉄、
亜鉛、マンガン等、又は個々のアミノ酸が包含される。
構成的プロモーター（例えば、Ａｌ）ｌ（Ｉ　、　ＧＡ
ＰＤ）ｌ）を有するバイブリドプラスミドを含有する酵
母細胞は該プロモーターに付加されたｕ−ＰＡ遺伝子を
誘導を伴わないで発現する。しかしながら、ｕ−ＰＡ遺
伝子が制御されるプロモーター（例えば、ＰＧＫ又は皿
）の制御のもとにある場合には、増殖培地の組成は最大
レベルのｍＲＮＡ転写物の得るように適合されなければ
ならない。すなわち、皿プロモーターを使用する場合、
このプロモーターを抑制解除するためにこの増殖培地は
低濃度の無機リン酸を含有しなければならない。
培養は常法を用いて行われる。培養条件、例えば濃度、
培地のｐＨ及び発酵時間は最大レベルのｓｃｕ−ＰＡ蛋
白質が生産される様に選択される。選択された酵母株は
好ましくは好気的条件下で、振とう又は撹拌を伴う液中
で、約２５℃〜３５℃の温度において、好ましくは２８
℃にて、４〜７のｐＨ値において、例えば約ｐＨ５にお
いて、そして２０〜５０時間、好ましくはｓｃｕ−ＰＡ
蛋白質の最大収量が得られるまで培養する。
生産されたｓｃｕ−ＰＡ蛋白質は酵母細胞中に貯積する
ことができ、又はペリプラズム空間に分泌され得る。ｓ
ｃｕ−ＰＡ蛋白質が細胞内に貯積する場合、ｓｃｕ−Ｐ
Ａ蛋白質の回収のための第一段階は細胞内から蛋白質を
遊離せしめることである。はとんどの方法において、細
胞壁がまずグリコシダーゼ（後記）を用いる酵素消化に
よって除去される。次に、生ずるスフ二ロプラストを洗
剤、例えばトリトンＸ−１００・により処理する。ある
いは、機械的力、例えば剪断力（例えばメープルス、フ
レンチプレス）、又はガラスピーズとの振とうが細胞を
破壊するために適当である。得られる混合物を常法に従
って、例えば、ポリエチレンイミンによる処理によるほ
とんどの非−蛋白質性物質の除去、硫酸アンモニウムに
よる蛋白質の沈澱、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラ
フィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー、サイズ
−排除クロマトグラフィー、１（ＰＬＣ又は逆相ｔｌＰ
Ｌｃ　、適当なセフプデックスカラム上での分子サイジ
ング等により、ｓｃｕ−ＰＡ蛋白質について濃縮する。
予備精製された生成物の最終精製は例えば、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、例えば抗体アフィニティーク
ロマトグラフィー、特に、従来技術において知られてい
る方法により不溶性マトリクスに固定されたモノクロー
ナル抗−ｕ−ＰＡ抗体を用いるモノクローナル抗体アフ
ィニティークロマトグラフィー等により達成される。
有利には、洗剤、特に非イオン性洗剤、例えばトリトン
Ｘ−１００又はトライーン８０を、精製段階で使用され
るすべての緩衝液に加木て、容器表面へのｓｃｕ−ＰＡ
蛋白質の吸着を防止しそして安定性を改良する。洗剤は
０．０１〜１％の最終濃度に加えることができる。
ｓｃｕ−ＰＡ蛋白質が酵母細胞によりペリプラズム空間
に分泌される場合、単純化された方法を用いることがで
きる。すなわち、細胞溶解を行うことなく、細胞壁の酵
素的除去により、又は細胞壁に損傷を与えて生産された
ｓｃｕ−Ｐ＾蛋白質の放出を可能にする化学物質、例え
ばチオール試薬又はＥＤＴＡで処理することにより、蛋
白質を回収する。　ｓｃｕ−ＰＡ蛋白質が培養液に分泌
される場合、そこから直接回収することができる。
使用される宿主株及び適用される精製方法に依存して、
該宿主細胞により放出される蛋白質分解活性により惹起
される少量の二本鎖により汚染される場合がある。目的
の一本鎖形からの二本鎖形の分離は当業界において既知
の方法により、例えばベンザミジン−セファロース上で
のクロマトグラフィー　ＣＭ、Ｅ、Ｗｉｎｋｌｅｒ等、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　２５＋４０４１　（１９
８６）　）により達成される。
驚くべきことに、この発明のｓｃｕ−ＰＡ蛋白質は、こ
れらがなんらの再生（ｒｅｆｏｒｄｉｎｇ）手順を必要
とすることなく天然ヒトｓｃｕ−ＰＡの生物学的活性を
示す点、及びＡｓｎ３０２において酵母−特異的にグリ
コシル化される点において、Ｅ、コリから得られたｓｃ
ｕ−ＰＡとは異る。酵母−特異的グリコシル化により、
本発明のｓｃｕ−ＰＡ蛋白質はまた培養された動物細胞
又は形質転換された動物細胞から単離されるｓｃｕ−Ｐ
Ａとは区別され、そしてそれ故に新規である。
従って、この発明は、酵母−特異的グリコシル化、特に
サツカロミセス・セレビシェ−について特異的なグリコ
シル化を有するｓｃｕ−ＰＡ及びその変異体に関する。
グリコシル化部位が該部位においてグリコシル化が起ら
ない様に変形されているｓｃｕ−ＰＡの変異体も同様に
新規であり、そして本発明のさらなる対象である。
従って本発明は、ＺｌがＡｓｎ以外の遺伝的にコードさ
れるアミノ酸の残基であり、Ｚ２がＴｈｒであり、そし
てＸＩ　、Ｘｔ　、’Ｙ＋　、Ｙｚ及びＹ３が式（１）
において前記した意味を有する式（１）の化合物、並び
にハがＡｓｎであり、Ｚ２がＴｈｒ又はＳｅｒ以外の遺
伝的にコードされるアミノ酸の残基であり、そしてＸＩ
、Ｘｔ　、Ｙ＋　。
Ｙｚ及びＹ、が式（１）において前記した意味を有する
式（１）の化合物に関する。
この発明は特に、ＸｌがＬｙｓ　、　Ｇｌｙ又はＳｅｒ
であり、Ｘ２がＬｙｓであり、Ｙ、がＡｒｇであり、Ｙ
ｚがＰｈｅ　、　Ａｓｐ又はＧｌｕであり、Ｙ、がＬｙ
ｓであり、ＺがＧｌｎであり、そしてＺ２がＴｈｒであ
る式（Ｉ）の化合物に関する。
この発明の最も好ましい化合物は、５ＣＬＩ−ＰＡ％〔
Ｇｌｙ１３５）　−ｓｃｕ−ＰＡ　、　　〔Ｓｅｒ１３
５）　−ｓｃｕ−ＰＡ　　。
〔Ａｓｐ１５７）　−ｓｃｕ−ＰＡ　ｓ　　〔Ｓｅｒ１
３５，Ａｓｐ１５７）　−ｓｃｕ−ＰＡ及び〔Ｇｌｙ１
３５，Ａｓｐ１５７）−ｓｃｕ−ＰＡ（式中、Ａｓｎ３
０２は酵母−特異的にグリコシル化される）、そしてさ
らにＣＧ１ｎ３０２）　−ｓｃｕ−ＰＡ　、　　〔Ｇｌ
ｙ１３５，Ａｓｐ１５７゜Ｇ１ｎ３０２）−ｓｃｕ−Ｐ
Ａ及び〔Ｓｅｒ１３５．　Ａｓｐ１５７．　Ｇ１ｎ３０
２）−ｓｃｕ−ＰＡである。
本発明の形質転換された酵母株は組換ＤＮＡ技法により
次の段階を含んで成る方法により製造することができる
。
・　ｓｃｕ−ＰＡ又はその変異体をコードする構造遺伝
子を調製し、 ・　得られた構造遺伝子を適当なベクターに導入し、 ・　この得られたハイブリドベクターにより適当な宿主
生物を形質転換し、そして ・　未形質転換宿主から形質転換宿主を選択する。
ｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡの及びゲノムｕ−ＰＡ　ＤＮＡのヌ
クレオチド配列は知られている（Ｈｏｌｍｅｓ等、Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３　＋９２３（１９８５）　ｉ
　Ａ、Ｒｉｃｃｉｏ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲ
ｅｓｅａｒｃｈ　　１３．２７５９（１９８５＞　）　
、　ｕ−ＰＡのｃＤＮＡ配列及びゲノムＤＮＡ配列を知
れば、ｕ−ＰＡ又はその変異体をコードする構造遺伝子
を従来技術において既知の方法により作ることができる
。これらのＤＮＡを作る方法は、ｓｃｕ−ＰＡを生産す
るヒト細胞、例えばヒト癌細胞、又はヒト胎児腎細胞か
らｍＲＮＡを単離し、例えば適当なりＮＡＡｃ−ブとの
ハイブリダイゼーションにより所望のｍＲＮＡを選択し
、該ｍＲＮＡに相補的な単鎖ＤＮＡを調製し、そしてこ
れから二本鎖相補的ＤＮＡ（ｄｓ　ｃＤＮＡ）を調製し
、又はヒト細胞からゲノムＤＮＡを単離しそして適当な
りＮＡＡｃ−ブを用いて所望のＤＮＡを選択し、そして
所望により、得られたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを変異
せしめ、又は化学合成により構造遺伝子を調製すること
含む。好ましくは、この発明の構造遺伝子は、ｍＲＮＡ
経路を介して、そして変異体が所望の場合には、−次的
に得られたｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡの変異誘発により調製さ
れる。従って、ｕ−ＰＡの変異体をコードする構造遺伝
子は、親成熟Ｕ−陥遺伝から不所望のアミノ酸残基をコ
ードするコドンを含んで成るＤＮＡの部分を切り出し、
そしてこれを、該コドンが所望のアミノ酸残基をコード
するコドンにより置き換えられているＤＮＡセグメント
により置換するか、又は部位特定変異誘発（Ｍ、Ｊ。
Ｚｏｌｌｅｒ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　
１００，４６８（１９８３）　ｉＤ、Ｂｏｓｔｅｉｎ等
、５ｃｉｅｎｃｅ　２２９１１９３（１９８５））によ
るデオキシリボヌクレオチド置換を達成することにより
、８周製することができる。
本発明のハイブリドベクターは、酵母発現制御配列、成
熟プロウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子又は
その変異体をコードする第二ＤＮＡ配列及び該ＤＮＡ配
列とリーディングフレームが整合しており且つその上流
にあるシグナルペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列か
ら成り前記発現制御配列の転写制御のもとにあるＤＮＡ
セグメント、並びに酵母遺伝子の転写停止シグナルを含
んで成るＤＮＡ配列を含有する。
酵母発現制御配列は酵母の、特にサツカロミセス・セレ
ビシェ−のゲノムＤＮＡに由来する。好ましくは、高度
に発現される酵母遺伝子の発現制御配列がｓｃｕ−ＰＡ
の発現のために使用される。すなわち、■■遺伝子、Ａ
ＤＨＩ又はＡＤＩ（Ｉｒ遺伝子、酸性ホスファターゼ（
ＰＨ０５）遺伝子のプロモーター、エノラーゼ、グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（
ＧＡＰＤＨ）　、３−ホスホグリセレート・キナーゼ（
ＰＧＫ）　、ヘキソキナーゼ、ピルベート・デカルボキ
シラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グリコース−６−
ホスフェート・イソメラーゼ、３−ホスホグリセレート
・ムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリホスフェート・
イソメラーゼ及びグリコキナーゼの遺伝子のプロモータ
ー、又はａ−又はα−因子をコードする酵母交配フェロ
モンのプロモーターを使用することができる。さらに、
ある酵母遺伝子の上流活性化配列（ＵＡＳ）と他の酵母
遺伝子の機能的ＴＡＴＡボックスを含むプロモーター要
素とを含んで成るバイブリドプロモーター、例えば酵母
Ｐｌ！０５遺伝子のＵＡＳと酵母ＧＡＰＤＨ遺伝子の機
能的ＴＡＴＡボックスを含む下流プロモーター要素とを
含有するバイブリドプロモーターを使用することがきる
。この発明の好ましいプロモーターは、転写制御を伴う
プロモーターを含有する。このタイプのプロモーター、
例えば皿遺転子のプロモーター及びＰＨ０５−ＧＡＰＤ
Ｈバイブリドプロモーターは増殖条件の変更によりター
ンオン又はターンオフすることができる。例えば、■仮
プロモーターは、培地中の無機リン酸（塩）の濃度を単
に上昇せしめることにより意のままに抑制解除すること
ができる。この発明はその他の好ましいプロモーターは
、ＧＡＰＤＨ遺伝子のプロモーター、特にＧＡＰＤＨ遺
伝子の−５５０と−１８０の間のヌクレオチドにおいて
、特にヌクレオチド−５４０，−２６３又は−１９８に
おいて始まり、そしてヌクレオチド−５において終るそ
の機能的断片である。
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列（“シグナル
配列”）は好ましくは、通常分泌されるポリペプチドを
コードする真核性の、例えばヒト又は酵母の遺伝子に由
来する。適当なシグナル配列は、例えば、ヒトのゲノム
ＤＮＡから得られるｕ−ＰＡシグナル配列、酵母シグナ
ル配列、例えばインベルターゼ、五−フアクタ−、フエ
ロモンベブチターゼ（ＫＥＸＩ）　、”キラートキシン
（ｋｉｌｌｅｒ　ｔｏｘｉｎ）、及び抑制性酸性ホスフ
ァターゼ（ＰＨ０５）遺伝子のシグナル及びプレプロ配
列、並びにアスペルギルス・アワモリ（Ａｓ　ｅｒ　１
ｌｌｕｓ　　ａｗａｍｏｒｉ）からのグルコアミラーゼ
シグナル配列である。あるいは、使用されるプロモータ
ーに自然にリンクしている遺・転子のシグナル配列（も
し存在すれば）の部分とｕ−ＰＡシグナル配列の部分と
を連結することにより融合シグナル配列を作製すること
ができる。シグナル配列と成熟ｓｃｕ−ＰＡアミノ酸配
列との間の正確な開裂を許容する組合わせが好ましい、
前駆体分子の正確なプロセシングを促進するため、特異
的プロセシングシグナルを担持しているか又は担持して
いないプロ配列又はスペーサー配列のごとき追加の配列
を構成物に含めることができる。あるいは、生体内又は
生体外において適当な成熟化を許容する内部プロセシン
グシグナルを含有する融合蛋白質を生じさせることがで
きる。例えば、ブロセシングシグナルはゴルジ（Ｇｏｌ
ｇｉ）膜に存在する酵母エンドベブチターゼにより認識
されるＬｙｓ−Ａｒｇ残基を含有する。この発明の好ま
しいシグナル配列は、次の式： で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母Ｐ　１
１０５遺伝子のシグナル配列； 次の式： ％式％ で表わされるシグナルペプチドをコードする酵母インベ
ルターゼ遺伝子のシグナル配列；並びに、次の式： ％式％ で表わされるシグナルペプチドをコードするヒトｕ−Ｐ
Ａ遺伝子のシグナルペプチドである。
酵母転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列は好ましく
は、転写停止及びポリアゾニレ−ジョンのための適切な
シグナルを含有する酵母遺伝子の３′−フランキング配
列である。適当な３′フランキング配列は例えば使用さ
れる発現制御配列に自然にリンクしている酵母遺伝子の
それである。
好ましいフランキング配列は酵母ＰＩＩ０５遺伝子のそ
れである。
この発明のバイブリドプラスミドは、プロモーター、シ
グナル配列、ｕ−ＰＡ又はその変異体をコードするＤＮ
Ａ配列及び３′−フランキング配列のほかに、例えば該
バイブリドプラスミドにより形質転換された細胞の増殖
において重要な機能を果す追加のＤＮＡ配列を含有する
。追加のＤＮＡ配列は原核細胞及び／又は真核細胞に由
来することができ、そして染色体ＤＮＡ配列及び／又は
染色体外ＤＮＡ配列を含むことができる。例えば、追加
のＤＮＡ配列は、プラスミドＤＮＡ、例えば細菌性又は
真核性プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ及び／又は染
色体ＤＮＡ、例えば細菌、酵母又は高等真核生物の染色
体ＤＮＡに由来する（又はそれらから成る）ことができ
る。好ましいバイブリドプラスミドは細菌プラスミド、
特にニジエリシーｔ−’コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　　ｃｏｌｉ）プラスミドｐＢＲ３２２又はｐＵｃ１９
関連プラスミド、バクテリオファージλ、酵母２μプラ
スミド、及び／又は酵母染色体ＤＮＡを含有する。
この発明の好ましいバイブリドプラスミドにおいて、追
加のＤＮＡ配列は酵母複製開始点及び酵母用選択遺伝マ
ーカーを担持する。酵母複製開始点、例えば自律複製セ
グメン）（ａｒｓ）を含有するバイブリドプラスミドは
、形質転換の後酵母細胞中で染色体外に保持され、そし
て有糸分裂の際に自律複製する。酵母２μプラスミドＤ
ＮＡに相同な配列を含有するバイブリドプラスミドも同
様に使用することができる。これらのバイブリドプラス
ミドは細胞内にすでに存在する酵母２μプラスミドと組
み換えられ、又は複製開始点が存在すればそれ自身自律
複製するであろう。２μ配列は特に高頻度形質転換プラ
スミドのために好ましく、そして高コピー数をもたらす
。
酵母用選択遺伝子マーカーとして、該マーカーの表現型
発現に基き形質転換体の選択を促進する任意のマーカー
遺伝子を使用することができる。
酵母用の適当な優性マーカーは特に、抗生物質耐性を発
現するもの、又は栄養要求性酵母変異株の場合には宿主
の傷害を補完する遺伝子である。対応する遺伝子は、例
えば、抗生物質Ｇ４１８又はハイガロマイシンに対する
耐性を付与し、あるいは栄養要求変異株において原栄養
性、例えば皿。
堕用２皿又は■■をもたらす。
有利には、この発明のバイブリドプラスミド中に存在す
る追加のＤＮＡ配列はさらに、細菌宿主、特にニジエリ
シャ・コリ用の複製開始点及び選択マーカーを含有する
。酵母ハイブリドベクター中にＥ、コリ複製開始点及び
Ｅ、コリマーカーが存在することに関連して追加の有用
な特徴が存在する。第一に、Ｅ、コリでの増殖及び増幅
により多量のバイブリドプラスミドＤＮＡが得られ、そ
して第二に、Ｅ、コリに基くクローニング技法のすべて
を用いてＥ、コリ中でバイブリドプラスミドの作製が便
利に行われる。Ｅ、コリプラスミド、例えばｐＢＲ３２
２等はＥ、コリ複製開始点、及び抗生物質例えばテトラ
サイタリン及びアンピシリンに対する耐性を付与するＥ
、コリ遺伝マーカーの両者を含有し、そして酵母ハイブ
リドベクターの部分として有利に使用される。
例えば酵母及び細菌宿主（上記参照のこと）用複製開始
点及び遺伝マーカーを含有する追加のＤＮＡ配列は、酵
母プロモーター及びｓｃｕ−ＰＡコード領域と一諸にな
って本発明のバイブリドプラスミドを構成し、“ベクタ
ーＤＮＡ”と称される。
好ましい態様において、この発明は、酵母宿主株中で自
律複製することができそして選択マーカーを有するバイ
ブリドプラスミドに関し、このバイブリドプラスミドは
、酵母発現制御配列、成熟プロウロキナーゼ型プラスミ
ノーゲン活性化因子又はその変異体をコードする第二Ｄ
ＮＡ配列及びＭ’Ａ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列とリーディングフ
レームが整合しており且つその上流にあるシグナルペプ
チドをコードする第二ＤＮＡ配列から成るＤＮＡセグメ
ント、並びに酵母遺伝子の転写停止シグナルを含んで成
るＤＮＡ配列を含んで成り、前記ＤＮＡセグメントは転
写開始及び停止シグナル並びにコードされた翻訳開始及
び終止シグナルと一緒に該ハイブリドベクター中で前記
発現制御配列の制御のもとに位置し、これによって、形
質転換された酵母株中でそれが発現され、前記プロウロ
キナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子又はその変異体
が生産される。
この発明のハイブリドベクターはそれ自体既知の方法に
より、例えば、酵母発現制御配列、シグナルペプチドコ
ード領域及びｕ−ＰＡ又はその変異体をコードするＤＮ
Ａ配列からなるＤＮＡセグメント、酵母遺伝子の３′−
フランキング配列、並びにベクターＤＮＡを連結するこ
とにより調製される。
バイブリドプラスミドの調製のためには、便利には、少
なくとも１個の制限部位、好ましくは２個以上の制限部
位を有するマツプされた環状ベクターＤＮＡ、例えば細
菌プラスミドＤＮＡ等（前記を参照のこと）を使用する
ことができる。有利には、ベクターＤＮＡは酵母及び／
又は細菌宿主のための複製開始点及び遺伝子マーカーを
すでに含有する。ベクターＤＮＡは適切な制限エンドヌ
クレアーゼを用いて開裂される。制限酵素処理されたＤ
ＮＡを酵母発現制御配列を含有するＤＮＡ断片、前記Ｄ
ＮＡセグメント、及び転換停止シグナルを含有する前記
ＤＮＡ配列に連結する。これらのＤＮＡ断片の連結の前
又は後（又は同時に）に、酵母又は細菌宿主用の複製開
始点及び／又はマーカーを導入することができる。制限
及び連結条件は、ベクターＤＮＡ及び発現制御配列の本
質的機能に対する妨害がないように選択される。ハイブ
リドベクターは、段階的に、又は注目のすべての配列を
含んで成る２個のＤＮＡセグメントを連結することによ
り組み立てることができる。
ＤＮＡセグメントを生体外で連結するために種々の技法
を用いることができる。ある種の制限エンドヌクレアー
ゼにより生成した。平滑末端（完全に塩基対合したＤＮ
Ａデュプレックス）はＴ４　ＤＮＡリガーゼにより直接
連結することができる。
より普通には、ＤＮＡセグメントはそれらの単鎖接着末
端を介して連結されそしてＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４
　ＤＮＡリガーゼにより共有結合的に閉じられる。この
様な単鎖“接着末端は、不ぞろい末端を生成する（ＤＮ
Ａデュプレックスの２本の鎖が少数個のヌクレオチド離
れた異る点で開裂される）他のクラスのエンドヌクレオ
チドにより形成され得る。単鎖はさらに、ターミナルト
ランスフェラーゼを用いて平滑末端又は不ぞろい末端に
ヌクレオチドを付加することにより（“ホモポリマーテ
ィリング）、あるいは平滑末端ＤＮＡセグメントの１つ
の鎖を適当なエキソヌクレアーゼ、例えばλエキソヌク
レアーゼにより単にチューバンク（ｃｈｅｗｉｎｇ　ｂ
ａｃｋ）することにより形成することができる。接着末
端を形成するための他の方法は平滑末端ＤＮＡセグメン
トに接着末端形成エンドヌクレアーゼのための認識部位
を含有する化学合成リンカ−ＤＮＡを連結し、そして生
じたＤＮＡを対応するエンドヌクレアーゼにより消化す
ることから成る。
この発明のハイブリドベクターの構成物、例えば酵母プ
ロモーター、シグナル配列を含むｕ−ＰＡ又はその変異
体のための構造遺伝子、転写クーミネーター、複製系等
は、プロモーター機能を保証するよ・うに所定の順序に
一緒に連結される。これらの構成物は共通の制限部位を
介して、又は合成リンカ−分子により連結してこれらの
構成物の適切な方向及び順序を保証する。
この発明の形質転換された酵母株は、それ自体既知の方
法により、例えば酵母発現制御配列、成熟プロウロキナ
ーゼ型プラスミノーゲン活性化因子又はその変異体をコ
ードする第二ＤＮＡ配列及び該ＤＮＡ配列とリーディン
グフレームが整合しており且つその上流にあるシグナル
ペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列から成り前記発現
制御配列の転写制御のもとにあるＤＮＡセグメント、並
びに酵母遺伝子の転写停止シグナルを含んで成るＤＮＡ
配列を含有するハイブリドベクターにより酵母株を形質
転換することにより製造される。
適当な酵母宿主生物にはタルイベロミセスー建ヵαμ■
μＵ皇狙）属、キャンディダ皿鉦虹韮）属、ピヒア（Ｐ
ｉｃｈｉａ）属、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
　ｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ト
ルロプシス（三匹旦匹ｎ）属及び類縁酸の種（Ｊ、Ｌｏ
ｄｄｅｒ、ＴｈｅＹｅａｓｔｓ、アムステルダム、１９
７１）　、特にサツカロミセス・セレビシェ−の株が含
まれる。
酵母宿主細胞の形質転換は当業界において既知の方法に
より達成される。例えば、形質転換はＨｉｎｎｅｎ等（
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ７５
．１９２９（１９７Ｂ）　）により記載された方法に従
って達成される。この方法は次の３段階に分けることが
できる。
（１）酵母細胞壁又はその部分の除去。
（２）ＰＥＧ　（ポリエチレングリコール）及びＣａ”
イオンの存在下での形質転換ＤＮＡによる“裸の”酵母
細胞（スフェロプラスト）の処理。
（３）寒天固相中での細胞壁の再生及び形質転換された
細胞の選択。
好ましい方法は次の通りである。
ａｄ（１）：　　グルコシダーゼの種々の調製物、例え
ばカタツムリの腸液〔例えば、グルスラーゼ（Ｇｌｕｓ
ｕｌａｓｅ）又はヘリカーゼ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ）　）
　、あるいは微生物から得られる酵素混合物〔例えば、
チモリアーゼ（Ｚｙ＋ｎｏｌｙａｓｅ）　）を用いて、
浸透圧的に安定な溶液（例えば１Ｍソルビトール）中で
、酵母細胞壁を酵素的に除去する。
ａｄ（２）：　　酵母スフェロプラストをＰＥＧの存在
下で凝集せしめ、そして細胞膜の局部的融合を誘導する
。“融合−株”条件の発生が重要であり、そして多くの
形質転換された酵母細胞が形質転換の過程で二倍体に又
は二倍体にさえなる。融合したスフェロプラストの選択
を可能にする方法を用いて形質転換体を濃縮することが
できる。すなわち、あらかじめ選択された融合生成物中
の形質転換された細胞を容易に選択することができる。
ａｄ（３）：　　細胞壁を有しない酵母細胞は分裂しな
いので、細胞壁が再生されなければならない。
この再生はスフェロプラストを寒天中に包埋することに
より便利に行われる。例えば、溶融した寒天（約５０℃
）をスフェロプラストと混合する。
溶液を酵母の増殖温度（約３０″Ｃ）に冷却した後、固
層を得る。この寒天層は、スフェロプラストからの必須
巨大分子の急速な拡散及び喪失を回避し、そしてそれに
よって細胞壁の再生を促進するためのものである。しか
しながら、スフェロプラストをあらかじめ形成された寒
天層の表面上にプレートすることによっても細胞壁の再
生を得ることができる（低い効率においてであるが）。
好ましくは、再生寒天は、再生と形質転換された細胞の
選択とを同時に可能にするように調製される。アミノ酸
生合成経路の酵素をコードする酵素遺伝子が一般に選択
マーカー（前記）として使用されるので再生は好ましく
は酵母最少培地寒天中で行われる。非常に高い再生効率
が要求される場合、次の二段階法が有利である。すなわ
ち、（１）冨複合培地中での細胞壁の再生、及び（２）
選択寒天プレート上への細胞層のレプリカプレートによ
る形質転換細胞の選択、を行う。
ハイブリドベクターがなんらのマーカー遺伝子も含有し
ない場合、形質転換された細胞は他の方法によって同定
することができる。この様な方法としでは、例えば、ハ
イブリドベクターの配列に相同なラベルされたＤＮＡ配
列とのインシチュ（ｉｎ　５ｉｔｕ）　ハイブリダイゼ
ーシヨン（Ｈｉｎｎｅｎ等、前掲、による〕、導入され
た遺伝子の生成物に対する抗体が入手可能であればイン
シチュ（ｉｎ　５ｉｔｕ）イムノアッセイ、又は形質転
換プラスミドによりコードされた遺伝子生成物を他のス
クリーニング法が包含される。
あるいは、酵母を本発明のハイブリドベクターと酵母用
遺伝マーカーを含有する第二ベクターとにより同時形質
転換することができる。２つの異るベクターが共通のＤ
ＮＡ配列（これらは細菌性配列であることができる）を
有する場合、組換が起こり、融合した選択可能なバイブ
リド分子を導く。
本発明のバイブリドプラスミドを含有する形質転換され
た酵母株は、当業界において知られている変異及び選択
により、ｓｃｕ−ＰＡ又はその変異体の生産について改
良を行うことができる。変異はＵ、Ｖ、照射又は適当な
化学薬剤により行うことができる。細胞内での生産され
たｓｃｕ−ＰＡ又はその変異体の蛋白質分解的分解を防
止するため、プロテアーゼ欠損変異株、特に酵母変異株
の調製が特に好ましい。
常法に従って適当な変異株を選択しそして単離すること
ができる。
この発明により得られるｓｃｕ−ＰＡ蛋白質、特に新規
なｓｃｕ−ＰＡ蛋白質は、価値ある薬理学的性質を有す
る。これらは既知のプラスミノーゲン活性化因子と同様
にしてヒトにおいて、血栓症、又はプラスミノーゲンの
活性化の機構を介しての局所的フィブリン溶解又は蛋白
質分解活性を生成することが望ましい他の状態、例えば
動脈硬化症、心筋及び脳梗塞、静脈血栓症、血栓塞栓症
、術後血栓症、血栓性静脈炎、及び糖尿病性脈管疾患（
ｄｉａｂｅｔｉｃｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｉｅｓ）の予
防又は治病のために使用することができる。
この発明はまた、療法的有効量の活性成分（ｓｃｕ−Ｐ
Ａ又はその変異体）を、非経口的投与、例えば静脈内投
与に適しそして活性成分と不都合な反応を行わない有機
又は無機の固体又は液体の医薬として許容されるキャリ
ヤーと共に含んで成る医薬組成物に関する。
特に注入溶液、特に水性溶液又は懸濁液が好ましく、こ
れらは、例えば、活性成分を単独で又はキャリヤー、例
えばマンニトール、ラクトース、グルコース、アルブミ
ン等と共に含有する凍結乾燥調製物から使用前に調製す
ることができる。医薬組成物は無菌化することができ、
そして所望により添加剤、例えば防腐剤、安定剤、乳化
剤、可溶化剤、緩衝剤及び／又は浸透圧調整用の塩、例
えば塩化ナトリウムを含有することができる。小孔サイ
ズ（０，４５卿以下の直径）のフィルターを通す無菌濾
過により無菌化を達成することができ、次に所望により
この調製物を凍結乾燥することができる。無菌性を補助
するために抗生物質を添加することができる。例えば、
この発明のｓｃｕ−ＰＡ蛋白質は、５％のグルコース並
びに場合によっては安定剤及び塩を含有する無菌水溶液
中に製剤化することができる。
本発明の医薬組成物は、単位投与当り１〜２０００■の
医薬として許容されるキャリヤー及び単位投与当り約１
〜２０■、好ましくは３〜１５■の活性成分（ｓｃｕ−
ＰＡ又はその変異体）を含んで成る単位投与形で供給さ
れる。
疾患のタイプ並びに患者の年令及び状態に依存して、約
７０ｋｇの体重の患者を処置するために２４時間当り２
０〜１５０■、好ましくは４５〜１００■が投与される
。
この発明はまた、この発明の生物学的に活性な蛋白質を
医薬として許容されるキャリヤーと混合することを特徴
とする医薬組成物の製造方法に関する。
人体の予防的及び治療的処治ための新規蛋白質の使用も
この発明の対象である。
本発明はまた、新規なバイブリドプラスミド及び該プラ
スミドにより形質転換された酵母株並びにこれらの製造
方法に関する。
この発明はまた、例に記載したｓｃｕ−ＰＡ蛋白質、ハ
イブリドベクター、形質転換された宿主、及びこれらの
製造方法に関する。
次の実験の部において、この発明の種々の態様を図面に
言及しながら説明する。下記の例は本発明を説明するた
めのものであって、発明の範囲を限定するものではない
。
ファージλのｃ１遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝
子の部分を含有するプラスミドｐＵＮ１２１（Ｂ、Ｎｉ
１ｓｓｏｎ等、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、　１１
．８０１９−８０３０（１９８３）　）の１．５ｋｂの
Ｐｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨｌ断片を、Ｐｓｔｌ及びＢａｍ
）Ｉ　Ｉで切断されたｐＵｃ１８　（Ｊ、Ｎｏｒｒａｎ
ｄｅｒ等、Ｇａｎｅ、　２６，１０１−１０６（１９８
３）］にクローン化する。
得られたクローンをＰｓｔｌにより消化する。３′−突
出末端を７４　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ、Ｍｉｎｉａｔ
ｉｓ等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９Ｂ
２）、３９５頁〕との反応において除去し、そしてその
平滑末端にＸｈｏ　Ｉリンカ−（５’　−ＣＣＴＧＧＡ
ＧＧ−３’　、ビオラプス）を連結する。Ｘｈｏ　Ｉに
より消化した後、分子を連結により再環化する。連結混
合物のアリコートを使用して、Ｃａ”処理されたＥ、コ
リＨＢＩＯＩ細胞を形質転換する０個々のアンピシリン
耐性の形質転換されたコロニーのＤＮＡを分析する。幾
つかの正しいクローンの１つを選択し、そしてｐｃｓ１
６と称する。
Ｂ）ブースミド　Ｃ３１６／ＵＰＡの　制（４文）ヒト
Ｈｅｐ３細胞（７ＪＩＨｉａｔｉｓ等、ｐ１８８−２４
６、前掲〕から得られたｍＲＮＡからウロキナーゼｃＤ
ＮＡを調製する。ｕ−ＰＡ　ｃＤＮ＾の１．３　ｋｂ　
Ｓｍａ　ｌ　−ＢａｍＨｌ断片及びｌ　ｋｂ　　Ｂａｍ
ＨＩ　−ＥｃｏＲｌ断片をｐＵＮ１２１　（Ｂ、Ｎｉ１
ｓｓｏｎ等、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１．
８０１９−８０３０（１９８３））のＳｍａ　Ｉ　、　
ＥｃｏＲ１部位にクローン化したプラスミドｐｃＵＫ１
７６を得る。ヒトｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡ挿入部の制限エン
ドヌクレアーゼ地図を第１図に示す。ｕ−ＰＡ挿入部の
ヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列を第２図
に示す。ｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡ挿入部をプラスミドｐｃｓ
１６にサブクローニングする。サブクローン化されたｃ
ＤＮＡは５′−非翻訳領域（第１図）中のＳｍａ　１部
位から３′−非翻訳領域中のヌクレオチド位置１４３９
−１４４４　（第２図）のＰｖｕ　１１部位に延びる。
１５■のプラスミドｐｃＵＫ１７６をＰｖｕ　ＩＩによ
り消化する。３７９ｂｐ　ＰｖｕＩ［断片を、Ｔｒｉｓ
−ボレート−ＥＤＴＥ緩衝液（ｐＨ８，３）中１．５％
アガロース上で他の断片から単離する。ＤＮＡを電気溶
出し、ＤＥ５２（ワットマン）イオン交換クロマトグラ
フィーにより精製し、そしてエタノールで沈澱せしめる
。−１，２シの単鎖Ｘｈｏ　Ｉリンカ−（５’　−ＣＣ
ＴＣＧＡＧＧ−３′）をその５′−・末端においてリン
酸化し、７５℃にて１０分間加熱し、室温に冷却する間
に自己アニールせしめ、そして−２０℃に冷却する。
０．９罐のキナーゼ処理された二本鎖Ｘｈｏ　Ｉリンカ
−を８０倍モル過剰でｐｃＵＫ１７６　（上記参照のこ
と）の３７９ｂｐ　Ｐｖｕｌｌ断片の平滑末端に、２０
Ｉｌ！の６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ７，５
）、１０ｍＭ　ＭｇＣｎ　ｚ、　５ｍＭ　ＤＴＴ。
３．５ｍＭへＴｒ’及び４００ユニツトのＴ４　［ＩＮ
−Ａリガーゼ（バイオラプス）中で１５℃にて１時間連
結する。
この混合物を８５℃にて１０分間加熱する。過剰のリン
カ−分子を、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ及び３００１酢酸ナト
リウム（ｐＨ６，０）の存在下、０．５４容量のイソプ
ロパツールにより、室温にて３０分間沈澱除去する。Ｄ
ＮＡをχｈｏｌ及びＢａｍＨＩにより消化する。
１２１ｂｐ　Ｂａｌｌｌ１（Ｉ−χｈｏｌ断片をＴｒｉ
ｓ−ボレート−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８，３）中１．５
％アガロースゲル上で単離する。６題のプラスミドｐｃ
ＵＫ１７６をＳｍａ　１及びＢａｎ＋Ｈ１で消化する。
　ｕ−ＰＡコード配列のほとんどを含有する１、　３　
ｋｂ　Ｓｍａ　Ｉ　−ＢａｌＩｌｌ　ｌ断片を単離する
。６躍のプラスミドｐｃｓ１６をＳｍａ　Ｉ及びＸｈｏ
　１で消化する。２．７ｋｂのベクター断片を単離する
。
ＤＮＡ断片をゲルから電気溶出し、そしてエタノール沈
澱せしめる。Ｑ、　２ｐｒｎｏ１ｅの１．３ｋｂ　Ｓｍ
ａ　Ｉ　−１１ａｍＨｌ断片、０．２９ＩＩＩ０１９の
１２１ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−Ｘｈｏ　１断片（両断片が
一緒になって完全なｕ−ＰＡコード配列を含む）及び０
．１　ｐｍｏｌｅの２．７ｋｂヘクタ一断片を、１０Ｉ
！！の６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１（Ｊ　　（ｐＨ７，５
）、　１０ｍＭＭｇＣｊ２１５　ｍＭ　ＤＴＴ、　　３
．５　ｍＭ　ＡＴＰ及び４００ユニツトのＴ４　ＤＮＡ
リガーゼ中で１５℃にて連結する。１μ！及び３ｊ１１
アリコートの連結混合物を１００ＩのＣａ４４処理ε、
コリＨＢＩＯＩ細胞に加える。記載されている様にして
形質転換を行う〔八、１Ｉｉｎｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５．１９２９
（１９７８）　）　、　　１２個のアンピシリン耐性コ
ロニーを１００■／！のアンピシリンを含有するＬＢ培
地中で増殖せしめる。
Ｈｏｌｍｅｓ等（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１４
１９３（１９８１）　）に従ってＤＮＡを単離し、そし
てＥｃｏＲＩ　、Ｐｖｕ　Ｕ及びＸｈｏ　Ｉ制限消化に
より分析する。予想通りの制限断片を有する単一のコロ
ニーのプラスミドＤＮＡをｐｃｓ１６／　ＵＰＡと称す
る。
同様にして、Ｓｍａ　Ｉ部位（第２図中、ヌクレオチド
位置１−６）からヌクレオチド位置１６３７−１６４２
　（第２図）のＰｓｔ１部位までのウロキナーゼｃＤＮ
Ａをプラスミドｐｃｓ１６中にサブクローニングする。
プラスミドｐｃＵＫ１７６をＰｓｔＩで消化する。
Ｍａｎｉａｔｉｓ等（前掲、３９５頁）に記載されてい
るようにしてＴ４　ＯＮＡポリメラーゼとの反応により
接着末端を平滑末端に転換する。１．２ｋｂＤＮＡ断片
を単離する。前記の様にしてＸｈｏ　１リンカ−を付加
する。ＤＮＡをＢａｗｌ（Ｉ及びＸｈｏ　Ｉにより消化
し、そして３１５ｂｐ　　Ｂａｍｔｌ　Ｉ　−Ｘｈｏ　
Ｉ断片を単離する。
Ｑ、２ｐｍｏｌｅのこの断片を１．３　ｋｂ　Ｓｍａ　
Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片及び２．７ｋｂベクタ一断片（前
記参照のこと）に連結する。連結混合物を用いてＥ、コ
リＨＢＩＯＩ　Ｃａ”細胞を形質転換する。予想通りの
制限断片を有する単一クローンのプラスミドＤＮＡをｐ
ｃｓ１６／ＵＰＡ−１３と称する。このプラスミドは、
５′−非翻訳領域（第１図）中のＳｍａ　Ｉから３′−
非翻訳領域中のヌクレオチド位置１６４１　（第２図）
におけるＰｓｔ１部位までのｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡ挿入部
を含有する。
ブラスミ４ドｐｃｓ１６／１ｌＰＡ　との唯一の違いは
延長された３′−非翻訳Ｎ域である。
ル　ｌ　　　　るブースミド３１ＲＩＴの４種類のオリ
ゴデオキシリボヌクレオチド＝１−１．Ｉ−２，Ｉ−３
，１−４をＤＮＡ合成機（モデル３８０Ｂ、アプライド
・バイオシステムス）により合成する。脱ブロッキング
の後、合成断片を８Ｍ尿素を含有する１２％ポリアクリ
ルアミドゲル上で精製する。　Ｓｅｐ、Ｐａｋ（ウォー
ターズ社）を用いて無塩精製オリゴデオキシリボヌクレ
オチドを行う。これらの断片は、頻繁に使用される酵母
のコドンを用するインベルターゼシグナル配列コードす
るデュプレックスを構成する。
１．５ｎのｐ３１Ｒ／５Ｓ−ＴＰＡΔ２（ヨー０７バ特
許出願１ｌｋＬ１４３，０８１）を、ＩＯＵのＥｃｏＲ
Ｉ　　（ベーリンガー）により５０１！！の１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、　６ｎ＋ＭＭｇＣ１
ｚ、　１００ｍＭ　ＮａＣｊ！　、　　６ｍＭメルカプ
トエタノール中で３７℃にて１時間消化する。１ｊ！ｌ
の２．５ＭＮａＣＪを添加した後、ＩＯＵのｘｈｏｌ（
ベーリンガー）を添加し、そして３７℃にて１時間イン
キュベートする。４．２ｋｂのベクターを０．８％分取
用アガロースゲル上で単離する。ゲルスライスをミクロ
・コロイトール（Ｍｉｃｒｏ　Ｃｏ１１ｏｉｄｏｒ）管
（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　Ｇｎｂｔｌ）に移し、２００　
ＩｌｌのＴＥで覆い、そして電気溶出する（９０ｍＭに
て５０分間電気泳動する）、ＴＥ溶液を集め、そして０
．１容量の１０χＴＮＥを添加した後、２．５容量の純
エタノール中で沈澱せしめる。ＤＮＡペレットを冷８０
％エタノールで洗浄し、そして真空乾燥する。ＤＮＡを
６ｄのＴ　Ｅ　（４０ｐｍｏｌｅ／　ｔｄ　）に再懸濁
する。
１０Ｉの０．５　Ｍ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　　（ｐＨ
８）中に１０ｐｍｏｌｅずつの４種類のデオキシリボヌ
クレオチドを含有する溶液を水浴中で９５℃にて５分間
インキュベートする。水浴を５時間にわたって徐々に３
０℃に冷却する。このアニールされた混合物に、２Ｊｔ
ｌずつの０．　Ｉ　Ｍ　　ＭｇＣ１ｚ、　０．　Ｉ　Ｍ
　　ＮａＣｊ２．３０ｍＭ　ＤＴＴ。
４ｍＭＡＴＰ及び８Ｕ（１ｍ）のポリヌクレオチドキナ
ーゼ（ベーリンガー）を加える。キナーゼ処理を３７℃
にて１時間行う。アニールさんそしてキナーゼ処理され
たオリゴデオキシリボヌクレオチド及び６Ｑｐｍｏｌｅ
のＥｃｏＲＩ　−Ｘｈｏ　Ｉ切断ｐ３１Ｒ／５Ｓ−ＴＰ
ＡΔ２ベクター（１，５ｄ）を、４００Ｕ（１ｍ）の７
４　ＤＮＡリガーゼ（バイオラプス）を用いて１４℃に
て１７時間連結する。６５℃にて１０分間のインキュベ
ーシヨンにより反応を停止せしめる。
１０１１１のこの連結混合物を用いて、Ｅ、コリＨＢＩ
ＯＩＣａ４４細胞を形質転換する（Ｍ、Ｄａｇｅｒｔ及
びＳ、Ｄ。
Ｅｈｒｌｉｃｈ、Ｇｅｎｅ　　５６，２３−２８（１９
７９））　−２０個のａｍｐ”コロニーを拾い上げる。
迅速単離法（Ｄ、Ｓ、Ｈｏｌｍｅｓ及び門３口ｕｉｇｌ
ｅｙ、Ａｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１４１９３−１９
７（１９８１））によりＤＮＡを調製する。ＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩ及びχｈｏＩにより消化し、ＥｃｏＲＩ末端に
おいて放射性ラベルし、そしてマーカーとしてｐＢＲ３
２２のＨａｅ　Ｉ［Ｉ切断ＤＮＡを用いて８Ｍ尿素を含
有する６％ポリアクリルアミドゲル上で分析する。２０
個すべてのコロニーから得られたＤＮＡについて、正し
いサイズのバンドが観察される。１つのクローンを、１
００ｇ／−のアンピシリンを含有する。ＬＢ培地１０Ｏ
ＩＩＩＺ中で増殖せしめる。プラスミドＤＮＡを単離し
、そしてｐ３２ＲＩＴ−１２と称する。
ｐＪＤＢ２０７／　ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰＡは■旺プロモ
ーター、インベルターゼシグナル配列、成熟ウロキナー
ゼのコード配列及び二転写ターミネータ−を、ｐＪＤＢ
２０７酵母発現ベクター中にクローン化されたタンデム
配置として含有する。
２０ガのプラスミドｐｃｓ１６／ＵＰＡを４０ユニツト
のＥｃｏＲＩにより完全消化する。フェノール抽出及び
エタノール沈澱の後、ＥｃｏＲＩで消化されたＤＮＡを
Ｔａｑ　Ｉにより６５℃にてさらに切断する。
得られる断片を分取用１．２％アガロースゲル上で分離
する。４６２ｂｐのＴａｑ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片をゲ
ルからの電気溶出及びエタノール沈澱により単離する。
次の式： ％式％ で表わされるオリゴデオキシリボヌクレオチドリンカ−
を前記ＤＮＡ断片のＴａｑ　Ｉ部位に連結する。
このリンカ−は成熟ｕ−ＰＡのコード配列（第２図中、
ヌクレオチド１３０−１５４）の５′−末端を回復し、
そしてインベルターゼシグナル配列へのインフレーム（
ｉｎ　ｆｒａｍｅ）融合を確立する。リンカ−の５′−
ＣＴＧＣＡ配列がＨｇａ　１開列により形成されたイン
ベルターゼシグナル配列の対応する３′−くぼみ末断を
満たす。
３００ｐｍｏｌｅずつのオリゴデオキシヌクレオチド（
１）及び（ＩＩ）をリン酸化し、そしてアリールする。
　５．２５ｎ　（６００ｐｍｏｌｅ）のリン酸化された
二本鎖リンカ−ＤＮＡを１．７　ｎ　（５，６ｐｍｏｌ
ｅ）の４６２ｐｂＴａｑ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片（前記
参照のこと）に、１７５Ｉの６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（
Ｊ　　（ｐＨ７，５）、１抛’　”ｇｃｌ　ｚ＊　１　
ｍＭＡＴＰ、　５　ｍＭ　ＤＴＴ及び８００ユニ７トの
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ中で１５℃にて１６時間連結する
。Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを８５℃にて１０分間不活性化
する。過剰のリンカ−を、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、３００
ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０）及び０．５４容量の
イソプロパツールの存在下で沈澱により除去する。ＤＮ
ＡをＰｓｔｌで消化する。ヌクレオチド４３６　（Ｐｓ
ｔ　１部位、第２図参照のこと）までのｕ−ＰＡをコー
ドするＤＮＡ配列に付加されたリンカ−を含有するユニ
ーク３１２ｂｐ断片を単離する。ＤＮＡ断片を電気溶出
及びエタノール沈澱により精製する。
プラスミドｐｃｓ１６／υＰＡをＸｈｏ　Ｉ及びＰｓｔ
Ｉにより消化する。　１００７ｂｐ　Ｐｓｔ　Ｉ　−Ｘ
ｈｏ　１断片を単離しそして精製する。この断片はウロ
キナーゼのコード配列のほとんどを含有する。
プラスミドｐ３１ＲＩＴ−１２（例２を参照のこと）を
５ａｉｌ及びＸｂｏ　Ｉにより消化する。８８２ｂｐ　
Ｓａｌ　１−Ｘｂｏｌ断片を電気溶出及びエタノール沈
澱によるゲルから単離する。ゲルをＢａｍＨＩ及びＨｇ
ａ　Ｉによりさらに消化する。ニプロモーター領域及び
インベルターゼシグナル配列を含有する５９１ｂｐＢａ
ｍＨＩ　−Ｈｇａ　ｌ断片を単離する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／皿−ＴＰＡ１８　（ヨーロ
ッパ特許出願Ｎ１１４３，０８１を参照のこと）をＢａ
ｍＨＩ及びＸｈｏ　Ｉで消化する。６，８ｋｂベクタ一
断片を、Ｔｒｉｓ−アセテート緩衝液（ｐＨ８，２）中
分取用０．６％アガロースゲル上で単離する。ＤＮＡを
電気溶出し、そしてエタノールで沈澱せしめる。
すべてのＤＮＡ断片を水中に０．１　ｐｍｏｌｅ／　ｔ
ｔｌ　（７）濃度で再懸濁する。０．２　ｐｍｏｌｅの
５９１ｂｐ　ＢａｍＨＩ　−Ｈｇａ　ｌ断片、０．２　
ｐｍｏｌｅの３１２ｂｐ　Ｈｇａ　Ｉ　−Ｐｓｔ　ｌ断
片、０．２　ｐｍｏｌｅの１００７ｂｐ　Ｐｓｔ　Ｉ−
Ｘｈｏ　ｌ断片及び０．１　ｐｍｏｌｅの６．８　ｋｂ
　　ＢａｍＨＩ　−Ｘｈｏ　Ｉベクター断片を１５℃に
て１５時間、１０．ｍの５０ｍＭ　Ｔｒｒｓ−ＨＣＩ　
　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｚ＋　５ｍＭ
　ＤＴＴ、　　１ｍＭ八Ｔへ及び４００ユニツトのＴ４
　ＤＮＡリガーゼ中で連結する。
１ｊｔｌ（７）連結混合物を用いてＥ、コリＨＢＩＯＩ
　Ｃａ”細胞を形質転換する。１２個のａｍｐ”コロニ
ーを拾い、そして１００■／Ｉｔのアンピシリンを含有
するＬＢ培地中で増殖せしめる。迅速単離法（Ｄ、Ｓ。
Ｈｏｌｍｅｓ等、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１４
，１９３（１９８１）　）によりＤＮＡを調製する。旧
ｎｄＩ［［及びＥｃｏＲＩによるプラスミドＤＮＡの制
限消化物上に予想通りの制限断片が観察される。単一コ
ロニーのプラスミドＤＮＡを選択し、そしてｐＪＤＢ２
０７／　ＰＨ０５−１−ＵＰＡと称する。
±土　ブースミド　ＪＯＢ２０７　　ＰＨ０５−ＵＰＡ
Ｏ制この構成物は、ｐＪＤＢ２０７酵母ベクター中にク
ローン化すしたＰＨ０５転写ターミネータ−１成Ｐ　ｆ
）　。
キナーゼのコード配列にフレームを合わせて連結された
ＰＨ０５シグナル配列、及び皿プロモーターを含んで成
る。
次の式： で表わされるオリゴデオキシリポヌクレオチドリンカー
はＰ１１０５シグナル配列の８個のヌクレオチド（５’
　−ＣＣＡＡＴＧＣＡ）　（内部Ｂａｔ１部位からのそ
のプロセシング部位まで）を提供し、そして成熟ｕ−Ｐ
Ａのコード配列（ヌクレオチド位置１３０−１５４　、
第２図）へのインフレーム融合を確立する。リンカ−を
、ｐｃｓ１６／　ＵＰＡ　（例えば３を参照のこと）の
４６２ｂｐＴａｑ　Ｉ　−ＥｃｏＲｌ断片のＴａｑ　１
部位に連結する。例３の方法に従ってリン酸化、アニー
リング及び連結を行う。ＤＮＡをＢａ１Ｉ及びＰｓｔｌ
により消化する。３１５ｂｐ断片を単離する。このＤＮ
Ａ断片は位置４３６（第２図）のＰｓｔＩ部位までのｕ
−ＰＡ遺伝子のＤＮＡ配列を含有する。
プラスミドｐ３１（ヨーロッパ特許出願Ｎｌｌ００．５
６１）をＢａｌ　Ｉ及びＢａｍＨＩで消化する。ＰＨ０
５プロモーター及び■競シグナル配列のほとんどを含有
する５８４ｂｐ　ＢａｍＨＩ　−Ｂａｌ　１断片を単離
する。ＤＮＡ断片を電気溶出及びＤＥ５２クロマトグラ
フィーにより精製し、エタノールにより沈澱せしめ、そ
して水中に０．１　ｐｍｏｌｅ／　ｔｄの濃度で再懸濁
する。
０、２　ｐｍｏｌｅの５８４ｂｐ　Ｂａ１ｒｎ　Ｉ　−
Ｂａｌ　ｌ断片、０．２ｐｍｏｌｅの３１５ｂｐ　Ｂａ
ｌ　Ｉ　−Ｐｓｔ　ｌ断片、０．２　ｐｍｏｌｅの１０
０７　Ｐｓｔ　Ｉ　−Ｘｈｏ　ｌ断片（例３を参照のこ
と）及び０．１　ｐｍｏｌｅの６．８　ｋｂ　　Ｒａｍ
１ｌ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉベクター断片（例３を参照のこ
と）を連結し、そしてこれを用いてＥ、コリＩＩ　Ｂ　
１０１を形質転換する。６個のａＩＩｌｐＲコロニーを
拾い、そして１００■／ｌのアンピシリンを含有するＬ
Ｂ培地中で増殖せしめる。
プラスミドＤＮＡを迅速ＤＮＡ法により調製し、そして
ＢａｍＨＩ　／　Ｐｓｔ　Ｔ二重消化により分析する。
予想通りの制限断片を有する単一クローンを選択し、そ
してそのプラスミドＤＮＡをＩ）ＪＤＢ２０７／■邦−
［ＩＰ八と称する。。
ｆｉ！　　ブースミド　ＪＤＢ２０７　　ＰＨ０５−Ｓ
ＳＵＰＡ（７）　　ｌｌｒ＋１このプラスミドは、酵母
発現ベクター中ＰＨ０５プロモーターの制御のもとにそ
れ自体のシグナル配列を有するウロキナーゼ遺伝子を含
有する。
２０■のプラスミドｐＣＳ１６／ＵＰＡ−１３（例１を
参照のこと）を１００ユニツトのＢｇｌ　Ｉにより完全
消化する（第２図中、ヌクレオチド位置７６−８６）。
生・する３個の断片をＴｒｉｓ−ボレー１−−ＥＤＴＡ
緩衝液中分取用１％アガロースゲル上で分離する。１．
７　ｋｂＢｇｌ　ｌ断片を電気溶出し、そしてエタノー
ルで沈澱せしめる。
以下余日 次の式： （Ｉ）　　５’−ＡＡＴＴＣＧＡＴＴＡＣＣＡＡＴＧＡ
ＧＡＧＣＣＣＴＧＣ−３’（ＩＩ）　３’−ＧＣＴＡＡ
ＴＧＧＴＴＡＣＴＣＴＣ（ｉＧＧ　　−５’で表わされ
るオリゴデオキシリボヌクレオチドリンカ−は、ＰＨ０
５のＡＴＧの前の皿の５′−非コード領域の８ヌクレオ
チドに連結されたＥｃｏＲ１部位及びＡＴＧを含むｕ−
ＰＡのコード配列のヌクレオチド７Ｏ−８２（第２図）
を有する。例３に記載したようにしてＤＮＡのＢｇｌ　
Ｉ接着末端にリンカ−を連結する。ＤＮＡをＥｃｏＲＩ
及びＰｓｔＩにより消化する。
ｕ−ＰＡシグナシレ配列及びヌクレオチド４３６（第２
図中、Ｐｓｔ１部位）までの成熟ｕ−ＰＡのコード配列
を含有する３８０ｂｐ断片を単離する。
プラスミドｐ３１（ヨーロッパ特許出１３１ｍ１００□
５６１を参照のこと）をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＴで消
化し、そして…匹プロモーターを含有するＢａｎ＋ＨＩ
　−ＥｃｏＲＴ断片を単離する。ＤＮＡ断片をアガロー
スゲルから電気？容出し、ＤＥ５２クロマトグラフィー
により精製し、エタノールで沈澱せしめ、そして水中に
０、１　　ｐｍｏｌｅ／　ｕｌの濃度で再懸濁する。
０、２　ｐｍｏｌｅの５３４ｂｐ　Ｂａｍ）Ｉ　Ｉ　−
ＥｃｏＲｌ断片、０．２ｐｍｏｌｅの３８０ｂｐ　Ｅｃ
ｏＲＩ　−Ｐｓｔ　ｌ断片、Ｑ、　’ｌ　ｐｍｏｌ、ｅ
の１００７ｂｐ　Ｐｓｔ　Ｉ　−Ｘｈｏ　ｌ断片（例３
を参照のこと）及び０．１　ｐｍｏｌｅの６．８　ｋｂ
　　ＢａｍＨＴ　−Ｘｈｏ　Ｉベクター断片（例３を参
照のこと）を連結し、そしてこれを用いてＥ、コリＨＢ
ＩＯＩ　Ｃａ”細胞を形質転換する。１２個のａ＋ｎｐ
”コロニーを１００■／βのアンピシリンを含有するＬ
Ｂ培地中で別々に増殖せしめる。ＤＮＡを迅速ＤＮＡ法
により調製し、そしてＢ’ａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによ
り分析する。単一クローンからのプラスミドＤＮＡを選
択し、ｐＪＤＢ２０７／■亜−３ＳＵＰＡと称する。
ｌ　　プラ！ＳｌＪ銭７Ｒ／Ｐｉ位防！愼λ１裂成熟ウ
ロキナーゼのコード配列をＰ　ＩＩ　Ｏ５プロモーター
に連結する。比較のために作られたこの構成物にはシグ
ナル配列は含有されない。
以下余白 次の式： ％式％ で表わされるオリゴデオキシリボヌクレオチドリンカ−
はＡＴＧ、及び成熟ウロキナーゼのアミノ酸５ｅｒｌか
ら５ｅｒ９をコードするｕ−ＰＡのヌクレオチド１３０
−１５４（第１図参照のこと）を含有する。このオリゴ
ヌクレオチドをリン酸化し、アニールし、そしてｐｃｓ
１６／ＵＰＡ（例３を参照のこと）の４６２ｂｐＴａｑ
　Ｉ　−ＥｃｏＲｌ断片に連結する。このＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩ及びＰｓｔｌで消化する。ＡＴＧ、及び４３６位
（第２図）のＰｓｔ１部位までの成熟ｕ−ＰＡのコード
配列を含んで成る３１５ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　
！断片を単離する。
プラスミドｐ３１Ｒ（ヨーロッパ特許出願１！ｈｌｏｏ
、５６１）をＢａｗｌ　Ｉ及びＥｃｏＲＩで消化し１、
そして５３４ｂｐＢａｎ＋ＨＩ　−ＥｃｏＲＴ断片を分
取用１．５％アガロースゲル上で単離する。この断片は
ＰＩ＋０５ＩＩモーターを含有する。
すべてのＤＮＡ断片を電気溶出し、ＤＥ５２クロマトグ
ラフィーで精製し、エタノールで沈澱せしめ、そして水
中に０．１　ｐｍｏｌｅ　／μ！の濃度に再懸濁する。
Ｑ、　２ｐｍｏｌｅずつの５３４ｂｐ　ＢａｍＨｌ　−
ＩｉｃｏＲｌ断片、３１５ｂｐ　ＨｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ
　ｌ断片及び１００７ｂｐ　Ｐｓｔ　Ｉ　−。
Ｚｈｏ　ｌ断片（例３を参照のこと）及びＱ、　ｌ　ｐ
ｍｏｌｅの６．８　ｋｂ　　Ｂａｄ　１−　Ｘｈｏ　Ｉ
ベクター断片（例３を参照のこと）を連結し、そして常
法に従ってＥ。
コリＨＢＩＯＩ　Ｃａ”に形質転換する。８個のａｍｐ
Ｒコロニーを拾い、そして１００■／ｌのアンピシリン
を含有するＬＢ培地中で増殖せしめる。プラスミドＤＮ
Ａを調製し、ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲＴ制限消化により
分析する。予想通りの制限パターンを有する単一クロー
ンのプラスミドＤＮＡをｐＪＤＢ２０７Ｒ／■川−ＵＰ
Ａと称する。
野性型サツカロミセス・セレビシェ−５２８８Ｃ株から
の高分子量酵母Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｍ、Ｖ、０Ｉｓｅｎ等、
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　１３２３８７（１９７９）　
）合計３０硝を、２ユニツトのＥｃｏＲＩメチラーゼに
ューイングランドビオラブス）と共に３７℃にて３０分
間、供給者により推奨されたようにして２５０４のＥｃ
ｏＲＩメチル化緩衝液中でインキュベートする。ＤＮＡ
をエタノールで沈澱せしめ、５００Ｉの２５ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｊ！（ｐＨ８，５）、　２　ｍＭ　ＭｇＣｊ
’　ｚ（ＥｃｏＲＩ　”緩衝液）〔Ｈ９Ｍｅｙｅｒ、Ｆ
ＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、９０，４５１（１９７９））中で再
懸濁し、そしてＤＮＡ断片のサイズ分布が３０〜５０ｋ
ｂの範囲に最大を有するまで（λＤＮＡのχｈｏｌ消化
物が３３ｋｂ及び１７１ｋｂのマーカーを与える）　Ｅ
ｃｏＲＩ（ベーリンガー）により消化するａＥｃｏＲＩ
”条件下で消化された酵母ＤＮＡを外４０ローター中シ
ニークロース勾配（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ？　、
　ｐＨ７，６、１ｍＭＥＤＴＡ中５〜２０％シュークロ
ース）上で３８．００Ｏｒｐｍにて６時間サイズ分画す
る。０．４ａｆｆｉずつの３０画分を勾配の頭から集め
る。画分１６が３０〜４０ｋｂのサイズのＤＮＡ断片を
含有する。この百分のＤＮＡ（３ＩＪｇ）のエタノール
で沈澱せしめ、そして合成容量１５１１１中で１５℃に
て１６時間、ＥｃｏＲＩにより線状化されたコスミドベ
クターｐＹｃｌ　（Ｂ、Ｈｏｈｎ等、”Ｃｅｎｅｔｉｃ
　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”、Ｖｏｌ、２＋　１６９頁
ｓ−ニーヨーク、１９８０）に連結される。連結は３０
０　ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼにューイングランド・バ
イオラプス）により供給者により′記載された緩衝系を
用いて行う。ＤＮＡをバタテリオファージλ　（Ｂ。
Ｈｏｈｎ、“Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ″、　Ｖｏｌ、６８．２９９頁・ニューヨーク、１
９７９）に生体外パッケージし、そしてこの集成された
ファージを用いてＥ、コリ８８１０１株（ｒ、ｌｅ　、
　ｍ、　９　、　　ｌｅｕ”　、　ｒｅｃＡ）をトラン
スデユースする。トランスダクションの効率はｐＹｃ１
ベクター賄当り約５０００のアンピシリン耐性コロニー
である。３０００　ａｍｐ′１コロニーを拾い、そして
ミクロクイター皿中の１００．ｉ／−のアンピシリンを
含有するＬＢ培地〔１０ｇバタトートリプトン（ディフ
コ）、５ｇバクト・酵母エキス（ディフコ）、１０ｇ　
　ＮａＣｌり中で個々に増殖せしめる。
以下余白 ｂ）　　ＧＡＰＤＨ’云の′ 前記の遺伝子ライブラリーを、次の構造：５　’　−Ｇ
ＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣ−３’を有す
る合成オリゴヌクレオチド〔ホスホトリエステル法、Ｋ
、　Ｉｔａｋｕｒａ等、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、
、９］＋７３２７（１９７５）；Ｊ、Ｆ、Ｍ、　ｄｅ　
Ｒｏｏｉｊ等、Ｒｅｃｌ、Ｔｒａｖ、Ｃｈｉｍ、Ｐａｙ
ａ−Ｂａｓ　９８．５３７（１９７９）を用いて調製さ
れたもの〕を用いてスクリーニングする。１０ｔｒｇの
オリゴヌクレオチドを１０４のＴ−ゴ２Ｐ−＾ＴＰ　（
３０００Ｃｉ　／　ｍｌｌ１ａｌ　。
１０μＣｉ／Ｉｌ！、アメルシャム）を用いてＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーマンハイム）によ
り、合計容量５０Ｊ１１中でＭａｎｉａｔｉｓ等（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　、コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラドリース、１９８２．１２５頁）
により記載されているようにしてキナーゼ処理する。同
じ著者（３１２頁）により記載されているようにしてコ
ロニーハイブリダイゼーションを行う、陽性クローンを
、コダフクχ−５Ｘ４％フィルムを用いてオートラジオ
グラフィーにより検出する。プラスミドＤＮＡの単離（
ヨーロッパ特許出願歯１００．５６１を参照のこと）が
ＧＡＰＤＨ（Ｊ、Ｐ、Ｈｏ１ｌａｎｄ等、Ｊ　、　Ｂ　
ｉ　ｏ　ｌ　、　Ｃｈ　ｅｔａ　、■虹９８３９　（１
９７９）　）をコードする。２１００ｂｐ　　Ｈｉｎｄ
　ｍ断片を含有するバイブリドクローンを生成する。ク
ローン化されたＤＮＡが真正であることの最終的証拠は
、二本鎖ＤＮＡについてのＧＦ、Ｈｏｎｇ（Ｂｉｏｇｃ
ｉｅｎｃｅ　Ｒｅｐｏｒｔｓｌ、２４３（１９８１））
により記載されたジデオキシ配列決定法と組み合わせた
前記オリゴヌクレオチドを用いるＤＮＡ配列決定実験か
ら得られる。このクローン化されたＧＡＰＤ）ｌ遺伝子
は、Ｈｏ１ｌａｎｄ等（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ＋、２
５５２５９６（１９８０））により発表されたρ１徂４
９１同じ配列を有する。
ｃ　）　　ＧＡＰＤＩ’ｌプｏｔ−−−ノＬ”’１上記
のバイブリドプラスミドをＴａｑＩにューイングランド
ビオラブス）により消化し、１．２％ソフトアガロース
ゲル上でＤＮＡ断片を分離し、そして熱フェノールでＤ
ＮＡを抽出することにより、ＧＡＰＤＨ遺伝子（第６図
を参照のこと）のＡＴＧから位置−２７〜−６７５を含
む６４９ｂｐ　　Ｔａｑ　Ｉ断片を単離する。　ｐＢＲ
３２２０Ｃ１ａ　１部位にＴａｑ　Ｔ断片のクローニン
グを行う。１汀のｐＢＲ３２２を３ユニットのＣ１ａｌ
にューイングランドバイオラブス）により、供給者によ
り記載されているようにして開裂せしめる−　　３００
ｎｇの切断され、フェノール処理されたベクターを約３
００ｎｇの挿入部Ｄ　Ｎ　Ａ　（６４９ｂｐＴａｑ断片
）に、２００ＵのＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて２０ｍ
の合計容量中で連結する。アンピシリン耐性についてＥ
、コリＨＢＩＯＩに形質転換を行い、プラスミドＤＮＡ
を調製し、そして制限酵素分析（Ｔａｑ　Ｉ　、Ｄｒａ
　Ｉ　）により分析する。Ｂａｍ１ｌ　１部位と組合わ
せて制限エンドヌクレアーゼＤｒａ　Ｉを用いてプラス
ミドのＴａｑ　Ｉ断片の方向を確立し、そしてｐＢＲ３
２２の旧ｎｄｌ［［部位に近い一６７５位のＴａｑ　Ｉ
部位を有するプラスミドを選択する。　ｐＢＲ３２２／
ＧＡＰＤＨと称するこのプラスミドをＢａａ＋ＨＩ（二
ニー・イングランド・バイオラプス）を用いて線状化す
る。
ＤＮＡを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）中に０．５
ｇ／−の濃度に再懸濁する。１６ｔｎｒのＳａｌ　Ｉで
開裂されたＤＮＡを２ＵのエキソヌクレアーゼＢａ１３
１　（ＢＲＬ）により１００Ｉの２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（
ｐＨ８，０）、　１９９ｍＭ　ＮａＣ１。
１２ｍＭ　ＭｇＣｌ　ｉ　１２ｍＭ　ＣａＣＩｔ　ｔ、
及びｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中で消化する。２ｎずつのＤＮ
Ａの了りコートを、３０℃でのインキュベーションの１
．２，３．４゜５及び６分間の後に取り出し、そしてす
ぐに５０Ｉのフェノール及び６０ＪｌｌのＴＮＥと混合
する。
フェノール／クロロホルムによる抽出及びエタノールに
よる沈澱の後、ＤＮＡを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ＋　ｐｉｆ
　８．０中に１００ｇ／ｍＺの濃度で再懸濁する。８ｇ
１３１によるエキソヌクレアーゼ開裂の程度を分析する
ため、各時点からの０．５　ｔｒｇのＤＮＡをエンドヌ
クレアーゼＢａｍＨＩにより消化し、そしてＴｒｉｓ−
ボレート緩衝液（ｐＨ８，３）　　（９０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＡ　、　ｐＨ８，３、９０ｍＭ硼酸、２．５　
ｍＭＥＤＴＡ）中１．５％アガロースゲル上で分析する
。Ｂａ１３１消化の１分間当り、断片の各末端から平均
１００ｂｐが除去される。
Ｂａ１Ｉ［リンカ−（５’　−ＧＧＡＧＡＴＣＴＣＣ−
３’　）　　をリン酸化し、アニールし、そしてＢａ１
３１で処理されたＤＮＡ断片に連結する。イソプロパツ
ールを用いる沈澱により過剰のリンカ−を除去する。
ＤＮＡをＢａ１ｉｌで消化し、そして２０μＦの全容量
中５　ｇ　／　＠！の濃度で直接環化する。Ｂａ１３１
で短縮されたＴａｑ　Ｉ断片のサイズを制限酵素分析（
Ｂａｌ　ｎ及び旧ｎｄｎｌを用いる）により決定する。
３個のクローンを選択する。これらは、ＡＴＣから上流
方向ＧＡＰＤＨプロモーターにそれぞれ約２００ｂｐ、
　２６５ｂｐ及び５４ｏｂｐ延びるＤＮＡ断片を含有す
る。３個の断片のすべてが約−１４０ｂｐに推定される
ＴＡＴＡボックスを含有する。これらのクローンはなお
、ＤＮＡのｐＢＲ３２２由来部分に複製開始点を含有し
、そしてそれぞれｐＧＡＰＤＨ−ＦｌｐＧＡＰＤＨ−Ｅ
　、及びｐＧＡＰＤＨ−Ｄと命名される。
ＧＡＰＤＨプロモーター要素を一２７位のＴａｑ　１部
位からＧＡＰＤＨ遺伝子のＡＴＧに直接隣接する位置に
延長するため、次の構造： を有する２個の相補的オリゴヌクレオチドを合成する。
これらのオリゴヌクレオチドは、末端ＥｃｏＲ１部位の
生成を伴って一２６位〜−５位の真正なＧＡＰＤＨプロ
モーター配列を提供する。２屑のプラスミドｐＧＡＰＤ
Ｈ−ＦＩｐＧＡＰＤＨ−Ｅ　、及びｐＧＡＰＤＨ−Ｄを
それぞれ６ユニツトのＴａｑ　１により５０ｐ１中で消
化し、そして生ずる混合物をフェノール処理し、エタノ
ール沈澱せしめ、そして１０バの水に再懸濁する。２Ｉ
ずつの単鎖を、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　　（ｐ
Ｈ７，５）、　１０ｍＭＭｇＣ１ｚ、５０ｍＭ　ＮａＣ
１を含有する１００ｍ１の溶液中で混合し、９０℃に３
分間加熱し、徐々に（約３時間以内に）室温まで冷却す
ることによりアニールせしめる。ＩｎのＴａｑ　１消化
プラスミドを約２０倍モル過剰のアニールされたオリゴ
ヌクレオチドと、２０Ｉｉの容量中で混合し、そして８
００ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて約１８時間連結す
る。リガーゼのインキュベーションの後、全混合物を３
ユニツトのＢｇｌＩ［（二ニー・イングランド・バイオ
ラプス）により消化する。それぞれ約２００ｂｐ、　２
６５ｂｐ及び５４０ｂｐのＢｇｌ　ＩＩ　−ＥｃｏＲＩ
断片を１．５％ソフトアガロースゲル上で分離し、ゲル
から抽出し、そして沈澱せしめる。
プラスミドｐ３１ＲＩＴ−１２（例２を参照のこと）を
ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにより消化する。３．６ｋｂ
の大ヘクター断片を単離する。この断片を用いて、２０
０ｂｐ。
２６５ｂｐ及び５４０ｂｐのＢｇｌ　ＩＩ　−ＥｃｏＲ
Ｉ　　ＧＡＰＤＨ−プロモーター断片をクローニングす
る。前記の様にして、連結、形質転換及びプラスミドの
単離を行う。
正しい挿入部を有するプラスミドをそれぞれｐ３１ＧＡ
ＰＦＬ−ＩＴ、　ｐ３１ＧＡＰＥＬ−ＴＴ及びｐ３１Ｇ
ＡＰＤＬ−ＴＴと称する。
プラスミドｐ３１ＧＡＰＦＬ−ＴＴ、　ｐ３１ＧＡＰＦ
Ｌ−、ＩＴ及びｐ３１ＧＡＰＤＬ−ＩＴのＢｇｌ　ＩＩ
　−ＥｃｏＲＩ断片のＤＮＡゼグメントを第８図に示す
。これらの断片の正確なサイズはそれぞれ２０２ｂｐ、
　２６７ｂｐ及び５４４ｂｐである。
このプラスミドは、ＧＡＰＤＨ−Ｄプロモーター、イン
ベルターゼシグナル配列、成熟ウロキナーゼのコード配
列及び皿転写ターミネータ−を、シャトルベルターｐＪ
ＤＢ２０Ｔ中にタンデム配置で含有する。
ｐ３１ＧＡＰＤＬ−ＩＴのプラスミドＤＮＡをＳａｌ　
ｌ及びＨｉｎｄｌＩ［により消化する。０．８　ｋｂ　
Ｓａｌ　Ｉ　−ｔｌｉｎｄ　ｍ断片を分取用１％アガロ
ースゲル上で分離する。この断片は、ＧＡＰＤＩＩ−Ｄ
プロモーター及びインベルターゼシグナル配列の部分を
含有する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｔ−ＬＩＰＡを
旧ｎｄＩ１１及びＢａｍ）Ｉ　Ｉにより消化する。１２
３９ｂｐ　　Ｆｌｉｎｄ　ｍ　−ＢａｍＨＩ断片はイン
ベルターゼシグナル配列の残りの部分及びｕ−ＰＡコー
ド配列のほとんどを含有する。
ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰＡをさらにＳａｌ
　Ｉ及びＢａｍＨ１により消化する。大きな６．６ｋｂ
ベクタ一断片をＴｒｉｓ−アセテート緩衝液（ｐＨ８，
２）中分取用６．０％アガロースゲル上で単離する。
ＤＮＡ断片を電気溶出によりゲルから単離し、ＤＥ５２
クロマトグラフィーにより精製し、そしてエタノールに
より沈澱せしめる。０．８ｋｂ　Ｓａｌ　Ｔ　−Ｈｌｎ
ｄ　ｍ断片、１２３９ｂｐ　　ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｍ
ＨＩ断片及び６、６　ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ
ベクター断片を連結し、そしてこれを用いてＥ、コリＨ
ＢＩＯＩ　Ｃａ”細胞を形質転換する。６個のａｍｐＲ
耐性形質転換体からのプラスミドＤＮＡを）ｌｉｎｄｌ
ｌｌ及びＳａｌ　Ｉ制限消化により分析する。予想通り
の制限断片を有する単一クローンからのプラスミドＤＮ
ＡをｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＤＬ−１−ＵＰＡ　と称す
る。
同様の作製方法において、プラスミドｐ３１ＧＡＰＦＬ
−ＩＴ　（例７を参照のこと）の４９３ｂｐ　　Ｓａｌ
　Ｉ　−ＨｌｎｄＩ［［断片を単離し、そして連結のた
めに使用する。得られるプラスミドをｐＪＤＢ２０７／
ＧＡＰＦＬ４−ＵＰＡ　と称する。
同様にして、ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ−Ｉ−ＵＰＡ
を作製する。
ＧＡＰＤＨ−Ｄプロモーター、■旺シグナル配列、ウロ
キナーゼコード配列及びＰＨ０５転写ターミネータ−を
酵母シャトルベクターｐＪＤＢ２０７中にクローン化す
る。
２０Ｉ！ｇのプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ皿−ＵＰ
ＡをＢｇｌ　ＩＩ及び５ａｌＴにより消化する。生ずる
２個の断片をＴｒｉｓ−アセテート緩衝液（ｐＨ８，２
）中分取用０．８％アガロースゲル上で分離する。７．
６ｋｂ及び１．１　ｋｂのＢｇｌ　ＩＩ　−Ｓａｌ　Ｉ
断片を単離する。１．１ｋｂ断片をさらにＤｒａ　Ｉに
より消化する。フェノール／クロロホルム抽出及びエタ
ノール沈澱の後、３．５　ｐｍｏｌｅのＤＮＡを、次の
式：％式％ で表わされる、Ｅｃｏ−Ｒ１及びＡＴＧの前の…皿５′
−非コード領域の８ヌクレオチド及びＤｒａ　Ｉ認識部
位の部分を有する、キナーゼ処理されそしてアニールさ
れたオリゴデオキシリボヌクレオチドリンカ−の１００
倍過剰量と連結する。
１５℃にて１６時間の連結の後、リガーゼを不活性化し
、そして３００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０）及び
１０ｍＭ　ＥＤＴ＾の存在下でのイソプロパツール沈澱
（０，５４容量）により過剰のリンカ−を除去する。
ＤＮＡをＢｇｌ　Ｉｆ及びＥｃｏＲＩにより消化する。
３２６ｂｐＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　ＩＩ断片を単離する
。
プラスミドｐ３１ＧＡＰＤＬ−ＩＴを５ａｌＩ及びＥｃ
ｏＲＩにより消化する。０．７５ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−
ＥｃｏＲＩ断片を単離する。
ＤＮＡ断片を電気溶出によりアガロースゲルから単離し
、ＤＥ５２クロマトグラフィーにより精製し、そしてエ
タノールにより沈澱せしめる。０．２　ｐｍｏｌｅの０
．７５ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片、０．４　
ｐｍｏｌｅの３２６ｐｐＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌ　Ｉｆ断
片及びＱ、ｌ　ｐｍｏｌｅの７．６ｋｂＳａｌ　Ｉ　−
Ｂｇｌ　ｎベクター断片を１５゛Ｃにて５．５時間連結
する。１メの連結混合物を使用してＥ、コリＨＢＩＯＩ
　Ｃａ”細胞を形質転換する。１０個のａｍｐ”形質転
換体を増殖せしめ、そしてプラスミドＤＮＡを調製する
。プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限消化により分析す
る。予想通りの制限パターンを示す単一クローンからの
プラスミドＤＮＡをｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＤＬ−ＩＪ
ＰＡ　と称する。
同様にして、プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−
１ｌＰＡ及びｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ−ＵＰ八を作
製する。
サツカロミセス・セレビシェ−５２８８Ｃ株の細胞壁を
５ｎ／−のチモラーゼ（Ｚｙｍｏｌａｓｅ）　（１００
，０００ユニツト／硝）により３７℃にて２０分解消化
し、次に２％ＳＯ３により細胞を溶解することにより、
２ミクロンの共有結合により閉じられたＤＮＡを単離す
る。次に、ＥＤＴＡを２５ｍＭとなるように加え、塩化
セシウムを最終密度１．５５ｇ／ｍ１となるように加え
、臭化エチジウムを１■／ｉに加え、そして次に全体を
超遠心管に移す。プラスミドＤＮＡを染色体ＤＮＡから
、超速により１５°Ｃ、４２，ＯＯＯｒｐｍにて４２時
間分離する。２ミクロンプラスミドＤＮＡをシリンジに
より勾配から切り出す。臭化エチジウムをＮａＣβ−飽
和インプロパノールにより除去し、そして最後にプラス
ミドＤＮＡをエタノール沈澱せしめる。次に、精製され
たプラスミドＤＮＡをＰｓｔｌにより線状化し、そして
ｐＵｃ１９（Ｊ、　Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ等、Ｇｅｎｅ　
２６，１０Ｈ１９８３））のＰｓｔＩ部位にクローン化
してプラスミドｐＤＰ３１を得る。プラスミドｐＪＤＢ
２０７を酵素Ｉ（ｐｎｌ及びＨｐａ　Ｉにより消化する
。生ずる０、５５ｋｂ断片を精製し、そしてプラスミド
ｐＵＣ７／ＬＥＵ２　（プラスミドｐＵｃ７（Ｊ、Ｖｉ
ｅｉｒａ等、Ｇｅｎｅ　１９，２５９．１９８２）の５
ａｌＩ部位にクローン化された酵素ゲノム２．２　ｋｂ
　Ｘｈｏ　！−Ｓａｔ　Ｉ　ＬＥＵ２遺伝子（Ａ、Ａｎ
ｄｒｅａｄｉｓ等、Ｃｅ１ｌ　ｌ。
３１９、１９８２）を含有するプラスミド〕の４．２５
ｋｂＫｐｎ　Ｉ　−Ｈｐａ　Ｉ断片にクローン化する。
この結果、プラスミドｐＪＤＢ２０７におけるようなも
との２ミクロン／ＬＥＵ２融合体がＬＥＵ２遺伝子＋そ
の完全なターミネータ−の前に置かれているプラスミド
ｐＤＰ３０を得る。ｐｏｐａｏをＨｐａ　Ｉ及びＳａｌ
　Ｉで消化し、そして完全なＬＥＵ２遺伝子を含有する
１、８５ｋｂ断片を精製し、そしてプラスミドｐＤＰ３
１の８．７ｋｂ　Ｈｐａ　Ｉ　−５ａｌｌ断片にクロー
ン化する。得られるプラスミドｐＤＰ３３を、５０ｎ／
−の臭化エチジウムの存在下（Ｍ、０ｅｓｔｅｒｌｕｎ
ｄ等、Ｇｅｎｅ　２０，１２１（１９８２））でＢｉｎ
ｄｎ［により線状化し、そしてＵＲＡ３遺伝子（Ｍ。
Ｒｏｓｅ等、Ｇｅｎｅ　２７　：　１１３（１９８４）
　）を含有する１、１７ｋｂ　　Ｈｉｎｄ　ｍ断片と連
結する。Ｅ、コリｐｙｒｆ株（Ｍ。
Ｒｏｓｅ等、前掲）に形質転換することによりυＲＡ３
遺伝子の陽性挿入を選択する。これによりプラスミドｐ
ＤＰ３４を得る。ｐＤＰ３４を酵素ｓｐｈ　Ｔにより消
化する。生ずる８、４ｋｂ断片を精製し、そして自己連
結してプラスミドｐｏｐａｓを得る。
ベクターｐＤＰ３Ｂ　（例１０を参照のこと）はＬＥＵ
２及びＵＲＡ３遺伝子、ｐＢＲ３２２配列、並びに酵母
２ミクロンＤＮＡの部分を含有する。プラスミドｐＤＰ
３８をＢａｍＨＩにより線状化する。生ずる接着末端を
Ｋｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｎｉａｔｉｓ
等、１１３頁、前掲）との反応において満たす、ＤＮＡ
をＳａｌ　Ｉによりさらに完全消化し、そして大８．４
ｋｂ断片を単離する。
１０硝のプラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＤＬ−１−
ＵＰＡをＨｉｎｄｌｌｌ　（１ユニツト／ＲＤＮＡ）に
よりＩＬｒｇ／ｍ／の臭化エチジウムの存在下で３７℃
にて２８分間部分消化する。ＥＤＴＡを最終濃度１０ｍ
Ｍに添加することにより反応を停止する。ＤＮＡの接着
末端をＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼとの反応によ
りフィルインする。このＤＮＡをさらにＳａｌにより消
化する。２．２ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−（旧ｎｄＩ［ｒ）
／平滑末端断片を単離する。精製されたＤＮＡ断片を連
結し、そしてＥ、３１月ＩＢＩＯＩ　Ｃａ”細胞に形質
転換する。２４個のａｌｌｌｐＲコロニーを増殖せしめ
る。プラスミドＤＮＡを調製し、そしてＥｃｏＲＩ及び
５ａｌＴ／Ｈｉｎｄｎｌ制限消化により分析する。予想
取りの制限断片を示す単一クローンのプラスミドＤＮＡ
をｐＤｌ’３８／　ＧＡＰＤＬ−１−ＵＰＡ　と称する
。
同様の作製法において、２．２ｋｂ　Ｓａｔ　Ｉ　−［
ｔｌｉｎｄ　ｍ　）　／平滑末端断片をｐＪＤＢ２０７
／ＧＡＰＤＬ−ＵＰＡから、旧ｎｄｌＩ［完全消化、Ｋ
ｌｅｎｏ匈ＤＮＡポリメラーゼ反応、及びＳａｌ　Ｉ消
化の後に得る。この断片を前記の様にしてｐＤＰ３Ｂに
連結する。単一クローンをｐＤＰ３Ｂ／　ＧＡＰＤＬ−
ＵＰＡ　と称する。
同様にして、ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ−１−ＵＰ八
、　ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−１−ＵＰＡ、　ｐＪ
ＤＢ２０７／ＧＡＰＥＬ−ＵＰＡ及びｐＪＤＢ２０７／
ＧＡＰＦＬ−ＵＰＡから２．２ｋｂ　Ｓａｔ　Ｉ−（Ｈ
ｉｎｄｌｌ［）　／平滑末端を得る。精製された断片を
ｐＤＰ３Ｂに連結する。連結混合物を用いてＥ、コリＨ
ＢＩＯＩを形質転換する。
各ｊｌ−クローンのプラスミドＤＮＡをｐＤＰ３Ｂ／Ｇ
ＡＰＥＬ−１−ＵＰＡ、　　ｐＤＰ３８／ＧＡＰＦＬ−
Ｉ−ＵＰＡ、　　ｐＤＰ３８／ＧＡＰＥＬ−ＵＰＡ　、
及びｐＤＰ３８／ＧＡＰＦＬ−ｔｌＰＡと称する。
サツカロミセス・セレビシェ−ｕＴ２４６ａ　（ａ　。
Ｉｅｕ２−３＋　Ｌ赳２−１１２．」）を、次のプラス
ミド：ｐＪＤＢ２０７／至−ＵＰＡ ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰＡｐＪＤＢ２０７
７ＰＨ０５−９ＳＵＰＡｐＪＤＢ２０７Ｒ／狸並−ＵＰ
Ａ ｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＤＬ−ＵＰＡｐＪＤＢ２０７
／ＣＡＰＦＬ−ＵＰＡ ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＤＬ−（−ＵＰＡにより、旧ｎ
ｎｅｎ等［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ７５＋１９２９　（１９７８）　）により記載され
た方法により形質転換する。形質転換された酵母細胞を
、ロイシンを欠く酵母最少培地プレート上で選択する。
形質転換された酵母の単一コロニーを選択し、そして次
すフカロミセス・セレビシェ−ＨＴ２４６／ｐＪＤＢ２
０７り思臣−ＵＰＡサツカロミセス・セレビシェ−Ｈτ
２４６／ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰＡサフカ
ロミセス・セレビシェ−ＨＴ２４６／ｐＪＤＢ２０７／
ニー５ＳＵＰＡサツカロミセス・セレビシェ−ＨＴ２４
６／ｐＪＤＢ２０７Ｒ／ＰＨ０５−ＵＰＡサン力ロミセ
ス・セレビ’、／：ｆ−−ＨＴ２４６／ｐＪＤＢ２０７
／ＧＡＰＤ１．−ＵＰＡサツカロミセス・セレビシェ−
ＨＴ２４６／ｐＪＤＢ２０７／ＧＡ、ＰＦＬ−ＵＰＡｔ
　−／　力０　ミセス・セＬｉヒ’／ニー　ＨＴ２４６
　／　ｐＪＤＢ２０７　／　ＧＡＰＤＬ−Ｉ　−ＵＰＡ
同様にして、サツカロミセス・セ°レビシエーＧＲＦ１
８株（ＤＳＭ　３６６５）を前記のプラスミドにより形
質転換する。生ずる形質転換された酵母株を次の様に命
名する。
サツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２
０７／狸並−ＵＰＡ−ＩＪ−−、力ｏ　ミセス−セｔｋ
シｘ　−ＧＲＦ１８　／ｐＪＤＢ２０７／　ＰＨ０５−
ｒ−ＵＰＡサフカロミセス・セレビシェ−〇ＲＦ１Ｂ　
／　ｐＪＤＩ１２０７　／見匹臣−５Ｓｔ）ＰＡサツカ
ロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤ１１２０７
Ｒ／Ｐ）＋０５−１ＪＰＡサツカロミセス・セレビシェ
−ＧＲＦ１８／ｐＪＤＥ２０７／ＧＡＰＤＬ−１ＪＰＡ
サツカロミセズ・セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２
０７／（ｉＡＰＦＬ−１ｊＰＡサツカロミセス・セレビ
シェ−ＧＲＦ１８　／ｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＤＬ−
Ｉ−ＵＰＡ。
罰、サツカロミセス・セレビシェ−ＨＴ５０　　のサツ
カロミセス・セレビシェ−ＨＴ２４６と一胆−３欠失株
、例えばＳ、セレビシェ−〇７２８５　（α。
皿３−１１．皿３−１５．ユ赳２−３１ユ些２−１１２
．−厖１３゜Ｊ？ｕ４−３）と交配することにより、例
えば次の遺伝子型を有する株：　ＨＴ３５０（α、」圏
３−１１．血３−１５゜Ｉｅｕ２−３＋コ２−１１２．
　ｕ工Ｉ、」亘、」翌４−３）を得る。
ＨＴ３５０株を、プラスミド：　　ｐＤＰ３８／ＧＡＰ
ＤＬ−１−ＵＰＡ。
ｐＤＰ３８／ＧＡＰＦＬ−１−ＵＰＡ、　　ｐＤＰ３８
／ＧＡＰＥＬ−Ｉ−ＵＰＡ。
ｐＤＰ３８／ＧＡＰＤＬ−ＵＰＡ、　ｐＤＰ３８／ＧＡ
ＰＦＬ−ＵＰ八、及びＰＤＰ３８／ＧＡＰＥＬ−ＵＰＡ
のそれぞれにより、旧ｎｎｅｎ等（前掲）の形質転換法
により形質転換する。形質転換された酵母細胞を、ウラ
シルを欠きそしてロイシンが補充された酵母最小培地上
で選択する。
形質転換された酵母コロニーを単離し、そして次の様に
命名する。
以下余自 サツカロミセス・セレビシェ−ＨＴ３５０／ｐＤＰ３８
／ＧＡＰＤＬ−Ｉ−１ＪＰＡサツカロミセス・セレビシ
ェ−ＨＴ３５０／ｐＤＰ３８／ＧＡＰＦＬ−Ｉ−１ＪＰ
Ａサツカロミセス°セレビシエ−ＨＴ３５０／ｐＤＰ３
８／ａＡＰＥＴ、−Ｉ−ＬＩＰＡサツカロミセス゛セレ
ビシェ−ＨＴ３５０／ｐＤＰ３８／ｃＡＰＤＬ−ｕｐＡ
サツカロミセス°セレビシェ−ＨＴ３５０／ｐＤＰ３８
／ＧＡＰＦＬ−ＵＰＡサツカロミセス°セレビシェ−Ｈ
Ｔ３５０／ｐＤＰ３８／ＧＡＰＥＬ−ｔｌＰＡ■■、　
ノ　丑　　れた　　　、の 次の形質転換体： サツカロミセス・セレビシェ−ＨＴ２４６／ｐＪＤＢ２
０７／ＰＨ０５−ＵＰＡ。
サツカロミセス、セレビシェ−Ｈ工２４６／ｐＪＤＢ２
０７Ｒ／至−Ｉ−ＵＰＡは十分な長さのＰＨ０５プロモ
ーターを有するプラスミドを含有し、そしてｓｃｕ−Ｐ
Ａの発現のために該プロモーターの抑制解除を必要とす
る。Ｓ、セレビシェ−〇　Ｔ　２４６形質転換体のそれ
ぞれを、５０−のエルシンマイヤーフラスコ中１０−の
酵母最少培地（アミノ酸を含有しないディフコ・イース
ト・ニトロゲン・ベースに２％のグルコース及び２０■
／ｆのし一ヒスチジンが添加したもの）中で、３０℃に
て撹拌しながら２４時間、５〜７Ｘ１０’細胞／＋ｎＺ
の濃度に達するまで増殖せしめる。次に、この前培養の
細胞を０．９％ＮａＣβ中で洗浄し、そして２０％の前
培養細胞を用いて、アミノ酸を含有しないディフコ・イ
ースト・ニトロゲン・ベース培地に０．０３　ｇ　／β
のＫＨｚＰＯｔ、（Ｎ）１４）　ｚｓＯａの代りに１０
ｇ／ｌのし一アスパラギン、２０ｇ／ｌのグルコース、
及びＩｇ／７！のＬ−ヒスチジンを添加したもの（低Ｐ
ｉ最少培地）５０ｎｔｔ’に接種する。
培養物を３０℃、１８０回／分にて４８時間まで撹拌す
る。ｌＸｌ０”細胞／　ｍｆ　（００ｂ。。＝４〜５）
の最終濃度を得る。
異る長さのＧＡＰＤＨプロモーターを有するプラスミド
を含有する酵素形質転換体はｓｃｕ−ＰＡを構成的に発
現する。ｐＪＤＢ２０７由来のプラスミドを含有する形
質転換体を酵母最少培地（前記）中で培養する。２０％
の洗浄された前培養物を、ペプトン５ｇ／ｊ！、酵母エ
キス１０ｇ／Ｉ！、グルコース２０ｇ／ｌ、シュークロ
ース４０ｇ／ｊ！。
（ＮＨ４，）２ＳＯ４３ｇ＃２５ＫＨ２ＰＯ４，２ｇ／
β、門ｇｓｏ。
０．５ｇ／Ｉ！、ＮａＣｊ！　０．１　ｇ　／ｌ　５Ｃ
ａＣＪ　ｚ　０．１ｇ／ｌ、ビチオン１０ｔｓ／１２か
ら成る複合主培養培地５０ｍＺに接種する。約ｌＸｌ０
’細胞／献（ＯＤ、。。−４０〜４６）が３０℃、２０
０回／分にて４８時間のインキュベーションの後に得ら
れる。
ｐＤＰ３８由来プラスミドを含んで成る対応する形質転
換体をウラシル選択のもとで培養する。カザミノ酸４．
５ｇ／ｌ、酵母エキス６．５ｇ／ｌ、シュークロース２
０ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｆ、（ＮＨ４）２５０４
３．６　ｇ　／β、ＫＨｚＰＯｔ　１　ｇ　／β、Ｍｇ
５０４０．２ｇ／ｌ、ＣａＣＩ！　ｚ　　Ｏ，０１３ｇ
　／　ｌ−及び微量元素を含有する前培養培地中で、細
胞を３０℃、１８０回／分にて４８時間増殖せしめる。
１０％の洗浄された前培養物を用いて、イースト・ニト
ロゲン・ベース（ディフコ、アミノ酸含有せず）５ｇ／
ｊ！、Ｌ−アスパラギン７．５ｇ／ｌ、カザミノ酸８．
５ｇ／Ｊ、メチル−エチルスルホネート１０ｇ／ｌ、ア
デニン０．０５ｇ／ｅＳＬ−ヒスチジン０．０４ｇ／ｌ
　、、Ｌ−ロイシン０．１ｇｚｌ、Ｌ−トリプトファン
１ｇ／ｌ、パントテン酸カルシウム０．０３ｇ＃、グル
コース３０ｇ／βから成る選択主培養培地５０−に接種
する。
３０℃、２００回／分にて４８時間のインキュベーショ
ンの後約８Ｘ１０”細胞／ｍ／（００，。。−約３５）
を得る。
ファルコン２０７０チューブ中で３０００ｒｐｍにて１
０分間遠心することにより、２ｍｌからの細胞をそれぞ
れ２４時間目と４８時間目に集める。細胞を０．９％Ｎ
ａＣβにて１回洗浄し、そして遠心分離する。細胞ベレ
ットを細胞溶解緩衝液（６０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ
７，４）　、４ｍＭソビッテルゲント（Ｚｗｉｔｔｅｒ
ｇｅｎｔ）　（カルバイオケム）〕中に＠濁する。
この細胞懸濁液中に８ｇのガラスピーズ（直径０．５〜
０．７５ｍｍ）を添加し、そして懸濁液をボルテフクス
ミキサー（サイエンティフィック・インストルメント社
ＵＳＡ）上で全速で４〜５×２分間振とうする。この方
法により９０％以上の細胞が破砕される。３０００ｒｐ
ｍ、４℃にて５分間遠心することにより細胞片及びガラ
スピーズを沈降せしめる。生物活性を試験する直前に上
滑を０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＩＩＣｌ（ｐＨ７，４）　
、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０．０．１％ウシ血清アルブ
ミン中に５００倍に希釈する。
五■、注上皿ユ皇決淀 ｓｃｕ−ＰＡのアミド分解活性はＫａｂｉ（Ｋａｂｉ　
Ｖｉｔｒ’ｕｍ。
ストックホルム、スエーデン）合成トリペプチド発色基
質Ｓ−２４４４（ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
ｐＮＡ）を用いて直接測定することができる。Ｌｙｓ１
５Ｂ／及び／又はＬｙｓ１３６において開裂されたｔｃ
ｕ−ＰＡの含量を決定するため、製造者の推奨に従って
（プラスミン活性化を行わないで）アッセイを行う。直
接アッセイの次の変更を導くアミド分解活性の決定に先
立ってｓｃｕ−ＰＡはプラスミド活性化を必要とする。
１００Ｉのｓｃｕ−ＰＡ含有サンプル（例１４を参照の
こと）を０．ＯＩＵのヒトプラスミン（ベーリンガー・
マンハイム、独国）と共に６０分間、３７℃にて前イン
キュベートする。５１．０のアプロチニン（ヘ−リンガ
−・マンハイム、独）を添加し、混合物をさらに１０分
間１００ｍ温度にてインキュベートした後発色基質Ｓ−
２４４４（前記）を加える。
ＷＨＯウロキナーゼ標準（ロット６６／４６）と比較し
て活性の定量を行い、国際単位（１，Ｕ、）で表わす。
市販の標品ｔｌｋｉｄａｎ　（セロノ、フライブルグ、
独）に従えば、人尿から単離された高度に精製されたウ
ロキナーゼは７０，０００〜１００．０００１．Ｕ、／
■蛋白質の比活性を有する。
ｓｃｕ−ＰＡ含量はまた、合成トリペプチド基質Ｓ−２
２５１（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ、ストックホルム、ス
エーデン）を用いてそのプラスミノーゲン活性化により
測定することができる。ｓｃｕ−ＰＡ含有サンプルをス
トレプトキナーゼとしてではなくプラスミノーゲン活性
化因子として、製造者の推奨（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ
）に従ってアッセイを行う。
酵母発酵ブロス中に存在する抗原の量が、プロット法（
ビオークド、リッチモンド、ＵＳＡ）を用いて推定され
る。ポリクローナル・ラビット抗−人尿ウロキナーゼ抗
体を検出のために用いる。
サンプルを発酵の２４時間目に採取し、そして例１４に
記載したようにして前処理する。異る２つの株における
異るプラスミドによるプラスミノーゲン活性化（基質と
してＳ−２２５１を使用）活性の要約第１表に示す。
男−」−一表 使用した３種類のアッセイによって決定されん決定の比
較を第２表に示す。プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰ
ＤＬ−１−ＵＰＡを用いるＨＴ２４６株の４８時間発酵
の後に得られた全容量力価（培養液−当り）を示す。
以下余白 茅−」ニー表 （１，Ｕ、／ｍＺ培養液） この結果は、ＤＮＡ構成物が酵母シグナル配列例えばＰ
Ｈ０５又はインベルターゼシグナル配列を含有する場合
に酵母における再良のｓｃｕ−ＰＡ生産が得られること
を示している。この結果はさらに、ｓｃｕ−ＰＡが異る
酵母宿主バンクグラウンドで発現され、これによって選
択条件下（低Ｐｉ最少培地又はウラシル選択）での発酵
がＯＤ当り比較的高い化生産性を導くことを示している
。プラスミン活性化を伴うか又は伴わないＳ−２４４４
での活性測定において示されるように、発現生成物の約
９０％がｓｃｕ−ＰＡである。ドツト−プロットは、存
在する抗原の量が、測定された生物活性の量を有意に越
えないことを示している。従って、酵母組換ｓｃｕ−Ｐ
Ａは真正なｓｃｕ−ＰＡにおけると同様に正しく折りた
たまれる（ｆｏｌｄ）。
Ｓ、セレビシェ−株ＨＴ２４６／　ｐＪＤＢ２０７　／
　ＧＡＰＤＬ−Ｉ−ＵＰＡを、ヒルジンの製造（ヨーロ
ッパ特許出願Ｎ１２２５６３３を参照のこと）における
Ｓ、セレビシェ−株ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７　／Ｇ
ＡＰＦＬ−ＨＴＲと同様にして増殖せしめる。細胞内の
ｓｃｕ−ＰＡＯ量（破砕した後、例１４を参照のこと）
を、基質Ｓ−２２５１（例１５を参照のこと）を用いる
間接アミド分解アッセイにより測定する。４８時間のイ
ンキュベーションの後、細胞をシャープレス遠心機（ア
バレイル・セントリヒユーゲス、ルエイル、フランス）
中での遠心分離により収穫し、そして同量の細胞溶解緩
衝液（２００ｍＭ　ＫｚＨＰＯ４，０，２％Ｔｗｅｅｎ
８０：ｌに懸濁する０次に、細胞をガラスピーズミル（
ダイノミル、ＫＤＬ、　Ｂａｃｈｏｆｅｎ　ＡＧ％バー
ゼル；　４５００ｒｐｍ　、　１８　Ｎ　／時）中で破
砕する。懸濁液を１５０ｍＭ　ＮａＣｊ！　、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ８０により５倍に希釈し、そして細胞破片
ヲ０．６％４のポリエチレンイミンの存在下４℃にて、
ウエストファリア分離機ＳＢ？−４７中での遠心分離に
より沈降せしめる。わずかに濁った上清をセタボールカ
ートリッジ（Ｚｅｔａｐｏｒ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）　
（０，２２７／Ｉｌ＋孔サイズ）を通して濾過し、そし
てＩＮＨＣ６にてｐＨ６，０５に調整する。沈降した酵
母細胞ｋｇ当り１ｉの陽イオン交換体Ｓ−セファロース
・ファスト・フロラ（ファルマシア）を添加し、そして
懸濁液を４℃にて１時間撹拌する。次に、ビーズを直径
９ｃｍ０カラムに移し、そして５０酵リン酸ナトリウム
（ｐＨ７，０）、１５０ｍＭ　Ｎａ（Ｊ！　、０．０５
％シンペロニック（Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ）により洗浄
する。ｓｃｕ−ＰＡを３０−７分の流速で２５０ｍＭ　
ＮａＣ１を含有する同じ緩衝液を用いて溶出する。ｓｃ
ｕ−ＰＡを含有する両分（直接アミド分解アッセイによ
り測定；例１５を参照のこと）にコンカナバリンＡセフ
ァロース（ファルマシア）を添加しく０．２■のｓｃｕ
−ＰＡ当り１■のゲル）、そして懸濁液を４℃にて４５
分間撹拌する。ＩＭ　　ＮａＣ１，１０ｎｒＭリン酸ナ
トリウム（ｐＨ７，０）　、０．０５％シンペロニック
で洗浄した後、ビーズを直径４．４　ａｍのカラムに移
し、そしてｓｃｕ−ＰＡを０．８　Ｍメチル−ｅｘ−ｐ
−マンノピラノシド、１５０　ｍＭ　ＮａＣ１，２０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４、０＞　　、０．０５％シン
ペロニックにより１β／時の流速で溶出する。ｓｃｕ−
ＰＡを含有する両分に、抗−ウロキナーゼＩｇＧ−セフ
ァロース〔人尿ウロキナーゼに対する精製されたラビッ
トポリクローナル抗体（ＩｇＧ−画分）〕を加え、そし
てこの懸濁液を４℃にて４５分間撹拌する。次に、ビー
ズを直径２．２　Ｃ１ｍのカラムに移し、そしてＩＭＮ
ａ（Ｊ。
１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０＞　、０．０５
％シンペロニックで洗浄する。ｓｃｕ−ＰＡを０．１Ｍ
グリシン−ＨＣｌ　　（ｐ）１２．４）　、０．０５％
シンペロニックにより１ｍ１Ｚ分の流速で溶出する。ｓ
ｃｕ−ＰＡを含有する百分をＩ　Ｎ　ＮａＯＨにてｐＨ
６に調整する。
この段階で、直接アミド分解アッセイ　（例１５を参照
のこと）により同定した場合、全活性の約２５〜３０％
がｔｃｕ−ＰＡから成る。抗体カラムからの溶出液を、
５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，０）、０．０５シ
ンペロニツクで平衡化したＭｏｎｏ−Ｓカラム（ベッド
ボリウム１−；ファルマシア）に通用スる。平衡化緩衝
液で洗浄した後、ｓｃｕ−ＰＡを、平衡化緩衝液及び緩
衝液Ｂ　（５００ｍＭ　ＮａＣＪ　、５０　ｍＭリン酸
ナトリウム（ｐＨ７，０）　、０．０５％シンペロニッ
ク）の段階的グラジェントにより１ｍＺ／分の流速で溶
出する。この溶出により、２個の活性ピークが観察され
、１つのピークは３０％緩衝液Ｂの第一段階で溶出し、
そして他方は緩衝液Ｂ５５％の第二段階で溶出する。直
接アミド化アッセイにより、３０％緩衝液Ｂにおいて溶
出される両分は高比率のｔｃｕ−ＰＡを示し、他方５５
％緩衝液Ｂにおいて溶出する両分は１〜３％という少な
いｔｃｕ−ＰＡを示す。
こうして生産される酵母ｓｃｕ−ＰＡは、非還元条件下
でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動において、
約５１［１の分子量の単一バンドとして泳動する。得ら
れるｓｃｕ−ＰＡは、直接アミド分解アッセイ（例１５
を参照のこと）及び還元条件下での５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により判断する場合、約９５％以
上の純度を有する。
且Ｕ、・　５ＣＬＩ−ＰＡのグリコシルヒ゛能ゲル電気
泳動の後に　＋ｚｓｌ−コンカナバリンＡ重層アッセイ
によりグリコシル化を決定する。
コンカナバリンＡはマンノース残基を特異的に認識する
植物レクチンである。酵母から精製されたｓｃｕ−ＰＡ
及びｕ−ＰＡ標準Ｕｋｉｄａｎ　（セロノ、フライプル
グ、独）を１０％ゲル上でのゲル電気泳動にかける。次
に、蛋白質を７％酢酸中で３０分間ゲルに固定する。ゲ
ルを、次の組成： ０．１５　Ｍ　　ＮａＣｌ ３０　　ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＭＣＩ　ｐＨ７，４０，５ｍ
Ｍｃａｃｌｚ Ｏ，５ｍＭＭｎｃｌｚ を有するレクチン緩衝液中で洗浄する。ｐＨが約７．３
になるまで洗浄を続ける。次に、ゲルに、３曙ヘモグロ
ビン、１００．ＨコンカナバリンＡ及ヒ２μ（ｉＩ　２
％Ｉ−コンカナバリンＡを含有するレクチン緩衝液２−
を重層する。他の同様なゲルに、０．２Ｍ　α−メチル
−マンノシドが補充された前記混合物を重層する。温室
にて３時間のインキュベーションの後、ゲルをレクチン
緩衝液で十分に洗浄し、乾燥し、そしてＸ−線フィルム
に暴露する。α−メチルーアンノシドを使用しなかった
場合、Ｕｋｉｄａｎ及び酵母ｓｃｕ−ＰＡの両者は＋２
５１−コンカナバリンにより染色される。これらの分子
量は実質的に同一である。レクチジ結合の競争的阻害剤
であるα−メチル−マンノシドの存在下では、人尿ウロ
キナーゼは消失するが、酵母ｓｃｕ−ＰＡはなお見るこ
とができる。これは、酵母ｓｃｕ−ＰＡがグリコシル化
されており、そしてそのグリコシル化は人尿ウロキナー
ゼと比べて異るタイプのものであることを示している。
ｐ、　ｓｃｕ−ＰＡのさらなる　＋１ ０．５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　　（ｐＨ８，０）　
、０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０．０．０５Ｍ　　ＮａＣ１
に対して透析されたｓｃｕ−ＰＡの溶液（例１６を参照
のこと）を３ｍｌのベンズアミジン−セファロースカラ
ム（ファルマシア、ウプサラ、スエーデン）に負荷し、
そしてＩＭ　　ＮａＣ１１を含有するＴｒｉｓ−ＨＣｊ
！　　（ｐｉ（８，０）により洗浄する。ｓｃｕ−ＰＡ
は流通液及び洗浄液中に十分に回収され、他方副生成物
ｔｃｕ−ＰＡはＩＭ　　Ｌ−アルギニンを含有するＯ、
０５Ｍ　　Ｔｒｉｓ−１（ＣＦ！　　（ｐＨ８，０）緩
衝液によりカラムから溶出することができる。得られた
ｓｃｕ−Ｐ＾は約９８％以上の純度を有する。
ローニング ブラスミドｐＪＩＩＢ２０７／皿−１−１１陥（例３を
参照のこと）はウロキナーゼの完全なコード配列を含有
する。ＤＮＡをＰｓｔＩ及びＢａｍＨＩで切断する。
ウロキナーゼ遺伝子からの８８６ｂｐ　Ｐｓｔ　Ｉ　−
ＢａｍＨＩ断片はヌクレオチド位置１０３３−１０４１
にグリコシル化部位（Ａｓｎ３０２）を含有する。類（
以の長さの他の断片をＢｓｔＥＩｒによりさらに切断す
る。８８６ｂｐ　Ｐｓｔ　１−ＢａｍＨＩ断片を分取用
０．８％アガロースゲル上で単離する。
Ｍ１３ｍｐ１８　ＲＦ−ＤＮＡをＰｓｔＩ及びＩｌａｍ
Ｈ’ｌにより切断゛する。７．３ｋｂ断片を分取用０．
８％アガロースゲル上で単離する。ＤＮＡ断片をアガロ
ースゲルから電気溶出し、そしてＤＥ５２クロマトグラ
フィー及びエタノール沈澱により精製する。
０、１　ｐｍｏｌｅの７．３　ｋｂ　Ｐｓｔ　Ｉ　−Ｂ
ａｍＨＩ切断ベクター断片及び０．２　ｐｍｏｌｅの８
８６ｂｐ　Ｐｓｔｌ　−ＢａｍＨＩｕ−Ｐ＾断片を連結
する。１１１１及び３Ｊ１１の連結混合物を用いてＥ、
コリＪＭ１０９　Ｃａ”の形質転換を、アメルシャムに
より発行された手引き、”Ｍ１３　ｃｌｏｎｉｎｇａｎ
ｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｈａｎｄｂｏｏｋ″に従っ
て行う。１２個の無色プラークを拾い、そして単鎖ＤＮ
Ａを調製する［Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｗ、２ｌ−７８（１９８
３）　）。この単鎖ＤＮＡを用いて、アニーリング及び
Ｋｌｅｎｏ−ポリメラーゼによるＭ１３ユニバーサルプ
ライマーの延長により部分的二本ｔＮ　Ｄ　ＮＡｌｃＳ
ｌＩ製する。反応生成物をフェノール／クロロホルムで
抽出し、そしてＤＮＡをエタノールにより沈澱せしめる
。ＤＮＡをＰｓｔｌ及びＢａｍＨＩにより切断する。８
８６ｂｐ断片は、ｕ−ＰＡ断片刃＜Ｍ１３ｍｐ１８ベク
ターにクローン化されていることを示す。１つのクロー
ンをさらに分析し、そして正しい挿入部を配列決定によ
りｆ！認する。このクローンをｂ）Ａｓ００２にお番る
グ奪コシル　　亡の゛６変異原プライマーＷ’　　　　
　　　５’　−ＧＧＡ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　ＴＣ
Ｔ　ＡＣＣＧＡＣ−３’１０２１ｔ　　　　回　　　　
１０４１１変異原プライマー及び配列決定プライマーは
、ホスホラミダイト法（Ｍ、Ｈ，Ｃａｕｔｈｅｒｓ、Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄＥｎｚｙｍａｔｉｃ　５ｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、　
（Ｈ，Ｇ。
Ｇａ５５ｅｎ及びＡ、ＬａｎｇＷ）　％　Ｖｅｒｌａｇ
　Ｃｈｅｍｉｅ　％パインハイム、西独）を用いて、ア
プライド・バイオシステム・モデル３８０Ｂ合成機上で
合成する。
、単鎖鋳型ＤＮＡ上のインビトロ変異誘発は、Ｔ、Ａ−
Ｋｕｎｋｅｌ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ
、ＩＪｓＡ　８２．４Ｂ８−４９２（１９８５）　）に
より記載されているようにして行う。
ウラシル含有単鎖鋳型ＤＮＡはＥ、コＩＪ　ＲＺ１０３
２（ｄｕｔ”　、ｕｎｇ−）での１サイクルの増殖によ
り生産される。
１００ｐ１００ｐの変異原オリゴヌクレオチドプライマ
ーＷを２０ＩＪ１０５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃｊ２　
　（ｐＨ７、５）　、１０ｍＭＭｇＣｊ！ｚ　、５ｍＭ
　ＤＴＴ、　０．５ｍＭ　ＡＴＰ及び２０ユニツトのＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼ（ヘーリンガー）中でリン
酸化する。３７°Ｃにて３０分の後、７０℃にて１０分
間加熱することにより反応を停止する。
０、３　ｐｍｏｌｅのウラシル含有Ｍ１３ｍｐ１８／υ
ＰＡ鋳型ＤＮＡを１０μｍｏｌｅのリン酸化変異原オリ
ゴデオキシリボヌクレオチドプライマーＷ及び１０ｐｍ
ｏｌｅのＭ１３ユニバーサル配列決定プライマーと共に
、３０バの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　　（ｐＨ８
，０）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｆ　ｚ中でインキュベート
する。サンプルを８０℃に加熱し、そして小水浴中で室
温に冷却する。
Ｃ）延長二止益及良 前記のアニールされたサンプルに、１ｍＭ　ｄＮＴＰ　
。
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１ｃｊ！　　（ｐＨ８，０）　、
１０ｍＭ　＋１ｇＣＡ　ｚ　、２０ｍＭＤＴＴ　、　　
１ｍＭ＾ＴＰ、　　４００ユニツトの７４　ＤＮＡリガ
ーゼ（バイオラプス、４００Ｕ／Ｊ）及び６ユニツトの
Ｋｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー、６
Ｕ／４）を含有する酵素−ｄＮＴＰ混合物１０４を加え
る。
インキュベージタンを１５℃にて−７２ｘ行う。
ｄ）　Ｅ、コＩＢＭ１１７．　　のノ　一連結混合物を
ＴＥにより２００メに希釈する。
０．１１１１、ＩＩｌ！及び１０４の延長連結混合物を
コンピテントＥ、コリＢＭｌ１７１　Ｃａ”細胞（Ｋｕ
ｎｋｅｌ、前掲）に加える。氷上に３０分間装いた後、
細胞を４３℃にて３分間ヒートショックにかけ、そして
氷上に保持する。細胞を、上層寒天及びＥ、コリＪＭＩ
ＯＩインディケーター細胞と共にプレートする。
６個のプラークを拾い、そしてそれを用いてＥ、コリＪ
Ｍ１０９に感染せしめる。ファージをＰＥＧ沈澱により
上清から単離する。フェノールで抽出しそしてエタノー
ルで沈澱せしめることによりＤＮＡ調製する。鋳型ＤＮ
ＡをＴＥ中に再懸濁する。
ＡＡＴコドン（Ａｓｎ３０２）からＣＡＡコドン〔Ｇｌ
ｎ３０２）への変異を１つのクローンにつき、チェイン
・ターミネーション法ＣＦ、Ｓａｎｇｅｒ等、Ｐｒｏ、
Ｎａｔ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ　Ｉ４．５４６３−６７（１９７７）］
を用いて前記の配列決定プライマーにより確認する。こ
の変量はｕ−ＰＡのアミノ酸位置３０２のＡｓｎ−＝Ｇ
Ｉｎ変化をもたらし、これによりウロキナーゼ中の一個
のグリコシル化部位を除去する。Ｗは、ｕ−ＰＡ　　Ｂ
−鎖中のグリコシル化部位の変異（Ａｓｎ３０２−”Ｇ
１ｎ３０２）を示す。ｕ−ＰＡコード配列中に他の変異
は見出されない。
陽性クローンをＭ１３ｍｐｌＢ／ＵＰＡ−と称する。
監、　　Ｌｓ３５　＝Ｇ１の・ Ｌｙｓ１３５−Ｌｙｓ１３５におけるｓｃｕ−ＰＡの蛋
白質分解的開裂は低分子ウロキナーゼの生成を導く。
（Ｌｙｓ１３５）からグリシンへの生体外変異により二
塩基性開裂部位を除去する。
以下余白 ＩＮ　　１Ｍ＆ 四コＬｙｅ Ｍ１３ｍｐ１８環季却５：　　　　　　　３１．、、、
Ａｃｃ　　ｃｃτ　ＣτＡｃｅ丁　工ＴＴ　　ＴＴＣＧ
ＯＯＡＧＧ　　ＡＯＡ、、、、、５’（アンチセンスを
第 変異原プライマー１，Ｇ：　　　　　５’−ＣＣＡ　Ｃ
ＡＴ　ＧＧＡ　ＧＧＴ　ＡＡＧ　ＣＣＣＴＣＣ−３’生
体外変異誘発の方法は例１９に記載した。変異した単鎖
センス鎖を調製する。ＡＡＡコドン（Ｌｙｓ１３５）か
らＧＧＴコドン〔Ｇｌｙ）への変異を、Ｍ１３ユニバー
サルブライマー（バイオラプス）を用いるＤＮＡ配列決
定により確認する。変異（Ｌｙｓ１３５）　＝Ｇ］ｙが
ウロキナーゼのＡ鎖中のアミノ酸１３５における蛋白質
分解的開裂部位の除去をもたらす。変異したＤＮＡをを
する１つのクローンをＭ１３ｍｐ１８／ＵＰＡ−ＬＧと
称する。
土１２．　　Ｌ　５１３５　＝Ｓｅｒの・例２０と同様
の方法によりアミノ酸（Ｌｙｓ１３５）をセリンに変異
せしめる。
１４５　１３＆ 国コＬｙｇ 変異房け°ライマーＬ、Ｓ　：　　　　　５’−ＣＣＡ
　ＣＡＴＧＯＡ　Ａ（匹ＡＡＧ　ＣＣＣＴＣＣ−３’Ａ
ＡＡコドン（Ｌｙｓ１３５）からＡＧＴコドン〔Ｓｅｒ
）への変異は、Ｍ１３ユニバーサルプライマーを用いて
単鎖鋳型ＤＮＡを配列決定することにより確認する。
罰、　　Ｐｈｅ　７−Ａｓの・ 単鎖ｕ−ＰＡは、Ｌｙｓ１５Ｂ−１１ａ１５９結合のプ
ラスミンによる蛋白質分解的開裂により二本＃１ｉ　ｕ
　−Ｐ　Ａに転換される。スロンビンはＡｒｇ１５６−
　Ｐｈｅ１５７結合を開裂せしめる。プラスミン及びス
ロンビンによるｓｃｕ−ＰＡの蛋白質分解的開裂を防止
するため、（Ｐｈｅ１５７）をＡｓｐに変異せしめる。
以下余白 Ａｒｇ区コＬｙｓ　Ｉｌ＊ Ｍ１３ｏ＋ｐｌ沸入部：　　　３’　、、、Ｇｋ　ＧＡ
ＣＴＣＣＧＯ（ｉ　ＧＣＧ黒買Ｃτ品Ｔ紘ＣＣＣＣＣ，
、，５゜（アンチセンス＠　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　−溪Ｊ暇度ブライマーＰ　二　　　　５’
−Ｇ　ＡＧＯＣＣＣＣＧＣＧＡＣＡＡＧ　ＡＴＴ　ＡＴ
Ｔ　Ｇ　−３’ＴＴＴコドン（Ｐｈｅ１５７）からＧＡ
Ｃコドン〔Ａｓｐ１５７）への変異を、Ｍ１３ユニバー
サルブライマー（バイオラプス）を用いるＤＮＡ配列決
゛定により確認する。変異（Ｐｈｅ１５７）−八ｓｐは
、単鎖ウロキナーゼ中のアミノ酸位置１５６におけるス
ロンビンのための蛋白質分解的開裂部位及びアミノ酸位
置１５８におけるプラスミンのための開動部位を除去す
る。
変異したＤＮＡを有する１つのクローンをＭ１３ｍｐｌ
Ｂ／ＵＰＡ−Ｐと称する。
門１３ｍｐ１８／　ｔｌＰＡ−駒は、ウロキナーゼＢ−
鎖中のグリコシル化部位を除去する単一の変異（ＧＩｎ
３０２）を有するアミノ酸配列をコードする変異したＤ
ＮＡ挿入部を含有する。この変異を有するＤＮＡ断片を
酵母発現プラスミドＩ）ＪＤＢ２０７／！ＭＬ−１−Ｕ
ＰＡに移す。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／Ｐ）１０５−Ｉ−ＵＰＡを
５ａ１１及びＢａ＋＊ＦＩ　Ｉにより切断する。６．６
ｋｂベクタ一断片を単離する。このものは、ヌクレオチ
ド位置１３２３　（第１図）のＢａ１ＷＩ　Ｉ部位から
１４４１位（付加されたＸｈｏ　Ｉリンカ−を伴うＰｖ
ｕ　１１部位）までのｕ−ＰＡの３′部分及びＰＨ０５
転写停止シグナルを含有する。
ｐＪＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰ八を５ａｉｌ及び
Ｐｓｔｌにより消化する。１．２ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−
Ｐｓｔ　Ｉ断片を単離し、そしてゲルから電気溶出する
。このＤＮＡ断片はｐＢＲ３２２のＳａｌ　Ｉ　−Ｂａ
ａ＋ＨＩ配列、皿プロモーター、インベルターゼシグナ
ル配列及びＰｓｔＩ部位までのｕ−ＰＡコード配列を含
有する。
迅速ＤＮＡ単離法（Ｄ、Ｓ、Ｈｏ１ｎ＋ｅｓ等、Ａｎａ
ｌｙｔ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、ユ１４（１９８１）、１９３−１９７
）によりＭ１３ｍｐｌＢ／ＵＰＡ−Ｗ（例１９を参照の
こと）のＲＦ−ＤＮＡを調製する。
２汀のｌ？Ｎａ５ｅ　（セルバ）を添加しそして３７℃
にて５分間インキュベートした後、８８６ｂｐ　Ｐｓｔ
　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片を分取用０．８％アガロースゲ
ル上で単離する。ＤＮＡ断片を電気溶出し、そしてエタ
ノール中で沈澱せしめる。この断片は、ウロキナーゼ変
異体中のヌクレオチド位置１０３３−１０３５に変異Ａ
ＡＴ−＝ＣＡＡ　（Ａｓｎ３０２−＝ＧＩｎ）を有する
。Ｑ、’ｌ　ｐｍｏｌｅずつの１．２ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ
　−Ｐｓｔ　Ｉ断片及び８８６ｂｐのＰｓｔ　Ｉ　−Ｂ
ａｗｌ　Ｉ断片、並びに０．１　ｐｍｏｌｅの６．６　
ｋｂＳａｌ　ｌ−Ｂａｍ１’ｌ　Ｉベクター断片を連結
する。コンピテントＥ、コリＨＢＩＯＩ　Ｃａ“°細胞
を形質転換する。
１２個のアンピシリン耐性形質転換体を増殖せしめる。
プラスミドＤＮＡを単離し、そしてＥｃｏＲＴ及びＨｉ
ｎｄＩ［Ｉ制限酵素切断により分析する。
グリコシル化部位の変異がヌクレオチド位置１０３２−
１０３７のＥｃｏＲ１部位を破壊する。変異の存在をＤ
ＮＡ配列決定により確認する。変異を有する１つのプラ
スミドｐＪＤＢ２０７／皿匹−１−ＵＰＡ−Ｗと称する
。
同様にして、Ｍ１３ｍｐｌＢ／ＵＰＡ−Ｐ　ＳＭ１３ｍ
ｐ１Ｂ／ＵＰＡ−ＬＧ及びＭ１３ａ＋Ｐ１Ｂ／ＵＰＡ−
ＬＳのＰｓｔ　ｌ　−ＢａｍＨＩ断片を用いて、それぞ
れｐＪＤＢ２０７／ＰＨ仮−１−ＵＰ八−Ｐ１ｐＪＤＢ
Ｏ２７／皿−Ｉ−ＵＰＡ−ＬＧ　、及びｐＪＤＢ２０７
／ニーＩ−ＵＰＡ−ＬＳを作製する。
鮨、ブースミ　゛　ＪＤＢ２０７　　ＰＨ０５１−ｔｊ
ＰＡ−ＬＧＰの翌 ｓｃｕ−ＰＡの蛋白質分解的開裂を防止するため、１３
５位（Ｌｙｓ−Ｇｌｙ）及び１５７位（Ｐｈｅ−＝Ａｓ
ｐ）のアミノ酸配列の変異を組み合わせ、そしてプラス
ミドｐＪＤＢ２０７／皿−Ｔ−ＵＰＡ−ＬＧＰ中にコー
ド甘めしる。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／ニーＩ−ＩＪＰＡ−ＬＧ　
（例２３を参照のこと）を５ａｌＩ及びＢａ冊で切断す
る。
１、３ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｂａｌ　Ｉ断片はｐＢＲ３
２２のＳａｉｌ−ＢａｍＨＩ配列、皿プロモーター、イ
ンベルターゼシグナル配列、及びＧ１ｙ１３５変異を担
持するＢａ１１部位までのｕ−ＰＡコード配列を含有す
る。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／ハ垣−ｒ−ＵＰＡ−Ｐ　（
例２３を参照のこと）をＢａｔ　Ｉ及びＢａｍＨＩで消
化する。
０、７　ｋｂ　Ｂａｔ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片はＡｓｐ
１５７変異を担持するｕ−ＰＡコード配列の内部断片で
ある。
１、３ｋｂ　Ｓａｔ　Ｉ　−Ｂａｌ　Ｉ断片、０．７ｋ
ｂ　ＢａＩＩ　−ＢａｍＨｒ断片及び６．６　ｋｂ　Ｓ
ａｔ　Ｉ　−ＢａｍＨＩベクター断片（例２３）を連結
する。Ｅ、コリ）ＩＢＩＯＩのコンピテント細胞を形質
転換する。形質転換体のプラスミドＤＮＡを単離し、そ
して制限消化及びＤＮＡ配列決定により分析する。変異
Ｇｌｙ１３５及びＡｓｐ１５７をコードする予想通りの
ヌクレオチド配列を有する単一クローンを選択し、そし
てｐＪＤＢ２０７／■弧−１−ＵＰＡ−ＬＧＰと称する
。
同様にして、ｐＪｆ）Ｂ２０７／　ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰ
Ａ−ＬＳのＳａｌ　Ｉ　−Ｂａｔ　Ｉ断片を用いてｐＪ
ＤＢ２０７／ＰＨ０５−Ｔ−ＵＰＡ−ＬＳＰを作製する
。
ｕ−ＰＡアミノ酸配列中１３５位、１５７位及び３０２
位の３個の変異の組み合わせが〔Ｇｌｙ１３５．　Ａｓ
ｐ１５７゜Ｇ１ｎ３０２）−ｕ−ＰＡをもたらす。この
新規なウロキナーゼ分子は、蛋白質分解的開裂部位１３
５位（Ｌｙｓ−”Ｇｌｙ）及び１５７位（Ｐｈｅ−＝Ａ
ｓｐ）並びに３０２位のグリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｇ
ｌｎ）が変異により除去されている。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／　ＰＨ０５−１−ＵＰＡ−
ＬＧｒ’Ｗ　ハコ（７）ウロキナーゼ変異体をコードし
ており、そして次の様にして作製する。
プラスミドｐＪＤＢ２０７／　Ｐｆ１０５−１−ＵＰＡ
−ＬＧＴを５ａｉｌ及びＸｈｏ　Ｉにより消化する。２
．２ｋｂ　Ｓａｔ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片を単離し、ア
ガロースゲルから電気溶出し、ＤＥ５２クロマトグラフ
ィーにより精製し、そしてエタノール中で沈澱せしめる
。このＤＮＡ断片はＰＨ０５プロモーター及びｕ−ＰＡ
配列中に３個のＭｓｔＩ部位を有する。３！！ｇの２．
２ｋｂ　Ｓａｔ　Ｉ　−Ｘｈｏ　Ｉ断片を３ユニツトの
ＭｓｔＩにより３７°Ｃにて１時間部分消化する。反応
生成物を分取用０．８％アガロースゲル上で分離し、そ
して１．７　ｋｂＳａｔ　Ｉ　−Ｍｓｔ　Ｉ断片を単離
し、そしてゲルから電気溶出する。このＤＮＡ断片はｐ
ＢＲ３２２のＳａｌ　ｒ−ＢａｍＨＩ断片、ＰＨ０５プ
ロモーター、インベルターゼシグナル配列、及びヌクレ
オチド９３５のＭｓｔＩ部位までのｕ−ＰＡコード配列
を含有する。
５４のＭ１３ｍｐｌＢ／ＵＰＡ−獣例１９を参照のこと
）のＩ？Ｆ−ＤＮＡをＢａｍ１ｌ　Ｉ及びＭｓｔｌで消
化する。２鱈のＲＮａｓｅ　（セルバ）を添加し、そし
て３７℃にて５分間インキュベートした後、３８７ｂｐ
　Ｍｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨ１断片を分取用０．８％アガ
ロースゲル上で単離する。
Ｄ　Ｎ　Ａ断片を電気溶出しそしてエタノール中で沈澱
せめしる。この断片は、ウロキナーゼＢ−鎖中でヌクレ
オチド位置１０３３−１０３５に変異＾ＡＴ−ＣＡＡ（
Ａｓｎ３０２−Ｇｉｎ）を含有する。
１、７ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｍｓｔｌ断片、３８７ｂｐ
　Ｍｓｔ　Ｉ　−ＢａｍＨｒ断片及び６．６　ｋｂ　Ｓ
ａｌ　Ｉ　−ＢａｍＨＩベクター断片（例２３）を連結
する。この連結混合物のアリコートを用いてＥ、コリＨ
ＢＩＯＩのコンピテント細胞を形質転換する。ａｍｐ”
形質転換体のプラスミドＤＮＡを単離し、そして旧ｎｄ
ｌ［［及びＥｃｏＲＩ制限消化、並びにＤＮＡ配列決定
により分析する。変異Ｇｌｙ１３５　、　Ａｓｐ１５７
及びＧ１ｎ３０２をコードするｕ−ＰＡ挿入部の予想通
りのヌクレオチド配列を有する単一クローンを選択し、
そしてｐＪＤＢ２０７／　ＰＨ０５−１−ＵＰＡ−ＬＧ
ＰＷ　と称する。
同様にして、ｐＪＤＢ２０？／厘−Ｉ−ＵＰ＾−ＬＳＰ
のＳａｌ　Ｔ　−Ｍｓｔ　Ｉ断片を用いてｐＪＤＢ２０
７／ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰＡ−ＬＳ四を作製する。
サツカロミセス・セレビシェ−ｏｒ２４６ｍ及びＧＲＦ
１８株を次のプラスミド： ｐＪＤＢ２０７７ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰＡ−賢ｐＪＤＢ２
０７７狸亜−Ｉ−ＵＰＡ−ＰｐＪＤＢ２０７７ＰＨ０５
−Ｉ−ＵＰＡ−ＬＧｐＪＤＢ２０７／胆競−Ｉ−ＵＰＡ
−ＬＳｐＪＤＢ２０７　／狸因−Ｉ−ＵＰＡ−１１ＣＰ
ｐＪＤＢ２０７／胆桑−ニーυＰＡ−ＬＳＰｐＪＤＢ２
０７／ＰＨ０５−１−ＵＰＡ−ＬＧＰＷｐＪＤＢ２０７
７Ｐ）１０５−Ｉ−ＵＰＡ−ＬＳＰＷにより、旧ｎｎｅ
ｎ等（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
７５゜１９２９　（１９７８）により記載された形質転
換法を用いて形質転換する。形質転換された酵母細胞を
、ロイシンを欠く酵母最少培地プレート上で選択する。
形質転換された酵母の単一コロニーを単離し、そして次
の様に命名する。
サツカロミセス・セレビシェ−ＨＴ２４６／ｐＪＤＢ２
０７／ＰＨ０５−Ｉ−ＵＰＡ−賢すソカロミセス・セレ
ビシェ−ＨＴ２４６／ｐＪＤＢ２０フｌニーｌ−１ｊＰ
Ａ−Ｐサツカロミセス・セレビシェ−ＨＴ２４６　／　
ｐＪＤＢ２０７　／　Ｐ！（Ｏ５−１−１ｌＰＡ−ＬＧ
サツカロミセス、セレビシェ−ＨＴ２に６／ｐＪＤＢ２
０７に−Ｚ−ＵＰＡ−ＬＳサフカロミセス・セレビシェ
−ＨＴ２４６／ｐＪＤＢ２０７／ニーニーυＰＡ−ＬＧ
Ｐす、　、！、　ｏ　ミセス、　セ（、ヒシｘ−ＨＴ２
４６／　ｐＪＤＢ２０７　／　ＰＨ０５−１−ＬＩＰＡ
−ＬｓＰサツカロミセス、セレビシェ−ＨＴ２４６／ｐ
ＪＤＢ２０７／至−ニーυＰＡ−ＬＧＰＷサッ’ｊＪＤ
ミセス、セレ：：Ｘ）ニー　　ＨＴ２４６／ｐＪＤＥ２
°７７ＰＨ０５−ｆｆ−ＵＰＡ−ＬＳＰＷサツカロミセ
ス、セレビシェ−ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２０７／翌亜−
１−ＵＰＡ−賢すフカロミセス・セレビシェ−〇ＲＦ１
Ｂ／ｐＪＤＥ２０７／ニー１−ＵＰＡ−Ｐサツカロミセ
ス°セレビシェ−ＧＵ１８１ｐＪＤＢ２０７／理並−Ｉ
−ＵＰＡ−ＬＳサツカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ１
８　／　ｐＪＤＢ２０７　／　ＰＨ０５−１−ＵＰＡ−
ＬＧサン力ロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ　１８　／　
ｐＪＤＢ２０７７月ぢ臣−１−ＵＰＡ−ＬＧＰ４ｊ−７
カロミセスーセレ；ニジ１　　ＧＲＦ１８／ｐＪＤＢ２
０７／ＰＨ０５−１−ＵＰＡ−ＬＳＰす、カロミセス・
セレビシェ−ＧＲＦ１８１ｐＪＤＢ２０７／盟亜−Ｊ−
υＰＡ−ＬＧＰＷサフカロミセス・セレビシェ−ＧＲＦ
１８／ｐＪＤＢ２０７／亜競−ｆｆ−ＵＰＡ−ＬＳ四。
これらの株を例１４に記載したのと同様にして培養する
。ｓｃｕ−ＰＡ変異蛋白質を例１６又は１８に■釘、　
　　　′　のた　の　−の　−？３■の精製３ＣＬｌ−
ＰＡ％　２５■のマンニトール及び４５■の塩化ナトリ
ウムを５−の無菌水中に溶解し、そして得られた溶液を
適当な容量の５％グルコース溶液と混合することにより
非経口投与用溶液を調製する。この溶液を０．２２−膜
フィルターを通して濾過することにより無菌化する。
１６９．３■の大豆レシチン（大豆ホスファチドＮＧ９
５　；製造者：ナツタ−マン、コログネ、独；純度９０
−９６％；脂肪酸組成：リノール酸６１−７１％、リル
ン酸４〜７％、オレイン酸６〜１３％、バルミチン酸１
０〜１５％、ステアリン酸１．５〜３．５％）及び９２
．７■のグリココール酸ナトリウムを７５２．５−の無
菌水に溶解する。この溶液をｌＮＮａＯＨによりｐＨ７
，４に調整する。１０■の凍結乾燥されたｓｃｕ−Ｐ＾
を添加する。透明な溶液が得られるまで混合物を撹拌す
る。溶液を、０．２２．１１１１膜フイルターを通して
アンプルに入れることにより焦面化する。
下記の微生物がｄｅｕＬｓｃｈｅ　Ｓａｖｗｌｕｎｇ　
ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎ　ｉｓｎ＋ｅｎ　（ＤＳＭ
）に寄託された。
＊　　Ｇｒｉｓｅｂａｃｈｓｔｒａｓｓｅ　８＋Ｄ−３
４００Ｇｉ５ｔｔｉｎｇｅｎ；＊＊　Ｍａｓｃｈｅｒｏ
ｄｅｒ　Ｗｅｇ　１６＋Ｄ−３３００Ｂｒａｕｎｓｃｈ
ｗｅｉｇ。
ｉ　びＷ 本　サツカロミセス・セレビシェ−困赳並肛竺ｇｃｅｒ
ｃｖｉ、５ｉａｅ）ＨＴ２４６　：　１９８７年４月１
５日、　ＤＳＭ４０８４本率エッセリシ＋・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）ＨＢＩＯＩ／ｐｃｓ
１６：１９８７年１０月２３日、　ＤＳＭ４２９４宰＊
エッセリシ＋’コリ（Ｅ！５ｃｈｅｒｔｃｈｉａ　　ｃ
ｏ二１４）ＨＢＩＯＩ／ｐ３１Ｒ／５Ｓ−ＴＰＡΔ２：
１９８７年１０月２３日、　ＤＳＭ４２９５本本エッセ
リシ−ｔ−”コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ
ｉ）ＨＢＩＯＩｐｃＵＫ１７６：１９８７年１０月２３
日；　ＤＳｌ’１４２９０＊＊Ｓｌ上リシ＋’コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ旦）ＪＭ１０９／ｐＤＰ
３８：１９８８年２月１９日；　ＤＳＭ４４１４　。
【図面の簡単な説明】
第　１図は、ヒトｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡの制限エンドヌク
レアーゼ地図である。 第２−１図〜第２−３図は、ヒトｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。 成熟蛋白質の第一アミノ酸にアンダーラインが付しであ
る。 第３図は、プラスミドｐｃｓ１６の作製を模式的に示す
。 第４図は、ｕ−ＰＡ　ｃＤＮＡを含んで成るプラスミド
ｐｃｓ１６／ＵＰＡの作製を模式的に示す。 第５図は、プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＰＨ仮−Ｔ−Ｕ
ＰＡの作製を示すダイアグラムである。図中、ｓｓはシ
グナル配列、ｔは転写ターミネータ−１ｐはプロモータ
ー、Ｌはリンカ−を示す。 第６図は、ＧＡＰＤＩ（のプロモーター領域のＤＮＡ配
列を示す。 第７図は、プラスミドｐ３１ＧＡＰＤＬ−ＩＴの作製を
模式的に示す。 第８図は、本発明において使用されるＧＡＰＤＨ遺伝子
のプロモーター要素を示す。 第９図は、プラスミ）’　ｐＪ、ＤＢ２０７／ＧＡＰＤ
Ｌ−Ｉ−１１ＰＡの作製を模式的に示す。 第１０図は、フラスミｔ’　ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＤ
Ｌ−ＵＰＡの作製を模式的に示すダイアグラムである９
第１１図及び第１２図は、プラスミドｐＤＰ３３を経由
してのプラスミドｐＤＰ３８の作製を模式的に示す。 第１３−１図及び第１３−２図は、この発明の変異した
ｕ−ＰＡ遺伝子、及び変異体ｓｃｕ−ＰＡ蛋白質の対応
するアミノ酸配列を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因
    子又はその変異体の製造方法であって、酵母発現制御配
    列、成熟プロウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因
    子又はその変異体をコードする第二ＤＮＡ配列及び該Ｄ
    ＮＡ配列とリーディングフレームが整合しており且つそ
    の上流にあるシグナルペプチドをコードする第一ＤＮＡ
    配列から成り前記発現制御配列の転写制御のもとにある
    ＤＮＡセグメント、並びに酵母遺伝子の転写停止シグナ
    ルを含んで成るＤＮＡ配列を含有するハイブリドベクタ
    ーにより形質転換された酵母株を適切な栄養条件下で培
    養し、そして前記プロウロキナーゼ型プラスミノーゲン
    活性化因子又はその変異体を単離することを含んで成る
    方法。 ２、ヒト単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因
    子のプロテアーゼ耐性変異体を製造するための、請求項
    １に記載の方法。 ３、グリコシル化部位がその部位でグリコシル化が起こ
    り得ない様に変形されているヒト単鎖ウロキナーゼ型プ
    ラスミノーゲン活性化因子の変異体を製造するための、
    請求項１に記載の方法。 ４、次の式（ I ）： 【遺伝子配列があります】 （式中、Ｘ＿１及びＸ＿２は相互に独立にＬｙｓ、塩基
    性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基又は化学結合を表わ
    し；Ｙ＿１はＡｒｇ、塩基性アミノ酸残基以外の酸残基
    又は化学結合であり；Ｙ＿２はＰｈｅ、酸性アミノ酸残
    基又は化学結合であり；Ｙ＿３はＬｙｓ、塩基性アミノ
    酸残基以外のアミノ酸残基又は化学結合であり：Ｚ＿１
    、は酵母−特異的にグリコシル化されるＡｓｎであるか
    又は他のアミノ酸残基であり；そしてＺ＿２はＴｈｒで
    あるか、又はＳｅｒ以外の他のアミノ酸残基である） で表わされる蛋白質を製造するための、請求項１に記載
    の方法。 ５、Ｘ＿１がＬｙｓ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ＿２
    がＬｙｓであり、Ｙ＿１がＡｒｇであり、Ｙ＿２がＰｈ
    ｅ、Ａｓｐ又はＧｌｕであり、Ｙ＿３がＬｙｓであり、
    Ｚ＿１が酵母−特異的にグリコシル化される Ａｓｎであるか、又はＧｌｎであり、そしてＺ＿２がＴ
    ｈｒである、請求項４に記載の式（ I ）の蛋白質の製
    造方法。 ６、Ａｓｎ３０２が酵母−特異的にグリコシル化される
    、天然ヒト単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化
    因子のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のプラス
    ミノーゲン活性化因子の製造方法。 ７、ｓｃｕ−ＰＡ、〔Ｇｌｙ１３５〕−ｓｃｕ−ＰＡ、
    〔Ｓｅｒ１３５〕−ｓｃｕ−ＰＡ、〔Ａｓｐ１５７〕−
    ｓｃｕ−ＰＡ、〔Ｓｅｒ１３５，Ａｓｐ１５７〕−ｓｃ
    ｕ−ＰＡ及び〔Ｇｌｙ１３５，Ａｓｐ１５７〕−ｓｃｕ
    −ＰＡ（式中、Ａｓｎ＾３＾０＾２は酵母−特異的にグ
    リコシル化される）、〔Ｇｌｎ３０２〕−ｓｃｕ−ＰＡ
    、〔Ｇｌｙ１３５，Ａｓｐ１５７，Ｇｌｎ３０２〕−ｓ
    ｃｕ−ＰＡ、並びに〔Ｓｅｒ１３５，Ａｓｐ１５７，Ｇ
    ｌｎ３０２〕−ｓｃｕ−ＰＡから成る群から選択された
    プラスミノーゲン活性化因子の製造のための、請求項１
    に記載の方法。 ８、前記酵母株がサッカロミセス・セレビシエー（＠Ｓ
    ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ＠　＠ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
    ＠）の株である、請求項１に記載の方法。 ９、酵母特異的にグリコシル化されるヒト単鎖ウロキナ
    ーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、及び酵母−特異的
    にグリコシル化される又はグリコシル化部位が変形され
    ていてそのグリコシル化部位においてグリコシル化が起
    こり得ないヒト単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活
    性化因子の変異体から成る群から選択されたプラスミノ
    ーゲン活性化因子。 １０、サッカロミセス・セレビシエーについて特異的な
    グリコシル化を有する請求項９に記載のプラスミノーゲ
    ン活性化因子。 １１、次の式（ I ）： 【遺伝子配列があります】 （式中、Ｘ＿１及びＸ＿２は相互に独立にＬｙｓ、塩基
    性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基又は化学結合を表わ
    し：Ｙ＿１はＡｒｇ、塩基性アミノ酸残基以外のアミノ
    酸残基又は化学結合であり；Ｙ＿２はＰｈｅ、酸性アミ
    ノ酸残基は化学結合であり；Ｙ＿３はＬｙｓ、塩基性ア
    ミノ酸残基以外のアミノ酸残基又は化学結合であり；Ｚ
    ＿１は酵母−特異的にグリコシル化されるＡｓｎである
    か又は他のアミノ酸残基であり；そしてＺ＿２はＴｈｒ
    であるか又はＳｅｒ以外の他のアミノ酸残基である） で表わされる請求項９に記載の式（ I ）のプラスミノ
    ーゲン活性化因子。 １２、Ｘ＿１がＬｙｓ、Ｇｌｙ又はＳｅｒであり、Ｘ＿
    ２がＬｙｓであり、Ｙ＿１がＡｒｇであり、Ｙ＿２がＰ
    ｈｅ、Ａｓｐ又はＧｌｕであり、Ｙ＿３がＬｙｓであり
    、そしてＺ＿１が酵母−特異的にグリコシル化されるＡ
    ｓｎであるか、又はＧｌｎであり、そしてＺ＿２がＴｈ
    ｒである、請求項１１に記載の式（ I ）のプラスミノ
    ーゲン活性化因子。 １３、ｓｃｕ−ＰＡ、〔Ｇｌｙ１３５〕−ｓｃｕ−ＰＡ
    、〔Ｓｅｒ１３５〕−ｓｃｕ−ＰＡ、〔Ａｓｐ１５７〕
    −ｓｃｕ−ＰＡ、〔Ｓｅｒ１３５，Ａｓｐ１５７〕−ｓ
    ｃｕ−ＰＡ及び〔Ｇｌｙ１３５，Ａｓｐ１５７〕−ｓｃ
    ｕ−ＰＡ（式中、Ａｓｎ＾３＾０＾２は酵母特異的にグ
    リコシル化される）、〔Ｇｌｎ３０２〕−ｓｃｕ−ＰＡ
    、〔Ｇｌｙ１３５，Ａｓｐ１５７，Ｇｌｎ３０２〕−ｓ
    ｃｕ−ＰＡ、並びに〔Ｓｅｒ１３５，Ａｓｐ１５７，Ｇ
    １ｎ３０２〕−ｓｃｕ−ＰＡから成る群から選択された
    、請求項９に記載のプラスミノーゲン活性化因子。 １４、酵母発現制御配列、成熟プロウロキナーゼ型プラ
    スミノーゲン活性化因子又はその変異体をコードする第
    二ＤＮＡ配列及び該ＤＮＡ配列とリーディングフレーム
    が整合しており且つその上流にあるシグナルペプチドを
    コードする第一ＤＮＡ配列から成り前記発現制御配列の
    転写制御のもとにあるＤＮＡセグメント、並びに酵母遺
    伝子の転写停止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列を含有
    するハイブリドベクター。 １５、酵母＠ＰＨ０５＠プロモーター又はＧＡＰＤＨプ
    ロモーターを含んで成る、請求項１４に記載の酵母ハイ
    ブリドベクター。 １６、酵母＠ＰＨ０５＠遺伝子、酵母インベルターゼ遺
    伝子又はヒトウロキナーゼ遺伝子に由来するシグナル配
    列を含んで成る、請求項１４に記載の酵母ハイブリドベ
    クター。 １７、酵母＠ＰＨ０５＠遺伝子の転写停止シグナルを含
    んで成る請求項１４に記載の酵母ハイブリドベクター。 １８、酵母発現制御配列、成熟プロウロキナーゼ型プラ
    スミノーゲン活性化因子又はその変異体をコードする第
    二ＤＮＡ配列及び該ＤＮＡ配列とリーディングフレーム
    が整合しており且つその上流にあるシグナルペプチドを
    コードする第一ＤＮＡ配列から成り前記発現制御配列の
    転写制御のもとにあるＤＮＡセグメント、並びに酵母遺
    伝子の転写停止シグナルを含んで成るＤＮＡ配列を含有
    するハイブリドベクターを含む形質転換された酵母宿主
    。 １９、予防又は治療のため人体を処置する方法において
    使用するための、請求項９に記載のヒト単鎖ウロキナー
    ゼ型プラスミノーゲン活性化因子又はその変異体。 ２０、医薬として許容されるキャリヤーと共に請求項９
    に記載のプラスミノーゲン活性化因子の療法的有効量を
    含んで成る医薬組成物。
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