DE69034013T2

DE69034013T2 - Serpin-resistenter T-PA; Mutanten; Gene

Info

Publication number: DE69034013T2
Application number: DE69034013T
Authority: DE
Inventors: Robert D. Gerard; Maryjane H. Gething; Elizabeth J. Goldsmith; Edwin L. Madison; Joseph F. Sambrook
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1989-03-06
Filing date: 1990-03-01
Publication date: 2003-07-31
Anticipated expiration: 2010-03-02
Also published as: DE69033699T2; ES2154629T3; EP0462207A1; EP1029921B1; DK0462207T3; CA2047702C; DE69034013D1; JP2000037195A; JP2991769B2; JP3076034B2; DK1029921T3; ATE226636T1; JP2000078990A; JP3076035B2; EP1029921A1; JPH04504952A; WO1990010649A1; ES2185529T3; EP0462207A4; EP0462207B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf t-PA Mutanten (Serinprotease-Mutanten der Chymotrypsin-Superfamilie), die resistent gegenüber Inhibition durch ihre dazugehörigen Inhibitoren, z. B. Serpine, sind; und Gene, die dieselben codieren. Die t-PA-Mutanten sind nützlich als z. B. pharmakologische Agentien.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

I. Serinproteasen

Serinproteasen (G.C. 3.4.21) sind die Unter-Unterklasse von Endopeptidasen, die zum Trennen einer Peptidbindung Serin als Nukleophil verwenden (Barret, A. J., in: Proteinase Inhibitors, Hrsg. Barrett, A. J. et al., Elsevier, Amsterdam, S. 3-22 (1986); und Hartley, B. S., Ann. Rev. Biochem, 29: 45-72 (1960)).
Serinproteasen sind in der Wissenschaft wohl bekannt und bis heute wurden zwei Superfamilien von Serinproteasen, d. h. die Chymotrypsin-Superfamilie und die Streptomyces-Subtilisin-Superfamilie, beobachtet (Barret, A, J., in: Proteinase Inhibitors, Hrsg. Barrett, A. J. et al., Elsevier, Amsterdam, S. 3-22 (1986); und James, M. N. G., in: Proteolysis und Physiological Regulation, Ed. Ribbons, D. W. et al., Academic Press, New York, S. 125-142 (1976)).
Beispiele von Serinproteasen der Chymotrypsin-Superfamilie schließen den Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator (tissue-type plasminogen activator) (im folgenden "t- PA"), Trypsin, Trypsin-ähnliche Protease, Chymotrypsin, Plasmin, Elastase, Urokinase (oder Harn-Plasminogenaktivator) (im folgenden "u-PA"), Akrosin, aktiviertes Protein C, C1- Esterase, Cathepsin G, Chymase und Proteasen der Blutgerinnungs-Kaskade einschließlich Kallikrein, Thrombin und der Faktoren VIIa, IXa, Xa, XIa, und XIIa mit ein (Barrett, A. J., in: Proteinase Inhibitors, Hrsg. Barrett, A. J. et al., Elsevier, Amsterdam, S. 3-22 (1986); Strassburger, W. et al., FEBS Lett., 157: 219-223 (1983); Dayhoff, M. O., Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, National Biomedical Research Foundation, Silver Spring, Maryland (1972); und Rosenberg, R. D. et al., Hosp. Prac., 21: 131-137 (1986)).
Einige der Serinproteasen der Chymotrypsin-Superfamilie, einschließlich t-PA, Plasmin, u-PA und der Proteasen der Blutgerinnungs-Kaskade, sind große Moleküle, die zusätzlich zu der katalytischen Serinprotease-Domäne andere strukturelle Domänen enthalten, die zum Teil für die Regulation ihrer Aktivität verantwortlich sind (Barrett, A. J., in: Proteinase Inhibitors, Hrsg. Barrett, A. J. et al., Elsevier, Amsterdam, S. 3-22 (1986); Gerard, R. D. et al., Mol. Biol, Med., 3: 449-457 (1986); und Blasi, E. et al., in: Human Genes and Diseases, Hrsg. Blasi, E., John Wiley & Sons, Ltd., S. 377-414 (1986)).
Die katalytischen Domänen aller Serinproteasen der Chymotrypsin-Superfamilie haben sowohl Sequenz-, als auch Strukturhomologie. Die Sequenzhomologie schließt die vollständige Konservierung
(i) der charakteristischen Reste der aktiven Stelle (z. B. Ser&sub1;&sub9;&sub5;, His&sub5;&sub7;, Asp&sub1;&sub0;&sub2; im Falle von Trypsin);
(ii) der Oxyanion-Tasche (z. B. Gly&sub1;&sub9;&sub3;, Asp&sub1;&sub9;&sub4;, im Falle von Trypsin);
(iii) den Cy stein-Reste, die in der Struktur Disulfid-Brücken ausbilden (Hartley, B. S., Symp. Soc. Gen. Nicrobiol., 24: 152-182 (1974)).
mit ein.
Die Strukturhomologie schließt mit ein:
(i) die homologe Faltung, die aus zwei Greek-Key-Strukturen besteht (Richardson, J., Adv. Prot. Chem, 34: 167-339 (1981));
(ii) eine homologes Verteilung von katalytischen Resten; und
(iii) detaillierte Konservierung der Struktur innerhalb des Kerns des Moleküls (Stroud, R. M., Sci. Am., 231: 24-88 (1974)).
Ein Vergleich der Sequenzen der Mitglieder der Chymotrypsin-Superfamilie zeigt das Vorhandensein von Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren innerhalb der katalytischen Domänen (siehe z. B. Fig. 1). In allen Fällen bilden sich diese Insertionen oder Deletionen auf der Oberfläche des gefalteten Moleküls ab und beeinflussen daher nicht die Grundstruktur des Moleküls (Strassburger, W. et al., FEBS Lett., 157: 219-223 (1983)).

II. Serinprotease-Inhibitoren

Serinprotease-Inhibitoren sind in der Wissenschaft wohl bekannt und werden in die folgenden Familien eingeteilt: (i) die Rinder-Pankreas-Trypsin-Inhibitor-Familie (Kunitz), auch bekannt als basischer Proteaseinhibitor (Ketcham, L. K. et al., in: Atlas of Protein Sequence und Structure. Hrsg. Dayhoff, M. O., S. 131-143 (1978)) (im Folgenden "BPTI"), (ii) die Kazal-Familie, (iii) die Streptomyces-Subtilisin-Inhibitor-Familie ("im Folgenden "SSI"), (iv) die Serpin-Familie, (v) die Sojabohnen-Trypsm-Inhibitor-Familie (Kunitz), (vi) die Kartoffel-Inhibitor-Familie, und (vii) die Bowman-Birk-Familie (Laskowski, M. et al., Ann. Rev. Biochem., 49: 593 626 (1980); Read. R. J. et al., Elsevier, Amsterdam, S. 301-336 (1986); und Laskowski, M. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., LII: 545-553 (1987)),
Für eine Reihe von intakten Inhibitoren stehen kristallographische Daten zur Verfügung, einschließlich von Mitgliedern der BPTI-, Kazal-, SSI-, Sojabohnen-Trypsin- und Kartoffel-Inhibitor-Familien, und für eine geschnittene Form des Serpins alpha-1-Antitrypsin (Read, R. J. et al., in: Proteinase Inhibitors, Hrsg. Barrett, A. J. et al., Elsevier, Amsterdam, S. 301-336 (1986)). Trotz der Tatsache, dass diese Serinprotease-Inhibitoren Proteine von unterschiedlicher Größe und Sequenz sind, haben alle intakten Inhibitoren, die bis heute untersucht wurden, eine charakteristische Schleife gemein, die aus der Oberfläche des Moleküls herausragt und die die Erkennungssequenz für die aktive Stelle der dazugehörigen Serinprotease enthält (Levin, E. G. et al., Proc. Natl. Acad. Bei, USA, 80: 6804-6808 (1983)). Die strukturelle Ähnlichkeit der Schleifen bei den unterschiedlichen Serinprotease-Inhibitoren ist bemerkenswert (Papamokos, E. et al., J. Mol. Biol., 158: 515-537 (1982)). Außerhalb der Aktive-Stelle-Schleife sind die Serinprotease-Inhibitoren von verschiedenen Familien grundsätzlich strukturell nicht verwandt, obwohl die Kazal-Familie und die Streptomyces- Subtilisin-Familie von Inhibitoren einige strukturelle und Sequenz-Ähnlichkeiten aufweisen. Viele der Serinprotease-Inhibitoren haben eine breite Spezifität und sind m der Lage, sowohl die Chymotrypsin-Superfamilie von Proteasen, einschließlich der Blutgerinnungs- Serinproteasen, als auch die Streptomyces-Subtilisin-Superfamilie von Serinproteasen zu inhibieren (Laskowski, M. et al., Ann. Rev. Biochem., 49: 593-626 (1980)). Man glaubt, dass die Spezifität jedes Inhibitors in erster Linie durch die Identität der Aminosäure, die direkt Amino-terminal von der potentiellen Schnittstelle des Inhibitors durch die Serinprotease liegt, bestimmt wird. Man glaubt, dass diese Aminosäure, bekannt als der P1-Stellen-Rest, eine Acylbindung mit dem Serin in der aktiven Stelle der Serinprotease bildet (Laskowski, M. et al., Ann. Rev. Biochem., 49: 593-626 (1980)).

A. Die BPTI-Familie

Serinprotease-Inhibitoren, die zu der BPTI-Familie gehören, schließen BPTI, Schlangengiftinhibitor, Inter-alpha-Inhibitor und den A4-Amyloid-Vorläufer A4695 (Laskowski, M. et al., Ann. Rev. Biochem., 49: 593-626 (1980); Read, R. J. et al., Elsevier, Amsterdam, S. 301-336 (1986); und Ponte, P. et al., Nature, 331: 525-527 (1988)) ein. Beispiele von Serinproteasen und ihren dazugehörigen BPTI-Familie-Inhibitoren sind in der Tabelle I unten aufgeführt. Tabelle I

B. Die Kazal Familie

Serinprotease-Inhibitoren, die zu der Kazal-Familie gehören, schließen pankreatischen sekretorischen Inhibitor, Ovomucoid- und Samenplasma-Akrosin-Inhibitor mit ein (Laskowski, M. et al., Ann. Rev. Biochem., 49: 593-626 (1980); Read, R. J. et al., in: Proteinase Inhibitors, Hrsg. Barrett, A. J. et al., Elsevier, Amsterdam, S. 301-336 (1986); und Laskowski, M. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., LII: 545-553 (1987)). Beispiele von Serinproteasen und ihren dazugehörigen Kazal-Familie-Inhibitoren sind in Tabelle II unten aufgelistet. Tabelle II

C. Der Streptomyces-Subtilisin-Inhibitor

Serinprotease-Inhibitoren, die zu der Streptomyces-Subtilisin-Inhibitor-Familie gehören, schließen Inhibitoren mit ein, die man aus Streptomyces albogriseolus erhält, und Plasminostreptin (Laskowski, M. et al., Ann. Rev. Biochem., 49: 593-626 (1980)). Beispiele von Serinproteasen und ihren dazugehörigen Inhibitoren der Streptomyces-Subtilisin-Klasse sind in Tabelle III unten aufgelistet. Tabelle III

D. Die Serpin-Familie

Serinprotease-Inhibitoren, die zur Serpin-Familie gehören, schließen die Plasminogen- Aktivator-Inhibitoren PAI-1, PAI-2, und PAI-3, C1 Esterase-Inhibitor, alpha-2-Antiplasmin, Contrapsin, alpha-1-Antitrypsin, Antithrombin III, Protease-Nexin I, alpha-1- Antichymotrypsin, Protein C-Inhibitor, Heparin-Cofactor II und Wachstumshormonreguliertes Protein mit ein (Carrel, R. W. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 52: 527-535 (1987); Sommer, J. et al., Biochem., 26: 6407-6410 (1987); Suzuki, K. et al., J. Biol. Chem., 262: 611-616 (1987) und Stump, D. C. et al., J. Biol Chem., 261: 12759-12766 (1986)).
Die Inhibition von Serinproteasen durch Serpine wurde besprochen in Travis, J. et al., Ann. Rev. Biochem., 52: 655-709 (1983); Carrell, R. W. et al., Trends Biochem. Sci., 10: 20- 24 (1985); Sprengers, E. D. et al., Blood, 69: 381-387 (1987); und Proteinase Inhibitors, Hrsg. Barrett, A. J. et al., Elsevier. Amsterdam (1986).
Beispiele von Serinproteasen und ihren dazugehörigen Serpin-Inhibitoren sind in Tabelle IV unten aufgelistet. Tabelle IV

E. Die Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor-Familie

Ein einziges Beispiel der Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor-Familie, gereinigt aus Sojabohnen, wurde sequenziert. Dessen Komplex mit Rinder-Pankreas-Trypsin wurde untersucht (Sweet, R. M. et al., Biochem., 13: 4214-4228 (1974)).

F. Die Kartoffel-Inhibitor-Familie

Serinprotease-Inhibitoren, die zu der Kartoffel-Inhibitor-Familie gehören, schließen Inhibitoren aus Kartoffeln, Gerste und Blutegeln mit ein (Read, R. J. et al., in: Proteinase Inhibitors, Hrsg. Barrett, A. J. et al., Elsevier, Amsterdam, S. 301-336 (1986)). Beispiele von Serinproteasen und ihren Kartoffel-Inhibitoren sind in der Tabelle V unten aufgelistet Tabelle V

G. Die Bowman-Birk-Inhibitor-Familie

Serinprotease-Inhibitoren, die zu der Bowman-Birk-Inhibitor-Familie gehören, schließen homologe Proteine von Hülsenfrüchten ein (Laskowski, M, et al., Ann. Rev. Biochem., 49: 593-626 (1980)). Beispiele von Serinproteasen und ihren Bowman-Birk- Inhibitoren sind m Tabelle VI unten aufgelistet. Tabelle VI

III. Serinprotease-Inhibitor-Komplexe

Serinprotease-Inhibitoren von allen Familien bilden stabile 1 : 1 Komplexe mit ihrer dazugehörigen Serinprotease. Diese Komplexe dissoziieren nur langsam (in Stunden bis zu Tagen) (Laskowski, M. et al., Ann Rev. Biochem., 49: 593-626 (1980); und Levin, E. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 6804-6808 (1983)). Bei allen Serinproteasen-Inhibitoren, nut Ausnahme der Serpine, sind die Dissoziationsprodukte eine Mischung aus den intakten und den geschnittenen Inhibitormolekülen. Andererseits glaubt man, da die Dissoziation von Serinprotease-Serpin-Komplexen nur geschnittene Inhibitor-Moleküle hervorzubringen scheint, dass die Serpine einen Mechanismus verwenden, der ein wenig verschieden von dem der anderen Serinprotease-Inhibitoren ist.
Für mehrere Serinprotease-Inhibitor-Komplexe stehen Strukturdaten zur Verfügung, einschließlich Trypsin-BPTI, Chymotrypsin-Ovomucoid-Inhibitor, Chymotrypsin-Kartoffel- Inhibitor, und Streptomyces-Subtilisin-Streptomyces-Subtilisin-Inhibitor (Read, R. J. et al., in: Proteinase Inhibitors, Hrsg. Barrett, A. J. et al., Elsevier, Amsterdam. S. 301-336 (1986)). Die Untersuchung dieser Strukturen offenbart bemerkenswerte Ähnlichkeiten der spezifischen Wechselwirkungen zwischen dem jeweiligen Inhibitor und seiner dazugehörigen Serinprotease, trotz der unterschiedlichen Sequenzen der Inhibitoren. Diese strukturelle Ähnlichkeit hat in der vorliegenden Erfindung nahegelegt, dass selbst wenn Kristallstrukturen nicht verfügbar sind, es möglich sein kann, die Aminosäurewechselwirkungen, die zwischen einem Inhibitor und seiner dazugehörigen Serinprotease auftreten, vorherzusagen.
Wie oben diskutiert, enthalten die Inhibitoren ein reaktives Zentrum, das als ein kompetetives Substrat für die aktive Stelle der Serinprotease dient. Ein Angriff auf die Peptidbindung zwischen den P&sub1;-P&sub1;'-Resten des reaktiven Zentrums (z. B. Arg&sub3;&sub4;&sub6;-Met&sub3;&sub4;&sub7; im Falle von PAI-1) führt nicht zu der normalen schnellen Dissoziation der Produkte von der Serinprotease, sondern eher zur Etablierung eines stabilen Serinprotease-Inhibitor- Komplexes, vermutlich durch die Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem Serin der aktiven Stelle, der Protease und dem P&sub1;-Rest des Inhibitors (Laskowski, M. et al., Ann. Rev. Biochem., 49: 593-626 (1980)). Dieser Mechanismus deutet darauf hin, dass das reaktive Zentrum eines Inhibitors wie PAI-1 fest und präzise in die aktive Stelle der Serinprotease hineinpassen muss. Bis heute gibt es jedoch keine röntgenkristallographischen Daten über PAI-1, seine dazugehörige Serinprotease, t-PA, oder den t-PA/PAI-1-Komplex. Daher ist der genaue Charakter der Wechselwirkungen zwischen diesem Proteinpaar unbekannt. Es gibt einen ähnlichen Mangel an strukturellen Informationen über andere Serpine oder Serpin- Serinprotease-Komplexe.

IV. Der Nutzen von Serinproteasen

Eine besonders wichtige Serinprotease der Chymotrypsin-Superfamilie ist t-PA. t-PA wird derzeit über intrakoronäre oder intravenöse Verabreichung verwendet, um Myokardinfarkt, Lungenembolie und tiefe Venenthrombose zu behandeln, obwohl es nicht direkt das Auflösen von Thromben (Blutgerinnsel) bewirkt. t-PA fördert eher das Schneiden der Peptidbindung zwischen Arg&sub5;&sub6;&sub0; und Val&sub5;&sub6;&sub1; von Plasminogen (Robins, K. C, et al., J. Biol. Chem., 242: 2333-2342 (1967)), wobei es das inaktive Zymogen in die leistungsfähige aber nicht-spezifische Protease Plasmin umwandelt, die dann das Fibrinnetzwerk des Blutgerinnsels abbaut (Bachmann, F. et al., Semin. Throm. Haemost., 43: 77-89 (1984); Gerard, R. D. et al., Mol. Biol. Med., 3: 449-557 (1986); und Verstraete, M. et al., Blood, 67: 1529-1541(1986)).
t-PA erzeugt eine lokale Fibrinolyse, ohne notwendigerweise eine Verarmung an systemischem Fibrinogen zu erzeugen. Dies ist darin begründet, dass t-PA die Fähigkeit besitzt, direkt an Fibrin zu binden, wobei ein Fibrin-t-PA-Komplex gebildet wird, dessen Affinität für Plasminogen ungefähr 500fach erhöht ist (Ranby, M. et al., Biochim. Biophys. Acta, 704: 461-469 (1982); und Rijken, D. C. et al., J. Biol. Chem., 257: 2920-2925 (1982)). Daher führt die Bindung von intravenös verabreichten t-PA an Koronarthromben, wo Plasminogen ebenfalls in hohen Konzentrationen vorliegt (Wiman, B. et al., Nature, 272: 549- 550 (1978)), zu einer effizienten Produktion von Plasmin an der Stelle des Thrombus, wo es den meisten Nutzen bringt.
Zur Zeit wird t-PA in der Form eines anfänglichen Bolus gefolgt von anhaltender Infusion verabreicht. Die Gesamtmenge an verabreichtem Enzym während einer Standard- Behandlung von drei Stunden ist im allgemeinen ungefähr 50-100 mg. Solche großen Mengen sind offensichtlich aus zwei Gründen erforderlich: Erstens, um die Auswirkungen der schnellen Beseitigung von t-PA aus dem Blutkreislauf durch Leberzellen auszugleichen (Krause, J., Fibrinolysis, 2: 133-142 (1988)), und zweitens, um die Einflüsse der relativ hohen Konzentrationen an Serinprotease-Inhibitoren, die m Plasma und Blutplättchen vorliegen, zu überwinden (Carrell, R. W. et al., in: Proteinase Inhibitors, Hrsg. Barrett, A. J. et al., Elsevier, Amsterdam, S. 403-420 (1986)).
Der physiologische Haupt-Inhibitor von t-PA ist das Serpin, PAI-1, ein Glykoprotein von ungefähr 50 kD Größe (Pannekoek, H. et al., EMBO J., 5: 2539-2544 (1986), Ginsberg, D. et al., J. Clin. Invest., 78: 1673-1680 (1980); und Carrell, R. W. et al., in: Proteinase Inhibitors, Hrsg. Barrett, A. J. et al., Elsevier, Amsterdam, S. 403-420 (1986)). PAI-1 wurde als der Grund für verminderte fibrinolytische Kapazität von Plasma von Überlebenden von Myokardinfarkten impliziert (Hamsten, A. et al., New Eng. J. Med., 313: 1557-1563 (1985)). Zusätzlich ist PAI-1 ein Akute-Phase-Reaktant, und die erhöhten Spiegel, die mit Myokardinfarkt assoziiert sind, könnten die fibrinolytische Aktivität erheblicher Mengen des t-PA, das nach therapeutischer Infusion des t-PA im Plasma zurückbleibt, abschwächen (Lucore, C. L. et al., Circ., 77: 660-669 (1988)). Die Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung für die Assoziation von PAI-1 mit t-PA ist extrem hoch (Hekman, C. et al., Arch. Biochem. Biophys., 262: 199-210 (1988)) und bedingt die anfängliche "schnelle-Phase"- Inhibierung von t-PA durch humanes Plasma (Colucci, M. et al., J. Lab. Clin. Med., 108: 53- 59 (1986)). Die schnelle Neutralisierung von t-PA durch PAI-1 in vivo könnte daher zu Koronarrestenose nach thrombolytischer Therapie beitragen, eine Komplikation, die zwischen 10% und 35% der Patienten betrifft, die auf akuten Myokardinfarkt behandelt wurden (Chesebro, J. H. et al., Circ., 76: 142-154 (1987)).
Obwohl die Assoziationskonstante anderer Serpine wie C1-Esterase-Inhibitor und alpha-2-Antiplasmin, mit t-PA um Größenordnungen niedriger liegen als die mit PAI-1 (Ranby, M. et al., Throm. Res., 27: 175-183 (1982); und Hekman, C. et al., Arch. Biochem. Biophys., 262: 199-210 (1988)), binden diese Serpine dennoch an durch Infusion verabreichtes t-PA (Lucore, C. L. et al., Circ., 77: 660-669 (1988)) und können die günstigen pharmakologischen Eigenschaften von t-PA vermindern.
Neben t-PA und PAI-1 können viele andere Serinprotease-Serpin-Paare von großer medizinischer Bedeutung sein. Zum Beispiel ist u-PA, wie t-PA bei der Behandlung von Myokardinfarkt nützlich und ist der Inhibierung durch dieselben Serinprotease-Inhibitoren unterworfen wie t-PA.
Thrombin, die Serinprotease, die topisch verwendet wird, um die Blutgerinnung bei Wunden zu fördern, ist ein Prokoagulans. Sein dazugehöriges Serpin, Antithrombin III, ist ein Anti-Koagulans, das eine spezifische Reihe von Serinproteasen inhibiert, die an der Blutgerinnungskaskade teilhaben, einschließlich Thrombin und die Faktoren IXa, Xa, XIa und XIIa (Heimburger, N. et al., in: Proceedings of the International Research Conference on Proteinase Inhibitors, Hrsg. Fritz, H. et al., Walter de Gruyter, New York, S. 1-22 (1971); Kurachi, K. et al. Biochem, 15: 373-377 (1976); Kurachi, K. et al. Biochem., 16: 5831-5839 (1977); und Osterud, B. et al., Semin. Thromb. Haemost., 35: 295-305 (1976)). Antithrombin III wurde therapeutisch verwendet, um verstreute intravaskuläre Gerinnung zu behandeln. Die Aktivierung von Protein C durch Thrombin führt zur Selbstbegrenzung des Blutgerinnungs- Prozesses, da aktiviertes Protein C die Gerinnungsfaktoren VIa und VIIIa inaktiviert, und es wird seinerseits durch sein dazugehöriges Serpin, Protein C-Inhibitor, inhibiert.
Kallikrein, das bewirkt, dass die Uterus-Kontraktion induziert wird, dass die vaskuläre Permeabilität erhöht wird und dass der intrinsische Weg der Blutgerinnung initiiert wird, unterliegt der Inhibierung durch das Serpin alpha-1-Antitrypsin, eines der wichtigeren Serpine. Alpha-1-Antitrypsin inhibiert auch Leukozyten, Elastase und Kathepsin sowie Trypsin, Chymotrypsin und Plasmin (Heimburger, N. et al., in: Proceedings of the International Research Conference on Proteinase Inhibitors, Hrsg. Fritz, H. et al., Walter de Gruyter, New York, S. 1-47 (1971); Janoff, A., Am. Rev. Resp. Dis., 105: 121-127 (1972); und Ohlsson, K. et al., Eur. J. Biochem., 36: 473-481 (1973)). Der genetische Mangel an Alpha-1-Antitrypsin steht in direkter Verbindung zu Emphysem (Carrell, R. W. et al., Trends Biochem. Sci., 10: 20-24 (1985)) und Alpha-1-Antitrypsin-Ersatztherapie wurde angewendet, um Emphyseme zu behandeln (Marx, J. L., Science, 243: 315-316 (1989)).

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Wildtyp-t-PA durch Proteinmanipulation zu verbessern, um deren enzymatische Effizienz zu erhöhen und /oder deren Dosierung zu verändern, ohne notwendigerweise andere vorteilhafte pharmakologische Eigenschaften zu verändern.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Gene zur Verfügung zu stellen, die die verbesserten t-PAs codieren.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird eine t-PA-Mutante bereitgestellt, welche resistent gegenüber einer Inhibition durch den dazugehörigen Inhibitor ist, wobei die besagte t-PA-Mutante eine Substitution der basischen Aminosäure, die Apposition Nr. 304 des t-PA entspricht, durch eine saure oder neutrale Aminosäure hat.
Der dazugehörige Inhibitor kann Proteaseinhibitoren der Serpin-Familie, besonders PAI-1, PAI-2, und PAI-3, miteinschließen.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Gen bereit, das eine t-PA-Mutante codiert, welche resistent gegenüber einer Inhibition durch deren dazugehörigen Inhibitor ist, wobei die besagte t-PA-Mutante eine Substitution der basischen Aminosäure, die der Position 304 des t-PA entspricht, durch eine saure oder neutrale Aminosäure hat.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Erhalt einer t-PA-Mutante bereit, welche resistent gegenüber einer Inhibition durch deren dazugehörigen Inhibitor ist, umfassend:
a) Kultivieren einer Wirtszelle, welche mit DNA transformiert wurde, die ein Gen umfasst, das die t-PA-Mutante codiert, wobei die besagte t-PA-Mutante eine Substitution der basischen Aminosäure, die der Position 304 des t-PA entspricht, durch eine saure oder neutrale Aminosäure hat;
b) Isolieren der resultierenden t-PA-Mutante.
Plasmide, die verwendet werden können, um die Erfindung in die Praxis umzusetzen, schließen pSVT7(RI&supmin;)/t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → S) [DH-1] der die Identifizierungskennzeichen von ATCC Nr. 67894 hat, oder pSVT7(RI&supmin;)/t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → E) [DH-1], der die Identifizierungskennzeichen von ATCC Nr. 67896 hat, mit ein.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt einen Vergleich der Sequenz verschiedener Serinproteasen der Chymotryp sin- Superfamilie. Die Sequenzen sind vergleichend angeordnet, um die Überlappung konservierter Aminosäuren aufzuzeigen. Die Zahlen über dem Trypsin beziehen sich auf das Nummerierungssystem, das im PDB3ptp.ent-Eintrag in der Proteindatenbank (Protein Data Bank) verwendet ist. Die Zahlen über dem t-PA beziehen sich auf die Aminosäuren im reifen t-PA-Molekül. Die Fig. 2 zeigt einen Vergleich der Sequenzen verschiedener Mitglieder der Serpin-Familie von Serinprotease-Inhibitoren. Die Sequenzen sind vergleichend angeordnet, um die Überlappung konservierter Aminosäuren aufzuzeigen. Die Zahlen unter dem alpha-1-Antitrypsin und die Zahlen über dem PAI-1 beziehen sich auf Aminosäurereste in den reifen Molekülen.
Fig. 3 stellt schematisch die Konstruktion der Vektoren dar, die verwendet wurden, um das Wildtyp-t-PA und die Serin-resistenten Mutanten von t-PA der vorliegenden Erfindung zu mutieren und zu exprimieren.
Fig. 4 zeigt einen Vergleich der Aktivitäten von Wildtyp-t-PA und Serpin-resistenten Mutanten von t-PA in einem indirekten chromogenen Assay. In Fig. 4 stellt Wildtyp-t-PA , t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → S), t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → E), ·t-PA(Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) dar.
Fig. 5 zeigt die Wirkung von PAI-1 auf die Aktivitäten von Wildtyp-t-PA und Serpin-resistenten Mutanten von t-PA in einem indirekten chromogenen Assay.
In Fig. 5 stellt Wildtyp-t-PA, t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → S), t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → E), und ·t-PA(Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) dar.
Fig. 6 zeigt einen Vergleich der Aktivitäten von Wildtyp-t-PA und Serpin-resistenten Mutanten von t-PA in einem indirekten chromogenen Assay. In Fig. 6 stellt t-PA(H&sub2;&sub9;&sub7; → Y), · Wildtyp-t-PA, + t-PA(K&sub2;&sub9;&sub6; → E), die dreifach-Mutante t-PA(K&sub2;&sub9;&sub6;, R&sub2;&sub9;&sub8;, R&sub2;&sub9;&sub9; → E, E, E) , t-PA(R&sub2;&sub9;&sub9; → E), Δ t-PA(R&sub2;&sub9;&sub8; → E) und t-PA(P&sub3;&sub0;&sub1; → G) dar.
Fig. 7 zeigt die Wirkung von PAI-1 auf die Aktivitäten von Wildtyp-t-PA und Serpin-resistenten Mutanten von t-PA in einem indirekten chromogenen Assay. In Fig. 7 stellt t-PA(H&sub2;&sub9;&sub7; → Y), · Wildtyp-t-PA, + t-PA(K&sub2;&sub9;&sub6; → E), t-PA(K&sub2;&sub9;&sub6;, R&sub2;&sub9;&sub8;, R&sub2;&sub9;&sub9; → E, E, E), t-PA(R&sub2;&sub9;&sub9; → E), Δ t-PA(R&sub2;&sub9;&sub8; → E), und t-PA(P&sub3;&sub0;&sub1; → G) dar.
Fig. 8 stellt schematisch die Konstruktion des Vektors dar, der verwendet wurde, um den Wildtyp-PAI-1 und die Mutanten von PAI-1 der vorliegenden Erfindung zu mutagenisieren und zu exprimieren.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie oben diskutiert, wurden die oben beschriebenen Aufgaben der vorliegenden Erfindung in einer Ausführungsform durch Serinprotease-Mutanten der Chymotrypsin- Superfamilie, insbesondere t-PA-Mutanten, die resistent gegenüber der Inhibition durch ihren zugehörigen Inhibitor sind, erfüllt; und durch Gene, die dieselben codieren.
Der spezielle Serinprotease-Inhibitor, gegen den die t-PA-Mutante gegenüber einer Inhibition resistent ist, ist ein Mitglied der Serpin-Familie. Beispiele von Serpin-Inhibitoren schließen PAI-1, PAI-2, PAI-3, C1-Esterase-Inhibitor (C1inh), Protein-C-Inhibitor (PCinh), Heparin Cofaktor II (HCII), Alpha-2-Antiplasmin (A2AP), Antithrombin III (ATIII), Alpha- 1-antitrypsin (A1AT), Protease-Nexin I (Nex-I), Contrapsin (Cntrps), Wachstumshormonreguliertes Protein (GHRP), und Alpha-1-Antichymotrypsin (AChym) ein. Das bevorzugte Serpin ist PAI-1.
Alle bekannten Serinprotease-Inhibitoren sind in ihrer Schleife des reaktiven Zentrums strukturell homolog und bilden ähnliche Wechselwirkungen mit ihren dazugehörigen Serinproteasen aus (Read, R. J. et al., in: Proteinase Inhibitors, Hrsg. Barrett, A. J, et al., Elsevier, Amsterdam, S. 301-336 (1986)). Die strukturellen Übereinstimmungen zwischen Serinproteasen und Serinproteasen-Inhibitoren können dazu verwendet werden, Modelle von Komplexen aufzustellen, die zuvor noch nicht studiert wurden.
Aufgrund des hohen Grades struktureller Homologie zwischen der katalytischen Domäne von t-PA und anderen Serinproteasen (Blundell, T. et al., Nature, 326: 347-352 (1987)) wurde in der Erfindung postuliert, dass die bekannte Struktur des Komplexes aus Trypsin und BPTI (Huber. R. et al., J. Mol. Biol, 89: 73-101 (1974); und Bode, W. et al., in: Proteolysis and Physiological Regulation, Academic Press, New York, S. 43-76 (1976)) als Model für die Wechselwirkung zwischen t-PA und PAI-1 dienen kann. Im Gegensatz zu den Aminosäuren der Haupt-Erkennungsstelle sind die Trypsin-Aminosäuren, die einen direkten Kontakt mit BPTI herstellen, in zwei getrennten Regionen der Polypeptidkette lokalisiert (Reste 37-41 und 210-213) (siehe Fig. 1).
Die Region um die Aminosäurereste &sub2;&sub1;&sub4;SWGS&sub2;&sub1;&sub7; ist bei allen Mitgliedern der Chymotrypsin-Superfamilie hochgradig konserviert. Im Gegensatz dazu ist die Region um die Aminosäurereste &sub3;&sub6;NSGYHF&sub4;&sub1; variabler und bildet einen Teil der Oberfläche, die mit dem Inhibitor interagiert. Wie in Fig. 1 gezeigt, unterscheidet sich die Aminosäuresequenz von t- PA in dieser Region von derjenigen von Trypsin hauptsächlich in zweierlei Hinsicht. Erstens, der Tyr(Y&sub3;&sub9;)-Rest von Trypsin wurde in t-PA durch einen Arg(R&sub3;&sub0;&sub4;)-Rest ersetzt. Eine Modellbildung basierend auf der Annahme, dass die Wechselwirkung zwischen t-PA und PAI-1 diejenige zwischen Trypsin und BPTI nachahmt, legt nahe, dass R&sub3;&sub0;&sub4; von t-PA eine Salzbrücke mit einem Glu (E&sub3;&sub5;&sub0;)- Rest von PAI-1 ausbilden kann. Dieser Glu-Rest in PAI-1 ist in Bezug auf die Stellung äquivalent zu E&sub1;&sub9; von BPTI (Tabelle VII unten) welcher einen von der Waal'schen Kontakt mit Y&sub3;&sub9; von Trypsin ausbildet (Huber, R. et al., J. Mol. Biol., 89: 73-101 (1974); und Bode, W. et al., in: Proteolysis and Physiological Regulation, Academic Press, New York, S. 43-76 (1976)). Daher wird vorausgesagt, dass E&sub3;&sub5;&sub0; von PAI-1 ein Ionenpaar mit R&sub3;&sub0;&sub4; von t-PA ausbildet. Tabelle VII
Zweitens, trägt t-PA eine zusätzliche Verlängerung von sieben Aminosäuren (&sub2;&sub9;&sub6;KHRRSPG&sub3;&sub0;&sub2;, siehe Fig. 1), benachbart neben dem vorhergesagten Kontakt zwischen t- PA(R&sub3;&sub0;&sub4;) und PAI-1(E&sub3;&sub5;&sub0;) gelegen. Vier von sieben dieser Aminosäuren sind positiv geladen, während die vorhergesagte komplementäre Region von PAI-1(&sub3;&sub5;&sub0;EEIIMD&sub3;&sub5;&sub5;) drei negativ geladene Reste enthält. Man glaubt entsprechend der vorliegenden Erfindung, dass elektrostatische Wechselwirkungen zwischen diesen Regionen eine wichtige Rolle bei der Bildung oder Stabilisierung von Komplexen zwischen t-PA und PAI-1 spielen könnten. Im Gegensatz dazu können solche Wechselwirkungen nicht auftreten, wenn t-PA mit seinem Substrat, Plasminogen (PLG), interagiert, welche keine negativ geladenen Reste in der äquivalenten Region hat (siehe Tabelle VII oben).
Vergleiche der Sequenzen verschiedener Serinproteasen der Chymotrypsin- Superfamilie, so wie jene in Fig. 1 gezeigten, können als Richtschnur verwendet werden, um eine oder mehrere Mutationen in den verschiedenen Serinproteasen der Chymotrypsin- Superfamilie zu entwerfen, um sie gegenüber der Inhibition durch ihre dazugehörigen Wildtypen-Inhibitoren resistent zu machen. Wie t-PA unterscheiden sich die anderen Serinproteasen der Chymotryp sin-Superfamilie, die in Fig. 1 gezeigt sind, von Trypsin im wichtigen Kontaktrest (Y&sub3;&sub9; von Trypsin) und darin, dass sie Insertionen verschiedener Größe enthalten, die benachbart zum Kontaktrest lokalisiert sind. Somit schließen Beispiele für Kandidaten für Mutationen folgende mit ein:
i) Aminosäurereste, die in anderen Serin-Proteasen die Position äquivalent zu der von Tyr(Y&sub3;&sub9;) von Trypsin belegen (dem Rest, der einen Kontakt mit He (I&sub1;&sub9;) von BPTI ausbildet und daher eine wichtige Rolle bei der Wechselwirkung zwischen den zwei Proteinen spielt). In Plasmin, zum Beispiel, belegt ein Met (M)- Rest nun die Position äquivalent der von Y&sub3;&sub9; von Trypsin. Es wird erwartet, dass das Mutieren dieses Met-Restes zu einer anderen Aminosäure mit unterschiedlichen Eigenschaften, wie Ladung oder Größe (Glu (E) zum Beispiel), die Empfänglichkeit von Plasmin für die Inaktivierung durch Antiplasmin aufhebt oder reduziert, obwohl die bestimmte verwendete Ersatz-Aminosäure nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung ist. Ganz ähnlich wird erwartet, dass das Mutieren des Gh (Q)- Restes von Thrombin (der die Position äquivalent zu der des Y&sub3;&sub9; von Trypsin belegt) zu einer anderen Aminosäure mit unterschiedlichen Eigenschaften, wie Ladung oder Größe (zum Beispiel Asp (D)) die Empfänglichkeit von Thrombin für die Inaktivierung durch Antithrombin III aufhebt oder reduziert, obwohl die bestimmte verwendete Aminosäure nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung ist; und
ii) Reste von anderen Serinproteasen der Chymotrypsin-Superfamilie, die nicht in Trypsin vorkommen und sich nahe der aktiven Stelle als kleine Insertionen auf der Oberfläche des Moleküls abbilden (siehe Fig. 1). Zum Beispiel enthält Plasmin ein Insert von 2 Aminosäuren (RF) in der Nähe des Kontaktrestes m einer Position, die äquivalent ist zu der, die durch &sub2;&sub9;&sub6;KHRRSPG&sub3;&sub0;&sub2; von t-PA belegt wird. Es wird erwartet, dass die Mutation durch Deletion oder Substitution einer oder beider dieser zwei Aminosäuren oder durch Insertion einer kleinen Anzahl zusätzlicher Aminosäuren die Wechselwirkung mit dem Inhibitor beseitigt oder reduziert, ohne notwendigerweise die katalytische Stelle der Serinprotease zu beeinflussen. Als weiteres Beispiel enthält u-PA ein Insert von sechs Aminosäuren (RHRGGS) in der Nähe von dem Kontaktrest in einer Position äquivalent zu der, die durch &sub2;&sub9;&sub6;KHRRSPG&sub3;&sub0;&sub2; von t-PA belegt wird. Es wird erwartet, dass die Mutation oder Deletion dieser sechs Reste die Wechselwirkung mit Serinprotease- Inhibitoren in einer Weise reduziert oder ausschließt, ähnlich zu der, die bei der Mutante t-PA (Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) beobachtet wird.
Gleichermaßen ist die Region der Serinprotease-Inhibitoren innerhalb des reaktiven Zentrums recht variabel und bildet einen Teil der Oberfläche, die mit der Serinprotease interagiert. Sequenzvergleiche verschiedener Serinprotease-Inhibitoren der Serpinfamilie, wie jene, die in Fig. 2 gezeigt sind, können als Richtschnur verwendet werden, um eine oder mehrere Mutationen in den verschiedenen Serinprotease-Inhibitoren zu konzipieren, und insbesondere bei Mitgliedern der Serinfamilie von Serinprotease-Inhibitoren, um diese in die Lage zu versetzen, die erfindungsgemäßen Serinprotease-Inhibitor-resistenten der Chymotrypsin- Superfamilie effektiv zu inhibieren. Wie PAI-1 unterscheiden sich andere Mitglieder der Serinfamilie, die in Fig. 2 gezeigt sind, in der Sequenz in dem wichtigen Kontakt- Aminosäure-Rest (E&sub3;&sub5;&sub0; von PAI-1) und enthalten Insertionen verschiedener Größen, lokalisiert in direkter Nähe zum Kontaktrest (siehe Tabelle VIII unten). Tabelle VIII
(h = human; r = Ratte; b = Pavian und m = Maus)
Daher schließen Beispiele für Kandidaten für Mutationen mit ein:
i) Aminosäurereste, die in anderen Serinprotease-Inhibitoren die Position (P4') äquivalent zu der von Glu (E&sub3;&sub5;&sub0;) von PAI-1 (der Rest, der einen Kontakt mit Arg(R&sub3;&sub0;&sub4;) von t-PA ausbildet und daher eine wichtige Rolle bei der Wechselwirkung der zwei Proteine spielt) besetzen. In der vorliegenden Erfindung wurde der Glu-Rest von PAI-1(E&sub3;&sub5;&sub0;) zu Arg(R) mutiert, um die elektrostatische Wechselwirkung wieder herzustellen, die durch Konstruktion der R&sub3;&sub0;&sub4; → E- Mutation in t-PA zerstört wurde. Diese spezifische Mutation im Serpin wurde so konstruiert, dass sie komplementär zu der Mutation ist, die in die Serinprotease eingefügt wurde, welche diese resistent gegenüber Inhibition durch das Wildtyp- Serpin macht. Diese komplementäre E&sub3;&sub0;&sub4; → R-Mutation im Serpin wurde spezifisch ausgewählt, um das Serpin in die Lage zu versetzen, die erfindungsgemäßen Serinprotease-Inhibitor-resistenten Serinproteasen der Chymotrypsin-Superfamilie zu inhibieren; die bestimmte verwendete Ersatz-Aminosäure ist jedoch nicht entscheidend für die vorliegende Erfindung. Wenn zum Beispiel der Met (M)-Rest im Plasmin äquivalent zu Y&sub3;&sub9; von Trypsin (siehe Fig. 1) in eine andere Aminosäure mit unterschiedlichen Eigenschaften, wie Ladung oder Größe (wie das oben aufgezeigte Beispiel, Glu (G)) geändert würde, und dieses mutante Plasmin eine reduzierte Empfänglichkeit für die Inhibition durch Wildtyp-alpha- Antiplasmin zeigen würde, dann wird erwartet, dass die Mutation des P4-Ser (S)- Restes in alpha-2-Antiplasmin zu einer anderen Aminosäure (Arg (R) zu Beispiel), die in der Lage ist, mit dem veränderten Glu-Rest in Plasmin zu interagieren, die Empfänglichkeit des mutanten Plasmins für Inaktivierung durch das mutante alpha-2-Antiplasmin wiederherstellt. Ganz ähnlich wird, wenn der Gin (Q)-Rest von Thrombin zu Asp (D) geändert würde, wie im Beispiel für die Mutation von Thrombin oben aufgezeigt, erwartet, dass dann die Mutation des P6'-Arg (R)- Restes von Antithrombin III zu Glu (E) die Empfänglichkeit des Wiidtyp- Inhibitor-resistenten Thrombins für die Inhibition durch das mutante Anti- Thrombin III wiederherstellt; und
ii) zusätzliche Aminosäurereste anderer Mitglieder der verschiedenen Familien von Serinprotease-Inhibitoren innerhalb des reaktiven Zentrums, das einen Teil der Wechselwirkungs-Oberfläche mit ihrer dazugehörigen Serinprotease ausbildet. Diese Reste sind in Tabelle VIII oben für die Serpin-Familie von Serinprotease- Inhibitoren gezeigt.
Zum Beispiel enthält alpha-2-Antiplasmin die Sequenz SLSSFSVN im reaktiven Zentrum in einer Position, die der von &sub3;&sub4;&sub8;APEEIIMD&sub3;&sub5;&sub5; von PAI-1 äquivalent ist. Es wird erwartet, dass die Mutation durch Substitution einer dieser acht Aminosäuren oder durch Insertion kleiner Anzahlen zusätzlicher Aminosäuren, die Wechselwirkung mit der Serinprotease wiederherstellt, vorausgesetzt dass diese Substitutionen oder Insertionen in einigen Eigenschaften wie Ladung oder Größe oder Hydrophobizität, komplementär zu den Aminosäureresten sind, die bei der Serinprotease eingeführt wurden, die sie ursprünglich resistent gegenüber dem Wildtyp-Serpin gemacht haben.
Die erfindungsgemäßen Serinprotease-Mutanten und Serinprotease-Inhibitor- Mutanten können Punkt-Mutanten, Deletions-Mutanten, Additions-Mutanten oder Mutanten sein, die Kombinationen dieser Arten von Mutationen enthalten.
Die erfindungsgemäßen Serinprotease-Mutanten und Serinprotease-Inhibitor- Mutanten können z. B. mittels der wohlbekannten Technik der Oligonukleotid-vermittelten Mutagenese hergestellt werden (Zoller, M. et al., DNA, 3: 479-488 (1984); Kunkel, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985); und Kunkel, T. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates & Wiley Interscience, New York (1987)). Die genaue Methode zur Erzeugung einer Mutation in der Serinprotease oder dem Serinprotease-Inhibitor ist jedoch für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend.
Mit den erfindungsgemäßen mutanten Serinproteasen kann ein Screening nach denjenigen durchgeführt werden, die die erwünschten Eigenschaften besitzen, d. h. Serinprotease-Aktivität, jedoch Resistenz gegenüber der Inhibition durch den dazugehörigen Inhibitor, unter Verwendung wohlbekannter Assays, wie beschrieben bei Lottenberg, R. et al., Meth. Enzymol, 80: 341-361 (1981).
Mit den erfindungsgemäßen mutanten Serinprotease-Inhibitoren kann ein Screening nach denjenigen durchgeführt werden, die die erwünschten Eigenschaften besitzen, d. h. Serinprotease-Inhibitor-Aktivität gegen die erfindungsgemäßen Serinprotease-Inhibitorresistenten Serinproteasen, unter Verwendung wohlbekannter Assays, wie beschrieben in Lottenberg, R. et al., Meth. Enzymol., 80: 341-361 (1981); Holmes, W. E, et al., Biochem, 26: 5133-5140 (1987); und Hekman, C. M. et al., Arch. Biochem. Biophys., 262: 199-210 (1988).
Die Arbeit, die hierin beschrieben ist, zeigt zum ersten Mal, dass es möglich ist, Serinproteasen durch Mutagenese so zu modifizieren, dass die Wechselwirkung zwischen Serinproteasen der Chymotrypsin-Superfamilie und ihren dazugehörigen Inhibitoren reduziert oder beseitigt wird. Dies erlaubt den Serinprotease-Mutanten, in der Gegenwart des dazugehörigen Inhibitors enzymatisch aktiver als das Wildtyp-Enzym zu bleiben, wobei die Menge an Restaktivität von dem Ausmaß abhängt, in dem ihre Wechselwirkung mit ihrem dazugehörigen Inhibitor inhibiert ist.
Es wird vermutet, dass die Verabreichung solcher mutierter Serin-Proteasen in einer Vielzahl von klinischen und kommerziellen Anwendungen von Nutzen ist. Zum Beispiel wird vermutet, dass eine mutierte Form von aktiviertem Protein C nützlich ist, wenn es vorteilhaft wäre, die Gerinnung von Blut zu inhibieren, genauso wie man vermutet, dass die mutierten Formen von t-PA, die hierin in Beispiel 1 beschrieben sind, nützlich sind, um die effektive Lebensdauer von t-PA im Blutkreislauf eines Patienten mit einer thrombotischen Funktionsstörung, bei der verlängerte Fibrinolyse erforderlich ist, zu verlängern.
Die hierin beschriebene Arbeit zeigt auch zum ersten Mal, dass es möglich ist, Serinprotease-Inhibitoren durch Mutagenese so zu modifizieren, dass die Wechselwirkung zwischen Serinprotease-Inhibitor-resistenten Serinprotease-Mutanten der Chymotrypsin- Superfamilie und ihren dazugehörigen Serinprotease-Inhibitoren durch geeignetes Verändern der Struktur des Serinprotease-Inhibitors funktionell wiederhergestellt wird. Dies erlaubt es den Serinprotease-Mutanten schneller inaktiviert zu werden, als sie es in der Gegenwart des dazugehörigen Wildtyp-Serinprotease-Inhibitors würden, wobei der Grad der Inhibition davon abhängt bis zu welchem Grad ihre Wechselwirkung mit der Serinprotease-Mutante wiederhergestellt worden ist. Man glaubt, dass die Verabreichung eines solchen mutanten Serinprotease-Inhibitors in einer Vielzahl verschiedener klinischer und kommerzieller Anwendungen von Nutzen ist, um die Aktivität von Serinprotease-Inhibitor-resistenten Serinproteasen zu begrenzen. Zum Beispiel wird vermutet, dass eine mutierte Form von Protein C-Inhibitor nützlich ist, wenn es vorteilhaft wäre, die Gerinnung von Blut in Anwesenheit einer mutanten Form von aktiviertem Protein C zu fördern. In ähnlicher Weise glaubt man, dass die mutierten Formen von PAI-1 nützlich beim Verkürzen der effektiven Lebensdauer von Serinprotease-Inhibitor-resistenten t-PA, z. B. t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → E), im Blutkreislauf von einem Patienten, der auf eine thrombotische Funktionsstörung behandelt wurde, sind, sollte ein invasives Verfahren erforderlich sein. Solche veränderten Serinprotease-Inhibitoren könnten daher als Antidots für die Serinprotease-Inhibitorresistenten Serinproteasen verwendet werden.
Die Menge an erfindungsgemäßen Serinprotease-Mutanten, die in klinischen Anwendungen zu verabreichen ist, wird von der spezifischen Serinprotease-Mutante, die verwendet wird, der erwünschten therapeutischen Wirkung der Serinprotease und von Faktoren wie Geschlecht, Alter, Gewicht und physiologischem Zustand des Patienten, dem die Protease verabreicht werden soll, abhängen. Die Menge anzuwendender Serinprotease- Mutante kann durch Routineexperimente bestimmt werden.
Die Menge an erfindungsgemäßem mutanten Serinprotease-Inhibitor, die in klinischen Anwendungen zu verabreichen ist, wird von der spezifischen Serinprotease-Inhibitor- Mutante, die verwendet wird, der erwünschten therapeutischen Wirkung des Serinprotease- Inhibitors und von Faktoren wie Geschlecht. Alter, Gewicht und physiologischem Zustand des Patienten, dem der Serinprotease-Inhibitor verabreicht werden soll, abhängen. Die zu verwendende Menge an mutantem Serinprotease-Inhibitor kann durch Routineexperimente festgestellt werden.
Die erfindungsgemäßen mutanten t-PAs sollten so verabreicht werden, wie durch Tests in geeigneten in vitro und in vivo Modellen und in klinischen Versuchsreihen ermittelt wird. Es wird erwartet, dass die erforderlichen Dosen zwischen 10 und 1000 mal niedriger sein werden als die, die bei Wildtyp-t-PA erforderlich sind.
Die erfindungsgemäßen mutanten PAI-1s sollten ebenfalls so verabreicht werden, wie mittels Tests in geeigneten in vitro und in vivo Modellen und in klinischen Versuchsreihen bestimmt. Es wird angenommen, dass die erforderlichen Dosen ungefähr dieselben sein werden wie die für mutante t-PAs erforderlichen.
Die erfindungsgemäßen mutanten Serinproteasen können mit irgendeinem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht werden, wie im Stand der Technik wohlbekannt ist, wie einer physiologischen Kochsalzlösung (Lucore, C. L. et al., Circ., 77: 660-669 (1988); und Chesebro, J. H. et al., Circ., 76: 142-154 (1987)).
Die erfindungsgemäßen mutanten Serinprotease-Inhibitoren können ebenfalls mit irgendeinem pharmazeutisch-verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht werden, wie im Stand der Technik wohlbekannt, wie einer physiologischen Kochsalzlösung (Lucore, C. L. et al., Circ., 77: 660-669 (1988); und Chesebro, J. H. et al., Circ., 76: 142-154 (1987)).
Der jeweilige Verabreichungsmodus der erfindungsgemäßen mutanten Serinprotease hängt von dessen jeweiliger Anwendung ab. Beispiele solcher Verabreichungsmodi schließen intravenöse oder intraperitoneale Injektion, intrakoronare Infusion, örtliche Anwendung und Aerosol-Inhalation mit ein.
Der besondere Verabreichungsmodus der erfindungsgemäßen mutanten Serinprotease- Inhibitoren hängt von deren jeweiliger Anwendung ab. Beispiele solcher Verabreichungsmodi schließen intravenöse oder intraperitoneale Injektion, interkoronare Infusion, örtliche Anwendung und Aerosol-Inhalation mit ein. Die folgenden Beispiele werden nur für Zwecke der Veranschaulichung gegeben und es ist in keiner Weise beabsichtigt, damit den Umfang der vorliegenden Erfindung zu begrenzen.

BEISPIEL 1

t-PA-MUTANTEN

Obwohl die in diesem Beispiel beschriebene Technologie auf die Verwendung von t- PA als Serinprotease und PAI-1 als dazugehörige Serinprotease-Inhibitoren abzielt, können andere Serinproteasen der Chymotryp sin-Superfamilie, so wie die oben beschriebenen, und die dazugehörigen Inhibitoren, wie die oben beschriebenen, einfach und leicht unter Verwendung der hierin beschriebenen Techniken verwendet werden, ohne von Geist und Umfang dieser Erfindung abzuweichen.

A. Auswahl von t-PA Stellen für die Mutagenese

Um die Hypothese zu testen, dass die Reste Arg&sub3;&sub0;&sub4; und (&sub2;&sub9;&sub6;KHRRSPG&sub3;&sub0;&sub2;) von t-PA mit PAI-1 interagieren, wurde Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese angewendet, um die drei mutanten Formen von t-PA herzustellen, die in Tabelle IX unten gezeigt sind. Tabelle IX
Der Mutante t-PA (Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) fehlt die Insertion von sieben Aminosäuren, die oben diskutiert ist, welche nicht in Trypsin zu finden ist, und wurde konstruiert, um einen Teil der t-PA- Sequenz vollständig zu entfernen, der mit dem zugehörigen Serinprotease-Inhibitor, PAI-1, interagiert. Die Mutanten t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → S) und t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → E) enthalten Substitutionen des Arg&sub3;&sub0;&sub4; durch Ser bzw. Glu, und wurden ausgewählt, um selektiv den positiv geladenen Arg- Rest zu verändern und seine Wechselwirkung mit dem dazugehörigen Serinprotease-Inhibitor, PAI-1, zu eliminieren. Eine Vielzahl verschiedener anderer Substitutionen von R&sub3;&sub0;&sub4; kann vorgenommen werden, was t-PA mit verminderter Empfänglichkeit für den dazugehörigen Serinprotease-Inhibitor aufgrund eines Mangels an der Wechselwirkung geladener Paare hervorbringen würde. Zum Beispiel würde vorhergesagt, dass Punkt-Mutationen, die die positiv geladenen Reste in der Schleife (Reste 296-302) gegen negativ geladene oder neutrale Aminosäuren austauschen, die Wechselwirkung zwischen t-PA und PAI-1 verhindern, reduzieren oder destabilisieren. Ein ähnliches Ergebnis kann durch Ersetzen von P&sub3;&sub0;&sub1; durch eine andere Aminosäure, mit der Ausnahme von Gly (G), erzielt werden. Zusätzlich können zwischen den Resten 304 und 305, oder irgendwo zwischen den Resten 296 und 305, Insertionsmutationen vorgenommen werden, um eine Reihe von 1-6 Aminosäuren zu insertieren, die nicht richtig mit den PAI-1-Resten interagieren. Es wird erwartet, dass unterschiedliche Substitutionen und/oder Kombinationen aus Substitutionen, Insertionen und Deletionen die Wechselwirkung zwischen t-PA und PAI-1 in unterschiedlichem Ausmaß beeinflussen, wobei es dabei möglich wird, eine unterschiedliche Vielzahl von t-PAs mit Eigenschaften, die für bestimmte Anwendungen oder klinische Bedingungen geeignet sind, zu erzeugen.

B. Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese von t-PA

Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese von t-PA wurde im Wesentlichen durchgeführt wie beschrieben bei Zoller, M. et al., DNA, 3: 479-488 (1984), wie modifiziert von Kunkel, T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985); und Kunkel, T. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates & Wiley Interscience, New York (1987).
Zuerst wurde Plasmid pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA, das eine klonierte Kopie des cDNA enthält, die für humanes VolUängen-t-PA codiert, hergestellt wie beschrieben von Sambrook, J. et al., Mol. Biol. Med., 3: 459-481 (1986). pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA ist ein Derivat von pSVT7 (Bird, P. M. et al., J. Cell Biol., 105: 2905-2914 (1987)) (siehe Fig. 3).
pSVT7 wurde aus pKC3 konstruiert pKC3 ist ein Derivat von pko (Van Doren, K. et al., J. Virol., 50: 606-614 (1984)), bei dem die pBR322-abgeleiteten Sequenzen von der Aval- Stelle bis zur EcoRI-Stelle (die den Replikationsursprung und das β-Lactamase-Gen enthalten) durch die aus pUC 8 (Messing, J., Meth. Enzymol., 101: 20-78 (1983)) ersetzt wurden. Zusätzlich wurde ein Polylinker in die einmal vorkommende HindIII-Stelle eingefügt und die PvuII-Stelle stromaufwärts des SV40-Ursprungs wurde in eine ClaI-Stelle umgewandelt. Der Vektor pSVT7 wurde durch Einfügen eines 20 Basenpaar-Fragments, das einen Bakteriophage T7- RNA-Polymerase-spezifischen Promoter enthält (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), in die einmal vorkommende StuI-Stelle von pKC3 erhalten. Diese StuI-Stelle liegt innerhalb der Sequenzen, abgeleitet von der frühen Region SV40, bei Nukleotid 5190 in der SV40-Sequenz und ungefähr 30 Basenpaare stromabwärts vom Punkt der Initiation des frühen Transkriptes (Tooze, J. et al., DNA, Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Press, S. 813 (1981)).
Dann wurde die einzelne EcoRI-Stelle durch Auffüllen der zurückgesetzten 3'-Enden mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase aus pSVT7 entfernt. Der daraus hervorgehende Expressionsvektor wurde als pSVT7 (RI&supmin;) bezeichnet (siehe Fig. 3).
Als nächstes wurde cDNA, die für Wildtyp-t-PA codiert, aus Plasmid pL611 ausgeschnitten (Sambrook, j. et al., Mol. Biol. Med., 3: 459-481 (1986); zur Verfügung gestellt von Genetic Institute, Boston, MA) und in pSVT7 (RI&supmin;) eingefügt. pL611 enthält direkt stromaufwärts des initiierenden AUG-Codons von t-PA, ein synthetisches Oligonukleotid, das Schnittstellen für NcoI und BamHI einfügt. Ungefähr 280 Basenpaare stromabwärts des TGA-Terminations-Codons liegt eine BalI-Stelle innerhalb der 3'- untranslatierten Sequenz der t-PA-cDNA. Zu dem ungefähr 1965 Basenpaare umfassenden NcoI-BalI-Fragment der t-PA-DNA, das aus Plasmid pL611 ausgeschnitten wurde, wurde ein XbaI-Linker hinzugefügt. Dieses Ncol-BalI-Fragment enthält die Sequenzen, die für das vollständige t-PA-Protein codieren, aber es enthält keine Sequenz, die (i) der distalen 3'- untranslatierten Region von t-PA-mRNA und (ii) allen 5'-untranslatierten Sequenzen von t- PA-mRNA, d. h. den Sequenzen zwischen einer SalI-Stelle und dem iniziierenden ATG- Kodon entspricht (Pennica, D. et al., Nature, 301: 214-221 (1983)). Das t-PA-cDNA-Fragment trägt XbaI-Stellen an beiden Enden (Sambrook, j. et al., Mol. Biol. Med., 3: 459-481 (1986)) und wurde verwendet, um pSVT7/t-PA zu erzeugen (siehe Fig. 3). Das ungefähr 1970 Basenpaare lange DNA-Fragment wurde aus dem entstehenden Plasmid durch Verdauung mit XbalI ausgeschnitten, durch 0.8% (G/V)-Agarosegelelektrophorese gereinigt und in die XbaI- Stelle von Plasmid pSVT7 (RI&supmin;) eingefügt, so dass die Sequenzen, die für den N-Terminus von t-PA codieren, unmittelbar stromabwärts der Bakteriophagen-T7-und SV40- frühe Phase- Promotoren platziert wurden. Das daraus hervorgehende Plasmid wurde als pSVT7 (RI&supmin;)/t- PA bezeichnet (siehe Fig. 3).
Dann wurde pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA vollständig mit EcoRI verdaut. Das 472 Basenpaar lange Fragment (Nukleotide 842-1314, welche die Region der Aminosäuren 206 bis 364 codiert) von t-PA wurde mittels 1.2% (G/V)-Agarosegelelektrophorese gereinigt. Dieses Fragment wurde dann mit der DNA der replikativen Form des Bakteriophagen-M13-Vektors M13mp18 ligiert (Yanisch-Perron, C. et al., Gene, 33: 103-119 (1985)), welche vorher mit EcoRI verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert worden war (siehe Fig. 3).
Wenn nicht anders angegeben wurden diese und andere Standardverfahren für rekombinante DNA, die hierin beschrieben sind, ausgeführt wie beschrieben in (i) Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1. Auflage, Cold Spring Harbor (1982) und (ii) Meth. Enzymol., Volume 152, Hrsg. Berger, S. et al., Academic Press, New York (1987).
Die ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm TG-1 transfiziert (Gibson, T., University of Cambridge, England (1984)). Weiße Plaques, die durch rekombinante Bakteriophagen gebildet wurden, wurden aufgenommen und die Anwesenheit des richtigen 472 Basenpaar langen EcoRI-Fragmentes wurde durch Restriktionskartierung, Southern Hybridisierung und DNA-Sequenzierung verifiziert.
Mutationen in dem 472 Basenpaar langen EcoRI-Fragment wurden unter Verwendung eines 5'-phosphorylierten synthetischen mutagenen Primers eingeführt, wie beschrieben durch Kunkel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985); und Kunkel T., Meth. Enzymol., 154: 367-382 (1987)). Die Sequenzen der drei mutagenen Primer, die verwendet werden, um die t-PA-Mutanten zu konstruieren, waren:
t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → S) 5'GCCCGGAGAGTCGTTCCTGTGC3'
t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → E) 5'GCCCGGAGAGGAGTTCCTGTGC3'
t-PA (Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) 5'GCCATCTTTGCCGAGCGGTTCCTG3'
Das obige Protokoll verwendet eine DNA-Matritze, die in einem E. coli-Stamm erzeugt wurde, der dut&supmin; und ung&supmin; ist, d. h. Stamm CJ236 (Kunkel, T., et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985); und Kunkel. T., Meth. Enzymol, 154: 367-382 (1987)). Die DNA- Matritze enthält eine kleine Anzahl von Uracilresten anstelle von Thymin.
Nachdem der mutagene Primer in vitro verlängert worden war, wurde die zum Teil aufgefüllte zirkuläre DNA einen E. coli-Stamm transfiziert, der dut&spplus; und ung&supmin; war, d. h. TG-1 (Gibson, T., Thesis, University of Cambridge, England (1984)). Die Uracilreste im Matritzen-Strang wurden dann in vivo durch die Funktion des Enzyms Uracil-N-Glycosylase entfernt. Dies erzeugte letale Beschädigungen im Matritzenstrang und ermöglichte somit eine schnelle und effiziente Gewinnung von Mutanten.
Genauer gesagt wurden die Uracil enthaltenden Matritzen-DNAs unter Doppelstrangbildung an die 5'-phosphorylierten mutagenen Primer, die oben gezeigt sind, angelagert. Die Verlängerung der Primer wurde für 12-16 Stunden bei 15ºC unter Verwendung des Klenow-Fragmentes von E. coli-DNA-Polymerase durchgeführt. Der neusynthetisierte Strang wurde mit der DNA-Ligase von Bacteriophage T4 an das 5'-Ende des mutagenen Primers ligiert, unter Bildung eines Ringes, der eine Fehlpaarung enthielt. Die entstehende DNA wurde verwendet, um E. coli-Stamm TG-1 zu transfizieren (Gibson, T., Thesis, University of Cambridge, England (1984)) und von einer Anzahl der Plaques wurde einzelsträngige DNA hergestellt. Diese DNAs wurden vollständig sequenziell. Die doppelsträngige replikative Form der DNAs erwiesener Mutanten wurde dann isoliert und die mutierten 472 Basenpaar langen Fragmente wurden durch Verdau mit EcoRI und Electrophorese in 1.2% (w/v)-Agarosegelen isoliert. Wie unten im Detail beschrieben wurden diese Fragmente, die Mutationen enthalten, dann verwendet, um Versionen der t-PA-cDNA zu rekonstruieren, die die t-PA-Mutanten, die von Interesse sind, codieren.

C. Konstruktion von Expressionsvektoren für mutante t-PAs

Mutanten von t-PA in Plasmid pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA wurden wie folgt konstruiert: Das zentrale 472 Basenpaar lange EcoRI-Fragment der t-PA-cDNA wurde durch Verdau mit EcoRI und durch 1.2% (w/v)-Agarosegelelektrophorese aus Plasmid pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA entfernt. Das übrige lineare Fragment der Plasmid-DNA wurde dann an die Versionen des 472 Basenpaar langen Fragmentes, die durch Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese erzeugt wurden, ligiert (siehe Fig. 3). Die daraus hervorgehenden Plasmide wurden als pSVT7(RI&supmin;)/t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → S), pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → E) und pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) bezeichnet.
Der E. coli- Stamm DH-1 (Hanahan, D. et al., DNA cloning, Band 1, Hrsg. Glover, D. M., I. R. L. Press, Oxford, S. 109-135 (1985)) wurde mit den obigen mutanten Plasmiden transformiert und die daraus hervorgehenden Stämme wurden als pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (R304 → S) [DH-1], pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (R304 → E) [DH-1]; bzw. pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) [DH-1] bezeichnet. Die Abwesenheit des korrekten Fragments wurde durch Hybridisierung an das richtige radioaktiv-markierte mutagene Oligonukleotid bestätigt und die Orientierung des Fragmentes wurde durch Restriktionskartierung und DNA- Sequenzierung verifiziert, unter Verwendung der richtigen mutagenischen Oligonukleotide als Primer.
pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → S) [DH-1], pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → E) [DH-1] und pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) wurden bei der American Type Culture Collection mit den Hinterlegungsnummern ATCC 67894, 67896 bzw. 67895 hinterlegt.

D. Transfektion von COS-ZeUen

Als nächstes wurden ungefähr 106 COS-Zellen (Gluzman, Y. et al., Cell, 23: 175-182 (1981)) pro 100 mm Schale mit 1,0 ug der geeigneten Plasmid-DNA, gereinigt durch das alkalische Lyse-Verfahren (Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1. Ausgabe, Cold Spring Harbor (1982)), transfiziert. Genauer gesagt wurde das Medium von den COS-Zellen durch Absaugen entfernt und die Monolayer wurden einmal mit 5,0 ml Dulbeccos Medium (GIBCO, Inc.), enthaltend 10 mM HEPES (pH 7,15) (Sigma Chemical Co.), gewaschen. Nach Entfemen der Waschlösung wurde die Plasmid-DNA in einem Volumen von 1,5 ml Waschlösung, enthaltend 300 ug DEAE-Dextran (Pharmacia, Inc.), auf die Monolayer gegeben. Die Monolayer wurden dann für 1 Stunde bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre mit 6,0% CO&sub2; inkubiert.
Während dieser Zeitspanne wurden die Monolayer alle 20 Minuten leicht geschüttelt. Nachdem die Monolayer für 1 Stunde der Plasmid-DNA ausgesetzt wurden, wurden sie einmal mit Dulbecco's-Medium, enthaltend 10 mM HEPES (pH 7,15), gewaschen und dann wurden 10 ml Dulbecco's-Medium, enthaltend 10% (v/v) fötales Kälberserum (GIBCO, Inc.) und 100 uM Chloroquin (Sigma Chemical Co.), hinzugefügt. Die Monolayer wurden dann bei 37ºC für 4 Stunden wie oben beschrieben inkubiert und dann zweimal mit 5,0 ml Dulbecco's- Medium ohne fötales Kälberserum aber mit 10 mM HEPES (pH 7,15) gewaschen. Dann wurden 10 ml Dulbecco's-Medium, enthaltend 10% (v/v) fötales Kälberserum, hinzugefügt und die Monolayer wurden bei 37ºC wie oben beschrieben für 12 Stunden inkubiert. Dann wurden die Monolayer dreimal mit 5,0 ml Dulbecco's-Medium ohne fötales Kälberserum gewaschen und bei 37ºC in demselben Medium für weiter 36-60 Stunden inkubiert. Mock- transfizierte Zellen wurden identisch behandelt, mit der Ausnahme, dass die Plasmid-DNA bei der Lösung, enthaltend DEAE-Dextran, weggelassen wurde. Am Ende der Inkubationsperiode wurde das überstehende Medium von den Zellen abgenommen und wie unten beschrieben analysiert.

E. Quantifizierung von Wildtyp- und Mutanten- t-PAs durch Festphasen- Radioimmuntests

Ein Festphasen-Radioimmuntest wurde im Wesentlichen wie für Influenza- Hämagglutinin beschrieben (Gethin, M. J. et al., Nature, 293: 620-625 (1981)), unter Verwendung der IgG-Fraktion von Kaninchen-Antiseren, die gegen gereinigtes humanes t-PA gezogen wurden, durchgeführt, um die Mengen von Wildtyp- und Mutanten- t-PAs, die in den COS-Zellen produziert werden, zu quantifizieren. Die Konzentration von t-PA, die mit dieser Methode bestimmt wurde, lag zwischen 0,5 und 10 ug/ml.

F. Enzymatischer Assay auf Wildtyp- und Mutanten- t-PAs

Ein indirekter chromogener Assay wurde durchgeführt, um die Aktivitäten der Wildtyp- und Mutanten- t-PAs, die in den COS-Zellen produziert werden, zu bestimmen. Bei diesem Assay wird freies t-Nitroanilin vom chromogenen Substrat Spectrozym PL (H-D- Norleucylhexahydrotyrosyl-lysin-p-nitroanilid-Diazetatsalz) (American Diagnostica, Inc.) unter Einwirkung von Plasmin freigesetzt, welches unter der Einwirkung von t-PA auf Plasminogen erzeugt wird. Die Freisetzung von freiem p-Nitroanilin wurde spektrophotometrisch bei OD&sub4;&sub0;&sub5; nm gemessen.
Genauer gesagt wurden 100 ul Reaktionsmischungen, enthaltend 150-200 pg der zu testenden t-PA, 0,4 mM Spectrozyme PL, 0,1 uM Lys-Plasminogen (American Diagnostica, Inc.) und 0,5-25 ug/ml lösliches Fibrin (Des-A-Fibrinogen) (American Diagnostica, Inc.), in einem Puffer enthaltend 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl, 1,0 mM EDTA und 0,01% (V/V) Tween 80 bei 37ºC in 96er Flachboden-Microtiter-Platten (Costar, Inc.) inkubiert und der OD&sub4;&sub0;&sub5;nm wurde mit einem Bio-tek Microplatten-Leser (Model EL310) in 15- oder 30- Minuten-Intervallen über, eine Zeitspanne von 2 Stunden gemessen. Aliquots von Puffer oder entsprechend verdünnten Proben Medium von Mock-transfizierten Zellen wurden als Kontrollen analysiert und die erhaltenen OD-Werte (≤0,01 Einheiten) wurden von den entsprechenden Testwerten substrahiert. Delta OD-Werte wurden als Veränderung der optischen Dichte zwischen 30 Minuten und 60 Minuten gemessen, d. h. im Anschluss an die Anlaufphase der Reaktion und an die vollständige Umwandlung einzelkettiger t-PA m die zweikettige Form. Unter den Bedingungen, die im Standard-Assay verwendet wurden (0,1 uM Lys-Plasminogen und 25 ug/ml Des-A-Fibrinogen), stimulierte lösliches Fibrin die Aktivität von t-PA 20-40fach. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt.
Wie in Fig. 4 gezeigt fand man heraus, dass alle drei der oben beschriebenen erfindungsgemäßen t-PA-Mutanten enzymatisch aktiv sind und dass ihre spezifische Aktivität sich nicht signifikant von der von Wildtyp-t-PA unterscheidet. Zusätzlich fand man heraus, dass die oben beschriebenen erfindungsgemäßen t-PA-Mutanten auf verschiedene Konzentrationen von Des-A-Fibrinogen in einer Weise reagieren, die ähnlich der von Wildtyp-t-PA ist. Die maximale Stimulation durch Des-A-Fibrinogen war 20-40fach. Dies stimmt mit den Beobachtungen anderer bei Wildtyp-t-PAs bei der Verwendung einer Des-A- Fibrinogen-Präparation überein (Karlan, B. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 142: 147-154 (1987)). In jedem Fall trat halbmaximale Stimulation auf, wenn Des-A-Fibrinogen mit einer Konzentration von ungefähr 1,0 ug/ml anwesend war.
Als nächstes wurden die Km- und Kcat-Werte der Wildtyp- und Mutanten-t-PAs bestimmt, indem die verschiedenen Formen des Enzyms in der Gegenwart von sättigenden Konzentrationen von Des-A-Fibrinogen (25 ug/ml) und von verschiedenen Konzentrationen (von 0,02-0,16 uM) des Substrats, Lys-Plasminogen gemessen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle X unten gezeigt. Tabelle X
Wie in Tabelle X oben gezeigt waren die Km und Kcat-Werte bei den t-PA-Mutanten untereinander ähnlich. Die Werte sind auch ähnlich den Werten bei Wildtyp-t-PA, berichtet durch Boose, J. et al., Biochem., 28: 635-643 (1989); und Hoylaerts, M. et al., J. Biol. Chem., 257: 2912-2919 (1982).
Die in Fig. 4 und Tabelle X gezeigten Daten zeigen, dass (i) die Deletion der Aminosäuren 296-302 aus t-PA und (ii) die Substitution des Arg an Position 304 durch Ser oder Glu nur einen kleinen Effekt auf die Fähigkeit von t-PA, Plasminogen zu aktivieren und durch lösliche Fibrin-Fragmente stimuliert zu werden, hat.
Um zu testen, ob die Deletion von Aminosäuren 296-302 und die Substitution von Arg&sub3;&sub0;&sub4; die Wechselwirkung von t-PA mit PAI-1 beeinflusst, wurden jeweils ungefähr 250 pg (3,8 Femtomol) der Wildtyp- und Mutanten-t-PAs für 20 Minuten mit 0-480 Femtomolen von partlell-gereinigtem rekombinantem PAI-1 präinkubiert. Die verbleibende enzymatische Aktivität wurde dann unter Verwendung des indirekten chromogenischen Assays, der oben beschrieben ist, gemessen. Der partiell-gereinigte rekombinante PAI-1 wurde wie in Beispiel 2 unten beschrieben erhalten. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.
Wie in Fig. 5 gezeigt verhalten sich alle drei der erfindungsgemäßen t-PA-Mutanten deutlich anders als Wildtyp-t-PA. Das heißt, unter Bedingungen, wo Wildtyp-t-PA ( ) vollständig durch PAI-1 inhibiert wird (24 Femtomole PAI-1), behält die Deletionsmutante t- PA (Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) ( ) ungefähr 95% ihrer Aktivität. Nur wenn hohe Konzentrationen von PAI-1 anwesend sind (480 Femtomol PAI-1), zeigt die Mutante t-PA (Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) ( ) eine signifikante Verminderung der enzymatischen Aktivität. Die zwei Substitutionsmutanten, d. h. t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → S) ( ) und t-PA (R304 → E) ( ), sind ebenfalls resistent gegen Inhibition durch PAI-1, obwohl in unterschiedlichem Ausmaß. Die zwei Substitutionsmutanten, enthaltend Ser oder Glu anstelle von Arg benötigen, wie in Fig. 5 gezeigt, ungefähr 4 bzw. 25 mal mehr PAI-1 für die halbmaximale Inhibition der Enzymaktivität, als es Wildtyp-t-PA benötigt.
Die obigen Daten weisen daraufhin, dass die Aminosäuren 296-302 und 304 nicht bei der katalytischen Funktion von t-PA involviert sind, dass sie aber eine wichtige Rolle bei der Wechselwirkung des Enzyms mit seinem dazugehörigen Serinprotease-Inhibitor, PAI-1, spielen. Verwendet man die Struktur von Trypsin als Modell, wird vorhergesagt, dass diese Aminosäuren sich nahe der aktiven Stelle der Serinprotease in einiger Entfernung von der katalytischen Triade befinden. Somit ist die Kontaktfläche von t-PA und PAI-1 ausgedehnter als die Wechselwirkung zwischen t-PA und ihrem wahren Substrat Plasminogen.
Um zu bestimmen, ob die Mutante t-PA (Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) ebenfalls Resistenz gegen die komplexe Mischung von Serinprotease-Inhibitoren, die in humanem Plasma vorhanden ist, zeigt oder nicht, wurde der partiell-gereinigte rekombinante PAI-1 m dem oben beschriebenen Protokoll durch eine 1 : 100 Verbindung von humanem Plasma ersetzt. Unter diesen Bedingungen wurden ungefähr 70% der Aktivität von Wildtyp t-PA inhibitiert, während die Aktivität von t-PA (Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) unbeeinflusst blieb.
Zusätzlich wurden Wildtyp-t-PA und t-PA (Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) mit unverdünntem humanem Plasma inkubiert und dann wurden die Mischungen auf pH 5,0 angesäuert und für 5 Minuten bei 12.000 · g zentrifugiert. Die geklärten Überstände wurden verdünnt auf verbleibende t- PA-Aktivität getestet, welche sich auf 90% für die Mutante-t-PA (Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) und auf 20% oder weniger für Wildtyp-t-PA belief. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die Mutante t-PA (Del&sub2;&sub9;&sub6;&submin;&sub3;&sub0;&sub2;) resistent gegen die komplexe Mischung an Serinprotease-Inhibitoren, die in humanem Plasma anwesend sind, ist, und es wird daher angenommen, dass sie der Wildtyp-t- PA als therapeutisches Agens überlegen ist.

G. Zusätzliche t-PA-Mutanten

Die Daten, die im Abschnitt F oben präsentiert sind, zeigen, dass die Reste 296-302 und 304 von t-PA eine wichtige Rolle bei der Wechselwirkung des Enzyms mit dem dazugehörigen Inhibitor PAI-1, aber nicht mit dem Substrat Lys-Plasminogen spielen. Eine Modellbildung der katalytischen Domäne t-PA, basierend auf der bekannten Struktur von Trypsin, legt nahe, dass die Reste 296-302 eine Oberflächenschleife an der Grenze der aktiven Stelle des Enzyms bilden und diese Schleife stark positiv geladen ist. Wie oben in den Abschnitten A und F diskutiert wurde in der vorliegenden Erfindung vorhergesagt, dass die Wirkung dieser Region durch Ausbildung elektrostatischer Bindungen mit PAI-1 vermittelt werden könnte. Um diese Hypotese zu testen wurde jeder der geladenen Reste innerhalb der Schleife verändert und der Effekt dieser Mutationen auf die Wechselwirkung des Enzyms mit PAI-1 wurde wie unten beschrieben untersucht. Wenn die positiv geladenen Reste in der Schleife Salzbrücken mit einer komplementären Region des Serinproteaseinhibitors, PAI-1, ausbilden, dann wäre zu erwarten, dass deren Substitution durch negativ geladene Reste zerstörerisch für Wechselwirkungen zwischen t-PA und PAI-1 sein würde, aufgrund der Gegenüberstellung der Seitenketten mit ähnlich geladenen Resten während der Anlagerung dieser zwei Proteine.
Genauer gesagt wurde eine gerichtete Mutagenese durchgerührt, wie oben in B beschrieben, und sie wurde dazu verwendet, cDNAs zu konstruieren, die t-PA-Mutanten codieren, bei denen Lys&sub2;&sub9;&sub6;, Arg&sub2;&sub9;&sub8; oder Arg&sub2;&sub9;&sub9; durch einen Glu-Rest ersetzt wurden. Auch eine cDNA, codierend für eine dreifach-Mutante von t-PA, bei der alle drei dieser Reste durch Glu ersetzt wurden, wurde konstruiert. Zwei zusätzliche cDNAs wurden hergestellt; eine codiert für eine t-PA-Mutante, bei der His&sub2;&sub9;&sub7; durch einen Tyr-Rest ersetzt wurde, während die andere für ein Enzym codiert, bei dem Pro&sub3;&sub0;&sub1; durch Gly ersetzt wurde. Die Sequenzen der 6 mutagenischen Primer, die verwendet wurden, um diese t-PA-Mutanten herzustellen, waren:
t-PA (K&sub2;&sub9;&sub6; → E): 5'-ATCTTTGCCGAGCACAGGA-3'
t-PA (H&sub2;&sub9;&sub7; → Y): 5'-TTTGCCAAGTACAGGAGGT-3'
t-PA(R&sub2;&sub9;&sub8; → E): 5'-GCCAAGCACGAGAGGTCGCCC-3'
t-PA (R&sub2;&sub9;&sub9; → E): 5'-AAGCACAGGGAGTCGCCCGG-3'
t-PA (P&sub3;&sub0;&sub1; → G): 5'-AGGAGGTCGGGCGGAGAGCG-3'
t-PA (K&sub2;&sub9;&sub6;, R&sub2;&sub9;&sub8;, R&sub2;&sub9;&sub9; → E, E, E): 5'-GCCATCTTTGCCGAGCACGAGGAGTCGCCCGGAGA-3'
cDNAs, die für die mutierten Enzyme t-PA (K&sub2;&sub9;&sub6; → E), t-PA (H&sub2;&sub9;&sub7; → Y), t-PA (R&sub2;&sub9;&sub8; → E) und t- PA (P&sub3;&sub0;&sub1; → G) codieren, wurden m den transienten Expressionsvektor pSVT7 (RI&supmin;) ligiert, wie oben beschrieben.
cDNAs, codierend für die mutierten Enzyme t-PA (K&sub2;&sub9;&sub6;, R&sub2;&sub9;&sub8;, R&sub2;&sub9;&sub9; → E, E, E) und t- PA(R&sub2;&sub9;&sub9; → E), wurden in den transienten Expressionsvektor pSTE ligiert. pSTE ist ein Derivat von pSVT7 und wurde durch Ersetzen des 350 bp ClaI-HindIII-Promotor/Origin-Fragmentes von pSTV7 mit dem 41Bbp HpaII-HindIII-Fragment aus der Promotor/Origin-Region von SV40 cs1085 (DiMaio, D. et al., J. Mol. Biol, 140: 129-142 (1980)) konstruiert.
Die daraus hervorgehenden Plasmide wurden als pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (K&sub2;&sub9;&sub6; →→ E), pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (H&sub2;&sub9;&sub7; → Y); pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (R&sub2;&sub9;&sub8; → E); pSTE/t-PA (R&sub2;&sub9;&sub9; → E); pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (R&sub3;&sub0;&sub1; → G); und pSTE/t-PA (K&sub2;&sub9;&sub6;, R&sub2;&sub9;&sub8;, R&sub2;&sub9;&sub9; → E, E, E) bezeichnet.
E. coli-Stamm DH-1 (Hanahan. D. et al., DNA Cloning, Bd. 1. Hrsg. Glover, D. M., I. R. L. Press, Oxford, S. 109-135 (1985)) wurde mit den obigen mutanten Plasmiden transformiert und die daraus hervorgehenden Stämme wurden bezeichnet mit pSVT7 (RI&supmin;)/t- PA (K&sub2;&sub9;&sub6; → E) [DH-1], pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (H&sub2;&sub9;&sub7; → Y) [DH-1], pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (R&sub2;&sub9;&sub8; → E) [DH-1]; pSTE/t-PA (R&sub2;&sub9;&sub9; → E) [DH-1] pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA (R&sub3;&sub0;&sub1; → G) [DH-1], bzw. pSTE/t- PA (K&sub2;&sub9;&sub6;, R&sub2;&sub9;&sub8;, R&sub2;&sub9;&sub9; → E, E, E) (DH-1). Die Anwesenheit des korrekten Fragments wurde durch Hybridisierung mit dem richtigen radioaktiv-markierten mutagenen Oligonukleotid bestätigt und die Orientierung des Fragments wurde durch Restriktionskartierung und DNA- Sequenzierung unter Verwendung des richtigen mutagenischen Oligonukleotid s als Primer, verifiziert.
pSVT (RI&supmin;)/t-PA (R&sub2;&sub9;&sub8; → E) [DH-1]; pSTE/t-PA (R&sub2;&sub9;&sub9;-E) [DH-1]; und pSTE/t-PA (K&sub2;&sub9;&sub6;, R&sub2;&sub9;&sub8;, R&sub2;&sub9;&sub9; → E, E, E) [DH-1] wurden bei der American Type Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer ATCC 68157, 68154 bzw. 68153 hinterlegt.
Die obigen Plasmid-DNAs wurden dann verwendet, um COS-Zellen wie oben beschrieben zu transfizieren. Tests wurden mit beiden Verdünnungen der resultierenden konditionierten Medien (typischerweise 1 : 300) und mit immungereinigten Enzymen wie oben beschrieben durchgeführt.
Als nächstes wurden die Km- und Kcat-Werte der Wildtyp- und Mutanten- t-PAs durch Testen der verschiedenen Formen des Enzyms m der Anwesenheit von sättigenden Konzentrationen von Des-A-Fibrinogen (25 ug/ml) und verschiedener Konzentrationen (von 0,02-0,16 uM) des Substrats, Lys-Plasminogen, bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle XI unten gezeigt. Tabelle XI
Wie in Tabelle XI oben gezeigt veränderte keine der oben diskutierten Mutationen wesentlich die t-PA-Wechselwirkung mit ihrem Substrat.
Ähnlich dazu legen die Daten, die in Fig. 6 gezeigt sind, nahe, dass die Mutationen nicht die Wechselwirkung t-PA mit ihrem positiven Effektor Des-A-Fibrinogen, verändert haben. Im Gegensatz dazu zeigen die Daten, die in Fig. 7 gezeigt sind, klare Unterschiede im Verhalten von Wildtyp-t-PA und einigen der mutanten t-PAs. Besonders die Fähigkeit, normal mit dem Serpin, PAI-1, zu interagieren, wurde für drei der mutanten t-PAs wesentlich verändert, d. h. t-PA (R&sub2;&sub9;&sub8; → E), t-PA (R&sub2;&sub9;&sub9; → E) und t-PA (K&sub2;&sub9;&sub6;, R298, R&sub2;&sub9;&sub9; → E, E, E). Das Verhalten der Dreifach-Mutante ist besonders auffallend; sogar nach Präinkubation mit einem mehr als 200fachen molaren Überschuss von PAI-1 zeigte die Dreifach-Mutante keinen Verlust an Aktivität. Diese Befunde unterstützen die Vorhersage, dass die Oberflächenschleife von t-PA, d. h. Reste 296-302, spezifisch mit dem dazugehörigen Inhibitor PAI-1, interagieren und legen nahe, dass diese Wechselwirkung Arg&sub2;&sub9;&sub8; und A&sub2;&sub9;&sub9; einbezieht. Diese Beobachtungen stimmen mit der Hypothese überein, dass die spezifische Wechselwirkung zwischen t-PA und PAI-1 elektrostatische Bindungen umfasst. Die Reste von t-PA, die m diese Wechselwirkungen verwickelt sind, sind Arg&sub2;&sub9;&sub8;, Arg&sub2;&sub9;&sub9; und Arg&sub3;&sub0;&sub4;.

BEISPIEL 2

PAI-1-Mutanten

Die Technologie, die in diesem Beispiel beschrieben ist, ist auf die Verwendung von t-PA als Serinprotease und PAI-1 als Serinprotease-Inhibitor ausgerichtet. Um die Inhibition der t- PA-Mutanten, die oben beschrieben sind, wiederherzustellen, können Mutationen in PAI-1 konstruiert werden.

A. Expression, Reinigung und Assay von glykosyliertem PAI-1 in eukaryotischen Zellen

Zwei verschiedene cDNA-Klone, abgeleitet von den 3,2 kb und 2, 2 kb mRNAs, die PAI-1 codieren (Ny, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 6776-6780 (1986); und Pannekoek, H. et al., EMBO J., 5: 2539-2544 (1986)), wurden verwendet, um eine Volllängen-cDNA einem Säuger-Expressionsvektor zu konstruieren. Der erste Klon, lambda PAI-1, war eine verkürzte Version der cDNA, die durch Durchmustern einer humanen plazentalen cDNA-Bibliothek (von Dr. Carol Mendelson, Department of Biochemistry, Southwestern Medical Center, Dallas, TX zur Verfügung gestellt) mit einem synthetischen Oligonukleotid, das der folgenden Sequenz von 8 Aminosäuren von PAI-1 (AVDQLTRL) entsprach, erhalten wurde (Ny, t. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 6776-6780 (1986); und Pannekoek, H. et al., EMBO J., 5: 2539-2544 (1986)). Das DNA-Fragment, das von diesem Klon durch Verdauung mit EcoRI freigesetzt wurde, entsprach den Nukleotiden 147-2013 der PAI-1 Sequenz, über die von Ny. T. et al., Proc. Natl. Acad. Bei, USA, 83: 6776- 6780 (1986) berichtet wurde. Dieses Fragment wurde in den Plasmidvektor pUC 18 (Yanisch- Perron, C. et al., Gene, 33: 103-119 (1985)) subkloniert, um das rekombinante Plasmid pPAI-1 zu erhalten. Das Insert von diesem Plasmid wurde dann verwendet, um eine humane Endothelzellen-cDNA-Bibliothek durchzumustern, die in Bakteriophage lambda-gtll konstruiert worden war (Huynh, T. et al., DNA Cloning, Volume 1, Ed. Glover, D, M., I. R. L. Press, Oxford, S. 49-88 (1985)). Einer der cDNA-Klone, die auf diese Weise isoliert wurden, d. h. lambda PAI-1-11A, trägt ein Insert, das sequenzidentisch zu der PAI-1-cDNA ist, von der zuvor berichtet wurde (Pannekoek, H. et al., EMBO J., 5: 2539-2544 (1986)), abgesehen von der Anwesenheit von zwei zusätzlichen Nukleotiden am 5'-Ende. Das EcoRI- BglII-Fragment, abgeleitet von dem 5'-Ende von diesem Klon, Nukleotide 52-1479, wurde an das 3'-BglII-EcoRI-Fragment von pPAI-1 fusioniert, um pPAI-1-RBR zu erhalten. Der SV40- Vektor, der verwendet wurde, um PAI-1 in Säugerzellen zu exprimieren, wurde wie folgt konstruiert. Die Enden des EcoRI-Fragmentes, das von pPAI-1-RBR freigesetzt wurde, wurde mit dem Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase aufgefüllt, an synthetische XbaI- Linker ligiert und anstelle des t-PA-Fragmentes im Plasmid pSV/t-PA3 eingefügt, um pSVL- PAI-1 zu erhalten (Sambrook, J. et al., Mol. Biol. Med., 3: 459-481 (1986)). Es wurden Stammkulturen von SVL-PAI-1 hergestellt und vermehrt, wie von Doyle, C. et al., J. Cell. Biol, 105: 704-714 (1985) beschrieben.
PAI-1-Klone, die von Pannekoek, H. et al., EMBO J., 5: 2539-2544 (1986) und Ginsberg, D. et al., J. Clin. Invest. 78: 1673-1680 (1986) beschrieben wurden, codieren ein PAI-1-Protein, das sequenzidentisch ist zu dem, das von pPAI-1-RBR codiert wird, und diese hätten anstelle von pPAI-1-RBR verwendet werden können, um SVL-PAI-I zu konstruieren.
Es wurden Monolayer von CV-1-Affenzellen bei 37ºC gezüchtet und dann mit SVL- PAI-1 infiziert. Nach 24 Stunden wurde das Medium mit serumfreien Dulbecco's-Medium (GIBCO, Inc.) ersetzt und die Inkubation wurde für weitere 48 Stunden fortgesetzt. Das überstehende Medium, enthaltend sekretiertes PAI-1, wurde dann mit einem 0,45 Mikrometer-Filter (Nalge Co.) filtriert. Dann wurden Nonidet P40 (Sigma Chemical Co.) und 1,0 M Natriumphosphat (pH 7,2)-Puffer zu einer Konzentration von 0,1% (V/V) bzw. 10 mM hinzugefügt. Das stabilisierte Medium wurde auf eine Affinitätssäule aus Concanavalin-A- Sepharose 4B (1,0 ml gepacktes Säulenvolumen) aufgebracht, die mit einem Puffer, enthaltend 20 mM Natriumphosphat (pH 7,2), 135 mM NaCl, 7,0 mM KCl (im Folgenden "PBS"), bei einer Durchflussrate von 50 ml pro Stunde äquilibriert worden war. Die Säule wurde nacheinander mit 25 Volumina PBS, enthaltend 0,1% (V/V) Nonidet P40, mit 25 Volumen PBS enthaltend 0,1 (v/v) Nonidet P40 und 1,0 M NaCl und schließlich mit 10 Volumen von 20 mM Natriumphosphat-Puffer (pH 7,2) gewaschen. Das gebundene PAI-1 wurde mit 0,5 M alpha-methyl-D-Glucosid (Sigma Chemical Co.) in 20 mM Sodiumphosphat- Puffer (pH 7,2) spezifisch eluiert. Fraktionen, die PAI-1 enthielten (gemessen durch Inhibition von Urokinase von Calbiochem, Inc. im oben beschriebenen indirekten chromogenen Assay), wurden vereinigt. Dann wurde Nonidet P40 bis zu einer Konzentration von 0,1% (V/V) hinzugegeben und 0,57 g Guanidin-HydrochIorid (U.S. Biochemicals) pro ml vereinigtes Eluat hinzugegeben. Das so erhaltene teilgereinigte PAI-1 wurde gegen einen Puffer, enthaltend 20 mM Natriumphosphat (pH 7,2) und 10% (V/V) Glycerin, dialysiert und wurde bis zur Verwendung in Aliquots bei -80ºC gelagert.
Der auf diese Weise hergestellte PAI-1 enthielt 40 ug/ml Gesamtprotein (gemessen durch Bradford's Reagenz, von BioRad Inc. erworben) und 15 ug/ml PAI-1, gemessen durch Färben von 12,5% (G/V)-SDS-Polyacrylamid-Gel. Die Titration gegen Urokinase, (diese selbst darauf titriert, 52% aktiv zu sein, unter Verwendung von ³H-Diisopropylfluorophosphat (NET-065 von New England Nuclear, Inc,) zeigte, dass das PAI-1 hergestellt wie hierin beschrieben, 16,6% aktiv war und dass die Konzentration von aktivem PAI-1 48 nM betrug.

B. Auswahl von PAI-1-Stellen zur Mutagenese

Um die Hypothese zu testen, dass die Reste Glu&sub3;&sub5;&sub0; und Glu&sub3;&sub5;&sub1; von PAI-1 mit t-PA interagieren, wurde eine gerichtete Oligonukleotid-Mutagenese verwendet, um die zwei Mutantenformen von PAI-1 zu erzeugen, die in Tabelle XII unten gezeigt sind. Tabelle XII
Die Mutanten PAI-1(E&sub3;&sub5;&sub0; → R) und PAI-1(E&sub3;&sub5;&sub1; → R) enthalten Substitutionen von Glu&sub3;&sub5;&sub0; bzw. Glu&sub3;&sub5;&sub1; durch Arg und wurden ausgewählt, um selektiv die negativ geladenen Glu-Reste in positiv-geladene Arg-Reste zu ändern und potentielle Wechselwirkungen mit dem negativ- geladenen Glu&sub3;&sub0;&sub4;-Rest bei t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → E) zu verstärken. Eine Auswahl von anderen Substitutionen könnte für Glu&sub3;&sub5;&sub0; vorgenommen werden, welche PAI-1 mit erhöhter Wechselwirkung mit z. B. der t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → E)-Mutante hervorbrächten, vorausgesetzt, dass diese Substitutionen komplementär zu den spezifischen Mutationen, die beim Rest Arg&sub3;&sub0;&sub4; t- PA eingeführt wurden, sind, ohne vom Geist und vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

C. Oligonukleotid-vermittelte Mutagenese von PAI-1

Als erstes war es notwendig, ein PAI-1-Expressionsplasmid zu konstruieren, bezeichnet als Plasmid pPAIST7, das für die direkte Expression von Methionyl-PAI-1 vorgesehen ist, während die Signalsequenz und die 3'-untranslatierte Region der cDNA- Sequenz des Expressions-Vektors eliminiert werden. Um dies zu erreichen wurden synthetische DNA-Linker verwendet, um beide Enden der PAI-1-cDNA-Codierungssequenz umzukonstruieren und um ein ATG-Proteinsynthese-Initiationskodon unmittelbar vor dem Triplett, das den ersten Rest von reifem PAI-1 codiert, einzufügen. Zusätzlich wurden die Linker, um die Insertion der cDNA-codierenden Region in das Plasmid pBR322 zu erleichtern, so gestaltet, dass EcoRI und HindIII-Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen am 5'- bzw. 3'- Terminus des PAI-1-cDNA-Fragmentes erzeugt wurden.
Genauer gesagt erhielt man das Plasmid pPAIST7 durch Verdauen von pPAI-1-RBR mit ApaLI und PflMI. Das daraus hervorgehende 1127 bp Fragment enthaltend 2 bp des Codons von Rest 1 von PAI-1 und die gesamte codierende Sequenz für Reste 2-376 vom 379- Reste-Protein, wurde durch Gelelektrophorese gereinigt. Als nächstes wurden synthetische Linker (10 bp am 5'-Ende und 13 bp am 3'-Ende) mit dem 1127 bp ApaLI- und PflMI-DNA- Fragment ligiert, mit EcoRI und HindIII verdaut und das 1146 bp-EcoRI-HindIII-verdaute DNA-Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde dann in EcoRI- und HindIII-verdautes pBR322 kloniert.
Um die Konstruktion eines Expressionsplasmids zu beginnen, wurde der Unterklon mit EcoRI verdaut und das lineare Plasmid mit bakterieller alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Unter Verwendung des 360 bp EcoRI-DNA-Fragments von pC5A-48 (Franke, A. et al., Meth. Enzymol., 162: 653-668 (1988)), enthaltend den trp-Promotor und eine Ribosomen-Bindungsstelle, wurde dann durch Zusammenligieren der zwei Fragmente ein PAI-1-Expressionsplasmid konstruiert. Als nächstes wurde E. coli mit den daraus hervorgehenden Plasmiden transformiert wie beschrieben von Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1. Auflage, Cold Spring Harbor (1982). Die Plasmid-DNA der daraus hervorgehenden Transformanden wurde durch Restriktions-Analyse mit HindIII auf Anwesenheit und Orientierung des trp-Promotor-Fragmentes durchgemustert. Es wurden verschiedene Transformanden identifiziert, die die Plasmide enthalten, die das PAI-1-Gen benachbart zum trp-Promotor in der Konfiguration enthalten, die für direkte Expression des Inhibitors erforderlich ist. Eines dieser Plasmide wurde als pPAIST7 bezeichnet.
Das SalI-HindIII-Fragment von Plasmid pPAIST7, das die Nukleotidsequenz von PAI-1 enthält, die für die Aminosäurereste Val&sub2;&sub8;&sub4; bis Pro&sub3;&sub7;&sub9; codiert, wurde in SalI-HindIIIverdaute replikative Form von M13mp18 ligiert (siehe Fig. 8). Die ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm TG-1 transfiziert. Weiße Plaques, gebildet durch rekombinante Bakteriophagen wurden aufgenommen und die Anwesenheit des richtigen 290 Basenpaar- SalI-HindIII-Fragmentes wurde durch Southern-Hybridisierung, Restriktionskartierung und DNA-Sequenzierung verifiziert.
Mutationen im 290 Basenpaar-SalI-HindIII-Fragment wurden unter Verwendung von 5'-phosphorylierten synthetischen mutagenen Oligonukleotid-Primern eingefügt, wie oben für t-PA beschrieben (siehe Fig. 8). Die Sequenzen der zwei mutagenen Primer, die verwendet wurden, um diese PAI-1-Mutanten zu konstruieren, waren:
PAI-1 (E&sub3;&sub5;&sub0; → R): 5'TGATGATCTCTCTTGGGGC 3'
PAI-1 (E&sub3;&sub5;&sub1; → R): 5'CCATGATGATTCTCTCGGGG 3'
Die Sequenzen der resultierenden mutanten SalI-HindIII-Fragmente der PAI-1-DNA wurden vollständig bestimmt. Die doppelsträngige replikative Form der DNAs nachgewiesener Mutanten wurde dann isoliert und die mutierten 290 Basenpaar-SalI-HindIII- Fragmente wurden durch SalI-HindIII-Verdau und Elektorphorese in 6,0% (G/V) nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gelen isoliert. Wie unten im Detail beschrieben wurden diese Fragmente, die Mutationen enthielten, dann verwendet, um Versionen der PAI-1-cDNA zu rekonstruieren, die die PAI-1-Mutanten von Interesse codierten.

D. Konstruktion von Expressionsvektoren für PAI-1-Mutanten

Mutanten von PAI-1 im Plasmid pPAIST7HS (ein Derivat von Plasmid pPAIST7, dem die HindIII-Stelle bei Nukleotidpaar 1 und die SalI-Stelle an Nukleotidpaar 2106 fehlt, was so konstruiert wurde, um den Austausch von mutierten SalI bis HindIII-Fragmenten in der codierenden Sequenz der PAI-1-cDNA zu erleichtern (siehe Fig. 8)), wurden wie folgt konstruiert:
Das zentrale 290 Basenpaar-SalI-HindIII-Fragment der PAI-1-cDNA wurde aus Plasmid pPAIST7HS durch Verdau mit SalI und HindIII und durch 1,0% (G/V)- Agarosegelelektrophorese entfernt. Das zurückbleibende lineare Fragment der Vektor-DNA wurde dann an die Mutanten-Versionen des 290 Basenpaar SalI bis HindIII-Fragmentes, die oben beschrieben sind, welche durch gerichtete Oligonukleotid-Mutagenese erzeugt wurden (siehe Fig. 8), ligiert. Die daraus hervorgehenden Plasmide wurden als pPAIST7HS (E&sub3;&sub5;&sub0; → R) und pPAIST7HS (E&sub3;&sub5;&sub1; → R) bezeichnet.
E. coli-Stamm DH-1 (Hanahan, D. et al., DNA Cloning, Volume 1, Ed. Glover, D. M., I. R. L. Press, Oxford, S. 109-135 (1985)) wurde mit den oben genannten Plasmiden transformiert und die daraus hervorgehenden Stämme wurden als pPAIST7HS [DH-1]; pPAIST7HS (E&sub3;&sub5;&sub0; → R) [DH-1], bzw. pPAIST7HS (E&sub3;&sub5;&sub1; → R) [DH-1] bezeichnet. E. coli- Stamm TG-1 (Gibson, T., Thesis, University of Cambridge, England (1984)) wurde mit den obigen mutanten Plasmiden transformiert und die daraus hervorgehenden Stämme wurden bezeichnet als pPAIST7HS [TG-1]; pPAIST7HS (E&sub3;&sub5;&sub0; → R) [TG-1]; bzw. pPAIST7HS (E&sub3;&sub5;&sub1; → R) [TG-1]. Die Anwesenheit des richtigen Fragments wurde durch Hybridisierung mit dem geeigneten radioaktiv-markierten Oligonukleotid und durch Nukleinsäure-Sequenzierung bestätigt.
pPAIST7HS (E&sub3;&sub5;&sub0; → R) [DH-1]; und pPAIST7HS (E&sub3;&sub5;&sub1; → R) [DH-1] wurden bei der American Type Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer ATCC 68155 bzw. 68156 hinterlegt.

E. Expression, Extraktion und Assay von Wildtyp- und Mutanten- PAI-1s

Die E. coli-Stämme pPAIST7HS (TG-1), pPAIST7HS (E&sub3;&sub5;&sub0; → R) (TG-1), und pPAIST7HS (E&sub3;&sub5;&sub1; → R) wurden überwacht bei 37ºC in Luria-Bertani-Medium bis zu sättigender Dichte gezogen. 50 u1 Kultur wurden verwendet, um 50 ml modifiziertes M9 Medium (pH 7,4), enthaltend pro Liter 6,0 g Na&sub2;HPO&sub4;, 3,0 g KH&sub2;PO&sub4; 0,5 g NaCl, 0,5 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 1,0 g NH&sub4;Cl, 5,0 g Casaminosäure ("casamino acids"), 10,0 g Glukose, 10,0 ml Glycerin, 1,0 mg Thiamin-HCl und 25 mg Ampicillin, anzuimpfen. Die Bakterienkulturen wurden für 22 Stunden bei 37ºC in 250 ml Ehrlenmeyer-Flaschen gezogen. Zellextrakte wurden wie folgt von den Kulturen hergestellt.
E. coli wurden durch Zentrifugation sedimentiert, in 20 ml kaltem 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1.0 mM EDTA durch Zentrifugation gewaschen und in 3,6 ml desselben Puffers auf Eis resuspendiert. Die Extraktion wurde durch die Zugabe von 0,4 ml 10 mg pro ml Lysozym für 20 Minuten, 0,1 ml 10% (V/V) Nonidet P-40 für 10 Minuten und 0,2 ml 5,0 M NaCl für 10 Minuten erreicht. Die Zellen wurden kurz unter Verwendung der Mikrospitze eines Beschallungsgeräts/Zellaufbrechers bei 50% Arbeitszyklusdauer ("duty cycle") und Einstellung 7 (Branson Sonic Power Company) aufgebrochen, um die Viskosität vor der Zentrifugation bei 15,000 · g für 30 Minuten bei 4ºC zu reduzieren. Zu den geklärten Bakterienlysaten wurde Glycerin bis zu einer Konzentration von 10% (V/V) zugegeben und die PAI-1-enthaltenden Extrakte wurden bei -80ºC in Aliquots bis zur Verwendung gelagert.
Die Extrakte wurden durch Inkubation für 3 Stunden bei 24ºC mit Urokinase, wie oben für PAI-1, das in Säuger-Zellen exprimiert wurde, beschrieben für aktives PAI-1, titriert. Die Extrakte von Wildtyp-PAI-1, PAI-1 (E&sub3;&sub5;&sub0; → R), und PAI-1 (E&sub3;&sub5;&sub1; → R) enthielten 803 nM, 593 nM bzw. 162 nM aktiven PAI-1.
Kinetische Messungen der Wechselwirkungsrate von Wildtyp- und Mutanten-t-PAs mit Wildtyp- und Mutanten PAI-1s wurden bei 24ºC in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) enthaltend 0,1 mM EDTA und 0,1% (V/V) Tween 20, durchgeführt. Der indirekte chromogene Assay, der für t-PA oben beschrieben ist, wurde verwendet, um die enthaltene Rest-Enzym-Aktivität als Funktion der Zeit zu bestimmen. Die Halbwertszeit (t1/2) wurde für jede Inhibitorkonzentration aus der Steigung einer linearen halb-logarithmischen Darstellung der Restaktivität von t-PA gegen die Zeit unter Bedingungen pseudo-erster Ordnung für einen Überschuss von PAI-1 gegenüber t-PA bestimmt. Die Geschwindigkeitskonstante ("rate constant"), k&sub1;, wurde dann durch Teilen der apparenten Geschwindigkeitskonstante (kapp = 0,693/t1/2) durch die Inhibitorkonzentration errechnet.
Die Inhibitionsrate von 60 um t-PA wurde unter Bedingungen pseudo-erster Ordnung unter Verwendung von Inhibitorkonzentrationen reichend von 0,6 bis 100 nM studiert. Die t- PA-PAI-1 -Mischungen wurden in Mikrotiter-Platten bei 24ºC über verschiedene Zeitspannen (von 0 bis 30 Minuten) präinkubiert, vor der Zugabe einer Mischung aus Lys-Plasminogen, Spectrozym PL und Des-A-Fibrinogen zu Endkonzentrationen von 300 nM, 0,4 nM bzw. 12,5 ug/ml. Nach der Zugabe von Substraten wurden die Mikrotiter-Platten bei 37ºC inkubiert und die Absorbtion bei 405 nm wurde für 2 Stunden gemessen, um die Rest-t-PA-Aktivität zu bestimmen.
Die ungefähren Geschwindigkeitskonstanten der Inhibition (M&supmin;¹s&supmin;¹) von Wildtyp- und Mutanten-t-PAs durch Wildtyp- und Mutanten - PAI-1s sind in Tabelle XIII unten gezeigt. Tabelle XIII
Wie in Tabelle XIII oben gezeigt, zeigen PAI-1 (E&sub3;&sub5;&sub0; → R) und PAI-1 (E&sub3;&sub5;&sub1; → R) erhöhte Geschwindigkeitskonstanten der Wechselwirkung mit t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → E) im Vergleich zu Wildtyp-PAI-1, was zeigt, dass die Mutationen die Fähigkeit von PAI-1, die Serinprotease- Inhibitor-resistente t-PA (R&sub3;&sub0;&sub4; → E) zu inhibieren, wiederhergestellt haben.

Claims

1. t-PA-Mutante, welche resistent gegenüber einer Inhibition durch den dazugehörigen Inhibitor ist, wobei die t-PA-Mutante eine Substitution der basischen Aminosäure, die der Position 304 des t-PA entspricht, durch eine saure oder neutrale Aminosäure hat.

2. t-PA-Mutante nach Anspruch 1, wobei die t-PA- Mutante t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → S) oder t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → E) ist.

3. t-PA-Mutante nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der dazugehörige Inhibitor aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus PAI-1, PAI-2 und PAI-3 besteht.

4. Gen, das eine t-PA-Mutante codiert, welche resistent gegenüber einer Inhibition durch deren dazugehörigen Inhibitor ist, wobei die t-PA-Mutante eine Substitution der basischen Aminosäure, die der Position 304 des t-PA entspricht, durch eine saure oder neutrale Aminosäure hat.

5. Gen nach Anspruch 4, wobei die t-PA-Mutante t- PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → S) oder t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → E) ist.

6. Gen nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei der dazugehörige Inhibitor aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus PAI-1, PAI-2 und PAI-3 besteht.

7. Verfahren zum Erhalt einer t-PA-Mutante, welche resistent gegenüber einer Inhibition durch deren dazugehörigen Inhibitor ist, umfassend:

(A) Kultivieren einer Wirtszelle, welche mit DNA transformiert wurde, die ein Gen umfasst, das die t-PA-Mutante codiert, wobei die t-PA-Mutante eine Substitution der basischen Aminosäure, die der Position 304 des t-PA entspricht, durch eine saure oder neutrale Aminosäure hat; und

(B) Isolieren der resultierenden t-PA-Mutante.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die t-PA-Mutante t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → S) oder t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → E) ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei der dazugehörige Inhibitor aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus PAI-1, PAI-2 und PAI-3 besteht.

10. Plasmid, ausgewählt von

pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → S), das in Mikroorganismen pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → S) [DH-1], welche die ATCC-Hinterlegungsnummer 67894 haben, vorliegt; und

pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → E), das in Mikroorganismen pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → E) [DH-1], welche die ATCC-Hinterlegungsnummer 67896 haben, vorliegt.

11. Mikroorganismus, ausgewählt von

pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → S) [DH-1], der die Identifizierungskennzeichen von ATCC Nr. 67894 hat; und

pSVT7 (RI&supmin;)/t-PA(R&sub3;&sub0;&sub4; → E) [DH-1], der die Identifizierungskennzeichen von ATCC Nr. 67896 hat.