JP3076035B2 - ｔ−ＰＡ変異体及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

ｔ−ＰＡ変異体及びそれをコードする遺伝子

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は同起源阻害剤による
阻害に対して抵抗性であるキモトリプシン ス−パ−フ
ァミリ−のセリン プロテア−ゼ変異株、及びそれをコ
−ドする遺伝子に関する。本発明は又、本発明のセリン
プロテア−ゼ変異株を阻害するセリンプロテア−ゼ
インヒビタ−変異株、及びそれをコ−ドする遺伝子に関
する。セリン プロテア−ゼ変異株、及びセリン プロ
テア−ゼ インヒビタ−変異株は、例えば薬剤として有
用である。
【０００２】
【従来の技術】Ｉ．セリン プロテア−ゼ セリン プロテア−ゼ（Ｅ．Ｃ．３．４．２１）はペプ
チド結合分裂における求核試薬としてセリンを使用する
エンドペプチダ−ゼのサブ−サブクラスである（Ｂａｒ
ｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．，於：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒｓ，出版 Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．
等，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，３−２２
頁；及びＨａｒｔｌｅｙ，Ｂ．Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２９：４５−７２（１９６０））。
【０００３】セリン プロテア−ゼは文献により周知で
あり、セリン プロテア−ゼの２つのス−パ−ファミリ
−、すなわちキモトリプシン ス−パ−ファミリ−、及
びストレプトミセス ズブチリシン ス−パ−ファミリ
−はこれまでに観察されていた（Ｂａｒｒｅｔｔ．Ａ．
Ｊ．，於：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｓ，出版 Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．等，Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，３−２２頁（１９８６）；
及びＪａｍｅｓ，Ｍ．Ｎ．Ｇ．，於：Ｐｒｏｔｅｏｌｙ
ｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇ
ｕｌａｔｉｏｎ，出版 Ｒｉｂｂｏｎｓ，Ｄ．Ｗ．等，
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１２
５−１４２頁（１９７６））。
【０００４】キモトリプシン ス−パ−ファミリ−のセ
リン プロテア−ゼの例には組織−型プラスミノ−ゲン
活性化因子（下文では”ｔ−ＰＡ”）、トリプシン、ト
リプシン−様プロテア−ゼ、キモトリプシン、プラスミ
ン、エラスタ−ゼ、ウロキナ−ゼ（又は尿−型プラスミ
ノ−ゲン活性化因子（下文ではｕ−ＰＡ”）、アクロシ
ン、活性化プロテインＣ、Ｃｌエステラ−ゼ、カテプシ
ンＧ、チマ−ゼ、ならびにカリクレイン、トロンビン及
び因子ＶＩＩａ，ＩＸａ，Ｘａ，ＸＩａ及びＸＩＩａを
含む血液凝固カスケ−ドのプロテア−ゼが含まれる（Ｂ
ａｒｒｅｔｔ．Ａ．Ｊ．，於：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，出版 Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．
Ｊ．等，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，３−
２２頁（１９８６）；Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇｅｒ，Ｗ．
等，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１５７：２１９−２２３
（１９８３）；Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ａｔｌａｓ
ｏｆＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ，５巻，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍ
ｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏ
ｎ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ
（１９７２）；及びＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ｄ．等，
Ｈｏｓｐ．Ｐｒａｃ．，２１：１３１−１３７（１９８
６））。 ｔ−ＰＡ、プラスミン、ｕ−ＰＡ、及び血液
凝固カスケ−ドのプロテア−ゼを含むキモトリプシン
ス−パ−ファミリ−のセリン プロテア−ゼのいくつか
は巨大分子であり、セリン プロテア−ゼ触媒ドメイン
の他にその活性の調節に一部関与する構造ドメインを含
む（Ｂａｒｒｅｔｔ．Ａ．Ｊ．，於：Ｐｒｏｔｅｉｎａ
ｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，出版 Ｂａｒｒｅｔｔ，
Ａ．Ｊ．等，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，
３−２２頁（１９８６）；Ｇｅｒａｒｄ，Ｒ．Ｄ．等，
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，３：４４９−４５７（１
９８６）；及びＢｌａｓｉ，Ｆ．等，於：Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅｓ ａｎｄＤｉｓｅａｓｅｓ，出版 Ｂｌａｓ
ｉ，Ｆ．等，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｌ
ｔｄ．，３７７−４１４頁（１９８６））。
【０００５】キモトリプシン ス−パ−ファミリ−のす
べてのセリン プロテア−ゼの触媒ドメインは配列相同
性、及び構造相同性の両方を有する。配列相同性は以
下： （ｉ）特徴的活性化部位残基（例えばトリプシンの場合
Ｓｅｒ195，Ｈｉｓ57，及びＡｓｐ102）； （ｉｉ）オキシアニオン ホ−ル（例えばトリプシンの
場合Ｇｌｙ193，Ａｓｐ194）；及び （ｉｉｉ）構造中にジスルフィド架橋を形成するシステ
イン残基の全部の保持を含む（Ｈａｒｔｌｅｙ，Ｂ．
Ｓ．，Ｓｙｍｐ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，２４：１５２−１８２（１９７４））。
【０００６】構造相同性は以下： （ｉ）２個のグリ−ク鍵構造から成る共通折りたたみ
（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃ
ｈｅｍ．，３４：１６７−３３９（１９８１））； （ｉｉ）触媒残基の共通の配置；及び （ｉｉｉ）分子のコア中の構造の詳細な保持（Ｓｔｒｏ
ｕｄ，Ｒ．Ｍ．，Ｓｃｉ．Ａｍ．，２３１：２４−８８
（１９７４））を含む。
【０００７】キモトリプシン ス−パ−ファミリ−のメ
ンバ−の配列を比較すると触媒ドメイン内のアミノ酸の
挿入、又は欠失の存在が明らかになる（例えば図１を参
照）。すべての場合、これらの挿入又は欠失は折りたた
まれた分子の表面にあり、従って分子の基本的構造に影
響しない（Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇｅｒ，Ｗ．等，ＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔ．，１５７：２１９−２２３（１９８
３））。 ＩＩ．セリン プロテア−ゼ インヒビタ− セリン プロテア−ゼ インヒビタ−は文献により周知
であり、以下の科（ファミリ−）に分けられる：（ｉ）
塩基性プロテア−ゼ インヒビタ−としても知られる牛
すい臓トリプシン インヒビタ−（Ｋｕｎｉｔｚ）ファ
ミリ−（Ｋｅｔｃｈａｍ，Ｌ．Ｋ．等，於：Ａｔｌａｓ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，出版 Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．
Ｏ．，１３１−１４３頁（１９７８）（下文では”ＢＰ
ＴＩ”）、（ｉｉ）Ｋａｚａｌファミリ−、（ｉｉｉ）
ストレプトミセス ズブチリシンインヒビタ−ファミリ
−（下文では”ＳＳＩ”）、（ｉｖ）セルピン ファミ
リ−、（ｖ）大豆トリプシンインヒビタ−（Ｋｕｎｉｔ
ｚ）ファミリ−、（ｖｉ）ポテト インヒビタ−ファミ
リ−、及び（ｖｉｉ）ボ−マン−バ−ク ファミリ−
（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．，４９：５９３−６２６（１９８０）；Ｒ
ｅａｄ．Ｒ．Ｊ．等，於：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒｓ，出版 Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．
等，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，３０１−
３３６頁（１９８６）；及びＬａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．
等，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．
Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，ＬＩＩ：５４５−５５３（１
９８７））。
【０００８】ＢＰＴＩ、Ｋａｚａｌ、ＳＳＩ、大豆トリ
プシン、及びポテト インヒビタ−ファミリ−のメンバ
−を含む多くの完全な形の阻害剤、及びセルピン アル
ファ−１−アンチトリプシンの分裂形に関して結晶学的
デ−タが得られる（Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．等，於：Ｐｒｏ
ｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，出版 Ｂａｒ
ｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．等，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ，３０１−３３６頁（１９８６））。これらの
セリン プロテア−ゼ インヒビタ−は大きさ及び配列
が膨大なタンパク質であるにもかかわらず、これまでに
研究された完全な形のインヒビタ−はすべて分子の表面
から伸びる特徴的なル−プを共通して有しており、それ
は同起源のセリン プロテア−ゼの活性化部位に対する
認識配列を含む（Ｌｅｖｉｎ，Ｅ．Ｇ．等，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：６８０４
−６８０８（１９８３））。異なるセリン プロテア−
ゼインヒビタ−のル−プが構造的に類似していることは
驚くべきことである（Ｐａｐａｍｏｋｏｓ，Ｅ．等，
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５８：５１５−５３７（１
９８２））。阻害剤のＫａＺａｌファミリ−及びストレ
プトミセス ズブチリシン ファミリ−はいくらか構造
及び配列に類似性があるが、一般に異なるファミリ−の
セリン プロテア−ゼ インヒビタ−は活性化部位ル−
プ以外に構造的関連性はない。
【０００９】セリン プロテア−ゼ インヒビタ−の多
くは広範囲の特異性を持ち、血液凝固セリン プロテア
−ゼを含むプロテア−ゼのキモトリプシン ス−パ−フ
ァミリ−、及びセリン プロテア−ゼのストレプトミセ
ス ズブチリシン ス−パ−ファミリ−の両方を阻害す
ることができる（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．等，Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９：５９３−６２６
（１９８０））。各阻害剤の特異性はセリン プロテア
−ゼによる阻害剤の潜在分裂の部位への直接のアミノ末
端であるアミノ酸の同定によりまず決定すると思われ
る。Ｐ1部位残基として知られるこのアミノ酸はセリン
プロテア−ゼの活性部位内のセリンとアシル結合を形
成すると思われる（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．等，Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９：５９３−６２６
（１９８０））。
【００１０】Ａ．ＢＰＴＩファミリ− ＢＰＴＩファミリ−に属するセリン プロテア−ゼ イ
ンヒビタ−には、ＢＰＴＩ、ヘビ毒インヒビタ−、イン
タ−アルファ インヒビタ−、及びＡ４アミロイド前駆
体Ａ４６９５が含まれる（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．
等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９：５９３
−６２６（１９８０）；Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．等，於：Ｐ
ｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，出版 Ｂ
ａｒｒｅｔ，Ａ．Ｊ．等，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔ
ｅｒｄａｍ，３０１−３３６頁（１９８６）；及びＰｏ
ｎｔｅ，Ｐ．等，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：５２５−５２
７（１９８８））。セリン プロテア−ゼ、及びそれら
と同起源のＢＰＴＩファミリ−阻害剤の例を下表Ｉに挙
げる。
【００１１】 表Ｉ セリン プロテア−ゼ 同起源ＢＰＴＩ阻害剤 トリプシン ＢＰＴＩ ヘビ毒インヒビタ− インタ−アルファ インヒビタ− （未知） Ａ４アミロイド前駆体Ａ４６９５ プロテア−ゼ ネクシン ＩＩ Ｂ．Ｋａｚａｌファミリ− Ｋａｚａｌファミリ−に属するセリン プロテア−ゼ
インヒビタ−には、すい臓分泌阻害剤、オボムコイド、
及び精奬アクロシン インヒビタ−が含まれる（Ｌａｓ
ｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，４９：５９３−６２６（１９８０）；Ｒｅａｄ，
Ｒ．Ｊ．等，於：ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔ
ｏｒｓ，出版 Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．等，Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，３０１−３３６頁（１
９８６）；及びＬａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．等，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎ
ｔ，Ｂｉｏｌ．，ＬＩＩ：５４５−５５３（１９８
７））。セリン プロテア−ゼ、及びそれらと同起源の
Ｋａｚａｌファミリ−阻害剤の例を下表ＩＩに挙げる。
【００１２】 表ＩＩ セリン プロテア−ゼ 同起源Ｋａｚａｌ阻害剤 トリプシン すい臓分泌阻害剤 オボムコイド 精奬アクロシン インヒビタ− アクロシン オボムコイド 精奬アクロシン インヒビタ− Ｃ．ストレプトミセス ズブチリシン インヒビタ− ストレプトミセス ズブチリシン インヒビタ− ファ
ミリ−に属するセリンプロテア−ゼ インヒビタ−には
ストレプトミセス アルボグリセオルスから得られる阻
害剤、及びプラスミノストレプチンが含まれる（Ｌａｓ
ｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，４９：５９３−６２６（１９８０））。セリン
プロテア−ゼ及びそれらと同起源のストレプトミセス
ズブチリシン クラスの阻害剤の例を下表ＩＩＩに挙げ
る。
【００１３】 表ＩＩＩ セリン プロテア−ゼ 同起源ＳＳＩインヒビタ− ズブチリシン ＢＰＮ’ ストレプトミセス アルボグリセオルス インヒビタ− プラスミン プラスミノストレプチン トリプシン プラスミノシトレプチン Ｄ．セルピン ファミリ− セルピン ファミリ−に属するセリン プロテア−ゼ
インヒビタ−にはプラスミノ−ゲン活性化因子インヒビ
タ−ＰＡＩ−１，ＰＡＩ−２及びＰＡＩ−３、Ｃｌエス
テラ−ゼ インヒビタ−、アルファ−２−アンチプラス
ミン、コントラプシン、アルファ−１−アンチトリプシ
ン、アンチトロンビン ＩＩＩ、プロテア−ゼ ネクシ
ン Ｉ、アルファ−１−アンチキモトリプシン、プロテ
インＣインヒビタ−、ヘパリン補因子 ＩＩ、及び成長
ホルモン調節タンパク質が含まれる（Ｃａｒｒｅｌ，
Ｒ．Ｗ．等，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５２：５２７−５
３５(１９８７)；Ｓｏｍｍｅｒ，Ｊ．等，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，２６：６４０７−６４１０（１９８７）;Ｓｕｚ
ｕｋｉ，Ｋ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：
６１１−６１６（１９８７）；及びＳｔｕｍｐ，Ｄ．
Ｃ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：１２７５
９−１２７６６（１９８６））。
【００１４】セルピンによるセリン プロテア−ゼの阻
害はＴｒａｖｉｓ，Ｊ．等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ.，５２：６５５−７０９(１９８３);Ｃａｒｒｅ
ｌ，Ｒ．Ｗ．等，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃ
ｉ．，１０：２０−２４（１９８５）；Ｓｐｒｅｎｇｅ
ｒｓ，Ｅ．Ｄ．等，Ｂｌｏｏｄ，６９：３８１−３８７
（１９８７）；及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂ
ｉｔｏｒｓ，出版 Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．等，Ｅｌ
ｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８６）で調査
されている。
【００１５】セリン プロテア−ゼ、及びそれらと同起
源のセルピン インヒビタ−の例を下表ＩＶに挙げる。
【００１６】 表ＩＶ セリン プロテア−ゼ 同起源セルピン インヒビタ− 活性化プロテインＣ プロテインＣ阻害剤 ＰＡＩ−１ Ｃｌエステラ−ゼ Ｃｌエステラ−ゼ インヒビタ− カテプシン Ｇ アルファ−１−アンチトリプシン アルファ−１−アンチキモトリプシン チマ−ゼ アルファ−１−アンチキモトリプシン キモトリプシン アルファ−１−アンチキモトリプシン アルファ−２−アンチプラスミン コントラプシン 凝固因子（ＶＩＩａ，ＩＸａ， アンチトロンビン ＩＩＩ Ｘａ，ＸＩａ，ＸＩＩａ） Ｃｌエステラ−ゼ インヒビタ− エラスタ−ゼ アルファ−１−アンチトリプシン カリクレイン Ｃｌエステラ−ゼインヒビタ− アルファ−１−アンチトリプシン プラスミン アルファ−２−アンチプラスミン トロンビン アンチトロンビン ＩＩＩ ヘパリン補因子 ＩＩ ｔ−ＰＡ ＰＡＩ−１，ＰＡＩ−２， ＰＡＩ−３ トリプシン アルファ−１−アンチトリプシン 成長ホルモン調節蛋白質 トリプシン−様 プロテア−ゼ プロテア−ゼ ネクシン Ｉ ｕ−ＰＡ ＰＡＩ−１，ＰＡＩ−２， ＰＡＩ−３ Ｅ．大豆トリプシン インヒビタ− ファミリ− 大豆から精製した大豆トリプシン インヒビタ− ファ
ミリ−の唯一の例は配列が決定されている。牛すい臓ト
リプシンとのその複合体が研究されている（Ｓｗｅｅ
ｔ，Ｒ．Ｍ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３：４２１４−
４２２８（１９７４））。
【００１７】Ｆ．ポテト インヒビタ− ファミリ− ポテト インヒビタ− ファミリ−に属するセリン プ
ロテア−ゼ インヒビタ−には、じゃがいも、大麦、及
びひるからの阻害剤が含まれる（Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．
等，於：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｓ，出版 Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．等，Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，３０１−３３６頁（１９８
６））。セリン プロテア−ゼ、及びそれらのポテト
インヒビタ−の例を下表Ｖに挙げる。
【００１８】 表Ｖ セリンプロテア−ゼ ポテト インヒビタ− キモトリプシン 大麦キモトリプシン インヒビタ− ズブチリシン ノボ 大麦キモトリプシン インヒビタ− ズブチリシン カルスベルグ ひる阻害剤 エグリン Ｇ．ボ−マン−バ−ク インヒビタ− ボ−マン−バ−ク インヒビタ− ファミリ−に属する
セリン プロテア−ゼインヒビタ−はマメからの相同タ
ンパク質を含む（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．等，Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９：５９３−６２６
（１９８０））。セリン プロテア−ゼ、及びそれらの
ボ−マン−バ−ク インヒビタ−の例を下表ＶＩに挙げ
る。
【００１９】 表ＶＩ セリン プロテア−ゼ ボ−マン−バ−ク インヒビタ− トリプシン あおいまめ阻害剤 ＩＶ エラスタ−ゼ ガ−デンビ−ン阻害剤 キモトリプシン アズキマメ阻害剤 ＩＩ ＩＩＩ．セリン プロテア−ゼ−インヒビタ−複合体 すべてのファミリ−からのセリン プロテア−ゼ イン
ヒビタ−はそれらと同起源のセリン プロテア−ゼと安
定な１：１複合体を形成する。これらの複合体の解離は
非常におそい（数時間から数日）（Ｌａｓｋｏｗｓｋ
ｉ，Ｍ．等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４
９：５９３−６２６（１９８０）；及びＬｅｖｉｎ，
Ｅ．Ｇ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８０：６８０４−６８０８（１９８３））。セル
ピンを除くすべてのセリン プロテア−ゼ インヒビタ
−の場合、解離生成物は完全な形の、及び分裂した阻害
剤分子の混合物である。他方、セリン プロテア−ゼ−
セルピン複合体は解離により分裂した阻害剤分子のみを
生ずるようなので、セルピンは他のセリン プロテア−
ゼインヒビタ−と多少異なる機構を使用すると思われ
る。
【００２０】トリプシン−ＢＰＴＩ、キモトリプシン−
オボムコイド インヒビタ−、キモトリプシン−ポテト
インヒビタ−、及びストレプトミセス ズブチリシン
−ストレプトミセス ズブチリシン インヒビタ−を含
む数種のセリン プロテア−ゼ−阻害剤複合体に関する
構造デ−タが得られる（Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．等，於：Ｐ
ｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，出版 Ｂ
ａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．等，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓ
ｔｅｒｄａｍ，３０１−３３６頁（１９８６））。これ
らの構造を調べると、阻害剤の膨大な配列にもかかわら
ず、各阻害剤とその同起源のセリン プロテア−ゼ間の
特異的な相互作用において顕著な類似性があることが明
らかになる。本発明においてこの構造的類似性により、
結晶構造が得られない場合でも阻害剤及びそれと同起源
のセリン プロテア−ゼの間に起きるアミノ酸相互作用
を予測することができるということを示唆した。
【００２１】上記の議論の通り阻害剤は活性中心を含
み、それがセリン プロテア−ゼの活性部位に対する拮
抗基質となる。活性中心のＰ1−Ｐ1残基（例えばＰＡＩ
−１の場合ＡＲＧ346−Ｍｅｔ347）間のペプチド結合へ
の攻撃によりセリン プロテア−ゼからの生成物の正常
で迅速な解離が起こらず、おそらくプロテア−ゼの活性
部位のセリン及び阻害剤のＰ1残基の間の共有結合の形
成により安定なセリンプロテア−ゼ−インヒビタ−複合
体が確立される（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．等，Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４９：５９３−６２６
（１９８０））。この機構は、ＰＡＩ−１などの阻害剤
の活性中心がセリン プロテア−ゼの活性部位に緊密
に、正確に適合しなければならないこを示す。しかしこ
れまでＰＡＩ−１、それと同起源のセリン プロテア−
ゼ、ｔ−ＰＡ、又はｔ−ＰＡ／ＰＡＩ−１複合体につい
てのＸ−線結晶学的デ−タはない。従ってこのタンパク
質の対の間の相互作用の正確な性質は未知である。他の
セルピン、又はセルピン−セリン プロテア−ゼ複合体
の構造についての情報も同様に不足している。 ＩＶ．セリン プロテア−ゼの利用 キモトリプシン ス−パ−ファミリ−の特に重要なセリ
ン プロテア−ゼはｔ−ＰＡである。ｔ−ＰＡは直接作
用して血栓（血餅）を溶解するわけではないが、心筋梗
塞、肺塞栓症、及び重症の静脈血栓の治療に、冠動脈内
又は静脈内投与によって現在使用されている。ｔ−ＰＡ
はプラスミノ−ゲンのＡｒｇ560及びＶａｌ561の間のペ
プチド結合の分裂を促進し（Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｋ．Ｃ．
等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４２：２３３３−２
３４２（１９６７））、それにより不活性なチモ−ゲン
を強力であるが非特異的なプロテア−ゼ、プラスミンに
変換し、それが血餅のフィブリンの網目を分解する（Ｂ
ａｃｈｍａｎｎ，Ｆ．等，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍ．Ｈ
ａｅｍｏｓｔ．，４３：７７−８９（１９８４）；Ｇｅ
ｒａｒｄ，Ｒ．Ｄ．等，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，
３：４４９−５５７（１９８６）；及びＶｅｒｓｔｒａ
ｅｔｅ，Ｍ．等，Ｂｌｏｏｄ，６７：１５２９−１５４
１（１９８６））。
【００２２】ｔ−ＰＡは必ずしも全身的にフィブリノ−
ゲンを枯渇させることなく局部的なフィブリン溶解現象
を起こす。これはｔ−ＰＡがフィブリンに直接結合しフ
ィブリン−ｔ−ＰＡ複合体を形成することができ、その
プラスミノ−ゲンに対する親和力が約５００倍に増加す
るからである（Ｒａｎｂｙ，Ｍ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７０４：４６１−４６９
（１９８２）；及びＲｉｊｋｅｎ，Ｄ．Ｃ．等，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２９２０−２９２５（１
９８２））。このようにプラスミノ−ゲンも高濃度で存
在する（Ｗｉｍａｎ，Ｂ．等，Ｎａｔｕｒｅ，２７２：
５４９−５５０（１９７８））冠動脈血栓に、静脈内投
与されたｔ−ＰＡが結合すると血栓の部位でプラスミン
が有効に製造され、そこで最高に働く。
【００２３】現在、ｔ−ＰＡは最初にボ−ラスの形態で
投与され、その後一定の注入を続ける。３時間の標準の
治療の間に投与される酵素の合計量は一般に約５０−１
００ｍｇである。２つの理由でこのような大量を必要と
することが明白である：第１に、肝細胞による循環から
の急速なｔ−ＰＡのクリアランスの効果を補うため（Ｋ
ｒａｕｓｅ，Ｊ．，Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，２：１
３３−１４２（１９８８））、及び第２に、血漿及び血
小板中に存在する比較的高濃度のセリン プロテア−ゼ
インヒビタ−の影響を克服するため（Ｃａｒｒｅｌ
ｌ，Ｒ．Ｗ．等，於：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉ
ｂｉｔｏｒｓ，出版 Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．等，Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，頁４０３−４２
０（１９８６））。
【００２４】ｔ−ＰＡの主な生理学的阻害剤はセルピ
ン、ＰＡＩ−１、約５０ｋｄの糖タンパク質である（Ｐ
ａｎｎｅｋｏｅｋ，Ｈ．等，ＥＭＢＯ Ｊ．，５：２５
３９−２５４４（１９８６）；Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｄ．
等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，７８：１６７３−
１６８０（１９８０）；及びＣａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．
等，於：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｓ，出版 Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．等，Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，頁４０３−４２０（１９
８６））。ＰＡＩ−１は心筋肉梗塞から生き残った人か
らの血漿のフィブリン溶解現象の能力が減少している原
因とされてきた（Ｈａｍｓｔｅｎ，Ａ．等，Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１３：１５５７−１５６３(１
９８５))。さらにＰＡＩ−１は急性期反応性タンパク質
であり、心筋梗塞に伴いその量が増加することにより、
治療のためのｔ−ＰＡの注入後に血漿中に残った実質的
量のｔ−ＰＡのフィブリン溶解現象活性を減衰させうる
（Ｌｕｃｏｒｅ，Ｃ．Ｌ．等，Ｃｉｒｃ．，７７：６６
０−６６９（１９８８））。ＰＡＩ−１とｔ−ＰＡの結
合の２次速度定数は非常に高く(Ｈｅｋｍａｎ，Ｃ．
等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ.，２
６２：１９９−２１０（１９８８））、人の血漿による
ｔ−ＰＡの最初の”急速相（ｆａｓｔ−ｐｈａｓｅ）”
阻害を説明している（Ｃｏｌｕｃｃｉ，Ｍ．等，Ｊ．Ｌ
ａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１０８：５３−５９（１９
８６））。従ってインビボにおけるＰＡＩ−１によるｔ
−ＰＡの急速な中和は、急性心筋梗塞の治療をした１０
％から３５％の患者が冒される合併症である、血栓分解
治療後の冠動脈レステノシスに寄与しうる（Ｃｈｅｓｅ
ｂｒｏ，Ｊ．Ｈ．等，Ｃｉｒｃ．，７６：１４２−１５
４（１９８７））。
【００２５】Ｃｌエステラ−ゼ インヒビタ−、及びア
ルファ−２−アンチプラスミンなどの他のセルピンとｔ
−ＰＡの結合定数はＰＡＩ−１の場合より低次数である
が（Ｒａｎｂｙ，Ｍ．等，Ｔｈｒｏｍ．Ｒｅｓ．，２
７：１７５−１８３（１９８２）；及びＨｅｋｍａｎ，
Ｃ．等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．，２６２：１９９−２１０（１９８８））、それに
もかかわらずこれらのセルピンは注入されたｔ−ＰＡと
結合し、ｔ−ＰＡの有利な薬理学的性質を減衰させるこ
とができる。
【００２６】ｔ−ＰＡ及びＰＡＩ−１の他に多くのセリ
ン プロテア−ゼ−セルピンの対が医学的に非常に重要
である。例えばｕ−ＰＡはｔ−ＰＡと同様に心筋梗塞の
治療に有用であり、ｔ−ＰＡと同様のセリン プロテア
−ゼ インヒビタ−による阻害を受ける。
【００２７】傷における血餅形成の促進に局所的に使用
されるセリン プロテア−ゼであるトロンビンはプロ凝
固剤である。それと同起源のセルピンである、アンチト
ロンビン ＩＩＩは、トロンビン、及び因子ＩＸａ，Ｘ
ａ，ＸＩａ及びＸＩＩａを含む血液凝固カスケ−ドに関
与する多くのセリン プロテア−ゼを特異的に阻害する
凝固防止剤である（Ｈｅｉｍｂｕｒｇｅｒ，Ｎ．等，
於：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｎｆｅｒ
ｅｎｃｅ ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉ
ｔｏｒｓ，出版Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．等，Ｗａｌｔｅｒ ｄ
ｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，頁１−２２
（１９７１）；Ｋｕｒａｃｈｉ，Ｋ．等，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，１５：３７３−３７７（１９７６）；Ｋｉｒａｃ
ｈｉ，Ｋ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６：５８３１−５
８３９（１９７７）；及びＯｓｔｅｒｕｄ，Ｂ．等，Ｓ
ｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，３５：２
９５−３０５（１９７６））。アンチトロンビン ＩＩ
Ｉは播種性血管内血液凝固の治療に使用されてきた。ト
ロンビンによりプロテインＣを活性化すると、活性化プ
ロテインＣが凝固因子Ｖａ及びＶＩＩＩａを不活性化
し、それ自身はそれと同起源のセルピン、プロテインＣ
インヒビタ−により阻害されるので血液凝固過程の自己
制限が起こる。
【００２８】子宮収縮を起こす、血管の浸透性を増す、
及び血液凝固の内部経路を起こす機能を持つカリクレイ
ンは、比較的重要なセルピンのひとつであるアルファ−
１−アンチトリプシンにより阻害を受ける。
【００２９】アルファ−１−アンチトリプシンはトリプ
シンと同様に白血球エラスタ−ゼ、及びカテプシンも阻
害する（Ｈｅｉｍｂｕｒｇｅｒ，Ｎ．等，於：Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，出版
Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．等，Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙ
ｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，頁１−４７（１９７１）；
Ｊａｎｏｆｆ，Ａ．，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐ．Ｄｉ
ｓ．，１０５：１２１−１２７（１９７２）；及びＯｈ
ｌｓｓｏｎ，Ｋ．等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，
３６：４７３−４８１（１９７３））。アルファ−１−
アンチトリプシンの遺伝子欠失は直接気腫に関連し（Ｃ
ａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．等，Ｔｒｅｎｄｓ
【００３０】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１０：２０−
２４（１９８５））、従ってアルファ−１−アンチトリ
プシン置換が気腫の治療に使用されてきた（Ｍａｒｘ，
Ｊ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３１５−３１６
（１９８９））。
【００３１】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、キモトリプシン ス−パ−ファミリ−の野生型セリ
ン プロテア−ゼ、特に野生型ｔ−ＰＡをタンパク質工
学により改良し、必ずしも他の有利な薬理学的性質を変
えることなくその酵素有効性を増し、及び／又は必要な
投薬量を変えることである。
【００３２】本発明のもうひとつの目的は、キモトリプ
シン ス−パ−ファミリ−の改良セリン プロテア−ゼ
をコ−ドする遺伝子を提供することである。
【００３３】本発明のさらに別の目的は、特にセルピン
ファミリ−の野生型セリン プロテア−ゼ インヒビ
タ−、特に野生型ＰＡＩ−１を変え、それらの阻害有効
性を増し、及び／又はその投薬必要量を変え、本発明の
変異セリン プロテア−ゼを阻害することができるよう
にすることである。
【００３４】本発明のさらに別の目的は、改良セリン
プロテア−ゼ インヒビタ−をコ−ドする遺伝子を提供
することである。
【００３５】本発明のこれらの、及び他の目的は、同起
源の阻害剤による阻害に対して抵抗性であるキモトリプ
シン ス−パ−ファミリ−のセリン プロテア−ゼ 変
異株；及びそれをコ−ドする遺伝子；ならびにセリン
プロテア−ゼ インヒビタ−抵抗性セリン プロテア−
ゼを阻害するセリン プロテア−ゼ インヒビタ−変異
株；及びそれをコ−ドする遺伝子により満たされ、これ
は下文に示す本発明の詳細な説明により明らかとなるで
あろう。
【００３６】
【課題を解決するための手段】上記で議論した通り、本
発明の上記の目的は、それらと同起源の阻害剤による阻
害にたいして抵抗性を持つキモトリプシン ス−パ−フ
ァミリ−のセリン プロテア−ゼ変異株；及びそれをコ
−ドする遺伝子を用いたひとつの具体化により達成する
ことができた。
【００３７】本発明のもうひとつの具体化において、本
発明のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−−抵抗性セ
リン プテア−ゼを阻害するセリン プロテア−ゼ イ
ンヒビタ−変異株；及びそれをコ−ドする遺伝子により
上記の目的を達成した。
【００３８】さらに別の具体化において、本発明のセリ
ン プロテア−ゼ インヒビタ−変異株はキモトリプシ
ン ス−パ−ファミリ−の野生型セリン プロテア−ゼ
をも阻害する。
【００３９】エンドペプチダ−ゼのこのセリン プロテ
ア−ゼ サブ−サブクラスのメンバ−はすべて相同タン
パク質であり、共通の作用機構を有するので、本発明に
おいて使用するキモトリプシン ス−パ−ファミリ−の
特定のセリン プロテア−ゼはここで重要ではない。そ
のようなキモトリプシン ス−パ−ファミリ−のセリン
プロテア−ゼの特別な例には上記で上げたセリン プ
ロテア−ゼ、すなわちｔ−ＰＡ、トリプシン、トリプシ
ン−様プロテア−ゼ、キモトリプシン、プラスミン、エ
ラスタ−ゼ、ｕ−ＰＡ、アクロシン、活性化プロテイン
Ｃ、Ｃｌエステラ−ゼ、カテプシンＧ、チマ−ゼ、及び
カリクレイン、トロンビン、及び因子ＶＩＩａ，ＩＸ
ａ，Ｘａ，ＸＩａ，ならびにＸＩＩａを含む血液凝固カ
スケードのプロテア−ゼが含まれる。本発明において使
用した好ましいキモトリプシン ス−パ−ファミリ−の
セリン プロテア−ゼはｔ−ＰＡである。
【００４０】キモトリプシン ス−パ−ファミリ−の変
異セリン プロテア−ゼが阻害にたいして抵抗性を示す
特定のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−は本発明に
おいて重要ではない。そのようなインヒビタタ−の例に
はＢＰＴＩファミリ−、Ｋａｚａｌファミリ−、ＳＳＩ
ファミリ−、セルピン ファミリ−、大豆トリプシンイ
ンヒビタ−（Ｋｕｎｉｔｚ） ファミリ−、ポテト イ
ンヒビタ− ファミリ−、及びボ−マン−バ−ク ファ
ミリ−のメンバ−が含まれる。
【００４１】キモトリプシン ス−パ−ファミリ−の変
異セリン プロテア−ゼが阻害に対して抵抗性を示す特
定のＢＰＴＩインヒビタ−は本発明において重要ではな
い。そのようなＢＰＴＩインヒビタ−の例にはＢＰＴ
Ｉ、ヘビ毒インヒビタ−、インタ−アルファ インヒビ
タ−、及びＡ４アミロイド前駆体Ａ４６９５が含まれ
る。
【００４２】キモトリプシン ス−パ−ファミリ−の変
異セリン プロテア−ゼが阻害に対して抵抗性を示す特
定のＫａｚａｌインヒビタ−は本発明において重要では
ない。そのようなＫａｚａｌインヒビタ−の例にはすい
臓分泌インヒビタ−、オボムコイド、及び精漿アクロシ
ン インヒビタ−が含まれる。
【００４３】キモトリプシン ス−パ−ファミリ−の変
異セリン プロテア−ゼが阻害に対して抵抗性を示す特
定のセルピン インヒビタ−は本発明において重要では
ない。そのようなセルピン インヒビタ−の例にはＰＡ
Ｉ−１，ＰＡＩ−２，ＰＡＩ−３，Ｃｌエステラ−ゼ
インヒビタ−（Ｃｌｉｎｈ），プロテインＣ インヒビ
タ−（ＰＣｉｎｈ）、ヘパリン 補因子 ＩＩ（ＨＣＩ
Ｉ）、アルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）、
アンチトロンビン ＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、アルファ−
１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）、プロテア−ゼ ネ
クシン Ｉ(Ｎｅｘ−１)、コントラプシン（Ｃｎｔｒｐ
ｓ）、成長ホルモン調節タンパク質（ＧＨＲＰ）、及び
アルファ−１−アンチキモトリプシン（ＡＣｈｙｍ）が
含まれる。キモトリプシン ファミリ−のセリン プロ
テア−ゼが阻害に対して抵抗性を示す好ましいセルピン
はＰＡＩ−１である。
【００４４】本発明のキモトリプシン ス−パ−ファミ
リ−のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−−抵抗性セ
リン プロアテア−ゼを阻害することができる変異セリ
ンプロテア−ゼ インヒビタ−をそれから誘導すること
ができる特定のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−
は、本発明において重要ではない。そのようなセリンプ
ロテア−ゼ インヒビタ−の例にはＢＰＴＩ、Ｋａｚａ
ｌ、ＳＳＩ、Ｋｕｎｉｔｚ、ポテト インヒビタ−、ボ
−マン−バ−ク インヒビタ−、及びセルピン ファミ
リ−のメンバ−が含まれ、ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−２、Ｐ
ＡＩ−３、Ｃｌエステラ−ゼ インヒビタ−、プロテイ
ンＣ インヒビタ−、ヘパリン 補因子 ＩＩ、アルフ
ァ−２−アンチプラスミン、アンチトロンビン III、
アルファ−１−アンチトリプシン、プロテア−ゼ ネク
シン Ｉ、コントラプシン、成長ホルモン調節タンパク
質、及びアルファ−１−アンチキモトリプシンなどのセ
ルピン ファミリ−のセリン プロテア−ゼ インヒビ
タ−が好ましい。キモトリプシン ス−パ−ファミリ−
のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−−抵抗性セリン
プロテア−ゼを阻害する好ましい変異セルピンはＰＡ
Ｉ−１である。
【００４５】すべての周知のセリン プロテア−ゼ イ
ンヒビタ−はその活性中心ル−プにおいて構造的に相同
であり、それらと同起源のセリン プロテア−ゼと類似
の相互作用を行う（Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．等，於：Ｐｒｏ
ｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、出版 Ｂａｒ
ｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．等，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ，頁３０１−３３６（１９８６））。セリン
プロテア−ゼ、及びセリン プロテア−ゼ インヒビタ
−の間の構造における対応はこれまでに研究されたこと
のない複合体のモデルの構築に利用することができる。
【００４６】ｔ−ＰＡ、及び他のセリン プロテア−ゼ
の触媒ドメインの間の構造的相同性が高いので（Ｂｌｕ
ｎｄｅｌｌ，Ｔ．等，Ｎａｔｕｒｅ，３２６：３４７−
３５２（１９８７））、本発明においてトリプシン、及
びＢＰＴＩ間の複合体の周知の構造（Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．
等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８９：７３−１０１（１
９７４）；及びＢｏｄｅ，Ｗ．等，於：Ｐｒｏｔｅｏｌ
ｙｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅ
ｇｕｌａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，頁４３−７６（１９７６））がｔ−Ｐ
Ａ及びＰＡＩ−１の間の相互作用のモデルとなり得ると
仮定した。主な認識部位のアミノ酸以外にＢＰＴＩと直
接接触するトリプシンのアミノ酸はポリペプチド鎖の２
つの別の領域に位置する（残基３７−４１、及び２１０
−２１３）（図１参照）。
【００４７】アミノ酸残基214ＳＷＧＳ217の周囲の領域
はキモトリプシン ス−パ−ファミリ−のすべてのメン
バ−の間に高度に保持されている。反対にアミノ酸残基
36ＮＳＧＹＨＦ41の周囲の領域は比較的変化し易く、イ
ンヒビタ−と相互作用を行う表面の部分を形成する。図
１に示される通りこの領域のｔ−ＰＡのアミノ酸配列は
２つの大きな点でトリプシンのアミノ酸配列と異なる。
第１にトリプシンのＴｙｒ（Ｙ39）残基がｔ−ＰＡにお
いてはＡｒｇ（Ｒ304）で置換されている。ｔ−ＰＡ及
びＰＡＩ−１の間の相互作用がトリプシン及びＢＰＴＩ
の間の相互作用を模倣しているという仮定に基づくモデ
リングはｔ−ＰＡのＲ304がＰＡＩ−１のＧｌｕ
（Ｅ350）残基と塩橋を形成することを示唆する。この
ＰＡＩ−１のＧｌｕ残基の位置は、トリプシンのＹ39と
ファン デル ワ−ルス結合を形成するＢＰＴＩのＩ19
に対応する(下表ＶＩＩ)（Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．等，Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８９：７３−１０１（１９７４))；
及びＢｏｄｅ，Ｗ．等，於：Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ
ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｇｕｌａｔ
ｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，頁４３−７６（１９７６））。従ってＰＡＩ−１
のＥ350はｔ−ＰＡのＲ304とイオン対を形成すると思わ
れる。
【００４８】 表ＶＩＩ Ｐ１ Ｐ４’ １２ ・ ・ ２４ ＢＰＴＩ ＧＰＣＫＡＴＩＩＲＹＦＹＮ ３４３ ・ ・ ３５５ ＰＡＩ−１ ＶＳＡＲＭＡＰＥＥＩＩＭＤ ５５７ ・ ・ ５６９ ＰＬＧ ＣＰＧＲＶＶＧＧＣＶＡＭＰ 第２にｔ−ＰＡは、ｔ−ＰＡ（Ｒ304）及びＰＡＩ−１
（Ｅ350）の間の接点と思われる位置に隣接して位置す
る余分な７個のアミノ酸（296ＫＨＲＲＳＰＧ302，図１
を参照）を有する。これらの７個のアミノ酸の中の４個
は正に帯電しており、ＰＡＩ−１（350ＥＥＩＩＭ
Ｄ355）の相補的領域と思われる領域は３個の負に帯電
した残基を含む。本発明においては、これらの領域間の
静電的相互作用がｔ−ＰＡ及びＰＡＩ−１の間の複合体
の形成、及び安定化に重要な役割を果たし得ると思われ
た。逆にｔ−ＰＡがその基質である、同領域に負に帯電
した残基を持たないプラスミノ−ゲン（ＰＬＧ）と相互
作用を行う場合はこのような相互作用が起こり得ない
（上記表ＶＩＩを参照）。
【００４９】図１に示すようなキモトリプシン ス−パ
−ファミリ−の種々のセリン プロテア−ゼの配列の比
較は、キモトリプシン ス−パ−ファミリ−の種々のセ
リンプロテア−ゼの１種類又はそれ以上の変異を設計し
てそれらと同起源の野生型阻害剤による阻害に対して抵
抗性とするための指針として使用することができる。ｔ
−ＰＡと同様に図１に示すキモトリプシン ス−パ−フ
ァミリ−の他のセリン プロテア−ゼは、重要な結合残
基（トリプシンのＹ39）、及び結合残基に隣接して位置
する種々の大きさの挿入残基を含む点でトリプシンと異
なる。従って変異の候補の例には以下が含まれる： （ｉ）他のセリン プロテア−ゼにおいてトリプシンの
Ｔｙｒ（Ｙ39）（ＢＰＴＩのＩｌｅ（Ｉ19）と結合し、
従って２個のタンパク質間の相互作用において重要な役
割を果たす残基）の位置に対応する位置を占めるアミノ
酸残基。例えばプラスミンにおいて、Ｍｅｔ（Ｍ）残基
はトリプシンのＹ39に対応する位置を占める。このＭｅ
ｔ残基を電荷、又は大きさなどの性質の異なる他のアミ
ノ酸（例えばＧｌｕ（Ｅ））に変異させると、プラスミ
ンのアンチプラスミンによる不活性化に対する感受性が
なくなるか、又は減少することが期待されるが、使用す
る特定の置換アミノ酸は本発明において重要でない。同
様にトロンビンのＧｌｎ（Ｑ）残基（トリプシンのＹ39
に対応する位置を占める）を電荷、又は大きさなどの性
質が異なる別のアミノ酸（例えばＡsp（Ｄ））に変異さ
せると、トロンビンのアンチトロンビンＩＩＩによる不
活性化に対する感受性がなくなる、又は減少することが
期待されるが、使用する特定の置換アミノ酸は本発明に
おいて重要でない；及び （ｉｉ）トリプシンには存在せず、分子の表面の小さい
挿入として活性部位の近辺に位置するキモトリプシン
ス−パ−ファミリ−の他のセリン プロテア−ゼの残基
（図１を参照）。例えばプラスミンは結合残基に隣接し
てt-ＰＡの296ＫＨＲＲＳＰＧ302により占められている
位置に対応する位置に、２個のアミノ酸（ＲＦ）の挿入
を含む。これらの２個のアミノ酸のどちらか、又は両方
の欠失、又は置換、あるいは少量の別のアミノ酸の挿入
による変異により、必ずしもセリン プロテア−ゼの触
媒部位に影響することなく阻害剤との相互作用を失わせ
る、又は減少させることが期待される。もうひとつの例
として、ｕ−ＰＡは結合残基に隣接してｔ−ＰＡの296
ＫＨＲＲＳＰＧ302により占められている位置に対応す
る位置に６個のアミノ酸（ＲＨＲＧＧＳ）の挿入を含
む。これらの６個の残基の変異、又は欠失は変異ｔ−Ｐ
Ａ（Ｄｅｌ296-302）の場合に観察される相互作用と類
似の方法によるセリン プロテア−ゼ インヒビタ−と
の相互作用が減少する、又はなくなることが期待され
る。
【００５０】同様に、セリン プロテア−ゼ インヒビ
タ−の活性中心内の領域は非常に変化し易く、セリン
プロテア−ゼと相互作用を行う表面の部分を形成する。
図２〜３に示すようなセルピン ファミリ−の種々のセ
リン プロテア−ゼ インヒビタ−の配列の比較は種々
のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−において、特に
セリン プロテア−ゼ インヒビタ−のセルピン ファ
ミリ−のメンバ−に、本発明のキモトリプシン ス−パ
−ファミリ−のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−−
抵抗性セリン プロテア−ゼを有効に阻害することがで
きるような１種類かそれ以上の変異を起こす設計の指針
として利用することができる。ＰＡＩ−１と同様に図２
〜３に示した他のセルピン ファミリ−のメンバ−は、
重要な結合アミノ酸残基（ＰＡＩ−１のＥ350）におけ
る配列が異なり、結合残基に隣接した位置に種々の大き
さの挿入を含む（下表ＶＩＩＩを参照）。
【００５１】 表ＶＩＩＩ セルピン ３４４ Ｐ１−Ｐ１′ ３５８ h ＰＡＩ−１ ＳＡ−ＲＭＡＰＥＥ−−−−−ＩＩＭＤＲＰＦ r ＰＡＴ−１ ＳＡ−ＲＭＡＰＴＥ−−−−−ＭＶＬＤＲＳＦ h ＰＡＩ−２ ＴＧ−ＲＴＧＨＧＧ−−−ＰＱＦＶＡＤＨＰＦ h ＡｌＡＴ ＩＰ−ＭＳＩＰＰＥ−−−−−ＶＫＦＮＫＰＦ b ＡｌＡＴ ＩＰ−ＭＳＩＰＰＥ−−−−−ＶＫＦＮＫＰＦ m ＡｌＡＴ ＶＰ−ＹＳＭＰＰＩ−−−−−ＬＲＦＤＨＰＦ r ＧＨＲＰ Ｌ−−ＫＳＬＰＱＴＩ−−ＰＬＬＮＦＮＲＰＦ h ＡＣhym ＴＬ−ＬＳＡＬＶＥＴＲＴＩ−ＶＲＦＮＲＰＦ m Ｃntrps ＧＩＲＫＡＩＬＰＡ−−−−−ＶＨＦＮＲＰＦ h ＡＴＩＩＩ ＡＧ−ＲＳＬＮＰＮ−−ＲＶＴＦＫＡＮＲＰＦ h ＨＣＩＩ ＭＰ−ＬＳＴＱＶＲ−−−−−ＦＴＶＤＲＰＦ h Ａ２ＡＰ Ｓ−−ＲＭＳＬＳＳ−−−−−ＦＳＶＮＲＰＦ h Ｃlinh ＡＡ−ＲＴＬＬＶ−−−−−−ＦＥＶＱＱＰＦ h ＰＣinh ＴＦ−ＲＳＡＲＬＮ−−ＳＱＲＬＶＦＮＲＰＦ r Ｎex-1 Ａ−−ＲＳＳＰＰＷ−−−−−ＦＩＶＤＲＰＦ （ｈ＝ヒト；ｒ＝ラツト；ｂ＝ひひ；およびｍ＝マウス） 従って変異の候補の例には以下が含まれる： （ｉ）他のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−におい
て、ＰＡＩ−１のＧｌｕ（Ｅ350）（ｔ−ＰＡのＡｒｇ
（Ｒ304）と結合し、従って２個のタンパク質の相互作
用において重要な役割を果たす残基）の位置に対応する
位置（Ｐ４’）を占めるアミノ酸残基。本発明において
は、ｔ−ＰＡにおけるＲ304−＞Ｅ変異の構築によりこ
われた静電的相互作用を復活させるためにＰＡＩ−１
（Ｅ350）のＧｌｕ残基をＡｒｇ（Ｒ）に変異させた。
このセルピンにおける特異的な変異は、セリン プロテ
ア−ゼに導入され野生型セルピンによる阻害に対する抵
抗性を与えた変異と相補的であるように構築された。セ
ルピンにおけるこの相補的Ｅ350−＞Ｒ変異はセルピン
に本発明のキモトリプシンス−パ−ファミリ−のセリン
プロテア−ゼ インヒビタ−−抵抗性セリン プロテア
−ゼを阻害する能力を与えるために特別に選んだ；しか
し使用した特定の置換アミノ酸は本発明に対して重要で
はない。例えばトリプシンのＹ39に対応するプラスミン
のＭｅｔ（Ｍ）残基（図１参照）を電荷又は大きさなど
の性質の異なる別のアミノ酸（上記の例のようにＧｌｕ
（Ｅ））に変え、変異プラスミンが野生型アルファ−２
−アンチプラスミンによる阻害に対する感受性の減少を
示した場合、アルファ−２−アンチプラスミンのＰ４’
Ｓｅｒ（Ｓ）残基を、プラスミンにおいて代わったＧｌ
ｕ残基と相互作用のできる他のアミノ酸（例えばＡｒｇ
（Ｒ））に変異させると、変異アルファ−２−アンチプ
ラスミンによる不活性化に対する変異プラスミンの感受
性が復活することが期待される。同様にトロンビンの変
異に関する上記の例のようにトロンビンのＧｌｎ（Ｑ）
残基Ａｓｐ（Ｄ）に変えた場合、アンチトロンビン Ｉ
ＩＩのＰ６’Ａｒｇ（Ｒ）残基をＧｌｕ（Ｅ）に変異さ
せると変異アンチトロンビン ＩＩＩによる阻害に対す
る野生型インヒビタ−−抵抗性トロンビンの感受性が復
活することが期待される； （ｉｉ）同種のセリン プロテア−ゼとの相互作用表面
を形成する、種々のファミリ−のセリン プロテア−ゼ
インヒビタ−の他のメンバ−の活性中心内の余分な残
基。セリン プロテア−ゼインヒビタ−のセルピンファ
ミリ−に関してこれらの残基を上記の表ＶＩＩＩに示
す。 例えばアルファ−２−アンチプラスミンは活性中心のＰ
ＡＩ−１の348ＡＰＥＥＩＩＭＤ355に対応する位置に配
列ＳＬＳＳＦＳＶＮを含む。これらの８個のアミノ酸の
いずれかの置換により、又は少量の別のアミノ酸の挿入
により変異を起こすと、これらの置換又は挿入が電荷、
大きさ、あるいは嫌水性などの性質において、セリン
プロテア−ゼに導入されて最初に野生型セルピンに対す
る抵抗性を与えたアミノ酸残基と相補的であればセリン
プロテア−ゼとの相互作用を復活することが期待され
る。
【００５２】本発明の変異セリン プロテア−ゼ、及び
変異セリン プロテア−ゼ インヒビタ−は、例えばオ
リゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発などの周知の方法
により製造することができる（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．等，
ＤＮＡ，３：４７９−４８８（１９８４）；Ｋｕｎｋｅ
ｌ，Ｔ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８２：４８８−４９２（１９８５）；及びＫｕ
ｎｋｅｌ，Ｔ．等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒ
ｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ
＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ（１９８７））。しかしセリン プロテア−
ゼ、又はセリン プロテア−ゼ インヒビタ−に変異を
起こす正確な方法は本発明にとって重要ではない。
【００５３】本発明の変異セリン プロテア−ゼは、Ｌ
ｏｔｔｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．等，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．，８０：３４１−３６１（１９８１）に記載の方法
などの周知のアッセイを用いて所望の性質、すなわちセ
リン プロテア−ゼ活性、及び同起源の阻害剤による阻
害に対する抵抗性を持つセリン プロテア−ゼに関して
スクリ−ニングを行うことができる。
【００５４】本発明の変異セリン プロテア−ゼ イン
ヒビタ−は、Ｌｏｔｔｅｎｂｅｒｇ，Ｒ．等，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８０：３４１−３６１(１９８
１)；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｗ．Ｅ．等，Ｂｉｌｃｈｅｍ．，
２６：５１３３−５１４０（１９８７）；及びＨｅｋｍ
ａｎ，Ｃ．Ｍ．等，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｌ
ｐｈｙｓ．，２６２：１９９−２１０（１９８８）に記
載の方法などの周知のアッセイを用いて所望の性質、す
なわち本発明のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−−
抵抗性セリン プロテア−ゼに対するセリン プロテア
−ゼ インヒビタ−活性を有するセリン プロテア−ゼ
インヒビタ−に関してスクリ−ニングを行うことがで
きる。
【００５５】本文に記載する研究は、セリン プロテア
−ゼを突然変異誘発により修正し、キモトリプシン ス
−パ−ファミリ−のセリン プロテア−ゼ、及びそれと
同起源の阻害剤の間の相互作用を減少させる、又はなく
すことが可能であることを初めて示すものである。これ
により変異セリン プロテア−ゼは同起源の阻害剤の存
在下で野生型の酵素より酵素活性が多く残り、残留活性
の量はそれと同起源の阻害剤との相互作用が阻害される
程度に依存している。そのような変異セリンプロテア−
ゼの投与は多種類の臨床的、及び商業的用途において有
益であると思われる。例えば活性化プロテインＣの変異
型は、血液の凝固を阻害するのが有利である場合有用で
あると思われ、本文の実施例１に記載のｔ−ＰＡの変異
型が、フィブリン溶解現象を延長する必要がある場合に
血栓性の異常のある患者の循環におけるｔ−ＰＡの有効
寿命を延ばすのに有用であると思われるのとちょうど同
じである。
【００５６】本文に記載した研究は又、セリン プロテ
ア−ゼ インヒビタ−を突然変異誘発により修正し、セ
リン プロテア−ゼ インヒビタ−の構造を適切に変化
させることにより、キモトリプシン ス−パ−ファミリ
−のセリン プロテア−ゼインヒビタ−−抵抗性変異セ
リン プロテア−ゼ、及びそれと同起源のセリンプロテ
ア−ゼ インヒビタ−間の相互作用を機能的に復活させ
ることが可能であることを初めて示すものである。これ
により同起源の野生型セリン プロテア−ゼ インヒビ
タ−が存在する場合より急速に変異セリン プロテア−
ゼを不活性化することができ、阻害の速度は変異セリン
プロテア−ゼとの相互作用が復活した程度に依存す
る。このような変異セリン プロテア−ゼ インヒビタ
−の投与は、多種の臨床的及び商業的用途においてセリ
ン プロテア−ゼ インヒビタ−−抵抗性セリン プロ
テア−ゼの活性を制限するのに有益であると思われる。
例えばプロテインＣ インヒビタ−の変異型は、活性化
プロテインＣの変異型の存在下で血液の凝固を促進する
のが有利であるような場合に有用であると思われる。同
様にＰＡＩ−１の変異型は、侵入的な方法が必要な場合
に、血栓性異常の治療をした患者の循環においてセリン
プロテア−ゼ インヒビタ−−抵抗性ｔ−ＰＡ、例え
ばｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｅ）の有効寿命を短縮するのに
有用であると思われる。従ってこのような変異セリン
プロテア−ゼ インヒビタ−はセリン プロテア−ゼ
インヒビタ−−抵抗性セリン プロテア−ゼの解毒薬と
して使用することができる。
【００５７】臨床的用途において投与するべき本発明の
変異セリン プロテア−ゼの量は使用する特定の変異セ
リン プロテア−ゼ、所望するセリンプロテア−ゼの治
療効果、及び性別、年令、体重、ならびにプロテア−ゼ
を投与する患者の生理学的条件などの因子に依存するで
あろう。変異セリン プロテア−ゼの使用量は日常的実
験により決定することができる。 臨床的用途において
投与するべき本発明の変異セリン プロテア−ゼ イン
ヒビタ−の量は使用する特定の変異セリン プロテア−
ゼ インヒビタ−、所望するセリン プロテア−ゼ イ
ンヒビタ−の治療効果、及び性別、年令、体重、ならび
にセリン プロテア−ゼ インヒビタ−を投与する患者
の生理学的条件などの因子に依存するであろう。変異セ
リン プロテア−ゼ インヒビタ−の使用量は日常的実
験により決定することができる。
【００５８】本発明の変異ｔ−ＰＡは適したインビト
ロ、及びインビボ モデルにおける試験、ならびに臨床
試験により決定した通りに投与しなければならない。必
要な投薬量は野生型ｔ−ＰＡの場合の必要量の１０−１
０００分の１となるであろうと思われる。
【００５９】本発明の変異ＰＡＩ−１も適したインビト
ロ、及びインビボ モデルにおける試験、ならびに臨床
試験により決定した通りに投与しなければならない。必
要な投薬量は変異ｔ−ＰＡの場合に必要な量と大体同じ
であろうと思われる。
【００６０】本発明の変異セリン プロテア−ゼは文献
により周知のいずれの製薬上許容できるキャリヤ−、又
は希釈剤、例えば生理食塩溶液と共にでも投与すること
ができる（Ｌｕｃｏｒｅ，Ｃ．Ｌ．等，Ｃｉｒｃ．，７
７：６６０−６６９（１９８８）；及びＣｈｅｓｅｂｒ
ｏ，Ｊ．Ｈ．等，Ｃｉｒｃ．，７６：１４２−１５４
（１９８７））。
【００６１】本発明の変異セリン プロテア−ゼの特定
の投与形態はその特定の用途に依存する。そのような投
与形態の例には、静脈内又は腹腔内注射、冠動脈内注
入、局所的適用、及びエ−ロゾル吸入が含まれる。
【００６２】本発明の変異セリン プロテア−ゼ イン
ヒビタ−の特定の投与形態はその特定の用途に依存す
る。そのような投与形態の例には、静脈内又は腹腔内注
射、冠動脈内注入、局所的適用、及びエ−ロゾル吸入が
含まれる。
【００６３】以下の実施例は説明のみを目的としてお
り、本発明の範囲をどのようにも制限するものではな
い。
【００６４】
【実施例】実施例１ｔ−ＰＡ変異株 本実施例に記載する方法はセリン プロテア−ゼとして
ｔ−ＰＡを使用し、同起源のセリン プロテア−ゼ イ
ンヒビタ−としてＰＡＩ−１を使用する場合を対象とす
るが、上記のようなキモトリプシン ス−パ−ファミリ
−の他のセリンプロテア−ゼ、及び上記のようなそれと
同起源の阻害剤も本発明の精神と範囲から逸脱すること
なく本文に記載の方法により容易に使用することができ
る。
【００６５】Ａ．突然変異誘発のためのｔ−ＰＡ部位の
選択 ｔ−ＰＡの残基Ａｒｇ304及び（296ＫＨＲＲＳＰ
Ｇ302）がＰＡＩ−１と相互作用をするという仮定を試
験するため、オリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発を
用いて下表ＩＸに示すｔ−ＰＡの３種類の変異型を製造
した。
【００６６】 表ＩＸ 野生型ｔ−ＰＡ ＦＡＫＨＲＲＳＰＧＥＲＦＬＣ ・ ｔ−ＰＡ（Ａｒｇ304−＞Ｓ） ＦＡＫＨＲＲＳＰＧＥＳＦＬＣ ・ ｔ−ＰＡ（Ａｒｇ304−＞Ｅ） ＦＡＫＨＲＲＳＰＧＥＥＦＬＣ ｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ296-302） ＦＡ．．．．．．．ＥＲＦＬＣ 変異ｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ296-302）は上記で議論した、ト
リプシンには存在しない７個のアミノ酸挿入を含まず、
同起源のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−、ＰＡＩ
−１と相互作用する部分のｔ−ＰＡ配列を完全に除去し
て構築した。変異株ｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｓ）及びｔ−
ＰＡ（Ｒ304−＞Ｅ）はＡｒｇ304がそれぞれＳｅｒ及び
Ｇｌｕに置換されており、正に帯電したＡｒｇ残基を選
択的に変え、それと同起源のセリン プロテア−ゼ イ
ンヒビタ−、ＰＡＩ−１との相互作用を除去するように
選んだ。Ｒ304に対して、電荷対相互作用の欠落のため
に同起源のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−に対す
る感受性の減少したｔ−ＰＡを与える種々の他の置換を
行うことができる。例えばル−プ中の正に帯電した残基
（残基２９６−３０２）を負に帯電した、又は中性のア
ミノ酸に変える点変異は、ｔ−ＰＡ及びＰＡＩ−１の間
の相互作用を妨げる、減少させる、又は不安定化すると
予測される。Ｐ301をＧｌｙ（Ｇ）以外の他のアミノ酸
で置換することにより類似の結果を得ることができる。
さらに残基３０４と３０５の間、又は残基２９６と３０
５の間のどこかに、ＰＡＩ−１の残基と全く相互作用し
ない約１−６個のアミノ酸の系列を挿入するように挿入
変異を行うことができる。異なる置換、及び／又は置
換、挿入及び欠失の組み合わせは、ｔ−ＰＡとＰＡＩ−
１の相互作用に異なる程度で影響し、それによって特定
の用途、又は臨床的条件に適する性質を持った種々のｔ
−ＰＡを製造することができるであろう。
【００６７】Ｂ．ｔ−ＰＡのオリゴヌクレオチド−媒介
突然変異誘発 ｔ−ＰＡのオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発は基
本的にＺｏｌｌｅｒ，Ｍ．等，ＤＮＡ，３：４７９−４
８８（１９８４）の記載に従い、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８
２：４８８−４９２（１９８５）；及びＫｕｎｋｅｌ，
Ｔ．等，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ＆ Ｗｉ
ｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
（１９８７）による修正により行った。
【００６８】第１に、ヒトのｔ−ＰＡ全長をコ−ドする
ｃＤＮＡをクロ−ニングした複写を含むプラスミドｐＳ
ＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｊ．等，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，３：４５９−４
８１（１９８６）に従って用意した。ｐＳＶＴ７（ＲＩ
-）／ｔ−ＰＡはｐＳＶＴ７の誘導体である（Ｂｉｒ
ｄ．Ｐ．Ｍ．等，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１０５：
２９０５−２９１４（１９８７））（図４を参照）。
【００６９】ｐＳＶＴ７はｐＫＣ３から構築した。ｐＫ
Ｃ３は、ＡｖａＩ部位からＥｃｏＲＩ部位までのｐＢＲ
３２２−誘導配列（これは複製の源、及びβ−ラクタマ
−ゼ遺伝子を含む）がｐＵＣ ８（Ｍｅｓｓｉｎｇ，
Ｊ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１：２０−７
８（１９８３））の配列に置換されているｐｋｏ（Ｖａ
ｎ Ｄｏｒｅｎ，Ｋ．等，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５０：６
０６−６１４（１９８４））の誘導体である。さらに独
特のＨｉｎｄＩＩＩ部位にポリリンカ−が挿入されてお
り、ＳＶ４０オリジンのＰｖｕＩＩ部位上流がＣｌａＩ
部位に変換されている。ベクタ−ｐＳＶＴ７はバクテリ
オファ−ジ Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラ−ゼ特異性プロモ
−タ−を含む２０個の塩基対フラグメント（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａＦｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｉｓｃａｔ
ａｗａｙ，ＮＪ）をｐＫＣ３の独特のＳｔｕＩ部位に挿
入することによって得た。このＳｔｉＩ部位はＳＶ４０
の初期領域から誘導した配列内のＳＶ４０配列のヌクレ
オチド５１９０の位置、初期転写の開始点から下流約３
０塩基対にある（Ｔｏｏｚｅ，Ｊ．等，ＤＮＡ Ｔｕｍ
ｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，頁８１３（１９８１））。
【００７０】その後Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ−ゼ
のクレノウフラグメントを用いてくぼんだ３’−末端を
満たすことにより単一のＥｃｏＲＩ部位をｐＳＶＴ７か
ら除去した。得られた発現ベクタ−をｐＳＶＴ７（ＲＩ
-）と称する（図４を参照）。
【００７１】次に野生型ｔ−ＰＡをコ−ドするｃＤＮＡ
をプラスミドｐＬ６１１から切り出し（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｊ．等，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，３：４５９
−４８１（１９８６）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡから提供）、ｐＳＶＴ７
（ＲＩ-）に挿入した。ｐＬ６１１はｔ−ＰＡのＡＵＧ
開始コドンからすぐ上流にＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩの切
断部位を導入する合成オリゴヌクレオチドを含む。ｔ−
ＰＡ ｃＤＮＡの３’非翻訳配列内の、ＴＧＡ終結コド
ンの下流約２８０塩基対の位置にＢａ１Ｉ部位がある。
プラスミド ｐＬ６１１から切り出したｔ−ＰＡ ＤＮ
Ａの約１９６５塩基対ＮｃｏＩ−ＢａｌＩフラグメント
にＸｂａＩリンカ−を加えた。このＢｃｏＩ−ＢａｌＩ
フラグメントは完全なｔ−ＰＡタンパク質をコ−ドする
配列を含むが、（ｉ）ｔ−ＰＡｍＲＮＡの末端３’−非
翻訳領域、及び（ｉｉ）ｔ−ＰＡ ｍＲＮＡの５’−非
翻訳領域全体、すなわちＳａｌＩ部位及びＡＴＧ開始コ
ドンの間の配列に対応する配列が欠けている（Ｐｅｎｎ
ｉｃａ，Ｄ．等，Ｎａｔｕｒｅ，３０１：２１４−２２
１（１９８３））。各末端にＸｂａＩ部位を持つｔ−Ｐ
Ａ ｃＤＮＡのフラグメント（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．
等，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，３：４５９−４８１
（１９８６））をｐＳＶＴ７／ｔ−ＰＡの製造に使用し
た（図４を参照）。得られたプラスミドからＸｂａＩを
用いた消化、０．８％（ｗ／ｖ）アガロ−スゲル電気泳
動による精製により約１９７０塩基対ＤＮＡフラグメン
トを切り出し、ｔ−ＰＡのＮ−末端をコ−ドする配列が
バクテリオファ−ジ Ｔ７及びＳＶ４０初期プロモ−タ
−のすぐ下流におかれるようにしてプラスミドｐＳＶＴ
７（ＲＩ-）のＸｂａＩ部位に挿入した。得られたプラ
スミドをｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡと称した（図
４を参照）。
【００７２】その後ｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡを
ＥｃｏＲＩを用いて完全に消化した。ｔ−ＰＡの４７２
塩基対フラグメント（アミノ酸２０６−３６４を含む領
域をコ−ドするヌクレオチド８４２−１３１４）を１．
２％（ｗ／ｖ）アガロ−スゲル電気泳動により精製し
た。このフラグメントを、前以てＥｃｏＲＩで消化し、
牛腸アルカリホスファタ−ゼを用いて脱ホスホリル化し
たバクテリオファ−ジＭ１３ベクタ−Ｍ１３ｍｐ１８
（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．等，Ｇｅｎｅ．３
３：１０３−１１９（１９８５）の複製型ＤＮＡと連結
した（図４を参照）。
【００７３】他に特定しない場合は本文に記載するこれ
らの、及び他の標準的組み替えＤＮＡ法は（ｉ）Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，Ｔ．等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第１
版，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８
２）、及び（ｉｉ）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５
２巻，出版Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．等，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）に記載の要
領で行った。
【００７４】連結ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ株ＴＧ−１（Ｇ
ｉｂｓｏｎ，Ｔ．，Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９
８４））にトランスフェクションした。組み替えバクテ
リオファ−ジにより形成された白いプラ−クを採取し、
適切な４７２塩基対ＥｃｏＲＩフラグメントの存在を制
限マッピング、サザンハイブリッド形成、及びＤＮＡ配
列決定により確認した。
【００７５】Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８−４９２
（１９８５）；及びＫｕｎｋｅｌ，Ｔ．，Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．，１５４：３６７−３８２（１９８７）
の記載に従い、５’−ホスホリル化合成突然変異誘発プ
ライマ−を用いて４７２塩基対ＥｃｏＲＩフラグメント
における変異を導入した。ｔ−ＰＡ変異株の構築に使用
した３種類の突然変異誘発プライマ−の配列は以下であ
る： 5′ 3′ ｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｓ） GCCCGGAGAGTCGTTCCTGTGC 5′ 3′ ｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｅ） GCCCGGAGAGGAGTTCCTGTGC 5′ 3′ ｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ296-302） GCCATCTTTGCCGAGCGGTTCCTG 上記原案はｄｕｔ-，ｕｎｇ-であるＥ．ｃｏｌｉの株、
すなわち株ＣＪ２３６において製造したＤＮＡ鋳型を使
用する（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８−４９２(１
９８５)；及びＫｕｎｋｅｌ，Ｔ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．，１５４：３６７−３８２（１９８７））。
ＤＮＡ鋳型はチミンの位置に少量のウラシル残基を含
む。
【００７６】突然変異誘発プライマ−をインビトロで伸
ばした後、部分的充填環状ＤＮＡをｄｕｔ+，ｕｎｇ+で
あるＥ．ｃｏｌｉの株、すなわちＴＧ−１にトランスフ
ェクトした（Ｇｅｂｓｏｎ，Ｔ．，Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇ
ｌａｎｄ（１９８４））。鋳型らせん中のウラシル残基
を酵素ウラシル Ｎ−グリコシラ−ゼの作用によりイン
ビボで除去した。これにより鋳型らせんに致死損害が加
えられ、変異株を迅速に、及び有効に回収することがで
きる。
【００７７】特に、ウラシル含有鋳型ＤＮＡを上に示し
た５’ホスホリル化突然変異誘発プライマ−にアニ−ル
した。プライマ−の伸長はＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラ
−ゼのクレノウフラグメントを用いて１５℃にて１２−
１６時間行った。新規に合成したらせんをバクテリオフ
ァ−ジＴ４ ＤＮＡリガ−ゼを用いて突然変異誘発プラ
イマ−の５’末端に連結し、不適正を持つ環を形成し
た。得られたＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ株ＴＧ−１
（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１
９８４））のトランスフェクションを行い、多くのプラ
−クから一重鎖ＤＮＡを製造した。これらのＤＮＡの配
列を完全に決定した。その後立証された変異株の複製型
２重鎖ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩによる消化、及び１．２％
（ｗ／ｖ）アガロ−スゲルによる電気泳動により単離し
た。下記に詳細に記載する通り、変異を含むこれらのフ
ラグメントを使用して問題のｔ−ＰＡ変異株をコ−ドす
るｔ−ＰＡ ｃＤＮＡのバ−ジョンを構築した。
【００７８】Ｃ．変異株ｔ−ＰＡのための発現ベクター
の構築 プラスミドｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡにおけるｔ
−ＰＡの変異株は以下のようにして構築した：ｔ−ＰＡ
ｃＤＮＡの中心４７２塩基対ＥｃｏＲＩフラグメント
をＥｃｏＲＩによる消化、及び１．２％（ｗ／ｖ）アガ
ロ−スゲルによる電気泳動によりｐＳＶＴ７（ＲＩ-）
／ｔ−ＰＡから除去した。その後残ったプラスミドＤＮ
Ａの直線状フラグメントをオリゴヌクレオチド−媒介−
突然変異誘発によって作った４７２塩基対フラグメント
のバ−ジョンに連結した（図４を参照）。得られたプラ
スミドをｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞
Ｓ），ｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞
Ｅ）、及びｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ
296-302）と称した。
【００７９】Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ−１（Ｈａｎａｈａ
ｎ，Ｄ．等，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１巻，出版 Ｇ
ｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｉ．Ｒ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘ
ｆｏｒｄ，頁１０９−１３５（１９８５））を上記の変
異株プラスミドを用いて形質転換し、得られた株をそれ
ぞれｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｓ）
［ＤＨ−１］；ｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ（Ｒ304
−＞Ｅ）［ＤＨ−１］；及びｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ
−ＰＡ（Ｄｅｌ296-302）［ＤＨ−１］と称した。正し
いフラグメントの存在は適した放射標識突然変異誘発オ
リゴヌクレオチドとのハイブリッド形成により確認し、
フラグメントの配向は適した突然変異誘発オリゴヌクレ
オチドをプライマ−として用いた制限マッピング、及び
ＤＮＡ配列決定により確認した。
【００８０】ｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ（Ｒ304−
＞Ｓ）［ＤＨ−１］、ｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ
（Ｒ304−＞Ｅ）［ＤＨ−１］、及びｐＳＶＴ７（Ｒ
Ｉ-）／ｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ296-302）［ＤＨ−１］はＡｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎにそれぞれＡＴＣＣ番号６７８９４，６７８
９６及び６７８９５として供託した。
【００８１】Ｄ．ＣＯＳ細胞のトランスフェクション 次に１００ｍｍの皿当たり約１０6個のＣＯＳ細胞（Ｇ
ｌｕｚｍａｎ，Ｙ．等，Ｃｅｌｌ，２３：１７５−１８
２（１９８１））をアルカリリシス法により精製した
１．０μｇの適したプラスミドＤＮＡを用いてトランス
フェクトした（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，第１版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ（１９８２））。特に、吸引により培地をＣ
ＯＳ細胞から除去し、単層を１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐ
Ｈ７．１５）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．）を含む５．０ｍｌのダルベッコの培地（ＧＩＢＣ
Ｏ，Ｉｎｃ．）で１回洗浄した。洗浄液を除去した後、
３００μｇのＤＥＡＥ−デキストラン（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ，Ｉｎｃ．）を含む１．５ｍｌの洗浄液中の単層に
プラスミドＤＮＡを加えた。その後単層を６．０％のＣ
Ｏ2を含む湿潤大気中、３７℃にて１時間インキュベ−
トした。この間２０分毎に単層をおだやかに撹拌した。
単層をプラスミドＤＮＡに１時間暴露した後、１０ｍＭ
のＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１５）を含むダルベッコの培地
で１回洗浄し、１０％（ｖ／ｖ）の牛胎児血清（ＧＩＢ
ＣＯ，Ｉｎｃ．）を含む１０ｍｌのダルベッコの培地、
及び１００μＭのクロロキン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．）を加えた。その後単層を上記に従い３
７℃にて４時間インキュベ−トし、牛胎児血清を含まず
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１５）を含むダルベッ
コの培地５．０ｍｌで２回洗浄した。その後１０％（ｖ
／ｖ）の牛胎児血清を含む１０ｍｌのダルベッコの培地
を加え、単層を上記に従い３７℃にて１２時間インキュ
ベ−トした。そして単層を牛胎児血清を含まないそれぞ
れ５．０ｍｌのダルベッコの培地で３回洗浄し、同培地
中、３７℃にてさらに３０−６０時間インキュベ−トし
た。ＤＥＡＥ−デキストランを含む溶液からプラスミド
ＤＮＡを省略する以外は同様の方法で偽−トランスフェ
クション細胞を処理した。インキュベ−ション期間の最
後に上澄み培地を細胞から集め下記に従い分析した。
【００８２】Ｅ．固相ラジオイムノアッセイによる野生
型、及び変異ｔ−ＰＡの定量 固相ラジオイムノアッセイは基本的にインフルエンザＨ
Ａに関して記載されている方法に従い（Ｇｅｔｈｉｎ
ｇ，Ｍ．Ｊ．等，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２
５（１９８１））、精製ヒトｔ−ＰＡに対するうさぎの
抗血清のＩｇＧフラクションを用いて行い、ＣＯＳ細胞
中の製造された野生型、及び変異ｔ−ＰＡの量を定量し
た。この方法によって決定したｔ−ＰＡの濃度は０．５
−１．０μｇ／ｍｌであった。
【００８３】Ｆ．野生型、及び変異ｔ−ＰＡの酵素によ
るアッセイ ＣＯＳ細胞中に製造された野生型、及び変異株ｔ−ＰＡ
の活性を決定するため、間接的色素澱粉法を行った。こ
のアッセイにおいては、遊離のｐ−ニトロアニリンが色
素澱粉法の基質、スペクトルザイムＰＬ（Ｈ−Ｄ−ノル
ロイシルヘキサヒドロチロシル−リシン−ｐ−ニトロア
ニリド 二酢酸塩）（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃａ，Ｉｎｃ．）から、プラスミノ−ゲン上のｔ−
ＰＡの作用により生成されたプラスミンの作用により放
出される。遊離のｐ−ニトロアニリンの放出は分光光度
分析によりＯＤ405ｎｍにて測定した。
【００８４】特に、１５０−２００ｐｇの試験するべき
ｔ−ＰＡ、０．４ｍＭのスペクトルザイムＰＬ、０．１
μＭのＬｙｓ−プラスミノ−ゲン（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｉｎｃ．）、及び０．５−２
５μｇ／ｍｌの可溶性フィブリン（Ｄｅｓ−Ａ−フィブ
リノ−ゲン）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃａ，Ｉｎｃ．）を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、０．１ＭのＮａＣｌ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ
及び０．０１％（ｖ／ｖ）のツイ−ン８０から成る緩衝
液中に含む反応混合物を９６ウェルの平底ミクロタイタ
−プレ−ト（Ｃｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）中で３７℃にて
インキュベ−トし、２時間の間１５又は３０分間隔でＢ
ｉｏ−ｔｅｃミクロプレ−トリ−ダ−を用いてＯＤ405
ｎｍを測定した。偽−トランスフェクション細胞からの
緩衝液、又は適切に希釈した試料のアリコ−トを標準と
して分析し、得られたＯＤ値（＜０．０１単位）を対応
する試験値から差し引いた。デルタＯＤ値を３０分と６
０分の間の光学濃度の変化として、すなわち反応の遅滞
期、及び１本鎖ｔ−ＰＡから２本鎖の形態への完全な変
換による変化として測定した。標準的アッセイに使用す
る条件下で（０．１μＭのＬｙｓ−プラスミノ−ゲン及
び２５μｇ／ｍｌのＤｅｓ−Ａ−フィブリノ−ゲン）、
可溶性フィブリンはｔ−ＰＡの活性を２０−４０倍賦活
した。結果を図５に示す。
【００８５】図５に示す通り、上記の本発明のｔ−ＰＡ
変異株の３種類全部が酵素として活性であり、その活性
の特異性は野生型の活性と大きく異なるものではないこ
とが見い出された。さらに上記の本発明のｔ−ＰＡ変異
株は野生型ｔ−ＰＡと類似の方法でＤｅｓ−Ａ−フィブ
リノ−ゲンの濃度の変化に応答することが見い出され
た。Ｄｅｓ−Ａ−フィブリノ−ゲンによる最適刺激は２
０−４０倍であった。これはＤｅｓ−Ａ−フィブリノ−
ゲン製造を用いた野生型ｔ−ＰＡについての他の観察と
一致する（Ｋａｒｌａｎ，Ｂ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｎ．，１４２：１４７−
１５４（１９８７））。それぞれの場合、Ｄｅｓ−Ａ−
フィブリノ−ゲンの濃度が約１．０μｇ／ｍｌの場合に
半−最適刺激が起きた。
【００８６】次に飽和濃度のＤｅｓ−Ａ−フィブリノ−
ゲン（２５μｇ／ｍｌ）、及び種々の濃度（０．０２−
０．１６μＭ）の基質、Ｌｙｓ−プラスミノ−ゲンの存
在下における種々の形態の酵素のアッセイにより、野生
型及び変異株ｔ−ＰＡのＫm及びＫcat値を決定した。結
果を下表Ｘに示す。
【００８７】 表Ｘ 酵素 Ｋm（μＭ） Ｋcat（ｓ-1） 野生型ｔ−ＰＡ ０．０２４ ０．２２ ｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｓ） ０．０１９ ０．２３ ｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｅ） ０．０２３ ０．２２ ｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ296-302） ０．０２９ ０．１７ 上記の表に示す通り、異なるｔ−ＰＡ変異株に関するＫ
m及びＫcat値は互いに類似していた。又、それらの値は
Ｂｏｏｓｅ，Ｊ．等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８：６３５
−６４３（１９８９）；及びＨｏｙｌａｅｒｔｓ，Ｍ．
等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２９１２−２
９１９（１９８２）により報告されている野生型ｔ−Ｐ
Ａに関する値とも類似している。
【００８８】図５及び表Ｘに示されたデ−タは（ｉ）ｔ
−ＰＡのアミノ酸２９６−３０２の欠失、及び（ｉｉ）
３０４位のＡｒｇのＳｅｒ又はＧｌｕへの置換が、プラ
スミノ−ゲンを活性化する、及び可溶性フィブリン フ
ラグメントにより賦活されるｔ−ＰＡの能力にほとんど
影響しないことを示している。
【００８９】アミノ酸２９６−３０２の欠失、及びＡｒ
ｇ304の置換がｔ−ＰＡとＰＡＩ−１の相互作用に影響
するかどうかを調べるために、それぞれ２５０ｐｇ
（３．８フェントモル）の野生型、及び変異株ｔ−ＰＡ
を０−４８０フェントモル(femtomoles)の部分的に精製
した組み替えＰＡＩ−１と共に２０分間予備的にインキ
ュベ−トした。その後上記の間接的色素澱粉法により残
留酵素活性を測定した。部分的精製組み替えＰＡＩ−１
は下記の実施例２の記載にしたがって得た。結果を図６
に示す。
【００９０】図６に示す通り、３種類の本発明のｔ−Ｐ
Ａ変異株のすべてが野生型ｔ−ＰＡと全く異なる挙動を
示した。すなわち野生型ｔ−ＰＡ（■）がＰＡＩ−１に
より完全に阻害される条件下で（２４フェントモルのＰ
ＡＩ−１）、欠失変異株ｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ296-302）
（・）はその活性の約９５％を保持していた。高濃度の
ＰＡＩ−１（４８０フェントモルのＰＡＩ−１）が存在
する場合に初めて変異株ｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ296-302）
（・）の酵素活性がかなりの減少を示した。２種類の置
換変異株、すなわちｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｓ）（〇）及
びｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｅ）（□）も程度は異なるがＰ
ＡＩ−１による阻害に対して抵抗性であった。又、図６
に示す通り、Ａｒｇの代わりにＳｅｒ又はＧｌｕを含む
２種類の置換変異株がその酵素活性の半−最適阻害に要
するＰＡＩ−１の量は野生型ｔ−ＰＡのそれぞれ４及び
２５倍であった。
【００９１】上記デ−タは、アミノ酸２９６−３０２及
び３０４がｔ−ＰＡの酵素機能に含まれておらず、同種
のセリン プロテア−ゼ インヒビタ−、ＰＡＩ−１と
酵素の相互作用に重要な役割を果たすことを示してい
る。モデルとしてトリプシンの構造を用いて、これらの
アミノ酸がセリン プロテア−ゼの活性部位の近辺、及
び触媒性３回回転軸からある程度離れた位置にあること
が予想される。したがってｔ−ＰＡとＰＡＩ−１の接触
面積はｔ−ＰＡとその本当の基質であるプラスミノ−ゲ
ンノ相互作用より広い。
【００９２】変異株ｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ296-302）もヒト
の血漿中に存在するセリン プロテア−ゼ インヒビタ
−の複合混合物に対して抵抗性を示すかどうかを調べる
ために、上記の原案において部分的精製組み替えＰＡＩ
−１をヒトの血漿の１：１００希釈液に置換した。この
条件下で野生型ｔ−ＰＡの活性の約７０％が阻害された
がｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ296-302）の活性は影響を受けなか
った。
【００９３】さらに野生型ｔ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ（Ｄｅ
ｌ296-302）を、希釈しないヒトの血漿と共にインキュ
ベ−トし、混合物を酸性化してｐＨ５．０とし、１２，
０００ｘｇで５分間遠心した。透明になった上澄みを希
釈し、残留ｔ−ＰＡ活性に関して分析すると変異ｔ−Ｐ
Ａ(Ｄｅｌ296-302）の場合９０％であり、野生型ｔ−Ｐ
Ａの場合２０％以下であった。上記の結果は変異ｔ−Ｐ
Ａ（Ｄｅｌ296-302）がヒトの血漿中に存在するセリン
プロテア−ゼ インヒビタ−の複合混合物に対して抵
抗性であることを示しており、したがって治療薬として
野生型ｔ−ＰＡより優れていると思われる。
【００９４】Ｇ．別のｔ−ＰＡ変異株 上節Ｆに示したデ−タはｔ−ＰＡの残基２９６−３０２
及び３０４が酵素、及び同起源の阻害剤、ＰＡＩ−１の
相互作用に重要な役割を果たすが、基質、Ｌｙｓ−プラ
スミノ−ゲンとの相互作用には影響しないことを示す。
トリプシンの周知の構造に基づいたｔ−ＰＡの触媒ドメ
インのモデリングは、残基２９６−３０２が酵素の活性
部位の端において表面ル−プを形成することを示唆して
いる。このル−プは正の高い電荷を帯びている。節Ａ及
びＦで議論した通り、この領域の効果がＰＡＩ−１との
静電的結合の形成に媒介されているという考えが本発明
において提出された。この仮定の試験のために、ル−プ
内の帯電した残基のそれぞれを変え、酵素のＰＡＩ−１
との相互作用に与えるその変異の効果を下記に従って評
価した。ル−プ中の正に帯電した残基がセリン プロテ
ア−ゼ インヒビタ−、ＰＡＩ−１の相補的領域と塩橋
を形成するならば、負に帯電した残基で置換すると、こ
れらの２個のタンパク質の会合の際に同一に帯電した残
基が並列するためｔ−ＰＡとＰＡＩ−１の相互作用は崩
壊すると予想される。
【００９５】特に、節Ｂに記載した要領で特定部位の突
然変異誘発を行い、Ｌｙｓ296，Ａｒｇ298、又はＡｒｇ
299がＧｌｕ残基により置換されたｔ−ＰＡ変異株をコ
−ドするｃＤＮＡの構築に使用した。これらの３個の残
基のすべてがＧｌｕに置換された、ｔ−ＰＡの３重変異
株をコ−ドするｃＤＮＡも構築した。さらに２個のｃＤ
ＮＡを製造した；ひとつはＨｉｓ297がＴｙｒ残基によ
り置換されたｔ−ＰＡ変異株をコ−ドし、他方はＰｒｏ
301がＧｌｙにより置換された酵素をコ−ドする。
【００９６】これらのｔ−ＰＡ変異株の構築に使用した
６種類の突然変異誘発プライマ−の配列は以下である： t-PA(K296->E):5′-ATCTTTGCCGAGCACAGGA-3′ t-PA(H297->Y):5′-TTTGCCAAGTACAGGAGGT-3′ t-PA(R298->E):5′-GCCAAGCACGAGAGGTCGCCC-3′ t-PA(R299->E):5′-AAGCACAGGGAGTCGCCCGG-3′ t-PA(P301->G):5′-AGGAGGTCGGGCGGAGAGCG-3′ t-PK(K296, R298, R299 -> E, E, E): 5′-GCCATCTTTGCCGAGCACGAGGAGTCGCCCGGAGA-3′ 変異酵素ｔ−ＰＡ（Ｋ296−＞Ｅ），ｔ−ＰＡ（Ｈ297−
＞Ｙ），ｔ−ＰＡ（Ｒ 298−＞Ｅ）及びｔ−ＰＡ（Ｐ301
−＞Ｇ）を上記の要領で遷移発現ベクタ−ｐＳＶＴ（Ｒ
Ｉ-）に連結した。
【００９７】変異酵素ｔ−ＰＡ（Ｋ296，Ｒ298，Ｒ299
−＞Ｅ，Ｅ，Ｅ）、及びｔ−ＰＡ（Ｒ299−＞Ｅ）をコ
−ドするｃＤＮＡを遷移発現ベクタ−ｐＳＴＥに連結し
た。ｐＳＴＥはｐＳＶＴ７の誘導体であり、ｐＳＴＶ７
の３５０ｂｐ ＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩプロモ−タ−
／オリジン フラグメントをＳＶ４０ ｃｓ１０８５の
プロモ−タ−／オリジン領域からの４１８ｂｐ Ｈｐａ
ＬＬ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントで置換することによ
り構築した（Ｄｉｍａｉｏ，Ｄ．等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，１４０：１２９−１４２（１９８０））。
【００９８】得られたプライマ−をｐＳＶＴ７（Ｒ
Ｉ-）／ｔ−ＰＡ(Ｋ296−＞Ｅ)，ｐＳＶＴ７（ＲＩ-）
／ｔ−ＰＡ（Ｈ297−＞Ｙ）；ｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ
−ＰＡ（Ｒ298−＞Ｅ）；ｐＳＴＥ７（ＲＩ-）／ｔ−Ｐ
Ａ（Ｒ299−＞Ｅ）；ｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ
（Ｒ301−＞Ｇ）；及びｐＳＴＥ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ
（Ｋ296，Ｒ298，Ｒ299−＞Ｅ，Ｅ，Ｅ）と称した。
【００９９】Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ−１（Ｈａｎａｈａ
ｎ，Ｄ．等，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１巻，Ｇｌｏｖ
ｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｉ．Ｒ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒ
ｄ，頁１０９−１３５（１９８５））を上記の変異プラ
スミドを用いて形質転換し、得られた株をそれぞれｐＳ
ＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ（Ｋ296−＞Ｅ）［ＤＨ−
１］，ｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ（Ｈ297−＞Ｙ）
［ＤＨ−１］；ｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ（Ｒ298
−＞Ｅ）［ＤＨ−１］；ｐＳＴＥ７（ＲＩ-）／ｔ−Ｐ
Ａ（Ｒ299−＞Ｅ）［ＤＨ−１］；ｐＳＶＴ７（ＲＩ-）
／ｔ−ＰＡ（Ｒ301−＞Ｇ）［ＤＨ−１］；及びｐＳＴ
Ｅ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ（Ｋ296，Ｒ298，Ｒ299−＞
Ｅ，Ｅ，Ｅ）［ＤＨ−１］と称した。正しいフラグメン
トの存在を、適した放射活性突然変異誘発オリゴヌクレ
オチドへのハイブリッド形成により確認し、フラグメン
トの配向を、適した突然変異誘発オリゴヌクレオチドを
プライマ−として使用した制限マッピング、及びＤＮＡ
配列決定により確認した。
【０１００】ｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ（Ｒ298−
＞Ｅ）［ＤＨ−１］；ｐＳＴＥ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ
（Ｒ299−＞Ｅ）［ＤＨ−１］；及びｐＳＴＥ７（Ｒ
Ｉ-）／ｔ−ＰＡ（Ｋ296，Ｒ298，Ｒ299−＞Ｅ，Ｅ，
Ｅ）［ＤＨ−１］をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにてそれぞれＡＴＣ
Ｃ番号６８１５７，６８１５４及び６８１５３として供
託した。
【０１０１】上記プラスミドＤＮＡはその後上記の要領
でＣＯＳ細胞のトランスフェクションに使用した。得ら
れた条件下の培地の希釈液（典型的には１：３００）、
及び免疫精製酵素の両方を用いて上記の要領でアッセイ
を行った。
【０１０２】次に飽和濃度のＤｅｓ−Ａ−フィブリノ−
ゲン（２５μｇ／ｍｌ）及び種々の濃度（０．０２−
０．１６μＭ）の基質、Ｌｙｓ−プラスミノ−ゲンの存
在下における種々の形態の酵素のアッセイにより野生
型、及び変異株ｔ−ＰＡのＫm及びＫcat値を決定した。
結果を下表ＸＩに示す。
【０１０３】 表ＸＩ 酵素 Ｋm（μＭ） Ｋcat（ｓ-1） 野生型ｔ−ＰＡ ０．０２４ ０．２２ ｔ−ＰＡ（Ｋ296−＞Ｅ） ０．０２６ ０．２２ ｔ−ＰＡ（Ｈ297−＞Ｙ） ０．０１７ ０．１４ ｔ−ＰＡ（Ｒ298−＞Ｅ） ０．０２７ ０．２４ ｔ−ＰＡ（Ｒ299−＞Ｅ） ０．０３３ ０．２６ ｔ−ＰＡ（Ｐ301−＞Ｇ） ０．０２７ ０．２４ ｔ−ＰＡ（Ｋ296，Ｒ298，Ｒ299−＞ Ｅ，Ｅ，Ｅ） ０．０２７ ０．２４ 上記の表ＸＩの示す通り、上記で議論したいずれの変異
もｔ−ＰＡとその基質との相互作用を変化させなかっ
た。
【０１０４】同様に図７に示したデ−タは、変異がｔ−
ＰＡとその正のエフェクタ−であるＤｅｓ−Ａ−フィブ
リノ−ゲンとの相互作用を変えなかったことを示してい
る。逆に図８に示したデ−タは野生型ｔ−ＰＡと変異ｔ
−ＰＡのいくつかの挙動における明確な差を示してい
る。特に３種類の変異株ｔ−ＰＡ、すなわちｔ−ＰＡ
（Ｒ298−＞Ｅ），ｔ−ＰＡ（Ｒ299−＞Ｅ）及びｔ−Ｐ
Ａ（Ｋ296，Ｒ298，Ｒ299−＞Ｅ，Ｅ，Ｅ）の場合、セ
ルピン、ＰＡＩ−１と正常に相互作用する能力が実質的
に変化した。特に三重変異株の挙動は顕著である；２０
０倍モル以上過剰のＰＡＩ−１と共に予備的インキュベ
−トを行った後でさえ活性の損失を示さない。これらの
発見はｔ−ＰＡの表面ル−プ、すなわち残基３９６−３
０２が特異的に同起源の阻害剤ＰＡＩ−１と相互作用す
るという提案を支持しており、この相互作用にＡｒｇ
298及びＡｒｇ299が含まれることを示唆している。これ
らの観察はｔ−ＰＡ、及びＰＡＩ−１の間の特異的相互
作用に静電的結合が含まれるという仮定を満足する。こ
れらの相互作用に含まれるｔ−ＰＡの残基はＡｒ
ｇ298，Ａｒｇ299及びＡｒｇ304である。
【０１０５】実施例２ＰＡＩ−１変異株 本実施例に記載する方法はセリン プロテア−ゼとして
ｔ−ＰＡを、及びセリン プロテア−ゼ インヒビタ−
としてＰＡＩ−１を使用する場合を対象としているが、
上記のようなキモトリプシン ス−パ−ファミリ−の他
のセリン プロテア−ゼ、及び上記のような他のセリン
プロテア−ゼ インヒビタ−を、本発明の精神及び範
囲から逸脱することなく本文の方法を用いて容易に使用
することができる。
【０１０６】Ａ．真核細胞におけるグリコシル化ＰＡＩ
−１の発現、精製、及びアッセイ ＰＡＩ−１をコ−ドする３．２ｋｂ及び２．２ｋｂ ｍ
ＲＮＡから誘導した２種類のｃＤＮＡクロ−ン（Ｎｙ，
Ｔ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８３：６７７６−６７８０（１９８６）；及びＰａ
ｎｎｅｋｏｅｋ，Ｈ．等，ＥＭＢＯ Ｊ．，５：２５３
９−２５４４（１９８６））を使用して哺乳類発現ベク
タ−中に全長のｃＤＮＡを構築した。第１のクロ−ン、
ラムダＰＡＩ−１は、ヒトの胎盤性ｃＤＮＡライブラリ
からスクリ−ニングにより得たｃＤＮＡの先端を切り取
ったバ−ジョンであり（Ｄｒ．Ｃａｒｏｌ Ｍｅｎｄｅ
ｌｓｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｗｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒ
ｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄａｌｌａｓ，Ｔ
Ｘより提供）ＰＡＩ−１の以下の８アミノ酸配列に対応
する合成オリゴヌクレオチドを有する（ＡＶＤＱＬＴＲ
Ｌ）（Ｎｙ，Ｔ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：６７７６−６７８０(１９８
６)；及びＰａｎｎｅｋｏｅｋ，Ｈ．等，ＥＭＢＯ
Ｊ．，５：２５３９−２５４４（１９８６））。Ｅｃｏ
ＲＩを用いた消化によりこのクロ−ンから放出されるＤ
ＮＡのフラグメントはＮｙ，Ｔ．等，Ｐｒｏｃ，Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：６７７６−６７
８０（１９８６）に報告されているＰＡＩ−１配列のヌ
クレオチド１４７−２０１３に対応した。このフラグメ
ントをプラスミドベクタ−ｐＵＣ １８(Ｙａｎｉｓｃｈ
−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．等，Ｇｅｎｅ，３３：１０３−１
１９（１９８５））にサブクロ−ニングし、組み替えプ
ラスミドｐＰＡＩ−１を得た。このプラスミドからの挿
入を、バクテリオファ−ジ ラムダ ｇｔｌｌに構築し
たヒトの内皮細胞ｃＤＮＡライブラリのスクリ−ニング
に使用した（Ｈｕｙｎｈ，Ｔ．等，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ，１巻，出版 Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｉ．Ｒ．
Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，頁４９−８８（１９８
５））。このようにして単離したｃＤＮＡ クロ−ンの
ひとつ、すなわちラムダ ＰＡＩ−１−１１Ａは、５’
末端に２個の余分なヌクレオチドが存在する以外既報の
（Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ，Ｈ．等，ＥＭＢＯ Ｊ．，５：
２５３９−２５４４（１９８６））ＰＡＩ−１ ｃＤＮ
Ａと同一配列の挿入を持つ。このクロ−ンの５’末端、
ヌクレオチド５２−１４７９から誘導したＥｃｏＲＩ−
ＢｇｌＩＩフラグメントをｐＰＡＩ−１の３’ＢｇｌＩ
Ｉ−ＥｃｏＲＩフラグメントに融合させ、ｐＰＡＩ−１
−ＲＢＲを得た。
【０１０７】哺乳類細胞におけるＰＡＩ−１の発現に使
用したＳＶ４０ベクタ−は以下の要領で構築した。ｐＰ
ＡＩ−１−ＲＢＲから放出されたＥｃｏＲＩフラグメン
トの末端にＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラ−ゼのクレノ
ウ フラグメントを満たし、合成ＸｂａＩ リンカ−に
連結し、プラスミドｐＳＶ／ｔ−ＰＡ３中のｔ−ＰＡフ
ラグメントの代わりに挿入し、ｐＳＶL−ＰＡＩ−１を
得た（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．等，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
Ｍｅｄ．，３：４５９−４８１（１９８６））。ＳＶL
−ＰＡＩ−１の株を製造し、Ｄｏｙｌｅ，Ｃ．等，Ｊ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０５：７０４−７１４（１９
８５）に記載の要領で増殖させた。
【０１０８】以前にＰａｎｎｅｋｏｅｋ，Ｈ．等，ＥＭ
ＢＯ Ｊ．，５：２５３９−２５４４（１９８６）及び
Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｄ．等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．７８：１６７３−１６８０（１９８６）に記載され
たＰＡＩ−１ クロ−ンはｐＰＡＩ−１−ＲＢＲにより
コ−ドされる配列と同一配列のＰＡＩ−１タンパク質を
コ−ドし、ＳＶL−ＰＡＩ−１の構築にｐＰＡＩ−１−
ＲＢＲの代わりに使用することができた。
【０１０９】ＣＶ−１シミアン細胞の単層を３７℃で成
長させ、ＳＶL−ＰＡＩ−１を注入した。２４時間後、
培地を血清を含まないダルベッコの培地（ＧＩＢＣＯ，
Ｉｎｃ．）に置換し、さらに４８時間インキュベ−ショ
ンを続けた。その後分泌されたＰＡＩ−１を含む上澄み
培地を０．４５ミクロンのフィルタ−（Ｎａｌｇｅ Ｃ
ｏ．）を通して濾過した。Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（Ｓ
ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、及び１．０Ｍ
のリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）緩衝液をそれぞれ
０．１％（ｖ／ｖ）、及び１０ｍＭの濃度まで加えた。
安定化した培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ
７．２）、１３５ｍＭのＮａＣｌ、７．０ｍＭのＫＣｌ
から成る緩衝液（後文では”ＰＢＳ”）を用いて１時間
当たり５０ｍｌの流量で平衡化したコンカナバリアン
Ａ−セファロ−ス ４Ｂのアフィニティ− カラム（充
填床容量１．０ｍｌ）に適用した。カラムを０．１％
（ｖ／ｖ）のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０を含むＰＢＳ、２
５容量、０．１％（ｖ／ｖ）のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ４
０、及び１．０ＭのＮａＣｌを含むＰＢＳ２５容量、及
び最後に２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
２）１０容量で連続的に洗浄した。結合ＰＡＩ−１は２
０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中の
０．５Ｍのアルファ−メチル−Ｄ−グルコシド（Ｓｉｇ
ｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）で特異的に溶離し
た。ＰＡＩ−１を含む留分（上記間接的色素澱粉法にお
いてＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．からのウロキナ−
ゼの阻害により分析して）をプ−ルした。その後Ｎｏｎ
ｉｄｅｔ Ｐ４０を０．１％（ｖ／ｖ）の濃度まで加
え、プ−ルした溶離物１ｍｌ当たり０．５７ｇのグアニ
ジン ヒドロクロリド（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）を加えた。このようにして得た部分的精製ＰＡＩ
−１を２０ｍＭのリン酸ナトリウムから成る緩衝液（ｐ
Ｈ７．２）、及び１０％（ｖ／ｖ）のグリセロ−ルに対
して透析し、使用まで−８０℃にてアリコ−トとして保
存した。
【０１１０】このようにして製造したＰＡＩ−１は４０
μｇ／ｍｌの全タンパク質（Ｂｉｏｒａｄ Ｉｎｃ．販
売によるＢｒａｄｆｏｒｄの試薬により分析）、及び１
２．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
の染色により分析して１５μｇ／ｍｌのＰＡＩ−１を含
んでいた。ウロキナ−ゼ（それ自身は3Ｈ−ジイソプロ
ピルフルオロホスフェ−ト（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｉｎｃ．からのＮＥＴ−０６５）を用
いた滴定により活性５２％）に対する滴定により、本文
の記載に従って製造したＰＡＩ−１の活性は１６．６％
であり、活性ＰＡＩ−１の濃度は４８ｎＭであることが
明らかになった。
【０１１１】Ｂ．突然変異誘発のためのＰＡＩ−１部位
の選択 ＰＡＩ−１の残基Ｇｌｕ350及びＧｌｕ351がｔ−ＰＡと
相互作用するという仮定を試験するため、特定オリゴヌ
クレオチドの突然変異誘発を使用して下表ＸＩＩに示す
ＰＡＩ−１の２種類の変異株を形成した。
【０１１２】 表ＸＩＩ ３４６・ ・３５５ 野生型ＰＡＩ−１ ＲＭＡＰＥＥＩＩＭＤ ・ ＰＡＩ−１（Ｅ350−＞Ｒ） ＲＭＡＰＲＥＩＩＭＤ ・ ＰＡＩ−１（Ｅ351−＞Ｒ） ＲＭＡＰＥＲＩＩＭＤ 変異株ＰＡＩ−１（Ｅ350−＞Ｒ）、及びＰＡＩ−１
（Ｅ351−＞Ｒ）はそれぞれＧｌｕ350及びＧｌｕ351の
Ａｒｇへの置換を含み、負に帯電したＧｌｕ残基を正に
帯電したＡｒｇ残基に代え、ｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｅ）
に存在する負に帯電したＧｌｕ残基との有力な相互作用
を促進するために選択的に選んだ。置換がｔ−ＰＡの残
基Ａｒｇ304に導入された特異的変異と相補的であれ
ば、Ｇｌｕ350をｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｅ）変異株などと
の相互作用が強化されたＰＡＩ−１を形成する他のいろ
いろな置換基に、本発明の精神及び範囲から逸脱するこ
となく置換することができた。
【０１１３】Ｃ．ＰＡＩ−１のオリゴヌクレオチド−媒
介突然変異誘発 第１に、メチオニル−ＰＡＩ−１を直接発現し、１方で
発現ベクタ−からのシグナル配列及びｃＤＮＡの３’非
翻訳領域を除去するための、プラスミド ｐＰＡＩＳＴ
７と称するＰＡＩ−１発現プラスミドの構築が必要であ
った。この達成のため、合成ＤＮＡリンカ−を使用して
ＰＡＩ−１コ−ド配列の両末端の再構築、及び成熟ＰＡ
Ｉ−１の第１残基をコ−ドするトリプレットの直前にＡ
ＴＧタンパク質合成開始コドンの導入を行った。さらに
プラスミドｐＢＲ３２２へのｃＤＮＡコ−ド領域の挿入
を容易にするため、ＰＡＩ−１ ｃＤＮＡフラグメント
のそれぞれ５’及び３’末端に、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎ
ｄＩＩＩ制限エンドヌクレア−ゼ認識部位を形成するリ
ンカ−を設計した。
【０１１４】特にＡｐａＬｉ及びＰｆｌＭＩを用いてｐ
ＰＡＩ−１−ＲＢＲを消化することによりプラスミドｐ
ＰＡＩＳＴ７を得た。得られたＰＡＩ−１の残基１のた
めの２ｂｐのコドン、及び３７９残基タンパク質の残基
２−３７６のための全コ−ド配列を含む１１２７ｂｐフ
ラグメントをゲル電気泳動により精製した。次に合成リ
ンカ−（５’末端にて１０ｂｐ、及び３’末端にて１３
ｂｐ）を１１２７ｂｐＡｐａＬＩ、及びＰｆｌＭＩ Ｄ
ＮＡフラグメントと連結し、ＥｃｏＲＬ及びＨｉｎｄＩ
ＩＩを用いて消化し、１１４６ｂｐ ＥｃｏＲＩ−及び
ＨｉｎｄＩＩＩ−消化ＤＮＡフラグメントをゲル電気泳
動により単離した。その後このフラグメントをＥｃｏＲ
Ｉ−及びＨｉｎｄＩＩＩ−消化ｐＢＲ３２２にクロ−ニ
ングした。
【０１１５】発現プラスミドの構築の開始のために、サ
ブクロ−ンをＥｃｏＲＩで消化し、直鎖プラスミドを細
菌のアルカリホスファタ−ゼを用いて脱ホスホリル化し
た。その後ｔｒｐプロモ−タ−、及びリボソ−ム結合部
位を含むｐＣ５Ａ−４８からの３６０ｂｐ ＥｃｏＲＩ
ＤＮＡフラグメント（Ｆｒａｎｋｅ，Ａ．等，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１６２：６５３−６６８（１９
８８））を用いて、二フラグメントを連結することによ
りＰＡＩ−１発現プラスミドを構築した。次に、得られ
たプラスミドを用い、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第１版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ（１９８２）に記載の要領でＥ．ｃｏｌｉ
の形質転換を行った。得られた形質転換物のプラスミド
ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩを用いた制限分析によりｔｒｐ
プロモ−タ−フラグメントの存在、及び配向に関してス
クリ−ニングを行った。多くの形質転換物がｔｒｐプロ
モ−タ−に隣接して阻害剤の直接の発現に必要な立体配
置でＰＡＩ−１遺伝子を持つプラスミドを含むと同定さ
れた。それらのプラスミドのひとつをｐＰＡＩＳＴ７と
称した。
【０１１６】アミノ酸残基Ｖａｌ284からＰｒｏ379まで
をコ−ドするＰＡＩ−１のヌクレオチド配列を含むプラ
スミドｐＰＡＩＳＴ７のＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントをＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化複製型Ｍ１３
ｍｐ１８（図９を参照）に連結した。連結ＤＮＡをＥ．
ｃｏｌｉ株ＴＧ−１にトランスフェクトした。組み替え
バクテリオファ−ジにより形成された白色プラ−クを採
取し、適した２９０塩基対ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフ
ラグメントの存在をサザン ハイブリッド形成、制限マ
ッピング、及びＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１１７】２９０塩基対ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフ
ラグメントにおける変異をｔ−ＰＡについての上記の記
載の要領で５’−ホスホリル化合成突然変異誘発オリゴ
ヌクレオチドプライマ−を用いて導入した（図９を参
照）。これらのＰＡＩ−１変異株の構築に使用した２個
の突然変異誘発プライマ−の配列は以下である： PAI-1(E350->R):5′TGATGATCTCTCTTGGGGC 3′ PAI-1(E351->R):5′CCATGATGATTCTCTCGGGG 3′ 得られたＰＡＩ−１ ＤＮＡの変異株ＳａｌＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩフラグメントの配列を完全に決定した。立証さ
れた変異株のＤＮＡの二重鎖複製型を単離し、変異２９
０塩基対ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをＳａ
ｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化、及び６．０％（ｗ／ｖ）の
非変性ポリアクリルアミドゲルを通した電気泳動により
単離した。下記に詳細に記載する通り、変異を含むこれ
らのフラグメントを使用し、問題のＰＡＩ−１変異株を
コ−ドするＰＡＩ−１ ｃＤＮＡのバ−ジョンを再構築
した。
【０１１８】Ｄ．変異株ＰＡＩ−１のための発現ベクタ
−の構築 プラスミド ｐＰＡＩＳＴ７ＨＳ（ヌクレオチド対１に
おけるＨｉｎｄＩＩＩ部位、及びヌクレオチド対２１０
６におけるＳａｌＩ部位の欠落したプラスミドｐＰＡＩ
ＳＴ７の誘導体であり、ＰＡＩ−１ ｃＤＮＡコ−ド配
列における変異ＳａｌＩのＨｉｎｄＩＩＩフラグメント
への交換を容易にするために構築された）におけるＰＡ
Ｉ−１の変異株を以下の要領で構築した： ＰＡＩ−１ ｃＤＮＡの中心２９０塩基対のＳａｌＩか
らＨｉｎｄＩＩＩまでのフラグメントを、ＳａｌＩ及び
ＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化、及び１．０％（ｗ／ｖ）
アガロ−スゲル電気泳動によりプラスミドｐＰＡＩＳＴ
７ＨＳから除去した。その後ベクタ−ＤＮＡの残留直鎖
フラグメントを特定オリゴヌクレオチドの突然変異誘発
で製造した上記の２９０塩基対ＳａｌＩからＨｉｎｄＩ
ＩＩフラグメントの変異株バ−ジョンに連結した（図９
を参照）。得られたプラスミドをｐＰＡＩＳＴ７ＨＳ
（Ｅ350−＞Ｒ）及びｐＰＡＩＳＴ７ＨＳ（Ｅ351−＞
Ｒ）と称した。
【０１１９】Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ−１（Ｈａｎａｈａ
ｎ，Ｄ．等，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，１巻，出版 Ｇ
ｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｉ．Ｒ．Ｌ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘ
ｆｏｒｄ，頁１０９−１３５（１９８５））を上記変異
プラスミドを用いて形質転換し、得られた株をそれぞれ
ｐＰＡＩＳＴ７ＨＳ［ＤＨ−１］；ｐＰＡＩＳＴ７ＨＳ
（Ｅ350−＞Ｒ）［ＤＨ−１］；及びｐＰＡＩＳＴ７Ｈ
Ｓ（Ｅ351−＞Ｒ）［ＤＨ−１］と称した。Ｅ．ｃｏｌ
ｉ株ＴＧ−１（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．，Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｅｎ
ｇｌａｎｄ（１９８４））を上記変異プラスミドを用い
て形質転換し、得られた株をそれぞれｐＰＡＩＳＴ７Ｈ
Ｓ［ＴＧ−１］；ｐＰＡＩＳＴ７ＨＳ（Ｅ350−＞Ｒ）
［ＴＧ−１］；及びｐＰＡＩＳＴ７ＨＳ（Ｅ351−＞
Ｒ）［ＴＧ−１］と称した。正しいフラグメントの存在
を適した放射標識突然変異誘発オリゴヌクレオチドへの
ハイブリッド形成、及び核酸配列決定により確認した。
ｐＰＡＩＳＴ７ＨＳ（Ｅ350−＞Ｒ）［ＤＨ−１］；
及びｐＰＡＩＳＴ７ＨＳ（Ｅ351−＞Ｒ）［ＤＨ−１］
をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎにてそれぞれＡＴＣＣ番号６８１５５
及び６８１５６として供託した。
【０１２０】Ｅ．野生型、及び変異株ＰＡＩ−１の発
現、抽出、及びアッセイ Ｅ ．ｃｏｌｉ株ｐＰＡＩＳＴ７ＨＳ［ＴＧ−１］，ｐＰ
ＡＩＳＴ７ＨＳ（Ｅ35 0−＞Ｒ）［ＴＧ−１］，及びｐ
ＰＡＩＳＴ７ＨＳ（Ｅ351−＞Ｒ）［ＴＧ−１］を、ル
リア−ベルタニ ブイヨン中で３７℃にて飽和濃度まで
終夜成育した。５０μｌの培養物を使用して、１リット
ル当たり６．０ｇのＮａ2ＨＰＯ4，３．０ｇのＫＨ2Ｐ
Ｏ4，０．５ｇのＮａＣｌ，０．５ｇのＮｇＳＯ4・７Ｈ
2Ｏ，１．０ｇのＮＨ4Ｃｌ，５．０ｇのカサミノ酸、１
０．０ｇのグルコ−ス、１０．０ｍｌのグリセロ−ル、
１．０ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、及び２５ｍｇのアンピ
シリンを含む修正Ｍ９培地（ｐＨ７．４）５０ｍｌに接
種した。２５０ｍｌのア−レンメイヤ−フラスコ中、３
７℃にて培養細菌を２２時間成育した。抽出細胞を以下
の要領で培養物から得た。
【０１２１】Ｅ．ｃｏｌｉを遠心によりペレット化し、
２０ｍｌの冷５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
及び１．０ｍＭのＥＤＴＡ中で遠心により洗浄し、氷上
の３．６ｍｌの同緩衝液中に再懸濁した。１ｍｌ当たり
１０ｍｇのリソチ−ム０．４ｍｌを添加して２０分間、
０．１ｍｌの１０％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４
０を添加して１０分間、及び０．２ｍｌの５．０Ｍ Ｎ
ａＣｌを添加して１０分間抽出を行った。聴音器(sonif
ier)／細胞切断器のミクロチップを５０％使用サイク
ル、及び設定７（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｃ Ｐｏｗ
ｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ）で使用して細胞を短く切断し、
粘度を下げ、４℃にて３０分間１５，０００ｘｇの遠心
を行った。透明な溶菌体に１０％（ｖ／ｖ）までグリセ
ロ−ルを加え、ＰＡＩ−１を含む抽出物を使用まで−８
０℃にてアリコ−トとして保存した。
【０１２２】哺乳類細胞に発現したＰＡＩ−１に関して
上記に記載した要領でウロキナ−ゼを用いて２４℃にて
３時間インキュベ−トすることにより、抽出物を活性Ｐ
ＡＩ−１に関して滴定した。野生型ＰＡＩ−１、ＰＡＩ
−１（Ｅ350−＞Ｒ）、及びＰＡＩ−１（Ｅ351−＞Ｒ）
の抽出物はそれぞれ８０３ｎＭ、５９３ｎＭ、及び１６
２ｎＭの活性ＰＡＩ−１を含んでいた。
【０１２３】野生型、及び変異株ｔ−ＰＡと野生型、及
び変異株ＰＡＩ−１の相互作用の速度に関する速度論的
測定を、０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び０．１％（ｖ／ｖ）
のツイ−ン２０を含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ７．４）中、２４℃にて行った。上記のｔ−ＰＡ
に関する間接的色素澱粉法を用いて残留酵素活性を時間
の関数として決定した。ｔ−ＰＡに対して過剰のＰＡＩ
−１の偽−１次条件下で、時間に対する残留ｔ−ＰＡ活
性の直線状片対数プロットの傾きから各阻害剤濃度に関
して半減期（ｔ1/2）を決定した。見掛けの速度定数
（ｋapp＝０．６９３／ｔ1/2）を阻害剤濃度で割って速
度定数、ｋ1を算出した。
【０１２４】６０ｐＭのｔ−ＰＡの阻害の速度を、偽−
１次条件下で０．６−１００ｎＭの範囲の阻害剤濃度に
て研究した。ｔ−ＰＡ−ＰＡＩ−１混合物をマイクロタ
イタ−プレ−トウェル中、２４℃にて種々の時間（０−
３０分）予備的にインキュベ−トし、その後Ｌｙｓ−プ
ラスミノ−ゲン、スペクトロザイム ＰＬ、及びＤｅｓ
−Ａ−フィブリノ−ゲンをそれぞれ最終濃度３００ｎ
Ｍ，０．４ｎＭ及び１２．５μｇ／ｍｌまで添加した。
基質の添加後、マイクロタイタ−プレ−トを３７℃にて
インキュベ−トし、４０５ｎｍにおける吸収を２次間追
跡して残留ｔ−ＰＡ活性を決定した。
【０１２５】野生型、及び変異株ＰＡＩ−１による野生
型、及び変異株ｔ−ＰＡの阻害の最高速度定数（Ｍ-1ｓ
-1）を下表ＸＩＩＩに示す。
【０１２６】 表ＸＩＩＩ 野生型 ｔ−ＰＡ ｔ−ＰＡ ｔ−ＰＡ （Ｒ304−＞Ｓ） （Ｒ304−＞Ｅ） 野生型ＰＡＩ−１ １ｘ１０6 ３ｘ１０5 １ｘ１０4 ＰＡＩ−１ （Ｅ350−＞Ｒ） １ｘ１０6 １ｘ１０6 １ｘ１０6 ＰＡＩ−１ （Ｅ351−＞Ｒ） ３ｘ１０5 １ｘ１０5 １ｘ１０5 上記の表ＸＩＩＩに示す通り、ＰＡＩ−１（Ｅ350−＞
Ｒ）及びＰＡＩ−１（Ｅ３５１−＞Ｒ）の両方とも、野
生型ＰＡＩ−１と比較してｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｅ）と
の相互作用の速度定数が増加しており、変異によりセリ
ン プロテア−ゼインヒビタ−−抵抗性ｔ−ＰＡ（Ｒ
304−＞Ｅ）の阻害に関するＰＡＩ−１の能力が復活し
たことを証明している。 本発明を特別な具体化を参照
して詳細に説明したが、種々の変化及び修正が本発明の
精神、及び範囲から逸脱することなく可能であることが
同業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】キモトリプシン ス−パ−ファミリ−の種々の
セリン プロテア−ゼの配列の比較を示す。配列は、保
持されたアミノ酸の重複が示されるように並べた。トリ
プシン上の数字はプロテイン デ−タ バンクのＰＤＢ
３ｐｔｐ．ｅｎｔ エントリ−で使用されている番号付
による。ｔ−ＰＡ上の数字は成熟ｔ−ＰＡ分子における
アミノ酸による。
【図２】セリン プロテア−ゼ インヒビタ−のセルピ
ン ファミリ−の種々のメンバ−の配列の比較を示す。
配列は保持されたアミノ酸の重複がわかるように並べ
た。アルファ−１−アンチトリプシン下の数字、及びＰ
ＡＩ−１上の数字は成熟分子におけるアミノ酸残基によ
る。
【図３】セリン プロテア−ゼ インヒビタ−のセルピ
ン ファミリ−の種々のメンバ−の配列の比較を示す。
配列は保持されたアミノ酸の重複がわかるように並べ
た。アルファ−１−アンチトリプシン下の数字、及びＰ
ＡＩ−１上の数字は成熟分子におけるアミノ酸残基によ
る。
【図４】野生型ｔ−ＰＡ、及び本発明のｔ−ＰＡのセル
ピン−抵抗性変異株の変異、及び発現に用いられたベク
タ−の構築を図示したものである。
【図５】野生型ｔ−ＰＡ及びｔ−ＰＡのセルピン−抵抗
性変異株の活性の間接的色素澱粉法における比較を示
す。図５で■は野生型ｔ−ＰＡを示し、〇はｔ−ＰＡ
（Ｒ 304−＞Ｓ）を示し、□はｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｅ）
を示し、・はｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ296-302）を示す。
【図６】間接的色素澱粉法による野生型ｔ−ＰＡ、及び
ｔ−ＰＡのセルピン−抵抗性変異株の活性に対するＰＡ
Ｉ−１の効果を示す。図６において、■は野生型ｔ−Ｐ
Ａを示し、〇はｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｓ）を示し、□は
ｔ−ＰＡ（Ｒ304−＞Ｅ）を示し、・はｔ−ＰＡ（Ｄｅ
ｌ296-302）を示す。
【図７】間接的色素澱粉法による野生型ｔ−ＰＡ、及び
ｔ−ＰＡのセルピン−抵抗性変異株の活性の比較を示
す。図７において、□はｔ−ＰＡ（Ｈ297−＞Ｙ）を示
し、・は野生型ｔ−ＰＡを示し、＋はｔ−ＰＡ（Ｋ296
−＞Ｅ）を示し、■は三重変異株ｔ−ＰＡ（Ｋ296，Ｒ
298，Ｒ299−＞Ｅ，Ｅ，Ｅ）を示し、▲はｔ−ＰＡ（Ｒ
299−＞Ｅ）を示し、△はｔ−ＰＡ（Ｒ298−＞Ｅ）を示
し、〇はｔ−ＰＡ（Ｐ301−＞Ｇ）を示す。
【図８】間接的色素澱粉法による野生型ｔ−ＰＡ、及び
ｔ−ＰＡのセルピン−抵抗性変異株の活性に対するＰＡ
Ｉ−１の効果を示す。図８において、□はｔ−ＰＡ（Ｈ
297−＞Ｙ）を示し、・は野生型ｔ−ＰＡを示し、＋は
ｔ−ＰＡ＝Ｋ296−＞Ｅ）を示し、■はｔ−ＰＡ
（Ｋ296，Ｒ298，Ｒ299−＞Ｅ，Ｅ，Ｅ）を示し、▲は
ｔ−ＰＡ（Ｒ299−＞Ｅ）を示し、△はｔ−ＰＡ（Ｒ298
−＞Ｅ）を示し、〇はｔ−ＰＡ（Ｐ301−＞Ｇ）を示
す。
【図９】野生型ＰＡＩ−１、及び本発明のＰＡＩ−１の
変異株の変異、及び発現に使用したベクタ−の構築を図
示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８１５４ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８１５５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８１５６ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８１５７ (72)発明者 エリザベス・ジエイ・ゴールドスミス アメリカ合衆国テキサス州75209ダラ ス・チエロキートレイル4626 (72)発明者 マリイジエイン・エイチ・ゲシング アメリカ合衆国テキサス州75229ダラ ス・アービンシモンズドライブ4320 (72)発明者 ロバート・デイ・ジエラード アメリカ合衆国テキサス州75252ダラ ス・フエザーウツドドライブ18620 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12N 9/64 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｔ−ＰＡのセリンプロテアーゼインヒビ
    ターによる阻害に対して抵抗性のｔ−ＰＡ変異体であっ
    て、２９６〜３０２位置のアミノ酸が欠失しているｔ−
    ＰＡであるｔ−ＰＡ変異体。
  2. 【請求項２】 ｔ−ＰＡのセリンプロテアーゼインヒビ
    ターによる阻害に対して抵抗性のｔ−ＰＡ変異体であっ
    て、２９６〜３０２位置のアミノ酸が欠失しているｔ−
    ＰＡであるｔ−ＰＡ変異体をコードしている遺伝子。
  3. 【請求項３】 （Ａ）２９６〜３０２位置のアミノ酸が
    欠失しているｔ−ＰＡをコードしている遺伝子を含んで
    成るＤＮＡにより形質転換された宿主細胞を培養し、そ
    して （Ｂ）生ずる変異体を単離することを特徴とする、ｔ−
    ＰＡのセリンプロテアーゼインヒビターによる阻害に対
    して抵抗性のｔ−ＰＡ変異体を得る方法。
  4. 【請求項４】 （Ａ）２９６〜３０２位置のアミノ酸が
    欠失しているｔ−ＰＡを得、そして （Ｂ）ｔ−ＰＡのセリンプロテアーゼインヒビターによ
    る阻害に対して抵抗性の変異体をスクリーニングする、
    ことを特徴とする、ｔ−ＰＡのセリンプロテアーゼイン
    ヒビターによる阻害に対して抵抗性のｔ−ＰＡ変異体を
    提供する方法。
  5. 【請求項５】 ｔ−ＰＡの２９６〜３０２位置のアミノ
    酸を欠失させることを特徴とする、ｔ−ＰＡのセリンプ
    ロテアーゼインヒビターによる阻害に対して抵抗性のｔ
    −ＰＡ変異体を得る方法。
  6. 【請求項６】 ＡＴＣＣ寄託番号６７８９５を有し且つ
    ２９６〜３０２位置のアミノ酸該欠失しているｔ−ＰＡ
    をコードするｐＳＶＴ７（ＲＩ-）／ｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ
    296-302）［ＤＨ−１］。
  7. 【請求項７】 ２９６〜３０２位置のアミノ酸が欠失し
    ているｔ−ＰＡをコードするプラスミドｐＳＶＴ７（Ｒ
    Ｉ-）／ｔ−ＰＡ（Ｄｅｌ296-302）。
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