JP3192419B2 - 同起源インヒビターによる阻害に対して抵抗性のキモトリプシンスーパーファミリーのセリンプロテアーゼ変異株及びそれをコードする遺伝子、ならびにセリンプロテアーゼインヒビター変異株及びそれをコードする遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 関連出願へのクロスリファレンス これは1989年３月６日出願のU.S.特許出願番号07/31
9,212の一部継属出願である1989年11月８日出願のU.S.
特許出願番号07/434,748の一部継属出願である。

発明の分野 本発明は同起源インヒビターによる阻害に対して抵抗
性であるキモトリプシン スーパーファミリーのセリン
プロテアーゼ変異株、及びそれをコードする遺伝子に
関する。本発明は又、本発明のセリン プロテアーゼ変
異株を阻害するセリン プロテアーゼ インヒビター変
異株、及びそれをコードする遺伝子に関する。セリン
プロテアーゼ変異株、及びセリン プロテアーゼ イン
ヒビター変異株は、例えば薬剤として有用である。

発明の背景 I.セリン プロテアーゼ セリン プロテアーゼ（E.C.3.4.21）はペプチド結合
分裂における求核試薬としてセリンを使用するエンドペ
プチダーゼのサブ−サブクラスである（Barrett,A.J.,
於:Proteinase Inhibitors,出版 Barrett,A.J.等,Els
evier,Amsterdam,3−22頁；及びHartley,B.S.,Ann.Rev.
Biochem.,29:45−72（1969））。

セリン プロテアーゼは文献により周知であり、セリ
ン プロテアーゼの２つのスーパーファミリー、すなわ
ちキモトリプシン スーパーファミリー、及びストレプ
トミセス ズブチリシン スーパーファミリーはこれま
でに観察されていた（Barrett.A.J.,於:Proteinase In
hibitors,出版 barrett,A.J.等,Elsevier,Amsterdam,3
−22頁（1986）；及びJames,M.N.G.,於:Proteolysis a
nd Physiological Regulation,出版 Ribbons,D.W.
等,Academic Press,New York,125−142頁（197
6））。

キモトリプシン スーパーファミリーのセリン プロ
テアーゼの例には組織−型プラスミノーゲン活性化因子
（下文では“ｔ−PA"）、トリプシン トリプシン−様
プロテアーゼ キモトリプシン、プラスミン、エラスタ
ーゼ、ウロキナーゼ（又は尿−型プラスミノーゲン活性
化因子（下文ではｕ−PA"）、アクロシン、活性化プロ
テインＣ、Clエステラーゼ、カテプシンＧ、チマーゼ、
ならびにカリクレイン、トロンビン及び因子VII a,IX
a,X a,XI a及びXII aを含む血液凝固カスケードのプロ
テアーゼが含まれる（Barrett.A.J.,於:Proteinase In
hibitors,出版 Barrett,A.J.等,Elsevier,Amsterdam,3
−22頁（1986）;Strassburger,W.等,FEBS Lett.,157:2
19−223（1983）;Dayhoff,M.O.,Atlas of Protein S
equence and Structure,5巻,National Biomedica1
Research Foundation,Silver Spring,Maryland（197
2）；及びRosenberg,R.D.等,Hosp.Rrac.,21:131−137
（1986））。

ｔ−PA、プラスミン、ｕ−PA、及び血液凝固カスケー
ドのプロテアーゼを含むキモトリプシン スーパーファ
ミリーのセリン プロテアーゼのいくつかは巨大分子で
あり、セリン プロテアーゼ触媒ドメインの他にその活
性の調節に一部関与する構造ドメインを含む（Barrett.
A.J.,於:Proteinase Inhibitors,出版 Barrett,A.J.
等,Elsevier,Amsterdam,3−22頁（1986）;Garard,R.D.
等,Mol.Biol.Med.,３:449−457（1986）；及びBlasi,F.
等，於:Human Genes and Diseases,出版 Blasi,F.
等,John Wiley ＆ Sons,Ltd.,377−414頁（198
6））。

キモトリプシン スーパーファミリーのすべてのセリ
ン プロテアーゼの触媒ドメインは配列相同性、及び構
造相同性の両方を有する。配列相同性は以下： （ｉ）特徴的活性化部位残基（例えばトリプシンの場合
Ser₁₉₅,His₅₇,及びAsp₁₀₂）； （ii）オキシアニオン ホール（例えばトリプシンの場
合Gly₁₉₃,Asp₁₉₄）；及び （iii）構造中にジスルフィド架橋を形成するシステイ
ン残基の全部の保持を含む（Hartley,B.S.,Symp.Soc.Ge
n.Microbiol.,24:152−182（1974））。

構造相同性は以下： （ｉ）２個のグリーク鍵構造から成る共通折りたたみ
（Richardson,J.,Adv.Prot.Chem.,34:167−339（198
1））； （ii）触媒残基の共通の配置；及び （iii）分子のコア中の構造の詳細な保持（Stroud,R.
M.,Sci.Am.,231:24−88（1974））を含む。

キモトリプシン スーパーファミリーのメンバーの配
列を比較すると触媒ドメイン内のアミノ酸の挿入、又は
欠失の存在が明らかになる（例えば図１を参照）。すべ
ての場合、これらの挿入又は欠失は折りたたまれた分子
の表面にあり、従って分子の基本的構造に影響しない
（Strassburger,W.等,FEBS Lett.,157:219−223（198
3））。

II.セリン プロテアーゼ インヒビター セリン プロテアーゼ インヒビターは文献により周
知であり、以下の科（ファミリー）に分けられる：
（ｉ）塩基性プロテアーゼ インヒビターとしても知ら
れる牛すい臓トリプシン インヒビター（Kunitz）ファ
ミリー（Ketcham,L.K.等，於:Atlas of Protein Seq
uence and Structure,出版 Dayhoff,M.O.,131−143
頁（1978）（下文では“BPTI"）、（ii）Kazalファミリ
ー、（iii）ストレプトミセス ズブチリシンインヒビ
ターファミリー（下文では“SSI"）、（iv）セルピン
ファミリー、（ｖ）大豆トリプシン インヒビター（Ku
nitz）ファミリー、（vi）ポテト インヒビターファミ
リー、及び（vii）ボーマン−バーク ファミリー（Las
kowski,M.等,Ann.Rev.Biochem.,49:593−626（1980）;R
ead.R.J.等，於:Proteinase Inhibitors,出版 Barret
t,A.J.等,Elsevier,Amsterdam,301−336頁（1986）；及
びLaskowski,M.等,Cold Spring Harbor Symp.Quant.
Biol.,LII:545−553（1987））。

BPTI、Kazal、SSI、大豆トリプシン、及びポテト イ
ンヒビターファミリーのメンバーを含む多くの完全な形
のインヒビター、及びセルピン アルファ−１−アンチ
トリプシンの分裂形に関して結晶学的データが得られる
（Read,R.J.等，於:Proteinase Inhibitors,出版 Bar
rett,A.J.等,Elsevier,Amsterdam,301−336頁（198
6））。これらのセリン プロテアーゼ インヒビター
は大きさ及び配列が膨大なタンパク質であるにもかかわ
らず、これまでに研究された完全な形のインヒビターは
すべて分子の表面から伸びる特徴的なループを共通して
有しており、それは同起源のセリン プロテアーゼの活
性化部位に対する認識配列を含む（Levin,E.G.等,Proc.
Natl.Acad.sci.USA,80:6804−6808（1983））。異なる
セリン プロテアーゼ インヒビターのループが構造的
に類似していることは驚くべきことである（Papamokos,
E.等,J.Mol.Biol.,158:515−537（1982））。インヒビ
ターのKaZalファミリー及びストレプトミセス ズブチ
リシン ファミリーはいくらか構造及び配列に類似性が
あるが、一般に異なるファミリーのセリン プロテアー
ゼ インヒビターは活性化部位ループ以外に構造的関連
性はない。

セリン プロテアーゼ インヒビターの多くは広範囲
の特異性を持ち、血液凝固セリン プロテアーゼを含む
プロテアーゼのキモトリプシン スーパーファミリー、
及びセリン プロテアーゼのストレプトミセス ズブチ
リシン スーパーファミリーの両方を阻害することがで
きる（Laskowski,M.等,Ann.Rev.Biochem.,49:593−626
（1980））。各インヒビターの特異性はセリン プロテ
アーゼによるインヒビターの潜在分裂の部位への直接の
アミノ末端であるアミノ酸の同定によりまず決定すると
思われる。P₁部位残基として知られるこのアミノ酸はセ
リン プロテアーゼの活性部位内のセリンとアシル結合
を形成すると思われる（Laskowski,M.等,Ann.Rev.Bioch
em.,49:593−626（1980））。

A.BPTIファミリー BPTIファミリーに属するセリン プロテアーゼ イン
ヒビターには、BPTI、ヘビ毒インヒビター、インターア
ルファ、インヒビター、及びA4アミロイド前駆体A4695
が含まれる（Laskowski,M.等,Ann.Rev.Biochem.,49:593
−626（1980）;Read,R.J.等，於:Proteinase Inhibito
rs,出版 Barret,A.J.等,Elsevier,Amasterdam,301−33
6頁（1986）；及びPonte,P.等,Nature,331:525−527（1
988））。セリン プロテアーゼ、及びそれらと同起源
のBPTIファミリーインヒビターの例を下表Ｉに挙げる。

B.Kazalファミリー Kazalファミリーに属するセリン プロテアーゼ イ
ンヒビターには、すい臓分泌インヒビター、オボムコイ
ド、多び精奨アクロシン インヒビターが含まれる（La
skowski,M.等,Ann.Rev.Biochem.,49:593−626（1980）;
Read,R.J.等，於:Proteinase Inhibitors,出版 Barre
tt,A.J.等,Elsevier,Amsterdam,301−336頁（1986）；
及びLaskowski,M.等,Cold Spring Harbor Symp.Quan
t,Biol.,LII:545−553（1987））。セリン プロテアー
ゼ、及びそれらと同起源のKazalファミリーインヒビタ
ーの例を下表IIに挙げる。

C.ストレプトミセス ズブチリシン インヒビター ストレプトミセス ズブチリシン インヒビター フ
ァミリーに属するセリン プロテアーゼ インヒビター
にはストレプトミセス アルボグリセオルスから得られ
るインヒビター、及びプラスミノストレプチンが含まれ
る（Laskowski,M.等,Ann.Rev.Biochem.,49:593−626（1
980））。セリン プロテアーゼ及びそれらと同起源の
ストレプトミセス ズブチリシン クラスのインヒビタ
ーの例を下表IIIに挙げる。

D.セルピン ファミリー セルピン ファミリーに属するセリン プロテアーゼ
インヒビターにはプラスミノーゲン活性化因子インヒ
ビターPAI−1,PAI−２及びPAI−３、Clエステラーゼ
インヒビター、アルファ−２−アンチプラスミン、コン
トラプシン、アルファ−１−アンチトリプシン、アンチ
トロンビン III、プロテアーゼ ネクシン Ｉ、アル
ファ−１−アンチキモトリプシン、プロテインＣインヒ
ビター、ヘパリン補因子 II、及び成長ホルモン調節タ
ンパク質が含まれる（Carrel,R.W.等,Cold Spring Ha
rbor Symp.Quant.Biol.,52:527−535（1987）;Sommer,
J.等,Biochem.,26:6407−6410（1987）;Suzuki,K.等,J.
Biol.Chem.,262:611−616（1987）；及びStump,D.C.等,
J.Biol.Chem.,261:12759−12766（1986））。

セルピンによるセリン プロテアーゼの阻害はTravi
s,J.等,Ann.Rev.Biochem.,52:655−709（1983）;Carre
l.R.W.等,Trends Biochem.Sci.,10:20−24（1985）;Sp
rengers,E.D.等,Blood,69:381−387（1987）；及びProt
einase Inhibitors,出版 Barrett,A.J.等,Elsevier,A
msterdam（1986）で調査されている。

セリン プロテアーゼ、及びそれらと同起源のセルピ
ン インヒビターの例を下表IVに挙げる。

E.大豆トリプシン インヒビター ファミリー 大豆から精製した大豆トリプシン インヒビター フ
ァミリーの唯一の例は配列が決定されている。牛すい臓
トリプシンとのその複合体が研究されている（Sweet,R.
M.等,Biochem.,13:4214−4228（1974））。

F.ポテト インヒビター ファミリー ポテト インヒビター ファミリーに属するセリン
プロテアーゼ インヒビターには、じゃがいも、大麦、
及びひるからのインヒビターが含まれる（Read,R.J.
等，於:Proteinase Inhibitors,出版 Barrett,A.J.
等,Elsevier,Amsterdam,301−336頁（1986））。セリン
プロテアーゼ、及びそれらのポテト インヒビターの
例を下表Ｖに挙げる。

G.ボーマン−バーク インヒビター ボーマン−バーク インヒビター ファミリーに属す
るセリン プロテアーゼ インヒビターはマメからの相
同タンパク質を含む（Laskowski,M.等,Ann.Rev.Bioche
m.,49:593−626（1980））。セリン プロテアーゼ、及
びそれらのボーマン−バーク インヒビターの例を下表
VIに挙げる。

III.セリン プロテアーゼ−インヒビター複合体 すべてのファミリーからのセリン プロテアーゼ イ
ンヒビターはそれらと同起源のセリン プロテアーゼと
安定な1:1複合体を形成する。これらの複合体の解離は
非常におそい（数時間から数日）（Laskowski,M.等,An
n.Rev.Biochem.,49:593−626（1980）；及びLevin,E.
G.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:6804−6808（198
3））。セルピンを除くすべてのセリン プロテアーゼ
インヒビターの場合、解離生成物は完全な形の、及び
分裂したインヒビター分子の混合物である。他方、セリ
ン プロテアーゼ−セルピン複合体は解離により分裂し
たインヒビター分子のみを生ずるようなので、セルピン
は他のセリン プロテアーゼ インヒビターと多少異な
る機構を使用すると思われる。

トリプシン−BPTI、キモトリプシン−オボムコイド
インヒビター、キモトリプシン−ポテト インヒビタ
ー、及びストレプトミセス ズブチリシン−ストレプト
ミセス ズブチリシン インヒビターを含む数種のセリ
ン プロテアーゼ−インヒビター複合体に関する構造デ
ータが得られる（Read,R.J.等，於:Proteinase Inhibi
tors,出版 Barrett,A.J.等,Elsevier,Amsterdam,301−
336頁（1986））。これらの構造を調べると、インヒビ
ターの膨大な配列にもかかわらず、各阻害剤とその同起
源のセリン プロテアーゼ間の特異的な相互作用におい
て顕著な類似性があることが明らかになる。本発明にお
いてこの構造的類似性により、結晶構造が得られない場
合でもインヒビター及びそれと同起源のセリン プロテ
アーゼの間に起きるアミノ酸相互作用を予測することが
できるということを示唆した。

上記の議論の通りインヒビターは活性中心を含み、そ
れがセリン プロテアーゼの活性部位に対する拮抗基質
となる。活性中心のP₁−P₁残基（例えばPAI−１の場合A
RG₃₄₆−Met₃₄₇）間のペプチド結合への攻撃によりセリ
ン プロテアーゼからの生成物の正常で迅速な解離が起
こらず、おそらくプロテアーゼの活性部位のセリン及び
インヒビターのP₁残基の間の共有結合の形成により安定
なセリン プロテアーゼ−インヒビター複合体が確立さ
れる（Laskowski,M.等,Ann.Rev.Biochem.,49:593−626
（1980））。この機構は、PAI−１などのインヒビター
の活性中心がセリン プロテアーゼの活性部位に緊密
に、正確に適合しなければならないこを示す。しかしこ
れまでPAI−１、それと同起源のセリン プロテアー
ゼ、ｔ−PA、又はｔ−PA/PAI−１複合体についてのＸ−
線結晶学的データはない。従ってこのタンパク質の対の
間の相互作用の正確な性質は未知である。他のセルピ
ン、又はセルピン−セリン プロテアーゼ複合体の構造
についての情報も同様に不足している。

IV.セリン プロテアーゼの利用 キモトリプシン スーパーファミリーの特に重要なセ
リン プロテアーゼはｔ−PAである。セリンプロテアー
ゼのキモトリプシン ファミリーのほとんどのメンバー
は、チモーゲンの不活性な１本鎖前駆体として合成され
る。続いて特異的ペプチド結合の分裂によりこれらの前
駆体が完全に活性な２本鎖酵素に変換される。対照的に
ｔ−PAの１本鎖形態は有意な触媒活性を示し、そのプラ
スミノーゲンからのプラスミン生成のV_maxは２本鎖ｔ−
PAの場合よりわずか３−５倍低いだけである（Boose,J.
A.et al,Biochem.,28:635−643（1988）；及びPeterso
n,L.C.et al,Biochem.Biophys.Acta,952:245−254（19
88））。

ｔ−PAは直接作用して血栓（血餅）を溶解するわけで
はないが、心筋梗塞、肺塞栓症、及び重症の静脈血栓の
治療に、冠動脈内又は静脈内投与によって現在使用され
ている。ｔ−PAはプラスミノーゲンのArg₅₆₀及びVal₅₆₁
の間のペプチド結合の分裂を促進し（Robbins,K.C.等,
J.Biol.Chem.,242:2333−2342（1967））、それにより
不活性なチモーゲンを強力であるが非特異的なプロテア
ーゼ、プラスミンに変換し、それが血餅のフィブリンの
網目を分解する（Bachmann,F.等,Semin.Throm.Haemos
t.,43:77−89（1984）;Gerard,R.D.等,Mol.Biol.Med.,
３:449−557（1986）；及びVerstraete,M.等,Blood,67:
1529−1541（1986））。

ｔ−PAは必ずしも全身的にフィブリノーゲンを枯渇さ
せることなく局部的なフィブリン溶解現象を起こす。こ
れはｔ−PAがフィブリンに直接結合しフィブリン−ｔ−
PA複合体を形成することができ、そのプラスミノーゲン
に対する親和力が約500倍に増加するからである（Ranb
y,M.等,Biochem.Biophys.Acta,704:461−469（1982）；
及びRijken,D.C.等,J.Biol.Chem.,257:2920−2925（198
2））。このようにプラスミノーゲンも高濃度で存在す
る（Wiman,B.等,Nature,272:549−550（1978））冠動脈
血栓に、静脈内投与されたｔ−PAが結合すると血栓の部
位でプラスミンが有効に製造され、そこで最高に働く。

現在、ｔ−PAは最初にボーラスの形態で投与され、そ
の後一定の注入を続ける。３時間の標準の治療の間に投
与される酵素の合計量は一般に約50−100mgである。２
つの理由でこのような大量を必要とすることが明白であ
る：第１に、肝細胞による循環からの急速なｔ−PAのク
リアランスの効果を補うため（Krause,J.,Fibrinolysi
s,２:133−142（1988））、及び第２に、血漿及び血小
板中に存在する比較的高濃度のセリン プロテアーゼ
インヒビターの影響を克服するため（Carrell,R.W.等，
於:Proteinase Inhibitors,出版 Barrett,A.J.等,Els
evier,Amsterdam,頁403−420（1986））。

ｔ−PAの主な生理学的インヒビターはセルピン、PAI
−１、約50kdの糖タンパク質である（Pannekoek,H.等,E
MBO J.,５:2539−2544（1986）;Ginsberg,D.等,J.Cli
n.Invest.,78:1673−1680（1980）；及びCarrell,R.W.
等，於:Proteinase Inhibitors,出版 Barrett,A.J.
等,Elsevier,Amsterdam,頁403−420（1986））。PAI−
１は心筋肉梗塞から生き残った人からの血漿のフィブリ
ン溶解現象の能力が減少している原因とされてきた（Ha
msten,A.等,New Eng.J.Med.,313:1557−1563（198
5））。さらにPAI−１は急性ファーゼのリアクタントで
あり、心筋梗塞に伴いその量が増加することにより、治
療のためのｔ−PAの注入後に血漿中に残った実質的量の
ｔ−PAのフィブリン溶解現象活性が増幅される（Lucor
e,C.L.等,Circ.,77:660−669（1988））。PAI−１とｔ
−PAの結合の２次速度定数は非常に高く（Hekman,C.等,
Arch.Biochem.Biophys.,262:199−210（1988））、人の
血漿によるｔ−PAの最初の“急速相（fast−phase）”
阻害を説明している（Colucci,M.等,J.Lab.Clin.Med.,1
08:53−59（1986））。従ってインビボにおけるPAI−１
によるｔ−PAの急速な中和は、急性心筋梗塞の治療をし
た10％から35％の患者が冒される合併症である、血栓分
解治療後の冠動脈レステノシスに帰することができる
（Chesebro,J.H.等,Circ.,76:142−154（1987））。

Clエステラーゼ インヒビター、及びアルファ−２−
アンチプラスミンなどの他のセルピンとｔ−PAの結合定
数はPAI−１の場合より低次数であるが（Ranby,M.等,Th
rom.Res.,27:175−183（1982）；及びHekman,C.等,Arc
h.Biochem.Biophys.,262:199−210（1988））、それに
もかかわらずこれらのセルピンは注入されたｔ−PAと結
合し、ｔ−PAの有利な薬理学的性質を増幅することがで
きる。

ｔ−PA及びPAI−１の他に多くのセリン プロテアー
ゼ−セルピンの対が医学的に非常に重要である。例えば
ｕ−PAはｔ−PAと同様に心筋梗塞の治療に有用であり、
ｔ−PAと同様のセリン プロテアーゼ インヒビターに
よる阻害を受ける。

傷における血餅形成の促進に局所的に使用されるセリ
ン プロテアーゼであるトロンビンはプロ凝固剤であ
る。それと同起源のセルピンである、アンチトロンビン
IIIは、トロンビン、及び因子IX a,X a,XI a及びXII
aを含む血液凝固カスケードに関与する多くのセリン
プロテアーゼを特異的に阻害する凝固防止剤である（He
imburger,N.等，於:Proceedings of the Internatio
nal Research Conference on Proteinase Inhibit
ors,出版 Fritz,H.等,Walter de Gruyter,New Yor
k,頁１−22（1971）;Kurachi,K.等,Biochem.,15:373−3
77（1976）;Kirachi,K.等,Biochem.,16:5831−5839（19
77）；及びOsterud,B.等,Semin.Thromb.haemost.,35:29
5−305（1976））。アンチトロンビン IIIは播種性血
管内血液凝固の治療に使用されてきた。トロンビンによ
りプロテインＣを活性化すると、活性化プロテインＣが
凝固因子V a及びVIII aを不活性化し、それ自身はそれ
と同起源のセルピン、プロテインＣインヒビターにより
阻害されるので血液凝固過程の自己制限が起こる。

子宮収縮を起こす、血管の浸透性を増す、及び血液凝
固の内部経路を起こす機能を持つカリクレインは、比較
的重要なセルピンのひとつであるアルファ−１−アンチ
トリプシンにより阻害を受ける。

アルファ−１−アンチトリプシンはトリプシンと同様
に白血球エラスターゼ、及びカテプシンも阻害する（He
imburger,N.等，於:Proceedings of the Internatio
nal Research Conference on Proteinase Inhibit
ors,出版 Fritz,H.等,Walter de Gruyter,New Yor
k,頁１−47（1971）;Janoff,A.,Am.Rev.Resp.Dis.,105:
121−127（1972）；及びOhlsson,K.等,Eur.J.Biochem.,
36:473−481（1973））。アルファ−１−アンチトリプ
シンの遺伝子欠失は直接気腫に関連し（Carrell,R.W.
等,Trends Biochem.sci.,10:20−24（1984））、従っ
てアルファ−１−アンチトリプシン置換が気腫の治療に
使用されてきた（Marx,J.L.,Science,243:315−316（19
89））。

発明の要約 従って本発明の目的は、キモトリプシン スーパーフ
ァミリーの野生型セリン プロテアーゼ、特に野生型ｔ
−PAをタンパク質工学により改良し、必ずしも他の有利
な薬理学的性質を変えることなくその酵素有効性を増
し、及び／又は必要な投薬量を変えることである。

本発明のもうひとつの目的はキモトリプシン スーパ
ーファミリーの改良セリン プロテアーゼのコードする
遺伝子の提供である。

本発明のさらに別の目的は特にセルピン ファミリー
の野生型セリン プロテアーゼ インヒビター、特に野
生型PAI−１を変え、それらの阻害有効性を増し、及び
／又はその投薬必要量を変え、本発明の変異セリン プ
ロテアーゼを阻害することができるようにすることであ
る。

本発明のさらに別の目的は改良セリン プロテアーゼ
インヒビターをコードする遺伝子を提供することであ
る。

本発明のこれらの、及び他の目的は、同起源のインヒ
ビターによる阻害に対して抵抗性であるキモトリプシン
スーパーファミリーのセリン プロテアーゼ 変異
株；及びそれをコードする遺伝子；ならびにセリン プ
ロテアーゼ インヒビター抵抗性セリン プロテアーゼ
を阻害するセリン プロテアーゼ インヒビター 変異
株；及びそれをコードする遺伝子により満たされ、これ
は下文に示す本発明の詳細な説明により明らかとなるで
あろう。

図の簡単な説明 図１はキモトリプシン スーパーファミリーの種々の
セリン プロテアーゼの配列の比較を示す。配列は、保
持されたアミノ酸の重複が示されるように並べた。トリ
プシン上の数字はプロテイン データ バンクのPDB3pt
p.ent エントリーで使用されている番号付による。ｔ
−PA上の数字は成熟ｔ−PA分子におけるアミノ酸によ
る。

図２はセリン プロテアーゼ インヒビターのセルピ
ン ファミリーの種々のメンバーの配列の比較を示す。
配列は保持されたアミノ酸の重複がわかるように並べ
た。アルファ−１−アンチトリプシン下の数字、及びPA
I−１上の数字は成熟分子におけるアミノ酸残基によ
る。

図３は野生型ｔ−PA、及び本発明のｔ−PAのセルピン
−抵抗性変異株の変異、及び発現に用いられたベクター
の構築を図示したものである。

図４は野生型ｔ−PA及びｔ−PAのセルピン−抵抗性変
異株の活性の間接的色素澱粉法における比較を示す。図
４で■は野生型ｔ−PAを示し、○はｔ−PA（R₃₀₄→Ｓ）
を示し、□はｔ−PA（R₃₀₄→Ｅ）を示し、・はｔ−PA
（Del_296-302）を示す。

図５は間接的色素澱粉法による野生型ｔ−PA、及びｔ
−PAのセルピン−抵抗性変異株の活性に対するPAI−１
の効果を示す。図５において、■は野生型ｔ−PAを示
し、○はｔ−PA（R₃₀₄→Ｓ）を示し、□はｔ−PA（R₃₀₄
→Ｅ）を示し、・はｔ−PA（Del_296-302）を示す。

図６は間接的色素澱粉法による野生型ｔ−PA、及びｔ
−PAのセルピン−抵抗性変異株の活性の比較を示す。図
６において、□はｔ−PA（H₂₉₇→Ｙ）を示し、・は野生
型ｔ−PAを示し、＋はｔ−PA（K₂₉₆→Ｅ）を示し、■は
三重変異株ｔ−PA（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉→E,E,E）を示し、
▲はｔ−PA（R₂₉₉→Ｅ）を示し、△はｔ−PA（R₂₉₈→
Ｅ）を示し、○はｔ−PA（P₃₀₁→Ｇ）を示す。

図７は間接的色素澱粉法による野生型ｔ−PA、及びｔ
−PAのセルピン−抵抗性変異株の活性に対するPAI−１
の効果を示す。図７において、□はｔ−PA（H₂₉₇→Ｙ）
を示し、・は野生型ｔ−PAを示し、＋はｔ−PA＝K₂₉₆→
Ｅ）を示し、■はｔ−PA（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉→E,E,E）を
示し、▲はｔ−PA（R₂₉₉→Ｅ）を示し、△はｔ−PA（R
₂₉₈→Ｅ）を示し、○はｔ−PA（P₃₀₁→Ｇ）を示す。

図８は野生型PAI−１、及び本発明のPAI−１の変異株
の変異、及び発現に使用したベクターの構築を図示した
ものである。

発明の詳細な説明 上記で議論した通り、本発明の上記の目的は、それら
と同起源のインヒビターによる阻害に対して抵抗性を持
つキモトリプシン スーパーファミリーのセリン プロ
テアーゼ変異株；及びそれをコードする遺伝子を用いた
ひとつの具体化により達成することができた。

本発明のもうひとつの具体化において、本発明のセリ
ン プロテアーゼ インヒビター−抵抗性セリン プロ
テアーゼを阻害するセリン プロテアーゼ インヒビタ
ー変異株；及びこれをコードする遺伝子により上記の目
的を達成した。

さらに別の具体化において、本発明のセリン プロテ
アーゼ インヒビター変異株はキモトリプシン スーパ
ーファミリーの野生型セリン プロテアーゼをも阻害す
る。

エンドペプチダーゼのこのセリン プロテアーゼ サ
ブ−サブクラスのメンバーはすべて相同タンパク質であ
り、共通の作用機構を有するので、本発明において使用
するキモトリプシン スーパーファミリーの特定のセリ
ン プロテアーゼはここで重要ではない。そのようなキ
モトリプシン スーパーファミリーのセリン プロテア
ーゼの特別な例には上記で上げたセリン プロテアー
ゼ、すなわちｔ−PA、トリプシン、トリプシン−様プロ
テアーゼ、キモトリプシン、プラスミン、エラスター
ゼ、ｕ−PA、アクロシン、活性化プロテインＣ、Clエス
テラーゼ、カテプシンＧ、チマーゼ、及びカリクレイ
ン、トロンビン、及び因子VII a,IX a,X a,XI a,ならび
にXII aを含む血液凝固カスケードのプロテアーゼが含
まれる。本発明で用いるキモトリプシン スーパーファ
ミリーの好ましいセリン プロテアーゼはｔ−PAであ
る。

キモトリプシン スーパーファミリーの変異セリン
プロテアーゼが阻害に対して抵抗性を示す特定のセリン
プロテアーゼ インヒビターは本発明において重要で
はない。そのようなインヒビターの例にはBPTIファミリ
ー、Kazalファミリー、SSIファミリー、セルピン ファ
ミリー、大豆トリプシン インヒビター（Kunitz）ファ
ミリー、ポテト インヒビター ファミリー、及びボー
マン−バーク ファミリーのメンバーが含まれる。

キモトリプシン スーパーファミリーの変異セリン
プロテアーゼが阻害に対して抵抗性を示す特定のBPTIイ
ンヒビターは本発明において重要ではない。そのような
BPTIインヒビターの例にはBPTI、ヘビ毒インヒビター、
インターアルファ インヒビター、及びA4アミロイド前
駆体A4695が含まれる。

キモトリプシン スーパーファミリーの変異セリン
プロテアーゼが阻害に対して抵抗性を示す特定のKazal
インヒビターは本発明において重要ではない。そのよう
なKazalインヒビターの例にはすい臓分泌インヒビタ
ー、オボムコイド、及び精漿アクロシン インヒビター
が含まれる。

キモトリプシン スーパーファミリーの変異セリン
プロテアーゼが阻害に対して抵抗性を示す特定のセルピ
ン インヒビターは本発明において重要ではない。その
ようなセルピン インヒビターの例にはPAI−1,PAI−2,
PAI−3,Clエステラーゼ インヒビター（Clinh），プロ
テインＣ インヒビター（PCinh）、ヘパリン 補因子
II（HC II）、アルファ−２−アンチプラスミン（A2A
P）、アンチトロンビン III（AT III）、アルファ−１
−アンチトリプシン（A1AT）、プロテアーゼ ネクシン
Ｉ（Nex−１）、コントラプシン（Cntrps）、成長ホ
ルモン調節タンパク質（GHRP）、及びアルファ−１−ア
ンチキモトリプシン（AChym）が含まれる。キモトリプ
シン ファミリーのセリン プロテアーゼが阻害に対し
て抵抗性を示す好ましいセルピンはPAI−１である。

本発明のキモトリプシン スーパーファミリーのセリ
ン プロテアーゼ インヒビター−抵抗性セリン プロ
テアーゼを阻害することができる変異セリン プロテア
ーゼ インヒビターをそれから誘導することができる特
定のセリン プロテアーゼ インヒビターは、本発明に
おいて重要ではない。そのようなセリン プロテアーゼ
インヒビターの例にはBPTI、Kazal、SSI、Kunitz、ポ
テト インヒビター、ボーマン−バーク インヒビタ
ー、及びセルピン ファミリーのメンバーが含まれ、PA
I−１、PAI−２、PAI−３、Clエステラーゼ インヒビ
ター、プロテインＣ インヒビター、ヘパリン 補因子
II、アルファ−２−アンチプラスミン、アンチトロン
ビン III、アルファ−１−アンチトリプシン、プロテ
アーゼ ネクシン Ｉ、コントラプシン、成長ホルモン
調節タンパク質、及びアルファ−１−アンチキモトリプ
シンなどのセルピン ファミリーのセリン プロテアー
ゼ インヒビターが好ましい。キモトリプシン スーパ
ーファミリーのセリン プロテアーゼ インヒビター−
抵抗性セリン プロテアーゼを阻害する好ましい変異セ
ルピンはPAI−１である。

すべての周知のセリン プロテアーゼ インヒビター
はその活性中心ループにおいて構造的に相同であり、そ
れらと同起源のセリン プロテアーゼと類似の相互作用
を行う（Read,R.J.等，於:Proteinase Inhibitors、出
版 Barrett,A.J.等,Elsevier,Amsterdam,頁301−336
（1986））。セリン プロテアーゼ、及びセリン プロ
テアーゼ インヒビターの間の構造における対応はこれ
までに研究されたことのない複合体のモデルの構築に利
用することができる。

ｔ−PA、及びセリン プロテアーゼの触媒ドメインの
間の構造的相同性が高いので（Blundell,T.等,Nature,3
26:347−352（1987））、本発明においてトリプシン、
及びBPTI間の複合体の周知の構造（Huber,R.等,J.Mol.B
iol.,89:73−101（1974）；及びBode,W.等，於:Proteol
ysis and Physiological Regulation,Academic Pre
ss,New York,頁43−76（1976））がｔ−PA及びPAI−１
の間の相互作用のモデルとなり得ると仮定した。主な認
識部位のアミノ酸以外にBPTIと直接接触するトリプシン
のアミノ酸はポリペプチド鎖の２つの別の領域に位置す
る（残基37−41、及び210−213）（図１参照）。

アミノ酸残基₂₁₄SWGS₂₁₇の周囲の領域はキモトリプシ
ン スーパーファミリーのすべてのメンバーの間に高度
に保持されている。反対にアミノ酸残基₃₆NSGYHF₄₁の周
囲の領域は比較的変化し易く、インヒビターと相互作用
を行う表面の部分を形成する。図１に示される通りこの
領域のｔ−PAのアミノ酸配列は２つの大きな点でトリプ
シンのアミノ酸配列と異なる。第１にトリプシンのTyr
（Y₃₉）残基がｔ−PAにおいてはArg（R₃₀₄）で置換され
ている。ｔ−PA及びPAI−１の間の相互作用がトリプシ
ン及びBPTIの間の相互作用を模倣しているという仮定に
基づくモデリングはｔ−PAのR₃₀₄がPAI−１のGlu
（E₃₅₀）残基と塩橋を形成することを示唆する。このPA
I−１のGlu残基の位置は、トリプシンのY₃₉とファン
デル ワールス結合を形成するBPTIのI₁₉に対応する
（下表VII）（Huber,R.等,J.Mol.Biol.,89:73−101（19
74））；及びBode,W.等，於:Proteolysis and Physio
logical Regulation,Academic Press,New York,頁43
−76（1976））。従ってPAI−１のE₃₅₀はｔ−PAのR₃₀₄
とイオン対を形成すると思われる。

第２にｔ−PAは、ｔ−PA（R₃₀₄）及びPAI−１
（E₃₅₀）の間の接点と思われる位置に隣接して位置する
余分な７個のアミノ酸（₂₉₆KHRRSPG₃₀₂,図１を参照）を
有する。これらの７個のアミノ酸の中の４個は正に帯電
しており、PAI−１（₃₅₀EEIIMD₃₅₅）の相補的領域と思
われる領域は３個の負に帯電した残基を含む。本発明に
おいては、これらの領域間の静電的相互作用がｔ−PA及
びPAI−１の間の複合体の形成、及び安定化に重要な役
割を果たし得ると思われた。逆にｔ−PAがその基質であ
る、同領域に負に帯電した残基を持たないプラスミノー
ゲン（PLG）と相互作用を行う場合はこのような相互作
用が起こり得ない（上記表VIIを参照）。

図１に示すようなキモトリプシン スーパーファミリ
ーの種々のセリン プロテアーゼの配列の比較は、キモ
トリプシン スーパーファミリーの種々のセリン プロ
テアーゼの１種類又はそれ以上の変異を設計してそれら
と同起源の野生型インヒビターによる阻害に対して抵抗
性とするための指針として使用することができる。ｔ−
PAと同様に図１に示すキモトリプシン スーパーファミ
リーの他のセリン プロテアーゼは、重要な結合残基
（トリプシンのY₃₉）、及び結合残基に隣接して位置す
る種々の大きさの挿入残基を含む点でトリプシンと異な
る。従って変異の候補の例には以下が含まれる： （ｉ）他のセリン プロテアーゼにおいてトリプシンの
Tyr（Y₃₉）（BPTIのIle（I₁₉）と結合し、従って２個の
タンパク質間の相互作用において重要な役割を果たす残
基）の位置に対応する位置を占めるアミノ酸残基。例え
ばプラスミンにおいて、Met（Ｍ）残基はトリプシンのY
₃₉に対応する位置を占める。このMet残基を電荷、又は
大きさなどの性質の異なる他のアミノ酸（例えばGlu
（Ｅ））に変異させると、プラスミンのアンチプラスミ
ンによる不活性化に対する感受性がなくなるか、又は減
少することが期待されるが、使用する特定の置換アミノ
酸は本発明において重要でない。同様にトロンビンのGl
u（Ｑ）残基（トリプシンのY₃₉に対応する位置を占め
る）を電荷、又は大きさなどの性質が異なる別のアミノ
酸（例えばAsp（Ｄ））に変異させると、トロンビンの
アンチトロンビン IIIによる不活性化に対する感受性
がなくなる、又は減少することが期待されるが、使用す
る特定の置換アミノ酸は本発明において重要でない；及
び （ii）トリプシンには存在せず、分子の表面の小さい挿
入として活性部位の近辺に位置するキモトリプシン ス
ーパーファミリーの他のセリン プロテアーゼの残基
（図１を参照）。例えばプラスミンは結合残基に隣接し
てｔ−PAの₂₉₆KHRRSPG₃₀₂により占められている位置に
対応する位置に、２個のアミノ酸（RF）の挿入を含む。
これらの２個のアミノ酸のどちらか、又は両方の欠失、
又は置換、あるいは少量の別のアミノ酸の挿入による変
異により、必ずしもセリン プロテアーゼの触媒部位に
影響することなくインヒビターとの相互作用を失わせ
る、又は減少させることが期待される。もうひとつの例
として、ｕ−PAは結合残基に隣接してｔ−PAの₂₉₆KHRRS
PG₃₀₂により占められている位置に対応する位置に６個
のアミノ酸（RHRGGS）の挿入を含む。これらの６個の残
基の変異、又は欠失は変異ｔ−PA（Del_296-302）の場合
に観察される相互作用と類似の方法によるセリン プロ
テアーゼ インヒビターとの相互作用が減少する、又は
なくなることが期待される。

同様に、セリン プロテアーゼ インヒビターの活性
中心内の領域は非常に変化し易く、セリン プロテアー
ゼと相互作用を行う表面の部分を形成する。図２に示す
ようなセルピン ファミリーの種々のセリン プロテア
ーゼ インヒビターの配列の比較は種々のセリン プロ
テアーゼ インヒビターにおいて、特にセリン プロテ
アーゼ インヒビターのセルピン ファミリーのメンバ
ーに、本発明のキモトリプシン スーパーファミリーの
セリン プロテアーゼ インヒビター−抵抗性セリン
プロテアーゼを有効に阻害することができるような１種
類かそれ以上の変異を起こす設計の指針として利用する
ことができる。PAI−１と同様に図２に示した他のセル
ピン ファミリーのメンバーは、重要な結合アミノ酸残
基（PAI−１のE₃₅₀）における配列が異なり、結合残基
に隣接した位置に種々の大きさの挿入を含む（下表VIII
を参照）。

従って変異の候補の例には以下が含まれる： （ｉ）他のセリン プロテアーゼ インヒビターにおい
て、PAI−１のGlu（E₃₅₀）（ｔ−PAのArg（R₃₀₄）と結
合し、従って２個のタンパク質の相互作用において重要
な役割を果たす残基）の位置に対応する位置（P4′）を
占めるアミノ酸残基。本発明においては、ｔ−PAにおけ
るR₃₀₄→Ｅ変異の構築によりこわれた静電的相互作用を
復活させるためにPAI−１（E₃₅₀）のGlu残基をArg
（Ｒ）に変異させた。このセルピンにおける特異的な変
異は、セリン プロテアーゼに導入され野生型セルピン
による阻害に対する抵抗性を与えた変異と相補的である
ように構築された。セルピンにおけるこの相補的E₃₅₀→
Ｒ変異はセルピンに本発明のキモトリプシン スーパー
ファミリーのセリン プロテアーゼ インヒビター−抵
抗性セリン プロテアーゼを阻害する能力を与えるため
に特別に選んだ；しかし使用した特定の置換アミノ酸は
本発明に対して重要ではない。例えばトリプシンのY₃₉
に対応するプラスミンのMet（Ｍ）残基（図１参照）を
電荷又は大きさなどの性質の異なる別のアミノ酸（上記
の例のようにGlu（Ｅ））に変え、変異プラスミンが野
生型アルファ−２−アンチプラスミンによる阻害に対す
る感受性の減少を示した場合、アルファ−２−アンチプ
ラスミンのP4′Ser（Ｓ）残基を、プラスミンにおいて
代わったGlu残基と相互作用のできる他のアミノ酸（例
えばArg（Ｒ））に変異させると、変異アルファ−２−
アンチプラスミンによる不活性化に対する変異プラスミ
ンの感受性が復活することが期待される。同様にトロン
ビンの変異に関する上記の例のようにトロンビンのGlu
（Ｑ）残基Asp（Ｄ）に変えた場合、アンチトロンビン
IIIのP6′Arg（Ｒ）残基をGlu（Ｅ）に変異させると
変異アンチトロンビン IIIによる阻害に対する野生型
インヒビター−抵抗性トロンビンの感受性が復活するこ
とが期待される； （ii）同種のセリン プロテアーゼとの相互作用表面を
形成する、種々のファミリーのセリン プロテアーゼ
インヒビターの他のメンバーの活性中心内の余分な残
基。セリン プロテアーゼ インヒビターのセルピン
ファミリーに関してこれらの残基を上記の表VIIIに示
す。

例えばアルファ−２−アンチプラスミンは活性中心の
PAI−１の₃₄₈APEEIIMD₃₅₅に対応する位置に配列SLSSFSV
Nを含む。これらの８個のアミノ酸のいずれかの置換に
より、又は少量の別のアミノ酸の挿入により変異を起こ
すと、これらの置換又は挿入が電気、大きさ、あるいは
嫌水性などの性質において、セリン プロテアーゼに導
入されて最初に野生型セルピンに対する抵抗性を与えた
アミノ酸残基と相補的であればセリン プロテアーゼと
の相互作用を復活することが期待される。

他の多くのセリン プロテアーゼと異なり、ｔ−PAは
不活性前駆体又はチモーゲンとして細胞から分泌されな
い。１本鎖ｔ−PAと対照的に、キモトリプシノーゲンな
どの真のチモーゲンは完全に蛋白質分解活性がなく、そ
の同起源インヒビターに対する反応性が減少している。
これは、基質−結合ポケットが正しく形成されていない
か（キモトリプシノーゲン:Birktoft,J.J.et al,Bioch
em.,15:4481−4485（1976））、又は混乱している（ト
リプシノーゲン;Bode,W.,J.Mol.Biol.,127:357−374（1
979））ためである。構造が既知のすべてのチモーゲン
において、Asp₁₉₄の側鎖はHis₄₀と決定的な極性相互作
用を形成する（トリプシン番号系）。このため側鎖が埋
没し、Gly₁₉₃及びSer₁₉₅の主鎖アミド基による正しいオ
キシアニオンホールの形成が妨害される。活性化すると
Asp₁₉₄及びHis₄₀の側鎖間の相互作用がAsp残基のCOO^-基
及びIle₁₆の活性化分裂により形成された遊離のNH₂基の
間の強い極性結合に置換される。新規の静電的結合が最
初のHis₄₀−Asp₁₉₄結合を破壊し、その結果機能性オキ
シアニオンホールが形成される。Asp−Ile極性結合はｔ
−PAの２本鎖形態にほとんど確実に存在する。しかし酵
素の１本鎖形態では、Asp残基の帯電した側鎖は、明ら
かに決定的なHis残基（ｔ−PAにおける位置305）がPhe
に置換されているために、触媒的−活性配置をとるとは
限らない。Phe₃₀₅がHisにより置換される特定部位の突
然変異誘発、従って“チモーゲン−様”性質を示すｔ−
PAを生産する突然変異が本発明において仮定された。
“チモーゲン−様”性質を有するｔ−PAを生産する突然
変異のための他の候補には、位置305における他の塩基
性アミノ酸の使用が含まれる。

本文で用いる“チモーゲン−様”性質は、酵素の１本
鎖形態により基質及び同起源インヒビターの両方に対す
る反応性が減少するが、酵素の２本鎖形態により正常な
反応性を示すことを意味する。この仮定に基づき、変異
酵素ｔ−PA（F₃₀₅→Ｈ）を本発明で構築し、この酵素の
１本鎖形態とその同起源インヒビター、PAI−１との相
互作用を下記の実施例１で調べた。

さらに本発明で、ｔ−PA（F₃₀₅→Ｈ）のAla₂₉₂のSer
（Ｓ）への突然変異がこの変異酵素の“チモーゲン−
様”性質を増大させることを仮定する。ｔ−PAのAla₂₀₂
はキモトリプシノーゲン及びトリプシノーゲンにおける
s₃₂の相同染色体（homolog）である。これらの２種類の
チモーゲンにおいてS₃₂はH₄₀と水素結合を形成する。従
って本発明の場合、S₃₂及びH₄₀の間の相互作用が、Asp
₁₉₄との最適交互作用のための立体配置においてH₄₀の側
鎖を安定化すると思われる。

本発明の変異セリン プロテアーゼ及び変異セリン
プロテアーゼ インヒビターは、点変異株、欠失変異
株、付加変異株又は３種類の変異の組み合わせを含む変
異株であることができる。

本発明の変異セリン プロテアーゼ、及び変異セリン
プロテアーゼ インヒビターは、例えばオリゴヌクレ
オチド−媒介突然変異誘発などの周知の方法により製造
することができる（Zoller,M.等,DNA,3:479−488（198
4）;Kunkel,T.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488−492
（1985）；及びKunkel,T.等,Current Protocols in
Molecular Biology,Green Publishing Associates
＆ Wiley Interscience,New York（1987））。しか
しセリン プロテアーゼ、又はセリン プロテアーゼ
インヒビターに変異を起こす正確な方法は本発明にとっ
て重要ではない。

本発明の変異セリン プロテアーゼはLottenberg,R.
等,Meth.Enzymol.,80:341−361（1981）に記載の方法な
どの周知のアッセイを用いて所望の性質、すなわちセリ
ン プロテアーゼ活性、及び同起源のインヒビターによ
る阻害に対する抵抗性を持つセリン プロテアーゼに関
してスクリーニングを行うことができる。

本発明の変異セリン プロテアーゼ インヒビター
は、Lottenberg,R.等,Meth.Enzymol.,80:341−361（198
1）;Holmes,W.E.等,Bilchem.,26:5133−5140（1987）；
及びHekman,C.M.等,Arch.Biochem.Bilphys.,262:199−2
10（1988）に記載の方法などの周知のアッセイを用いて
所望の性質、すなわち本発明のセリン プロテアーゼ
インヒビター−抵抗性セリン プロテアーゼに対するセ
リン プロテアーゼ インヒビター活性を有するセリン
プロテアーゼ インヒビターに関してスクリーニング
を行うことができる。

本文に記載する研究は、セリン プロテアーゼ イン
ヒビターを突然変異誘発により修正し、キモトリプシン
スーパーファミリーのセリン プロテアーゼ、及びそ
れと同起源のインヒビターの間の相互作用を減少させ
る、又はなくすことが可能であることを初めて示すもの
である。これにより変異セリン プロテアーゼは同起源
のインヒビターの存在下で野生型の酵素より酵素活性が
多く残り、残留活性の量はそれと同起源のインヒビター
との相互作用が阻害される程度に依存している。そのよ
うな変異セリン プロテアーゼの投与は多種類の臨床
的、及び商業的用途において有益であると思われる。例
えば活性化プロテインＣの変異型は、血液の凝固を阻害
するのが有利である場合有用であると思われ、本文の実
施例１に記載のｔ−PAの変異型が、フィブリン溶解現象
を延長する必要がある場合に血栓性の異常のある患者の
循環におけるｔ−PAの有効寿命を延ばすのに有用である
と思われるのとちょうど同じである。

本文に記載した研究は又、セリン プロテアーゼ イ
ンヒビターを突然変異誘発により修正し、セリン プロ
テアーゼ インヒビターの構造を適切に変化させること
により、キモトリプシン スーパーファミリーのセリン
プロテアーゼ インヒビター−抵抗性変異セリン プ
ロテアーゼ、及びそれと同起源のセリン プロテアーゼ
インヒビター間の相互作用を機能的に復活させること
が可能であることを初めて示すものである。これにより
同起源の野生型セリン プロテアーゼ インヒビターが
存在する場合より急速に変異セリン プロテアーゼを不
活性化することができ、阻害の速度は変異セリン プロ
テアーゼとの相互作用が復活した程度に依存する。この
ような変異セリン プロテアーゼ インヒビターの投与
は、多種の臨床的及び商業的用途においてセリン プロ
テアーゼ インヒビター−抵抗性セリン プロテアーゼ
の活性を制限するのに有益であると思われる。例えばプ
ロテインＣ インヒビターの変異型は、活性化プロテイ
ンＣの変異型の存在下で血液の凝固を促進するのが有利
であるような場合に有用であると思われる。同様にPAI
−１の変異型は、侵入的な方法が必要な場合に、血栓性
異常の治療をした患者の循環においてセリン プロテア
ーゼ インヒビター−抵抗性ｔ−PA、例えばｔ−PA（R
₃₀₄→Ｅ）の有効寿命を短縮するのに有用であると思わ
れる。従ってこのような変異セリン プロテアーゼ イ
ンヒビターはセリン プロテアーゼ インヒビター−抵
抗性セリン プロテアーゼの解毒薬として使用すること
ができる。

１本鎖形態のｔ−PAの酵素活性はおそらく、薬剤を与
えられている多くの患者の場合の循環フィブリノーゲン
の存在量の30−50％の減少（Collen,D.et al,Circ.,7
3:511−517（1986）；及びRao,A.K.et al,J.Am.Coll.C
ardiol.,11:1−11（1988））、及びおそらく非常に少数
で起こる出血性合併症の一因である。従って本発明にお
いて、１本鎖形態でその触媒活性が非常に低下している
ｔ−PAの変異株を形成することにより、これらの問題を
軽減する可能性を探査する。さらにこれらのｔ−PAの変
異株は、１本鎖形態で同起源インヒビターに対して反応
性の低下を示すことが本発明で示された。しかし本発明
の場合それらの変異株は血栓のフィブリン網目に付着す
ると、患者自身のｔ−PAにより局部的に生成されるプラ
スミンにより切断され、完全な触媒活性を示すと予想さ
れる。

臨床的用途において投与するべき本発明の変異セリン
プロテアーゼの量は使用する特定の変異セリン プロ
テアーゼ、所望するセリンプロテアーゼの治療効果、及
び性別、年令、体重、ならびにプロテアーゼを投与する
患者の生理学的条件などの因子に依存するであろう。変
異セリン プロテアーゼの使用量は日常的実験により決
定することができる。

臨床的用途において投与するべき本発明の変異セリン
プロテアーゼ インヒビターの量は使用する特定の変
異セリン プロテアーゼ インヒビター、所望するセリ
ン プロテアーゼ インヒビターの治療効果、及び性
別、年令、体重、ならびにセリン プロテアーゼ イン
ヒビターを投与する患者の生理学的条件などの因子に依
存するであろう。変異セリン プロテアーゼ インヒビ
ターの使用量は日常的実験により決定することができ
る。

本発明の変異ｔ−PAは適したインビトロ、及びインビ
ボ モデルにおける試験、ならびに臨床試験により決定
した通りに投与しなければならない。必要な投薬量は野
生型ｔ−PAの場合の必要量の10−1000分の１となるであ
ろうと思われる。

本発明の変異PAI−１も適したインビトロ、及びイン
ビボ モデルにおける試験、ならびに臨床試験により決
定した通りに投与しなければならない。必要な投薬量は
変異ｔ−PAの場合に必要な量と大体同じであろうと思わ
れる。

本発明の変異セリン プロテアーゼは文献により周知
のいずれの製薬上許容できるキャリヤー、又は希釈剤、
例えば生理食塩溶液と共にでも投与することができる
（Lucore,C.L.等,Circ.,77:660−669（1988）；及びChe
sebro,J.H.等,Circ.,76:142−154（1987））。

本発明の変異セリン プロテアーゼ インヒビターは
文献により周知のいずれの製薬上許容できるキャリヤ
ー、又は希釈剤、例えば生理食塩溶液と共にでも投与す
ることができる（Lucore,C.L.等,Circ.,77:660−669（1
988）；及びChesebro,J.H.等,Circ.,76:142−154（198
7））。

本発明の変異セリン プロテアーゼの特定の投与形態
はその特定の用途に依存する。そのような投与形態の例
には、静脈内又は腹腔内注射、冠動脈内注入、局所的適
用、及びエーロゾル吸入が含まれる。

本発明の変異セリン プロテアーゼ インヒビターの
特定の投与形態はその特定の用途に依存する。そのよう
な投与形態の例には、静脈内又は腹腔内注射、冠動脈内
注入、局所的適用、及びエーロゾル吸入が含まれる。

以下の実施例は説明のみを目的としており、本発明の
範囲をどのようにも制限するものではない。

実施例１ ｔ−PA変異株 本実施例に記載する方法はセリン プロテアーゼとし
てｔ−PAを使用し、同起源のセリン プロテアーゼ イ
ンヒビターとしてPAI−１を使用する場合を対象とする
が、上記のようなキモトリプシン スーパーファミリー
の他のセリン プロテアーゼ、及び上記のようなそれと
同起源のインヒビターも本発明の精神と範囲から逸脱す
ることなく本文に記載の方法により容易に使用すること
ができる。

A.突然変異誘発のためのｔ−PA部位の選択 ｔ−PAの残基Arg₃₀₄及び（₂₉₆KHRRSPG₃₀₂）がPAI−１
と相互作用をするという仮定を試験するため、オリゴヌ
クレオチド−媒介突然変異誘発を用いて下表IXに示すｔ
−PAの３種類の変異型を製造した。

変異ｔ−PA（Del_296-302）は上記で議論した、トリプ
シンには存在しない７個のアミノ酸挿入を含まず、同起
源のセリン プロテアーゼ インヒビター、PAI−１と
相互作用する部分のｔ−PA配列を完全に除去して構築し
た。変異株ｔ−PA（R₃₀₄→Ｓ）及びｔ−PA（R₃₀₄→Ｅ）
はArg₃₀₄がそれぞれSer及びGluに置換されており、正に
帯電したArg残基を選択的に変え、それと同起源のセリ
ン プロテアーゼ インヒビター、PAI−１との相互作
用を除去するように選んだ。R₃₀₄に対して、電荷対相互
作用の欠落のために同起源のセリン プロテアーゼ イ
ンヒビターに対する感受性の減少したｔ−PAを与える種
々の他の置換を行うことができる。例えばループ中の正
に帯電した残基（残基296−302）を負に帯電した、又は
中性のアミノ酸に変える点変異は、ｔ−PA及びPAI−１
の間の相互作用を妨げる、減少させる、又は不安定化す
ると予測される。P₃₀₁をGly（Ｇ）以外の他のアミノ酸
で置換することにより類似の結果を得ることができる。
さらに残基304と305の間、又は残基296と305の間のどこ
かに、PAI−１の残基と全く相互作用しない約１−６個
のアミノ酸の系列を挿入するように挿入変異を行うこと
ができる。異なる置換、及び／又は置換、挿入及び欠失
の組み合わせは、ｔ−PAとPAI−１の相互作用に異なる
程度で影響し、それによって特定の用途、又は臨床的条
件に適する性質を持った種々のｔ−PAを製造することが
できるであろう。

B.t−PAのオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発 ｔ−PAのオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発は基
本的にZoller,M.等,DNA,３:479−488（1984）の記載に
従い、Kunkel,T.,Proc.Natl.Acad.sci.USA,82:488−492
（1985）；及びKunkel,T.等,Current Protocols in
Molecular Biology,Green Publishing Associates
＆ Wiley Interscience,New york（1987）による修
正により行った。

第１に、ヒトのｔ−PA全長をコードするcDNAをクロー
ニングした複写を含むプラスミドpSVT7（RI^-）/t−PA
を、Sambrook,J.等,Mol.Biol.Med.,３:459−481（198
6）に従って用意した。pSVT7（RI^-）/t−PAはpSVT7の誘
導体である（Bird.P.M.等,J.Cell Biol.,105:2905−29
14（1987））（図３を参照）。

pSVT7はpKC3から構築した。pKC3は、Ava I部位からEc
oR I部位までのpBR322−誘導配列（これは複製の源、及
びβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む）がpUC ８（Messin
g,J.,Meth.Enzymol.,101:20−78（1983））の配列に置
換されているpko（Van Doren,K.等,J.Virol.,50:606−
614（1984））の誘導体である。さらに独特のHind III
部位にポリリンカーが挿入されており、SV40オリジンの
Pvu II部位上流がCla I部位に変換されている。ベクタ
ーpSVT7はバクテリオファージ T7 RNA ポリメラーゼ
特異性プロモーターを含む20個の塩基対フラグメント
（Pharmacia Fine Chemicals,Piscataway,NJ）をpKC3
の独特のStu I部位に挿入することによって得た。このS
ti I部位はSV40の初期領域から誘導した配列内のSV40配
列のヌクレオチド5190の位置、初期転写の開始点から下
流約30塩基対にある（Tooze,J.等,DNA Tumor Viruse
s,Cold Spring Harbor Press,頁813（1981））。

その後E.coli DNAポリメラーゼのクレノウフラグメ
ントを用いてくぼんだ３′−末端を満たすことにより単
一のEcoR I部位をpSVT7から除去した。得られた発現ベ
クターをpSVT7（RI^-）と称する（図３を参照）。

次に野生型ｔ−PAをコードするcDNAをプラスミドpL61
1から切り出し（Sambrook,J.等,Mol,Biol.Med.,３:459
−481（1986）;Genetics Institute,Boston,MAから提
供）、pSVT7（RI^-）に挿入した。pL611はｔ−PAのAUG開
始コドンからすぐ上流にNco I及びBamH Iの切断部位を
導入する合成オリゴヌクレオチドを含む。ｔ−PA cDNA
の３′非翻訳配列内の、TGA終結コドンの下流約280塩基
対の位置にBal I部位がある。プラスミド pL611から切
り出したｔ−PA DNAの約1965塩基対Nco I−Bal Iフラ
グメントにXba Iリンカーを加えた。このBco I−Bal I
フラグメントは完全なｔ−PAタンパク質をコードする配
列を含むが、（ｉ）ｔ−PA mRNAの末端３′−非翻訳領
域、及び（ii）ｔ−PA mRNAの５′−非翻訳領域全体、
すなわちSal I部位及びASG開始コドンの間の配列に対応
する配列が欠けている（Pennica,D.等,Nature,301:214
−221（1983））。各末端にXba I部位を持つｔ−PA cD
NAのフラグメント（Sambrook,J.等,Mol.Biol.Med.,３:4
59−481（1986））をpSVT7/t−PAの製造に使用した（図
３を参照）。得られたプラスミドからXba Iを用いた消
化、0.8％（w/v）アガロースゲル電気泳動による精製に
より約1970塩基対DNAフラグメントを切り出し、ｔ−PA
のＮ−末端をコードする配列がバクテリオファージ T7
及びSV40初期プロモーターのすぐ下流におかれるように
してプラスミドpSVT7（RI^-）のXba I部位に挿入した。
得られたプラスミドをpSVT7（RI^-）/t−PAと称した（図
３を参照）。

その後pSVT7（RI^-）/t−PAをEcoR Iを用いて完全に消
化した。ｔ−PAの472塩基対フラグメント（アミノ酸206
−364を含む領域をコードするヌクレオチド842−1314）
を1.2％（w/v）アガロースゲル電気泳動により精製し
た。このフラグメントを、前以てEcoR Iで消化し、牛腸
アルカリホスファターゼを用いて脱ホスホリル化したバ
クテリオファージM13ベクターM13mp18（Yanish−Perro
n,C.等,Gene.33:103−119（1985）の複製型DNAと連結し
た（図３を参照）。

他に特定しない場合は本文に記載するこれらの、及び
他の標準的組み替えDNA法は（ｉ）Maniatis,T.等,Molec
ular Clonig:A Laboratory Manual,第１版,Cold Sp
ring Harbor（1982）、及び（ii）Meth.Enzymol.,152
巻，出版Berger,S.等,Academic Press,New York（198
7）に記載の要領で行った。

連結DNAをE.coli株TG−１（Gibson,T.,Thesis,Univer
sity of Cambridge,England（1984））にトランスフ
ェクションした。組み替えバクテリオファージにより形
成された白いプラークを採取し、適切な472塩基対EcoR
Iフラグメントの存在を制限マッピング、サザンハイブ
リッド形成、及びDNA配列決定により確認した。

Kunkel,T.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488−492
（1985）；及びKunkel,T.,Meth.Enzymol.,154:367−382
（1987）の記載に従い、５′−ホスホリル化合成突然変
異誘発プライマーを用いて472塩基対EcoR Iフラグメン
トにおける変異を導入した。ｔ−PA変異株の構築に使用
した３種類の突然変異誘発プライマーの配列は以下であ
る： 上記原案はdut^-,ung^-であるE.coliの株、すなわち株C
J236において製造したDNA鋳型を使用する（Kunkel,T.
等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488−492（1985）；及
びKunkel,T.,Meth.Enzymol.,154:367−382（1987））。
DNA鋳型はチミンの位置に少量のウラシル残基を含む。

突然変異誘発プライマーをインビトロで伸びた後、部
分的充填環状DNAをdut⁺,ung⁺であるE.coliの株、すなわ
ちTG−１にトランスフェクトした（Gebson,T.,Thesis,U
niversity of Cambridge,England（1984））。鋳型ら
せん中のウラシル残基を酵素ウラシル Ｎ−グリコシラ
ーゼの作用によりインビボで除去した。これにより鋳型
らせんに致死損害が加えられ、変異株を迅速に、及び有
効に回収することができる。

特に、ウラシル含有鋳型DNAを上に示した５′ホスホ
リル化突然変異誘発プライマーにアニールした。プライ
マーの伸長はE.coliDNAポリメラーゼのクレノウフラグ
メントを用いて15℃にて12−16時間行った。新規に合成
したらせんをバクテリオファージT4 DNAリガーゼを用
いて突然変異誘発プライマーの５′末端に連結し、不適
正を持つ環を形成した。得られたDNAを用いてE.coli株T
G−１（Gibson,T.Thesis,University of Cambridge,E
ngland（1984））のトランスフェクションを行い、多く
のプラークから一重鎖DNAを製造した。これらのDNAの配
列を完全に決定した。その後立証された変異株の複製型
２重鎖DNAを、EcoR Iによる消化、及び1.2％（w/v）ア
ガロースゲルによる電気泳動により単離した。下記に詳
細に記載する通り、変異を含むこれらのフラグメントを
使用して問題のｔ−PA変異株をコードするｔ−PA cDNA
のバージョンを構築した。

C.変異株ｔ−PAのための発現ベクターの構築 プラスミドpSVT7（RI^-）/t−PAにおけるｔ−PAの変異
株は以下のようにして構築した： ｔ−PA cDNAの中心472塩基対EcoR IフラグメントをE
coR Iによる消化、及び1.2％（w/v）アガロースゲルに
よる電気泳動によりpSVT7（RI^-）/t−PAから除去した。
その後残ったプラスミドDNAの直線状フラグメントをオ
リゴヌクレオチド−媒介−突然変異誘発によって作った
472塩基対フラグメントのバージョンに連結した（図３
を参照）。得られたプラスミドをpSVT7（RI^-）/t−PA
（R₃₀₄→Ｓ）,pSVT7（RI^-）/t−PA（R₃₀₄→Ｅ）、及びp
SVT7（RI^-）/t−PA（Del_296-302）と称した。

E.coli株DH−１（Hanahan,D.等,DNA Cloning,1巻，
出版 Glover,D.M.,I.R.L.Press,Oxford,頁109−135（1
985））を上記の変異株プラスミドを用いて形質転換
し、得られた株をそれぞれpSVT7（RI^-）/t−PA（R₃₀₄→
Ｓ）［DH−１］;pSVT7（RI^-）/t−PA（R₃₀₄→Ｅ）［DH
−１］；及びpSVT7（RI^-）/t−PA（Del_296-302）「DH−
１］と称した。正しいフラグメントの存在は適した放射
標識突然変異誘発オリゴヌクレオチドとのハイブリッド
形成により確認し、フラグメントの配向は適した突然変
異誘発オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた制
限マッピング、及びDNA配列決定により確認した。

pSVT7（RI^-）/t−PA（R₃₀₄→Ｓ）［DH−１］、pSVT7
（RI^-）/t−PA（R₃₀₄→Ｅ）［DH−１］、及びpSVT7（RI
^-）/t−PA（Del_296-302）［DH−１］はAmerican Type
Culture CollectionにそれぞれATCC番号67894,67896
及び67895として供託した。

D.COS細胞のトランスフェクション 次に100mmの皿当たり約10⁶個のCOS細胞（Gluzman,Y.
等,Cell,23:175−182（1981））をアルカリリシス法に
より精製した1.0μｇのNAを用いてトランスフェクトし
た（Maniatis,T.等,Molecular Cloning:A Laboratory
Manual,第１版,Cold Spring Harbor（1982））。特
に、吸引により培地をCOS細胞から除去し、単層を10mM
のHEPES（pH7.15）（Sigma Chemical Co.）を含む5.0
mlのダルペッコの培地（GIBCO,Inc.）で１回洗浄した。
洗浄液を除去した後、300μｇのDEAE−デキストラン（P
harmacia,Inc.）を含む1.5mlの洗浄液中の単層にプラス
ミドDNAを加えた。その後単層を6.0％のCO₂を含む湿潤
大気中、37℃にて１時間インキュベートした。この間20
分毎に単層をおだやかに撹拌した。単層をプラスミドDN
Aに１時間暴露した後、10mMのHEPES（pH7.15）を含むダ
ルベッコの培地で１回洗浄し、10％（v/v）の牛胎児血
清（GIBCO,Inc.）を含む10mlのダルベッコの培地、及び
100μＭのクロロキン（Sigma Chemical Co.）を加え
た。その後単層を上記に従い37℃にて４時間インキュベ
ートし、牛胎児血清を含まず10mMのHEPES（pH7.15）を
含むダルベッコの培地5.0mlで２回洗浄した。その後10
％（v/v）の牛胎児血清を含む10mlのダルベッコの培地
を加え、単層を上記に従い37℃にて12時間インキュベー
トした。そして単層を牛胎児血清を含まないそれぞれ5.
0mlのダルベッコの培地で３回洗浄し、同培地中、37℃
にてさらに30−60時間インキュベートした。DEAE−デキ
ストランを含む溶液からプラスミドDNAを省略する以外
は同様の方法で偽−トランスフェクション細胞を処理し
た。インキュベーション期間の最後に上澄み培地を細胞
から集め下記に従い分析した。

E.固相ラジオイムノアッセイによる野生型、及び変異ｔ
−PAの定量 固相ラジオイムノアッセイは基本的にインフルエンザ
HAに関して記載されている方法に従い（Gething,M.J.
等,Nature,293:620−625（1981））、精製ヒトｔ−PAに
対するうさぎの抗血清のIgGフラクションを用いて行
い、COS細胞中の製造された野生型、及び変異ｔ−PAの
量を定量した。この方法によって決定したｔ−PAの濃度
は0.5−1.0μg/mlであった。

F.野生型、及び変異ｔ−PAの酵素によるアッセイ COS細胞中に製造された野生型、及び変異株ｔ−PAの
活性を決定するため、間接的色素澱粉法を行った。この
アッセイにおいては、遊離のｐ−ニトロアニリンが色素
澱粉法の基質、スペクトルザイムPL（Ｈ−Ｄ−ノルロイ
シルヘキサヒドロチロシル−リシン−ｐ−ニトロアニリ
ド 二酢酸塩）（American Diagnostica,Inc.）から、
プラスミノーゲン上のｔ−PAの作用により生成されたプ
ラスミンの作用により放出される。遊離のｐ−ニトロア
ニリンの放出は分光光度分析によりOD₄₀₅nmにて測定し
た。

特に、150−200pgの試験するべきｔ−PA、0.4mMのス
ペクトルザイムPL、0.1μＭのLys−プラスミノーゲン
（American Diagnostica,Inc.）、及び0.5−25μg/ml
の可溶性フィブリン（Des−Ａ−フィブリノーゲン）（A
merican Diagnostica,Inc.）を、50mMのトリス−HCl
（pH7.5）、0.1MのNaCl、1.0mMのEDTA及び0.01％（v/
v）のツイーン80から成る緩衝液中に含む反応混合物を9
6ウェルの平底ミクロタイタープレート（Costar,Inc.）
中で37℃にてインキュベートし、２時間の間15又は30分
間隔でBio−tecミクロプレートリーダーを用いてOD₄₀₅n
mを測定した。偽−トランスフェクション細胞からの緩
衝液、又は適切に希釈した試料のアリコートを標準とし
て分析し、得られたOD値（＜0.01単位）を対応する試験
値から差し引いた。デルタOD値を30分と60分の間の光学
濃度の変化として、すなわち反応の遅滞期、及び１本鎖
ｔ−PAから２本鎖の形態への完全な変換による変化とし
て測定した。標準的アッセイに使用する条件下で（0.1
μＭのLys−プラスミノーゲン及び15μg/mlのDes−Ａ−
フィブリノーゲン）、可溶性フィブリンはｔ−PAの活性
を20−40倍賦活した。結果を図４に示す。

図４に示す通り、上記の本発明のｔ−PA変異株の３種
類全部が酵素として活性であり、その活性の特異性は野
生型の活性と大きく異なるものではないことが見い出さ
れた。さらに上記の本発明のｔ−PA変異株は野生型ｔ−
PAと類似の方法でDes−Ａ−フィブリノーゲンの濃度の
変化に応答することが見い出された。Des−Ａ−フィブ
リノーゲンによる最適刺激は20−40倍であった。これは
Des−Ａ−フィブリノーゲン製造を用いた野生型ｔ−PA
についての他の観察と一致する（Karlan,B.等,Biochem.
Biophys.Res.Comn.,142:147−154（1987））。それぞれ
の場合、Des−Ａ−フィブリノーゲンの濃度が約1.0μg/
mlの場合に半−最適刺激が起きた。

次に飽和濃度のDes−Ａ−フィブリノーゲン（25μg/m
l）、及び種々の濃度（0.02−0.16μＭ）の基質、lys−
プラスミノーゲンの存在下における種々の形態の酵素の
アッセイにより、野生型及び変異株ｔ−PAのK_m及びK_cat
値を決定した。結果を下表Ｘに示す。

上記の表に示す通り、異なるｔ−PA変異株に関するK_m
及びK_cat値は互いに類似していた。又、それらの値はBo
ose,J.等,Biochem.,28:635−643（1989）；及びHoylaer
ts,M.等,J.Biol.Chem.,257:2912−2919（1982）により
報告されている野生型ｔ−PAに関する値とも類似してい
る。

図４及び表Ｘに示されたデータは（ｉ）ｔ−PAのアミ
ノ酸296−302の欠失、及び（ii）304位のArgのSer又はG
luへの置換が、プラスミノーゲンを活性化する、及び可
溶性フィブリン フラグメントにより賦活されるｔ−PA
の能力にほとんど影響しないことを示している。

アミノ酸296−302の欠失、及びArg₃₀₄の置換がｔ−PA
とPAI−１の相互作用に影響するかどうかを調べるため
に、それぞれ250pg（3.8フェントモル）の野生型、及び
変異株ｔ−PAを０−480フェントモル（femtomoles）の
部分的に精製した組み替えPAI−１と共に20分間予備的
にインキュベートした。その後上記の間接的色素澱粉法
により残留酵素活性を測定した。部分的精製組み替えPA
I−１は下記の実施例２の記載にしたがって得た。結果
を図５に示す。

図５に示す通り、３種類の本発明のｔ−PA変異株のす
べてが野生型ｔ−PAと全く異なる挙動を示した。すなわ
ち野生型ｔ−PA（■）がPAI−１により完全に阻害され
る条件下で（24フェントモルのPAI−１）、欠失変異株
ｔ−PA（Del_296-302）（・）はその活性の約95％を保持
していた。高濃度のPAI−１（480フェントモルのPAI−
１）が存在する場合に初めて変異株ｔ−PA（De
l_296-302）（・）の酵素活性がかなりの減少を示した。
２種類の置換変異株、すなわちｔ−PA（R₃₀₄→Ｓ）
（○）及びｔ−PA（R₃₀₄→Ｅ）（□）も程度は異なるが
PAI−１による阻害に対して抵抗性であった。又、図５
に示す通り、Argの代わりにSer又はgluを含む２種類の
置換変異株がその酵素活性の半−最適阻害に要するPAI
−１の量は野生型ｔ−PAのそれぞれ４及び25倍であっ
た。

上記データは、アミノ酸296−302及び304がｔ−PAの
酵素機能に含まれておらず、同種のセリン プロテアー
ゼ インヒビター、PAI−１と酵素の相互作用に重要な
役割を果たすことを示している。モデルとしてトリプシ
ンの構造を用いて、これらのアミノ酸がセリン プロテ
アーゼの活性部位の近辺、及び触媒性３回回転軸からあ
る程度離れた位置にあることが予想される。したがって
ｔ−PAとPAI−１の接触面積はｔ−PAとその本当の基質
であるプラスミノーゲンノ相互作用より広い。

変異株ｔ−PA（Del_296-302）もヒトの血漿中に存在す
るセリン プロテアーゼ インヒビターの複合混合物に
対して抵抗性を示すかどうかを調べるために、上記の原
案において部分的精製組み替えPAI−１をヒトの血漿の
1:100希釈液に置換した。この条件下で野生型ｔ−PAの
活性の約70％が阻害されたがｔ−PA（Del_296-302）の活
性は影響を受けなかった。

さらに野生型ｔ−PA及びｔ−PA（Del_296-302）を、希
釈しないヒトの血漿と共にインキュベートし、混合物を
酸性化してpH5.0とし、12,000xgで５分間遠心した。透
明になった上澄みを希釈し、残留ｔ−PA活性に関して分
析すると変異ｔ−PA（Del_296-302）の場合90％であり、
野生型ｔ−PAの場合20％以下であった。上記の結果は変
異ｔ−PA（Del_296-302）がヒトの血漿中に存在するセリ
ン プロテアーゼ インヒビターの複合混合物に対して
抵抗性であることを示しており、したがって治療薬とし
て野生型ｔ−PAより優れていると思われる。

G.別のｔ−PA変異株 上節Ｆに示したデータはｔ−PAの残基296−302及び30
4が酵素、及び同起源のインヒビター、PAI−１の相互作
用に重要な役割を果たすが、基質、Lys−プラスミノー
ゲンとの相互作用には影響しないことを示す。トリプシ
ンの周知の構造に基づいたｔ−PAの触媒ドメインのモデ
リングは、残基296−302が酵素の活性部位の端において
表面ループを形成することを示唆している。このループ
は正の高い電荷を帯びている。節Ａ及びＦで議論した通
り、この領域の効果がPAI−１との静電的結合の形成に
媒介されているという考えが本発明において提出され
た。この仮定の試験のために、ループ内の帯電した残基
のそれぞれを変え、酵素のPAI−１との相互作用に与え
るその変異の効果を下記に従って評価した。ループ中の
正に帯電した残基がセリン プロテアーゼ インヒビタ
ー、PAI−１の相補的領域と塩橋を形成するならば、負
に帯電した残基で置換すると、これらの２個のタンパク
質の会合の際に同一に帯電した残基が並列するためｔ−
PAとPAI−１の相互作用は崩壊すると予想される。

特に、節Ｂに記載した要領で特定部位の突然変異誘発
を行い、Lys₂₉₆,Arg₂₉₈、又はArg₂₉₉がGlu残基により置
換されたｔ−PA変異株をコードするcDNAの構築に使用し
た。これらの３個の残基のすべてがGluに置換された、
ｔ−PAの３重変異株をコードするcDNAも構築した。さら
に２個のcDNAを製造した；ひとつはHis₂₉₇がTyr残基に
より置換されたｔ−PA変異株をコードし、他方はPro₃₀₁
がGlyにより置換された酵素をコードする。

これらのｔ−PA変異株の構築に使用した６種類の突然
変異誘発プライマーの配列は以下である： 変異酵素ｔ−PA（K₂₉₆→Ｅ）,t−PA（H₂₉₇→Ｙ）,t−
PA（R₂₉₈→Ｅ）及びｔ−PA（P₃₀₁→Ｇ）を上記の要領で
遷移発現ベクターpSVT（RI^-）に連結した。

変異酵素ｔ−PA（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉→E,E,E）、及びｔ
−PA（R₂₉₉→Ｅ）をコードするcDNAを遷移発現ベクター
pSTEに連結した。pSTEはpSVT7の誘導体であり、pSTV7の
350bp Cla I−Hind IIIプロモーター／オリジン フラ
グメントをSV40 cs1085のプロモーター／オリジン領域
からの418bp HpaLL−Hind IIIフラグメントで置換する
ことにより構築した（Dimaio,D.等,J.Mol.Biol.,140:12
9−142（1980）。

得られたプライマーをpSVT7（RI^-）/t−PA（K₂₉₆→
Ｅ）,pSVT7（RI^-）/t−PA（H₂₉₇→Ｙ）;pSVT7（RI^-）/t
−PA（R₂₉₈→Ｅ）;pSTE7（RI^-）/t−PA（R₂₉₉→Ｅ）;pS
VT7（RI^-）/t−PA（R₃₀₁→Ｇ）；及びpSTE7（RI^-）/t−
PA（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉→E,E,E）と称した。

E.coli株DH−１（Hanahan,D.等,DNA Cloning,1巻,Gl
over,D.M.,I.R.L.Press,Oxford,頁109−135（1985））
を上記の変異プラスミドを用いて形質転換し、得られた
株をそれぞれpSVT7（RI^-）/t−PA（K₂₉₆→Ｅ）［DH−
１］,pSVT7（RI^-）/t−PA（H₂₉₇→Ｙ）［DH−１］;pSVT
7（RI^-）/t−PA（R₂₉₈→Ｅ）［DH−１］;pSTE7（RI^-）/
t−PA（R₂₉₉→Ｅ）［DH−１］;pSVT7（RI^-）/t−PA（R
₃₀₁→Ｇ）［DH−１］；及びpSTE7（RI^-）/t−PA（K₂₉₆,
R₂₉₈,R₂₉₉→E,E,E）［DH−１］と称した。正しいフラグ
メントの存在を、適した放射活性突然変異誘発オリゴヌ
クレオチドへのハイブリッド形成により確認し、フラグ
メントの配向を、適した突然変異誘発オリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして使用した制限マッピング、及びDN
A配列決定により確認した。

pSVT7（RI^-）/t−PA（R₂₉₈→Ｅ）［DH−１］;pSTE7
（RI^-）/t−PA（R₂₉₉→Ｅ）［DH−１］；及びpSTE7（RI
^-）/t−PA（K₂₉₆,R₂₉₈,R₂₉₉→E,E,E）［DH−１］をAmer
ican Type Culture CollectionにてそれぞれATCC番
号69157,68154及び68153として供託した。

H.t−PAのチモーゲン−様変異株 上記の通り本発明において、Phe₃₀₅がHisにより置換
されたｔ−PAの変異株はチモーゲン−様物質を示すこと
が仮定された。この仮定に基づき上記Ｂ節に記載した要
領で特定部位の突然変異誘発を行い、Phe₃₀₅がHis残基
により置換されたｔ−PA変異株をコードするcDNAの構築
に用いた。このｔ−PA−ye株の構築に用いた突然変異誘
発プライマーの配列は： であった。

変異酵素ｔ−PA（F₃₀₅→Ｈ）をコードするcDNAを上記
Ｃ及びＧ節に記載の要領で発現ベクトルpSTEに連結し
た。得られたプラスミドをpSTE/t−PA（F₃₀₅→Ｈ）と称
する。

E.coli株DH−１（Hanahan,D.等,DNA Cloning,1巻,Gl
over,D.M.,I.R.L.Press,Oxford,頁109−135（1985））
を上記の変異プラスミドを用いて形質転換し、得られた
株をpSTE/t−PA（F₃₀₅→Ｈ）［DH−１］と称した。正し
いプラスミドの存在を、制限マッピング及び適した放射
性標識突然変異誘発オリゴヌクレオチドへのハイブリッ
ド形成により確認した。472塩基対EcoR Iフラグメント
の配向を制限マッピングにより証明した。

pSTE/t−PA（F₃₀₅→Ｈ）［DH−１］を、1990年９月27
日にAmerican Type Culture CollectionにATCC番号6
8428として供託した。

I.変異ｔ−PAの速度論的特性化 上記Ｇ及びＨ節に記載したプラスミドDNAはその後上
記の要領でCOS細胞のトランスフェクションに使用し
た。得られた条件下の培地の希釈液（典型的には1:30
0）、及び免疫精製酵素の両方を用いて上記の要領でア
ッセイを行った。

次に飽和濃度のDes−Ａ−フィブリノーゲン（25μg/m
l）及び種々の濃度（0.02−0.16μＭ）の基質、Lys−プ
ラスミノーゲンの存在下における種々の形態の酵素のア
ッセイにより野生型、及び変異株ｔ−PAのK_m及びK_cat値
を決定した。結果を下表XIに示す。

上記の表XIの示す通り、上記で議論したいずれの変異
もｔ−PAとその基質との相互作用を変化させなかった。

同様に図６に示したデータは、変異がｔ−PAとその正
のエフェクターであるDes−Ａ−フィブリノーゲンとの
相互作用を変えなかったことを示している。逆に図７に
示したデータは野生型ｔ−PAと変異ｔ−PAのいくつかの
挙動における明確な差を示している。特に３種類の変異
株ｔ−PA、すなわちｔ−PA（R₂₉₈→Ｅ）,t−PA（R₂₉₉→
Ｅ）及びｔ−PA（K₂₉₆,R₂₀₈,R₂₉₉→E,E,E）の場合、セ
ルピン、PAI−１と正常に相互作用する能力が実質的に
変化した。特に三重変異株の挙動は顕著である;200倍モ
ル以上過剰のPAI−１と共に予備的インキュベートを行
った後でさえ活性の損失を示さない。これらの発見はｔ
−PAの表面ループ、すなわち残基396−302が特異的に同
起源のインヒビターPAI−１と相互作用するという提案
を支持しており、この相互作用にArg₂₉₈及びArg₂₉₉が含
まれることを示唆している。これらの観察はｔ−PA、及
びPAI−１の間の特異的相互作用に静電的結合が含まれ
るという仮定を満足する。これらの相互作用に含まれる
ｔ−PAの残基はArg₂₉₈,Arg₂₉₉及びArg₃₀₄である。

１本鎖形態のｔ−PA（F₃₀₅→Ｈ）はその同起源セルピ
ンによる阻害に対して抵抗性を示す。この酵素は、野生
型ｔ−PAより約８倍遅くPAI−１と反応する。

“チモーゲン−様”性質を有するこのｔ−PA変異株
は、従ってセルピン抵抗性酵素のもうひとつの例であ
る。本発明の他の変異酵素と対照的に１本鎖形態のｔ−
PA（F₃₀₅→Ｈ）のみがセルピンによる阻害に対して抵抗
性を示すと思われる。

実施例２ PAI−１変異株 本実施例に記載する方法はセリン プロテアーゼとし
てｔ−PAを、及びセリン プロテアーゼ インヒビター
としてPAI−１を使用する場合を対象としているが、上
記のようなキモトリプシン スーパーファミリーの他の
セリン プロテアーゼ、及び上記のような他のセリン
プロテアーゼ インヒビターを、本発明の精神及び範囲
から逸脱することなく本文の方法を用いて容易に使用す
ることができる。

A.真核細胞におけるグリコシル化PAI−１の発現、精
製、及びアッセイ PAI−１をコードする3.2kb及び2.2kb mRNAから誘導
した２種類のcDNAクローン（Ny,T.等,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,83:6776−6780（1986）；及びPannekoek,H.等,E
MBO J.,５:2539−2544（1986））を使用して哺乳類発
現ベクター中に全長のcDNAを構築した。第１のクロー
ン、ラムダPAI−１は、ヒトの胎盤性cDNAライブラリか
らスクリーニングにより得たcDNAの先端を切り取ったバ
ージョンであり（Dr.Carol Mendelson Center,Dwpart
ment of Biochemistry,Southwestern Medical Cent
er,Dallas,TXより提供）PAI−１の以下の８アミノ酸配
列に対応する合成オリゴヌクレオチドを有する（AVDQLT
RL）（Ny,T.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:6776−6780
（1986）；及びPannekoek,H.等,EMBO J.,５:2539−254
4（1986））。EcoR Iを用いた消化によりこのクローン
から放出されるDNAのフラグメントはNy,T.等,Proc,Nat
l.Acad.Sci.USA,83:6776−6780（1986）に報告されてい
るPAI−１配列のヌクレオチド147−2013に対応した。こ
のフラグメントをプラスミドベクターpUC 18（Yanisch
−Perron,C.等,Gene,33:103−119（1985））にサブクロ
ーニングし、組み替えプラスミドpPAI−１を得た。この
プラスミドからの挿入を、バクテリオファージ ラムダ
gtllに構築したヒトの内皮細胞cDNAライブラリのスク
リーニングに使用した（Huynh,T.等,DNA Cloning,1
巻，出版 Glover,D.M.,I.R.L.Press,Oxford,頁49−88
（1985））。このようにして単離したcDNA クローンの
ひとつ、すなわちラムダ PAI−１−11Aは、５′末端に
２個の余分なヌクレオチドが存在する以外既報の（Pann
ekoek,H.等,EMBO J.,５:2539−2544（1986）PAI−１
cDNAと同一配列の挿入を持つ。このクローンの５′末
端、ヌクレオチド52−1479から誘導したEcoR I−Bgl II
フラグメントをpPAI−１の３′Bgl II−EcoR Iフラグメ
ントに融合させ、pPAI−１−RBRを得た。

哺乳類細胞におけるPAI−１の発現に使用したSV40ベ
クターは以下の要領で構築した。pPAI−１−RBRから放
出されたEcoR Iフラグメントの末端にE.coli DNAポリ
メラーゼのクレノウ フラグメントを満たし、合成Xba
I リンカーに連結し、プラスミドpSV/t−PA3中のｔ−P
Aプラグメントの代わりに挿入し、pSV_L−PAI−１を得た
（Sambrook,J.等,Mol.Biol.Med.,３:459−481（198
6））。SV_L−PAI−１の株を製造し、Doyle,C.等,J.Cel
l.Biol.,105:704−714（1985）に記載の要領で増殖させ
た。

以前にPannekoek,H.等,EMBO J.,５:2539−2544（198
6）及びGinsberg,D.等,J.Clin.Invest.78:1673−1680
（1986）に記載されたPAI−１ クローンはpPAI−１−R
BRによりコードされる配列と同一配列のPAI−１タンパ
ク質をコードし、SV_L−PAI−１の構築にpPAI−１−RBR
の代わりに使用することができた。

CV−１シミアン細胞の単層を37℃で成長させ、SV_L−P
AI−１を注入した。24時間後、培地を血清を含まないダ
ルベッコの培地（GIBCO,Inc.）に置換し、さらに48時間
インキュベーションを続けた。その後分泌されたPAI−
１を含む上澄み培地を0.45ミクロンのフィルター（Nalg
e Co.）を通して濾過した。Nonidet P40（Sigma Che
mical Co.）、及び1.0Mのリン酸ナトリウム（pH7.2）
緩衝液をそれぞれ0.1％（v/v）、及び10mMの濃度まで加
えた。安定化した培地を、20mMのリン酸ナトリウム（pH
7.2）、135mMのNaCl、7.0mMのKClから成る緩衝液（後文
では“PBS"）を用いて１時間当たり50mlの流量で平衡化
したコンカナバリアン Ａ−セファロース 4Bのアフィ
ニティー カラム（充填床容量1.0ml）に適用した。カ
ラムを0.1％（v/v）のNonidet P40を含むPBS、25容
量、0.1％（v/v）のNonidet P40、及び1.0MのNaClを含
むPBS25容量、及び最後に20mMのリン酸ナトリウム緩衝
液（pH7.2）10容量で連続的に洗浄した。結合PAI−１は
20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）中の0.5Mのア
ルファ−メチル−Ｄ−グルコシド（Sigma Chemical C
o.）で特異的に溶離した。PAI−１を含む留分（上記間
接的色素澱粉法においてCalbiochem,Inc.からのウロキ
ナーゼの阻害により分析して）をプールした。その後No
nidet P40を0.1％（v/v）の濃度まで加え、プールした
溶離物1ml当たり0.57gのグアニジン ヒドロクロリド
（U.S.Biochemicals）を加えた。このようにして得た部
分的精製PAI−１を20mMのリン酸ナトリウムから成る緩
衝液（pH7.2）、及び10％（v/v）のグリセロールに対し
て透析し、使用まで−80℃にてアリコートとして保存し
た。

このようにして製造したPAI−１は40μg/mlの全タン
パク質（Biorad Inc.販売によるBradfordの試薬により
分析）、及び12.5％（w/v）のSDS−ポリアクリルアミド
ゲルの染色により分析して15μg/mlのPAI−１を含んで
いた。ウロキナーゼ（それ自身は³H−ジイソプロピルオ
ロホスフェート（New England Nuclear,Inc.からのNE
T−065）を溶いた滴定により活性52％）に対する滴定に
より、本文の記載に従って製造したPAI−１の活性は16.
6％であり、活性PAI−１の濃度は48nMであることが明ら
かになった。

B.突然変異誘発のためのPAI−１部位の選択 PAI−１の残基Glu₃₅₀及びGlu₃₅₁がｔ−PAと相互作用
するという仮定を試験するため、特定オリゴヌクレオチ
ドの突然変異誘発を使用して下表XIIに示すPAI−１の２
種類の変異株を形成した。

変異株PAI−１（E₃₅₀−＞Ｒ）、及びPAI−１（E₃₅₁−
＞Ｒ）はそれぞれGlu₃₅₀及びGlu₃₅₁のArgへの置換を含
み、負に帯電したGlu残基を正に帯電したArg残基に代
え、ｔ−PA（R₃₀₄−＞Ｅ）に存在する負に帯電したGlu
残基との有力な相互作用を促進するために選択的に選ん
だ。置換がｔ−PAの残基Arg₃₀₄に導入された特異的変異
と相補的であれば、Glu₃₅₀をｔ−PA（R₃₀₄−＞Ｅ）変異
株などとの相互作用が強化されたPAI−１を形成する他
のいろいろな置換基に、本発明の精神及び範囲から逸脱
することなく置換することができた。

C.PAI−１のオリゴヌクレオチド−媒介突然変異誘発 第１に、メチオニル−PAI−１を直接発現し、１方で
発現ベクターからのシグナル配列及びcDNAの３′非翻訳
領域を除去するための、プラスミド pPAIST7と称するP
AI−１発現プラスミドの構築が必要であった。この達成
のため、合成DNAリンカーを使用してPAI−１コード配列
の両末端の再構築、及び成熟PAI−１の第１残基をコー
ドするトリプレットの直前にATGタンパク質合成開始コ
ドンの導入を行った。さらにプラスミドpBR322へのcDNA
コード領域の挿入を容易にするため、PAI−１ cDNAフ
ラグメントのそれぞれ５′及び３′末端に、EcoR I及び
Hind III制限エンドヌクレアーゼ認識部位を形成するリ
ンカーを設計した。

特にApaLi及びPflMIを用いてpPAI−１−RBRを消化す
ることによりプラスミドpPAIST7を得た。得られたPAI−
１の残基１のための2bpのコドン、及び379残基タンパク
質の残基２−376のための全コード配列を含む1127bpフ
ラグメントをゲル電気泳動により精製した。次に合成リ
ンカー（５′末端にて10bp、及び３′末端にて13bp）を
1127bp ApaLI、及びPflMI DNAフラグメントと連結
し、EcoRL及びHind IIIを用いて消化し、1146bp EcoR
I−及びHind III−消化DNAフラグメントをゲル電気泳動
により単離した。その後このフラグメントをEcoR I−及
びHind III−消化pBR322にクローニングした。

発現プラスミドの構築の開始のために、サブクローン
をEcoR Iで消化し、直鎖プラスミドを細菌のアルカリホ
スファターゼを用いて脱ホスホリル化した。その後trp
プロモーター、及びリボソーム結合部位を含むpC5A−48
からの360bp EcoR I DNAプラグメント（Franke,A.等,
Meth.Enzymol.,162:653−668（1988））を用いて、二フ
ラグメントを連結することによりPAI−１発現プラスミ
ドを構築した。次に、得られたプラスミドを用い、Mani
atis,T.等,Moleoular Cloning:A Laboratory Manua
l,第１版,Cold Spring Harbor（1982）に記載の要領
でE.coliの形質転換を行った。得られた形質転換物のプ
ラスミドDNAをHind IIIを用いた制限分析によりtrpプロ
モーターフラグメントの存在、及び配向に関してスクリ
ーニングを行った。多くの形質転換物がtrpプロモータ
ーに隣接してインヒビターの直接の発現に必要な立体配
置でPAI−１遺伝子を持つプラスミドを含むと同定され
た。それらのプラスミドのひとつをpPAIST7と称した。

アミノ酸残基Val₂₈₄からPro₃₇₉までをコードするPAI
−１のヌクレオチド配列を含むプラスミドpPAIST7のSal
I−Hind IIIフラグメントをSal I−Hind III消化複製
型M13mp18（図８を参照）に連結した。連結DNAをE.coli
株TG−１にトランスフェクトした。組み替えバクテリオ
ファージにより形成された白色プラークを採取し、適し
た290塩基対Sal I−Hind IIIフラグメントの存在をサザ
ン ハイブリッド形成、制限マッピング、及びDNA配列
決定により確認した。

290塩基対Sal I−Hind IIIフラグメントにおける変異
をｔ−PAについての上記の記載の要領で５′−ホスホリ
ル化合成突然変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーを
用いて導入した（図８を参照）。これらのPAI−１変異
株の構築に使用した２個の突然変異誘発プライマーの配
列は以下である： 得られたPAI−１ DNAの変異株Sal I−Hind IIIフラ
グメントの配列を完全に決定した。立証された変異株の
DNAの二重鎖複製型を単離し、変異290塩基対Sal I−Hin
d IIIフラグメントをSal I−Hind III消化、及び6.0％
（w/v）の非変性ポリアクリルアミドゲルを通した電気
泳動により単離した。下記に詳細に記載する通り、変異
を含むこれらのフラグメントを使用し、問題のPAI−１
変異株をコードするPAI−１ cDNAのバージョンを再構
築した。

D.変異株PAI−１のための発現ベクターの構築 プラスミド pPAIST7HS（ヌクレオチド対１におけるH
ind III部位、及びヌクレオチド対2106におけるSal I部
位の欠落したプラスミドpPAIST7の誘導体であり、PAI−
１ cDNAコード配列における変異Sal IのHind IIIフラ
グメントへの交換を容易にするために構築された）にお
けるPAI−１の変異株を以下の要領で構築した： PAI−１ cDNAの中心290塩基対のSal IからHind III
までのフラグメントを、Sal I及びHind IIIを用いた消
化、及び1.0％（w/v）アガロースゲル電気泳動によりプ
ラスミドpPAIST7HSから除去した。その後ベクターDNAの
残留直鎖フラグメントを特定オリゴヌクレオチドの突然
変異誘発で製造した上記の290塩基対Sal IからHind III
フラグメントの変異株バージョンに連結した（図８を参
照）。得られたプラスミドをpPAIST7HS（E₃₅₀→Ｒ）及
びpPAIST7HS（E₃₅₁→Ｒ）と称した。

E.coli株DH−１（Hanahan,D.等,DNA Cloning,1巻，
出版 Glover,D.M.,I.R.L.Press,Oxford,頁109−135（1
985））を上記変異プラスミドを用いて形質転換し、得
られた株をそれぞれpPAIST7HS［DH−１］;pPAIST7HS（E
₃₅₀→Ｒ）［DH−１］；及びpPAIST7HS（E₃₅₁→Ｒ）［DH
−１］と称した。E.coli株TG−１（Gibson,T.,Thesis,U
niversity of Cambridge,England（1984））を上記変
異プラスミドを用いて形質転換し、得られた株をそれぞ
れpPAIST7HS［TG−１］;pPAIST7HS（E₃₅₀→Ｒ）［TG−
１］；及びpPAIST7HS（E₃₅₁→Ｒ）［TG−１］と称し
た。正しいフラグメントの存在を適した放射標識突然変
異誘発オリゴヌクレオチドへのハイブリッド形成、及び
核酸配列決定により確認した。pPAIST7HS（E₃₅₀→Ｒ）
［DH−１］；及びpPAIST7HS（E₃₅₁→Ｒ）［DH−１］をA
merican Type Culture CollectionにてそれぞれATCC
番号68155及び68156として供託した。

E.野生型、及び変異株PAI−１の発現、抽出、及びア
ッセイ E.coli株pPAIST7HS［TG−１］,pPAIST7HS（E₃₅₀→
Ｒ）［NG−１］，及びpPAIST7HS（E₃₅₁→Ｒ）［TG−
１］を、ルリアーベルタニ ブイヨン中で37℃にて飽和
濃度まで終夜成育した。50μｌの培養物を使用して、１
リットル当たり6.0gのNa₂HPO₄,3.0gのKH₂PO₄,0.5gのNaC
l,0.5gのNgSO₄・7H₂O,1.0gのNH₄Cl,5.0gのカサミノ酸、
10.0gのグルコース、10.0mlのグリセロール、1.0mgのチ
アミン−HCl、及び25mgのアンピシリンを含む修正M9培
地（pH7.4）50mlに接種した。250mlのアーレンメイヤー
フラスコ中、37℃にて培養細菌を22時間成育した。抽出
細胞を以下の要領で培養物から得た。

E.coliを遠心によりペレット化し、20mlの冷50mMトリ
ス−HCl（pH8.0）、及び1.0mMのEDTA中で遠心により洗
浄し、氷上の3.6mlの同緩衝液中に再懸濁した。1ml当た
り10mgのリソチーム0.4mlを添加して20分間、0.1mlの10
％（v/v）Nonidet Ｐ−40を添加して10分間、及び0.2m
lの5.0M NaClを添加して10分間抽出を行った。聴音器
（sonifier）／細胞切断器のミクロチップを50％使用サ
イクル、及び設定７（Branson Sonic Power Compan
y）で使用して細胞を短く切断し、粘度を下げ、４℃に
て30分間15,000xgの遠心を行った。透明な溶菌体に10％
（v/v）までグリセロールを加え、PAI−１を含む抽出物
を使用まで−80℃にてアリコートとして保存した。

哺乳類細胞に発現したPAI−１に関して上記に記載し
た要領でウロキナーゼを用いて24℃にて３時間インキュ
ベートすることにより、抽出物を活性PAI−１に関して
滴定した。野生型PAI−１、PAI−１（E₃₅₀→Ｒ）、及び
PAI−１（E₃₅₁→Ｒ）の抽出物はそれぞれ803nM,593nM、
及び162nMの活性PAI−１を含んでいた。

野生型、及び変異株ｔ−PAと野生型、及び変異株PAI
−１の相互作用の速度に関する速度論的測定を、0.1mM
のEDTA及び0.1％（v/v）のツイーン20を含む0.1Mトリス
−HCl緩衝液（pH7.4）中、24℃にて行った。上記のｔ−
PAに関する間接的色素澱粉法を用いて残留酵素活性を時
間の関数として決定した。ｔ−PAに対して過剰のPAI−
１の偽−１次条件下で、時間に対する残留ｔ−PA活性の
直線状片対数プロットの傾きから各インヒビター濃度に
関して半減期（ｔ_1/2）を決定した。見掛けの速度定数
（k_app＝0.693/t_1/2）をインヒビター濃度で割って速度
定数、k₁を算出した。

60pMのｔ−PAの阻害の速度を、偽−１次条件下で0.6
−100nMの範囲のインヒビター濃度にて研究した。ｔ−P
A−PAI−１混合物をマイクロタイタープレートウェル
中、24℃にて種々の時間（０−30分）予備的にインキュ
ベートし、その後Lys−プラスミノーゲン、スペクトロ
ザイム PL、及びDes−Ａ−フィブリノーゲンをそれぞ
れ最終濃度300nM,0.4nM及び12.5μg/mlまで添加した。
基質の添加後、マイクロタイタープレートを37℃にてイ
ンキュベートし、405nmにおける吸収を２次間追跡して
残留ｔ−PA活性を決定した。

野生型、及び変異株PAI−１による野生型、及び変異
株ｔ−PAの阻害の最高速度定数（M^-1s^-1）を下表XIIIに
示す。

上記の表XIIIに示す通り、PAI−１（E₃₅₀→Ｒ）及びP
AI−１（E351→Ｒ）の両方とも、野生型PAI−１と比較
してｔ−PA（R₃₀₄→Ｅ）との相互作用の速度定数が増加
しており、変異によりセリン プロテアーゼ インヒビ
ター−抵抗性ｔ−PA（R₃₀₄→Ｅ）の阻害に関するPAI−
１の能力が復活したことを証明している。

本発明を特別な具体化を参照して詳細に説明したが、
種々の変化及び修正が本発明の精神、及び範囲から逸脱
することなく可能であることが同業者には明らかであろ
う。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゴールドスミス， エリザベス・ジエイ アメリカ合衆国テキサス州75209ダラ ス・チエロキートレイル4626 (72)発明者 ゲシング， メアリジエーン・エイチ アメリカ合衆国テキサス州75229ダラ ス・アービンシモンズドライブ4320 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/64 A61K 38/48 ACB C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＭＥＤＬＩＮＥ (54)【発明の名称】 同起源インヒビターによる阻害に対して抵抗性のキモトリプシンスーパーファミリーのセリンプ ロテアーゼ変異株及びそれをコードする遺伝子、ならびにセリンプロテアーゼインヒビター変異 株及びそれをコードする遺伝子

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ｔ−PAの位置305におけるフェニルアラニ
   ンが塩基性アミノ酸によって置換され且つｔ−PAの位置
   292におけるアラニンがセリンによって置換されている
   ｔ−PAの変異体。
2. 【請求項２】１本鎖形態の変異体がPAI−１、PAI−２及
   びPAI−３からなる群より選ばれるセルピン インヒビ
   ターによる阻害に対して抵抗性である請求の範囲第１項
   記載の変異体。
3. 【請求項３】セルピン インヒビターがPAI−１である
   請求の範囲第２項記載の変異体。
4. 【請求項４】ｔ−PA（F₃₀₅→H,A₂₉₅→Ｓ）である請求の
   範囲第１項記載の変異体。
5. 【請求項５】トリプシンの位置40におけるヒスチジンに
   対応するｔ−PAにおけるフェニルアラニンが塩基性アミ
   ノ酸によって置換され且つトリプシンの位置32における
   セリンに対応するｔ−PAにおけるアラニンがセリンによ
   って置換されているｔ−PAの変異体をコードする遺伝
   子。
6. 【請求項６】１本鎖形態の変異体がPAI−１、PAI−２及
   びPAI−３からなる群より選ばれるセルピン インヒビ
   ターによる阻害に対して抵抗性である請求の範囲第５項
   記載の遺伝子。
7. 【請求項７】セルピン インヒビターがPAI−１である
   請求の範囲第６項記載の遺伝子。
8. 【請求項８】変異体ｔ−PA（F₃₀₅→H,A₂₉₅→Ｓ）をコー
   ドする請求の範囲第５項記載の遺伝子。
9. 【請求項９】ｔ−PAがヒトｔ−PAである請求の範囲第５
   項記載の遺伝子。