JPS62500420A - ヒトα↓１−アンチトリプシン誘導体及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトα１−アンチトリプシン 誘導体及びその製造法 本発明は、ヒトα１−アンチトリプシンアナコーグ、その製造法及びそれら化合 物を含有する医薬組成物に関する。

本出願人名義のフランス特許出願Ｎｏ、８３００９０９及び対応するヨーロッパ 特許Ｎｏ、８４４００１２６に記載のように、遺伝子工学技術によりヒトα１− アンチトリプシン活性造することができる。

本特許出願は、該化合物の応用の可能性を著るしく増大させるものである。

ヒトα１−アンチトリプシン活性に関するより詳細な研究により、この生成物の アナローブが提供し得る利点を確立することができた。

α１−アンチトリプシンの最も重要な生理学的役割は、気道下部における好中球 エラスターゼの阻害である。

健常な肺においては、α１−アンチトリプシンとエラスターゼとは、バランスよ く作用して、異物のまわりに液化域を作り、それらを排出する。

この平衡がくずれてエラスターゼが優勢になると、プロテアーゼの作用は制御さ れず、組織にかなりの障害を与える。こうして、臨床的には気腫となる。

このようなアンバランスは、遺伝性α１−アンチトリプシン欠乏症例に認められ る。

非遺伝性気腫の最も多い原因は、喫煙である。この場合には、種々の因子の相互 作用により、肺胞のプロテアーゼ／抗プロテアーゼはアンバランスになる。α１ −アンチトリプシン活性は、酸化により、例えば９！！煙自体により直接にある いは汚染煙粒子の存在のため肺に生じるマクロファージにより放出される酸素ラ ジカルにより低下する。さらに、これらマクロファージ（これ自体エラスターゼ を産生ずる）は、化学走性因子を分泌し、その部位で好中球エラスターゼを遊離 する。

また、α１−アンチトリプシンはおそらく蛋白分解切断による非可逆性不活性化 に反応しやすくなる。即ち、ヘビースモーカーの肺には、肺の破壊的疾患に導き 得るエラスターゼの混入が存在する。

もし、先述のフランス特許出願に記載のように、前記のあらゆる種類のアンバラ ンスを処置するのに細菌性のα１−アンチトリプシン（以下α＋　ＡＴと称する ）を使用できるとしても、インビボでの安定性が改善されたα＋　ＡＴアナロー グを提供することは興味あることと思われる。

このことが、本発明が、特にインビボでの安定性が改善された、特に酸化に対す る耐性が増大したα＋　ＡＴアナローグを提供している理由である。

多くの研究により、α＋ＡＴの不活性化は、おそらく、エラスターゼ固定部位に 位置することが明らかにされている第３５８位のメチオニン残塁の酸化によるも のであることが判明している。

本発明は、従って、第３５８位にアミノ酸、メチオニン、の代りにバリンのよう な非酸化性アミノ酸を含有するヒトα＋　ＡＴ、並びに相応するα＋　−Ａ−ｒ アナローブを細菌、特に大腸菌中で製造することに関する。

種々の基質へのエラスターゼの固定に関する研究により、メチオニンをバリンに 変えるとα＋ＡＴとエラスターゼ間の結合定数は改善され、アナローブの活性は 増大することが明らかにされている。

さらに、α＋−ＡＴは、エラスターゼ、トリプシン、キモトリプシン、プラスミ ン及びトロンビンを含む人聞のセリンプロテアーゼを阻害する。その最も重要な 機能は、前述のように、気道中の好中球エラスターゼの阻害である。

凝固過程におけるα＋ＡＴの役割は、そのトロンビン阻害能により示唆される。

この酵素は、血液凝固カスケードにおける最終段階であるフィブリノーゲンのフ ィブリンへの切断に関与する。

トロンビンは、また、血小板凝集をトリガーし、第ｖ１第■及び第ＸＩ［［因子 の活性化を触媒する。

α＋−ＡＴによるトロンビンの不活性化は、複雑な過程である。モル比１：１： では、不活性化は弱（不完全であるが、α１−アンチトリプシンをモル過剰にす ると、阻害率は増大し、トロンビンは完全に阻害される。しめ１し、α１−アン チトリプシン欠乏ホモ接合体の場合には、凝固入道症状は観察されないので、α １−アンチトリプシンは、血液凝固の制御において重要な役割を演じていないこ とが確実であると思われる。

トロンビンＩＩ［（ＡＴ−１［［）及びα２−マクログロブリンの活性に完全に 帰因する。

最近の成る刊行物には、α１−アンチトリプシン変異体（（Ｚ＋−ＡＴピッツバ ーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）　）が記載されており、これは分子の第３５８位 反応性部位のレベルでメチオニンをアルギニンで置換した単一ヌクレオチドの装 入を含んでいる。このα＋　ＡＴ変異体は、破壊的障害を起こし、１４才の患者 を死亡せしめた。このα。

−ＡＴ変異体は、もはやエラスターゼ阻害因子としては作用せず、数百倍増大し た抗トロンビン活性を示す。この活性は、ヘパリンの作用とは無関係である。

これらの観察は、α＋ＡＴ及びＡＴ−１［１のアミノ酸配列を比較することによ り説明されるかもしれない。これらプロテアーゼ阻害因子は、構造の２９％が共 通しており、両者がある共通蛋白に由来していることを示している。

それらの反応中心は、類似の配列を示している：α１−アンチトリプシンの中心 部分にはメチオニン残基が見られ、これはエラスターゼにとって好ましい切断部 位であり、一方、同じ場所にＡＴ−Ｉ［１はアルギニン残基を有しており、これ はトロンビンにとって好ましい部位である。

このように、α＋　ＡＴピッツバーグにおいて、メチオニンのアルギニンによる 置換は、エラスターゼに対する阻害特異性をトロンビンに対するそれに変化させ る。

従って、本発明は第一に、α＋ＡＴの全部又は一部、に相応する蛋白において第 ３５８位のアミノ酸（通常はメチオニン）がアルギニンまたはインビボにおいて 全くあるいはほとんど酸化され得ないアミノ酸、即ち、特にグリシン、アラニン 、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンによって置換されている ヒトα＋　−ＡＴアナローグに関するものである。

本明細書の記載において、「α＋−ＡＴＪとは、それらの構造は完全には知られ ていないがこの蛋白の種々の自然変異体であるものの１つであることを意味して いる。

アミノ酸の番号付けは、通常採用されているものであり、第１アミノ酸はクラチ ら及びチャンドラらの刊行物にあるグルタミンである（第１図）。

更に詳しくは、第３５８アミノ酸は、エラスターゼ固定領域にあり、本発明の化 合物においては、この領域は下記の構造を有することが好ましい： ａ　Ｉ　ａ　−ｉ　Ｉ　ｅ−ｐｒｏ−Ｘ−ｓｅｒ　−ｉ　Ｉ　ｅＸは、ａｒｇ、 ｇｌｙ、ａｌａ、ｖａｔ、ｉ　Ｉｅ。

Ｉ　ｅｕ、またはｐｈｅである。

勿論、「α＋ＡＴＪという表現もまた、非反応性部位で突然変異を起こし得る黒 変異体を示している：この変異は、特に、遺伝子の点変異の技術によるアナ口− グの製造において起こるかもしれない。

本発明アナローブのうち、下記の２つが特に興味深（１：（ＡｒＱ３５８）（Ｘ ＋−ＡＴ　及び （Ｖａ　１３５８）（Ｘ＋　ＡＴ。

更に、最近の研究により、通常の血漿α＋ＡＴは、２つの形、即ち１つは既述の 形で、もう１つは５つのアミノ酸のＮ末端欠失を含む形で存在することが明らか にされている。

このことが、本発明が、αＩ　−ＡＴ又はそのアナローブの配列がその５つのＮ 末端アミノ酸だけ切り取られていることを特徴とする、前述のようなα、−ＡＴ 誘導体又はαｌ　−ＡＴアナローグに関する理由である。

現在進行中の研究によれば、この截頭形又は切断形は、血漿中の天然分子の再配 列に由来するものと思われる。

この截頭形は、天然形より約１０倍低い濃度で存在する。

これら截頭変異体に関する試験により、これらが天然蛋白のようなエラスターゼ の有効な阻害因子であることが明らかにされている。

本発明は、また、宿主細胞、特に、成熟蛋白の第３５８アミノ酸に相応するコド ンがアルギニン又は蛋白中に統合される時酸化されない天然アミノ酸をコードす るかまたはα＋ＡＴあるいはそのアナローブをコードするＤＮＡ配列が５′末端 で１５個の塩基を欠失しているα＋−ＡＴをコードするＤＮＡ配列の発現ベクタ ーを含有する微生物を培養することを特徴とする、α１−ＡＴ。

アナローブの製造法に関する。

発現ベクターの性質は、明らかに使用される微生物に依存している。

微生物が最近、特に大腸菌である場合、ベクターは大腸菌中に複製開始点、例え ばｐＢＲ３２２の複製開始点を含んであるプラスミドであることが好ましい。

細菌中でのα＋−ＡＴＩ伝子に対する発現プラスミドは、本出願人によるヨーロ ッパ特許Ｎ０１８４　４００１２６並びにベルギー特許Ｎｏ、８９５９６１に記 載されている。

細菌性ベクタープラスミドのうち、λファージのプロモーター、Ｐ、プロモータ ー及びλの蛋白Ｃ■リボソー　；ム（ＣＩＩλｒｂｓ）固定部位又はヨーロッパ 特許Ｎｏ、８４　４００１２６に記載されているような合成部位を含むものを使 用するのが好ましい。

さらに、これらプラスミドは、Ｎｉ伝子の全部又は一部を含有することができる 。これらプラスミドのその他の特徴は、実施例及び前記引用特許に明らかにされ ている。

微生物が酵母である場合、ヨーロッパ特許Ｎｏ、０１０３４０９に記載のベクタ ーをベクタープラスミドとして、使用することができる。該酵母がサツカロミセ ス・セレビシェ株である場合、該ベクターは、２μプラスミドの複製開始点及び 前記ヨーロッパ特許出願に記載のもののうち酵母プロモーターを含んでいること が好ましい。

一般に、発現ベクターの正確な構造は、本発明の本質的特徴を構成しない。

α＋−ＡＴアナローグをコードする配列は、クローンの天然α＋ＡＴ配列から既 知の方法により製造してもよい。

制限／ライゲーションにより、修飾することが望まれる遺伝子部分を、所望のア ナローブをコードする配列を含む合成遺伝子で置換することができる。

しかしながら、特にアナローブのコドンがメチオニンコドンＡＴＧに比し、また クレオチドＩＩＩＩＵだけ異なっている場合、点突然変異により行なうこともで きる；これは、例えばバリンの場合ＧＴＧ、アルギニンの場合ＡＧＧ、又はＯイ シン、イソロイシン又はフェニルアラニンの場合である。

この点変異法は実論例に詳細に記載する。

α＋　−ＡＴのクローンならびにそれらの製造は既知であり、クラチら及びチャ ンドラらの刊行物、並びに種々の特許や前記特許出願に記載されている。

これらの製造法において使用されている方法は、原則として既知であり、及び／ 又は、引用資料に記載されている。

α＋　ＡＴアナローグを得るため、ベクターにより菌株を形質転換すること、並 びに形質転換体の培養条件も既知であり、使用される微生物に依存する。

本発明のα＋　ＡＴアナローグは、切り取られているかいないかにかかわらず、 薬物として、特にα＋ＡＴの代りに、遺伝性又は非遺伝性α＋　−ＡＴ欠乏の治 療に、例えば肺気腫の治療及び予防に用いることができる。

第３５８位にアルギニンを含むアナローブは、抗凝固能を有し、特に抗凝固剤と して使用し得るであろうが、血液を処理、分析、保存する研究所においても使用 できる。

例えば、このアナ口−グは、血栓症の治療及び予防、並びに腫脹を減じるため顕 微外科において使用できよう。

このα＋−ＡＴアナローグの利点の１つは、ヘパリンと違って、これが直接作用 し、ＡＴ−ＩＩＩのような成分を介して作用するのではないことであろう；とこ ろで、手術ショックの場合には、ＡＴ＝ＩＩ［の低下がしばしば認められ、これ ら条件下ではヘパリンはα＋　−ＡＴアナローグと違って、抗凝固剤としてその 役割を果すことができない。

実験室での使用の場合、α＋−ＡＴアナローグは、例えば、体外循環又は血液分 析において使用することができる。

本発明の種々の変異体は、特に好中球エラスターゼ及びトロンビンの分析に、生 物学的試薬としても使用できる。

特に、変異体（Ｌｅｕ３５８）ａｔ　−ＡＴ及び（ｌＶｌｅｌ：３５８）（２１ ＡＴは、カテプシンＧの阻害剤として有用である。

使用量は、勿論、治療疾患の種類及び使用アナローブの正確な性質に大きく依存 しており、当業者にとって既知の方法により適応させなければならない。

同様に、医薬組成物の正確な性質は、予定される投与経路に依存しており、本発 明の特徴の１つを構成するものではない。

最後に、これら種々の化合物は、例えばビーズ又はチューブのような適当な支持 体に固定した形で使用してもよい。

以下の実施例は、本発明のその他の特徴や利点を明らかにするために示すもので ある。

付図は次の通りである： ・第１図は、α＋ＡＴをコードするコト遺伝子のＣ［）ＮＡ配列である。

・第２図は、大腸菌／１）ＴＧ９９９から得た生成物の抗エラスターゼ活性を示 す。

・第３図は、大腸菌／ｐＴＧ１９００抽出物の抗エラスターゼ活性を示す。

・第４図は、大腸菌／ｐＴＧ１９００抽出物の抗トロンビン活性を示す。

及びヘパリン存在下でのＡＴ−１［［の抗トロンビン活性の比較を示す。

・第６図は、ｐＴＧ９２０の調製図を示す。

・第７図は、ｐＴＧ９２９のｖＡ調製図示す。

・第８図は、ｐＴＧ９２６の調製図を示す。

・第９図には、α＋　−ＡＴ遺伝子内での適当なりＮＡ断片の置換による変異体 の調製法を図示する。

・第１０図は、ヒト好中球エラスターゼの種々の変異体に対する阻害率（％）の 変化を示す。

・第１１図は、ヒトカテプシンＧの種々の変異体に対する阻害率（％）の変化を 示す。

・第１２ａ〜１２ｅ図は、ＣＮＳ処理後のエラスターゼの種々の変異体に対する 阻害の割合（％）を示す。

・第１３図は、截頭変異体の調製図を示す。

実施例１−（Ｖａ　１３５８）　α＋　−ＡＴヒトα＋　ＡＴ遺伝子のインビト ロにおける直接変異誘メチオニンをバリンで置換する変異は、単一塩基の装入が 必要である（ＡＴＧはＧＴＧを生じる）。該部位の直接変異誘発は、まず単鎖遺 伝子のモデルとハイブリッド化され、次いでＤＮＡポリメラーゼにより補助調合 成用のイニシエーターとして作用してもよい合成オリゴヌクレオチド（変異した 配列を有する）を用いることにより得ることができる。

このようにして、二重鎖配列が得られ、この鎖のうちの１つは野生型に相応する 配列を含んでおり、もう１つは変異した配列を含んでいる。

一本鎖α＋−ＡＴ遺伝子を含むＭ２Ｓのゲノムをモデルとして用いれば、得られ た二重鎖分子は、大腸菌宿主細胞を形質転換するのに用いることができるであろ う。

また変異体遺伝子を含有するファージは、プレートをスクリーニングすることに より同定できるであろう。

ヒトα＋ＡＴのｃＤＮＡクローニング及びその大腸菌内での発現は、既に、例え ば前記特許に開示され、更にコートニー　＜　ｃｏｕｒｔｎｅｙ）ら（１９８４ ）によって記述されている。

α＋ＡＴを生産するクローンｐＴＧ９８３は、大腸菌の総細胞蛋白の約１％に相 当するレベルで生物学的に活性なα＋ＡＴを生産する。

α＋　ＡＴ配列を変えるえるため、ｐＴＧ９８３から部位間に導入する。

次いで、−木調コードＤＮＡを、宿主細胞旦。

ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３の感染後に得られるファージ粒子から分離する。オリゴヌ クレオチド５’　−ＡＴＡＧＡＣＡＣＧＧＴＡＴＧ−３’　（化学的に合成した ）をモデルＤＮＡと１００倍モル過剰において、１００℃で５分間加熱し、続い てゆっくりと４℃に冷却することによりハイブリッド化する。このオリゴヌクレ オチドは、α１−ＡＴの活性部位領域と相補性であるが、メチオニンコドンの代 りにバリンコドンを含んでいる：もとの配列： ａｌａ　ｉｌｅ　ｐｒｏ　ｍｅｔ　Ｓｅｒ　１ｌｅＧＣＣＡＴＡ　ＣＣＣＡＴＧ 　ＴＣＴ　ＡＴＣ変異した配列： ａｌａ　ｉｌｅ　ｐｒｏ　ｖａｌ　ｓｅｒ　１ｌｅＧＣＣＡＴＡ　ＣＣＣＧＴＧ 　ＴＣＴ　ＡＴＧ次に、第２鎖の合成を、試料（−末鎖ＤＮＡ０．５ｐｍｏｌ） を室温で２時間、ＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ断片）２００μｏ／ｍＱ、ＴＡ 　ＤＮＡリガーゼ４０μ／鵬、三リン酸デオキシヌクレオチド０．５ｍＭ、及び ＡＴＰｌｍＭと共に緩衝液（８ｍＭＴｒ　ｉ　５−ＨＣｔＱ（ｐＨ７，５）／８ ｍＭＭｇＣ（！２／４０ｍＭＮａＣＱ／６ｍＭβ−メルカプトエタノール）中で 培養することにより行なう。

続いて、試料を６５℃で１０分間加熱し、リガーゼ１単位及びＡＴＰｌｍＭを加 え、再び４℃で１６時間培養する。反応混合物の一部を用い、旦、ｃｏｌｉ　Ｊ Ｍ１０３適格細胞を形質転換する。ファージ領域を１８プレート上に標定し、得 られたコロニーをニトロセルロースフィルタに吸着させ、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼを用いて、３２ｐで標識した変異オリゴヌクレオチドとのバイブリプ− ジョンにより変異体ファージを明らかにするために選択する。

適切な条件下では、オリゴヌクレオチドは、完全に相同な配列を用いる場合にの み安定なハイブリッドを形成する、即ち、変異がおこる。この場合、３ｘｓｓｃ 、１Ｘデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）　、０．５％ビロリン酸ナトリウム、０ ．１％ＳＤＳ中５０℃でのパイプリゾ−ジョンを行なうと、効果的に選択するこ とができる。

ファージＤＮＡは、ポジティブなコロニーの培養物から調製され、ＪＭ１０３細 胞を形質転換するのに用いられる。次に、得られたプレート由来のＤＮＡは、ジ デオ　；、キシ鎖の停止法により配列決定される。ヌクレオチド配列により、遺 伝子の所望の部位に変異が得られたことが確認される。

変異したα＋−ＡＴ遺伝子の断片、Ｂｑ　ｌ　ＩＩ−Ｐｓｔ工、はＭ１３ゲノム から切断され、ＢｇＩ　ＩＦ／Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片の切除後、発現プラスミドｐＴ Ｇ９８３中に導入される。この操作により、ｐＴＧ９８３と類似のプラスミドｐ ＴＧ９９９が得られるが、前者はα＋　−ＡＴをコードする遺伝子がエラスター ゼ固定部位レベルで変異を含むことだけが異なる。

大腸菌での（Ｖａｔ３５８）α＋　ＡＴ１７）発現エラスターゼ固定部位レベル の変異体（ｐＴ６９９９）の発現を直接ｐＴＧ９８３と比較する。α＋　−ＡＴ の合成レベル及び生物活性は、２種のクローンにおいて同等であることが明らか にされる。

２８℃で発育させたｐＴＧ９８３、ｐＴＧ９９９及びｐＴＧ９５１　（α＋　− ＡＴをコードする遺伝子でのｐＴＧ９８３に相応する陰性対照）の半対数培養期 （約１０８個／鵬）を３７℃で５時間加熱することにより誘導する。このことに より、低温でｐＬプロモーターからの転写を阻止することにより、α＋−ＡＴｍ 伝子の発現を抑制する宿主によりコードされるレプレッサーＣｌ８５７は不活性 化される。細胞を集めた後、再懸濁細胞を超音波により粉砕し、残層を遠心分離 により除去し、上澄液の蛋白濃度を標準法（バイオラド）により測定する。　各 抽出物中のα＋−ＡＴ１１度は、放射免疫拡散法（ＲＩＤ）によりキット（カル ビオヶムーベーリング）を用い測定する。免疫沈降リングの直径は、標準血清稀 釈シリーズとの比較により算出される試料中の抗原濃度に比例する。

このテストにより、ｐＴＧ９８３及びｐＴＧ９９９は、総細胞蛋白の０．６５及 び０．５５％のレベルでα１−ＡＴを生産することが明らかとなる。

また、超音波処理後に得られた上澄液の一部を用い、ｐＴＧ９８３及びｐＴＧ９ ９９により産生したα＋　−ＡＴの族エラスターゼ活性を比較する。これは、ヒ ト白血球エラスターゼ（エラスチン・プロダクツ社）によるメトキシ−スクシニ ル−ａ　Ｉａ−ａ　ｌ　ａ−ｐｒｏ−Ｖａ　１ストすることにより行なう。エラ スターゼの阻害曲線は、第１図に示されており、ｐＴＧ９８３及びｐＴＧ９９９ がα＋　−ＡＴの活性形を産生していることが明らかにわかる。この観察は、エ ラスターゼ固定部位レベルにメチオニンの代りにバリンを有するα＋ＡＴの変異 形が天然分子と同様に活性であることが立証されているため、重要である。

これらの曲線から、ｐＴＧ９８３及びｐＴＧ９９９は、αＩ−ＡＴをそれぞれ０ ．８％及び０．７％生産すると計算できる（但し、この条件下では、エラスター ゼ５０ｎｇは、α＋　ＡＴ５０ｎ（］により５０％阻害されるものと仮定する） 。

実施例２−　（Ａｒｇ３５８　）ａ、−ＡＴα＋　ＡＴａ伝子におけるａｒｐに よるｍｅｔコドンの置換は、前記と同じ方法で行なう。Ｍｅｔからａｒｇへの変 換にはヌクレオチドの置換を必要とする（ＡＴＧはＡＧＣを生じる）： もとの配列： ａｌａ　ｉｌｅ　ｐｒｏ　ＭＥＴ　ｓｅｒ　１ｌｅＧＣＣＡＴＡ　ＣＣＣＡＴＧ 　ＴＣＴ　ＡＴＣ変異した配列： ａｌａ　ｉｌｅ　ｐｒｏ　ＡＲＧ　ｓｅｒ　１ｌｅＧＣＣＡＴＡ　ＣＣＣＡＧＧ 　ＴＣＴ　ＡＴにの変異誘発を行なうのに使用したオリゴヌクレオチドは、５’ −ＡＴＡＧＡＣＣＴＧＧＧＴＡＴＧ−３’である。このオリゴヌクレオチドはα ＋　ＡＴの反応性領域と相補的であるが、メチオニンコドンの代りにアルギニン コドンを含有する。

該部位の直接変異誘発は、前述のように、Ｍ１３ｍｌ）７０１においてクローン 化されたα＋　−ＡＴ３ｕ伝子で行なわれる。前記オリゴヌクレオチドとハイブ リダイゼーションを行なうことにより変異体を同定した後、変異はＤＮＡの配列 決定を行なうことにより確認する。

次にＢＱ　Ｉ　ＩＩ−Ｐｓｔ：［断片上のα＋　−ＡＴの変異遺伝子をＭ１３ゲ ノムから取り出し、ＢｇＩ　ＩＩ／Ｐｓｔ　Ｉ断片を切除後発現ベクターｐＴＧ ９８３中に導入する。

このことにより、反応性部位における変異した配列以外はＤＴＧ９８３と同一の プラスミドｐＴＧ１９００が得られる。

腸菌での修飾　Ａｒｃ３５”　）ａ、−ＡＴ（７）　現ｐＴＧ１９００により産 生されたα＋　−ＡＴを、ｐＴＧ９８３を介して得られたα＋ＡＴと直接比較す る。これら２つのクローンは、α＋　ＡＴのための放射免疫拡散試験（ＲＩＤ） において同じ様式で反応する蛋白を生産せしめることが明らかにされた。　”α ＋−ＡＴ変異体は、検出し得る抗エラスターゼ活性を全く示さず、非常に有効な トロンビンの阻害剤である。

ｐＴＧ１９００及びｐＴＧ９８３を含有する旦。

ｃｏ　ｌ　１ＴＧＥ９００の誘導培養物において超音波処理に付した抽出物を調 製し、各抽出物中のα１　ＡＴの割合をＲＩＤにより測定する。各抽出物は免疫 反応性物質を含有し、試験により、いずれの場合も発現率は大腸菌の総細胞蛋白 の約１％であることが明らかとなる。

また、これら抽出物の一部を用い、各場合において産生じたα＋ＡＴの族エラス ターゼ及び抗トロンビン活性を比較する。抗エラスターゼ活性は、抽出物がヒト 白血球エラスターゼによるメトキシ−スクシニル−ａｌａ−ａ　Ｉ　ａ−ｐｒｏ −ｖａ　１−ｐ−ニトロアニリドの切断を阻害する可能性を測定することにより 測定する。エラスターゼの阻害曲線は、ｐＴＧ９８３で観察されたこと−とは反 対に、ｐＴＧ１９００が抗エラスターゼ活性を全く示さないことを示していたく 第３図）。

、　抗トロンビン活性は、ウシトロンビンによるクロモチームＴＨ（トシル−ｇ 　Ｉ　ｙ−ｐｒｏ−ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド−アセテート）（ベーリンガー ／マンハイム）切断の阻害率を測定することにより測定する。トロンビン４μ９ を細菌抽出物の一部と３７℃で２０分間予備培養し、その後基質を０．１ｍＭま で添加する。反応速度は４１０ｎｍでの吸光度の変化率を測定することにより測 定する。結果（第４図）は、この条件下では、ｐＴＧ９８３の抽出物は検出可能 な抗トロンビン活性を全く含まず、一方ｐＴＧ１９００の抽出物はトロンビンを 効果的に不活性化することを示している。

これらデータとＡＴ−Ｉ［［阻害曲線を比較すると、α１−ＡＴ変異体の抗トロ ンビン活性は、ヘパリン非存在下でのＡＴ−ＩＩＩのそれより約１５〜２０倍高 く、ヘパリン存在下でのＡＴ−１［［のそれとほぼ同じ活性（モルで）であるこ とがわかる（第５図）。

ｐＴＧ９８３の調製 プラスミドｐＴＧ９８３の調製は、ヨーロッパ特許出願第８４．−４００１２６ 号に記載されており、以下に要約する。

プラスミドｐＴＧ９８３のｍｌはプラスミドｐＴＧ９０７及びファージＭ１３ｔ ｃ＋９１２から出発し、その調製自体は本出願人名義のヨーロッパ特許第００９ ４８８７号に記載されている。

ｐＴＧ９０７のＢａｍＨＩ／５ｐｈＩＩ断片、Ｍ１３ｔＱ９１２のＣ［ｒｂＳ及 びＩａｃＺ’を担持するＢＱＩＩｆ／Ｈｐ　ａ　Ｉ断片及びリン酸化アダプター ＨｇａＩ／５ｐｈＩはモル比１：２：１であらかじめハイブリッド化し、次いで Ｔ４リガーゼで処理した。一部を用い６１５０株のコンピテント細胞を３０℃で 形質転換する。

興味ある細胞は、ｐ３２で標識したｃＩ［ｒｂｓ／ＩａｃＺ’　断片で形質転換 体を選択することにより同定し、得られた構造は酵素制限研究により確認する。

発現系の諸要素が所望のように働いていることを示す最初の手掛かりを得るため 、得られたプラスミドｐＴＧ９０８を、ｃＩ８５７及び該プラスミドによりコー ドされるα断片を相補するβ−ガラクトシダーゼのω断片の両者を有するＮ６４ ３７宿主株中に導入する。

得られた形質転換体をＩ　ＰＴＧ＋Ｘｑａ　Ｉ含有の皿に置くと２８℃で白色で あり、それらを４２℃に移すと約３０分後に青色に変る。

このプラスミドｐＴＧ９０８を用い、前述の公知方法により得たヒトα＋　−Ａ ＴＩ伝子を発現させる。

使用したヒトα＋　−ＡＴのｃＤＮＡクローンｐＴＧ６０３は、成熟蛋白の第１ アミノ酸のコドンのすぐ後に単一制限部位ＢａｍＨＩを含有する。全成熟ポリペ プチドのコード化能は、最初のグルタミン酸を除き、発現ベク側λプロモーター ＰＬから起り、翻訳は、リポソーム固定部位及びλｃｌＩ３１！伝子の最初の３ ９のｂｐを伴い、図示されているように、１ａｃＺ’３ｕ伝子の先頭に融合する λｃＩ［ｒｂｓのＡＴＧで開始する。

単一制限部位を含む結合領域はＣ［と１ａｃＺ’配列の接合部にある。プラスミ ドＩ）ＴＧ９２０は先に調製したｐＴＧ９０８ｒＤＭＳ体であ’Ｏ、コ（７）Ｉ ）　Ｔ　Ｇ　９２０　ニｃｔ’ｊいては、第６図に示すように、ｐＴＧ９０８に おけるＣ■のＡＴＧから４０ｂｐ下流にある元のＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ断片はＭ １３ｔｑ１１５のＢｑ　ｌ　ＩＩ／Ｐｓｔ工により置換されている。

この過程により、α＋　ＡＴ３ｉ伝子のＢａｍＨＩ部位と同じ翻訳相にあるＢａ ｍＨＩ部位が得られる。

第６図にはプラスミドｐＴＧ９０８及びファージＭ１３ｔＱ１１５からプラスミ ドｐＴＧ９２０を調製するクローニング法及び１）ＴＧ６０３のクローン化さる べき断片が示されている。実線は蛋白をコードする配列を示しリベブチドをコー ドする配列を示している。ハツチングされた部分は、最終的にα＋　−ＡＴを融 合するｃ■の１３個のＮ−末端アミノ酸をコードする領域を示す。

このように、ｐＴＧ９２０のＢａｍＨＩとｐｓｔＩ部位との間にｐＴＧ６０３の ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ断片を挿入すれば、末端Ｎ’Ｈ２のグルタミン酸を除き、 ｃ■蛋白の（末端ＮＨ２由来）１３個のアミノ酸、アダプター配列由来の４個の アミノ酸及びα＋　ＡＴの成熟ポリペプチドを含有する融合ポリペプチドが発現 するであろう。

ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ及びアルカリホスファターゼで処理したｐＴＧ９２０を１ ）ＴＧ６０３と結合させ、ＢａｍＨＩ及びＰＳｔ工で消化する。Ｕ＋　−ＡＴ断 片を担持する形質転換ＴＧＥ９００細胞を酵素制限研究後に分離する。これらク ローンの１つがｐＴＧ９２２である。

このクローンの詳細な調製法はコートニー（Ｃｏｕｒｔｏｎｅｙ　）ら（１９８ ４）の論文に記載されている。

セスタ・リサーチ・ラプス）を用い、メーカー指示の条件で完全制限に付す。

既知の方法により、下記構造を有する非リン酸化相補性アダプターオリゴヌクレ オチドを合成する：５’−ｄＴＡＴＧＧＡＧ−３’及び ５’　−ｄＧＡＴＣＣＴＣＣＡ−３’ これらオリゴヌクレオチドをあらかじめハイブリッド化し、次いで、酵素制限に 付したプラスミドｐＴＧ９２２とモル比５０：１で、既知条件下にＤＮＡリガー ゼを用い、４℃でライゲーションさせる（第７図）。

ライゲーション混合物を用い、ＴＧＥ９００株のコンピテント細胞を形質転換さ せ、得られた形質転換体をアンピシリンの存在下に培養培地上に広げる。

コロニーは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ５’　−ｄＣＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴ ＣＣＡ−３’標識プローブとのバイブリプ−ジョンによりニトロセルロースフィ ルター上で選択する。このプローブは選択したい非融合構築物を完全に相補する が、親プラスミドｐＴＧ９２２のヌクレオチドのうち７つを相補するだけであり 、これはハイブリダイゼイションを起こさしめるには不充分である。

こうして、６つの可能性のある候補が得られ、そのうちの１つをｐＴＧ９２９と 称する。

プラスミドｐＴＧ９２９は生伍のαＩ−ＡＴ（総細胞蛋白の０．１％以下）を生 じるだけである。発現レベルを増大するにはＣＩＩｒｂＳを合成ｒｂｓ部位によ り置換する： 翻　訳 ＴＣＧＡＴＡＡＣＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧ↑ シャイン／ダルガノ配列 この交換は第８図に示すように行なう。

ｐＴＧ９２９のＨｌ）ａＩ及びＢｇ１１１部位は、合成挿入片を用いそれぞれＣ １ａＩ及びＸｈｏＩ部位で置換される。

次いで、合成ｒｂｓ　（ｓｙｎｔｈ　ｒｂｓ）を、ＮｄｅＩ部位とＮｍ伝金剛に 作られた新しいＣｌａＩ部位との間に挿入する。

この操作によりｃＩＩｒｂｓは排除され、截頭Ｎ遺伝子を生じ、すぐに合成ｒｂ ｓが続く。合成ｒｂｓへの翻訳停止コドン（ＴＡＡ）はＮの翻訳を阻止する。得 られたプラスミドはｐＴＧ９５６である。

プラスミドｐＴＧ９５６において、α＋ＡＴのもとの配列は変異した配列で置換 される： もとの配列： ｍｅｔ　ｇｌｕ　ａｓｐ　ｐｒｏ　ｇｌｕ　ｇａｙＡＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　Ｃ ＣＣＣＡＧ　ＧＧＡａｓｐ　ａｌａ ＧＡＴ　ＧＣＴ 変異した配列： ｍｅｔ　ｇｌｕ　ａｓｐ　ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＱＩＶＡＴＧ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　Ｃ ＣＴ　ＣＡＡ　ＧＧＣ※　※　※　※ ａｓｐ　ａｌａ ＧＡＴ　ＧＣＴ 各変化（※印）はコドンの第３位で起り、コードされたアミノ酸を修飾しない。

α＋ＡＴ遺伝子は、特定塩位に向けられた変異誘発法により修飾された。

選択された配列変化は、大腸菌遺伝子の先頭に隣接するいくつかの部位においで ある種の塩基が好ましいことを明らかにする統計研究に由来する。

これらの変化はまた、α−ＡＴのｍＲＮＡ配列にあらねれるかもしれない二次構 造に相応する領域を不安定にする。変異誘発のためのオリゴヌクレオチドは：５ ’　−ＡＧＣＡＴＣＧＣＣＴＴＧＡＧＧＡＴＣＴＴＣにの配列はもとの配列と比 べ４つの違いがあり、α−ＡＴ３ｕ伝子において前記で示した修飾を生じる。

得られたプラスミド、ｐＴＧ９８３、は前記変化以外はｐＴＧ９５６と同一であ る。

実施例３ 変異体（Ｇ　Ｉ　ｙ３５８　α＋ＡＴの調製この変異体は、実施例１に記載のよ うに、合成オリゴヌクレオチドを用い、部位の直接変異誘発により構築される。

この場合、所望の変異を有する使用オリゴヌクレオチドは下記のものである： ５’　ＧＡＴＡＧＡＡＣＣＧＧＧＴＡＴＧＧＣ３’これは変異ＡＴＧ−＋ＧＧＴ 　（Ｍｅ　ｔ−＋Ｇ　ｌ　ｙ）を生じる。

実施例１に記載のように、変異誘発はＭ１３ｍｐ７０１においてサブクローン化 したα＋　−ＡＴｉ伝子金剛い行なう。変異後、変異した遺伝子を含むＢａ１Ｉ ［−ＰＳｔ工断片を主特許に記載の発現プラスミドｐＴＧ９８３に導入する。

前記のようにこのプラスミドを用いて大腸菌を形質転換することにより、変異体 （Ｇｌ　ｙ３５８　）α＋　−ＡＴの発現が得られる。

実施例４ 異体（１６ｕ３５　＠　）、（Ａｌ　ａ　３５　ｌ１１１ｅ３５８）及び（Ｐｈ ｅ３５’　ａｌ　−ＡＴの調製 前述の種々の変異体は、ａＩ　ＡＴ！ｆ伝子の金剛Ａの適当な断片を置換するこ とにより調製される。

水沫の原理を第９図に記載する。

変異体は、第３５８アミノ酸をコードする領域レベルで小さなりＮＡ上セグメン ト適当な変異を有する二重鎖合成断片で置換することにより構築する。

小さな断片は、α＋　ＡＴの活性部位をコードする領域の各側で切断する制限酵 素ＮｄｅＩ及びＡｖａ工を用い、遺伝子から切断する。

Ａｖａ工部位は既にもとの遺伝子に存在するが、新しいＮｄｅＩ部位は該工程を 行なうために作らねばならない。これは合成オリゴヌクレオチドにより部位に向 けられた変異により行なう（実施例１）。

制限酵素処理後、活性部位をコードする領域を欠失したプラスミドを分取用ゲル 電気泳動により分離し、仔つシ腸ホスファターゼで処理し、この調製物をＴ４リ ガーゼを用い、所望の変異並びにＮｄｅＩ及びＡｖａＩで切断された遺伝子の配 列に相応する一末鎖５′伸長部を形成する配列を含む小さな合成りＮＡ断片と結 合させる。

この方法により、活性部位レベルでの変異以外はｐＴＧ９８３のそれと同一構造 がもたらされる。

各変異体は、放射免疫拡散試験から示されるように、主特許に記載のｐＴＧ９８ ３の場合に得られるものの付近にあるレベルで、即ち、大腸菌の総細胞蛋白の約 １％の割合で、大腸菌において生産される。

超音波処理し、澄明にした抽出物は、ヒト好中球エラスターゼ又はカテプシンＧ の阻害活性が存在するかどうか試験する。

得られた結果は第１０及び１１図に示す。エラスターゼの阻害は、実施例２に記 載のようにして測定し、カテプシンＧ活性は、色素産生基質、Ｎ−スクシニル− ａ　ｌ　ａ−ａ　Ｉ　ａ−ｐｒＯ−ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドを用い測定する 。

変異体（ｌ　ｅ　ｕ　３５　Ｂ　）、（Ａｌａ３ｓａ）及び（［ｌｅ３５ｇ）は 、変異体〔Ｍｅｔ３５８〕及び（Ｖａｌ　３５８　）と同様にエラスターゼ活性 を阻害し、一方変異体（Ｇｌｙａ５８）及び（Ａ　ｒ　ａ　３５　Ｂ　）は阻害 しない。

試験したすべての変異体のうち、変異体（Ｌ　ｅ　ｕ　３５８　）及び（Ｍｅ　 ｊ３５　Ｂ　）のみがカテプシンＧを阻害する。

１０ｍＭＮ−クロロスクシンイミド（ＣＮＳ）で処理すると（結果は第１２図に 示す）、変異体（Ｍｅｔ３５８）（第１２ａ図）が酸化により完全に不活性化さ れる条件下において、変異体（Ｌ　ｅ　ｕ　３５８　）（第１２ｂ図）、（Ａ１ ８３５８）（第１２ｃ図）、（１１８３５８）（第１２ｄ図）及び（Ｖａ１３５ ８）（第１２ｅ図）は、好中球エラスターゼに対し十分活性　：なままであるこ とを示している。

実施例５ 切断α＋　ＡＴ変異体の生産 これら変異体は、第１３図に示す、以下の方法で調製される。

プラスミドｐＴＧ９８３から出発し、合成オリゴヌクレオチドを用いて変異させ 、第７コドンの２つのＣＴヌクレオチドをＧＧヌクレオチドで置換することによ り第８コドンの付近に単−ＡｐａＩ部位を作る。

次に、そのプラスミドをさらに変異させ、翻訳開始コドンのレベルにＮｄｅＩ部 位を作る。

得られたプラスミドを酵素ＡｐａＩ及びＮｄｅＩで処理し、切り取りたいアミノ 酸に相応する部分を欠失させる。

この欠失断片は、α＋　−ＡＴの第６コドンを開始コドンに融合せしめる合成オ リゴヌクレオチドで置換される。

截頭蛋白の発現レベルを改善するために、ｐＴＧ９８３に存在するリボンーム固 定部位を、第５図に示される構造を示し、制限部位Ｃ１ａＩとＮｄｅＩの間に挿 入されているＲ１と名付けた合成リポソーム固定部位で置換した。

得られたプラスミド（ｐＴＧ１９０４ＲＩＴ２と命名）を用いて大腸菌を形質転 換することにより、Ｎ末端の最初の５個のアミノ酸を欠くα＋　−ＡＴが得られ る；その発現率は大腸菌の総細胞蛋白の約１５％である。

この発現を、クマシー青（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）で発色した電気泳動 ゲルをデンシトメーターで読み取ることにより測定する。

誘発細胞の超音波処理し澄明化した上澄液は、截頭α＋　ＡＴを含んでいる；後 者はヒト好中球エラスターゼを効果的に阻害する。

放射免疫拡散による測定どうエラスターゼ活性との間にはよい相関が認められる 。

ある種の截頭誘導体にこの活性が明らかにされたことを考慮すると、本発明はま た、これらを含む医薬組成物及び生物学的試薬、特に好中球エラスターゼ及びト ロンビン測定に有用な試薬にも関するものである。

参　考　文　献 クラチ（ＫｔＪＲＡＣＨＩ　）ら、、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・スティッノ・ オブ・アメリカ（Ｐｒｏ、Ｎａｔ　ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＬＩＳＡ）、Ｌ旦 、６８２６−６８３０　（１９８１）。

チャンドラ（ＣＨＡＮＤＲＡ）ら、、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ ル・リサーチ・コミュニケイションズ（３ｉ　ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉ　ｏｐｈｙｓ 、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、）１０３．７５１−７５８　（１９８１）。

コートニーら（ＣＯＵＲＴＮＥＹ　ｅｔ　ｃｏｉｌ、）プロシーデイングズ・オ ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッ ド・ステープ・オブ−７メリカ（Ｐｒｏ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、炙ユ、６６９−７３　（１９８４）。

↑由巴′ｒＩＪ′）中の蛋白 トロンビン 阻百羊（ヅ・） Ｂ″！ｆ　昆ｈ　（３７°Ｃ） ８９１■ Ｆ！Ｇ　−８ ヒトス要中エネエラスターセ゛ｐ且宕 １　２３４　５　インヒビター−ヒｂモル数ヒトカテプシンＧ阻召 国際調売報告 −―−＾−一−ｍＰｃＴ／ＦＲ８５１００１５ＢＡＮ）ＩＥＸＴｏ’Ｄｋ！ＥＩ ＮＴＥＲまＪＡＴＩＯＮＡＬＳＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴＯＮＥＰ−Ａ−０１０３ ４０９２１１０３／８４　ＡＵ−Ａ−１７７００８３１６１０２／８４ＪＰ−Ａ −５９０９１８８６２６１０Ｓ／８４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １第３５８位のアミノ酸がアルギニン及び蛋白中に統合された時ほとんどまたは まつたく酸化されない天然アミノ酸から選ばれるヒトα１−アンチトリブシンに 相応する蛋白の全部又は一部であることを特徴とするヒトα１−アンチトリブシ ンのアナローグ。 ２α１−アンチトリブシンまたはそのアナローグの配列が、５個のＮ−末端アミ ノ酸を切り取られていることを特徴とする、請求の範囲第１項記載のα１−アン チトリブシン誘導体又はα１−アンチトリプシンアナローダ。 ３〔Ａｒｇ３５８〕α１−ＡＴである請求の範囲第１項記載のアナローグ。 ４〔Ｇｌｙ３５８〕α１−ＡＴ、〔Ａｌａ３５８〕α１−ＡＴ、〔Ｉｌｅ３５８ ）α１−ＡＴ、〔Ｖａｌ３５８〕α１−ＡＴ、〔Ｌｅｕ３５８〕α１−ＡＴ、（ Ｐｈｅ３５８〕α１−ＡＴである請求の範囲第１項記載のアナローグ。 ５第３５８位付近の構造が、次式 ３５８ −ａｌａ−ｉｌｅ−ｐｒｏ−Ｘ−ｓｅｒ−ｉｌｅ〔式中、Ｘはａｒｇ、ｇｌｙ、 ａｌａ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ及びｐｈｅから選ばれる〕であることを特徴と する請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載のアナローグ。 ６〔ΔＧＩｕ１→Ｇｌｙ５〕α１−ＡＴ７α１−ＡＴがグリコシル化されていな いことを特徴とする請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載の誘導体また はアナローグ。 ８α１−ＡＴが、さらに、非反応性部位にひとつまたはいくつかの点変異を含ん でいることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第７項のいずれかに記載の誘導体 またはアナローグ。 ９宿主細胞、特に、成熟蛋白の第３５８アミノ酸に相応するコドンがａｒｇ又は 蛋白中に統合される時酸化されない天然アミノ酸をコードする、ヒトα１−アン チトリブシンをコードするＤＮＡ配列の発現ベクターを含む微生物を培養するこ とを特徴とする請求の範囲第１項記載のアナローグの製造法。 １０第３５８アミノ酸に相応するコドンがＧＴＣ（Ｖａｌ）、ＡＧＧ（ａｒｇ） から選択されることを特徴とする請求の範囲第９項記載の製造法。 １１宿主細胞、特に、α１−ＡＴ又は５′末端の１５個の塩基が欠失したα１− ＡＴアナローグをコードするＤＮＡ配列の発現ベクターを含む微生物を培養する ことを特徴とする請求の範囲第９項記載の誘導体の製造法。 １２微生物が、細菌であることを特徴とする請求の範囲第９項乃至第１１項のい ずれかに記載の製造法。 １３細菌が、発現ベクターを構成するブラスミドで形質転換された大腸菌株であ ることを特徴とする請求の範囲位第１２項記載の製造法。 １４ブラスミドが、大腸菌中に複製開始点を含み、ブロモーターＰＬがα１−Ａ ＴアナローグをコードするＤＮＡ配列を促進せしめることを特徴とする請求の範 囲第１３項記載の製造法。 １５微生物が、酵母であることを特徴とする請求の範囲第９項乃至第１１項のい ずれかに記載の製造法。 １６請求の範囲第１項乃至第８項のいずれかに記載のα１−ＡＴのアナローダま たは誘導体を含有することを特徴とする薬剤。 １７〔Ａｒｇ３５８〕α１−ＡＴの抗凝固剤としての使用。 １８少なくとも１種の〔ａｒｇ３５８〕α１−ＡＴを含むことを特徴とする血栓 症治療または予防用薬剤。 １９請求の範囲第２項、第４項、第５項及び第６項のいずれかに記載のα１−Ａ Ｔアナローグの少なくとも１種を含有することを特徴とする肺気腫治療または予 防薬剤。 ２０請求の範囲第１項乃至第８項のいずれかに記載の化合物を含有し、特に好中 球エラスターゼ及びトロンビンの測定に有用であることを特徴とする生物学的試 薬。 ２１抗カテブシンＧ剤としての化合物〔Ｍｅｔ３５８］α１−ＡＴ及び〔Ｌｅｕ ３５８〕α１−ＡＴ。