JPH06105689A - アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 - Google Patents
アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 活性部位における酸化に対する抵抗が大きい
野生型アルファ−１−抗トリプシンの変異体を提供する
こと。 【構成】 少なくとも１個の突然変異コドンを含む構造
遺伝子からなり、該遺伝子が哺乳類のアルファ−１−抗
トリプシンの突然変異体のための暗号づけをしているＤ
ＮＡ構造物。
野生型アルファ−１−抗トリプシンの変異体を提供する
こと。 【構成】 少なくとも１個の突然変異コドンを含む構造
遺伝子からなり、該遺伝子が哺乳類のアルファ−１−抗
トリプシンの突然変異体のための暗号づけをしているＤ
ＮＡ構造物。
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は突然変異誘発遺伝子の作製および微生物中に於
けるその構造蛋白質の表現に関する。特に、本発明は突
然変異誘発ヒトアルファ−１−抗トリプシン遺伝子の作
製およびアルファ−１−抗トリプシンの部位特異性突然
異性体の表現に関する。アルファ−１−抗トリプシン
（以下ＡＴと略称する）はプロテァーゼ阻害剤であり、
その主な機能は広スペクトルプロテァーゼであるエラス
ターゼを阻害することである。哺乳類の肺組織はエラス
ターゼに特に侵されやすいので、ＡＴの欠乏または不活
性化は肺組織および弾性の損失およびそれに続く気腫を
生ずる可能性がある。ＡＴ活性の損失または減少はタバ
コの煙を含む環境汚染物質によるＡＴの酸化の結果であ
り得る。ガデク、ジェームズＥ．（Ｇａｄｅｋ，Ｊａｍ
ｅｓＥ．）およびＲ．Ｄ．クリスタル（Ｒ．Ｄ．Ｃｒｙ
ｓｔａｌ），“アルファ−１−抗トリプシン欠損（Ａｌ
ｐｈａ−１−Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ Ｄｅｆｉｃｉｅ
ｎｃｙ）”ザ・メタボリック・ベーシス・オブ・インヘ
ライテッド・ディジーズ（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
Ｂａｓｉｓ，ｏｆＩｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓ
ｅ），スタンバリー、Ｊ．Ｂ．（Ｓｔａｎｂｕｒｙ，
Ｊ．Ｂ．）ら編、マグロー・ヒル、ニューョーク（１９
８８）ｐｐ．１４５０−１４６７およびキャロル（Ｃａ
ｒｒｌｌ）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９８８、
３２９−３３４（１９８２）参照。オウエン（Ｏｗｅ
ｎ）ら（Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：６９４
−６９８、１９８３）は、患者がアミノ酸位置３５８に
於けるメチオニンの代わりにアルギニンを置換したアル
ファ−１−抗トリプシンの突然変異体形を生成する条件
を記載している。遺伝子配列中の単点突然変異（ＡＴＧ
→ＡＧＧ）の結果として、アルファ−１−抗トリプシン
はエラスターゼ阻害剤としてのその正常な機能からトロ
ンビン阻害剤の機能へ変化した。この機能変化は野生型
ＡＴとアンチトロンビンＩＩＩとの間の構造の３０％相
同から生じる（キャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ）ら、同上を
も参照のこと）。これらの発見は、ＡＴの変化形が例え
ば播種血管内凝固の治療に於けるような血液凝固防止に
用いるために臨床的に重要となり得ることを示す。蛋白
質の活性部位に於ける酸化に対する抵抗のような安定性
の増強をもたらし得る野生型ヒトＡＴの変化形を作製す
ることは望ましいことである。ＡＴに於ける遺伝的欠損
にかかっている患者に投与するための、かかる患者と免
疫学的により相容性である野生型ＡＴの変化形を作製す
ることも望ましいことであろう。増加したアンチトロン
ビン活性を有するＡＴの変化形を作製することも望まし
いことであろう。従って、本発明の１つの目的は野生型
ヒトＡＴの部位特異性突然変異誘発の作製方法を提供す
ることである。本発明のもう１つの目的は突然変異誘発
ＡＴのための暗号づけをする構造遺伝子からなる表現ベ
クターを提供することである。本発明のもう１つの目的
は部位特異性突然変異誘発ＡＴ蛋白質を提供することで
ある。本発明は部位特異性突然変異誘発ＡＴのための構
造遺伝子のための暗号づけをする１本鎖および２本鎖閉
環状ＤＮＡの生成方法を提供する。特に、本発明は
（ａ） 野生型ＡＴのための構造遺伝子の暗号配列また
はその相補物からなる環状１本鎖ｃＤＮＡ分子を作製す
る工程と、（ｂ） かかる１本鎖ＤＮＡに、（１）かか
る１本鎖ＤＮＡのセグメントに相補的であることと野生
型ＡＴの位置３５８に於けるアミノ酸に対応するコドン
に於て１つまたは２つ以上の誤対合を含みかつ該誤対合
がアラニンまたはバリンまたはグリシンまたはフェニル
アラニンまたはアルギニンまたはリジンのためのコドン
の１つからなることとを特徴とする直線状オリゴヌクレ
オチドと（２）Ｍ１３のための万能プライマーのような
プライマーとをアニーリングさせる工程と、（ｃ） 該
オリゴヌクレオチドとプライマーとを酵素的に延長する
工程と、（ｄ） 延長されたオリゴヌクレオチドとプラ
イマーとの末端を一緒に結合してギャップつき環状２本
鎖ＤＮＡ分子を生成させる工程と、（ｅ） 該２本鎖ギ
ャップ付き環状ＤＮＡ分子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中
へトランスフェクションしてヒトＸ３５８−ＡＴのため
の構造遺伝子を含む閉環状ＤＮＡ分子を生成させかつプ
ラークハイブリダイゼーションのためのプローブとして
の突然変異体オリゴヌクレオチドでスクリーニング後、
突然変異体ＤＮＡを分離する工程とからなるヒトＸ
３５８−ＡＴ（ここでＸはアラニンまたはバリンまたは
グリシンまたはフェニルアラニンまたはアルギニンまた
はリジンである）のための構造遺伝子のための暗号づけ
をする１本鎖または２本鎖閉環状ＤＮＡの生成方法を提
供する。同様の方法によって、ＡＴのＺ−対立遺伝子と
しても知られているヒトＬｙＳ３４２−ＡＴの構造遺伝
子からなる閉環状ＤＮＡ分子を作製することができる。
本発明の方法は３４２と３５８の両方の位置ならびに他
の位置に於て突然変異誘発されたＡＴの作製にも利用す
ることができる。本発明は突然変異誘発ＡＴのための構
造遺伝子からなるＤＮＡ構造物およびクローニングベク
ターおよび突然変異誘発蛋白質の表現方法ならびに実質
的に純粋な部位特異性突然変異誘発ＡＴをも提供する。
図１について説明すると、この図には野生型ＡＴの優勢
形の構造遺伝子およびアミノ酸配列が示してある。位置
３５６−３６０に於けるアミノ酸からなるＡＴの活性部
位はメチオニン残基を含む。位置３５８に於ける残基は
タバコの煙または他の酸化性汚染物質に暴露されるとき
酸化を受けやすい。かかる酸化はＡＴの生物学的活性を
減少させる可能性があるので、部位特異性突然変異誘発
により、該位置に於て別のアミノ酸、すなわちアラニン
またはバリンまたはグリシンまたはフェニルアラニンま
たはアルギニンまたはリジンで置換して、より安定なＡ
Ｔの形を生成させることができる。さらに、遺伝的ＡＴ
欠損の１つはＺ−対立遺伝子変異体として知られている
異常形の生成である。図１について言うと、この突然変
異はアミノ酸位置３４２に於けるグルタミン酸のリジン
による置換によって示される。Ｚ−対立遺伝子変異体に
対して同型接合性の個人は、明らかに肝臓に於ける処理
妨害のために正常レベルの約１５％のＡＴを生成する。
このことは肝臓中にＡＴの未熟形の蓄積を生じ、これに
対応して血漿の該阻害剤レベルが減少する。この状態を
もつ個人の８０％までは慢性の肺および（または）肝臓
疾患で死に至ると考えられている。Ｚ−対立遺伝子変異
体蛋白質自体は野生型蛋白質と同じ抗エラスターゼ活性
を有することは注目すべきである。かかる個人のＡＴレ
ベルは野生型ＡＴの静脈内投与によって増強することが
できる〔ガデク（Ｇａｄｅｋ）ら、ジャーナル・オブ・
クリニカル・インベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｃｌｉｎｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ
６８，１１５８−１１６５（１９８１）参照〕。しか
し、野生型蛋白質はこれらの患者にとって異種であるの
で、幾人かのＺＺ個人は野生型蛋白質にアレルギーにな
ると期待され得る。かくして、本発明はある種のＡＴ欠
損患者に於て非免疫原となり得るＺ−対立遺伝子変異体
の生成方法を提供する。抗トロンビン活性を有すること
が示されているＡｒｇ３５９−ＡＴは血液凝固阻止に有
用でもあり得る。天然産アンチトロンビンＩＩＩは、通
常、体内で血液凝固を調節する働きがある。アンチトロ
ンビンＩＩＩは播種血管内凝固の治療のため〔ガスナー
（Ｇａｓｓｎｅｒ）ら、Ｗｉｅｎ．Ｋｌｉｎ．Ｗｏｃｈ
ｅｎｓｃｈｒ．９１：５１−５３、１９７９；およびヘ
ルグレン（Ｈｅｌｌｇｒｅｎ），Ｍ．他、Ｇｙｎｅｃｏ
ｌ．Ｏｂｓｔｅｔ． Ｉｎｖｅｓｔ・１６：１０７−１
１８、１９８３〕、および他の症状の治療に於いてヘパ
リンの代替物として〔バーンハート（Ｂｅｒｎｈａｒｄ
ｔ），Ｗ，およびノバコバ−バネット（Ｎｏｖａｋｏｖ
ａ−Ｂａｎｅｔ），Ａ，Ｒｉｃ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ，１
３ ：６１−６６、１９８３〕用いられて来た。特に、
本発明は野生型ヒトＡＴ遺伝子のｃＤＮ４Ａたはその相
補物からなる１本鎖ＤＮＡ鋳型の作製に関する。突然変
異させようとするコドンに於て１個または２個以上の誤
対合を含む直線状オリゴヌクレオチドプライマーを、突
然変異誘発部位の５′側にアニーリングする第２プライ
マーと一緒に鋳型へアニーリングさせる。好ましい第２
プライマーは市販されておりかつＭ１３ベクター中のラ
ック （ｌａｃ）Ｚ遺伝子へハイブリダイゼーションす
るＭ１３の万能プライマーである〔メッシング（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ），Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１０１：２０−７７、１９８３〕。該オリゴヌクレオチ
ドを廷長しかつ末端に於て結合させて２本鎖ギャップつ
き環状ＤＮＡを得る。この２本鎖ＤＮＡを用いて宿主微
生物大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をトランスフェクション
し、突然変異体および野生型ＤＮＡ分子の混合物を含む
集団をもたらす。突然変異体ＤＮＡオリゴヌクレオチド
をプローブとして用いるプラークハイブリダイゼーショ
ンによって突然変異体ＤＮＡ分子を選択する。このＤＮ
Ａをシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）変化したコ
ドンの存在を証明した後、適当な表現ベクター中へクロ
ーニングすることができる。突然変異誘発ＡＴ蛋白質
は、細菌または酵母あるいは他の前核類または真正核類
中で表現させることができる。本明細書中で使用する
“ＤＮＡ構造物”、“ベクター“プラスミド”という用
語は、ヒトの介在によって変性されているＤＮＡ分子あ
るいはかく変性されている分子のクローンであるＤＮＡ
分子であって、そうでなければ天然には存在しない方法
で結合させかつ配列させたＤＮＡのセグメントを含むＤ
ＮＡ分子を構成する。本明細書中で使用する“表現ベク
ター”という用語は、宿主生物中へ形質転換させるとき
それ自体の複製を保証する遺伝情報と宿主生物中で表現
されるべき少なくとも１つの遺伝子ならびに転写の開
始、翻訳の開始、プロモーター領域およびある場合には
読み終り領域のための部位のような、表現が起こるため
に必要となり得る他の制御機能を含むＤＮＡ構造物であ
る。“表現”という用語は、通常の用途に於ては、宿主
生物中に存在する遺伝子によって暗号づけされる蛋白質
生成物がある生物によって合成される条件を意味すると
定義される。“ギャップつき”という用語は、実質的に
２本鎖であるが１本鎖領域を含むＤＮＡ分子を意味す
る。物質および方法 全体にわたって標準の生化学的方法を用いた。Ｍ１３宿
主株、万能プライマーおよびベクターはベテスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から得た。制限エン
ドヌクレフアーゼは、ベデスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）、ニュー・イングランド・バイオラ
ブズ（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）、ベー
リンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）から得、メーカーの指令書に従って使用した。細
菌細胞の形質転換、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレナウ
（Ｋｌｅｎｏｗ）断片）を用いるＤＮＡ断片の平滑化
（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）方法、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
るＤＮＡ断片の接合方法を含む一般的クローニング方法
はマニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らが記載している
〔モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ．
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８
２〕。一般的な部位特異性突然変異誘発方法は、ゾラ
ー、マークＪ．（Ｚｏｌｌｅｒ，ＭａｒｋＪ．）および
Ｍ．スミス（Ｍ．Ｓｍｉｔｈ）著、“Ｍ１３誘導ベクタ
ー中へクローニングされたＤＮＡ断片のオリゴヌクレオ
チド指示突然変異誘発（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆ
ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｃｌｏｎｅｄ Ｉｎｔｏ
Ｍ１３Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ）”、マニュ
アル・フォー・アドバンスト・テクニックス・イン・モ
レキュラー・クローニング・コース（Ｍａｎｕａｌ ｆ
ｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓ
ｅ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｅｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）、１９８３に記載されている。野生型ＡＴ中の配
列から１つ以上の塩基変化を含むオリゴヌクレオチド
は、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびカルサー
ズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、テトラヘドロン・レターズ
（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）２２：１
８５９−１８６２、１９８１およびマッテウチ（Ｍａｔ
ｔｅｕｃｈ）およびカルーサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１３８
（１９８１）に一般的に記載されている亜燐酸トリエス
テル法により、マッテウチ（Ｍａｔｔｅｕｃｈ）および
カルーザーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、テトラヘドロン
・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｓｅｒ
ｓ）２１：７１９−７２２（１９８０）に記載されてい
るようなポリマー支持体を用いて作製することができ
る。別法では、アプライド，バイオシステムズ・モデル
３８０−ＡＤＮＡ合成装置のような機械によって、オリ
ゴヌクレオチドを合成することができる。合成されたオ
リゴヌクレオチドは、変性用ゲル上でのポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって精製することができる。オリ
ゴヌクレオチドは、５′−端に於て、（ガンマ）３２
Ｐ−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼによって燐
酸化され得る。オリゴヌクレオチド配列の検定はマクサ
ム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法、メソド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ）、６５：５７（１９８
０）で行うことができる。野生型アルファ−１−抗トリ
プシン遺伝子からなる１本鎖ＤＮＡの作製ヒトＡＴの優
勢形のための暗号づけをする遺伝子は、ＤＮＡハイブリ
ダイゼーションプローブとして 々配列を用いる常法
〔クラチ（Ｋｕｒａｃｈｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８、６８２０−８３０（１
９８０）；およびチャンドラ（Ｃｈａｎｄｒａ）ら、Ｂ
ｉｏｃｈａｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，１
０３、７５１−７５８（１９８１）〕によってヒト肝臓
ｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。ＡＴ
遺伝子は１４４６ｂｐ Ｐｓｔ１ 断片として単離さ
れ、Ｐｓｔ１ 消化プラスミドｐＵＣ１３〔ビエイラ
（Ｖｉｅｉｒａ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９、２５
９−２６８（１９８２）記戴の方法で作製、但しｌａｃ
Ｚ遺伝子に於ける開始に於て図３に示す多重制限部位を
含む〕中へ挿入されてＡＴ遺伝子の３′側のポリリンカ
ー中にＢａｍ Ｈ１部位を含む組換型プラスミドｐＵＣ
α１を与える。プラスミド ｐＵＣα１はＢａｍ Ｈ１
で消化されてＡＴ配列を得る。１３２０ｂｐ Ｂａｍ
Ｈ１断片を次にＭ１３ｍｐ１０中に結合し〔メッシング
（Ｍｅｓｓｉｎｇ 、メソド・イン・エンザイモロジー
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１０
１：２０−７７（１９８３）〕、得られた組換型ファー
ジを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＪＭ１０
３）をトランスフェクションする。ＡＴ遺伝子を含む１
本鎖閉環状ＤＮＡを、次にゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およ
びスミス（Ｓｍｉｔｈ）の方法（上掲）で単離する。
けるその構造蛋白質の表現に関する。特に、本発明は突
然変異誘発ヒトアルファ−１−抗トリプシン遺伝子の作
製およびアルファ−１−抗トリプシンの部位特異性突然
異性体の表現に関する。アルファ−１−抗トリプシン
（以下ＡＴと略称する）はプロテァーゼ阻害剤であり、
その主な機能は広スペクトルプロテァーゼであるエラス
ターゼを阻害することである。哺乳類の肺組織はエラス
ターゼに特に侵されやすいので、ＡＴの欠乏または不活
性化は肺組織および弾性の損失およびそれに続く気腫を
生ずる可能性がある。ＡＴ活性の損失または減少はタバ
コの煙を含む環境汚染物質によるＡＴの酸化の結果であ
り得る。ガデク、ジェームズＥ．（Ｇａｄｅｋ，Ｊａｍ
ｅｓＥ．）およびＲ．Ｄ．クリスタル（Ｒ．Ｄ．Ｃｒｙ
ｓｔａｌ），“アルファ−１−抗トリプシン欠損（Ａｌ
ｐｈａ−１−Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ Ｄｅｆｉｃｉｅ
ｎｃｙ）”ザ・メタボリック・ベーシス・オブ・インヘ
ライテッド・ディジーズ（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
Ｂａｓｉｓ，ｏｆＩｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓ
ｅ），スタンバリー、Ｊ．Ｂ．（Ｓｔａｎｂｕｒｙ，
Ｊ．Ｂ．）ら編、マグロー・ヒル、ニューョーク（１９
８８）ｐｐ．１４５０−１４６７およびキャロル（Ｃａ
ｒｒｌｌ）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９８８、
３２９−３３４（１９８２）参照。オウエン（Ｏｗｅ
ｎ）ら（Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０９：６９４
−６９８、１９８３）は、患者がアミノ酸位置３５８に
於けるメチオニンの代わりにアルギニンを置換したアル
ファ−１−抗トリプシンの突然変異体形を生成する条件
を記載している。遺伝子配列中の単点突然変異（ＡＴＧ
→ＡＧＧ）の結果として、アルファ−１−抗トリプシン
はエラスターゼ阻害剤としてのその正常な機能からトロ
ンビン阻害剤の機能へ変化した。この機能変化は野生型
ＡＴとアンチトロンビンＩＩＩとの間の構造の３０％相
同から生じる（キャロル（Ｃａｒｒｏｌｌ）ら、同上を
も参照のこと）。これらの発見は、ＡＴの変化形が例え
ば播種血管内凝固の治療に於けるような血液凝固防止に
用いるために臨床的に重要となり得ることを示す。蛋白
質の活性部位に於ける酸化に対する抵抗のような安定性
の増強をもたらし得る野生型ヒトＡＴの変化形を作製す
ることは望ましいことである。ＡＴに於ける遺伝的欠損
にかかっている患者に投与するための、かかる患者と免
疫学的により相容性である野生型ＡＴの変化形を作製す
ることも望ましいことであろう。増加したアンチトロン
ビン活性を有するＡＴの変化形を作製することも望まし
いことであろう。従って、本発明の１つの目的は野生型
ヒトＡＴの部位特異性突然変異誘発の作製方法を提供す
ることである。本発明のもう１つの目的は突然変異誘発
ＡＴのための暗号づけをする構造遺伝子からなる表現ベ
クターを提供することである。本発明のもう１つの目的
は部位特異性突然変異誘発ＡＴ蛋白質を提供することで
ある。本発明は部位特異性突然変異誘発ＡＴのための構
造遺伝子のための暗号づけをする１本鎖および２本鎖閉
環状ＤＮＡの生成方法を提供する。特に、本発明は
（ａ） 野生型ＡＴのための構造遺伝子の暗号配列また
はその相補物からなる環状１本鎖ｃＤＮＡ分子を作製す
る工程と、（ｂ） かかる１本鎖ＤＮＡに、（１）かか
る１本鎖ＤＮＡのセグメントに相補的であることと野生
型ＡＴの位置３５８に於けるアミノ酸に対応するコドン
に於て１つまたは２つ以上の誤対合を含みかつ該誤対合
がアラニンまたはバリンまたはグリシンまたはフェニル
アラニンまたはアルギニンまたはリジンのためのコドン
の１つからなることとを特徴とする直線状オリゴヌクレ
オチドと（２）Ｍ１３のための万能プライマーのような
プライマーとをアニーリングさせる工程と、（ｃ） 該
オリゴヌクレオチドとプライマーとを酵素的に延長する
工程と、（ｄ） 延長されたオリゴヌクレオチドとプラ
イマーとの末端を一緒に結合してギャップつき環状２本
鎖ＤＮＡ分子を生成させる工程と、（ｅ） 該２本鎖ギ
ャップ付き環状ＤＮＡ分子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中
へトランスフェクションしてヒトＸ３５８−ＡＴのため
の構造遺伝子を含む閉環状ＤＮＡ分子を生成させかつプ
ラークハイブリダイゼーションのためのプローブとして
の突然変異体オリゴヌクレオチドでスクリーニング後、
突然変異体ＤＮＡを分離する工程とからなるヒトＸ
３５８−ＡＴ（ここでＸはアラニンまたはバリンまたは
グリシンまたはフェニルアラニンまたはアルギニンまた
はリジンである）のための構造遺伝子のための暗号づけ
をする１本鎖または２本鎖閉環状ＤＮＡの生成方法を提
供する。同様の方法によって、ＡＴのＺ−対立遺伝子と
しても知られているヒトＬｙＳ３４２−ＡＴの構造遺伝
子からなる閉環状ＤＮＡ分子を作製することができる。
本発明の方法は３４２と３５８の両方の位置ならびに他
の位置に於て突然変異誘発されたＡＴの作製にも利用す
ることができる。本発明は突然変異誘発ＡＴのための構
造遺伝子からなるＤＮＡ構造物およびクローニングベク
ターおよび突然変異誘発蛋白質の表現方法ならびに実質
的に純粋な部位特異性突然変異誘発ＡＴをも提供する。
図１について説明すると、この図には野生型ＡＴの優勢
形の構造遺伝子およびアミノ酸配列が示してある。位置
３５６−３６０に於けるアミノ酸からなるＡＴの活性部
位はメチオニン残基を含む。位置３５８に於ける残基は
タバコの煙または他の酸化性汚染物質に暴露されるとき
酸化を受けやすい。かかる酸化はＡＴの生物学的活性を
減少させる可能性があるので、部位特異性突然変異誘発
により、該位置に於て別のアミノ酸、すなわちアラニン
またはバリンまたはグリシンまたはフェニルアラニンま
たはアルギニンまたはリジンで置換して、より安定なＡ
Ｔの形を生成させることができる。さらに、遺伝的ＡＴ
欠損の１つはＺ−対立遺伝子変異体として知られている
異常形の生成である。図１について言うと、この突然変
異はアミノ酸位置３４２に於けるグルタミン酸のリジン
による置換によって示される。Ｚ−対立遺伝子変異体に
対して同型接合性の個人は、明らかに肝臓に於ける処理
妨害のために正常レベルの約１５％のＡＴを生成する。
このことは肝臓中にＡＴの未熟形の蓄積を生じ、これに
対応して血漿の該阻害剤レベルが減少する。この状態を
もつ個人の８０％までは慢性の肺および（または）肝臓
疾患で死に至ると考えられている。Ｚ−対立遺伝子変異
体蛋白質自体は野生型蛋白質と同じ抗エラスターゼ活性
を有することは注目すべきである。かかる個人のＡＴレ
ベルは野生型ＡＴの静脈内投与によって増強することが
できる〔ガデク（Ｇａｄｅｋ）ら、ジャーナル・オブ・
クリニカル・インベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｃｌｉｎｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ
６８，１１５８−１１６５（１９８１）参照〕。しか
し、野生型蛋白質はこれらの患者にとって異種であるの
で、幾人かのＺＺ個人は野生型蛋白質にアレルギーにな
ると期待され得る。かくして、本発明はある種のＡＴ欠
損患者に於て非免疫原となり得るＺ−対立遺伝子変異体
の生成方法を提供する。抗トロンビン活性を有すること
が示されているＡｒｇ３５９−ＡＴは血液凝固阻止に有
用でもあり得る。天然産アンチトロンビンＩＩＩは、通
常、体内で血液凝固を調節する働きがある。アンチトロ
ンビンＩＩＩは播種血管内凝固の治療のため〔ガスナー
（Ｇａｓｓｎｅｒ）ら、Ｗｉｅｎ．Ｋｌｉｎ．Ｗｏｃｈ
ｅｎｓｃｈｒ．９１：５１−５３、１９７９；およびヘ
ルグレン（Ｈｅｌｌｇｒｅｎ），Ｍ．他、Ｇｙｎｅｃｏ
ｌ．Ｏｂｓｔｅｔ． Ｉｎｖｅｓｔ・１６：１０７−１
１８、１９８３〕、および他の症状の治療に於いてヘパ
リンの代替物として〔バーンハート（Ｂｅｒｎｈａｒｄ
ｔ），Ｗ，およびノバコバ−バネット（Ｎｏｖａｋｏｖ
ａ−Ｂａｎｅｔ），Ａ，Ｒｉｃ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ，１
３ ：６１−６６、１９８３〕用いられて来た。特に、
本発明は野生型ヒトＡＴ遺伝子のｃＤＮ４Ａたはその相
補物からなる１本鎖ＤＮＡ鋳型の作製に関する。突然変
異させようとするコドンに於て１個または２個以上の誤
対合を含む直線状オリゴヌクレオチドプライマーを、突
然変異誘発部位の５′側にアニーリングする第２プライ
マーと一緒に鋳型へアニーリングさせる。好ましい第２
プライマーは市販されておりかつＭ１３ベクター中のラ
ック （ｌａｃ）Ｚ遺伝子へハイブリダイゼーションす
るＭ１３の万能プライマーである〔メッシング（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ），Ｍｅｔｈ．ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１０１：２０−７７、１９８３〕。該オリゴヌクレオチ
ドを廷長しかつ末端に於て結合させて２本鎖ギャップつ
き環状ＤＮＡを得る。この２本鎖ＤＮＡを用いて宿主微
生物大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をトランスフェクション
し、突然変異体および野生型ＤＮＡ分子の混合物を含む
集団をもたらす。突然変異体ＤＮＡオリゴヌクレオチド
をプローブとして用いるプラークハイブリダイゼーショ
ンによって突然変異体ＤＮＡ分子を選択する。このＤＮ
Ａをシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）変化したコ
ドンの存在を証明した後、適当な表現ベクター中へクロ
ーニングすることができる。突然変異誘発ＡＴ蛋白質
は、細菌または酵母あるいは他の前核類または真正核類
中で表現させることができる。本明細書中で使用する
“ＤＮＡ構造物”、“ベクター“プラスミド”という用
語は、ヒトの介在によって変性されているＤＮＡ分子あ
るいはかく変性されている分子のクローンであるＤＮＡ
分子であって、そうでなければ天然には存在しない方法
で結合させかつ配列させたＤＮＡのセグメントを含むＤ
ＮＡ分子を構成する。本明細書中で使用する“表現ベク
ター”という用語は、宿主生物中へ形質転換させるとき
それ自体の複製を保証する遺伝情報と宿主生物中で表現
されるべき少なくとも１つの遺伝子ならびに転写の開
始、翻訳の開始、プロモーター領域およびある場合には
読み終り領域のための部位のような、表現が起こるため
に必要となり得る他の制御機能を含むＤＮＡ構造物であ
る。“表現”という用語は、通常の用途に於ては、宿主
生物中に存在する遺伝子によって暗号づけされる蛋白質
生成物がある生物によって合成される条件を意味すると
定義される。“ギャップつき”という用語は、実質的に
２本鎖であるが１本鎖領域を含むＤＮＡ分子を意味す
る。物質および方法 全体にわたって標準の生化学的方法を用いた。Ｍ１３宿
主株、万能プライマーおよびベクターはベテスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から得た。制限エン
ドヌクレフアーゼは、ベデスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ）、ニュー・イングランド・バイオラ
ブズ（Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）、ベー
リンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ）から得、メーカーの指令書に従って使用した。細
菌細胞の形質転換、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレナウ
（Ｋｌｅｎｏｗ）断片）を用いるＤＮＡ断片の平滑化
（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）方法、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
るＤＮＡ断片の接合方法を含む一般的クローニング方法
はマニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らが記載している
〔モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇ）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ．
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８
２〕。一般的な部位特異性突然変異誘発方法は、ゾラ
ー、マークＪ．（Ｚｏｌｌｅｒ，ＭａｒｋＪ．）および
Ｍ．スミス（Ｍ．Ｓｍｉｔｈ）著、“Ｍ１３誘導ベクタ
ー中へクローニングされたＤＮＡ断片のオリゴヌクレオ
チド指示突然変異誘発（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｏｆ
ＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｃｌｏｎｅｄ Ｉｎｔｏ
Ｍ１３Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ）”、マニュ
アル・フォー・アドバンスト・テクニックス・イン・モ
レキュラー・クローニング・コース（Ｍａｎｕａｌ ｆ
ｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓ
ｅ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｅｒＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ）、１９８３に記載されている。野生型ＡＴ中の配
列から１つ以上の塩基変化を含むオリゴヌクレオチド
は、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびカルサー
ズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、テトラヘドロン・レターズ
（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）２２：１
８５９−１８６２、１９８１およびマッテウチ（Ｍａｔ
ｔｅｕｃｈ）およびカルーサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ｓ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１３８
（１９８１）に一般的に記載されている亜燐酸トリエス
テル法により、マッテウチ（Ｍａｔｔｅｕｃｈ）および
カルーザーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）、テトラヘドロン
・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｓｅｒ
ｓ）２１：７１９−７２２（１９８０）に記載されてい
るようなポリマー支持体を用いて作製することができ
る。別法では、アプライド，バイオシステムズ・モデル
３８０−ＡＤＮＡ合成装置のような機械によって、オリ
ゴヌクレオチドを合成することができる。合成されたオ
リゴヌクレオチドは、変性用ゲル上でのポリアクリルア
ミドゲル電気泳動によって精製することができる。オリ
ゴヌクレオチドは、５′−端に於て、（ガンマ）３２
Ｐ−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼによって燐
酸化され得る。オリゴヌクレオチド配列の検定はマクサ
ム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法、メソド・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ）、６５：５７（１９８
０）で行うことができる。野生型アルファ−１−抗トリ
プシン遺伝子からなる１本鎖ＤＮＡの作製ヒトＡＴの優
勢形のための暗号づけをする遺伝子は、ＤＮＡハイブリ
ダイゼーションプローブとして 々配列を用いる常法
〔クラチ（Ｋｕｒａｃｈｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８、６８２０−８３０（１
９８０）；およびチャンドラ（Ｃｈａｎｄｒａ）ら、Ｂ
ｉｏｃｈａｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．，１
０３、７５１−７５８（１９８１）〕によってヒト肝臓
ｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。ＡＴ
遺伝子は１４４６ｂｐ Ｐｓｔ１ 断片として単離さ
れ、Ｐｓｔ１ 消化プラスミドｐＵＣ１３〔ビエイラ
（Ｖｉｅｉｒａ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９、２５
９−２６８（１９８２）記戴の方法で作製、但しｌａｃ
Ｚ遺伝子に於ける開始に於て図３に示す多重制限部位を
含む〕中へ挿入されてＡＴ遺伝子の３′側のポリリンカ
ー中にＢａｍ Ｈ１部位を含む組換型プラスミドｐＵＣ
α１を与える。プラスミド ｐＵＣα１はＢａｍ Ｈ１
で消化されてＡＴ配列を得る。１３２０ｂｐ Ｂａｍ
Ｈ１断片を次にＭ１３ｍｐ１０中に結合し〔メッシング
（Ｍｅｓｓｉｎｇ 、メソド・イン・エンザイモロジー
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１０
１：２０−７７（１９８３）〕、得られた組換型ファー
ジを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２（ＪＭ１０
３）をトランスフェクションする。ＡＴ遺伝子を含む１
本鎖閉環状ＤＮＡを、次にゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およ
びスミス（Ｓｍｉｔｈ）の方法（上掲）で単離する。
野生型ＡＴ中の配列から１つ以上の塩基変化を含むオリゴヌクレオチドの作製 下記表１に示すオリゴヌクレオチドを通常の亜燐酸トリ
エステル法またはアプライド・バイオシステムズ・モデ
ル３８０−Ａ合成装置で合成した後、変性用ポリアクリ
ルアミドゲル上で精製することができる。このオリゴヌ
クレオチドは、アミノ酸３５８のコドンのための適当な
誤対合が存在する以外は 図１に示す野生型ヒトＡＴの
アミノ酸３５６−３６０のための暗号づけをする。
エステル法またはアプライド・バイオシステムズ・モデ
ル３８０−Ａ合成装置で合成した後、変性用ポリアクリ
ルアミドゲル上で精製することができる。このオリゴヌ
クレオチドは、アミノ酸３５８のコドンのための適当な
誤対合が存在する以外は 図１に示す野生型ヒトＡＴの
アミノ酸３５６−３６０のための暗号づけをする。
上記のものよりも長いオリゴヌクレオチドを使用できる
ことは言うまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、
表１中に示したものの代わりに他の突然変異体コドンを
用いることができることも言うまでもない。オリゴヌク
レオチドは、長さが１５−２１ヌクレオチドの範囲であ
りかつ少なくともヌクレオチド１１８４−１１９８を含
むことが好ましい。もう１つのオリゴヌクレオチドは第
２表に示すようにして作製され、ＡＴ配列中のアミノ酸
３４２のためのコドンの周りにほぼ中心を置く配列に対
応する。表２のオリゴヌクレオチドはアミノ酸３４２の
ためのコドンに於ける誤対合を含み、それによってリジ
ンのコドンが含まれてＺ−対立遺伝子変異体を生じる。
ことは言うまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、
表１中に示したものの代わりに他の突然変異体コドンを
用いることができることも言うまでもない。オリゴヌク
レオチドは、長さが１５−２１ヌクレオチドの範囲であ
りかつ少なくともヌクレオチド１１８４−１１９８を含
むことが好ましい。もう１つのオリゴヌクレオチドは第
２表に示すようにして作製され、ＡＴ配列中のアミノ酸
３４２のためのコドンの周りにほぼ中心を置く配列に対
応する。表２のオリゴヌクレオチドはアミノ酸３４２の
ためのコドンに於ける誤対合を含み、それによってリジ
ンのコドンが含まれてＺ−対立遺伝子変異体を生じる。
上記よりも長いオリゴヌクレオチドが利用できることは
言うまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、表２に
示したものの代わりに他の突然変異体コドンを用いるこ
とができることも言うまでもない。オリゴヌクレオチド
は、長さが１５−２１ヌクレオチドでありかつヌクレオ
チド１１３５−１１４９を含むことが好ましい。オリゴヌクレオチドの延長および結合 上に挙げたオリゴヌクレオチドのおのおのを、Ｍ１３の
万能プライマーのような第２プライマーと一緒に野生型
ＡＴ遺伝子を含む１本鎖組換型Ｍ１３ファージＤＮＡと
アニーリングさせる。典型的な操作に於ては、２０ｐｍ
ｏｌの燐酸化Ｚ−対立遺伝子オリゴヌクレオチドと２０
ｐｍｏｌのＭ１プライマーとをＡＴｃＤＮＡを含む組換
型Ｍ１３ファージ１ｐｍｏｌと混合し、アニーリングさ
せた。このオリゴヌクレオチドを、次にＤＮＡポリメラ
ーゼ１〔クレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント〕を用
いて延長し、合成鎖の末端をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て接合させた。得られたＤＮＡ分子はＡＴ暗号領域にわ
たって明らかに二本鎖でありかつＭ１３ベクター領域に
わたって部分的に１本鎖である。これらのギャップ付き
ＤＮＡ環をコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２
（ＪＭ１０１）中へトランスフェクションして細菌ＤＮ
Ａ修復系によってギャップを埋めて活性ファージを作る
ことができる。突然変異体分子の集団は、ファージＤＮ
Ａをニトロセルロースフィルターに結合させて３２Ｐで
ラベルした突然変異誘発性オリゴヌクレオチドでプロー
ブするプラーク・リフト（ｐｌａｑｕｅ−ｌｉｆｔ）ハ
イブリダイゼーション法〔ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）ら、
上掲〕によって野生型から識別される。本操作の背後に
ある原理は、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドが野生
型クローンとよりも安定な複式を突然変異体クローンと
形成する（野生型クローンとのハイブリダイゼーション
は誤対合を生ずる）ということである。低温に於けるハ
イブリダイゼーションの後、突然変異体分子だけがプロ
ーブとハイブリッドを形成するまで洗浄温度を上げる。
典型的には、２３℃の温度でハイブリダイゼーションを
行った後、２３℃、３７℃、５０℃、５５℃で逐次洗浄
し、各洗浄後にオートラジオグラフィーを行うことがで
きる。突然変異体ファージを次に単離し、再度プレート
にまき、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１４３：１６１、１９８３）およびサンガー
（Ｓａｎｇｅｒ）ら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ．，７４：５４６３、１９７７）のジ
デオキ（ｄｉｄｅｏｘｙ）法を用いるシーケンシング
（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって突然変異の存在を証
明することができる。
言うまでもない。また、遺伝暗号の縮退のため、表２に
示したものの代わりに他の突然変異体コドンを用いるこ
とができることも言うまでもない。オリゴヌクレオチド
は、長さが１５−２１ヌクレオチドでありかつヌクレオ
チド１１３５−１１４９を含むことが好ましい。オリゴヌクレオチドの延長および結合 上に挙げたオリゴヌクレオチドのおのおのを、Ｍ１３の
万能プライマーのような第２プライマーと一緒に野生型
ＡＴ遺伝子を含む１本鎖組換型Ｍ１３ファージＤＮＡと
アニーリングさせる。典型的な操作に於ては、２０ｐｍ
ｏｌの燐酸化Ｚ−対立遺伝子オリゴヌクレオチドと２０
ｐｍｏｌのＭ１プライマーとをＡＴｃＤＮＡを含む組換
型Ｍ１３ファージ１ｐｍｏｌと混合し、アニーリングさ
せた。このオリゴヌクレオチドを、次にＤＮＡポリメラ
ーゼ１〔クレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント〕を用
いて延長し、合成鎖の末端をＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て接合させた。得られたＤＮＡ分子はＡＴ暗号領域にわ
たって明らかに二本鎖でありかつＭ１３ベクター領域に
わたって部分的に１本鎖である。これらのギャップ付き
ＤＮＡ環をコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２
（ＪＭ１０１）中へトランスフェクションして細菌ＤＮ
Ａ修復系によってギャップを埋めて活性ファージを作る
ことができる。突然変異体分子の集団は、ファージＤＮ
Ａをニトロセルロースフィルターに結合させて３２Ｐで
ラベルした突然変異誘発性オリゴヌクレオチドでプロー
ブするプラーク・リフト（ｐｌａｑｕｅ−ｌｉｆｔ）ハ
イブリダイゼーション法〔ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）ら、
上掲〕によって野生型から識別される。本操作の背後に
ある原理は、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドが野生
型クローンとよりも安定な複式を突然変異体クローンと
形成する（野生型クローンとのハイブリダイゼーション
は誤対合を生ずる）ということである。低温に於けるハ
イブリダイゼーションの後、突然変異体分子だけがプロ
ーブとハイブリッドを形成するまで洗浄温度を上げる。
典型的には、２３℃の温度でハイブリダイゼーションを
行った後、２３℃、３７℃、５０℃、５５℃で逐次洗浄
し、各洗浄後にオートラジオグラフィーを行うことがで
きる。突然変異体ファージを次に単離し、再度プレート
にまき、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．１４３：１６１、１９８３）およびサンガー
（Ｓａｎｇｅｒ）ら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ．，７４：５４６３、１９７７）のジ
デオキ（ｄｉｄｅｏｘｙ）法を用いるシーケンシング
（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって突然変異の存在を証
明することができる。
細菌表現ベクター中への配列に於ける突然変異体のクロ
ーニング 突然変異体ＡＴ暗号領域は、複製型のＢａｍＨ１および
Ｐｓｔ１による消化によって閉環状ＤＮＡから取除くこ
とができる。突然変異体ＡＴ遺伝子を含む断片を、Ｂａ
ｍＨ１およびＰｓｔ１消化ベクターＭ１３ＴＡｃまたは
Ｍ１３ｍｐ１０中へ挿入することができる。ファージＭ
１３ｍＰ１０はＰ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）またはベテスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ （Ｂｅｔｈｅｓｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｙａｔｏｒｉｅｓ）から市販されている。得ら
れた構造物は、上述のように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ
１２（ＪＭ１０３）を形質転換させるために用いること
ができる。ファージＭ１３ｍｐ１０をＥｃｏＲＩおよび
ＢａｍＨｌで消化してＭ１３ＴＡｃを作製する。得られ
た付着末端に、Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−ＬＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した、下記構造を有し
ＡＡＴＴｃＡＴＧＧＡＧ ＧＴＡｃｃＴｃｃＴＡＧ かつ５個の主憐酸塩が欠損している合成ＤＮＡアダプタ
ーを結合させて構造物ｍｐ１０Ａを生成させる。かくし
て、構造物ｍｐ１０ＡはＡＴ遺伝子のための開始コドン
と第１アミノ酸（Ｇｌｕ）コドンとを与えるＡＴＧＧＡ
Ｇを含む配列についてのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨｌ制
限部位を含む。ｍｐ１０のもとのＥｃｏＲＩとＢａｍＨ
ｌとの間の領域のためのアダプターの置換はラックオペ
ロン解読フレームを破壊し、得られたトランスフェクタ
ントは白色プラークを与える。ベクターｍｐ１０ＡをＡ
ｖａＩＩで消化し、付着末端をＤＮＡポリメラーゼのク
レナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントを用いて埋める。
この後でＥｃｏＲＩで消化しかつＳ１ヌクレアーゼを用
いて付着末端を除去する。得られた平滑末端断片がｍｐ
１０Ｂである。ｔｒｐ−ラックプロモーターからなるＤ
ＮＡ断片を市販プラスミドｐＤＲ５４０〔Ｐ−Ｌバイオ
ケミカルズ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）〕か
ら取り出す。このプラスミドｐＤＲ５４０をＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断し付着端をクレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリ
メラーゼで埋める。記列ＣＣＴＣＧＡＧＧを有するリン
カーをこの平滑末端に結合し、過剰のリンカーをＸｈｏ
Ｉによる消化によって除去する。得られたｐＤＲ５４０
Ｘとして知られている構造物はｐＤＲ５４０のＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位の代わりにＸｈｏＩ部位を含む。ＸｈｏＩお
よびＢａｍＨ１によるｐＤＲ５４０Ｘの消化およびそれ
に続くクレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントを用いる
末端の平滑化によってｔｒｐ−ラックプロモーター（Ｔ
Ａｃ）とシャイン−ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇ
ａｒｎｏ）配列とを含む断片を得る。ｔｒｐ−ラックプ
ロモーターを含む上記断片をｍｐ１０Ｂ断片中に挿入し
てハイブリッドファージｍｐ１０ｃを生成する。ｍｐ１
０Ｂの平滑化ＡｖａＩＩをＴＡｃ含有断片の平滑化Ｘｈ
ｏ１へ結合することによって結合部にＸｈｏ１部位を再
生する。ＴＡｃ断片の平滑化ＢａｍＨ１部位のｍｐ１０
Ｂの平滑化ＥｃｏＲＩ末端への結合によってこの結合部
にＮｃｏＩ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を生じる。断片の正し
い指向は、青色プラークの生成によってスクリーニング
することができる。ファージｍｐ１０Ｃは、もとのＢａ
ｍＨｌ部位中へのＡＴ遺伝子の挿入を容易にするために
除去されねばならないＡＴＧ開始コドンの上流に位置す
る第２ＢａｍＨｌを含む。この異質のＢａｍＨｌ部位を
除去するため、ｍｐ１０ｃをＢａｍＨｌによる２回の消
化にかける。第１の部分的消化の後で、クレナウ（Ｋｌ
ｅｎｏｗ）ポリメラーゼによって付着末端を埋め、Ｘｈ
ｏｌで消化し、アガロースゲル上て精製する。正しい断
片はＮｃｏＩ制限部位を含む断片として確認される。ｍ
ｐ１０ｃの第２のＢａｍＨｌ消化は完了まで行い、付着
末端をクレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼを用いて
埋め、α−３２Ｐ−ｄＮＴＰ′ｓを用いてＢａｌ３１エ
キソヌクレアーゼによる平滑末端のその後のマニキュア
リングの監視を容易にする。Ｂａｌ３１エキソヌクレア
ーゼにより標識末端から５塩基対を除去し、それによっ
てＢａｍＨ１部位を除去する。プロモーターを含む配列
をＸｈｏＩで除去し、ゲル精製する。ｍｐ１０とｐＯＲ
５４０誘導断片とを一緒に結合し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）Ｋ１２（ＪＭ１０３）〔メッシング、Ｊ．（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ，Ｊ．）ら１９８１ヌクレイックアシド・Ｒｅ
ｓ．（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）９：３０
９、ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ）から市販〕中へクローニングし、ＮｃｏＩ
感受性および青色プラークの生成でスクリーニングす
る。得られたベクターはＭ１３ＴＡＣである。酵母中に於ける表現ベクターのクローニング 酵母中に於けるクローニングおよび表現のために、Ｂａ
ｍＨｌ断片のような変異体配列を含むＭ１３ファージの
複製型から変異体ＡＴ配列を単離し、ＢａｍＨｌ消化プ
ラスミドＨＡＴ４中へ挿入することができる。プラスミ
ドＨＡＴ４は、下記の方法で作られたものである。プラ
スミドｐＪＤＢ ２４８〔ベッグズ（Ｂｅｇｇｓ）、ネ
ーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２７５：１０４−１０９、１
９７８）をＥｃｏＲ１で部分的に消化し、ｐＭＢ９配列
を除去した。プラスミドｐＢＲ３２２〔ポリバー（Ｂｏ
ｌｉｖａｒ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）２：９５−１１
３、１９７７〕をＥｃｏＲＩで開裂し、ｐＭＢ９配列の
代わりに直線状ｐＪＤＢ２４８へ接合させた。得られた
プラスミドはｃｌ／１として知られている。プラスミド
ｐＴＰＩＣ１０〔アルバー（Ａｌｂｅｒ）およびカワサ
キ（Ｋａｗａｓａｋｉ）、Ｊ．ＭｏＩ．Ａｐｐ．Ｇｅｎ
ｅｔ １：４１９−４３４、１９８２〕から、部分的Ｂ
ｇｌＩＩ消化、再結合、Ｋｐｎ１による消化によって酵
母ＴＰＩプロモーターを除去した。得られた直線状プラ
スミド約５０μｇを５単位のＢａｌ３１で、３０℃に於
て５分間処理した。このＤＮＡを、次にＤＮＡポリメラ
ーゼＩ〔クレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント〕で処
理して分子の末端を平滑化した。次に、ＨｉｎｄＩＩＩ
リンカ−を添加した。ＴＰＩ暗号領域の位置÷４に於て
ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−を含むプラスミドが同定され
た。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｂａｌ
３１で数秒間消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ〔クレナウ
（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント〕で平滑化した・次に、
ＥｃｏＲ１リンカー（ＧＧＡＡＴＴｃｃ）を添加し、こ
のＤＮＡをＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＴＰ
Ｉプロモーターからなる断片を単離した。この断片を、
ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで直線状にしてあるＹＲｐ
７′〔スティンチコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）ら、ネ
ーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２８２：３９−４３、１９７
９〕中へ挿入した。ＴＥ３２と呼ばれる１つのかかるプ
ラスミドは、ＴＰＩ配列中のおよそ−１４の位置にＥｃ
ｏＩリンカーを含んでいた。ＴＥ３２をＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨｌで切断し、下記配列 を有するリンカーの１０倍過剰と結合させた。得られた
プラスミドをＢａｍＨｌで切断し、再結合させてプラス
ミドＴＥＡ３２を生成させた。次に、ＴＥＡ３２から、
約９００塩基対のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨ１断片としてＴ
ＰＩプロモーター断片を除去し、Ｃ１／１のＢａｍＨ１
部位中へ挿入した。プラスミドｐＵＣα１を次にＸｂａ
Ｉで開裂し、プラスミドｐＴＰＩＣ１０〔アルバー（Ａ
ｌｂｅｒ）およびカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）、上
掲〕から得られた、７００塩基対Ｘｂａｌ−ＥｃｏＲ１
断片のような酵母ＴＰＩ終了暗号をＡＴ配列の下流に挿
入した。次に、ＥｃｏＲ１部位にＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ
１合成ＤＮＡアダプターを付加した。得られたプラスミ
ドをＢａｍＨｌで消化してＡＴ暗号配列とＴＰＩ終了暗
号とからなる約２１００塩基対の断片を遊離させた。こ
の断片をＣ１／１とＴＰＩプロモーターとからなるプラ
スミドのＢａｍＨｌ部位中へ挿入した。得られたプラス
ミドをＨＡＴ４と名付けた。ここに得た表現ベクターを
酵母株の形質転換に用いて突然変異誘発蛋白質を表現さ
せた。好ましい酵母株宿主はＧＫ１００、ＡＴＣＣ、Ｎ
ｏ２０６６９およびｓ．セレビシアエ（Ｓ．Ｃｅｒｖｉ
ｓｉａｅ）株Ｅ２−７Ｂ、ＴＣＣＮｏ２０６８９であ
る。また、この突然変異体配列は、他の酵母表現ベクタ
ー、例えばＹＥｐ１３〔ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら、
ジーン（Ｇｅｎｅ）８：１２１：１３３、１９７９〕、
ＹＲｐ７〔ストルール（Ｓｔｒｕｈｌ）ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１０３５−
１０３９、１９７９〕、ＣＩ／１（上記）、および２μ
またはＡＲＳ配列を含む他のプラスミドおよびそれらの
誘導体中へ挿入することもできる。別法では、該ＡＴ突
然変異体配列を宿主の染色体中へ組込むことによって表
現を得ることができる。この場合には、ＡＴ配列を、適
正な方向づけで、適当な転写プロモーターおよび終了暗
号配列へ連鎖させる。酵母中に於けるＸ３５８−ＡＴの表現 酵母中に於けるＶａｌ３５８−ＡＴの表現 酵母中に於ける突然変異体ＡＴ遺伝子の表現のための好
ましいベクターはＣＩ／１誘毒ｐＦＡＴＰｏ〔図４ ；
ｐＦＡＴＰＯＴで形質転換されたＳ．セレビシアエ
（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｅ１８が受入れＮｏ２
０６９でＡＴＣＣに寄託されている。ｐＦＡＴＰＯＴは
この形質転換体の溶菌細胞からの抽出によって入手でで
きる〕である。ベクターｐＦＡＴＰＯＴはａｍｐｒ、Ｕ
ＥＵ２およびＣ１／１のの２μ領域からなり、表現単位
はＳ．セレビシアエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）．対
三炭燐酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、ｐＵＣ
α１からの野生型ＡＴ配列、およびＳ．セレビシアエ
Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＰＩ転写終了暗号；およ
びシゾサッカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）三炭糖燐酸イソメラー
ゼ（ＰＯＴ１）遺伝子からなる。三炭糖燐酸イソメラー
ゼ産生の欠損している酵母宿主中へ形質転換させるとき
は、プラスミド上のＰＯＴＩ遺伝子が宿主細胞の欠損を
補い、富んだ培地上での成長中、高いコピー数でプラス
ミドを保つことができる。図４ について説明する。ｐ
ＵＣα１をＢａｍＨＩで開裂し、ＡＴ配列からなる約１
４００ｂｐ 断片をゲル精製した。この断片を、次にＢ
ａｍＨｌ消化Ｍ１３ｍｐ１０（複製型）と適当な方向づ
けで結合させて表１ のオリゴヌクレオチドを有する１
本鎖ファージのハイブリダイゼーションを可能にした。
次に、ＡＴ記列を上記のようにして突然変異誘発して配
列暗号づけＶａｌ３５８−ＡＴを生成させた。次に、複
製型ＤＮＡのＢａｍＨＩおよびＸｂａｌる消化によって
Ｍ１３ベクターから突然変異誘発配列を除去した。この
突然変異体ＡＴ配列を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによ
る消化によって直線状にしてあるｐＵｃ１３中へ挿入し
た。得られた組換型プラスミドをｐＵＺＣ３７と名付け
た。再び図 ４について説明する。Ｖａｌ３５８−ＡＴ
のための酵母表現ベクターは下記の方法で作られた。ｐ
ＵＺＣ３７から、ＢａｍＨｌおよびｘｂａＩによる消化
によって突然変異体ＡＴ配列を精製した。ｐＦＡＴＰＯ
Ｔから、ＢａｍＨｌおよびＢｇｌＩによる消化によっ
て、ＴＰＩプロモーターとａｍｐｒ遺伝子の上流部分と
からなる断片を除去し、ゲル精製した。３つの断片を一
緒に結合し、大腸菌 （Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＲＩ（ＡＴＣ
Ｃ３１３４３）の形質転換に用いた。形質転換体をアン
ピシリン耐性でスクリーニングした。得られたプラスミ
ドをｐＦＡＴＰＯＴ３７と名付けた。Ｓ．セレビシアエ
（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｅ１８〔アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に
寄託、受入れ番号Ｎｏ２０７４３〕をｐＦＡＴＰＯＴ３
７で形質転換し、培地Ｉ（グルコース６％、酵母エキス
２％、硫酸アンモニウム０．５％）中で定常期まで１晩
中成長させ、側定標準としてヒトα−１抗トリプシン
〔シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ）〕およびｐＡＦＡＴＰＯＴで形質転換した酵母
中で生成したＭｅｔ３５８−ＡＴを用い、下記のように
してエラスターゼ阻害活性およびトリプシン阻害活性の
生成を側定した。測定用酵母試料は、燐酸塩緩衝食塩水
中で、ガラスビーズで細胞を摩砕して作製した。酵母中
に於けるＡｒｇ３５８−ＡＴの表現Ａｒｇ３５８−ＡＴ
のための酵母表現ベクターを、ｐＦＡＴＰＯＴ３７につ
いて記載したようにして作製した。但し突然変異誘発段
階に於てオリゴヌクレオチドＡＴＡＣＣＣＡＧＧＴＣＴ
ＡＴＣＣＣＣを用いた。最終表現ベクターをｐＦＡＴＰ
ＯＴ１３６と名付けた。Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．Ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）株Ｅ１８をｐＦＡＴＰＯＴ１３６で形
質転換し、下記のようにして成長させ、測定した。結果
を表３に示す。エラスターゼ阻害測定 ｐＨ８８の０．２Ｍトリス中に１μｇ／μｆの豚膵臓エ
ラスターゼ〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）〕を含む溶液１０μ
ｌをＡＴ含有試料２００μｌに加えた。燐酸塩緩衝食塩
水を加えて全容１ｍｌとし、混合物を４℃に於て１５分
間インキュベートした。次に、ｐＨ８．８の０．４Ｍト
リス中に１０ｍｇ／ｍｌのエラスチン−オルセインを含
む溶液１ｍｌを加え、混合物を、１５分間隔で混合しな
がら３７℃に於て６０分間インキュベートした。混合物
を遠心分離し、上澄液のＡ５９０ を測定した。ヒトＡ
Ｔならびに上記のようにして作製したＭｅｔ３５８−Ａ
Ｔ、Ｖａｌ３５８−ＡＴ、Ａｒｇ３５８−ＡＴについて
の測定結果を第３表中に示す。トリプシン阻害活性 ＡＴ含有試料５０μｌに、２．５ｍＭＨｃｌ中に６μｇ
／ｍｌのトリプシン〔牛膵臓から、シグマ（Ｓｉｇｍ
ａ）〕を含む溶液４０μｌを添加し、ｐＨ８．２の０．
１Ｍトリス、０．０２ＭＣａＣｌ２で容積を５００μｌ
に調節し、室温で１０分間インキュベートした。憐酸塩
緩衝食塩水中１０ｍｇ／ｍｌのアゾコル（Ａｚｏｃｏｌ
ｌ）〔カルバイオケム（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）〕を含
む溶液１ｍｌを添加し、混合物を、１０分間間隔で混合
しながら３７℃に於て３０分間インキュベートした。混
合物を遠心分離し、上澄液のＡ５２０を測定した。ヒト
ＡＴならびに上記のようにして作製したＭｅｔ３５８−
ＡＴ、Ｖａｌ３５８−ＡＴ、Ａｒｇ３５８−ＡＴについ
ての測定結果を表３に示す。
ーニング 突然変異体ＡＴ暗号領域は、複製型のＢａｍＨ１および
Ｐｓｔ１による消化によって閉環状ＤＮＡから取除くこ
とができる。突然変異体ＡＴ遺伝子を含む断片を、Ｂａ
ｍＨ１およびＰｓｔ１消化ベクターＭ１３ＴＡｃまたは
Ｍ１３ｍｐ１０中へ挿入することができる。ファージＭ
１３ｍＰ１０はＰ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）またはベテスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ （Ｂｅｔｈｅｓｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｙａｔｏｒｉｅｓ）から市販されている。得ら
れた構造物は、上述のように大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ
１２（ＪＭ１０３）を形質転換させるために用いること
ができる。ファージＭ１３ｍｐ１０をＥｃｏＲＩおよび
ＢａｍＨｌで消化してＭ１３ＴＡｃを作製する。得られ
た付着末端に、Ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−ＬＢｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した、下記構造を有し
ＡＡＴＴｃＡＴＧＧＡＧ ＧＴＡｃｃＴｃｃＴＡＧ かつ５個の主憐酸塩が欠損している合成ＤＮＡアダプタ
ーを結合させて構造物ｍｐ１０Ａを生成させる。かくし
て、構造物ｍｐ１０ＡはＡＴ遺伝子のための開始コドン
と第１アミノ酸（Ｇｌｕ）コドンとを与えるＡＴＧＧＡ
Ｇを含む配列についてのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨｌ制
限部位を含む。ｍｐ１０のもとのＥｃｏＲＩとＢａｍＨ
ｌとの間の領域のためのアダプターの置換はラックオペ
ロン解読フレームを破壊し、得られたトランスフェクタ
ントは白色プラークを与える。ベクターｍｐ１０ＡをＡ
ｖａＩＩで消化し、付着末端をＤＮＡポリメラーゼのク
レナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントを用いて埋める。
この後でＥｃｏＲＩで消化しかつＳ１ヌクレアーゼを用
いて付着末端を除去する。得られた平滑末端断片がｍｐ
１０Ｂである。ｔｒｐ−ラックプロモーターからなるＤ
ＮＡ断片を市販プラスミドｐＤＲ５４０〔Ｐ−Ｌバイオ
ケミカルズ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）〕か
ら取り出す。このプラスミドｐＤＲ５４０をＨｉｎｄ
ＩＩＩで切断し付着端をクレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリ
メラーゼで埋める。記列ＣＣＴＣＧＡＧＧを有するリン
カーをこの平滑末端に結合し、過剰のリンカーをＸｈｏ
Ｉによる消化によって除去する。得られたｐＤＲ５４０
Ｘとして知られている構造物はｐＤＲ５４０のＨｉｎｄ
ＩＩＩ部位の代わりにＸｈｏＩ部位を含む。ＸｈｏＩお
よびＢａｍＨ１によるｐＤＲ５４０Ｘの消化およびそれ
に続くクレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントを用いる
末端の平滑化によってｔｒｐ−ラックプロモーター（Ｔ
Ａｃ）とシャイン−ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇ
ａｒｎｏ）配列とを含む断片を得る。ｔｒｐ−ラックプ
ロモーターを含む上記断片をｍｐ１０Ｂ断片中に挿入し
てハイブリッドファージｍｐ１０ｃを生成する。ｍｐ１
０Ｂの平滑化ＡｖａＩＩをＴＡｃ含有断片の平滑化Ｘｈ
ｏ１へ結合することによって結合部にＸｈｏ１部位を再
生する。ＴＡｃ断片の平滑化ＢａｍＨ１部位のｍｐ１０
Ｂの平滑化ＥｃｏＲＩ末端への結合によってこの結合部
にＮｃｏＩ部位（ＣＣＡＴＧＧ）を生じる。断片の正し
い指向は、青色プラークの生成によってスクリーニング
することができる。ファージｍｐ１０Ｃは、もとのＢａ
ｍＨｌ部位中へのＡＴ遺伝子の挿入を容易にするために
除去されねばならないＡＴＧ開始コドンの上流に位置す
る第２ＢａｍＨｌを含む。この異質のＢａｍＨｌ部位を
除去するため、ｍｐ１０ｃをＢａｍＨｌによる２回の消
化にかける。第１の部分的消化の後で、クレナウ（Ｋｌ
ｅｎｏｗ）ポリメラーゼによって付着末端を埋め、Ｘｈ
ｏｌで消化し、アガロースゲル上て精製する。正しい断
片はＮｃｏＩ制限部位を含む断片として確認される。ｍ
ｐ１０ｃの第２のＢａｍＨｌ消化は完了まで行い、付着
末端をクレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼを用いて
埋め、α−３２Ｐ−ｄＮＴＰ′ｓを用いてＢａｌ３１エ
キソヌクレアーゼによる平滑末端のその後のマニキュア
リングの監視を容易にする。Ｂａｌ３１エキソヌクレア
ーゼにより標識末端から５塩基対を除去し、それによっ
てＢａｍＨ１部位を除去する。プロモーターを含む配列
をＸｈｏＩで除去し、ゲル精製する。ｍｐ１０とｐＯＲ
５４０誘導断片とを一緒に結合し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）Ｋ１２（ＪＭ１０３）〔メッシング、Ｊ．（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ，Ｊ．）ら１９８１ヌクレイックアシド・Ｒｅ
ｓ．（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）９：３０
９、ｐ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ）から市販〕中へクローニングし、ＮｃｏＩ
感受性および青色プラークの生成でスクリーニングす
る。得られたベクターはＭ１３ＴＡＣである。酵母中に於ける表現ベクターのクローニング 酵母中に於けるクローニングおよび表現のために、Ｂａ
ｍＨｌ断片のような変異体配列を含むＭ１３ファージの
複製型から変異体ＡＴ配列を単離し、ＢａｍＨｌ消化プ
ラスミドＨＡＴ４中へ挿入することができる。プラスミ
ドＨＡＴ４は、下記の方法で作られたものである。プラ
スミドｐＪＤＢ ２４８〔ベッグズ（Ｂｅｇｇｓ）、ネ
ーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２７５：１０４−１０９、１
９７８）をＥｃｏＲ１で部分的に消化し、ｐＭＢ９配列
を除去した。プラスミドｐＢＲ３２２〔ポリバー（Ｂｏ
ｌｉｖａｒ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）２：９５−１１
３、１９７７〕をＥｃｏＲＩで開裂し、ｐＭＢ９配列の
代わりに直線状ｐＪＤＢ２４８へ接合させた。得られた
プラスミドはｃｌ／１として知られている。プラスミド
ｐＴＰＩＣ１０〔アルバー（Ａｌｂｅｒ）およびカワサ
キ（Ｋａｗａｓａｋｉ）、Ｊ．ＭｏＩ．Ａｐｐ．Ｇｅｎ
ｅｔ １：４１９−４３４、１９８２〕から、部分的Ｂ
ｇｌＩＩ消化、再結合、Ｋｐｎ１による消化によって酵
母ＴＰＩプロモーターを除去した。得られた直線状プラ
スミド約５０μｇを５単位のＢａｌ３１で、３０℃に於
て５分間処理した。このＤＮＡを、次にＤＮＡポリメラ
ーゼＩ〔クレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント〕で処
理して分子の末端を平滑化した。次に、ＨｉｎｄＩＩＩ
リンカ−を添加した。ＴＰＩ暗号領域の位置÷４に於て
ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−を含むプラスミドが同定され
た。このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｂａｌ
３１で数秒間消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ〔クレナウ
（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント〕で平滑化した・次に、
ＥｃｏＲ１リンカー（ＧＧＡＡＴＴｃｃ）を添加し、こ
のＤＮＡをＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＴＰ
Ｉプロモーターからなる断片を単離した。この断片を、
ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで直線状にしてあるＹＲｐ
７′〔スティンチコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）ら、ネ
ーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２８２：３９−４３、１９７
９〕中へ挿入した。ＴＥ３２と呼ばれる１つのかかるプ
ラスミドは、ＴＰＩ配列中のおよそ−１４の位置にＥｃ
ｏＩリンカーを含んでいた。ＴＥ３２をＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨｌで切断し、下記配列 を有するリンカーの１０倍過剰と結合させた。得られた
プラスミドをＢａｍＨｌで切断し、再結合させてプラス
ミドＴＥＡ３２を生成させた。次に、ＴＥＡ３２から、
約９００塩基対のＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨ１断片としてＴ
ＰＩプロモーター断片を除去し、Ｃ１／１のＢａｍＨ１
部位中へ挿入した。プラスミドｐＵＣα１を次にＸｂａ
Ｉで開裂し、プラスミドｐＴＰＩＣ１０〔アルバー（Ａ
ｌｂｅｒ）およびカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）、上
掲〕から得られた、７００塩基対Ｘｂａｌ−ＥｃｏＲ１
断片のような酵母ＴＰＩ終了暗号をＡＴ配列の下流に挿
入した。次に、ＥｃｏＲ１部位にＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ
１合成ＤＮＡアダプターを付加した。得られたプラスミ
ドをＢａｍＨｌで消化してＡＴ暗号配列とＴＰＩ終了暗
号とからなる約２１００塩基対の断片を遊離させた。こ
の断片をＣ１／１とＴＰＩプロモーターとからなるプラ
スミドのＢａｍＨｌ部位中へ挿入した。得られたプラス
ミドをＨＡＴ４と名付けた。ここに得た表現ベクターを
酵母株の形質転換に用いて突然変異誘発蛋白質を表現さ
せた。好ましい酵母株宿主はＧＫ１００、ＡＴＣＣ、Ｎ
ｏ２０６６９およびｓ．セレビシアエ（Ｓ．Ｃｅｒｖｉ
ｓｉａｅ）株Ｅ２−７Ｂ、ＴＣＣＮｏ２０６８９であ
る。また、この突然変異体配列は、他の酵母表現ベクタ
ー、例えばＹＥｐ１３〔ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら、
ジーン（Ｇｅｎｅ）８：１２１：１３３、１９７９〕、
ＹＲｐ７〔ストルール（Ｓｔｒｕｈｌ）ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１０３５−
１０３９、１９７９〕、ＣＩ／１（上記）、および２μ
またはＡＲＳ配列を含む他のプラスミドおよびそれらの
誘導体中へ挿入することもできる。別法では、該ＡＴ突
然変異体配列を宿主の染色体中へ組込むことによって表
現を得ることができる。この場合には、ＡＴ配列を、適
正な方向づけで、適当な転写プロモーターおよび終了暗
号配列へ連鎖させる。酵母中に於けるＸ３５８−ＡＴの表現 酵母中に於けるＶａｌ３５８−ＡＴの表現 酵母中に於ける突然変異体ＡＴ遺伝子の表現のための好
ましいベクターはＣＩ／１誘毒ｐＦＡＴＰｏ〔図４ ；
ｐＦＡＴＰＯＴで形質転換されたＳ．セレビシアエ
（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｅ１８が受入れＮｏ２
０６９でＡＴＣＣに寄託されている。ｐＦＡＴＰＯＴは
この形質転換体の溶菌細胞からの抽出によって入手でで
きる〕である。ベクターｐＦＡＴＰＯＴはａｍｐｒ、Ｕ
ＥＵ２およびＣ１／１のの２μ領域からなり、表現単位
はＳ．セレビシアエ（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）．対
三炭燐酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、ｐＵＣ
α１からの野生型ＡＴ配列、およびＳ．セレビシアエ
Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＰＩ転写終了暗号；およ
びシゾサッカロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）三炭糖燐酸イソメラー
ゼ（ＰＯＴ１）遺伝子からなる。三炭糖燐酸イソメラー
ゼ産生の欠損している酵母宿主中へ形質転換させるとき
は、プラスミド上のＰＯＴＩ遺伝子が宿主細胞の欠損を
補い、富んだ培地上での成長中、高いコピー数でプラス
ミドを保つことができる。図４ について説明する。ｐ
ＵＣα１をＢａｍＨＩで開裂し、ＡＴ配列からなる約１
４００ｂｐ 断片をゲル精製した。この断片を、次にＢ
ａｍＨｌ消化Ｍ１３ｍｐ１０（複製型）と適当な方向づ
けで結合させて表１ のオリゴヌクレオチドを有する１
本鎖ファージのハイブリダイゼーションを可能にした。
次に、ＡＴ記列を上記のようにして突然変異誘発して配
列暗号づけＶａｌ３５８−ＡＴを生成させた。次に、複
製型ＤＮＡのＢａｍＨＩおよびＸｂａｌる消化によって
Ｍ１３ベクターから突然変異誘発配列を除去した。この
突然変異体ＡＴ配列を、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによ
る消化によって直線状にしてあるｐＵｃ１３中へ挿入し
た。得られた組換型プラスミドをｐＵＺＣ３７と名付け
た。再び図 ４について説明する。Ｖａｌ３５８−ＡＴ
のための酵母表現ベクターは下記の方法で作られた。ｐ
ＵＺＣ３７から、ＢａｍＨｌおよびｘｂａＩによる消化
によって突然変異体ＡＴ配列を精製した。ｐＦＡＴＰＯ
Ｔから、ＢａｍＨｌおよびＢｇｌＩによる消化によっ
て、ＴＰＩプロモーターとａｍｐｒ遺伝子の上流部分と
からなる断片を除去し、ゲル精製した。３つの断片を一
緒に結合し、大腸菌 （Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＲＩ（ＡＴＣ
Ｃ３１３４３）の形質転換に用いた。形質転換体をアン
ピシリン耐性でスクリーニングした。得られたプラスミ
ドをｐＦＡＴＰＯＴ３７と名付けた。Ｓ．セレビシアエ
（Ｓ．Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株Ｅ１８〔アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に
寄託、受入れ番号Ｎｏ２０７４３〕をｐＦＡＴＰＯＴ３
７で形質転換し、培地Ｉ（グルコース６％、酵母エキス
２％、硫酸アンモニウム０．５％）中で定常期まで１晩
中成長させ、側定標準としてヒトα−１抗トリプシン
〔シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ）〕およびｐＡＦＡＴＰＯＴで形質転換した酵母
中で生成したＭｅｔ３５８−ＡＴを用い、下記のように
してエラスターゼ阻害活性およびトリプシン阻害活性の
生成を側定した。測定用酵母試料は、燐酸塩緩衝食塩水
中で、ガラスビーズで細胞を摩砕して作製した。酵母中
に於けるＡｒｇ３５８−ＡＴの表現Ａｒｇ３５８−ＡＴ
のための酵母表現ベクターを、ｐＦＡＴＰＯＴ３７につ
いて記載したようにして作製した。但し突然変異誘発段
階に於てオリゴヌクレオチドＡＴＡＣＣＣＡＧＧＴＣＴ
ＡＴＣＣＣＣを用いた。最終表現ベクターをｐＦＡＴＰ
ＯＴ１３６と名付けた。Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．Ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）株Ｅ１８をｐＦＡＴＰＯＴ１３６で形
質転換し、下記のようにして成長させ、測定した。結果
を表３に示す。エラスターゼ阻害測定 ｐＨ８８の０．２Ｍトリス中に１μｇ／μｆの豚膵臓エ
ラスターゼ〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）〕を含む溶液１０μ
ｌをＡＴ含有試料２００μｌに加えた。燐酸塩緩衝食塩
水を加えて全容１ｍｌとし、混合物を４℃に於て１５分
間インキュベートした。次に、ｐＨ８．８の０．４Ｍト
リス中に１０ｍｇ／ｍｌのエラスチン−オルセインを含
む溶液１ｍｌを加え、混合物を、１５分間隔で混合しな
がら３７℃に於て６０分間インキュベートした。混合物
を遠心分離し、上澄液のＡ５９０ を測定した。ヒトＡ
Ｔならびに上記のようにして作製したＭｅｔ３５８−Ａ
Ｔ、Ｖａｌ３５８−ＡＴ、Ａｒｇ３５８−ＡＴについて
の測定結果を第３表中に示す。トリプシン阻害活性 ＡＴ含有試料５０μｌに、２．５ｍＭＨｃｌ中に６μｇ
／ｍｌのトリプシン〔牛膵臓から、シグマ（Ｓｉｇｍ
ａ）〕を含む溶液４０μｌを添加し、ｐＨ８．２の０．
１Ｍトリス、０．０２ＭＣａＣｌ２で容積を５００μｌ
に調節し、室温で１０分間インキュベートした。憐酸塩
緩衝食塩水中１０ｍｇ／ｍｌのアゾコル（Ａｚｏｃｏｌ
ｌ）〔カルバイオケム（ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）〕を含
む溶液１ｍｌを添加し、混合物を、１０分間間隔で混合
しながら３７℃に於て３０分間インキュベートした。混
合物を遠心分離し、上澄液のＡ５２０を測定した。ヒト
ＡＴならびに上記のようにして作製したＭｅｔ３５８−
ＡＴ、Ｖａｌ３５８−ＡＴ、Ａｒｇ３５８−ＡＴについ
ての測定結果を表３に示す。
本発明の突然変異誘発蛋白質は、形質転換酵母細胞の抽
出物から免疫吸着によって精製することができる。免疫
吸着カラムは、アルファ−１−抗トリプシンに対する親
和性精製抗体を、キュアトレカサス（Ｃｕａｔｒｅｃａ
ｓａｓ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３０５
９、１９７０）の方注に従ってｃＮＢｒ活性化セファロ
ースに共有結合させることによって調製することができ
る。破壊した細胞を、０．５ＭのＮａＣｌを含むｐＨ
７．２の燐酸塩緩衝食塩水３容で抽出し、抽出液をカラ
ムに適用し、カラムを３ＭＮａＳＣＮで溶出した。本発
明の部位特異性突然変異誘発ＡＴ蛋白質は、遺伝的ＺＺ
−個体に見られるような遺伝的抗トリプシン欠損ならび
にＡＴの不十分なレベルまたは患者が野生型ＡＴと抗原
反応を示す状態に関する他の疾病状態の治療に有用であ
り得る。かくして、気腫のような症状および慢性阻害性
肺疾患や成人呼吸困難症候群のような肺嚢の進行性消化
に関する他の肺疾患を治療することができる，ヘビース
モーキングから来る気腫のような遺伝的でない気腫も治
療することができる。嚢胞性線維症や関節炎のような必
ずしも肺に関係のない疾患をも治療することができる。
アルファ−１−抗トリプシンの総説についてはガデク
（Ｇａｄｅｋ）（上掲）を参照されたい。ＡＴの突然変
異体形の上記用途に加えて、アミノ酸３５８に於けるメ
チオニンからアルギニンへの突然変異からなる蛋白質
は、例えば播種血管内凝固の治療に於て血液凝固防止の
ために用いることができる。本発明の蛋白質は、通常の
製剤用担体と混合することができる。好ましくは、本発
明の蛋白質は、静脈内または吸入によって投与すること
ができる。有効投与量は、症状の重度および患者の体重
によって異なるが、本発明の蛋白質を０．５−１０．０
ｇ／週の範の投与量で静脈内投与することが多くの場合
有効である。投与方法が吸入の場合には、上記よりも低
い投与量で有効であり得る。部位特異性突然変異誘発Ａ
Ｔが消化管中での早期分解を防ぐためにカプセルまたは
被覆担体内で保護されるならば経口投与も有効であり得
る。本発明の特別な好ましい実施態様について説明した
が、他の変化や他の実施態様は当業者には明らかであろ
う。かかる変化や実施態様は本発明の範囲内に入るべき
ものである。
出物から免疫吸着によって精製することができる。免疫
吸着カラムは、アルファ−１−抗トリプシンに対する親
和性精製抗体を、キュアトレカサス（Ｃｕａｔｒｅｃａ
ｓａｓ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５：３０５
９、１９７０）の方注に従ってｃＮＢｒ活性化セファロ
ースに共有結合させることによって調製することができ
る。破壊した細胞を、０．５ＭのＮａＣｌを含むｐＨ
７．２の燐酸塩緩衝食塩水３容で抽出し、抽出液をカラ
ムに適用し、カラムを３ＭＮａＳＣＮで溶出した。本発
明の部位特異性突然変異誘発ＡＴ蛋白質は、遺伝的ＺＺ
−個体に見られるような遺伝的抗トリプシン欠損ならび
にＡＴの不十分なレベルまたは患者が野生型ＡＴと抗原
反応を示す状態に関する他の疾病状態の治療に有用であ
り得る。かくして、気腫のような症状および慢性阻害性
肺疾患や成人呼吸困難症候群のような肺嚢の進行性消化
に関する他の肺疾患を治療することができる，ヘビース
モーキングから来る気腫のような遺伝的でない気腫も治
療することができる。嚢胞性線維症や関節炎のような必
ずしも肺に関係のない疾患をも治療することができる。
アルファ−１−抗トリプシンの総説についてはガデク
（Ｇａｄｅｋ）（上掲）を参照されたい。ＡＴの突然変
異体形の上記用途に加えて、アミノ酸３５８に於けるメ
チオニンからアルギニンへの突然変異からなる蛋白質
は、例えば播種血管内凝固の治療に於て血液凝固防止の
ために用いることができる。本発明の蛋白質は、通常の
製剤用担体と混合することができる。好ましくは、本発
明の蛋白質は、静脈内または吸入によって投与すること
ができる。有効投与量は、症状の重度および患者の体重
によって異なるが、本発明の蛋白質を０．５−１０．０
ｇ／週の範の投与量で静脈内投与することが多くの場合
有効である。投与方法が吸入の場合には、上記よりも低
い投与量で有効であり得る。部位特異性突然変異誘発Ａ
Ｔが消化管中での早期分解を防ぐためにカプセルまたは
被覆担体内で保護されるならば経口投与も有効であり得
る。本発明の特別な好ましい実施態様について説明した
が、他の変化や他の実施態様は当業者には明らかであろ
う。かかる変化や実施態様は本発明の範囲内に入るべき
ものである。
図１および 図２ は、ヒトアルファ−１−抗トリプシ
ンの優勢形の構造遺伝子および蛋白質のためのＤＮＡお
よびアミノ酸配列であり、図３はラックＺ遺伝子の開始
に於ける多重制限部位からなるｐＵＣ１３のＤＮＡ配列
であり、図４は突然変異体Ｖａｌ３５８−ＡＴ配列を含
むベクタ−ｐＦＡＴＰＯＴ３７の作製のためのスキーム
である。
ンの優勢形の構造遺伝子および蛋白質のためのＤＮＡお
よびアミノ酸配列であり、図３はラックＺ遺伝子の開始
に於ける多重制限部位からなるｐＵＣ１３のＤＮＡ配列
であり、図４は突然変異体Ｖａｌ３５８−ＡＴ配列を含
むベクタ−ｐＦＡＴＰＯＴ３７の作製のためのスキーム
である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 9/99 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 グレン ヒトシ カワサキ アメリカ合衆国 ワシントン州 98112 シアトル イースト シックスティーンス アベニュー 1547
Claims (11)
- 【請求項１】 少なくとも１個の突然変異コドンを含む
構造遺伝子からなり、該遺伝子が哺乳類のアルファ−１
−抗トリプシンの突然変異体のための暗号づけをしてい
るＤＮＡ構造物。 - 【請求項２】 該突然変異コドンが浦乳類のアルファ−
１−抗トリプシンの位置３５８に於てアミノ酸置換をも
たらすコドン３５８である請求項１記載のＤＮＡ構造
物。 - 【請求項３】 該突然変異コドンが哺乳類のアルファ−
１−抗トリプシンの位置３４２に於てグルタミン酸のリ
ジンによる置換をもたらすコドン３４２である請求項１
記載のＤＮＡ構造物。 - 【請求項４】 位置３５８に於てアラニンをもたらす請
求項２記載のＤＮＡ構造物。 - 【請求項５】 位置３５８に於てバリンをもたらす請求
項２記載のＤＮＡ構造物。 - 【請求項６】 位置３５８に於てグリシンをもたらす請
求項２記載のＤＮＡ構造物。 - 【請求項７】 位置３５８に於てフェニルアラニンをも
たらす請求項２記載のＤＮＡ構造物。 - 【請求項８】 位置３５８に於てアルギニンをもたらす
請求項２記載のＤＮＡ構造物。 - 【請求項９】 位置３５８に於てリジンをもたらす請求
項２記載のＤＮＡ構造物。 - 【請求項１０】 Ｘ３５８−アルファ−１−抗トリプシ
ン（ここでＸはアラニンまたはバリンまたはグリシンま
たはフェニルアラニンまたはアルギニンまたはリジンで
ある）のためのヒト構造遺伝子のために暗号づけする閉
環状ＤＮＡ分子の生成方法であって、 Ａ）野生型ヒトアルファ−１−抗トリプシンのための構
造遺伝子の暗号配列または相補物からなる環状１本鎖ｃ
ＤＮＡを作製する工程と、 Ｂ）該１本鎖ｃＤＮＡに（１）該１本鎖ＤＮＡのセグメ
ントに相補的であることと該野生型アルファ−１−抗ト
リプシンの位置３５８に於けるアミノ酸に対応するコド
ン誤対合を含みかつ該誤対合がアラニンまたはバリンま
たはグリシンまたはフェニルアラニンまたはアルギニン
またはリジンのためのコドンからなることを特徴とする
直線状オリゴヌクレオチドと（２）プライマーとをアニ
ーリングさせる工程と、 Ｃ）該オリゴヌクレオチドとプライマーとを延長する工
程と、 Ｄ）該延長されたオリゴヌクレオチドとプライマーとの
末端を結合してギャップつき環状２本鎖ＤＮＡ分子を生
成させる工程と、 Ｅ）該ギャップつき環伏２本鎖ＤＮＡを宿主微生物中へ
トランスフェクションしてヒトＸ３５８−アルファ−１
−抗トリプシンのための暗号づけをする該構造遺伝子か
らなる該閉環状ＤＮＡ分子を生成させる工程とを含む閉
環状ＤＮＡ分子の生成方法。 - 【請求項１１】 Ａ）野生型ヒトアルファ−１−抗トリ
プシンのための構造遺伝子の暗号配列または相補物から
なる環状１本鎖ｃＤＮＡを作製する工程と、 Ｂ）該１本鎖ＤＮＡを、（１）該１本鎖ＤＮＡのセグメ
ントに相補的であることと該野生型アルファ−１−抗ト
リプシンの位置３４２に於けるアミノ酸に対応するコド
ン誤対合を含みかつ該誤対合がリジンためのコドンから
なることを特徴とする直線状オリゴヌクレオチドと
（２）プライマーとにアニーリングさせる工程と、 Ｃ）該オリゴヌクレオチドとプライマーとを延長させる
工程と、 Ｄ）該延長されたオリゴヌクレオチドとプライマーとの
末端を結合させてギャップつき環状２本鎖ＤＮＡ分子を
生成させる工程と、 Ｅ）該２本鎖ギャップつき環状ＤＮＡを宿主微生物中へ
トランスフェクションしてヒトＺ−対立遺伝子アルファ
−１−抗トリプシン変異体のための暗号づけをする該構
造遺伝子からなる閉環状ＤＮＡ分子を生成させる工程と
を含むヒトＺ−対立遺伝子アルファ−１−抗トリプシン
変異体のための構造遺伝子のための暗号づけをする閉環
状ＤＮＡの生成方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US58941084A | 1984-03-14 | 1984-03-14 | |
| US589410 | 1984-03-14 | ||
| US06/709,382 US4711848A (en) | 1984-03-14 | 1985-03-07 | Site specific mutagenesis in alpha-1-antitrypsin |
| US709382 | 1985-03-07 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60051553A Division JP2539781B2 (ja) | 1984-03-14 | 1985-03-14 | アルフア−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9275648A Division JPH10113193A (ja) | 1984-03-14 | 1997-10-08 | アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
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|---|---|
| JPH06105689A true JPH06105689A (ja) | 1994-04-19 |
| JP2750257B2 JP2750257B2 (ja) | 1998-05-13 |
Family
ID=27080550
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|---|---|---|---|
| JP60051553A Expired - Fee Related JP2539781B2 (ja) | 1984-03-14 | 1985-03-14 | アルフア−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
| JP5115129A Expired - Fee Related JP2750257B2 (ja) | 1984-03-14 | 1993-04-06 | アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
| JP9275648A Pending JPH10113193A (ja) | 1984-03-14 | 1997-10-08 | アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60051553A Expired - Fee Related JP2539781B2 (ja) | 1984-03-14 | 1985-03-14 | アルフア−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9275648A Pending JPH10113193A (ja) | 1984-03-14 | 1997-10-08 | アルファ−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (2) | EP0566158A1 (ja) |
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| AT (1) | ATE99358T1 (ja) |
| AU (1) | AU593766B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341219C (ja) |
| DE (1) | DE3587703D1 (ja) |
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| US6291662B1 (en) | 1984-12-05 | 2001-09-18 | Amgen Inc. | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences |
| US6132990A (en) * | 1984-12-06 | 2000-10-17 | Amgen Boulder Inc. | Recombinant methods for production of serine protease inhibitors and DNA sequences useful for same |
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| US5900400A (en) * | 1984-12-06 | 1999-05-04 | Amgen Inc. | Serine protease inhibitor analogs |
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| ES8706823A1 (es) * | 1985-03-28 | 1987-06-16 | Cetus Corp | Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de al menos una secuencia especifica de acidos nucleicos en una muestra |
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| FR2599752B1 (fr) * | 1986-06-10 | 1989-11-03 | Transgene Sa | Variants de l'alpha1- antitrypsine utiles notamment comme inhibiteurs de la kallikreine |
| DE3782365T2 (de) * | 1986-07-08 | 1993-04-22 | Abbott Lab | Verfahren fuer die mutagenese durch eine oligonukleotidgeleitete reparatur eines strangbruchs. |
| JP2656944B2 (ja) * | 1987-04-30 | 1997-09-24 | クーパー ラボラトリーズ | タンパク質性治療剤のエアロゾール化 |
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| US5648254A (en) * | 1988-01-15 | 1997-07-15 | Zymogenetics, Inc. | Co-expression in eukaryotic cells |
| US5622845A (en) * | 1988-02-17 | 1997-04-22 | The Upjohn Company | Fermentation method for producing norleucine |
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