JP2599585B2 - ヒトα▲下１▼−アンチトリプシン誘導体及びその製造法 - Google Patents
ヒトα▲下１▼−アンチトリプシン誘導体及びその製造法Info
- Publication number
- JP2599585B2 JP2599585B2 JP60502680A JP50268085A JP2599585B2 JP 2599585 B2 JP2599585 B2 JP 2599585B2 JP 60502680 A JP60502680 A JP 60502680A JP 50268085 A JP50268085 A JP 50268085A JP 2599585 B2 JP2599585 B2 JP 2599585B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antitrypsin
- analog
- human
- alpha
- elastase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- C07K14/8121—Serpins
- C07K14/8125—Alpha-1-antitrypsin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトα１−アンチトリプシンアナローグ、
その製造法及びそれら化合物を含有する医薬組成物に関
する。
その製造法及びそれら化合物を含有する医薬組成物に関
する。
本出願人名義のフランス特許出願No.8300909及び対応
するヨーロツパ特許No.84400126に記載のように、遺伝
子工学技術によりヒトα１−アンチトリプシンを製造す
ることができる。
するヨーロツパ特許No.84400126に記載のように、遺伝
子工学技術によりヒトα１−アンチトリプシンを製造す
ることができる。
本特許出願は、該化合物の応用の可能性を著るしく増
大させるものである。
大させるものである。
ヒトα１−アンチトリプシン活性に関するより詳細な
研究により、この生成物のアナローグが提供し得る利点
を確立することができた。
研究により、この生成物のアナローグが提供し得る利点
を確立することができた。
α１−アンチトリプシンの最も重要な生理学的役割
は、気道下部における好中球エラスターゼの阻害であ
る。
は、気道下部における好中球エラスターゼの阻害であ
る。
健常な肺においては、α１−アンチトリプシンとエラ
スターゼとは、バランスよく作用して、異物のまわりに
液化域を作り、それらを排出する。
スターゼとは、バランスよく作用して、異物のまわりに
液化域を作り、それらを排出する。
この平衡がくずれてエラスターゼが優勢になると、プ
ロテアーゼの作用は制御されず、組織にかなりの障害を
与える。こうして、臨床的には気腫となる。
ロテアーゼの作用は制御されず、組織にかなりの障害を
与える。こうして、臨床的には気腫となる。
このようなアンバランスは、遺伝性α１−アンチトリ
プシン欠乏症例に認められる。
プシン欠乏症例に認められる。
非遺伝性気腫の最も多い原因は、喫煙である。この場
合には、種々の因子の相互作用により、肺胞のプロテア
ーゼ／抗プロテアーゼはアンバランスになる。α１−ア
ンチトリプシン活性は、酸化により、例えば喫煙自体に
より直接にあるいは汚染煙粒子の存在のため肺に生じる
マクロフアージにより放出される酸素ラジカルにより低
下する。さらに、これらマクロフアージ（これ自体エラ
スターゼを産生する）は、化学走性因子を分泌し、その
部位で好中球エラスターゼを遊離する。
合には、種々の因子の相互作用により、肺胞のプロテア
ーゼ／抗プロテアーゼはアンバランスになる。α１−ア
ンチトリプシン活性は、酸化により、例えば喫煙自体に
より直接にあるいは汚染煙粒子の存在のため肺に生じる
マクロフアージにより放出される酸素ラジカルにより低
下する。さらに、これらマクロフアージ（これ自体エラ
スターゼを産生する）は、化学走性因子を分泌し、その
部位で好中球エラスターゼを遊離する。
また、α１−アンチトリプシンはおそらく蛋白分解切
断による非可逆性不活性化に反応しやすくなる。即ち、
ヘビースモーカーの肺には、肺の破壊的疾患に導き得る
エラスターゼの混入が存在する。
断による非可逆性不活性化に反応しやすくなる。即ち、
ヘビースモーカーの肺には、肺の破壊的疾患に導き得る
エラスターゼの混入が存在する。
もし、先述のフランス特許出願に記載のように、前記
のあらゆる種類のアンバランスを処置するのに細菌性の
α１−アンチトリプシン（以下α１−ATと称する）を使
用できるとしても、インビボでの安定性が改善されたα
１−ATアナローグを提供することは興味あることと思わ
れる。
のあらゆる種類のアンバランスを処置するのに細菌性の
α１−アンチトリプシン（以下α１−ATと称する）を使
用できるとしても、インビボでの安定性が改善されたα
１−ATアナローグを提供することは興味あることと思わ
れる。
このことが、本発明が、特にインビボでの安定性が改
善された、特に酸化に対する耐性が増大したα１−ATア
ナローグを提供している理由である。
善された、特に酸化に対する耐性が増大したα１−ATア
ナローグを提供している理由である。
多くの研究により、α１−ATの不活性化は、おそら
く、エラスターゼ固定部位に位置することが明らかにさ
れている第358位のメチオニン残基の酸化によるもので
あることが判明している。
く、エラスターゼ固定部位に位置することが明らかにさ
れている第358位のメチオニン残基の酸化によるもので
あることが判明している。
本発明は、従って、358位の天然のメチオニン残基を
置換したロイシン残基を含むヒトα１−ATの、細菌中、
特に大腸菌中での製造に関する。
置換したロイシン残基を含むヒトα１−ATの、細菌中、
特に大腸菌中での製造に関する。
種々の基質へのエラスターゼの固定に関する研究によ
り、メチニオンをバリンに変えるとα１−ATとエラスタ
ーゼ間の結合定数は改善され、アナローグの活性は増大
することが明らかにされている。
り、メチニオンをバリンに変えるとα１−ATとエラスタ
ーゼ間の結合定数は改善され、アナローグの活性は増大
することが明らかにされている。
さらに、α１−ATは、エラスターゼ、トリプシン、キ
モトリブシン、プラスミン及びトロンビンを含む大量の
セリンプロテアーゼを阻害する。その最も重要な機能
は、前述のように、気道中の好中球エラスターゼの阻害
である。
モトリブシン、プラスミン及びトロンビンを含む大量の
セリンプロテアーゼを阻害する。その最も重要な機能
は、前述のように、気道中の好中球エラスターゼの阻害
である。
凝固過程におけるα１−ATの役割は、そのトロンビン
阻害能により示唆される。この酵素は、血液凝固カスケ
ードにおける最終段階であるフイブリノーゲンのフイブ
リンへの切断に関与する。
阻害能により示唆される。この酵素は、血液凝固カスケ
ードにおける最終段階であるフイブリノーゲンのフイブ
リンへの切断に関与する。
トロンビンは、また、血小板凝集をトリガーし、第
Ｖ、第VIII及び第XIII因子の活性化を触媒する。
Ｖ、第VIII及び第XIII因子の活性化を触媒する。
α１−ATによるトロンビンの不活性化は、複雑な過程
である。モル比1:1:では、不活性化は弱く不完全である
が、α１−アンチトリプシンをモル過剰にすると、阻害
率は増大し、トロンビンは完全に阻害される。しかし、
α１−アンチトリプシン欠乏ホモ接合体の場合には、凝
固亢進症状は観察されないので、α１−アンチトリプシ
ンは、血液凝固の制御において重要な役割を演じていな
いことが確実であると思われる。
である。モル比1:1:では、不活性化は弱く不完全である
が、α１−アンチトリプシンをモル過剰にすると、阻害
率は増大し、トロンビンは完全に阻害される。しかし、
α１−アンチトリプシン欠乏ホモ接合体の場合には、凝
固亢進症状は観察されないので、α１−アンチトリプシ
ンは、血液凝固の制御において重要な役割を演じていな
いことが確実であると思われる。
ヒト血漿中のアンチトロンビン活性レベルは、アンチ
トロンビンIII（AT−III）及びα２−マクログロブリン
の活性に完全に帰因する。
トロンビンIII（AT−III）及びα２−マクログロブリン
の活性に完全に帰因する。
最近の或る刊行物には、α１−アンチトリプシン変異
体〔α１−ATピツツバーグ（Pittsburgh）〕が記載され
ており、これは分子の第358位反応性部位のレベルでメ
チオニンをアルギニンで置換した単一ヌクレオチドを装
入を含んでいる。このα１−AT変異体は、破壊的障害を
起こし、14才の患者を死亡せしめた。このα１−AT変異
体は、もはやエラスターゼ阻害因子としては作用せず、
数百倍増大した抗トロンビン活性を示す。この活性は、
ヘバリンの作用とは無関係である。
体〔α１−ATピツツバーグ（Pittsburgh）〕が記載され
ており、これは分子の第358位反応性部位のレベルでメ
チオニンをアルギニンで置換した単一ヌクレオチドを装
入を含んでいる。このα１−AT変異体は、破壊的障害を
起こし、14才の患者を死亡せしめた。このα１−AT変異
体は、もはやエラスターゼ阻害因子としては作用せず、
数百倍増大した抗トロンビン活性を示す。この活性は、
ヘバリンの作用とは無関係である。
これらの観察は、α１−AT及びAT−IIIのアミノ酸配
列を比較することにより説明されるかもしれない。これ
らプロテアーゼ阻害因子は、構造の29％が共通してお
り、両者がある共通蛋白に由来していることを示してい
る。
列を比較することにより説明されるかもしれない。これ
らプロテアーゼ阻害因子は、構造の29％が共通してお
り、両者がある共通蛋白に由来していることを示してい
る。
それらの反応中心は、類似の配列を示している：α１
−アンチトリプシンの中心部分にはメチオニン残基が見
られ、これはエラスターゼにとつて好ましい切断部位で
あり、一方、同じ場所にAT−IIIはアルギニン残基を有
しており、これはトロンビンにとつて好ましい部位であ
る。
−アンチトリプシンの中心部分にはメチオニン残基が見
られ、これはエラスターゼにとつて好ましい切断部位で
あり、一方、同じ場所にAT−IIIはアルギニン残基を有
しており、これはトロンビンにとつて好ましい部位であ
る。
このように、α１−ATピツツバーグにおいて、メチオ
ニンのアルギニンによる置換は、エラスターゼに対する
阻害特異性をトロンビンに対するそれに変化させる。
ニンのアルギニンによる置換は、エラスターゼに対する
阻害特異性をトロンビンに対するそれに変化させる。
従つて、本発明は第一に、α１−ATの全部又は一部に
相応する蛋白において第358位のアミノ酸（通常はメチ
オニン）がロイシン残基によって置換されているヒトα
１−ATアナローグに関するものである。
相応する蛋白において第358位のアミノ酸（通常はメチ
オニン）がロイシン残基によって置換されているヒトα
１−ATアナローグに関するものである。
本明細書の記載において、「α１−AT」とは、それら
の構造は完全には知られていないがこの蛋白の種々の自
然変異体であるものの１つであることを意味している。
の構造は完全には知られていないがこの蛋白の種々の自
然変異体であるものの１つであることを意味している。
アミノ酸の番号付けは、通常採用されているものであ
り、第１アミン酸はクラチら及びチヤンドラらの刊行物
にあるグルタミンである（第１図）。
り、第１アミン酸はクラチら及びチヤンドラらの刊行物
にあるグルタミンである（第１図）。
更に詳しくは、第358アミノ酸は、エラスターゼ固定
領域にあり、本発明の化合物においては、この領域は下
記の構造を有することが好ましい： ala−ile−pro−leu−ser−ile。
領域にあり、本発明の化合物においては、この領域は下
記の構造を有することが好ましい： ala−ile−pro−leu−ser−ile。
勿論、「α１−AT」という表現もまた、非反応性部位
で突然変異を起こし得る点変異体を示している：この変
異は、特に、遺伝子の点変異の技術によるアナローグの
製造において起こるかもしれない。
で突然変異を起こし得る点変異体を示している：この変
異は、特に、遺伝子の点変異の技術によるアナローグの
製造において起こるかもしれない。
更に、最近の研究により、通常の血漿α１−ATは、２
つの形、即ち１つは既述の形で、もう１つは５つのアミ
ノ酸のＮ末端欠失を含む形で存在することが明らかにさ
れている。
つの形、即ち１つは既述の形で、もう１つは５つのアミ
ノ酸のＮ末端欠失を含む形で存在することが明らかにさ
れている。
このことが、本発明が、α１−AT又はそのアナローグ
の配列がその５つのＮ末端アミノ酸だけ切り取られてい
ることを特徴とする、前述のようなα１−ATアナローグ
に関する理由である。
の配列がその５つのＮ末端アミノ酸だけ切り取られてい
ることを特徴とする、前述のようなα１−ATアナローグ
に関する理由である。
現在進行中の研究によれば、この截頭形又は切断形
は、血漿中の天然分子の再配列に由来するものと思われ
る。この截頭形は、天然形より約10倍低い濃度で存在す
る。
は、血漿中の天然分子の再配列に由来するものと思われ
る。この截頭形は、天然形より約10倍低い濃度で存在す
る。
これら截頭変異体に関する試験により、これらが天然
蛋白のようなエラスターゼの有効な阻害因子であること
が明らかにされている。
蛋白のようなエラスターゼの有効な阻害因子であること
が明らかにされている。
本発明は、また、宿主細胞、特に、成熟蛋白の第358
アミノ酸に相応するコドンがロイシンをコードするかま
たはα１−ATあるいはそのアナローグをコードするDNA
配列が５′末端で15個の塩基を欠失しているα１−ATを
コードするDNA配列の発現ベクターを含有する微生物を
培養することを特徴とする、α１−ATアナローグの製造
法に関する。
アミノ酸に相応するコドンがロイシンをコードするかま
たはα１−ATあるいはそのアナローグをコードするDNA
配列が５′末端で15個の塩基を欠失しているα１−ATを
コードするDNA配列の発現ベクターを含有する微生物を
培養することを特徴とする、α１−ATアナローグの製造
法に関する。
発現ベクターの性質は、明らかに使用される微生物に
依存している。
依存している。
微生物が最近、特に大腸菌である場合、ベクターは大
腸菌中に複製開始点、例えばpBR322の複製開始点を含ん
であるプラスミドであることが好ましい。
腸菌中に複製開始点、例えばpBR322の複製開始点を含ん
であるプラスミドであることが好ましい。
細菌中でのα１−AT遺伝子に対する発現プラスミド
は、本出願人によるヨーロツパ特許NO.84 400126並び
にベルギー特許No.895961に記載されている。
は、本出願人によるヨーロツパ特許NO.84 400126並び
にベルギー特許No.895961に記載されている。
細菌性ベクタープラスミドのうち、λフアージのプロ
モーター、PLプロモーター及びλの蛋白c IIリボソーム
（c IIλrbs）固定部位又はヨーロツパ特許No.84 4001
26に記載されているような合成部位を含むものを使用す
るのが好ましい。
モーター、PLプロモーター及びλの蛋白c IIリボソーム
（c IIλrbs）固定部位又はヨーロツパ特許No.84 4001
26に記載されているような合成部位を含むものを使用す
るのが好ましい。
さらに、これらプラスミドは、Ｎ遺伝子の全部又は一
部を含有することができる。これらブラスミドのその他
の特徴は、実施例及び前記引用特許に明らかにされてい
る。
部を含有することができる。これらブラスミドのその他
の特徴は、実施例及び前記引用特許に明らかにされてい
る。
微生物が酵母である場合、ヨーロツパ特許No.0103409
に記載のベクターをベクタープラスミドとして使用する
ことができる。該酵母がサツカロミセス・セレビシエ株
である場合、該ベクターは、２μプラスミドの複製開始
点及び前記ヨーロツパ特許出願に記載のもののうち酵母
プロモーターを含んでいることが好ましい。
に記載のベクターをベクタープラスミドとして使用する
ことができる。該酵母がサツカロミセス・セレビシエ株
である場合、該ベクターは、２μプラスミドの複製開始
点及び前記ヨーロツパ特許出願に記載のもののうち酵母
プロモーターを含んでいることが好ましい。
一般に、発現ベクターの正確な構造は、本発明の本質
的特徴を構成しない。
的特徴を構成しない。
α１−ATアナローグをコードする配列は、クローンの
天然α１−AT配列から既知の方法により製造してもよ
い。
天然α１−AT配列から既知の方法により製造してもよ
い。
制限／ライゲーシヨンにより、修飾することが望まれ
る遺伝子部分を、所望のアナローグをコードする配列を
含む合成遺伝子で置換することができる。
る遺伝子部分を、所望のアナローグをコードする配列を
含む合成遺伝子で置換することができる。
しかしながら、特にアナローグのコドンがメチオニン
コドンATGに比し、またクレオチド１個だけ異なつてい
る場合、点突然変異により行なうこともできる；これ
は、例えばバリンの場合GTG、アルギニンの場合AGG、又
はロイシン、イソロイシン又はフエニルアラニンの場合
である。
コドンATGに比し、またクレオチド１個だけ異なつてい
る場合、点突然変異により行なうこともできる；これ
は、例えばバリンの場合GTG、アルギニンの場合AGG、又
はロイシン、イソロイシン又はフエニルアラニンの場合
である。
この点変異法は実施例に詳細に記載する。
α１−ATのクローンならびにそれらの製造は既知であ
り、クラチら及びチヤンドラらの刊行物、並びに種々の
特許や前記特許出願に記載されている。
り、クラチら及びチヤンドラらの刊行物、並びに種々の
特許や前記特許出願に記載されている。
これらの製造法において使用されている方法は、原則
として既知であり、及び／又は、引用資料に記載されて
いる。
として既知であり、及び／又は、引用資料に記載されて
いる。
α１−ATアナローグを得るため、ベクターにより菌株
を形質転換すること、並びに形質転換体の培養条件も既
知であり、使用される微生物に依存する。
を形質転換すること、並びに形質転換体の培養条件も既
知であり、使用される微生物に依存する。
本発明のα１−ATアナローグは、切り取られているか
いないかにかかわらず、薬物として、特にα１−ATの代
りに、遺伝性又は非遺伝性α１−AT欠乏の治療に、例え
ば肺気腫の治療及び予防に用いることができる。
いないかにかかわらず、薬物として、特にα１−ATの代
りに、遺伝性又は非遺伝性α１−AT欠乏の治療に、例え
ば肺気腫の治療及び予防に用いることができる。
本発明の種々の変異体は、特に好中球エラスターゼの
分析に、生物学的試薬としても使用できる。
分析に、生物学的試薬としても使用できる。
特に、変異体〔Leu358〕α１−ATは、カテプシンＧの
阻害剤として有用である。
阻害剤として有用である。
使用量は、勿論、治療疾患の種類及び使用アナローグ
の正確な性質に大きく依存しており、当業者にとつて既
知の方法により適応させなければならない。
の正確な性質に大きく依存しており、当業者にとつて既
知の方法により適応させなければならない。
同様に、医薬組成物の正確な性質は、予定される投与
経路に依存しており、本発明の特徴の１つを構成するも
のではない。
経路に依存しており、本発明の特徴の１つを構成するも
のではない。
最後に、これら種々の化合物は、例えばビーズ又はチ
ユーブのような適当な支持体に固定した形で使用しても
よい。
ユーブのような適当な支持体に固定した形で使用しても
よい。
以下の実施例は、本発明のその他の特徴や利点を明ら
かにするために示すものである。
かにするために示すものである。
付図は次の通りである： ・第１図は、α１−ATをコードするコト遺伝子のcDNA配
列である。
列である。
・第２図は、大腸菌/pTG999から得た生成物の抗エラス
ターゼ活性を示す。
ターゼ活性を示す。
・第３図は、大腸菌/pTG1900抽出物の抗エラスターゼ活
性を示す。
性を示す。
・第４図は、大腸菌/pTG1900抽出物の抗トロンビン活性
を示す。
を示す。
・第５図は、大腸菌/pTG1900抽出物、AT−III及びヘパ
リン存在下でのAT−IIIの抗トロンビン活性の比較を示
す。
リン存在下でのAT−IIIの抗トロンビン活性の比較を示
す。
・第６図は、pTG920の調製図を示す。
・第７図は、pTG929の調製図を示す。
・第８図は、pTG926の調製図を示す。
・第９図には、α１−AT遺伝子内での適当なDNA断片の
置換による変異体の調製法を図示する。
置換による変異体の調製法を図示する。
・第10図は、ヒト好中球エラスターゼの種々の変異体に
対する阻害率（％）の変化を示す。
対する阻害率（％）の変化を示す。
・第11図は、ヒトカテプシンＧの種々の変異体に対する
阻害率（％）の変化を示す。
阻害率（％）の変化を示す。
・第12a〜12e図は、CNS処理後のエラスターゼの種々の
変異体に対する阻害の役割（％）を示す。
変異体に対する阻害の役割（％）を示す。
・第13図は、截頭変異体の調製図を示す。
参考例１−〔Val358〕α１−AT ヒトα１−AT遺伝子のインビトロにおける直接変異誘発 メチオニンをバリンで置換する変異は、単一塩基の装
入が必要である（ATGはGTGを生じる）。該部位の直接変
異誘発は、まず単鎖遺伝子のモデルとハイブリツド化さ
れ、次いでDNAポリメラーゼにより補助鎖合成用のイニ
シエーターとして作用してもよい合成オリゴヌクレオチ
ド（変異した配列を有する）を用いることにより得るこ
とができる。
入が必要である（ATGはGTGを生じる）。該部位の直接変
異誘発は、まず単鎖遺伝子のモデルとハイブリツド化さ
れ、次いでDNAポリメラーゼにより補助鎖合成用のイニ
シエーターとして作用してもよい合成オリゴヌクレオチ
ド（変異した配列を有する）を用いることにより得るこ
とができる。
このようにして、二重鎖配列が得られ、この鎖のうち
の１つは野生型に相応する配列を含んでおり、もう１つ
は変異した配列を含んでいる。
の１つは野生型に相応する配列を含んでおり、もう１つ
は変異した配列を含んでいる。
一本鎖α１−AT遺伝子を含むM13のゲノムをモデルと
して用いれば、得られた二重鎖分子は、大腸菌宿主細胞
を形質転換するのに用いることができるであろう。また
変異体遺伝子を含有するフアージは、プレートをスクリ
ーニングすることにより同定できるであろう。
して用いれば、得られた二重鎖分子は、大腸菌宿主細胞
を形質転換するのに用いることができるであろう。また
変異体遺伝子を含有するフアージは、プレートをスクリ
ーニングすることにより同定できるであろう。
ヒトα１−ATのcDNAクローニング及びその大腸菌内で
の発現は、既に、例えば前記特許に開示され、更にコー
トニー（Courtney）ら（1984）によつて既述されてい
る。
の発現は、既に、例えば前記特許に開示され、更にコー
トニー（Courtney）ら（1984）によつて既述されてい
る。
α１−ATを生産するクローンpTG983は、大腸菌の総細
胞蛋白の約１％に相当するレベルで生物学的に活性なα
１−ATを生産する。
胞蛋白の約１％に相当するレベルで生物学的に活性なα
１−ATを生産する。
α１−AT配列を変えるえるため、pTG983から得た、遺
伝子を含むCla I−Pst I断片をM13ベクター（M13mp70
1）中にAcc I及びPst I部位間に導入する。
伝子を含むCla I−Pst I断片をM13ベクター（M13mp70
1）中にAcc I及びPst I部位間に導入する。
次いで、一本鎖コードDNAを、宿主細胞Ｅ．coli JM1
03の感染後に得られるフアージ粒子から分離する。オリ
ゴヌクレオチド５′−ATAGACACGGTATG−３′（化学的に
合成した）をモデルDNAと100倍モル過剰において、100
℃で５分間加熱し、続いてゆつくりと４℃に冷却するこ
とによりハイブリツド化する。このオリゴヌクレオチド
は、α１−ATの活性部位領域と相補性であるが、メチオ
ニンコドンの代りにバリンコドンを含んでいる： もとの配列： ala ile pro met ser ile GCC ATA CCC ATG TCT ATC 変異した配列： ala ile pro val ser ile GCC ATA CCC GTG TCT ATC 次に、第２鎖の合成を、試料（一本鎖DNA0.5p mol）
を室温で２時間、DNAポリメラーゼ（クレノウ断片）200
μg/ml、T4DNAリガーゼ40μ/ml、三リン酸デオキシヌク
レオチド0.5mM、及びATP1mMと共に緩衝液〔8mMTris−HC
l（pH7.5）/8mMMgCl2/40mMNaCl/6mMβ−メルカプトエタ
ノール〕中で培養することにより行なう。
03の感染後に得られるフアージ粒子から分離する。オリ
ゴヌクレオチド５′−ATAGACACGGTATG−３′（化学的に
合成した）をモデルDNAと100倍モル過剰において、100
℃で５分間加熱し、続いてゆつくりと４℃に冷却するこ
とによりハイブリツド化する。このオリゴヌクレオチド
は、α１−ATの活性部位領域と相補性であるが、メチオ
ニンコドンの代りにバリンコドンを含んでいる： もとの配列： ala ile pro met ser ile GCC ATA CCC ATG TCT ATC 変異した配列： ala ile pro val ser ile GCC ATA CCC GTG TCT ATC 次に、第２鎖の合成を、試料（一本鎖DNA0.5p mol）
を室温で２時間、DNAポリメラーゼ（クレノウ断片）200
μg/ml、T4DNAリガーゼ40μ/ml、三リン酸デオキシヌク
レオチド0.5mM、及びATP1mMと共に緩衝液〔8mMTris−HC
l（pH7.5）/8mMMgCl2/40mMNaCl/6mMβ−メルカプトエタ
ノール〕中で培養することにより行なう。
続いて、試料を65℃で10分間加熱し、リガーゼ１単位
及びATP1mMを加え、再び４℃で16時間培養する。反応混
合物の一部を用い、Ｅ．coli JM103適格細胞を形質転
換する。フアージ領域をLBプレート上に標定し、得られ
たコロニーをニトロセルロースフイルタに吸着させ、T4
ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、32Pで標識した変
異オリゴヌクレオチドとのハイブリデーシヨンにより変
異体フアージを明らかにするために選択する。
及びATP1mMを加え、再び４℃で16時間培養する。反応混
合物の一部を用い、Ｅ．coli JM103適格細胞を形質転
換する。フアージ領域をLBプレート上に標定し、得られ
たコロニーをニトロセルロースフイルタに吸着させ、T4
ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、32Pで標識した変
異オリゴヌクレオチドとのハイブリデーシヨンにより変
異体フアージを明らかにするために選択する。
適切な条件下では、オリゴヌクレオチドは、完全に相
同な配列を用いる場合にのみ安定なハイブリツドを形成
する、即ち、変異がおこる。この場合、３×ssc、１×
デンハルト（Denhardt）、0.5％ピロリン酸ナトリウ
ム、0.1％SDS中50℃でのハイブリデーシヨンを行なう
と、効果的に選択することができる。
同な配列を用いる場合にのみ安定なハイブリツドを形成
する、即ち、変異がおこる。この場合、３×ssc、１×
デンハルト（Denhardt）、0.5％ピロリン酸ナトリウ
ム、0.1％SDS中50℃でのハイブリデーシヨンを行なう
と、効果的に選択することができる。
フアージDNAは、ポジテイブなコロニーの培養物から
調製され、JM103細胞を形質転換するのに用いられる。
次に、得られたプレート由来のDNAは、ジデオキシ鎖の
停止法により配列決定される。ヌクレオチド配列によ
り、遺伝子の所望の部位に変異が得られたことが確認さ
れる。
調製され、JM103細胞を形質転換するのに用いられる。
次に、得られたプレート由来のDNAは、ジデオキシ鎖の
停止法により配列決定される。ヌクレオチド配列によ
り、遺伝子の所望の部位に変異が得られたことが確認さ
れる。
変異したα１−AT遺伝子の断片、Bgl II−Pst I、はM
13ゲノムから切断され、Bgl II/Pst I断片の切除後、発
現プラスミドpTG983中に導入される。この操作により、
pTG983と類似のプラスミドpTG999が得られるが、前者は
α１−ATをコードする遺伝子がエラスターゼ固定部位レ
ベルで変異を含むことだけが異なる。
13ゲノムから切断され、Bgl II/Pst I断片の切除後、発
現プラスミドpTG983中に導入される。この操作により、
pTG983と類似のプラスミドpTG999が得られるが、前者は
α１−ATをコードする遺伝子がエラスターゼ固定部位レ
ベルで変異を含むことだけが異なる。
大腸菌での〔Val358〕α１−ATの発現 エラスターゼ固定部位レベルの変異体（pTG999）の発
現を直接pTG983と比較する。α１−ATの合成レベル及び
生物活性は、２種のクローンにおいて同等であることが
明らかにされる。
現を直接pTG983と比較する。α１−ATの合成レベル及び
生物活性は、２種のクローンにおいて同等であることが
明らかにされる。
28℃で発育させたpTG983、pTG999及びpTG951（α１−
ATをコードする遺伝子でのpTG983に相応する陰性対照）
の半対数培養期（約108個/ml）を37℃で５時間加熱する
ことにより誘導する。このことにより、低温でpLプロモ
ーターからの転写を阻止することにより、α１−AT遺伝
子の発現を抑制する宿主によりコードされるレプレツサ
ーc I857は不活性化される。細胞を集めた後、再懸濁細
胞を超音波により粉砕し、残屑を遠心分離により除去
し、上澄液の蛋白濃度を標準法（バイオラド）により測
定する。各抽出物中のα１−AT濃度は、放射免疫拡散法
（RID）によりキツト（カルビオケム−ベーリング）を
用い測定する。免疫沈降リングの直径は、標準血清稀釈
シリーズとの比較により算出される試料中の抗原濃度に
比例する。
ATをコードする遺伝子でのpTG983に相応する陰性対照）
の半対数培養期（約108個/ml）を37℃で５時間加熱する
ことにより誘導する。このことにより、低温でpLプロモ
ーターからの転写を阻止することにより、α１−AT遺伝
子の発現を抑制する宿主によりコードされるレプレツサ
ーc I857は不活性化される。細胞を集めた後、再懸濁細
胞を超音波により粉砕し、残屑を遠心分離により除去
し、上澄液の蛋白濃度を標準法（バイオラド）により測
定する。各抽出物中のα１−AT濃度は、放射免疫拡散法
（RID）によりキツト（カルビオケム−ベーリング）を
用い測定する。免疫沈降リングの直径は、標準血清稀釈
シリーズとの比較により算出される試料中の抗原濃度に
比例する。
このテストにより、pTG983及びpTG999は、総細胞蛋白
の0.65及び0.55％のレベルでα１−ATを生産することが
明らかとなる。
の0.65及び0.55％のレベルでα１−ATを生産することが
明らかとなる。
また、超音波処理後に得られた上澄液の一部を用い、
pTG983及びpTG999により産生したα１−ATの抗エラスタ
ーゼ活性を比較する。これは、ヒト白血球エラスターゼ
（エラスチン・ブロダクツ社）によるメトキシ−スクシ
ニル−ala−ala−pro−val−ニトロアリニドの切断を抽
出物が阻害する可能性をテストすることにより行なう。
エラスターゼの阻害曲線は、第１図に示されており、pT
G983及びpTG999がα１−ATの活性形を産生していること
が明らかにわかる。この観察は、エラスターゼ固定部位
レベルにメチオニンの代りにバリンを有するα１−ATの
変異形が天然分子と同様に活性であることが立証されて
いるため、重要である。
pTG983及びpTG999により産生したα１−ATの抗エラスタ
ーゼ活性を比較する。これは、ヒト白血球エラスターゼ
（エラスチン・ブロダクツ社）によるメトキシ−スクシ
ニル−ala−ala−pro−val−ニトロアリニドの切断を抽
出物が阻害する可能性をテストすることにより行なう。
エラスターゼの阻害曲線は、第１図に示されており、pT
G983及びpTG999がα１−ATの活性形を産生していること
が明らかにわかる。この観察は、エラスターゼ固定部位
レベルにメチオニンの代りにバリンを有するα１−ATの
変異形が天然分子と同様に活性であることが立証されて
いるため、重要である。
これらの曲線から、pTG983及びpTG999は、α１−ATを
それぞれ0.8％及び0.7％生産すると計算できる（但し、
この条件下では、エラスターゼ50ngは、α１−AT50ngに
より50％阻害させるものと仮定する）。
それぞれ0.8％及び0.7％生産すると計算できる（但し、
この条件下では、エラスターゼ50ngは、α１−AT50ngに
より50％阻害させるものと仮定する）。
参考例２−〔Arg358〕α１−AT α１−AT遺伝子におけるargによるmetコドンの置換
は、前記と同じ方法で行なう。Metからargへの変換には
ヌクレオチドの置換を必要とする（ATGはAGCを生じ
る）： もとの配列： ala ile pro MET ser ile GCC ATA CCC ATG TCT ATC 変異した並列： ala ile pro ARG ser ile GCC ATA CCC AGG TCT ATC この変異誘発を行なうのに使用したオリゴヌクレオチ
ドは、５′−ATAGACCTGGGTATG−３′である。このオリ
ゴヌクレオチドはα１−ATの反応性領域と相補的である
が、メチオニンコドンの代りにアルギニンコドンを含有
する。
は、前記と同じ方法で行なう。Metからargへの変換には
ヌクレオチドの置換を必要とする（ATGはAGCを生じ
る）： もとの配列： ala ile pro MET ser ile GCC ATA CCC ATG TCT ATC 変異した並列： ala ile pro ARG ser ile GCC ATA CCC AGG TCT ATC この変異誘発を行なうのに使用したオリゴヌクレオチ
ドは、５′−ATAGACCTGGGTATG−３′である。このオリ
ゴヌクレオチドはα１−ATの反応性領域と相補的である
が、メチオニンコドンの代りにアルギニンコドンを含有
する。
該部位の直接変異誘発は、前述のように、M13mp701に
おいてクローン化されたα１−AT遺伝子で行なわれる。
前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーシヨンを行
なうことにより変異体を同定した後、変異はDNAの配列
決定を行なうことにより確認する。
おいてクローン化されたα１−AT遺伝子で行なわれる。
前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーシヨンを行
なうことにより変異体を同定した後、変異はDNAの配列
決定を行なうことにより確認する。
次にBgl II−Pst I断片上のα１−ATの変異遺伝子をM
13ゲノムから取り出し、Bgl II/Pst I断片を切除後発現
ベクターpTG983中に導入する。このことにより、反応性
部位における変異した配列以外はpTG983と同一のプラス
ミドpTG1900が得られる。
13ゲノムから取り出し、Bgl II/Pst I断片を切除後発現
ベクターpTG983中に導入する。このことにより、反応性
部位における変異した配列以外はpTG983と同一のプラス
ミドpTG1900が得られる。
大腸菌での修飾〔Arg358〕α１−ATの発現 pTG1900により産生されたα１−ATを、pTG983を介し
て得られたα１−ATと直接比較する。これら２つのクロ
ーンは、α１−ATのための放射免疫拡散試験（RID）に
おいて同じ様式で反応する蛋白を生産せしめることが明
らかにされた。
て得られたα１−ATと直接比較する。これら２つのクロ
ーンは、α１−ATのための放射免疫拡散試験（RID）に
おいて同じ様式で反応する蛋白を生産せしめることが明
らかにされた。
α１−AT変異体は、検出し得る抗エラスターゼ活性を
全く示さず、非常に有効なトロンビンの阻害剤である。
全く示さず、非常に有効なトロンビンの阻害剤である。
pTG1900及びpTG983を含有するＥ．coliTGE900の誘導
培養物において超音波処理に付した抽出物を調製し、各
抽出物のα１−ATの割合をRIDにより測定する。各抽出
物は免疫反応性物質を含有し、試験により、いずれの場
合も発現率は大腸菌の総細胞蛋白の約１％であることが
明らかとなる。
培養物において超音波処理に付した抽出物を調製し、各
抽出物のα１−ATの割合をRIDにより測定する。各抽出
物は免疫反応性物質を含有し、試験により、いずれの場
合も発現率は大腸菌の総細胞蛋白の約１％であることが
明らかとなる。
また、これら抽出物の一部を用い、各場合において産
生したα１−ATの抗エラスターゼ及び抗トロンビン活性
を比較する。抗エラスターゼ活性は、抽出物がヒト白血
球エラスターゼによるメトキシ−スクシニル−ala−ala
−pro−val−ｐ−ニトロアニリドの切断を阻害する可能
性を測定することにより測定する。エラスターゼの阻害
曲線は、pTG983で観察されたこととは反対に、pTG1900
が抗エラスターゼ活性を全く示さないことを示していた
（第３図）。
生したα１−ATの抗エラスターゼ及び抗トロンビン活性
を比較する。抗エラスターゼ活性は、抽出物がヒト白血
球エラスターゼによるメトキシ−スクシニル−ala−ala
−pro−val−ｐ−ニトロアニリドの切断を阻害する可能
性を測定することにより測定する。エラスターゼの阻害
曲線は、pTG983で観察されたこととは反対に、pTG1900
が抗エラスターゼ活性を全く示さないことを示していた
（第３図）。
抗トロンビン活性は、ウシトロンビンによるクロモチ
ームTH（トシル−gly−pro−arg−ｐ−ニトロアニリド
−アセテート）（ベーリンガー／マンハイム）切断の阻
害率を測定することにより測定する。トロンビン４μｇ
を細菌抽出物の一部と37℃で20分間予備培養し、その後
基質を0.1mMまで添加する。反応速度は410nmでの吸光度
の変化率を測定することにより測定する。結果（第４
図）は、この条件下では、pTG983の抽出物は検出可能な
抗トロンビン活性を全く含まず、一方pTG1900の抽出物
はトロンビンを効果的に不活性化することを示してい
る。
ームTH（トシル−gly−pro−arg−ｐ−ニトロアニリド
−アセテート）（ベーリンガー／マンハイム）切断の阻
害率を測定することにより測定する。トロンビン４μｇ
を細菌抽出物の一部と37℃で20分間予備培養し、その後
基質を0.1mMまで添加する。反応速度は410nmでの吸光度
の変化率を測定することにより測定する。結果（第４
図）は、この条件下では、pTG983の抽出物は検出可能な
抗トロンビン活性を全く含まず、一方pTG1900の抽出物
はトロンビンを効果的に不活性化することを示してい
る。
これらデータとAT−III阻害曲線を比較すると、α１
−AT変異体の抗トロンビン活性は、ヘパリン非存在下で
のAT−IIIのそれより約15〜20倍高く、ヘパリン存在下
でのAT−IIIのそれとほぼ同じ活性（モルで）であるこ
とがわかる（第５図）。
−AT変異体の抗トロンビン活性は、ヘパリン非存在下で
のAT−IIIのそれより約15〜20倍高く、ヘパリン存在下
でのAT−IIIのそれとほぼ同じ活性（モルで）であるこ
とがわかる（第５図）。
pTG983の調製 プラスミドpTG983の調製は、ヨーロツパ特許出願第84
400126号に記載されており、以下に要約する。
400126号に記載されており、以下に要約する。
ブラスミドpTG983の調製はプラスミドpTG907及びフア
ージM13tg912から出発し、その調製自体は本出願人名義
のヨーロツパ特許第0094887号に記載されている。
ージM13tg912から出発し、その調製自体は本出願人名義
のヨーロツパ特許第0094887号に記載されている。
pTG907のBamH I/Spn II断片、M13tg912のc II rbs及
びlacZ′を担持するBgl II/Hpa I断片及びリン酸化アダ
プターHga I/Sph Iはモル比1:2:1であらかじめハイブリ
ツド化し、次いでT4リガーゼで処理した。一部を用い61
50株のコンビテント細胞を30℃で形質転換する。
びlacZ′を担持するBgl II/Hpa I断片及びリン酸化アダ
プターHga I/Sph Iはモル比1:2:1であらかじめハイブリ
ツド化し、次いでT4リガーゼで処理した。一部を用い61
50株のコンビテント細胞を30℃で形質転換する。
興味ある細胞は、P32で標識したc II rbs/lacZ′断片
で形質転換体を選択することにより同定し、得られた構
造は酵素制限研究により確認する。
で形質転換体を選択することにより同定し、得られた構
造は酵素制限研究により確認する。
発現系の諸要素が所望のように働いていることを示す
最初の手掛かりを得るため、得られたプラスミドpTG908
を、c I857及び該プラスミドによりコードされるα断片
を相補するβ−ガラクトシダーゼのω断片の両者を有す
るN6437宿主株中に導入する。
最初の手掛かりを得るため、得られたプラスミドpTG908
を、c I857及び該プラスミドによりコードされるα断片
を相補するβ−ガラクトシダーゼのω断片の両者を有す
るN6437宿主株中に導入する。
得られた系質転換体をIPTG＋Xgal含有の皿に置くと28
℃で白色であり、それらを42℃に移すと約30分後に青色
に変る。
℃で白色であり、それらを42℃に移すと約30分後に青色
に変る。
このプラスミドpTG908を用い、前述の公知方法により
得たヒトα１−AT遺伝子を発現させる。
得たヒトα１−AT遺伝子を発現させる。
使用したヒトα１−ATのcDNAクローンpTG603は、成熟
蛋白の第１アミノ酸のコドンのすぐ後に単一制限部位Ba
mH Iを含有する。全成熟ポリペプチドのコード化能は、
最初のグルタミン酸を除き、発現ペクターpTG920上でク
ローン化されたBamH I/Pst I断片に含まれる；この構築
において、転写は左側λプロモーターPLから起り、翻訳
は、リボソーム固定部位及びλc II遺伝子の最初の39の
bpを伴い、図示されているように、lacZ′遺伝子の先頭
に融合するλc II rbsのATGで開始する。
蛋白の第１アミノ酸のコドンのすぐ後に単一制限部位Ba
mH Iを含有する。全成熟ポリペプチドのコード化能は、
最初のグルタミン酸を除き、発現ペクターpTG920上でク
ローン化されたBamH I/Pst I断片に含まれる；この構築
において、転写は左側λプロモーターPLから起り、翻訳
は、リボソーム固定部位及びλc II遺伝子の最初の39の
bpを伴い、図示されているように、lacZ′遺伝子の先頭
に融合するλc II rbsのATGで開始する。
単一制御部位を含む結合領域はc IIとlacZ′配列の接
合部にある。プラスミドpTG920は先に調製したpTG908の
誘導体であり、このpTG920においては、第６図に示すよ
うに、pTG908におけるc IIのATGから40bp下流にある元
のBamH I/Pst I断片はM13tg115のBgl II/Pst Iにより置
換されている。
合部にある。プラスミドpTG920は先に調製したpTG908の
誘導体であり、このpTG920においては、第６図に示すよ
うに、pTG908におけるc IIのATGから40bp下流にある元
のBamH I/Pst I断片はM13tg115のBgl II/Pst Iにより置
換されている。
この過程により、α１−AT遺伝子のBamH I部位と同じ
翻訳相にあるBamH I部位が得られる。
翻訳相にあるBamH I部位が得られる。
第６図にはプラスミドpTG908及びフアージM13tg115か
らプラスミドpTG920を調製するクローニング法及びpTG6
03のクローン化さるべき断片が示されている。実線は蛋
白をコードする配列を示しており、pTG603の場合には、
α１−ATの成熟ポリペプチドをコードする配列を示して
いる。ハツチングされた部分は、最終的にα１−ATを融
合するc IIの13個のＮ−末端アミノ酸をコードする領域
を示す。
らプラスミドpTG920を調製するクローニング法及びpTG6
03のクローン化さるべき断片が示されている。実線は蛋
白をコードする配列を示しており、pTG603の場合には、
α１−ATの成熟ポリペプチドをコードする配列を示して
いる。ハツチングされた部分は、最終的にα１−ATを融
合するc IIの13個のＮ−末端アミノ酸をコードする領域
を示す。
このように、pTG920のBamH IとPst I部位との間にpTG
603のBamH I/Pst I断片を挿入すれば、末端NH2のグルタ
ミン酸を除き、c II蛋白の（末端NH2由来）13個のアミ
ノ酸、アダプター配列由来の４個のアミノ酸及びα１−
ATの成熟ポリペプチドを含有する融合ポリペプチドが発
現するであろう。
603のBamH I/Pst I断片を挿入すれば、末端NH2のグルタ
ミン酸を除き、c II蛋白の（末端NH2由来）13個のアミ
ノ酸、アダプター配列由来の４個のアミノ酸及びα１−
ATの成熟ポリペプチドを含有する融合ポリペプチドが発
現するであろう。
BamH I/Pst I及びアルカリホスフアターゼで処理した
pTG920をpTG603と結合させ、BamH I及びPst Iで消化す
る。α１−AT断片を担持する形質転換TGE900細胞を酵素
制限研究後に分離する。これらクローンの１つがpTG922
である。このクローンの詳細な調製法はコートニー（Co
urtoney）等（1984）の論文に記載されている。
pTG920をpTG603と結合させ、BamH I及びPst Iで消化す
る。α１−AT断片を担持する形質転換TGE900細胞を酵素
制限研究後に分離する。これらクローンの１つがpTG922
である。このクローンの詳細な調製法はコートニー（Co
urtoney）等（1984）の論文に記載されている。
プラスミドpTG922を、制限酵素Nde I（ニユー・イン
グランド・バイオラブズ）及びBamH I（ベセスダ・リサ
ーチ・ラブス）を用い、メーカー指示の条件で完全制限
に付す。
グランド・バイオラブズ）及びBamH I（ベセスダ・リサ
ーチ・ラブス）を用い、メーカー指示の条件で完全制限
に付す。
既知の方法により、下記構造を有する非リン酸化相補
性アダプターオリゴヌクレオチドを合成する： ５′−dTATGGAG−３′及び ５′−dGATCCTCCA−３′ これらオリゴヌクレオチドをあらかじめハイブリツド
化し、次いで、酵素制限に付したプラスミドpTG922とモ
ル比50:1で、既知条件下にDNAリガーゼを用い、４℃で
ライゲーシヨンさせる（第７図）。
性アダプターオリゴヌクレオチドを合成する： ５′−dTATGGAG−３′及び ５′−dGATCCTCCA−３′ これらオリゴヌクレオチドをあらかじめハイブリツド
化し、次いで、酵素制限に付したプラスミドpTG922とモ
ル比50:1で、既知条件下にDNAリガーゼを用い、４℃で
ライゲーシヨンさせる（第７図）。
ライゲーシヨン混合物を用い、TGE900株のコンピテン
ト細胞を形質転換させ、得られた形質転換体をアンピシ
リンの存在下に培養培地上に広げる。
ト細胞を形質転換させ、得られた形質転換体をアンピシ
リンの存在下に培養培地上に広げる。
コロニーは、T4ポリヌクレオチドキナーゼ５′−dCCT
GGGATCCTCCA−３′標識プローブとのハイブリデーシヨ
ンによりニトロセルロースフイルター上に選択する。こ
のプローブは選択しない非融合構築物を完全に相補する
が、親プラスミドpTG922のヌクレオチドのうち７つを相
補するだけであり、これはハイブリダイゼイシヨンを起
こさしめるには不充分である。
GGGATCCTCCA−３′標識プローブとのハイブリデーシヨ
ンによりニトロセルロースフイルター上に選択する。こ
のプローブは選択しない非融合構築物を完全に相補する
が、親プラスミドpTG922のヌクレオチドのうち７つを相
補するだけであり、これはハイブリダイゼイシヨンを起
こさしめるには不充分である。
こうして、６つの可能性のある候補が得られ、そのう
ちの１つをpTG929と称する。
ちの１つをpTG929と称する。
プラスミドpTG929は少量のα１−AT（総細胞蛋白の0.
1％以下）を生じるだけである。発現レベルを増大する
にはc II rbsを合成rbs部位により置換する： この交換は第８図に示すように行なう。
1％以下）を生じるだけである。発現レベルを増大する
にはc II rbsを合成rbs部位により置換する： この交換は第８図に示すように行なう。
pTG929のHpa I及びBgl II部位は、合成挿入片を用い
それぞれCla I及びXho I部位で置換される。
それぞれCla I及びXho I部位で置換される。
次いで、合成rbs（synth rbs）を、Nde I部位とＮ遺
伝子中に作られた新しいCla I部位との間に挿入する。
伝子中に作られた新しいCla I部位との間に挿入する。
この操作によりc II rbsは排除され、截頭Ｎ遺伝子を
生じ、すぐに合成rbsが続く。合成rbsへの翻訳停止コド
ン（TAA）はＮの翻訳を阻止する、得られたプラスミド
はpTG956である。
生じ、すぐに合成rbsが続く。合成rbsへの翻訳停止コド
ン（TAA）はＮの翻訳を阻止する、得られたプラスミド
はpTG956である。
プラスミドpTG956において、α１−ATのもとの配列は
変異した配列で置換される： もとの配列： met glu asp pro glu gly ATG GAG GAT CCC CAG GGA asp ala GAT GCT 変異した配列： 各変化（※印）はコドンの第３位で起り、コードされ
たアミノ酸を修飾しない。α１−AT遺伝子は、特定塩基
の変化を決定する合成オリゴヌクレオチドを用いる部位
に向けられた変異誘発法により修飾された。
変異した配列で置換される： もとの配列： met glu asp pro glu gly ATG GAG GAT CCC CAG GGA asp ala GAT GCT 変異した配列： 各変化（※印）はコドンの第３位で起り、コードされ
たアミノ酸を修飾しない。α１−AT遺伝子は、特定塩基
の変化を決定する合成オリゴヌクレオチドを用いる部位
に向けられた変異誘発法により修飾された。
選択された配列変化は、大腸菌遺伝子の先頭に隣接す
るいくつかの部位においてある種の塩基が好ましいこと
を明らかにする統計研究に由来する。
るいくつかの部位においてある種の塩基が好ましいこと
を明らかにする統計研究に由来する。
これらの変化はまた、α−ATのmRNA配列にあらわれる
かもしれない二次構造に相応する領域を不安定にする。
変異誘発のためのオリゴヌクレオチドは： ５′−AGCATCGCCTTGAGGATCTTCCAT−３′ である。
かもしれない二次構造に相応する領域を不安定にする。
変異誘発のためのオリゴヌクレオチドは： ５′−AGCATCGCCTTGAGGATCTTCCAT−３′ である。
この配列はもとの配列と比べ４つの違いがあり、α−
AT遺伝子において前記で示した修飾を生じる。
AT遺伝子において前記で示した修飾を生じる。
得られたプラスミド、pTG983、は前記変化以外はpTG9
56と同一である。
56と同一である。
参考例３ 変異体〔Gly358〕α１−ATの調製 この変異体は、参考例１に記載のように、合成オリゴ
ヌクレオチドを用い、部位の直接変異誘発により構築さ
れる。
ヌクレオチドを用い、部位の直接変異誘発により構築さ
れる。
この場合、所望の変異を有する使用オリゴヌクレオチ
ドは下記のものである： ５′GATAGAACCGGGTATGGC3′ これは変異ATG→GGT（Met→Gly）を生じる。
ドは下記のものである： ５′GATAGAACCGGGTATGGC3′ これは変異ATG→GGT（Met→Gly）を生じる。
参考例１に記載のように、変異誘発はM13mp701におい
てサブクローン化したα１−AT遺伝子を用い行なう。変
異後、変異した遺伝子を含むBal II−Pst I断片を主特
許に記載の発現プラスミドpTG983に導入する。
てサブクローン化したα１−AT遺伝子を用い行なう。変
異後、変異した遺伝子を含むBal II−Pst I断片を主特
許に記載の発現プラスミドpTG983に導入する。
前記のようにこのプラスミドを用いて大腸菌を形質転
換することにより、変異体〔Gly358〕α１−ATの発現が
得られる。
換することにより、変異体〔Gly358〕α１−ATの発現が
得られる。
実施例１及び参考例４ 変異体〔Leu358〕、〔Ala358〕、〔Ile358〕及び〔Phe
358〕α１−ATの調製 前述の種々の変異体は、α１−AT遺伝子のDNAの適当
な断片を置換することにより調製される。
358〕α１−ATの調製 前述の種々の変異体は、α１−AT遺伝子のDNAの適当
な断片を置換することにより調製される。
本法の原理を第９図に記載する。
変異体は、第358アミノ酸をコードする領域レベルで
小さなDNAセグメントを適当な変異を有する二重鎖合成
断片で置換することにより構築する。
小さなDNAセグメントを適当な変異を有する二重鎖合成
断片で置換することにより構築する。
小さな断片は、α１−ATの活性部位をコードする領域
の各側で切断する制限酵素Nde I及びAva Iを用い、遺伝
子から切断する。
の各側で切断する制限酵素Nde I及びAva Iを用い、遺伝
子から切断する。
Ava I部位は既にもとの遺伝子に存在するが、新しいN
de I部位は該工程を行なうために作らねばならない。こ
れは合成オリゴヌクレオチドにより部位に向けられた変
異により行なう（参考例１）。
de I部位は該工程を行なうために作らねばならない。こ
れは合成オリゴヌクレオチドにより部位に向けられた変
異により行なう（参考例１）。
制限酵素処理後、活性部位をコードする領域を欠失し
たプラスミドを分取用ゲル電気泳動により分離し、仔ウ
シ腸ホスフアターゼで処理し、この調製物をT4リガーゼ
を用い、所望の変異並びにNde I及びAva Iで切断された
遺伝子の配列に相応する一本鎖５′伸長部を形成する配
列を含む小さな合成DNA断片と結合させる。
たプラスミドを分取用ゲル電気泳動により分離し、仔ウ
シ腸ホスフアターゼで処理し、この調製物をT4リガーゼ
を用い、所望の変異並びにNde I及びAva Iで切断された
遺伝子の配列に相応する一本鎖５′伸長部を形成する配
列を含む小さな合成DNA断片と結合させる。
この方法により、活性部位レベルでの変異以外はpTG9
83のそれと同一構造がもたらされる。
83のそれと同一構造がもたらされる。
各変異体は、放射免疫拡散試験から示されるように、
主特許に記載のpTG983の場合に得られるものの付近にあ
るレベルで、即ち、大腸菌の総細胞蛋白の約１％の割合
で、大腸菌において生産される。
主特許に記載のpTG983の場合に得られるものの付近にあ
るレベルで、即ち、大腸菌の総細胞蛋白の約１％の割合
で、大腸菌において生産される。
超音波処理し、澄明にした抽出物は、ヒト好中球エラ
スターゼ又はカテプシンＧの阻害活性が存在するかどう
か試験する。
スターゼ又はカテプシンＧの阻害活性が存在するかどう
か試験する。
得られた結果は第10及び11図に示す。エラスターゼの
阻害は、参考例２に記載のようにして測定し、カテプシ
ンＧ活性は、色素産生基質、Ｎ−スクシニル−ala−ala
−pro−phe−ｐ−ニトロアニリドを用い測定する。
阻害は、参考例２に記載のようにして測定し、カテプシ
ンＧ活性は、色素産生基質、Ｎ−スクシニル−ala−ala
−pro−phe−ｐ−ニトロアニリドを用い測定する。
変異体〔Leu358〕、〔Ala358〕及び〔Ile358〕は、変
異体〔Met358〕及び〔Val358〕と同様にエラスターゼ活
性を阻害し、一方変異体〔Gly358〕及び〔Arg358〕は阻
害しない。
異体〔Met358〕及び〔Val358〕と同様にエラスターゼ活
性を阻害し、一方変異体〔Gly358〕及び〔Arg358〕は阻
害しない。
試験したすべての変異体のうち、変異体〔Leu358〕及
び〔Met358〕のみがカテプシンＧを阻害する。
び〔Met358〕のみがカテプシンＧを阻害する。
10mMN−クロロスクシンイミド（CNS）で処理すると
（結果は第12図に示す）変異体〔Met358〕（第12a図）
が酸化により完全に不活性化される条件下において、変
異体〔Leu358〕（第12b図）、〔Ala358〕（第12c図）、
〔Ile358〕（第12d図）及び〔Val358〕（第12e図）は、
好中球エラスターゼに対し十分活性なままであることを
示している。
（結果は第12図に示す）変異体〔Met358〕（第12a図）
が酸化により完全に不活性化される条件下において、変
異体〔Leu358〕（第12b図）、〔Ala358〕（第12c図）、
〔Ile358〕（第12d図）及び〔Val358〕（第12e図）は、
好中球エラスターゼに対し十分活性なままであることを
示している。
実施例２ 切断α１−AT変異体の生産 これら変異体は、第13図に示す、以下の方法で調製さ
れる。
れる。
プラスミドpTG983から出発し、合成オリゴヌクレオチ
ドを用いて変異させ、第７コドンの２つのCTヌクレオチ
ドをGGヌクレオチドで置換することにより第８コドンの
付近に単一Apa I部位を作る。
ドを用いて変異させ、第７コドンの２つのCTヌクレオチ
ドをGGヌクレオチドで置換することにより第８コドンの
付近に単一Apa I部位を作る。
次に、そのプラスミドをさらに変異させ、翻訳開始コ
ドンのレベルにNde I部位を作る。
ドンのレベルにNde I部位を作る。
得られたプラスミドを酵素Apa I及びNde Iで処理し、
切り取りたいアミノ酸に相応する部分を欠失させる。
切り取りたいアミノ酸に相応する部分を欠失させる。
この欠失断片は、α１−ATの第６コドンを開始コドン
に融合せしめる合成オリゴヌクレオチドで置換される。
に融合せしめる合成オリゴヌクレオチドで置換される。
截頭蛋白の発現レベルを改善するために、pTG983に存
在するリボソーム固定部位を、第５図に示される構造を
示し、制限部位Cla IとNde Iの間に挿入されているR1と
名付けた合成リボソーム固定部位で置換した。
在するリボソーム固定部位を、第５図に示される構造を
示し、制限部位Cla IとNde Iの間に挿入されているR1と
名付けた合成リボソーム固定部位で置換した。
得られたプラスミド（pTG1904R1T2と命名）を用いて
大腸菌を形質転換することにより、Ｎ末端の最初の５個
のアミノ酸を欠くα１−ATが得られる；その発現率は大
腸菌の総細胞蛋白の約15％である。
大腸菌を形質転換することにより、Ｎ末端の最初の５個
のアミノ酸を欠くα１−ATが得られる；その発現率は大
腸菌の総細胞蛋白の約15％である。
この発現を、クマシー青（Coomassie blue）で発色
した電気泳動ゲルをデンシトメーターで読み取ることに
より測定する。
した電気泳動ゲルをデンシトメーターで読み取ることに
より測定する。
誘発細胞の超音波処理し澄明化した上澄液は、截頭α
１−ATを含んでいる；後者はヒト好中球エラスターゼを
効果的に阻害する。
１−ATを含んでいる；後者はヒト好中球エラスターゼを
効果的に阻害する。
放射免疫拡散による測定とうエラスターゼ活性との間
にはよい相関が認められる。
にはよい相関が認められる。
ある種の截頭誘導体にこの活性が明らかにされたこと
を考慮すると、本発明はまた、これらを含む医薬組成物
及び生物学的試薬、特に好中球エラスターゼに有用な試
薬にも関するものである。
を考慮すると、本発明はまた、これらを含む医薬組成物
及び生物学的試薬、特に好中球エラスターゼに有用な試
薬にも関するものである。
参考文献 クラチ（KURACHI）ら.,プロシーデイングズ・オブ・
ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オ
ブ・ザ・ユナイテツド・ステイツツ・オブ・アメリカ
（Pro.Natl.Acad.Sci.USA）、78、6826−6830（198
1）． チヤンドラ（CHANDRA）ら.,バイオケミカル・アンド
・バイオフイジカル・リサーチ・コミユニケイシヨンズ
（Biochem.Biophys.Res.Comm.）103、751−758（198
1）． コートニーら（COURTNEY et coil.）プロシーデイ
ングズ・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ・オブ・ザ・ユナイテツド・ステーツ・オブ
・アメリカ（Pro.Natl.Acad.Sci.USA）、81、669−73
（1984）．
ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オ
ブ・ザ・ユナイテツド・ステイツツ・オブ・アメリカ
（Pro.Natl.Acad.Sci.USA）、78、6826−6830（198
1）． チヤンドラ（CHANDRA）ら.,バイオケミカル・アンド
・バイオフイジカル・リサーチ・コミユニケイシヨンズ
（Biochem.Biophys.Res.Comm.）103、751−758（198
1）． コートニーら（COURTNEY et coil.）プロシーデイ
ングズ・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ・オブ・ザ・ユナイテツド・ステーツ・オブ
・アメリカ（Pro.Natl.Acad.Sci.USA）、81、669−73
（1984）．
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＥＤ (72)発明者 ルコク ジヤン‐ピエール フランス国 67460 ライヒシユテツト リユ デユ シヤン デユ フオ ６
Claims (12)
- 【請求項１】358位の天然のメチオニン残基がロイシン
残基で置換されることを特徴とするヒトα１−アンチト
リプシンアナローグ。 - 【請求項２】α１−アンチトリプシンの配列が、５個の
Ｎ−端末アミノ酸を切り取られていることを特徴とする
請求の範囲第１項記載のα１−アンチトリプシンアナロ
ーグ。 - 【請求項３】α１−アンチトリプシンがグリコシル化さ
れていないことを特徴とする請求の範囲第１項または第
２項に記載のアナローグ。 - 【請求項４】宿主細胞、特に、成熟蛋白の第358アミノ
酸に相当するコドンがLeuをコードする、α１−アンチ
トリプシンをコードするDNA配列の発現ベクターを含む
微生物を培養することを特徴とするヒトα１−アンチト
リプシンアナローグの製造法。 - 【請求項５】宿主細胞、特に、５′端末の15個の塩基が
欠失したα１−ATアナローグをコードするDNA配列の発
現ベクターを含む微生物を培養することを特徴とする請
求の範囲第４項記載のアナローグの製造法。 - 【請求項６】微生物が細菌であることを特徴とする請求
の範囲第４項または第５項記載の製造法。 - 【請求項７】細菌が、発現ベクターを構成するプラスミ
ドで形質転換された大腸菌株であることを特徴とする請
求の範囲第６項記載のアナローグの製造法。 - 【請求項８】プラスミドが、大腸菌中に複製開始点を含
み、プロモーターPLがα１−ATアナローグをコードする
DNA配列を促進せしめることを特徴とする請求の範囲第
７項記載の製造法。 - 【請求項９】微生物が酵母であることを特徴とする請求
の範囲第４項または第５項記載の製造法。 - 【請求項１０】358位の天然のメチオニン残基がロイシ
ン残基で置換されているヒトα１−アンチトリプシンア
ナローグを含むことを特徴とする好中球エラスターゼ測
定試薬。 - 【請求項１１】358位の天然のメチオニン残基がロイシ
ン残基で置換されているヒトα１−アンチトリプシンア
ナローグを含む抗カテプシンＧ剤。 - 【請求項１２】358位の天然のメチオニン残基がロイシ
ン残基で置換されているヒトα１−アンチトリプシンア
ナローグを含むエラスターゼインヒビター。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8409592 | 1984-06-19 | ||
| FR8409592A FR2565983B1 (fr) | 1984-06-19 | 1984-06-19 | Derives de l'a1-antitrypsine humaine et procede pour leur preparation |
| FR8507393 | 1985-05-15 | ||
| FR8507393A FR2582001B2 (fr) | 1985-05-15 | 1985-05-15 | Nouveaux derives de l'a1-antitrypsine humaine, composition et reactif biologique les contenant |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62500420A JPS62500420A (ja) | 1987-02-26 |
| JP2599585B2 true JP2599585B2 (ja) | 1997-04-09 |
Family
ID=26224015
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60502680A Expired - Lifetime JP2599585B2 (ja) | 1984-06-19 | 1985-06-18 | ヒトα▲下１▼−アンチトリプシン誘導体及びその製造法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6072029A (ja) |
| EP (1) | EP0169114B1 (ja) |
| JP (1) | JP2599585B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341216C (ja) |
| DE (1) | DE3581328D1 (ja) |
| DK (1) | DK171064B1 (ja) |
| WO (1) | WO1986000337A1 (ja) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4711848A (en) * | 1984-03-14 | 1987-12-08 | Zymogenetics, Inc. | Site specific mutagenesis in alpha-1-antitrypsin |
| DE3585969D1 (de) * | 1984-06-14 | 1992-06-11 | Chiron Corp | Protease-inhibitoren des alpha-1-antitrypsin typs mit modifizierter aktiever stelle und deren herstellung. |
| DE3581328D1 (de) * | 1984-06-19 | 1991-02-21 | Transgene Sa | Derivate des menschlichen alpha-1-antitrypins und verfahren zu deren herstellung. |
| US4752585A (en) * | 1985-12-17 | 1988-06-21 | Cetus Corporation | Oxidation-resistant muteins |
| IL80477A0 (en) * | 1985-11-08 | 1987-02-27 | Smithkline Beckman Corp | Mutant coding sequence |
| GB2188322A (en) * | 1986-03-26 | 1987-09-30 | Bayer Ag | Aprotinin and analogues thereof produced by a recombinant host |
| FR2599752B1 (fr) * | 1986-06-10 | 1989-11-03 | Transgene Sa | Variants de l'alpha1- antitrypsine utiles notamment comme inhibiteurs de la kallikreine |
| FR2601033B1 (fr) | 1986-07-02 | 1990-01-19 | Transgene Sa | Variants de l'alpha-antitryspine humaine glycosylee et procede pour la preparation |
| JP2772793B2 (ja) * | 1986-08-05 | 1998-07-09 | トランスジ−ン ソシエテ アノニム | 細菌中に含まれるプラスミドの安定化方法及びこれにより得られる菌株 |
| FR2618159B2 (fr) * | 1987-07-15 | 1990-02-02 | Transgene Sa | Procede de stabilisation d'un plasmide contenu dans une souche bacterienne et souche obtenue |
| DE3683910D1 (de) * | 1986-09-05 | 1992-03-26 | Cetus Corp | Oxidationsresistente muteine von beta-interferon, deren herstellung und diese muteine enthaltende praeparate. |
| FR2637613B1 (fr) * | 1987-06-19 | 1991-09-27 | Transgene Sa | Procede de preparation de lignees cellulaires stables pour la production de proteines determinees, a partir d'animaux transgeniques; lignees cellulaires tumorales et proteines obtenues |
| JPH01191687A (ja) * | 1988-01-28 | 1989-08-01 | Hoechst Japan Kk | ヒトα↓２−プラスミンインヒビターまたはそれと類似の蛋白質から誘導される新規蛋白質 |
| AU3479495A (en) * | 1994-09-30 | 1996-04-26 | Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd | Alpha-1-antitrypsin and antithrombine-iii variants |
| GB2318732A (en) | 1996-11-01 | 1998-05-06 | Johnson & Johnson Medical | Wound healing compositions containing alpha-1-antitrypsin |
| GB9825374D0 (en) * | 1998-11-19 | 1999-01-13 | Ppl Therapeutics Scotland Ltd | Method |
| WO2005019434A2 (en) | 2003-08-26 | 2005-03-03 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Serine protease inhibitors for treatment of bacterial infections |
| PL2496246T3 (pl) | 2009-11-03 | 2018-09-28 | Grifols Therapeutics Llc | Kompozycja, sposób i zestaw dla inhibitora proteinazy alpha-1 |
| NZ600271A (en) | 2009-11-24 | 2013-09-27 | Grifols Therapeutics Inc | Lyophilization methods, compositions, and kits |
| KR20200044138A (ko) | 2011-06-24 | 2020-04-28 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 콜로라도, 어 바디 코포레이트 | 알파-1 안티트립신 융합 분자용 조성물, 방법 및 용도 |
| AU2012337241B2 (en) | 2011-12-30 | 2016-10-13 | Grifols, S.A. | Alpha1-proteinase inhibitor for delaying the onset or progression of pulmonary exacerbations |
| CA2896951A1 (en) | 2012-01-10 | 2013-07-18 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Compositions, methods and uses for alpha-1 antitrypsin fusion molecules |
| RU2573933C1 (ru) * | 2014-08-21 | 2016-01-27 | Дафот Энтерпрайсис Лимитед | Пептид для лечения сахарного диабета 2-го типа и его осложнений |
| WO2017117558A1 (en) | 2015-12-31 | 2017-07-06 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Methods and uses for alpha-1 antitrypsin or recombinant forms thereof, on steroid-refractory graft versus host disease involving gastrointestinal complications |
| EP3600345A4 (en) * | 2017-03-29 | 2021-01-06 | Cornell University | OXIDATION-RESISTANT AAT GENE THERAPY |
| CA3085696A1 (en) | 2017-12-12 | 2019-06-20 | Kamada Ltd | Methods of inducing immune tolerance and reducing anti-drug antibody response |
| WO2023083859A1 (en) | 2021-11-09 | 2023-05-19 | Danmarks Tekniske Universitet | Variants of alpha-1-antitrypsin |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU577259B2 (en) * | 1982-08-13 | 1988-09-22 | Zymogenetics Inc. | Glycolytic promters for regulated protein expression protease inhibitor |
| BE895961A (fr) * | 1983-02-21 | 1983-06-16 | Wallone Region | Procede de preparation d'un clone bacterien produisant de 1'alpha 1-antitrypsine humaine |
| US4711848A (en) * | 1984-03-14 | 1987-12-08 | Zymogenetics, Inc. | Site specific mutagenesis in alpha-1-antitrypsin |
| US4732973A (en) * | 1984-06-14 | 1988-03-22 | Chiron Corporation | Active site modified protease α-1-antitrypsin inhibitors |
| DE3585969D1 (de) * | 1984-06-14 | 1992-06-11 | Chiron Corp | Protease-inhibitoren des alpha-1-antitrypsin typs mit modifizierter aktiever stelle und deren herstellung. |
| DE3581328D1 (de) * | 1984-06-19 | 1991-02-21 | Transgene Sa | Derivate des menschlichen alpha-1-antitrypins und verfahren zu deren herstellung. |
| US4752585A (en) * | 1985-12-17 | 1988-06-21 | Cetus Corporation | Oxidation-resistant muteins |
-
1985
- 1985-06-18 DE DE8585401207T patent/DE3581328D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-18 JP JP60502680A patent/JP2599585B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-18 EP EP85401207A patent/EP0169114B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1985-06-18 WO PCT/FR1985/000158 patent/WO1986000337A1/fr unknown
- 1985-06-19 CA CA000484504A patent/CA1341216C/fr not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-02-18 DK DK076286A patent/DK171064B1/da not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-10-27 US US07/967,576 patent/US6072029A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1986000337A1 (fr) | 1986-01-16 |
| EP0169114A2 (fr) | 1986-01-22 |
| EP0169114A3 (en) | 1986-11-20 |
| CA1341216C (fr) | 2001-04-24 |
| DK76286D0 (da) | 1986-02-18 |
| JPS62500420A (ja) | 1987-02-26 |
| DK76286A (da) | 1986-02-18 |
| EP0169114B1 (fr) | 1991-01-16 |
| DK171064B1 (da) | 1996-05-13 |
| DE3581328D1 (de) | 1991-02-21 |
| US6072029A (en) | 2000-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2599585B2 (ja) | ヒトα▲下１▼−アンチトリプシン誘導体及びその製造法 | |
| JP2539781B2 (ja) | アルフア−１−抗トリプシンに於ける部位特異性突然変異誘発 | |
| Courtney et al. | High-level production of biologically active human alpha 1-antitrypsin in Escherichia coli. | |
| US5824505A (en) | Vectors, transformed cells and process for the preparation of hirudin | |
| AU735015B2 (en) | Use of substrate subtraction libraries to distinguish enzyme specificities | |
| JP2681000B2 (ja) | 新規ペプチドのプラスミノーゲンアクチベーターをコードする核酸 | |
| US5278049A (en) | Recombinant molecule encoding human protease nexin | |
| Heinzel et al. | Molecular cloning and expression of cDNA for human antileukoprotease from cervix uterus | |
| JP2991769B2 (ja) | セルピン抵抗性キモトリプシン スーパーフアミリー プロテアーゼ、特にＰＡＩ―１抵抗性ｔ―ＰＡ、相補的阻害剤変異株；組成；遺伝子；発現 | |
| US5747449A (en) | Bovine pancreatic trypsin inhibitor derived inhibitors of factor XA | |
| US5378614A (en) | Vector and method for making tissue factor pathway inhibitor (TFPI) analogues in yeast | |
| US5102995A (en) | Dna encoding modified heparin cofactor ii | |
| JP2916228B2 (ja) | 遺伝子操作した組み換えアプロチニン変異型、均質に処理されたアプロチニン変異型の微生物調製の方法およびその治療学的使用 | |
| US20030186329A1 (en) | Use of substrate subtraction libraries to distinguish enzyme specificities | |
| US5705355A (en) | Hirudin, pharmaceutical compositions comprising it and their use | |
| AUERSWALD et al. | Synthesis, cloning and expression of recombinant aprotinin | |
| AU2004225718A1 (en) | Inhibitor proteins of a protease and use thereof | |
| EP0260757A1 (en) | Recombinant DNA molecule; a process for producing human endothelial plasminogen activator inhibitor (PAI) or a mutant thereof; pharmaceutical composition; transformed host cells | |
| FR2565983A1 (fr) | Derives de l'a1-antitrypsine humaine et procede pour leur preparation |