DK171064B1 - Analoger af humant alfa1-antitrypsin, fremgangsmåde til fremstilling deraf, lægemiddel indeholdende analogerne, biologisk reagens indeholdende analogerne, samt anvendelse af analogerne - Google Patents

Description

DK 171064 B1

Den foreliggende opfindelse angår analoge til humant 0^-antitrypsin, fremgangsmåder til fremstilling deraf, lægemidler indeholdende disse forbindelser, biologiske reagenser til bestemmelse af visse proteiner og indeholdende forbindelserne 5 samt anvendelse af en sådan analog.

Det er beskrevet i ansøgerens franske offentliggørelsesskrift nr. 2539758 og i det tilsvarende europæiske patentskrift nr. 114.777, at det er muligt at fremstille humant ax-antitrypsin ved hjælp af genetiske manipulationsteknikker.

10 I denne patentansøgning beskrives meget bredt de mulige anvendelser af denne forbindelse.

En nærmere undersøgelse af aktiviteten af humant -antitrypsin har gjort det muligt at klarlægge den interesse, som analoge til dette produkt kunne frembyde.

15 cx1-Antitrypsins vigtigste fysiologiske rolle er inhibering af neutrofil elastase i den nedre del af åndedrætsorganerne.

I sunde lunger virker o^-antitrypsin og elastase på afbalanceret måde og danner fortætningsområder lokaliseret rundt om fremmedlegemer, før disse udstødes.

20 En mangel i denne balance til fordel for elastase fører til en ukontrolleret virkning af proteasen og til meget betydelige skader på vævene. Dette fører på klinisk niveau til et emfysem.

Et sådant misforhold forekommer i tilfælde af en arveligt 25 betinget mangel på ax-antitrypsin.

Den hyppigste årsag til ikke-arveligt emfysem er cigaretrøg.

I dette tilfælde er der et samspil mellem forskellige faktorer, som fører til et misforhold mellem alveolær protease og anti-protease. oi1 -Antitrypsins aktivitet formindskes ved 30 oxidation, enten direkte af selve cigaretrøgen eller af DK 171064 B1 2 oxygenradikaler, som frigøres af de makrophager, der trækkes mod lungen på grund af tilstedeværelsen af forurenende røg-partikler. Desuden udskiller disse makrophager (som selv danner en elastase) en kemotaxisk faktor, som medfører frigi-5 velse af neutrofil elastase på stedet.

Det er ligeledes sandsynligt, at o^-antitrypsin bliver følsomt over for en irreversibel inaktivering på grund af pro-teolytisk spaltning. Der findes således i lungerne hos storrygere en elastasemængde, som kan medføre en sygdom, som 10 ødelægger lungerne.

Hvis det, som det er beskrevet i ovennævnte franske offentliggørelsesskrift, er muligt at anvende bakterielt %-anti-trypsin (herefter betegnet o^-AT) til behandling af misforhold af en hvilken som helst af de ovennævnte arter, synes 15 det ikke desto mindre at ville være hensigtsmæssigt at råde over en analog til o^-AT med en forbedret stabilitet in vivo.

Den foreliggende opfindelse angår således især analoge til ^-AT, som har en forbedret stabilitet in vivo. især forøget resistens over for oxidation.

20 Talrige undersøgelser har vist, at inaktivering af o^-AT formentlig skyldes oxidation af methioninresten i stilling 358, som befinder sig på stedet for fiksering af elastase.

Den foreliggende opfindelse angår således fremstilling i bakterier, især i Escherichia coli. af humant c^-AT, som i 25 stedet for aminosyren methionin i stilling 358 indeholder en ikke-oxiderbar aminosyre såsom valin, samt de tilsvarende analoge til o^-AT.

De undersøgelser, der er foretaget af fikseringen af elastase til forskellige substrater, indikerer, at udskiftning af 30 methionin med valin forbedrer forbindelseskonstanten mellem o^-AT og elastase og forøger analogens aktivitet.

DK 171064 B1 3

Desuden inhiberer a^-AT et stort antal serinproteaser, herunder elastase, trypsin, chymotrypsin, plasmin og thrombin. Dets vigtigste funktion er som nævnt ovenfor at fungere som inhibitor af neutrofil elastase i åndedrætsorganerne.

5 o^-AT's rolle i koagulationsprocessen antydes af dets evne til at inhibere thrombin. Dette enzym er ansvarligt for spaltning af fibrinogen til fibrin, hvilket er sluttrinnet i blodkoagulationskaskaden.

Thrombin udløser ligeledes blodpladeaggregering og kataly-10 serer aktiveringen af faktor V, faktor VIII og faktor XIII.

Inaktivering af thrombin ved hjælp af ax-AT er en kompleks proces. I et molforhold på 1:1 er inaktiveringen svag og ufuldstændig, men når det molære overskud af ax-antitrypsin forøges, forøges inhiberingsgraden, og thrombin inhiberes 15 fuldstændigt. Da der ikke iagttages noget symptom på hyper-koagulationsevne i tilfælde af en homozygot, der mangler a^-antitrypsin, synes det dog at være sikkert, at o^-antitrypsin ikke spiller nogen væsentlig rolle for reguleringen af blodkoagulationen .

20 Graden af anti-thrombinaktivitet i humant plasma kan fuldstændigt tilskrives aktiviteten af anti-thrombin III (AT-III) og af a2-makroglobulin.

I en nyere publikation er der beskrevet en mutant af oi1-antitrypsin c^-AT Pittsburgh), som indeholder en udskiftning 25 af et enkelt nucleotid, der erstatter methionin med arginin på det reaktive sted i stilling 358 af molekylet. Denne variant af a^-AT var ansvarlig for en tragisk forstyrrelse, som førte til døden af en patient på 14 år. Denne mutant af a1-AT opfører sig ikke længere som en elastaseinhibitor, men 30 har en anti-thrombinaktivitet, som er forøget flere hundrede gange. Denne aktivitet er uafhængig af heparins virkning.

. DK 171064 B1 4

Disse iagttagelser kan forklares ved sammenligning af amino-syresekvensen i o^-AT og AT-III. Disse proteaseinhibitorer har 29% fælles struktur, hvilket indikerer, at de begge stammer fra det samme protein.

5 Deres reaktive centrum har en lignende sekvens; ved den centrale stilling for c^-antitrypsin ses en methioninrest, som er det foretrukne spaltningssted for elastase, hvorimod AT-III på samme sted har en argininrest, som er det foretrukne sted for thrombin.

10 I a-|_-AT Pittsburgh medfører substitution af methionin med arginin således en ændring af specificiteten af inhiberingen i forhold til elastase, idet den overføres til thrombin.

Den foreliggende opfindelse angår således analoge til humant α^-AT, nemlig a) analoge i hvilke aminosyren i stilling 358 15 (normalt methionin) er erstattet med arginin eller en naturlig aminosyre, der kun i ringe grad eller slet ikke oxideres, når den er indsat i et protein, dvs. især glycin, alanin, valin, isoleucin, leucin eller phenylalanin, og hvor de 5 n-terminal aminosyrer er fjernet, og b) varianten [Leu358]a1-2 0 AT.

I nærværende beskrivelse betegner udtrykket "et α^-ΑΤ" én af flere naturlige varianter af dette protein, selv om deres strukturer ikke alle er kendte.

Nummereringen af aminosyrerne er den almindeligt anerkendte, 25 hvor den første aminosyre er glutamin i Kurachi et al. og Chandra et al.'s publikationer (fig. 1).

Udtrykt mere præcist befinder aminosyre 358 sig i fikseringsområdet for elastase, og i forbindelserne ifølge opfindelsen har dette område fortrinsvis følgende struktur: 30 358 ala - ile - pro - X - ser - ile DK 171064 B1 5 idet X betegner arg, gly, ala, val, ile, leu eller phe.

Naturligvis betegner udtrykket "et o^-AT" også punktmutanter, i hvilke en mutation kan forekomme på et ikke-reaktivt sted; denne mutation kan især finde sted ved fremstilling af analo-5 ge ved hjælp af teknikker til punktmutation af gener.

Blandt analogene ifølge opfindelsen er to særlig interessante : [Arg358] o^-AT og [Val358] o^-AT.

10 Desuden har nylige undersøgelser vist, at normalt plasma-a^ -AT findes i to former, én form, som er beskrevet tidligere, og en anden form, som indeholder en N-terminal sletning af 5 aminosyrer.

Den foreliggende opfindelse angår således også derivater af 15 -AT eller analoge til o^-AT som beskrevet ovenfor, hvilke derivater eller analoge er ejendommelige ved, at der fra sekvensen af o^-AT eller af dets analoge er fjernet de 5 N-terminale aminosyrer.

Ifølge de igangværende undersøgelser ser det ud til, at den 20 afkortede form stammer fra en modificering af det naturlige molekyle i plasmaet. Den afkortede form er til stede i en koncentration, der er ca. 10 gange svagere end den naturlige form.

De forsøg, der er blevet udført med disse afkortede varian-25 ter, viser, at de er effektive inhibitorer af elastase ligesom det naturlige protein.

Den foreliggende opfindelse angår ligeledes en fremgangsmåde til fremstilling af analoge til a1-AT, ved hvilken man dyrker en værtscelle, især en mikroorganisme, der omfatter en eks-30 pressionsvektor for den DNA-sekvens, som koder for a^-AT, og i hvilken den kodon, der svarer til aminosyre 35Θ af det DK 171064 B1 6 modne protein, koder for arg eller en ikke-oxiderbar naturlig aminosyre, når den er inkorporeret i et protein, eller i hvilken 15 baser ved 5'-enden er blevet slettet fra den DNA-sekvens, som koder for a^-AT eller dets analoge.

5 Arten af ekspressionsvektoren afhænger selvfølgelig af den anvendte mikroorganisme.

I det tilfælde, hvor mikroorganismen er en bakterie, især E. coli. er vektoren fortrinsvis et plasmid indeholdende et replikationsinitieringssted i E. coli. fx replikationsini-10 tieringsstedet fra pBR322.

Ekspressionsplasmider for genet for ax-AT i bakterier er beskrevet i ansøgerens europæiske patentskrift nr. 84 400126 samt i belgisk patentskrift nr. 895.961.

Blandt de bakterielle vektorplasmider foretrækkes det at 15 anvende sådanne, der indeholder en promotor for phagen λ, promotoren PL, og et ribosombindingssted fra cll-proteinet fra λ: cllXrbs eller et syntetisk sted som beskrevet i europæisk patentskrift nr. 84 400126.

Desuden kan disse plasmider indeholde hele eller en del af N-20 genet. Andre kendetegn ved disse plasmider er vist i eksemplerne og i det ovenfor nævnte patentskrift.

I det tilfælde, hvor mikroorganismen er en gær, er det muligt som vektorplasmid at anvende de vektorer, der er beskrevet i europæisk offentliggørelsesskrift nr. 0 103 409. Når gæren er 25 en stamme af Saccharomyces cerevisiae. indeholder vektoren fortrinsvis et replikationsinitieringssted fra plasmidet 2μ og en gærpromotor valgt blandt dem, der er beskrevet i nævnte offentliggørelsesskrift.

Den præcise struktur af ekspressionsvektoren udgør generelt 30 set ikke et essentielt træk ved den foreliggende opfindelse.

DK 171064 B1 7

Den sekvens, som koder for analogen til c^-AT, kan fremstilles ved kendte teknikker ved at gå ud fra sekvensen af naturligt ax-AT fra en klon.

Det er muligt ved restriktion/ligering at erstatte den del af 5 genet, som skal modificeres, med et syntetisk gen, som indeholder den sekvens, der koder for den ønskede analog.

Det er imidlertid også muligt at gå frem ved hjælp af punktmutation, især når analogens kodon kun afviger med ét nucleo-tid fra kodonen for methionin: ATG, hvilket fx er tilfældet 10 med val: GTG, arg: AGG eller leucin, isoleucin eller phenyl-alanin.

Denne punktmutationsteknik beskrives nærmere i eksemplerne.

Kloner af -AT samt fremstillingen deraf er kendte og er beskrevet i publikationer af Kurachi et al. og Chandra et al. 15 samt i de forskellige patentskrifter og patentansøgninger, der er nævnt ovenfor.

De teknikker, der benyttes ved disse fremgangsmåder, er i princippet kendte og/eller er beskrevet i de nævnte referencer.

20 Transformation af stammerne med vektorerne samt betingelserne for dyrkning af transformanterne til opnåelse af analoge til o^-AT er ligeledes kendte og er en funktion af de mikroorganismer, der anvendes.

De afkortede eller ikke-afkortede analoge til o^-AT ifølge 25 opfindelsen kan anvendes som lægemidler, især som erstatning for c^-AT, til behandling af arveligt eller ikke-arveligt betinget α^-AT-mangel, fx til behandling og forebyggelse af lunge -emfysem.

Den analog, som indeholder arginin i stilling 358, er et 30 antikoagulans og er mere specielt anvendeligt som antikoagu- DK 171064 B1 8 lerende lægemiddel, men kan også anvendes i de laboratorier, der behandler, doserer eller lagrer blod.

Fx kan denne analog anvendes til behandling og forebyggelse af thromboser og i mikrokirurgien til reduktion af hævelser.

5 En af fordelene ved denne analog til ofx-AT er, at den til forskel fra heparin synes at virke direkte og ikke ved hjælp af en bestanddel som AT-III; i tilfælde af operationsshock bemærkes ofte en nedgang i AT-III, og under disse betingelser kan heparin ikke udøve sin rolle som antikoagulans til for-10 skel fra analogen til o^-AT.

Til anvendelse i laboratorier kan analogen til o^-AT fx anvendes i kredsløb uden for kroppen eller i doseringer af blod.

De forskellige varianter ifølge den foreliggende opfindelse 15 kan ligeledes anvendes som biologiske reagenser, især til dosering af neutrofil elastase og af thrombin.

Især varianterne [Leu358] o^-AT og [Met358] α^-ΑΤ kan anvendes som inhibitorer af cathepsin G.

De doser, der skal anvendes, afhænger naturligvis i høj grad 20 af den type lidelse, der skal behandles, og af den bestemte karakter af den analog, der skal anvendes, og skal tilpasses ved hjælp af metoder, som er kendte for fagfolk.

Den bestemte karakter af de farmaceutiske præparater afhænger ligeledes af den påtænkte administrationsvej og udgør ikke et 25 karakteristisk træk ved den foreliggende opfindelse.

Disse forskellige forbindelser kan endelig anvendes i immobi-liseret form på et hensigtsmæssigt underlag såsom fx kugler eller rør.

DK 171064 B1 9

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler og ved hjælp af tegningen, på hvilken fig. 1 viser cDNA-sekvensen af et humant gen, som koder for o^-AT, 5 fig. 2 viser anti-elastaseaktiviteten af det pro dukt, der er vundet ud fra E. coli/pTG999. fig. 3 viser anti-elastaseaktiviteten af ekstrak ter af E. coli/pTG1900.

fig. 4 viser anti-thrombinaktiviteten af ekstrak- 10 ter af E. coli/pTG1900.

fig. 5 viser anti-thrombinaktiviteten sammenlignet med ekstrakter af E. coli/pTG1900. AT-III og AT-III i nærværelse af heparin, fig. 6 viser skematisk fremstillingen af pTG920, 15 fig. 7 viser skematisk fremstillingen af pTG929, fig. 8 viser skematisk fremstillingen af pTG956, fig. 9 viser skematisk teknikken til fremstilling af varianter ved erstatning af det hensigtsmæssige DNA-fragment i genet for a^-20 AT, fig. 10 viser variationen i den procentvise inhi- bering af human neutrofil elastase for forskellige varianter, fig. 11 viser variationen i den procentvise inhi- 25 bering af humant cathepsin G for forskelli ge varianter, fig. 12a-12e viser den procentvise inhibering af elasta se for varianterne efter behandling med NCS (N-chlorsuccinimid), og 30 fig. 13 viser skematisk fremstillingen af afkortede varianter.

EKSEMPEL 1 [Val358] o^-AT

Direkte mutagenese in vitro af genet for humant otx-AT

DK 171064 B1 10

Den mutation, der erstatter methionin med valin, gør udskiftning af én enkelt base nødvendig (ATG bliver til GTG). En direkte mutagenese af stedet kan opnås ved at anvende et syntetisk oligonucleotid (som bærer den muterede version af 5 sekvensen), som primært kan hybridiseres til en enkeltstren-get model af genet og derefter virke som skabelon for syntesen af den komplementære streng ved hjælp af DNA-polymerase.

På denne måde opnås der en dobbeltstrenget sekvens, hvor én af strengene indeholder den sekvens, der svarer til vild-10 typen, og den anden den muterede sekvens.

Hvis der som model anvendes et genom af M13 indeholdende det enkeltstrengede gen for o^-AT, kan det vundne dobbeltstrengede molekyle anvendes til transformation af E. coli-værtscel-lerne, og de phager, der indeholder det muterende gen, kan 15 identificeres ved screening af plaques.

Kloning af cDNA af humant ax-AT og ekspression deraf i E. coli er tidligere beskrevet, fx i de ovenfor nævnte patentskrifter og af Courtney et al., 1984.

En klon, som danner o^-AT, pTG983, danner biologisk aktivt 20 o^-AT i en mængde, der svarer til ca. 1% af det totale celleprotein i E. coli.

For at mutere sekvensen af o^-AT overføres et Clal-Pstl-fragment, der indeholder genet, og som er vundet ud fra pTG983, til vektoren M13, M13mp701, mellem Accl- og Pstl-25 stederne.

Det kodende enkeltstrengede DNA isoleres derefter fra den vundne phagpartikel efter inficering af værtscellen, E. coli JM103 . Oligonucleotidet 5'-ATAGACACGGTATG-3' (kemisk syntetiseret) hybridiseres med model-DNA'et i et molært overskud på 30 100 gange ved opvarmning ved 100°C i 5 minutter og derefter ved langsom afkøling til 4°C. Dette oligonucleotid er komple- DK 171064 B1 11 mentært med området for det aktive sted af c^-AT, men indeholder en valin-kodon i stedet for methionin-kodonen: ala ile pro met ser ile

Oprindelig sekvens:

GCC ATA CCC ATG TCT ATC

ala ile pro val ser ile Muteret sekvens: GCC ATA ccc GTG TCT ATC

5 Syntesen af den anden streng udføres derefter ved at inkubere prøven (0,5 pmol enkeltstrenget DNA) i 2 timer ved stuetemperatur med 200 μg/ml DNA-polymerase (Klenow-fragment) , 40 μg/ml T4-DNA-ligase, 0,5 mM deoxynucleotid-triphosphat og 1 mM ATP i en puffer (8 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl2, 10 4 0 mM NaCl og 6 mM /3-mercaptoethanol) .

Prøven opvarmes derefter ved 65°C i 10 minutter, der tilsættes én enhed ligase og 1 mM ATP, og der inkuberes i yderligere 16 timer ved 4°C. Alikvoter af reaktionsblandingen anvendes derefter til at transformere den kompetente E. coli 15 JM103-celle. Phagplaques udplades på LB-plader, og de resul terende kolonier adsorberes på et nitrocellulosefilter og selekteres til påvisning af mutantphagen ved hybridisering med det muterede oligonucleotid mærket med 32P under anvendelse af T4-polynucleotidkinase.

20 Under hensigtsmæssige betingelser danner oligonucleotidet kun en stabil hybrid med den fuldstændig homologe sekvens, dvs. muteret. I dette tilfælde giver hybridisering i 3 x SSC, 1 x Denhardt, 0,5% natriumpyrophosphat og 0,1% SDS ved 50°C en effektiv selektering.

25 Phag-DNA fremstilles ud fra kulturer af positive kolonier og anvendes til transformation af JM103-celler. DNA fra de resulterende plaques sekventeres derefter under anvendelse af dideoxykædeterminationsmetoden. Nucleotidsekvensen bekræfter, at der er opnået en mutation i den ønskede stilling af genet.

DK 171064 B1 12

Fragmentet af det muterede c^-AT-gen, Bglll-Pstl. skæres derefter ud af M13-genomet og overføres til ekspressions-plasmidet pTG983 efter udskæring af Bglll/PstI-fragmentet. Denne manipulation fører til et plasmid, pTG999, som er 5 identisk med pTG983 med den forskel, at det gen, som koder for αχ-ΑΤ, har en mutation ved stedet for fiksering af elast-ase.

Ekspression af [Val358] ax-AT i E. coli

Ekspressionen af varianten ved stedet for fiksering af elastic) ase (pTG999) sammenlignes direkte med pTG983. Det kan fastslås, at synteseniveauet og den biologiske aktivitet af a^-AT er sammenlignelig i de to kloner.

Den semilogaritmiske vækstfase (ca. 10® celler/ml) af pTG983, pTG999 og pTG951 (negativ kontrol svarende til pTG983, men 15 uden det gen, som koder for o^-AT) dyrket ved 28°C induceres ved opvarmning til 37°C i 5 timer. Dette inaktiverer repres-soren cI857, som indkodes af værten, og som ved lav temperatur inaktiverer ekspressionen af genet for o^-AT, idet trans-kriptionen fra promotoren PL blokeres. Efter høst sprænges de 20 resuspenderede celler ved sonikering, celleresterne elimineres ved centrifugering, og supernatantens proteinkoncentration bedømmes ved en standardteknik (Biorad).

Mængden af o^-AT i hver af ekstrakterne bestemmes ved radial immundiffusion (RID) under anvendelse af et kit (Calbiochem-25 Behring). Diameteren af ringen af immunbundfaldet er proportional med antigenkoncentrationen i prøven, hvilken beregnes ved sammenligning med en serie fortyndinger af stan-dardsera.

Denne undersøgelse viser, at pTG983 og pTG999 danner a^-AT i 30 en mængde på 0,65% og 0,55% af det totale celleprotein.

Alikvoter af den supernatant, som er vundet efter sonikering, anvendes også til at sammenligne anti-elastaseaktiviteten af DK 171064 B1 13 det o^-AT, som er dannet af pTG983 og pTG999. Dette udføres ved at teste ekstrakternes mulighed for at inhibere human leukocytelastases (Elastin Products Inc.) spaltning af met-hoxysuccinyl-ala-ala-pro-val-nitroanilid. Inhiberingskurverne 5 for elastase er vist i fig. 2 og viser klart, at pTG983 og pTG999 danner aktive former af o^-AT. Denne iagttagelse er vigtig, idet den viser, at variantformen af o^-AT med valin i stedet for methionin ved stedet for fiksering af elastase er aktiv ligesom det naturlige molekyle.

10 Ud fra disse kurver har man kunnet beregne, at pTG983 og pTG999 danner α^-AT i mængder på henholdsvis 0,8% og 0,7% (under den forudsætning, at under disse betingelser inhiberes 50 ng elastase 50% af 50 ng α^-AT).

EKSEMPEL 2

15 [Arg358] θ'!-AT

Udskiftning af met-kodonen med arg i (χλ- AT-genet udføres på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Ændringen af met til arg kræver udskiftning af ét nucleotid (ATG bliver til AGG):

ala ile pro MET ser ile Oprindelig sekvens: GCC ATA CCC ATG TCT ATC

ala ile pro ARG ser ile 20 Muteret sekvens: ^*G TCT ATC

Det oligonucleotid, der blev anvendt til at udføre denne mutagenese, er: 5'-ATAGACCTGGGTATG-3'. Dette oligonucleotid er komplementært med det reaktive område af o^-AT, men indeholder en arginin-kodon i stedet for methionin-kodonen. Den 25 direkte mutagenese af stedet udføres på genet for of1-AT

klonet i M13mp701 som beskrevet ovenfor. Efter identificering af mutanterne ved hybridisering med det ovenfor nævnte oligonucleotid bekræftes mutationen ved DNA-sekventering.

DK 171064 B1 14

Variantgenet for α^-AT på et ΒσΙΙΙ-PstI-fragment fjernes derefter fra Ml3-genomet og overføres til ekspressionsvektoren pTG983 efter udskæring af Bglll/PstI-fragmentet. Dette giver et plasmid, pTG1900, som er identisk med pTG983 med 5 undtagelse af den muterede sekvens ved det reaktive sted.

Ekspression af [Arg358] o^-AT modificeret i E. coli

Det af pTG1900 dannede c^-AT sammenlignes direkte med det, der er vundet fra pTG983. Det har kunnet fastslås, at disse to kloner fører til dannelse af proteiner, som reagerer på 10 identisk måde i en radial immundiffusionstest (RID) for o^-AT.

a^-AT-varianten udviser ingen detekterbar anti-elastaseakti-vitet og er en særdeles effektiv thrombin-inhibitor.

Der fremstilles ekstrakter, som underkastes sonikering, af 15 kulturer induceret med E. coli TGE900 indeholdende pTG1900 og pTG983, og mængden af ax-AT i hver af ekstrakterne bestemmes ved RID. Hver ekstrakt indeholder et immunreaktivt materiale, og forsøg indikerer, at i hvert tilfælde er ekspressionsmængden i størrelsesordenen 1% af det totale celleprotein i 20 E. coli.

Alikvoter af disse ekstrakter anvendes også til at sammenligne anti- elastaseaktiviteten og anti-thrombinaktiviteten af det dannede ax-AT i hvert tilfælde. Anti-elastaseaktivite-ten testes ved at måle ekstrakternes mulighed for at inhibere 25 human leukocytelastases spaltning af methoxysuccinyl-ala-ala-pro-val-p-nitroanilid. Inhiberingskurverne for elastase viser, i modsætning til det, som ses for pTG983, at pTG1900 ikke udviser nogen anti-elastaseaktivitet (fig. 3).

Anti-thrombinaktiviteten testes ved at måle graden af in-30 hibering af bovint thrombins spaltning af chromozym TH (to-syl-gly-pro-arg-p-nitroanilid-acetat) (Boehringer Mannheim).

4 μg thrombin præinkuberes ved 37°C i 20 minutter med alikvo- DK 171064 B1 15 ter af bakterieekstrakter før tilsætning af substrat op til 0,1 mM. Reaktionshastigheden overvåges ved måling af graden af ændring af absorbans ved 410 run. Resultaterne (fig. 4) viser under disse betingelser, at ekstrakterne af pTG983 ikke 5 indeholder nogen detekterbar anti-thrombinaktivitet, medens ekstrakterne af pTGl900 på effektiv måde inaktiverer thrombin.

Sammenligning af disse resultater med inhiberingskurverne for AT-III indikerer, at α^-AT-varianten har en anti-thrombin-10 aktivitet, som er 15-20 gange større end aktiviteten af AT-III i fraværelse af heparin og ca. samme aktivitet (i mol) som AT-III i nærværelse af heparin (fig. 5).

Fremstilling af pTG983

Fremstillingen af plasmidet pTG983 er beskrevet i europæisk 15 patentskrift nr. 84 400126 og forklares kort nedenfor.

Ved fremstillingen af plasmidet pTG983 starter man med plasmidet pTG907 og phagen M13tg912, hvis fremstilling er beskrevet i nærværende ansøgers europæiske patentskrift nr.

0 094 887.

20 BamHI/Sphl-fragmentet fra pTG907, Bqlll/Hpal. der bærer cllrbs og lacZ' fra M13tg912, og den phosphorylerede adaptor Hgal/Sphl blev præhybridiseret i et molforhold på 1:2:1 og derefter behandlet med T4-ligase. Alikvoter blev anvendt til at transformere de kompetente celler af stammen 6150 ved 25 30°C.

De interessante celler blev identificeret ved selektering af transformanterne med et cllrbs/lacZ'- fragment, der var mærket 32 med P, og den vundne konstruktion bekræftet ved en enzymatisk restriktionsundersøgelse.

30 For at opnå en første indikation, som viser, at ekspressionssystemets forskellige elementer opfører sig som ønsket, DK 171064 B1 16 overføres det vundne plasmid, pTG908, til en værtsstamme N6437, som både har cI857 og ω-fragmentet af /3-galactosidase, hvilket kompletterer a-fragmentet, som indkodes af plasmidet.

De vundne transformanter anbringes på en skål indeholdende 5 IPTG + Xgal og er hvide ved 28°C og bliver derefter blå ca.

30 minutter efter, at de er blevet overført til 42°C.

Plasmidet pTG908 blev anvendt til at udtrykke genet for humant c^-AT, som er vundet ved kendte teknikker og er beskrevet ovenfor.

10 Den anvendte cDNA-klon af humant o^-AT, pTG603, indeholder et unikt BamHI- restriktionssted umiddelbart efter kodonen for den første aminosyre af det modne protein. Kodningsevnen for hele det modne protein med undtagelse af den indledende glutaminsyre indeholdes således i et BamHI/PstI-fragment. som 15 er klonet på ekspressionsvektoren pTG920; i denne konstruktion sker transkriptionen ud fra den venstre λ-promotor, PL, og translationen indledes ved ATG fra XcIIrbs, som sammen med ribosombindingsstedet og de første 39 basepar af genet XcII fusioneres til begyndelsen af lacZ'-genet som vist.

20 Et forbindelsesområde, der omfatter de unikke restriktions-steder, befinder sig ved forbindelsen mellem cll og lacZ'-sekvensen. Plasmidet pTG920 er et derivat af pTG908, som tidligere er fremstillet, i hvilket det oprindelige BamHI/PstI-fragment. som sidder 40 bp nedenfor ATG'et fra cll 25 i pTG908, er erstattet med et Bglll/PstI-fragment fra M13tgll5, hvilket er vist i fig. 6.

Ved denne fremgangsmåde fås et BamHI-sted, som er anbragt i samme translationsfase som BamHI-stedet i genet for o^-AT.

Fig. 6 viser den kloningsstrategi, som gør det muligt at 30 fremstille plasmidet pTG920 ud fra plasmidet pTG908 og phagen M13tgll5, og indikerer det fragment, der skal klones fra pTG603. De fuldt optrukne linjer betegner de sekvenser, som DK 171064 B1 17 koder for et protein, og betegner i tilfælde af pTG603 den sekvens, som koder for det modne polypeptid, α^-AT. De skraverede områder betegner de områder, som koder for de 13 N-terminale aminosyrer af dl, som til slut skal fusioneres med 5 a-L-AT.

Indsætning af et BamHI/PstI-fragment fra pTG603 mellem BamHI-og Pstl-stedet i pTG920 fører således til ekspression af et fusioneret polypeptid, der indeholder (startende med NH2~ terminalen) 13 aminosyrer fra cll-proteinet, 4 aminosyrer 10 stammende fra sekvensen af adaptoren og det modne polypeptid α^-AT, bortset fra glutaminsyren ved NH2-terminalen.

pTG920, der er behandlet med BamHI/PstI og med alkalisk phosphatase, forbindes med pTG603, som er spaltet med BamHI og PstI. De transformante TGE900-celler, som bærer o^-AT-15 fragmentet, isoleres efter enzymatisk restriktionsundersøgelse. Én af disse kloner er pTG922. Den detaljerede fremstilling af denne klon er beskrevet i en artikel af Courtney et al. (1984).

Plasmidet pTG922 underkastes fuldstændig restriktion med 20 restriktionsenzymerne Ndel (New England Biolabs) og BamHI

(Bethesda Research Labs) under de betingelser, som er angivet af 1everandøren.

Ved kendte fremgangsmåder syntetiseres ikke-phosphorylerede komplementære adaptor-oligonucleotider med følgende struktur: 25 5'-dTATGGAG- 3' og 5'-dGATCCTCCA-3' .

Disse oligonucleotider præhybridiseres og underkastes derefter ligering ved 4°C med plasmidet pTG922, som er blevet underkastet enzymatisk restriktion i et molforhold på 50:1 under anvendelse af DNA- ligase under kendte betingelser 30 (fig. 7).

DK 171064 B1 18

Ligeringsblandingen anvendes til at transformere kompetente celler af stammen TGE900, og de vundne transformanter anbringes på et dyrkningsmiljø i nærværelse af ampicillin.

Kolonierne selekteres på nitrocellulosefiltre ved hybridi-5 sering med en probe mærket med T4-polynucleotidkinase 5'-dCCTGGGATCCTCCA-3'. Denne probe er fuldstændigt komplementær med den ikke-fusionerede konstruktion, som man ønsker at selektere, men er kun komplementær med 7 af nucleotiderne fra stamplasmidet pTG922, hvilket er utilstrækkeligt til at sikre 10 hybridisering.

Der opnås således 6 positive kandidater, hvoraf den ene betegnes pTG929.

Plasmidet pTG929 danner kun små mængder -AT (mindre end 0,1% af det totale celleprotein). For at forøge ekspressions-15 mængden erstattes cllrbs med et syntetisk rbs-sted: /translation

TCGATAACACAGGAACAGATCTÅTG

ί

Shine/Da Igarno-sekvens

Denne udskiftning udføres som vist i fig. 8.

Hpal- og ΒσΐII-stederne fra pTG929 erstattes under anvendelse 20 af syntetiske indsætninger med henholdsvis Clal- og Xhol-stederne.

Det syntetiske rbs (synt rbs) indsættes derefter mellem Ndel-stedet og det nye Clal-sted, som er dannet i N-genet.

Denne manipulation eliminerer cllrbs og giver et afkortet N-25 gen umiddelbart efterfulgt af synt rbs. En translationsterminat ionskodon (TAA) i synt rbs blokerer translationen af N.

Det vundne plasmid er pTG956.

DK 171064 B1 19 I plasmidet pTG956 erstattes den oprindelige -AT-sekvens med en muteret sekvens: met glu asp pro glu gly asp ala

Oprindelig sekvens: ATG GAG GAT CCC CAG GGA GAT GCT

met glu asp pro glu gly asp ala

Muteret sekvens: ATG G AA GAT CCT C AA GGC GAT GCT

* * * * 5 Hver ændring (markeret med en asterisk) udføres i stilling 3 af kodonerne og modificerer ikke den kodede aminosyre. c^-AT-genet blev modificeret under anvendelse af en teknik med styret mutagenese af de enkelte steder under anvendelse af et syntetisk oligonucleotid, som definerer de bestemte baseæn-10 dringer.

De valgte sekvensændringer stammer fra en statistisk undersøgelse, som viser en præference for visse baser i flere stillinger i nærheden af begyndelsen af E. coli-generne.

Disse ændringer destabiliserer ligeledes de områder, der 15 svarer til mulige sekundære strukturer, som kan forekomme i mRNA-sekvensen af a1-AT. Oligonucleotidet for mutagenesen er: 5'-AGCATCGCCTTGAGGATCTTCCAT-3'.

Denne sekvens indeholder 4 forskelle i forhold til den oprindelige sekvens og fører til de ovenfor anførte modifika-20 tioner i o^-AT-genet.

Det vundne plasmid, pTG983, er identisk med pTG956 bortset fra de ovenfor nævnte ændringer.

EKSEMPEL 3

Fremstilling af varianten [Gly358] af o^-AT

DK 171064 B1 20

Denne variant konstrueres ved direkte mutagenese af stedet ved hjælp af et syntetisk oligonucleotid som beskrevet i eksempel l.

I dette tilfælde er det anvendte oligonucleotid, som bærer 5 den ønskede mutation, følgende: 5' GATAGAACCGGGTATGGC 3'.

Dette fører til mutationen ATG -* GGT (Met -* Gly) .

Som beskrevet i eksempel 1 udføres mutagenesen på -AT-genet subklonet i M13mp701. Efter mutationen indsættes BolII/Pstl-10 fragmentet indeholdende variantgenet i ekspressionsplasmidet pTG983, som er beskrevet i ovennævnte patentskrift.

Ved transformation af E. coli med dette plasmid som beskrevet ovenfor fås ekspression af varianten [Gly358] af c^-AT.

EKSEMPEL 4 15 Fremstilling af varianterne [Leu358] , [Ala358] , [Ile358] og

[Phe358] af a1-AT

De forskellige varianter, der er nævnt ovenfor, fremstilles ved udskiftning af et hensigtsmæssigt DNA-fragment i a^-AT-genet.

20 Princippet for denne teknik er beskrevet i fig. 9.

Varianterne konstrueres ved at erstatte et lille DNA-segment i det område, som koder for aminosyre 358, med et dobbeltstrenget syntetisk fragment indeholdende den passende mutation.

25 Det lille fragment spaltes fra genet med restriktionsenzymerne Ndel og Aval. som skærer på hver side af det område, som koder for det aktive -AT-sted.

DK 171064 B1 21

Aval-stedet findes allerede i det oprindelige gen, men der skal dannes et nyt Ndel-sted for at kunne iværksætte fremgangsmåden; dette udføres ved en styret mutation af stedet ved hjælp af et syntetisk oligonucleotid (eksempel 1).

5 Efter behandling med restriktionsenzymer separeres plasmidet, hvorfra det område, som koder for det aktive sted, er slettet, ved præparativ gelelektroforese og behandles med kalve-tarm-phosphatase, hvorefter denne præparation ved hjælp af T4-ligase bindes til et lille syntetisk DNA-fragment, som 10 indeholder den ønskede mutation samt sekvenser, som udgør de enkeltstrengede 5'-forlængelser svarende til forlængelserne fra det med Ndel og Aval spaltede gen.

Denne metodik medfører konstruktioner, som er identiske med pTG983 bortset fra mutationerne ved det aktive sted.

15 Hver af varianterne dannes i E. coli i mængder, som er næsten identiske med de mængder, der opnås med pTG983 og er beskrevet i ovennævnte patentskrift, hvilket fremgår af forsøg med radial immundiffusion, dvs. i mængder på ca. 1% af det totale celleprotein i E. coli.

20 De sonikerede og klarede ekstrakter testes for tilstedeværelsen af inhiberende aktivitet på human neutrofil elastase eller cathepsin G.

De opnåede resultater er anført i fig. 10 og 11, idet in-hiberingen af elastase blev målt som beskrevet i eksempel 2, 25 og cathepsin G-aktiviteten blev målt under anvendelse af et chromogent substrat, N-succinyl-ala-ala-pro-phe-p-nitroani-lid.

Varianterne [Leu358] , [Ala358] og [Ile358] inhiberer elastase- aktiviteten i lighed med varianterne [Met358] og [Val358] , 30 hvorimod varianterne [Gly358] og [Arg358] ikke gør det.

DK 171064 B1 22

Af alle de testede varianter inhiberer kun varianterne [Leu358] og [Met358] cathepsin G.

Behandling med 10 mM N-chlorsuccinimid (NCS) (resultaterne er vist i fig. 12) viser, at under betingelser, hvor varianten 3 5 Θ 5 [Met ] (fig. 12a) er fuldstændigt inaktiveret ved oxida-

“3 C Q *3 C Q

tion, forbliver varianterne [Leu ] (fig. 12b), [Ala ] (fig. 12c), [Ile358] (fig. 12d) og [Val358] (fig. 12e) fuldt aktive mod neutrofil elastase.

EKSEMPEL 5 10 Dannelse af afkortede varianter af αχ-ΑΤ

Disse varianter fremstilles på følgende måde (vist i fig.

13) :

Der gås ud fra plasmidet pTG983, som muteres ved hjælp af et syntetisk oligonucleotid, således at der dannes et unikt 15 Apal-sted omkring kodon 8, idet de to nucleotider CT ved kodon 7 erstattes med nucleotiderne GG.

Derefter udføres en ny mutation af plasmidet til dannelse af et Ndel- sted ved translationsinitieringskodonen.

Det resulterende plasmid behandles med enzymerne Apal og Ndel 20 for at slette den del, som svarer til de aminosyrer, som man ønsker at skære bort.

Dette slettede fragment erstattes med et syntetisk oligonucleotid, som gør det muligt at sikre fusion mellem den 6. kodon af α1-ΑΤ og initieringskodonen.

25 For at forbedre ekspressionsmængden af de afkortede proteiner blev ribosombindingsstedet på pTG983 erstattet med et syntetisk ribosombindingssted betegnet RI, som har den i fig. 5 viste struktur, og som er indsat mellem restriktionsstederne Clal og Ndel.

DK 171064 B1 23

Ved transformation af E. coli med det vundne plasmid, betegnet pTG1904RlT2, vindes et o^-AT, som mangler de første 5 aminosyrer ved den N-terminale ende; dets ekspressionsmængde er i størrelsesordenen 15% af det totale celleprotein i 5 E. coli.

Denne ekspression måles ved densitometrisk læsning af en elektroforesegel, der er farvet med Coomassie-blåt.

De sonikerede og klarede supernatanter af de inducerede celler indeholder afkortet o^-AT; dette inhiberer på effektiv 10 måde human neutrofil elastase.

Der ses en god korrelation mellem doseringen ved radial immundiffusion og anti-elastaseaktiviteten.

Under hensyntagen til påvisningen af denne aktivitet af de nævnte afkortede derivater angår den foreliggende opfindelse 15 også farmaceutiske præparater og biologiske reagenser, der indeholder dem, især reagenser, som er nyttige ved dosering af neutrofil elastase og af thrombin.

REFERENCER

Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78. 1981, s. 6826-20 6830.

Chandra et al., Biochem. Biophvs. Res. Comm. 103. 1981, s. 751-758.

Courtney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81. 1984, s. 669-673 .

Claims (15)

1. Analog til humant o^-antitrypsin, kendetegnet ved, at det drejer sig om a) proteinet svarende til humant u1-antitrypsin, 5. hvilket -aminosyren i stilling 358 er valgt blandt arginin og de naturlige aminosyrer, som kun i ringe grad eller slet ikke oxideres, når de er indsat i et protein, og 10. de 5 N-terminale aminosyrer er fjernet, b) varianten [Leu358] α1-ΑΤ.

2. Analog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er valgt blandt [Δ1-5] [Arg358] c^-AT 15 [Δ1-5] [Leu358] o^-AT

3. Analog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er [Leu358] a1-AT.

4. Analog ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at dens struktur i nærheden af position 358 er følgende: 358 -ala - ile - pro- X - ser - ile, 25 hvor X er valgt blandt arg, gly, ala, val, ile, leu og phe.

5. Analog ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at o^-AT ikke er glycosyleret. 1 Analog ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, DK 171064 B1 kendetegnet ved, at o^-AT desuden omfatter én eller flere punktmutationer på et ikke-reaktivt sted.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af en analog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en værtscelle dyrkes, især en 5 mikroorganisme omfattende en ekspressionsvektor for den DNA-sekvens, som koder for αλ-antitrypsin, og i hvilken kodonen svarende til aminosyre 358 af det modne protein koder for arg eller en naturlig aminosyre, der ikke kan oxideres, når den er indsat i et protein.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at kodonen svarende til aminosyre 358 er valgt blandt GTC (val) og AGG (arg).

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at en værtscelle dyrkes, især en 15 mikroorganisme omfattende en ekspressionsvektor for den DNA-sekvens, som koder for a1-AT eller en analog til a^-AT, hvorfra de 15 baser ved 5'-enden er blevet slettet.

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 7-9, kendetegnet ved, at mikroorganismen er en 20 bakterie.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at bakterien er en stamme af E. coli. der er transformeret med et plasmid, som udgør ekspressionsvektoren.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at plasmidet omfatter et replika-tionsinitieringssted for E. coli. idet promotoren PL sikrer transkription af den DNA-sekvens, som koder for analogen til α1-ΑΤ.

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 7-9, kendetegnet ved, at mikroorganismen er en gær. DK 171064 B1

14. Lægemiddel, kendetegnet ved, at det omfatter en analog til a1-AT ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6.

15. Lægemiddel til behandling og forebyggelse af lunge-em-5 fysem, kendetegnet ved, at det omfatter i det mindste én analog til o^-AT ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6.

16. Biologisk reagens til bestemmelse af neutrofil elastase eller thrombin, 10 kendetegnet ved, at det omfatter en forbindelse ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6. 17. [Leu358] o^-AT til anvendelse som anticathepsin G.