JPH01191687A - ヒトα↓２−プラスミンインヒビターまたはそれと類似の蛋白質から誘導される新規蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、ヒト血漿中のα２−プラスミンインヒビター
（以下α２−　Ｐ　Ｉと称する）またはそれと類似の蛋
白質から誘導される新規蛋白質及びその遺伝子工学的手
法による製造方法を提供するものである。この蛋白質は
血液凝固防止活性ををし、心血管障害又は心血管病の予
防処置又は治療に使用することができる。

［発明の課題］ 近年、ウロキナーゼ、アンチトロンビン■（以下ＡＴ−
Ｉｎと称する）等の従来の血栓溶解剤に代わる、新しい
血栓溶解剤ないしは血液凝固防止剤として、組織プラス
ミノーゲン活性化因子、ヒトプロティンＣ等が注目され
ている。血液中に存在するセリンプロテア−ゼインヒビ
ターの一種である、α２−ＰＩは、血液凝固を促進させ
るものであり、血液凝固防止とは逆の作用を有している
。

しかし、本発明者等はそのペブタイドの一部を以下述べ
るように改変することによって、血液凝固防止的に作用
する蛋白質のできる可能性に注目した。従って本発明の
目的は血液凝固防止作用を有する新しい蛋白質を提供す
ることである。

［本発明の背景コ 本発明者等は、先に特願昭８１−１９９０５８．特願昭
８１−２８８８７５及び特願昭８２−２１１４０７号に
おいて、α２−ＰＩ及びそれをコードするＤＮＡを特許
出願した。このα、、−ＰＩは、そのアミノ末端がＡｓ
ｎ、　　Ｇｌｎ、　　Ｇｌｕ、　　Ｇｌｎ、　　Ｖａｔ
、　　Ｓｅｒ、　　Ｐｒｏ。

Ｌ　ｅｕ、　　Ｔ　ｈｒ、　　Ｌ　ｅｕ、であり、カル
ボキシ末端がＬｅｕ、　　Ｌｙｓ、　　Ｌｅｕ、　　Ｖ
ａｌ、　　Ｐｒｏ、　　Ｐｒｏ、　Ｍｅｔ。

Ｇｌｕ、　　Ｇｌｕ、　　Ａｓｐ、　Ｔｙｒ、　　Ｐｒ
ｏ、　Ｇｌｎ、　　Ｐｈｅ。

Ｇｌｙ、　　Ｓｅｒ、　　Ｐｒｏ、　　Ｌｙｓである４
５２個のアミノ酸からなる蛋白質である。これはＮ−末
端から第３６４番目のアルギニンと第３６５番目のメチ
オニンの間がプラスミンによって切断されてセリンプロ
テア−ゼインヒビター活性を発揮し、血液凝固促進的に
作用する。

また、α２−ＰＩは上記に示されたアミノ末端のペプチ
ドを介して、精製系では、水素結合的に、血漿中ではフ
ァクターＸＩによって共有結合的にフィブリンに結合す
ることが知られている（Ａｏｋｌ。

Ｎ、　ｅｔ、　ａｔ、　Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、、　
１９　；１４９〜１５５．１９８０）。

また、上記のカルボキシ末端のペプチドを介して水素結
合的にプラスミノーゲンに親和性を持つことが示されて
いる（Ｍｏｒｏｉ、　Ｍ、　ｅｔ、　ａｌ、　Ｊ、　Ｂ
ｌｏｌ。

Ｃｈｅｌｌ、、　２５１　；　５９５Ｂ　〜５９６５．
１９７Ｂ、）。これらの性質がα２−　Ｐ　Ｉのプラス
ミンとの非常に高い基質特異性を決定づけていると考え
られている。

したがって、アミノ末端、カルボキシ末端のアミノ酸配
列を保持したままで、セリンプロテア−ゼインヒビター
活性を失なわせるべく改変した誘導体は、α２−ＰＩの
セリンプロテア−ゼインヒビター活性を拮抗的に阻害す
ることに着目し本発明を完成した。

［発明の構成］ 本発明の新規蛋白質は、ヒト血漿中のα２−プラスミン
インヒビターもしくはそれと類似の蛋白質のプラスミン
によって切断されるリアクティブサイトとその周辺領域
が（ａ）欠如しているか又は（ｂ）アンチトロンビン活
性を有する蛋白質のトロンビンによって切断されるリア
クティブサイトとその周辺領域で置換されていること、
アミノ末端がＡｓｎ、　Ｇｌｎ、　Ｇｌ’ｕ、　Ｇｌｎ
、　Ｖａｌ、　　Ｓｅｒ。

Ｐｒｏ、　　Ｌｅｕ、　　Ｔｈｒ、　　Ｌｅｕ、である
こと、及びカルボキシ末端がＬｅｕ、Ｌｙｓ、　　Ｌｅ
ｕ、　Ｖａｌ、　　Ｐ　ｒｏ。

Ｐｒｏ、　　Ｍｅｔ、　　Ｇｌｕ、　　Ｇｌｕ、　　Ａ
ｓｐ、　　Ｔｙｒ、　　Ｐｒｏ。

Ｇｌｎ、　　Ｐｈｅ、　Ｇｌｙ、　　Ｓｅｒ、’　Ｐｒ
ｏ、　　Ｌｙｓであることを特徴とするものである。

本発明でいうα２−ＰＩとは、特願昭６１−２８８８７
５号に記載したアミノ酸配列の化合物を指し、そのアミ
ノ酸配列は第１図に示されている。

α２−ＰＩと類似の蛋白質とは、一部のアミノ酸が置換
されている、１以上のアミノ酸が付加されている、１以
上のアミノ酸が脱落しているあるいはこれらの置換、付
加、脱落が組合わされていることによってα２−ＰＩと
は相違しているが、全体としては類似し、その効果にお
いて均等の蛋白質を意味する。

α２−ＰＩのプラスミンによって切断されるすアクティ
ブサイトとその周辺領域とは、α２−アンチプラスミン
の第３６４番目のアルギニンと第３６５番目のメチオニ
ンとその周辺を含む２〜約６０個のアミノ酸のアミノ酸
配列のことを指す。そこに含まれるアミノ酸の数は適宜
変えることができる。特に好ましいのは第３５７番目の
アラニンから第３７２番目のバリン迄の１６個のアミノ
酸残基よりなる領域、第３４８番目のセリンから３９１
番目のバリン迄の４４個のアミノ酸残基もしくは第３４
８番目のセリンから第４０５番目のロイシン迄の５８個
のアミノ酸残基からなる領域である。

アンチトロンビン活性を有するセリンプロテア−ゼイン
ヒビターの代表的なものはＡＴ−ｍである。またＡＴ−
ｍ以外のセリンプロテア−ゼインヒビターを改変してト
ロンビンによって切断されるようになった蛋白質もＡＴ
−ＩＩＩと同様に取り扱うことができる。ＡＴ−ＩＩＩ
は、トロンビン等のセリンプロテアーゼの活性を阻害し
、α２−ＰＩとは逆に血液凝固抑制的に作用するもので
あり、そのアミノ酸配列はＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｌ。

ｔｌｓＡ、　ＩＩＩ）１８４５〜１８４Ｂ　（１９８３
）に記載されている。

ＡＴ−ＩＩＩがトロンビンを阻害する際には、ＡＴ−Ｉ
ＩＩのアミノ末端から３９３番目のアルギニンと３９４
番目のセリンの間がセリンプロテアーゼであるトロンビ
ンによって切断されトロンビンの活性部位のセリン残基
とリアクティブサイトが共有結合することによってトロ
ンビンを不活性化することが知られている（ｌｌａｒｐ
ｅｌ、　Ｐ、　Ｃ，ｅｔ、　Ａ１．　（１９７Ｂ）Ｐｒ
ｏｇ、　Ｉｌｅｍｏｓｔａｓｉｓ　Ｔｒｏｍｂ、　ｖｏ
ｌ、３．　ｐｐ１４５〜１８９）。

このＡＴ−ｍのトロンビンによって切断されるリアクテ
ィブサイトとその周辺領域とは、ＡＴ−ＩＩＩの３９３
番目のアルギニンと３９４番目のセリンとその周辺を含
む２から約６０個のアミノ酸のアミノ酸配列のことを指
す。特に好適には３８５番目のセリンから４０４番目の
アラニン迄の２０個のアミノ酸残基よりなる領域もしく
は第３７６番目のアスパラギンから４２３番目のメチオ
ニン迄の４８個のアミノ酸残基よりなる領域である。こ
れらの領域のアミノ酸は、その活性が変化しない範囲に
おいて、他のアミノ酸による置換、付加、脱落により変
更することかできる。α２−　Ｐ　Ｉのりアクティブサ
イトとその周辺領域をＡＴ−Ｉ［Ｉのリアクティブサイ
トとその周辺領域で置換するに当っては、α２−ＰＩの
３５７−３７２の１６個のアミノ酸をＡＴ−Ｈの３８５
−４０４の２０個のアミノ酸で置換するか又はα２−　
Ｐ　Ｉの３４８−３９１の４４個のアミノ酸をＡＴ−Ｉ
ＩＩの３７８−４２３の４８個のアミノ酸で置換するこ
とが好ましい。置換されるα２−Ｐｌの領域と置換する
ＡＴ−Ｉｆｆの領域はりアクティブサイトの周辺領域の
アミノ酸配列の相同性（アラインメント）に基づいて決
めることができる。すなわち、置換される領域と相同性
において対応する領域によって置換することができる。

ＡＴ−Ｉ［Ｉの３７６番目のアスパラギンから４２３番
目のメチオニン迄のアミノ酸配列は第２図に示されてい
る。

α　−アンチトリプシン（以下α１−ＡＴと称する）は
本来アンチトロンビン活性がないが、Ｎ−末端から第３
５８番目のメチオニンをアルギニンに変更したものは、
アンチトロンビン活性をもつことが知られている（Ｎａ
ｔｕｒｅ、　ｖｏｌ、３Ｌ３゜ｐｐ１４９〜１５１　（
１９８５））。このように人為的に作られたアンチトロ
ンビン活性を有するセリンプロテア−ゼインヒビターの
りアクティブサイトとその周辺領域で置換することもで
きる。この場合、置換されるべきα２−ＰＩの領−と、
置換すべきアンチトロンビン活性の物質の領域は、ＡＴ
−ＩＩＩにおけると同様に両者の相同性に基づいて決め
ることが望ましい。

本発明の雑種蛋白質は遺伝子工学の手法によって製造さ
れる。したがって本発明は該蛋白質をコードするＤＮＡ
、及び該ＤＮＡを用いて遺伝子工学的に該雑種蛋白質を
製造する方法にも関する。

α２−　Ｐ　Ｉをコードする遺伝子の塩基配列等は特願
昭８１−２Ｈ８７５及び特願昭８２−２１１４０７１．
：記載されており、その遺伝子（ＡＰＨＬ）を含むプラ
スミドｐαＡＰ３は大腸菌に形質転換されて工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌条第Ｈ５０号（ＦＥＩ
？Ｍ　ＢＰ−１３５０）として寄託されている。したが
ってα２−ＰＩをコードする遺伝子はｐａＡＰ３から切
り出して人手することが適当である。このようにして入
手した遺伝子をコードするアミノ酸が変わらない範囲で
塩基を変更することができる。

また活性が変わらない範囲でアミノ酸の変更を伴なう塩
基の変更を行なうこともできる。

ＡＴ−ｍ等のりアクティブサイトとその周辺領域のアミ
ノ酸配列に対応する遺伝子は、文献に発表されているア
ミノ酸配列および遺伝子の塩基配列をもとに化学的に合
成した短いＤＮＡ鎖を結合して作成することが適当であ
る。またＡＴ−ＩＩＩをコードする遺伝子から必要な部
分を切断して取り出すことも可能である。α２−　Ｐ　
Ｉをコードする遺伝子を改変するに当ってはα２−　Ｐ
　Ｉの遺伝子を制限酵素によって処理して欠如させる領
域を削除するか、欠如させる領域を削除した部位にＡＴ
−ＩＩＩのりアクティブサイトとその周辺領域のアミノ
酸配列に対応する遺伝子を組み込むことによって行なわ
れる。

このようにして得られた遺伝子は宿主に対応するプロモ
ーター、ターミネータ−等の発現に必要な機能を加えて
発現プラスミドを作成する。

動物細胞を宿主とする発現ベクターには、本発明の蛋白
質をコードする遺伝子の他に、転写開始を指示する真核
生物のプロモーター、転写終結を指示するポリアゾニレ
−ジョンサイトおよびこのＤＮＡベクターをＥ、　ｃｏ
ｌｔを用いて調製する時に必要な適当な選択マーカーを
コードする遺伝子を含む。この真核生物のプロモーター
の例としてはＳＶ４０初期プロモーター、マウスマンマ
リイ腫瘍ウィルス（Ｍｏｕｓｅ　Ｍａｍｍａｒｙ　Ｔｕ
ｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓ　：略してＭＭＴＶ）のプロモータ
ーおよびショウジヨウバエ熱シヨツク性蛋白−７０（Ｄ
ｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ＨｅａｔＳｈｏｃｋ　Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　７０　：略してＨＳ　Ｐ　７０）のプロモーター
等があげられる。また転写終結のシグナルの例としては
ＳＶ４０初期ｍＲＮＡポリアゾニレ−ジョンサイト等が
あげられる。

原核細胞を宿主とする発現ベクターには本発明の蛋白質
をコードする遺伝子の他に、転写開始を指示する原核生
物のプロモーター、転写の終結を指示する原核生物のタ
ーミネータ−および適当な選択マーカーをコードする遺
伝子を含む。原核生物宿主細胞の例としては大腸菌（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｌａ　ｃｏｌｔ　：Ｅ、　ｃｏｌｌと略
す）があげられる。またプロモーターの例としてはＥ、
　ｃｏｌｔの中で転写効率のいい、ｔｒｐプロモーター
やｔａｅプロモーターがあげられ、ターミネータ−の例
としては、強い終結シグナルであるｒｒｎ　Ｂリボゾー
ムＲＮＡターミネータ−があげられる。ＦＥＲＮ　ＢＰ
−１３５０として寄託されているｐαＡＰ３に含まれて
いるα２−ＰＩをコードする遺伝子は第１図に示されて
いる。

この塩基配列において１〜６の塩基配列はクローニング
に使用したＥｃｏＲＩリンカ−に由来するＥｃｏＲＩサ
イトであり、７〜２４は５′側−ノンコーディング領域
である。２５〜１４１はα２−ＰＩの前駆体にのみ結合
しているペプチド部分（いわゆるアンカ一部分）である
。１４２〜１４９７が目的とするα２−ＰＩ様物質をコ
ードする部分である。

１４９８〜１５０ＧのＴＧＡはストップコドンである。

１５０１以下には３′側−ノンコーディング領域、ポリ
Ａシグナル、及びクローニングに使用したＥｃｏＲＩリ
ンカ−由来のＥｃｏＲＩサイトがあるが、第１図からは
略されている。

動物細胞を宿主として用いるときは、２５〜１４１のア
ンカ一部分が結合している遺伝子が発現ベクターに組み
込まれる。原核細胞を宿主として用いるときはこのアン
カ一部分を削除し、その代りに翻訳開始コドンＡＴＧを
付加した遺伝子を発現ベクターに組み込む。

この塩基配列には、１１８１および１３５５で開裂する
Ｓ　ａｅ　Ｉサイトが存在する。したがって、α２−Ｐ
Ｉのリアクティブサイトとその周辺領域を欠如させたり
、置換するときには、このＳ　ａｃ　Ｉを利用するのが
便利である。

本発明は更に前記ＤＮＡを使って目的とする蛋白質を発
現するようにしたＤＮＡを含むプラスミドベクター及び
そのプラスミドＤＮＡでトランスフオームした原核また
は真核細胞にも関する。

以下に実施例により詳細に説明する。

（以下余白） 参考例　１ α２−プラスミンインヒビターｃＤＮＡを使った大腸菌
での発現ベクターの作成 Ｅ、　ｃｏｌｌ　Ｋ１２１０ａ＋２１４（ＦＥＲＮ　Ｂ
Ｐ−１３５０）を培養して得られるプラスミドｐαＡＰ
３をＥｃｏＲＩ切断しＴ４ＤＮＡポリメレースで平滑化
後、第２表中の１４２７の塩基の位置でＨｌｎｄＩＩＩ
で切断した。そのアミノ末端を含むフラグメントをｐＵ
ｃ１８（アンピシリン耐性、国立予防衛生研究所遺伝子
バンクより入手可能、寄託番号Ｖ　Ｅ　００７）のＴ４
ＤＮＡポリメレースによって平滑化したＰｓｔｌサイト
とＨ１ｎｄｕサイトとの間に挿入し、ｐαＡＰ５とする
。一方、１５０７の塩基の位置でＦ　ｏｋ　Ｉ切断後Ｔ
４ＤＮＡポリメレースにより平滑化してのちに、１４２
７でＨＩｎｄＩＩＩ切断して得られた（Ｚ　２−　Ｐ　
１のカルボキシ末端をコードする領域を含むフラグメン
トをｐＨ５Ｇ３９９　　（クロラムフェニコール耐性、
同上遺伝子バンクより入手可能、寄託番号Ｖ　Ｅ　０２
４）のＨＩｎｅＩＩサイトとＨｌｎｄＩ［Ｉサイトとの
間に挿入し、ｐαＡＰ６とする。次に、ｐａＡＰ５とｐ
αＡＰ６をＨｉｎｄｍで切断後ライゲートしアンピシリ
ンとクロラムフェニコールの二重耐性のプラスミドを選
択しｐαＡＰ７とする。

ｐαＡＰ７は、α２−ＰＩのコーディング領域全体（２
５〜１５００の１４７８　ｂｐ）を含み５′上流域をＡ
ｃｃｌで、３′下流域をＸｂａｌで切り出す事ができる
。

他方、ｐＨ３Ｇ２９ｇ　　（カナマイシン耐性、同上バ
ンクより入手可能、寄託番号Ｖ　Ｅ　０１８）のＳ　ａ
ｃ　Ｉサイトと５Ｉｌａｌサイトの間をそれぞれの酵素
による切断とＴ４ＤＮＡポリメレースによる平滑化によ
って欠失させたクローニングベクターｐＨ５Ｇ２９７の
ＡｃｃｌとＸｂａｌの間に、ｐαＡＰ７の（２２−Ｐ　
ＩのＡｅｃｌとＸｂａｌで挾まれたｃＤＮＡを挿入し、
ｐａＡＰ８　（第３図）とする。

一方、発現ベクターである、ｐＨ５Ｇ７４１　　（第４
図、アンピシリン耐性、同上バンクより入手可能、寄託
番号Ｖ　Ｅ　０４０）は、トリプトファンプロモーター
とりボゾームＲＮＡ遺伝子ｒｒｎＢのターミネータ−を
もちその間に、ＮｃｏＩ、　　Ｐｓｔｌ。

ＥｃｏＲＩ　ｓ　Ｈｉｎｄ　ｍサイト等のクローニング
サイトをこの順に持っている。まずこのプラスミドのＥ
ｃｏＲＩサイトと平滑化したＨｌｎｄＩ［［サイトの間
に６７６の位置のＥｃｏＲＩサイトから３′下流域にあ
るＸｂａ、Ｉサイトを平滑化した所までを挿入する。

この結果、ＸｂａＩサイトは再生する。次に、このプラ
スミドのＮｃｏＩサイトとＰｓｔＩサイトの間に化学合
成した次のようなフラグメントを挿入する。

３’　ＴＴＧＧＴＣＣＴＣＧＴＣＣＡＣＡＧＧＧＧＴＧ
ＡＡＴＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＣＣＣＧＴＴＧＧこ
のフラグメントの最初にある粘着末端ＣＡＴＧは、ｐＨ
５Ｇ７４１のトリプトファンプロモーターとＳＤシーク
エンスのすぐ後ろにあるＮｃｏｌサイトの粘着末端に相
補的になっており、かつこのうちＡＴＧは、α２−ＰＩ
の翻訳開始コドンになっている。二番目のコドン以下は
同蛋白質のリーダーシーフェンスを除＜１４２以下の塩
基に相当し第一番目のアミノ酸以下のＡｓｎ−Ｇｌｎ−
Ｇｌｕ−ＧＩｎ等をコードしている。後ろの粘着末端は
２３８）Ｐｓｔｌサイトの粘着末端に相補的になってい
る。

次に、このプラスミドのＰ　ｓｔ　ＩサイトとＥｅｏＲ
Ｉサイトの間にｐαＡＰ８のａ　２−　Ｐ　ＩのｃＤＮ
Ａ部分の残り、２３ＢのＰｓｔＩサイトと８７８のＥｃ
ｏＲＩサイトの間のフラグメントを挿入しｐαＡＰ２１
３　　（第５図）を完成させる。

実施例　１ α２−ＰＩのりアクティブサイトとその周辺領域（３４
ｇ−４０５）の５８アミノ酸を欠如する蛋白質を大腸菌
によって発現させるプラスミドベクターの作成 ｐ　ａ　Ａ　Ｐ　２１３をＳ　ａｃ　Ｉで消化し、１１
８１および１３５５ノ位置で開裂させ、ａ　２−　Ｐ　
Ｉ　（’）　３４ｇ−４０５０５８個のアミノ酸に相当
する塩基を除去した。これをライゲートすることにより
、３４８−４０５の５８個のアミノ酸を欠如する蛋白質
をコードするプラスミドｐαＡ　Ｐ　２１Ｂを作成した
。これがコードする蛋白質をＰＩ−Ｒ−０と呼ぶ。

実施例　２ α２．−　Ｐ　Ｉのリアクティブサイトとその周辺領域
が欠如する蛋白質を動物細胞によって発現させるプラス
ミドベクターの作成 参考例１で作成されたプラスミドのひとつｐαＡＰ８は
α２−ＰＩをコードするｃ−ＤＮＡの両端がＡｃｃＩと
Ｘｂａｌではさまれている。このｐαＡＰ８のα２−　
Ｐ　Ｉのリアクティブサイトおよびその周辺領域を含む
二つのＳ　ａｃ　Ｉにはさまれた５８個のアミノ酸残基
をコードする部分をＳ　ａｃ　Ｉにより除去し、ＤＮＡ
ポリメラーゼにより再結合することで、ｐαＡＰ９とい
うプラスミドを作成した。

次に、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０初期ｍＲＮ
Ａポリアゾニレ−ジョンサイトおよび動物細胞でのＤＮ
Ａ複製開始部位を含むＤＮＡ断片（ファルマシアジャパ
ン社より市販されているｐＫＳＶ−１０や米国ベセスダ
リサーチラボ社より市販されている５Ｖ４ＧＤＮＡより
単離作成できる）およびｐＢＲ３２２（宝酒造などより
市販されている）由来の大腸菌でのＤ　Ｎ　Ａ複製開始
部位およびアンピシリン耐性遺伝子からなるプラスミド
を作成する。このプラスミドのＳＶ４０初期プロモータ
ーとＳＶ４０初期ｍＲＮＡポリアゾニレ−ジョンサイト
の間に、ＡｃｃＩとＸｂａｌを含むポリリンカーＤＮＡ
断片を化学合成して組み入れる。

このポリリンカ一部位のＡｃｃｌとＸｂａＩの間に、ｐ
ｃｒＡＰ９から同様にＡｃｃｌとＸｂａＩで切り出した
りアクティブサイトおよびその周辺領域を欠失したα２
−ＰＩをコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を組み込
み、動物細胞での発現プラスミドベクターを完成した。

実施例　３ α２−ＰＩのりアクティブサイトを含む領域（３４ｇ−
３９１）の４４アミノ酸残基をＡＴ−Ｈの相当する領域
（３７Ｂ−４２３）の４８アミノ酸残基で置換した蛋白
質を大腸菌によって発現させるプラスミドベクターの作
成 ｐ　ａ　Ａ　Ｐ　２１３を５ａｃＩで消化し、１１８１
および１３５５の位置で開裂させ、α２−ＰＩの（３４
８−４０５）の５８個のアミノ酸に相当する塩基を除去
した。−方、ＡＴ−Ｈの３７６番目のアスパラギンから
４２３番目のメチオニンまでと、α２−　Ｐ　Ｉの３９
２のグリシンから４０５のロイシンまでをコードするオ
リゴヌクレオチドを以下の断片に分けて化学的に合成し
た。

（以下余白） 芸　　六　　　　　　　　宴　込　− 断片Ａと断片Ｂの前半分がＡＴ−ｍの３７８−４２３の
アミノ酸に相当する部分であり、断片２の後半分はα２
−ＰＩの３９２−４０５のアミノ酸に相当する部分であ
る。断片Ａ及びＢにおけるＡＴ−ｍのｃＤＮＡ配列はＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
。

ｖｏｌ、８０．　ｐｐ１８４５〜１８４８　（１９８３
）に基づいている。

ただし、フラグメント中にコーディング領域の上流から
アミノ酸配列を変えないようにＢｇｌｌ。

Ｈｌｎｄ　ｍ、　　ＸＩＩｌａｍ、　　ＢａｍＨＩの各
サイトが導入されている。ついで断片Ａと断片Ｂをライ
ゲートし、断片Ａ＋Ｂを調整した。この断片Ａ＋Ｂをｐ
αＡ　Ｐ　２１３の三箇所のＳ　ａｃ　Ｉサイトの間に
挿入し、上流からＢｇｌＩ、　Ｈｉｎｄ　ｍ、　Ｘ１ａ
Ｉ［Ｉ。

ＢａｍＨＩサイトの順に並んでいるクローンを選択し、
これをｐαＡＰ２１４とした。これによってコードされ
る蛋白質をＰＩ−ＲＡＴ−Ｌと呼ぶ。

実施例　４ α２−　Ｐ　Ｉのリアクティブサイトを含む領域（３５
７−３７２）の１６アミノ酸残基をＡＴ−ＩＩＩの相当
する領域（３８５−４０４）の２０アミノ酸残基で置換
した蛋白質を大腸菌によって発現させるベクターの作成 ｐ　ａ　Ａ　Ｐ　２１３をＳ　ａｃ　Ｉで消化し、１１
８１および１３５５ノ位置で開裂させ、α２−　Ｐ　Ｉ
　ノ（３４８−４０５）の５８個のアミノ酸に相当する
塩基を除去した。

一方α２−ＰＩの（３４ｇ−３５６）のアミノ酸、ＡＴ
−ＩＩＩの（３８５−４０４）のアミノ酸およびα２−
ＰＩの（３７３−４０５）のアミノ酸に相当するペプチ
ドをコードするオリゴヌクレオチドを以下の断片に分け
る化学的に合成した。

（以下余白） 盲　メ　菖　　　　　　　　　肖　込 これをライゲートし、断片Ｃ＋Ｄを調整した。

この断片Ｃ＋ＤをｐαＡＰ２１３の三箇所のＳ　ａｃ　
Ｉサイトの間に挿入し、得られたプラスミドをｐαＡＰ
２１５と名付けた。これがコードする蛋白質をＰＩ−Ｒ
ＡＴ−３と呼ぶ。

実施例　５ ｐαＡＰ２１３．ｐαＡ　Ｐ　２１Ｂを使った、α２−
ＰＩ及びα２−ＰＩのリアクティブサイトが欠失した蛋
白質ＰＩ−Ｒ−０の大腸菌に一１２株中での発現と、そ
のアンチプラスミン活性大腸菌Ｋ　−１２株、Ｗ３１１
０　（Ａ　Ｔ　ＣＣより入手可能、Ａ　Ｔ　ＣＣ２７３
２５）をｐαＡＰ２１３．１）αＡＰ２１８またはｐＨ
３Ｇ７４１でトランスフオームし、アンピシリン耐性の
ものを選択する。ＬＳ培地（Ｉｌａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇ
ｏｔｏｈ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｉｎｓｅｌｂｕｒｇ、　Ｊ
。

＜　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１３９．　（１９
７９）　６０８−６１９＞所載）でアンピシリン存在下
に３７℃で一晩培養する。これを、１ｍｌとり、同じ培
地１００ｍ１に接種する。３７℃で１時間４５分振盪培
養後遠心沈澱により細胞を回収しカザミノ酸培地（１０
，５ｇ、に２ＨＰＯ４；４．５ｇ、ＫＨ２０Ｐ４；２．
Ｏｇ、（ＮＨ４）　２Ｓｏ４；２．Ｏｇ、　ＮＨ４Ｃｆ
１　　；　０．５ｇ、　　Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ　　φ
２　Ｈ２０；　０．５　ｍｌ、１％塩酸チアミン；１％
ブドウ糖；１％ビタミンアッセイ用カザミノ酸；１００
ｇ／ｍｌ、アンピシリン；１ｆＩ水）に懸濁する。この
時点を０時間とし、振盪培養を更に続け、１．５時間後
、２．５時間後、３．５時間後、５．０時間後に０Ｄ５
５ｏ−０，０５相当の培養液（７，５μｇから４５μｇ
）を取り出し、細胞を回収後５ＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液
に懸濁して、１０％アクリルアミドゲルに電気泳動する
。これをウェスターンブロッティング法により解析する
。−次抗体としては、ラビット抗ヒトα２−ｐｔ抗血清
（ＣＡＬＢ１０ＣＨＥＭ１８）１７８２２２）を使用し
た。ｐαＡＰ２１３およびｐαＡ　Ｐ　２１Ｂとも、０
時間では何も見えないが、１．５時間後、３．５時間後
、５．０時間後には、各々分子量約５２Ｋｄおよび約４
０Ｋｄの所に鮮明な一本のバンドが見られた。

５．０時間後のｐαＡ　Ｐ　２１３およびｐαＡ　Ｐ　
２１Ｂのウェスタンブロッティングのパターンを第６図
に示す。図中レーン１はｐαＡ　Ｐ　２１３を持つ大腸
菌Ｗ３１１０の溶菌液のものであり、レーン２はｐαＡ
Ｐ２１Ｂを持つ大腸菌Ｗ３１１０の溶菌液のものである
。この時、対照に行った、ｐＨ８Ｇ７４１ではどの時点
でもいかなるバンドも見られなかった。

ｐαＡＰ２１３．ｐαＡ　Ｐ　２１ＢおよびｐＨ８Ｇ７
４１由来の溶菌液をラビット抗ヒトα２−プラスミンイ
ンヒビターポリクローナル抗体を用いて、ＥＬ　Ｉ　Ｓ
Ａ法で測定した。ヒトプラズマ由来の精製されたα２−
ＰＩを用いたスタンダードカーブから換算して、溶菌液
１ｍｌあたりｐαＡ　Ｐ　２１３では２８■（または培
養液１　ｍｌあたり　９．６ｇ）、ｐαＡ　Ｐ　２１Ｂ
では、１．Ａｕｇ（同０．４８ｑ／ｍｌ）の免疫反応性
のα２−ＰＩが観察された。ただし、後者では、リアク
ティブサイトが欠如しているので値は過小評価されてい
る可能性が大きい。この時、ｐＨ８Ｇ７４１を用いた実
験では、検出限界以下（≦０．２■／培養液ｍｌ）であ
った。

この３．５時間後の培養液４０ｍ１を取り、遠心沈澱後
、細胞を三共株式会社製α２−ＰＩ測定用キットくα２
−ＰＩカラーテスト「三共Ｊ　　（Ｎα４８７８３）　
＞付属のａ　　−ＰＩ用緩衝液１１！Ｉｌｌ　（ＯＤ５
５ｏ−２０）に、懸濁する。これを２．５ｍｌとり、０
，５ＭＥＤＴＡを、８０ｕＱ、　５　ｍｇ／　ｍｌ　Ｉ
Ｊゾチームをａｏｏμａ。

上記緩衝液を１４０μＱ加えて、総量　３　ｍｌとし０
℃に３０分放置する。続いて、超音疲破砕を１０秒間ず
つ７回行って、細胞を壊す。これを、１１８００　Ｘ　
ｇで遠心し溶菌液を回収する。この時、リゾチームを含
む総蛋白質濃度は、３．１−ｇ／ｍｌであった。この時
、ｐαＡＰ２１３由来の溶菌液では総蛋白質量１２５Ｒ
，２５０■、５００■あたりの、対ヒトプラズマ比の抗
プラスミン活性はそれぞれ８０％。

１４０％、２２０％であった。ｐαＡ　Ｐ　２１８を使
うた大腸菌では約ｌＯ％〜２０％で、対照に用いたｐＨ
８Ｇ７４１を使った大腸菌との間に有意の差は見られな
かった。

（以下余白） 実施例　６ ｐαＡＰ２１３．ｐαＡＰ２１４．ｐαＡＰ２１５を使
った、α　−ＰＩとそのＡＴ−ｍとの雑種蛋白質である
ＰＩ−ＲＡＴ−Ｌ、Ｐｌ−ＲＡＴ−８の大腸菌に一１２
株中での発現と、そのアンチプラスミン活性 大腸菌に一１２株、Ｗ３１１０　（Ａ　Ｔ　ＣＣより入
手可能、Ａ　Ｔ　ＣＣ２７３２５）をｐαＡＰ２１３．
ｐαＡＰ２１４、ｐαＡＰ２Ｌ５およびｐＨ８Ｇ７４１
でトランスフオームし、アンピシリン耐性のものを選択
する。これらのトランスフォーマットについて、実施例
５と同様の手順により培養しウェスターンブロッティン
グ法による解析を実施した。ｐαＡＰ２１３、ｐａＡＰ
２１４．　　ｐ（！ＡＰ２１５とも、０時間では何も見
えないが、１．５時間後、３．５時間後。

５．０時間後には、分子量約５２Ｋｄの所に鮮明な一本
のバンドが見られた。５．０時間後の各々のトランスフ
ォーマットの菌体懸濁液および溶菌液のウェスターンブ
ロッティングのパターンを第７図に示す。

レーン１はｐαＡＰ２１３を持つ大腸菌ｗａｉｏｏ株の
菌体懸濁液のものであり、レーン２はｐαＡＰ２１３を
持つ大腸菌Ｗ３１００株の溶菌液のものであり、レーン
３はｐαＡ　Ｐ　２１４を持つ大腸菌ｗａｔｏ。

株の菌体懸濁液のものであり、レーン４はｐαＡ　Ｐ　
２１４を持つ大腸菌Ｗ３１００株の溶菌液のものであり
、レーン５はｐαＡ　Ｐ　２１５を持つ大腸菌Ｗ３１０
０株の菌体懸濁液のものであり、レーン６はｐαＡ　Ｐ
　２１５を持つ大腸菌Ｗ３１００株の溶菌液のものであ
る。

この時、対照に行った、ｐＨ８Ｇ７４１ではどの時点で
もいかなるバンドも見られなかった。

ｐαＡ　Ｐ　２１３由来の溶菌液をラビット抗ヒトα２
−プラスミンインヒビターポリクローナル抗体を用いて
、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で測定したところ、２８ｇ／ｍｌ　
（または培養液に換算して９．６４／ｍｌ）、ｐαＡＰ
２１４．ｐαＡＰ２１５では、７〜１ｋｇ／ｍｌの免疫
反応性のα２−ＰＩが観察された。ただし、後二者では
、ＡＴ−ＩＩＩとの雑種蛋白質であるので値は過小評価
されている可能性が大きい。この時、ｐＨ５Ｇ７４１を
用いた実験では、検出限界以下（≦０．２■／培養液ｍ
ｌ）であった。

この３．５時間後の培養液４０ｍ１を取り、遠心沈澱後
、細胞を三共株式会社α２−ＰＩ測定用キット〈α２−
Ｐ！カラーテスト「三共」　（魔４ｇ７８３）　＞付属
のα２−　Ｐ　Ｉ用緩衝液１１ｍ１　（ＯＤ５５０　＝
２０）に、懸濁する。これを２．５ｍｌとり、０．５Ｍ
ＥＤＴＡを、８０ｕＱ、　５＋ａｇ／ｍｌリゾチームを
３００ｕＬ上記緩衝液を１４０μす加えて、総量３ｍｌ
とし０℃に３０分放置する。続いて、超音波破砕を１０
秒間ずつ７回行って、細胞を壊す。これを、１１８００
　ｘ　ｇで遠心し溶菌液を回収する。この時、リゾチー
ムを含む総蛋白質濃度は、３．ｌａ＋ｇ／ｍｌであった
。この時、ｐαＡ　Ｐ　２１３由来の溶菌液では総蛋白
質量１２５　ｔａｘ、　　２５０μｇ、　　５００■あ
たりの、対ヒトプラズマ比の抗プラスミン活性はそれぞ
れ８０％、１４０％。

２２０％であった。対照に用いたｐＨ５Ｇ７４１．およ
びｐαＡＰ２１４．ｐαＡ　Ｐ　２１５を使った大腸菌
では、いずれも１０％から２０％の範囲内であった。

以上よりｐαＡＰ２１３．ｐαＡＰ２１４．ｐαＡＰ２
１５はいずれも、大腸菌中でα２−ＰＩまたはそのＡＴ
−ｍとの雑種蛋白質を生産しており、ｐαＡＰ２１３が
生産する蛋白質は抗α２−ＰＩ抗血清に反応し抗プラス
ミン活性を有することが、またｐαＡＰ２１４．ｐαＡ
Ｐ２１５が生産する蛋白質は抗α２−プラスミンインヒ
ビター抗血清には反応するが抗プラスミン活性は有しな
い事が解る。

実施例　７ ＨＰＬＣによるα２−ＰＩ及びそのリアクティブサイト
欠如変異体の精製 ｐαＡＰ２１３．ｐαＡ　Ｐ　２１Ｂ及びｐＨ５Ｇ７４
１をもった大腸菌の実施例５に述べられたように調製さ
れた溶菌液を調製し、それをマイレックスフィルター（
日本ミリボア社製、５ＬＶＯ２５ＬＳ）を用いて濾過し
た後、以下の様にＨＰＬＣによるゲル濾過を行ってα２
−ＰＩおよびその欠如変異体を部分精製した。カラムは
ＴＳＫ　−Ｇ３０００５ＷＧ（２１，５＋ａｍＸ８００
ｍ＋ｓ）　　（東ソー■）を使用し、０．７５Ｍ　Ｎ　
ａ　Ｃ１を含む１０１１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ
１１７．２）を流速３ｍｌ／分でトータル約２１０　ｍ
ｌカラムに流した。上記溶菌液１ｍｌをＨＰＬＣにアプ
ライし３　ｍｌ　／　Ｆｒａｃｔｉｏｎで分取したとこ
ろα２−ＰＩは分子量５２Ｋｄ、溶出開始後７０分、そ
の欠如変異体は分子量的４０Ｋｄ、溶出開始後９０分の
ところに溶出されることが５ＤＳ−１０％アクリルアミ
ドゲル電気泳動法により確認された。こうして得られた
α２−プラスミンインヒビターおよびそのリアクティブ
サイト欠如変異体（ｐαＡ　Ｐ　２１８）は１００ｍ１
の大腸画壇・養液あたり、精製されたヒトα２−ＰＩを
スタンダードにして前述のポリクローナル抗体を使った
ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法で測定した値でそれぞれ、１１４■お
よび５．７４であった。精製倍率は約１５倍で総蛋白質
量はそれぞれ１８８０ｕｇと２０８０■であった。総蛋
白質量でそれぞれ１１００ｎをＳＤＳ　−ＰＡＧＥに電
気泳動してウェスターンブロッティング法で調べたとこ
ろ、はぼ同一の太さの鮮明な一本のバンドが見られた。

これは、精製前の溶菌液を用いた実験でも同様であった
。これらの事より、ＥＬＩＳＡの値によるα２−ＰＩの
見掛は上の蛋白質の量の差は、実際の量の差ではなく同
抗体に対する、アフィニティーの差を反映しているもの
と思われる。（大腸菌で発現したα２−ＰＩのヒト血清
由来のα２−　Ｐ　Ｉに対する同抗体に対するアフィニ
ティーの差は不明なのでこれらの値の絶対値は真実を反
映していない可能性がある。）

【図面の簡単な説明】

第１図はα２−ＰＩをコードする遺伝子の塩基配列およ
びα２−ＰＩのアミノ酸配列である。図中の数値は、＊
印をつけた塩基の番号及びアンダーラインを付したアミ
ノ酸の番号である。 第２図はＡＴ−ＩＩＩの３７６番目から４２３番目のア
ミノ酸配列である。 第３図はプラスミドｐαＡＰ８の制限酵素地図である。 図中（Ｆｏｋｌ）及び（ＥｃｏＲＩ）はライゲーション
によって消失したサイトである。 第４図はプラスミドｐＨ３Ｇ７４１の制限酵素地図であ
る。 第５図はｐαＡＰ２１３の制限酵素地図である。 図中（ＮｃｏＩ）はライゲーションによって消失したサ
イトである。 第６図はｐαＡ　Ｐ　２１３およびｐαＡ　Ｐ　２１Ｂ
の溶菌液のウェスターンブロッティングのパターンを示
す図である。 第７図はｐαＡＰ２１３．Ｉ）αＡ　Ｐ　２１４および
ｐαＡＰ２１５の菌体懸濁液および溶菌液のウェスター
ンブロッティングのパターンを示す図である。 特許出願人　　へキストジャバン株式会社ｕ　　　（Ｊ
　　　ｕ−Ｅ−４ｏ　　　＜Ｅ−４（Ｊ山ＣＪＣ：）　
　　（、）＜　　　＜−（Ｊｏ４ａａ　　　Ｑ−輻　　
　　　　　＞　　　　　　　４３　　　　　　　　Φ　
　　　　　　Φコ　　　　　　　句　　　　　　　＆＋
　　　　　　　Φ　　　　　　　Φ−−Ｊ：ｉ、ｅニー ０　　　　く　　　　←　　　　山　　　　−一　　　
　　Φ　　　　−−Φ ４Ｊ　　　　　−Ｉ　　　　　Ｃ１００！　　　　　−
の　　　　−　　　　〉〉− 飄　　　　−−コ　　　　　− 一　　　　　燭　　　　　＆＋ａＪ　　　　　ぶａ＞＜
　　　　　−ｈ コ　　　　−　　　　　＝　　　　　Ｑ　　　　　ｃ：
＝ｓ　　　　　　ｍ　　　　　　ｏ　　　　　　ｏ　　
　　　　＝＋−−１−　　　　　１−＋　　　　　　４
ＪＯく　　　　出　　　　山　　　　− 第３図 第６図　　　第７図 手続補正書 平成元年３月　３　日 特許庁長官　　吉　１）文　毅　　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第１５７６２号 ２、発明の名称 ヒトα２−プラスミンインヒビターまたはそれと類似の
蛋白質から誘導される新規蛋白質３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　東京都港区赤坂８丁目ｌＯ番１６号名称　へキス
トジャパン株式会社 ４、代理人 ７、補正の内容 ｌ）第１５頁第６行の「第２表」を「第１図」と補正し
ます。 ２）同頁第８行の「アミノ末端を含む」を「ａ２−ＰＩ
のアミノ末端をコードする部分を含む」と補正します。 ３）同頁第１Ｏ行のｒＴ４ＤＮＡ」をｒＨｉｎｄｍサイ
トとＴ４ＤＮＡＪと補正します。 ４）同頁第１１〜１２行の「とＨｉｎｄｌｌＩサイトと
」を削除します。 ５）第１７頁第３〜７行の「このプラスミドの・・・・
・次に、」を削除します。 ６）第１８頁第１行の「を除＜１４２以下」を「をコー
ドする部分を除く１４２以下」と補正します。 ７）同頁第６〜９行のｒｐａＡＰ８のαｚ−ｐ＋の・・
・・・完成させる。」を次のとおりに補正します。 ｒ　ｐ　ａ　ＡＰ８から得られる２３６のＰｓｔｌすｒ
　）　トロ７６（７）ＥｃｏＲｌサイトの間のフラグメ
ントを挿入する。 次にこのプラスミドのＥｃｏＲＩサイトと平滑化したＨ
ｉｎｄｍサイトの間にｐ　ａ　ＡＰ８から得られたα２
−ＰＩの６７６の位置のＥｃｏＲＩサイトから３′下流
域にあるＸｂａ　Ｉサイトを平滑化した所までを挿入す
る。この結果、Ｘｂａ　Ｉサイトは再生し、ｐａＡＰ２
１３（第５図）の構築が完成する。」８）第１９頁第１
２行のｒＤＮＡポリメラーゼ」をｒＴ４ＤＮＡライゲー
ス」と補正します。 ９）第２３頁第１行の「断片Ａと」を「断片Ａの全部と
」と補正します。 １０）同頁第２行の「断片２の後半」を「断片Ｂの後半
」と補正します。 １１）　　第２４頁第１３行の「断片に分ける」を「断
片に分けて」と補正します。 １２）　　第２７頁第７行の「２．５時間後、」を削除
します。 １３）　　第３０頁第１１行および第１７〜１８行の「
トランスフォーマット」ヲ「トランス７オーマント」ト
補正します。 以上

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト血漿中のα＿２−プラスミンインヒビターも
   しくはそれと類似の蛋白質のプラスミンによって切断さ
   れるリアクティブサイトとその周辺領域が（ａ）欠如し
   ているか又は（ｂ）アンチトロンビン活性を有するセリ
   ンプロテア−ゼインヒビターのトロンビンによって切断
   されるリアクティブサイトとその周辺領域で置換されて
   いること、アミノ末端がＡｓｎ．Ｇｌｎ．Ｇｌｕ．Ｇｌ
   ｎ．Ｖａｌ．Ｓｅｒ．Ｐｒｏ．Ｌｅｕ．Ｔｈｒ．Ｌｅｕ
   ．であること、及びカルボキシ末端が【遺伝子配列があ
   ります】であることを特徴とする蛋白質。
2. （２）第１図に記載されたアミノ酸配列を有するヒトα
   ＿２−プラスミンインヒビターの３４８−４０５のアミ
   ノ酸残基が欠如している請求項１記載の蛋白質。
3. （３）第１図に記載されたアミノ酸配列を有するヒトα
   ＿２−プラスミンインヒビターの３４８−３９１のアミ
   ノ酸残基がアンチトロンビンIIIの３７６−４２３のア
   ミノ酸残基で置換されている請求項１記載の蛋白質。
4. （４）第１図に示されたアミノ酸配列を有するヒトα＿
   ２−プラスミンインヒビターの３５７−３７２のアミノ
   酸残基がアンチトロンビンIIIの３８５−４０４のアミ
   ノ酸残基で置換されている請求項１記載の蛋白質。
5. （５）請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
6. （６）請求項５記載のＤＮＡを含むプラスミド。
7. （７）請求項６記載のプラスミドで形質転換された原核
   または真核細胞。
8. （８）請求項６記載の原核または真核細胞を培養する請
   求項１記載の蛋白質の製造方法。