JPS6339585A - 遺伝子操作による因子ＸＩＩＩａの製造 - Google Patents

遺伝子操作による因子ＸＩＩＩａの製造

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JPS6339585A
JPS6339585A JP62057902A JP5790287A JPS6339585A JP S6339585 A JPS6339585 A JP S6339585A JP 62057902 A JP62057902 A JP 62057902A JP 5790287 A JP5790287 A JP 5790287A JP S6339585 A JPS6339585 A JP S6339585A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 凝固因子Ｘｌｌ＋はを椎動物における天然の血液凝固過
程における「凝固カスケード」の最終構成員である。「
活性化フィブリン−安定化因子」、「フィブリノリガー
ゼ」或いは「血漿トランスグルタミナーゼ」とも称され
、及び以後ｒＦＸＩＩｌａＪとも称される因子Ｘｌｌ＋
の酵素的に活性な形態、因子Ｘ１ｌｌａは、分子内架橋
による先注する血栓におけるフィブリン単位の融合を触
媒する〔ローランド等（Ｌｏｒａｎｄ　ｅＬ　ｅｌ、）
メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｌ＋ｏｄｓ
　ｉｎ　ＩＥｎｚｙｏ＋ｏｌｏｇｙ　８０（１９８１）
。
３３３−３４１　　、カーティス等（Ｃｕｒｔｉｓ　ｅ
ｔ　ａｌ、）ＡｎｎａｌｓＮｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄ
ｅｍｙ　ｏｒ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　１９８３，５［１７
−５７６１゜血漿からの第Ｘ１ｌｌ因子の分子量は約３
００ｋＤである〔ローライ等（Ｌｏｅｖｙ　ｅｔ　ａｌ
、）　、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ、１ｌＩｏｌ。
Ｃｈｅｍ、）２３［１（１９６１）２０３４　）　。活
性サブユニットＦＸｌｌｌａの分子量は約８０ｋＤであ
る〔ボーン及びシュウイック（Ｂｏｈｎ　ａｎｄ　Ｓｃ
ｈｗｉｃｋ）　、Ａｒｚｎｃｉｍｉｔ−ｔｃｌｒｏｒｓ
ｃｂｕｎｇ　２１（１９７１）１４３２２）　、因子Ｘ
ｌｌ＋の活性化に際し、トロンビンは、前駆体から、約
４ｋＤの大きさであって、３６個のアミノ酸の公知の配
列をａするペプチドを分裂する（タカギ及びトウーリト
ル（Ｔａｋａｇｉ　ａｎｄ　ＤｏｏＬｉｔｔｌｅ）　、
バイオケミストリー（１３ｊｏｃｈｅａ＋ｌ５ｔｒｙ）
１３（１９７４）７５０−７５６）　、更に、４個のア
ミノ酸を有する配列が公知である〔ホルブルソク等（Ｉ
ｌｏｌｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、）、バイオケミカル・
ジャーナル（Ｂｌｏｃｈｅｍ、Ｊ、）１３５（１９７３
）９０１−９０３〕。
本発明は、遺伝子操作によるＦＸＩＩＩａの製造方法、
これに必要なｍＲＮＡ、それから得られるｃＤＮＡ、こ
のｃＤＮＡの全部或いは一部を含有するＤ　Ｎ　Ａ　ｔ
Ｍ造及びベクター、このタイプのＤＮＡで形質転換され
た細胞及びこれらの細胞により発現されたポリペプチド
に関する。本発明は又、ＦＸＩＩＩａのアミノ酸配列の
部分配列、それにより得られた特異的抗体、これらの抗
体から製造された診断補助品、及び抗体カラム及びその
様なカラムを用いて得られたポリペプチドにも関する。
本発明のもう一つの側面は、ＦＸｌｌｌａをフードする
ＤＮＡ或いはＲＮＡの全部或いは一部を含有する診断補
助品、及びこのタイプの診断補助品を用いて体液及び組
織を検査する診断方法に関する。
更に、本発明の他の側面及びその好ましい実施態様は以
下に詳細に説明され、及び特許請求の範囲に規定される
。
ＦＸＩＩＩａ断片のアミノ酸配列は、適当なプローブの
構築のために決定されたものである。対応するペプチド
断片は、臭化シアンを用いた蛋白質分解或いは切断によ
り得られた。その様な断片のアミノ酸配列についての知
識に基づき、一つの２０ｍｅｒ及び一つの６６ｍａｒの
二つのオリゴヌクレオチドプローブを合成した。
２０ｍｅ　ｒプローブにおいては、次のアミノ酸配列に
対する全ての理論的に可能なコドンを考慮に入れ、 Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｔｈｒ−ＡＳｐ−Ｔ
ｈｒ 最後のアミノ酸の場合にはコドンの第３番目の位置を省
略した。従って、この２０ｍａｒプローブは４８倍の縮
重体、即ち該アミノ酸配列をコードする４８個の理論的
に可能なオリゴヌクレオチド全部の混合物である（後記
表１参照）。
６６ｍｅｒのプローブは、次のアミノ酸配列に基づき、
統計学的データの助けを借りて選んだ〔レイズ（Ｌａｔ
ｂｃ）　、ジャーナルφオブ赤モレキュラー・バイオロ
ジー（Ｊ、Ｍｏ１ｃｃ、Ｂｉｏｌ　、）１８３（１９８
５）１−１２）　　（後記表２参照） Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇ
ｌｙ−ＩＬｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ
−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ これらのプローブを用いてｃＤＮＡバンクのスクリーニ
ングを行なった。ｃＤＮＡは、成熟ヒト胎盤からのｍＲ
ＮＡから調製した。なお、このｍＲＮＡを胎盤から単離
し、ｃＤＮＡをそれから調製した。ｃＤＮＡにＥｃｏＲ
Ｉ末端を付与し、ファージベクターλｇｔｌｏのＥｃｏ
ＲＩ切断部位に連結した。上記プローブにより同定され
た陽性クローンλｇｔｌｏ−１２を更に分析した（第１
図）。それ自体公知の方法による配列決定の結果、ＦＸ
ＩＩｌａをコードするＤＮＡ配列が得られた。
このＤＮＡ配列を用いたｃＤＮＡバンクの再スクリーニ
ングの結果、５′　−末端の方向及び３′−末端の両方
向に拡張するクローンを更に単離した。
第１図はＦＸＩＩｌａをコードするＤ　Ｎ−Ａ配列の制
限地図を示す。“Ｎ”はコード化領域のＮ−末端を示し
及び“Ｃ“はＣ−末端を示し、及び“Ａ（８９）”は８
９塩基のポリ（Ａ）配列を示す。
この配列はＦＸＩＩｌａのコード化配列の全部を表わす
。後記表３は、判明したＤＮＡ配列（コード鎖）及びそ
れから演鐸されたλｇｔｌＯ−１１及びλｇｔｌＯ−１
２からのクローン化ｃＤＮＡ断片からのアミノ酸配列を
示す。ｃＤＮＡの全長さは、３９０５塩基対である。タ
カギ及びトウーリトル（−Ｌ掲）により見出された３６
個のアミノ酸を有するＮ−末端配列はこの判明した配列
内に存在する。この配列は表３においてヌクレオチド位
置８８及び１９８の間に連続線により示されている。
タカギ及びトウーリトルにより見出された配列に加えて
、このｃＤＮＡは１８７−１８９のヌクレオチド位置に
おいてバリンをコードする。この４個のアミノ酸を有す
るホルブルック等（上掲）により見出されたアミノ酸−
Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−は位置１０２１−１
０３２におけるｃＤＮＡによりコードされている。この
配列は同様に連続線により示されている。加えて、２０
ｍｅｒ及び６６ｍｅ　ｒオリゴヌクレオチドプローブの
位置は破線により示されている。２０ｍｅｒプローブは
１５０７及び１５２６の位置の間にハイブリダイズし、
６６ｍｅｒプローブは７６６及び８３１の位置の間にハ
イブリダイズする。
本発明に従えば、変更された生物学的特性を有する蛋白
質をコードする変成された遺伝子の製造にこのコード化
ｃＤＮＡを用いることが可能である。この目的のために
、それ自体公知の方法で削除、挿入及び塩基交換を行な
うことが可能である。
宿主の選択によりＦＸＩＩＩａへの変成の性質に影響を
及ぼすことも可能である。即ち、細菌においてはグリコ
ジル化がないのに対し、酵母細胞において生ずるそれは
高等真核生物におけるそれと異なる。
ＦＸＩＩｌａのアミノ酸配列を知れば、ポリクローナル
或いはモノクローナル抗体の製造に抗原として作用する
ことのできるアミノ酸の部分配列を通常の方法或いは遺
伝子操作により製造することが可能である。その様な抗
体は診断目的のみならず、それを用いてこの因子を他の
蛋白質に加えて食付する溶液からＦＸＩＩＩａを除去す
ることが可能である抗体カラムの製造にも使用すること
ができる。
このＤＮＡ或いはその部分を用いて、直裁的にゲノムバ
ンクからＦＸＩＩｌａをコードするゲノムクローンを単
離することも可能であり、またそれを用いてそれを真核
生物細胞内に発現することが可能であるのみならず、更
に診断情報を得ことも可能である。
ＦＸ！Ｉｌａ欠陥は、前駆体の酵素の活性形態に転換す
ることができないことに大きく帰せられる各種症候群を
生じ得る。ＦＸｌｌｌａのｃＤＮＡについての知識によ
れば、今やそれを用いて遺伝的変成か存在するか否かを
直裁的に確立することが可能である診断補助品の製造す
ることが可能である。
即ち、本発明に従えば例えば、ウィルスその他の蛋白質
による１６染の如何なる危険性もなしに高純度の因子Ｘ
ＩＩＩａを製造することが可能である。
合口まて／ｊ在していた原料源としてヒト血漿或いは胎
盤への依（ｆはかくして克服された。加えて、本発明に
よれば、貴重な診断補助品及び従って遺伝的ＦＸＩＩｌ
ａ欠陥の分析ができるようになる。
以ド、本発明を具体的により詳細に説明する。
特に断りのない限り、パーセントは量に関連しない場合
にはｉｒｉ：　ｆｌｍに関する。
本文で説明するものの他、次の省略を用いた：ＥＤＴＡ
−エチレンジアミン四酢酸ナトリウム５ＤＳ−１’デシ
ル硫酸ナトリウム ＤＴＴ　　−ジチオスレイトール ＢＳＡ　　−ウシ血を青アルブミン。
例： ］、ヒト胎盤からのＲＮＡの単離 ＲＮＡは成熟ヒト胎盤から得られた〔チルギン等（Ｃｈ
ｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）、バイオケミストリー（
Ｂｉｏｃｌｃｍｉｓｔｒｙ）　１ｇ（１９７９）５２９
４−５２９９の方法による〕約１０ｇの胎盤組織を液体
窒素中で粉砕し、０．１ＭのメルカプＩ・エタノールを
食付する８０ｍ１の４Ｍグアニジニウムチオシアネー１
・中に懸濁させ、ホモジナイザー（ＵＩ　ＬｒａＬｕｒ
ｒａｘ）中で２０．００Ｏｒｐｍにて９０秒間処理した
。溶解物を７０００　ｒｐｍで１５分間遠心分離しく５
ｏｒｖａｌ　１ＧＳＡ　Ｏ−ター）、２ｍｌの１Ｍ酢酸
及び６０ｍ１の無水エタノールを上澄液に添加し、これ
を−２０℃で一晩沈澱させた。６０００　ｒｐｍ及び−
１０°Ｃにおいて１０分間沈降後、核酸を４０　ｍｌの
７．５Ｍグアニジニウム塩酸塩（ｐＨ７，０）中に完全
に溶解し、１ｍｌの１Ｍ酢酸及び２０ｍ１の無水エタノ
ールの混合物で沈澱した。ＤＮＡを除去するために、こ
の沈澱を半分の容量でもう一度繰返した。
ＲＮＡを１２ｍ１のＨ２Ｏに溶解し、１．２ｍｌの４Ｍ
酢酸カリウム及び２４ｍ１の無水エタノールの混合物で
沈澱させ、沈降させ、及び最終的に１０ｍ１の水に再溶
解した（ｇ組織当り１ｍ１）。
ポリ（Ａ）を含有するｍＲＮＡを単離するために、ｊ冶
盤ＲＮＡをＬｉＣ１中の２ｍｌバスツウールビベノ！・
内でオリゴ（ｄＴ）　　−セルロースクロマトグラフィ
により分別した〔アビブ及びレーダー（Ａｖｉｖ　ａｎ
ｄ　Ｌｃｄｃｒ）　、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、ＵＳＡ６９（１９７３）ｉ４０８−１４１２　
）。約５ｍｇの胎盤ＲＮＡを緩３ｉｉｆＪｊｌ　　［５
００ｍＭ　　Ｌ　ｉ　ＣＬ　２０ｍＭｔ　ｒ　ｉ　ｓ　
　（ｐＨ７，５）　、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ。
０、　１％５ＤＳ）中においてカラムにかけた。ポリ（
Ａ）”　ＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）　　−セルロースに結
合したのに対し、ポリ（Ａ）−ＲＮＡは再び溶出するこ
とができた。緩衝液２　（１００ｍＭＬｉＣ１，２９ｍ
Ｍ　　ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ
、０．１％５ＤＳ）で洗浄後、ポリ（Ａ）”　ＲＮＡ　
（胎盤ｍＲＮＡ）をカラムから緩衝液３〔５ｍ〜１　　
ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、０．
０５％ＳＤＳ：ｌで溶出した。
史に精製するために、ポリ（Ａ）　　ＲＮＡを緩衝液１
に対して調整し、オリゴ（ｄＴ）　　−セルロース上で
再クロマトグラフィを行なった。この第２回目の精製工
程の後、胎盤ポリ（Ａ）”　ＲＮＡの収率は使用ＲＮＡ
の約４％であった。
ｃＤＮＡ合成前に、ポリ（Ａ）を含有する胎盤ｒｎＲＮ
Ａが完全であることのチエツクを１．５９６アガロース
ゲル内で行なった。
次いで４μｇの胎盤ｍＲＮＡを６５．５μｇのＨっ０中
に溶解し、７０℃で１０分間変成し、再び水中で冷却し
た。２０μｇのＲＴ　ｉ緩衝液〔４２℃における２５０
ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ８、２）、２５０ｍＭ　
　ＫＣＩ、３０ｍＭＭｇＣ１，））　、２．５ｕＯの２
０ｍＭ　　ｄＮＴＰ（即ち全ての四つのデオキシヌクレ
オチドトリホスフェート）、１μｇの１μｚ　／　ｍｌ
オリゴ（ｄＴ）、１μｇのＩＭＤＴＴ、２μΩのＲＮＡ
５ｉｎ及び８μｇの逆転写酵素（２４Ｕ／μｊｉを添加
後、ｃＤＮＡを１００μｆＪ混合物中において４２°Ｃ
で９０分間合成した。
二本鎖ｃＤＮＡ　（ｄｓＤＮＡ）は、ガブラー及びホフ
マン（Ｇｕｌ＋ｌｃｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｌ’ｍａｎｎ）
の方法〔ジーン（Ｇｅｎｅ）２５（１９８３）２６３−
２８９１により合成した。この合成は、ｃＤＮＡ合成の
直後に３０５．５μｇのＨ２０−８０ｕ　ＤのＲＴ、緩
衝液（１００ｍＭｔ　ｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ７，５）　、
２５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．５００ｍＭ　　ＫＣＩ、５０
ｍＭ　　ＤＴＴ、２５０μｇ／ｍ１ＢｓＡ）　、２ｔｔ
ＤのＲＮａｓｅＨ（２Ｕ／μｐ＞、２．５μｇのＥ、ｃ
ｏｌｉＤＮＡリガーゼＣ５Ｕ／ｕｌ））　、５ｔｔｌ）
の１５ｍＭ　　β−ＮＡＤ、及び５μｇのＤＮＡポリメ
ラーゼＩ　（５Ｕ／μｇ）を添加し、１５℃において５
時間インキュベーションすることにより行なった。この
反応を熱不活性化（７０℃、３０分）により停止させた
。
５５μｇの２５０μＭ　　ｄＮＴＰ、５５μｇの１０ｍ
Ｍ　　ｔｒｉｓ　　（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣ１
２，１０μｇ／ｍ１ＢｓＡ、３ａｌｌのＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（ＩＵ／μｇ）、２μｇＲＮａｓｅＨ（２Ｕ
／μＲ）及び２ｕｌ）のＲＮ　ａ　ｓ　ｅ　Ａ　（２ｕ
　ｇ／ｍｌ）を添加後、反応液を第２番目のＤＮＡ鎖上
におけるポリメラーゼＩの誤った合成を修正するために
３７℃において更に３０分間インキュベートした（「修
１（反応」）。
ｄｓＤＮＡへのＥｃｏＲＩリンカ−の連結及びリンカ−
の開裂 胎盤ｃＤＮＡバンクを組立てるために、このｄｓＤＮＡ
にファージベクターλｇｔｌｏのＥｃｏＲＩ切断部位に
おいてそれを連結できるようにＥｃｏＲＩ末端を付与し
た（Ｔ、マニアティス等（Ｔ、ＭａｎｉａＬｉｓ　ｅＬ
　ａｌ、）、（１９８２）　、モレキュラー・クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、実験室
マニュアル、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ
〕ｏこの目的のために、ｄ　５ＤＮＡを ａ）　　ｄｓＤＮＡの内＃ＥｃｏＲＩ切断部位を保護す
るためにＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し一２ｂ）　　Ｅ
　ｃ　ｏ　ＲＩリンカ−を付与し、それらをＣ）　次い
でＥｃｏＲＩで開環させた。
ａ）について： ｄｓＤＮＡのメチラーゼ反応は、修復反応の直後に２５
μＮの５００ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８、０’）　６
０μｇのメチラーゼ緩衝液〔１００ｍＭＮａ０Ａｃ　（
ｐＨ５，２）　、２ｍｇのＳ−アデノシル−し−メチオ
ニン〕及び２μｇのＥｃｏＲ１メチラーゼ（２０ｕｌμ
ｍ）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートさせて
行なった。
反応液をフェノールで抽出し、ｄ　５ＤＮＡを６０μｇ
の４Ｍ　　Ｎａ０Ａｃ及び１３００μ、Ｑのエタノール
で沈澱させた。ｄｓＤＮＡを２回７０９６エタノールで
洗浄し、エーテルと振盪させて１同抽出し、乾燥させた
。
ｂ）について： このＥｃｏＲＩ−メチル化ｄｓＤＮＡを８８μｇのＨ２
０に溶解し、１０μｇのりガーゼ緩衝液（５００ｍＭ　
　ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ７，４）、１００ｍＭ　　Ｍ
ｇＣ１つ、１００ｍＭ　　ＤＴＴ。
１０ｍＭスペルミジン、１０ｍＭ　　ＡＴＰ。
１　ｍｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ〕及び１μＮのＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（ＩＯＵ／μｇ）を添加後、１μｇのＥｃｏＲ
１リンカ−（０，５μｇ／μｇ） （ｐＧＧＡＡＴＴＣＣ及びｐＡＧＡＡＴＴＣＴ）と１５
℃において一晩かけて連結させた。
Ｃ）について： このリガーゼ混合物の容量を６μｇのＨ２Ｏ，１２ｕｌ
）の１０ｘＥｃｏＲＩ緩衝液及び２μｇのＥｃｏＲＩ　
（１２０Ｕ／ｕＲ）で１２０μｇに調合した。ＥＣ０Ｒ
Ｉ消化は、３７°Ｃで２時間行なった。
ｄｓＤＮＡから全ての未結合ＥｃｏＲＩリンカ−を除去
するために、ＥｃｏＲＩ反応混合物を全部酢酸カリウム
勾配（５−２０％ＫＯＡｃ、１ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１ｕ
ｎ　／ｍｌエチジウムブロマイド）にかけ、それを５０
．００Ｏｒｐｍ及び２０℃で３時間遠心分離した（Ｂｃ
ｃｋｍａｎ　ＳＷ　６５／ローター）。
この勾配をＭｖｌの五つの画分の容はが５００μρで残
りの全てが１００μｇとなるように下から分別した。こ
れらの両分を０．０１容のアクリルアミド（２５ｍｇ／
ｍｌ）及び２．５容のエタノールで沈澱させ、７００６
強度のエタノールで１度洗浄し、！し、及びそれぞれを
５μｇのＨｌ、０中にとっｔこ。
ｄ　５ＤＮＡの大きさを決定するために、１μΩの各両
分を１．５％アガロースゲル内で分析した。
更にｄｓＤＮＡの量を１μｇの各自分について求めた。
１０００　ｂ　ｐを越えるｄ　５ＤＮＡを含有する両分
を合体し、この試料を最終濃度が２７μｇ／ｍｌになる
まで濃縮した。
ｄ　ｓ　ＤＮＡのファージ−ベクターλｇｔｌ。
（ＶｅｅＬｅｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、カ
リフォルニア州、サンギイエゴ）のＥｃｏＲＩ切断部位
中への導入は、４μｇリガーゼ混合物（２μΩのｄｓＤ
ＮＡ。
１ｕＤのλｇｔ１０ｘＥｃｏＲＩ　（ｌμｇ／ｍ＋）、
］〕、４μｇのりガーゼ緩衝液、０．５μｇのＨ２Ｏ及
び０．　１μｇのＴ４ＤＮＡリガーゼ）中において行な
った。この混合物は、１５°Ｃで４時間インキュベート
した。
ファージベクターλｇｔｌＯ内で胎盤ｃ　Ｄ　Ｎ　−Ａ
バンクを確立するために、このリガーゼ混合物を次いで
λ−溶原性細胞抽出物Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｎ５４２８及び
Ｎ５４３３とのＩｎ　ｖｉｔｒｏパッケージング反応に
室温において２時間付した［ＶａｃｔｅｒＣｌｏｎｊｎ
ｇ　５ｙｓｔｃ＋ｎｓ　％カリフォルニア州、サンディ
エゴ；エンキスト及びスターンバーブ（Ｅｎｑｕｌｓｌ
ａｎｄ　Ｓｔｃｒｎｂｃｒｇ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　８８（１９７９）２８１−２
９８　’ｌ。この反応は、５００ｔｔｎの懸濁媒体［Ｓ
Ｍ：Ｏ，ＩＭ　　ＮａＣ１，８ｍＭＭｇＳＯ４，５０ｍ
Ｍ　　ｔｒｉｓ　（＋）Ｈ７，５）、０．０１’、６セ
ラチン］及び２滴のクロロホルムで停止１−させた。
力価の決定及び胎盤ｃＤＮＡバンクの分析胎盤ｃＤＮＡ
バンクのプラーク形成ｌｉ位（ＰＦＵ）の数はＥ、ｃｏ
ｌｉ　　Ｋ１２株Ｃ６００ＨＦ　Ｌのコンピテント細胞
を用いて決定した：それはｌＸｌ０６ＰＦＵであった。
約８０％のファージか１０００塩基対より大きいＤＮＡ
インサートを金白゛した。
二つのオリゴヌクレオチドプローブ（２０ｍｅｒプロー
ブ及び６６ｍｅｒプローブ）を胎盤ＣＤＮＡ／＜ンクを
分析するために合成した。それらの配列は、ＦＸＩＩＩ
ａのいくつかの蛋白質分解及びＢｒＣＮ断片のアミノ酸
初期配列から演鐸した。
場合によっては重複する、従ってより長いアミノ酸配列
が見出されたが、これらによって極めて長いプローブ即
ち６６ｍｅｒプローブの合成が可能となっ／こ。
２Ｑｍｅｒプローブは、アミノ酸配列Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−
Ａｓｐ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒに対する全て
の理論的に可能なコドンが考慮された通常のＤＮＡプロ
ーブである（末端アミノ酸Ｔｈｒの場合には「ゆらぎ」
位置と称されるコドンの第３番目は省略された；表１参
照）。この２０ｍｅｒプローブは従って４８倍縮重体、
即ち該アミノ酸配列に対する全ての４８個の理論的に可
能なコード化オリゴヌクレオチドの混合物である。
６６ｍｅ　ｒプローブの構成方法及び使用は、レイズ（
Ｌａｔｈｅ）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１８３（１９８
５）１−１２の原則に本質的に従った。６６ｍｅｒプロ
ーブを構成するために二つの３９ｍｅｒプローブを合成
した（次の配列を有する３９ｍｅｒ、Ａ： ５’　ＴＡＴＧＧＣＣＡＧＴＴＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡ
ＴＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＴＧＴＣＴＧ３’及び次の配列
を自゛する３９ｍｅｒＢ：５’　ＧＴＣＣＡＴＣＴＧＣ
；ＧＣＣＣＧＧＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＡＣＡＧＡＣＡＧ
ＧＴＧＴＣ３’　）、３９ｍｅ　ｒＡ及び３９ｒｎｅｒ
Ｂは、二つの配列のハイブリダイゼーションの結果長い
遊離５′末端が生ずるように１２個の塩基よりなる相補
的配列を一釘する。
これらの二つの３９ｒｎｅｒプローブは（２０ｍ　ｅ　
ｒプローブと同様に）５′末端において（γ−３２Ｐ）
　−ＡＴＰ　（約１μｇのＤＮＡ、（γ−３２Ｐ）−Ａ
ＴＰ　：　３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０μＣｉ／μｇ
、６μΩ／４０μｇの反応混合液使用）の存／１：下に
おいてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで１雲識した。２
０ｍａ　ｒプローブは１×１０　　Ｂｑ／μｇ或いは１
．５ｘ１０６Ｂｑ／ｐｍｏ　Ｉの比活性を釘した。二つ
の３９ｍａ　ｒプローブは９５°Ｃで５分間加熱し、混
合し、及び低温室内で４°Ｃに徐々に冷却してハイブリ
ダイズさせた。
次いで、約１μｇのハイブリダイズされた３９ｍｅｒプ
ローブをＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノ’ｙｍｊ片で（
ａ−３”Ｐ）−ｄＡＴＰ　（３０００Ｃ１１０Ｉ［ｌＩ
Ｏ＋、１０　μＣｉ　／　μｇ、４μρ１５０ｕ１反応
混合物）を添加して処理した〔５′→３′埋填（ｒ　ｉ
　ｌ　ｌ　ｉｎｇ−ｉｎ）反応〕。この埋填された６６
ｍｅｒプローブは１．５ｘｌＯ８Ｂｑ／μｇの比活性を
角シた。これらのＤＮＡプローブは一２０°Ｃにおいて
貯蔵した。２０ｍｅｒプローブは直ちに分析（スクリー
ニング）のために用いたのに対し、６６ｍｅｒプローブ
は予め９５℃において５分間加熱し、次いで水浴内で迅
速に冷却した。
６６ｍｅ　ｒプローブは二つの３９ｍｅｒのハイブリダ
イゼーションに引続き５’−３’埋填反応により生成さ
れたので、各種実験を行なうことが可能である。一方に
おいて、ｃＤＮＡバンクを変性された６６ｍｅｒｂＮＡ
プローブとハイブリダイズさせることが可能であり、他
方において、次いで陽性のクローンを３９ｍｅｒＡ及び
Ｂプローブと個々にハイブリダイズさせることが可能で
ある。
長いプローブ及び二つの短い３９ｍｅ　ｒプローブＡ及
びＢの両者とハイブリダイズするクローンか所望の配列
をもつ確率は極めて高い。即ち、以上説明した長い、複
雑なオリゴヌクレオチドプローブを構成し、部分的に相
捕的な短いＤＮＡプローブを用いてクローンを「再スク
リーニングする」方法は特異性の向」二を表わす。加え
て、長いオリゴヌクレオチド及びその部分的にｔ目捕的
な短い部分オリゴヌクレオチドを用いて向」−シた特異
性を有するゲノムバンクをスクリーニングすることが可
能である。該方法のもう一つの利点は、より短いオリゴ
ヌクレオチドの合成をより簡１１に且つより高い収率及
び精度を用いて行なうことができることである。二つの
酵素反応、即ち１）　（γ−３２Ｐ）−ＡＴＰ標識付け
のためのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、及び２）（α
−３２Ｐ）−ｄＮＴＰの添加によるＤＮＡポリメラーゼ
埋填反応、の順序はより高い比活性（少なくともｌＸｌ
０８Ｂｑ／μｇＤＮＡ）を得ることが可能であることを
意味する。
２０Ｉ：ｒ１ｅｒプローブ及び６６ｍｅｒプローブを用
いて、５Ｘ１０５ＰＦＵの胎盤ｃＤＮＡバンクをＦＸＩ
ＩＩａをコードするｃＤＮＡ配列について調べた。これ
には、１３．５ｃｍのペトリ皿内の軟寒天中でＥ、ｃｏ
ｌｉ　　Ｋ１２株Ｃ６００ＨＦＬの細胞で培養され、３
７℃で６時間インキュベートされた３Ｘ１０４ＰＦＵを
伴った。この時までに生じた如何なる溶解も尚不完全で
あった。これらのプレートを冷蔵庫内で一晩インキユベ
ートし、ファージをニトロセルロースフィルターに移し
な〔シュライヒヤー及びシェル（Ｓｃｈｌａｉｃｈｅｒ
　＆５ｃｂｕｅｌｌ）、１３Ａ　８５．Ｒｅｌ’、Ｎｏ
、４０１１２４　〕（二重）。これらのニトロセルロー
スフィルター及びペトリ皿を引続き割当てを行なうため
に注射針で印をつけた。これらのベトリ皿はニトロセル
ロースフィルターの処理の際に低温室に貯蔵した。ニト
ロセルロースフィルター上のＤＮＡはフィルターを１．
５Ｍ　　ＮａＣ１，０，５Ｍ　　ＮａＯＨを含浸させた
濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｍ　３）上に５分間置くことに
より変性した。これらのフィルターを次いで１．５Ｍ　
　ＮａＣ！、０．５Ｍ　　ｔｒｉｓ　（ｐＨ８，０）を
用いて同一方法で再変成し、２×５ＳＰＥ　（０，３６
１ＶＩ　　ＮａＣ１，１６ｍＭＮ　ａ　ＯＨ−２０ｍＭ
　　Ｎ　ａ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４，２ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄し
た。これらのフィルターを次いで８０℃で２ａ、＋７間
真空乾燥した。これらのフィルターを３ＸＳＳＣ，０，
１％ＳＤＳ　（２０ＸＳＳＣ−３ＭＮａＣ１，０，３Ｍ
　　Ｎａクエン酸塩）で６５°Ｃにおいて４時間洗浄し
、６５℃において４時間予備ハイブリダイズした（予備
ハイブリダイゼーション溶液；０．６？ｖｌ　　ＮａＣ
１゜０、　０６Ｍｔ　ｒ　ｉ　ｓ　　（ｐＨ８，３）　
　、６ｍＭＥＤＴＡ、０．２９６非−イオン性合成スク
ロース屯合体（ＲＦｉｃｏｌｌ）、０．２％ポリビニル
ピロリドン４０，０．２％ＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ、５
０μｇ／ｍｌ変性にしん精子ＤＮＡ）、これらのフィル
ターをおだやかに振盪しながらビーカー或いは密封ポリ
エチレンフィルム内で／％イブリダイゼーション溶液（
にしん精子ＤＮＡのない予備ハイブリダイゼーション溶
液）のｍ１当り１００．０００〜２００，０００Ｂｑの
標識オリゴヌクレオチドを添加して一晩インキユベート
した。２０ｍｅｒ及び３９ｍｅ　ｒプローブに対するハ
イブリダイゼーション温度は４２℃であり、６６ｍｅｒ
プローブに対するそれは４７℃であった。
これらのニトロセルロースフィルターは６×５ＳＣ１０
，０５Ｍピロリン酸ナトリウムで室温において１時間及
び特別のハイブリダイゼーション温度において更に１時
間洗浄した。これらのフィルターを乾燥し、−晩オート
ラジオグラフィにかけた。二車のｘＨフィルムの両者に
生ずる信号をペトリ皿に割当て、その領域（約５０プラ
ーク）をパスツールピペットの広い末端で切抜き、ファ
ージを１ｍｌの５Ｍ緩衝液に再懸濁した。陽性ファージ
を？１１−クローンが得られるまで３回に亘って選抜し
た。
合計５Ｘ１０５ＰＦＵの胎盤ｃＤＮＡバンクをｖＩ継代
において調べた。二重フィルター七に１７個の信号が確
認された。より緊縮な条件下で更にスクリーニングを行
なったところ尚陽性である７個の信号を得た。これらの
７個のＰＦ、Ｕのうち１個のＰＦＵのみが２Ｑｔｎｅｒ
及び６６ｍｅ　ｒプローブによるハイブリダイゼーショ
ン及び３９ｍｅｒプローブＡ及びＢによる！−イブリダ
イゼーションの後共に陽性の信号を示した。この以後λ
ｇｔｌｏ−１２と称されるークローンはＦＸＩＩＩａを
コード化し、及び内部ＥｃｏＲＩ切断部位を有する１７
０４塩基対の配列を有する。サザーンプロット分析は、
５４０塩基対のより小さいＥｃｏＲ１断ハは２０ｍｅ　
ｒＤＮＡプローブとハイブリダイズし、１１６４塩基対
のより大きい断片は６６ｍｅｒＤＮＡプローブとハイブ
リダイズすることを示している。
再スクリーニング時に、サザーンプロットから３９ｍａ
ｒプローブＢよりも３９ｍｅ　ｒプローブＡとより多く
の反応があることが判明した。引続きクローンλｇｔｌ
ｏ−１２の配列分析によって、６６ｍｅｒプローブの全
長に互ってＦＸＩＩｌａに見出された配列に対して僅か
に７個の不適性塩基対があるに過ぎないことが判った（
表２）。これらの７個の不適性塩基対は次のように分布
している。
即ち３９ｍｅ　ｒＡプローブに３個の及び３９ｍｅｒＢ
プローブに５個の不適性塩基対がある（一つの不適性塩
基対は重複領域にあり、従って両者に共通である）。３
９ｍｅｒＢにおける５個の不適性塩基対は一団となって
おり、これがおそら＜　３９ｍｅ　ｒＢプローブの場合
におけるより弱いハイブリダイゼーション信号の理由で
あると思われる。
よる胎盤ｃＤＮＡのスクリーニング ５４０塩基対及び１１６４塩基対長さの二つのサブクロ
ーン化ＥｃｏＲＩ断片を市販のベクターｐＵＣ８（１１
６４ｂｐ−ｐＵＣ８−１２，１及び５４０ｂｐ−ｐＵＣ
８−１２，２）のＥｃｏＲＩ切断部位切断部口中ン化し
、それから調製的にＥｃｏＲＩにより１ｉｉｌｌｉｌし
、及び（α−”２Ｐ）−ｄＮＴＰの存在下にニック−ト
ランスレートした。
両断片の比活性はｌＸ１０８Ｂｑ／μｇＤＮＡであった
。これらの（３２Ｐ）　　−標識断片を数継代において
用いて胎盤ＣＤＮＡ／＜ンクの約１×１０６個の組換え
ファージを調べ（ハイブリダイゼーション温度６５°Ｃ
）、かくして１３個のハイブリダイズするファージを確
認した。これらのファージは単一均質ファージ挿木が得
られるまで３回に亘って選抜した。各ファージの２０ｍ
１溶解物を調装し、ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡをＥ
ｃｏＲＩで消化し、１％アガロースゲル」−で分別した
。このゲルをサザーンプロット技術に対し、ニトロセル
ロースフィルター 断片とハイブリダイズさせた。１１個のファージがハイ
ブリダイゼーション信号を示した。このニトロセルロー
スフィルターを沸騰させ、ニット−トランスレートされ
た１１６４ｂｐＥｃｏＲＩ断片とハイブリダイズさせた
。７個のファージがハイブリダイゼーション信号を示し
た。
ハイブリダイズする断片の大きさに基づいて、λｇｔｌ
Ｏ−１２に対比してλｇｔｌｏ−２０のように５′末端
方向及びλｇｔｌｏ−１１のように３′末端の方向の両
者に拡張するクローンを確認することが可能であった。
これらのクローンを用いて完全なＸ１ｌｌａ　　ｃＤＮ
Ａ配列を決定することが可能であった。内部制限部位を
用いることにより或いは重複配列のハイブリダイゼーシ
ョンにより、存在した部分配列を組合わせることが可能
であった。この完全なｃＤＮＡ配列は発現ベクター中に
連結し、適当な原核或いは真核系内において発現するこ
とができる。
ＤＮＡ配列分析 ファージクローンλｇｔｌｏ−１２を増殖し、ＤＮＡを
抽出した。二つのＥｃｏＲＩ断片を単離し、プラスミド
ベクターｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ部位中に部位−ン化した
。ｐＵＣ８−１２，１は１１６４塩基対断片を有し、ｐ
ＵＣ８−１２，２は５４０塩基対断片を有する。
１７０４塩基対よりなる全断片を単離するために、λｇ
ｔｌＯ−１２をＥｃｏＲｌで部分的に消化し、１７０４
塩基対バンドを単離し、ｐｌＣ１９Ｈ〔マーシュ等（Ｍ
ａｒｓｈ　ａｔ　ａｌ、）Ｇｅｎｅ　３２（１９８４）
４８１−４８５〕のＥｃｏＲ１部位中に部位−ン化した
。得られたプラスミドをｐｌＣ１９Ｈ−１２と称する。
クローンｐＵＣ８−１２，１、ｐＵＣ８−１２，２及び
ｐｌＣ１９Ｈ−１２のＳａｕ　　３Ａ。
Ａｌｕｌ及びＴａｑｌ小断片をｐｔｙｃプラスミド及び
Ｍ１３ファージにクローン化した後関連領域をサンガー
（Ｓａｎｇｅｒ）のジデオキシ法及びマクサム及びギル
バート（ＭａｘａＩＩｌａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）の化
学的ｈ゛法を用いて配列決定することにより、１７０４
ｂｐ断片の配列を決定することが可能であった（表３）
。この配列は１個のみの開放読取枠を示し、因子Ｘ１ｌ
ｌａ分子の最初の５４２個のアミノ酸をコードする。
クロ−２ス −１２及びクローンλｇｔｌｏ−１１及びλｇｔ１　０
−２０の制限分析は、適当な１ｌｔ−及び複数消化及び
スミス及びビルンスチールの方法（ＳｍＪＬＩｂｌｌ、
Ｏ．ａｎｄ　ＢｉｒｎｓＬｉｅｌ　、Ｍ．Ｌ．、ヌクレ
イツク・アシッズ・リサーサ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１
ｄｓ　Ｒｅｓ．）３（１９７Ｂ）２３８７−　２３９８
］による（３２Ｐ）−標識断片の部分消化の両者により
行なった（第１図）。
クローンλｇｔｌｏ−１１は２４３２ｂｐの大きさの内
部ＥｃｏＲＩ切断部位を有する断片を有する。この断片
は３′末端における２３７ｂｐによりλｇｔｌｏ−１２
からのｃＤＮＡ断片と重複し、コード化配列の残りの５
７０Ｍプラス８９塩基のポリ（Ａ）配列を含む非−コー
ド化領域の１６２５ｂｐよりなる。約７００ｂｐの大き
さのｃＤＮＡ断片を有するクローンλｇｔｌｏ　　２０
は又５′末端にλｇｔｌｏ−１２よりも６個多い塩基を
有する（ＧＡＧ　　ＧＡＡ・・・）。
２、発現されることができ、ＦＸｌｌＩａをコード化出
発クローンλｇｔｌＯ−１１及びλｇｔ１０−１２を用
いてＦＸＩＩｌａ　　ＣＤＮＡ（７）全コード化領域を
含有するプラスミドを得た。部分ＥｃｏＲ１の消化の助
けにより、λｇｔｌＯ−１２の１７０４塩基対よりなる
挿入物をｐｌｃ１９Ｈ（マーシュ等１−掲）のＥｃｏＲ
１部位にクローン化した。得られたプラスミドｐＩＣ１
９Ｈ−１２、１を引続き使用した（第２図参照）。この
クローンλｇｔｌＯ−１１は２４３２塩基対の大きさの
挿入物を有し、内部ＥｃｏＲＩ切断部位を角”する。１
２２４塩基対の大きさであり、コード化配列のＣ−末端
５７０塩基対プラス３′非−コード他領＋４の６５４塩
基対を有する左側（「５−末端Ｊ：）ＥｃｏＲＩ断片を
同様にｐｌｃ１９ＨのＥｃｏＲ１切断部位にクローン化
した。得られたプラスミドｐｌｃ１９Ｈ−１１．１を引
続き使用した（第２図）。これらのプラスミドｐ　ＩＣ
１９Ｈ−１２．１及びｐｊｃ１９Ｈ−１１．１はベクタ
ー中の同一配向においてＦＸＩＩＩａに対するコード化
領域を釘し、２３７塩基対よりなる市１賃領域を白°す
る。この重複領域を用いて部分クローンｐｌｃ１９Ｈ−
１２，１及びｐｌＣ１９Ｈ−１１，１から全コード化領
域を釘するクローンを構成した。これは上記二つのプラ
スミドからの１ｎｖｉｔｒｏでのハイブリダイゼーショ
ン（第２図）による部分的一本鎖へテロ二ｍ鎖分子の調
製及び反応混合物のＥ、ｃｏｌｉ中への形質転換を伴う
ものであった。細菌の修復機構（酵素ＤＮＡポリメラー
ゼエの３’　−５’　エキソヌクレアーゼ活性、５’　
−３’　重合活性）を利用して、全コード化領域をａす
るプラスミドを得た。具体的には、これはプラスミドｐ
ｌｃ１９Ｈ−１２，１（Ｃ１ａｌ＝消化）及びｐｌｃ１
９Ｈ−１１，１ （ＢａｍＨＩ−消化）の各々の１μｇのＤＮＡを混合し
、エタノールで沈澱するものであった。
ＤＮＡを真空乾燥し、２０μｇのＨっＯ中にとり、５μ
ΩのｌＮＮａＯＨを添加後、室温において１０分間イン
キュベートした。次いで次のものを示される順序に従っ
て添加した４２００μｇのＨ２Ｏ，２５，ｃｚＮのＩＭ
　　ｔｒｉｓ、ＨｃＩ（ｐＨ８，０）及び　５０μｇの
０．１ＮＨＣ１，反応混合物を６５°Ｃで３時間イキン
ユベ＝トシ、エタノールで沈澱させ、乾燥した。ＤＮＡ
を２０μΩのＨ，０中に再懸濁し、公知の方法によりＥ
、ｃｏｌｉ中に形質転換し、細胞をＬＢ＝ａ口ｌｐプレ
ート」二に乗せて一晩インキユベートした。合計９６個
のアンピシリン−耐性クローンのうち、２４個のクロー
ンをアルカリ法〔バーンボイム及びトリー（Ｂｉｒｎｂ
−ｏｌｍ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ）　、ヌクレイックーアシ
ソヅ・リサーチ（Ｎｕｅｌ、Ａｃ１ｄ１？ｃｓ、）７（
１９７９）１５１３−１５２３　）により処理し、プラ
スミドをＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及び
ＰｖｕＩＩによる制限酵素分解により特性決定した。
６個のプラスミドか期待された制限パターンを示した。
これらのプラスミドのうちの一つｐＦＸＩｌｌ−１３（
第２図）を詳細に特性決定した。これは配列決定された
２３７個の塩基対重重領域を有する。５ｔｕｌ　（位置
１２２５）−ＰｖｕｌＩ　（位置１８７０）を伴い、こ
のＤＮＡ配列は正確であることが確認された。プラスミ
ドｐ　ＦＸＩｌｉ−１３は７８ｂｐが５′非−翻訳領域
のものであり２１９６ｂｐが全コード領域であり、及び
４１９ｂｐが３′非−翻訳領域のものであるＦＸｌｌＩ
ａ　ｃ　ＤＮＡの２６９３塩基対よりなる。
ｐ　ＦＸＩｌｉ　１３は全ての引続く発現実験のための
出発プラスミドであった。
ＦＸＩｌｉ−１３はｌａｃプロモータに関して正しい配
向において、及び１ａｃＺα−ペプチドに対して正しい
読取枠内にＦＸＩＩＩａ　ｃ　ＤＮＡ挿入を有する。従
って、ｐ　ＦＸＩｌｉ−１３はＥ、ｃｏｌｉにおけるＦ
ＸＩＩＩａ融合蛋白質の合成を誘発することができる。
この蛋白質の分子口は、天然ＦＸＩＩＩａ（７）　７３
２　ｆｉｌのアミノ酸と共に１６個のベクターコード化
アミノ酸プラス５′非−コード化領域により特定される
２８個のアミノ酸よりなる。これらの４４個の追加のア
ミノ酸は融合蛋白質のＮ−末端に位置する。この蛋白質
の予想される分子口は８５．２５０Ｄ　（表４）である
。
ｌａｃプロモータの代りにより効率的なｔｒｐ／　１　
ａ　ｃハイブリッドプロモータを用いる発現プラスミド
を引続き構成した。このために、ｐＫＫ２３３−２　（
アマン及びプロシュウス（Ａｍａｎｎａｎｄ　Ｂｒｏｓ
ｉｕｓ）、ンーン（Ｇｅｎｅ）４０（１９８５）、１８
３−１９０　〕をＥｃｏＲＩで切断し、Ｂａ１３１で処
理した（第３図）。このＤＮＡを次いでＰｖｕＩＩで切
断し、２８００塩基対の大きさの断片をＦＡＡゲル」二
で精製した。この断片をＢｇｌｌｌリンカ−（５’　　
−ＣＡＧＡＴＣＴＧ）の存在下において再連結した。得
られたプラスミドｐＴｒｃ８９−１（第３図）をＮｃｏ
ｌ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、合成リンカ− ５’　　ＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡ３’３’　　ＣＴＴ
ＡＡＧＣＴＴＣＣ；Ａ５’をリガーゼ混合物中において
２８００塩基対の断片と共にインキュベートした。得ら
れたプラスミドｐＴｒｃ９６Ａ（第３図）をＥｃｏＲＩ
及びＨｉｎｄＩＩ［で切断し、２８００塩基対の大きさ
の断ｊ−１をゲル積装し、ｐＵｃ１８からの５５塩基対
の大きさのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩリンカ−と連結
した。得られたプラスミドはｐ　Ｔ　ｒ　ｃ　９７　Ａ
（第３図）である。ｐＫＫ２３３−２に対照的に、ｐＴ
ｒｃ９７Ａはプラスミド内で一度だけ存在するＮｃｏＩ
部位の下流にｐＵｃ１８からのポリリンカーをｑし、従
って数多くのクローニング部位を有する。
ｐＦＸｌｌｌ−１３中にクローン化されたＦＸＩＩｌａ
ｃＤＮＡはＡＴＧ開始コドン（位置６１）から離れてＰ
ｓｔ１部位２１塩基対５′を有する。次のＰｓｔ１部位
は３′未翻訳領域（位置２３９８）に位置する。２３３
７塩基対長のＰｓｔｌ断片がｐＦＸＩＩｌ−１３から単
離され、ｐＴｒｃ９７Ａの５ｓｔ１部位に連結された。
ＰｓｔＩ断片を所望配向に有する得られたプラスミドは
ｐ　ＦＸＩＩＩ−Ｃ４（第３ａ図）である。ｐＦＸＩ！
ｌ−Ｃ４により特性される期待されるＦＸＩＩＩ分子は
２２個の追加のＮ−末端アミノ酸を有し、それらの１５
個はベクター−コード化され及び７個はＦＸＩｌｌｃＤ
ＮＡの５′非−コード化領域により特定される。この蛋
白質の予想される分子賃は８２，３８０Ｄ　（表４）で
ある。
トロンビンを用いて３７個のアミノ−末端アミノ酸を切
断するとＦＸＩＩＩａを活性形態に転換させる。既に活
性化されたその様なＦＸＩＩＩａ分子は治療」二の興味
があるので、トロンビン切断により短くすることのでき
るＦＸＩＩｌａをＥ、ｃｏｌｉ中において発現する試み
がなされた。高い収率を得るために、クローニングは短
くされたＦＸＩＩＩａがＥ。
ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ断片に融合したハイブリ
ッド蛋白質の形態で発現されるように行なわれた。　ｐ
　ＦＸＩＩＩ−１３からの約２７００ｂｐ（７）大きさ
のＳｍａ　ｌ−Ｈｌ　ｎｄｍ断片を単離し、Ｓｍａ　Ｉ
及びＨｉｎｄＩＩ［で加水分解されたｐＢＤ２１　Ｃ２
ＯＨ中に連結した。新たなプラスミドｐＭＢ２５９　（
第３ｂ図）において、アミノ酸Ｐｒｏ　　からＭｅ　ｊ
　７３２のＦＸＩＩＩａに対するｃＤＮＡはβ−ガラク
トシダーゼの３７５のアミノ末端アミノ酸に該当する読
取枠内に位置し、それは合成された融合蛋白質からトロ
ンビン切断により活性ＦＸＩＩＩａを得ることが可能で
あるようにトロンビン切断部位Ａｒｇ３８／Ｇｌｙ３９
を有する。
発現ベクターｐＢＤ２１ｃ２０Ｈはｌａｃプロモーター
を有するｐＢＤ２〔ブローカー（Ｂｒｏｋｅｒ）ジーン
・アナリティカル・テクノロジー（ＧｅｎｅＡｎａｌ　
、’ｒｃｃｈｎ、）３（１９８６）５３−５７１中にＢ
ａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてプラスミドｐ　Ｉ
　Ｃ２０Ｈ（マーシュ等、上掲）の５８ｂｌ）よりなる
ポリリンカー領域を連結することにより構成された。
ｂ）発　現 ｐ　ＦＸＩＩＩ−１３、ｐＦＸＩＩＩ−Ｃ４或いｌ；ｔ
ｐＭＢ２５９で形質転換された菌株Ｄ２９Ａ１のＥ。
ｃｏｌｉ細胞は期待されたＦＸＩＩＩａ蛋白質を合成す
る能力があることが判明した。プラスミドｐＦＸｌｌ＋
−１３、ｐＭＢ　２５９及びｐ　Ｆ　Ｘ１ｌｌ　−Ｃ４
１，：よるＦＸＩＩＩの発現はＩ　ＰＴＧを用いて誘発
することができる。クーマシーブルー（ＣｏｏＩｌｌａ
ｓｓｌｃ　ｂｌｕｅ）で染色されたＦＡＡゲル上のＥ、
ｃｏｌｉＤ２９Ａ１　（ｐＦＸＩｌｌ−１３）　及びＤ
２９Ａ１（ｐＦＸＩＩＩ−Ｃ４）のＩＰＴＧ誘発後の蛋
白質抽出物の比較はＦＸＩＩ＋融合蛋白質の期待された
分子瓜を示した。ｒ４４　ａ　ａ　ＦＸＩＩＩ融合蛋白
質」の推定発現率はｒ２２　ａ　ａ　ＦＸＩＩＩ融合蛋
白質」のそれの約５倍である。
又、ｐ　ＦＸＩＩＩ−１３及びｐ　Ｆ　Ｘ１ｌｌ　−Ｃ
４＋：：ヨり特定されるＦＸＩＩｌａ分子は生物学的活
性を有することが判明した。これに対して、Ｅ、ｃｏｌ
ｉＤ２９Ａ１対照例の抽出物中にはＦＸＩＩ＋活性は見
出されなかった。クロット安定性アッセイ　〔カルギス
、ベルクマイヤーの酵素分析法第５巻酵素３：ペプチダ
ーゼ、ブロティナーゼ及びそれらの阻害剤、４００−４
１０頁（Ｋａｒｇｃｓ、ｉｎ　Ｂｃｒｇｆｆｌｅｉｃｒ
。
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｒＥｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙ
ｓｉｓ、Ｖｏｌｕｍｅ　５．　Ｅｎｚ−ｙｍｃｓ　３：
Ｐｃｐｔｉｄａｓｃｓ、Ｐｒｏｔｃｉｎａｓｃ　ａｎｄ
　ｔｈｅｉｒ　Ｉｎｈｌ−ｂｉｔｏｒｓ、ｐａｇｅ　４
００−４１０）所収〕において見出された活性はＥ、ｃ
ｏｌｉ　　Ｄ２９ＡＩ　（ｐＦＸＩＩＩ−ｙｍａｓ　３
：Ｐｅｐｔｊｄａｓｅｓ、Ｐｒｏｔｃｉｎａｓｃ　ａｎ
ｄ　ｔｈｅｉｒ　Ｉｎｈｉ−ｂｉｔｏｒｓ、ｐａｇｅ　
４００−４１０）所収〕において見出された活性はＥ、
　　ｃｏ　ｌ　ｉ　　Ｄ２９Ａ１　（ｐＦＸＩＩＩ　−
１３）に対してはＥ、ｃｏｌｉ培養液（ＯＤ２５゜−１
，５）に基づいて５μｇ／Ωであり、Ｄ２９−Ａ　１　
（ｐ　ＦＸＩＩＩ−Ｃ４）　ｌ：対しては１５μｇ／Ω
である。
ＦＸＩＩＩａ−特異的ＥＬＩＳＡにおいて見出された因
子Ｘ１１１の量はｐＦＸＩｌｌ−１３に対してはＥ。
ｃｏｌｔ培養液に基づいて１．５ｍｇ／Ωであり、ｐＦ
ＸＩＩＩ−Ｃ４に対しては３５ｍｇ／ｊ）である。生物
学的アッセイ及びＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいて測定されたＦ
ＸＩｌｌの量の間の食い違いは、Ｅ、ｃｏｌｉ細胞中の
ＦＸＩｌｌの主たる部分（〉９０％）が生物学的に不活
性であり７Ｍ尿素のみに溶解する不溶性沈澱の形態であ
るという事実に由来するものである。Ｅ、ｃｏｌｉ抽出
液中に存在するＦＸＩ１１分子の可溶性画分はオークタ
ロニー試験 （Ｏｕｃｈｔｃｒｌｏｎｙ　、プログレス・イン・アラ
−ジー（Ｐｒｏｇｒ、Ａｌｌｃｒｇｙ）５（１９５８）
１）において胎盤から単離されたＦＸＩＩＩのそれに実
質的に同一である沈澱曲線を示す。
不溶性蛋白質凝集物の形態でのＥ、ｃｏｌｉ内の真核生
物蛋白質の発現は数個の蛋白質について既に説明されて
いる。これらの蛋白質はその様な凝集物からカオトロピ
ック剤を用いて溶出することができ、適当再変成条件に
よりそれらの生物学的に活性形態に転換することができ
る。
４、　　ＦＸＩＩＩの酵母における発現酵母から遺伝子
操作により得られる生物学的に活性なＦＸＩｌｌの合成
はＦＸＩＩＩをコードするｃＤＮＡを酵母内において自
律的に慢製する能力を有する発現ベクター中に導入する
ことにより達成された。組換えクローンの抽出物からＦ
ＸＩｌｉ活性蛋白質を単離することが可能であった。
酵母を生育する条件及び分子生物学的方法は、デイロン
等（Ｄｌｌｌｏｎ　ａｔ　ａｔ、　　ｒ組換えＤＮＡ方
法」（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　　ＤＮＡ　　Ｍｅｔｈ
ｏｄｏｌｏｇｙ）、　　Ｊｏｈｎ　　Ｗｉｌｅｙ　　＆
５ｏｎｓ、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ（１９８５）　）及びマニ
アティス等（Ｍａｎｌａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、上掲）に
説明されている。
ＦＸＩｌｌｃＤＮＡは約２７００ｂｐ（７）大きさのＨ
ｉｎｄｍ断片としてベクターｐ　ＦＸＩＩＩ−１３から
単離され、ベクターｐＡＡＨ５’［アメラー（Ａｍｍｃ
ｒｃｒ）、メソッド・オブ・エンザイモロジ−（Ｍｅｔ
ｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ　、）ｌｏｔ　（１９８３）　１９
２−２０１１のＨｉｎｄ■部位中に部位−ン化された。
即ち、得られたプラスミドｐＨ８２４０（第４図）中ノ
ＦＸＩＩＩｃＤＮＡはアルコールデヒドロゲナーゼの遺
伝子発現信号を含有する強ＡＤＨＩプロモータの制御下
にある。このプラスミドｐＭＢ２４０をパン酵母、サツ
カロミセス・セレビ′シエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ−ｙｃ
ｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ＞、株Ｌｅｕ２−３、Ｐｅ
ｐ４−３中にイトウ等（Ｉｔｏｈ　ａｔ　ａｌ、ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｃｒｌｏ
ｌ、）１５３（１９８３）。
１６３−１６８　）の方法により形質転換し、及びＬｅ
ｕ＋形質転換体をＹＮＢ最小最小上地上択した。形質酵
母細胞の一つのコロニーを用いてＹＮＢ培地を有する液
体培養液に接種した。３０℃で２日間生育後腹合ＹＰＢ
培地中への転移を行ない、及び更に３日後細胞を遠心分
離により取出し、１００ｍＭクエン酸ナトリウムを含有
する等張塩溶液（ｐＨ７，２）中でガラスピーズミルに
より破壊した。細胞抽出物を５ｏｒｖａｌ　Ｉ高速遠心
分離器内の５Ｓ３４０−ター内で２０，０００ｒｐｍに
おいて４°Ｃで１時間高速遠心分離にかけた。
Ｓ、セレビシェ（ｐＭＢ２４０）の細胞を除去した上澄
液をウェスタンプロット法により分析した。胎盤からの
ＦＸＩＩＩと同一位置に検出することのできるバンドに
加えて、約１１６，０ＯＯＤの蛋白質が用いられた抗−
ＦＸＩＩ！血清と特異的に反応した。これは酵母中に形
成されたＦＸＩｌｌの一部がグリコジル化されたことを
証明する。蛋白質のグリコジル化はしばしば蛋白質、特
に血漿蛋白質、の半減期を延長する因子である。加えて
、蛋白質の側鎖は血漿蛋白質例えばアンチトロンビン■
の活性を増大するか或いは作用の期間を延長することが
ある。酵母において発現され、且つ胎盤から得られたＦ
ＸＩｌｌとは対照的にグリコジル化されているか或いは
その他の何等かの形で翻訳後修飾を行なったＦＸＩｌｌ
は、増大した活性のために胎盤からのＦＸＩｌｌに対し
て利点を有し得る。
細胞を除去した上澄液をＥＬＩＳＡによりＦＸＩｌｌに
ついて調べ、ＦＸＩＩＩ？ａ度が酵母培％液に基づき１
５０ｎｓｒ／ｍｌであることが判明した。ＦＸｌｌｌの
生物学的活性は上掲のカルゲスの方法により求められ、
ＥＬＩＳＡにおいて測定された濃度を確認した。パン酵
母から得られたＦＸＩｌｌの生物学的活性は抗−ＦＸＩ
ＩＩ抗体により特異的に阻害することができたので、非
−特異的ＦＫＩＩＩ様活性を様器性白質により除外する
ことが可能であった。
発現ベクターｐＳＶＡ　　５ＴＯＰＩは西独特許出願Ｐ
３６　２４　４５３・８（このベクターの合成に関する
この出願の実施例１は抜粋して付表に再現した）に提案
されている。このプラスミドの他に動物細胞におけるＦ
ＸＩＩｌａの発現のためにベクターｐＺＥＴ４　（下記
参照）及びドロソフイラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ　ｌａ）熱
衝撃蛋白質７０プロモータ〔ウルム等（Ｗｕｒｍ　ｅｔ
　ａｔ、）、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８３（１９８Ｇ）５４１４−５４１
８）を存するｐＳＰ６Ｈ３９を用いた。
ｐＺＥＴ４　（第５図）ニブラスミドｐＳＶＡＳＴＯＰ
ＩをＢａｍＨＩで切断し、２．６ｋｂの大きさでＳＶ４
０初期プロモーターを有するベクター断片を単離した。
ｐＳＶ２ｄｈｆ　ｒ　（り一等（Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、
）　、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９４（１９８１）
　　’２２８−２３２　］からの０．８５ｋｂの大きさ
のＢｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩ断片をこの様にして予備処理
されたベクター中に連結し、その結果プラスミドｐＺＥ
Ｔ４が得られた。ｐＳＶ２ｄｈ　ｆ　ｒからの０．８５
ｋｂ断片上にはエキソンーイントロン連結からのｍＲＮ
Ａスプライス部位及び５Ｖ４０ＤＮＡからのｔ抗原に対
する遺伝子のポリアデニル化部位が位置している。
ｂ）動物細胞のためのＦＸＩＩＩａ発現ベクターの横築
ｐｓＶＦ１３　（第５ａ図）：発現ベクターｐＳＶＡ　
　５ＴＯＰＩをＨｉｎｄＩ［Ｉ及びＸｂａｌで切断した
。約２．７ｋｂの大きさのＦＸＩＩＩａｃＤＮＡを有す
るｐＦＸＩＩＩ−１３からのＨｉｎｄＩ［Ｉ−Ｘｂａｌ
断片をこの様にして処理されたベクター中に連結した。
ｐＨ３Ｆ１Ｂ上）ＦＸＩＩＩａ転写単位はｍ　ＲＮ　Ａ
スプライス部位を有しない。
ｐＺＦ１３　（第５ｂ図）：約２，７ｋｂの大きさのＦ
ＸＩＩＩａｃＤＮＡを有するＨｉｎｄｎ［断片をプラス
ミドｐ　ＦＸＩｌｌ−１３から単離した。得られた５′
突出末端をｔ目補鎖内にＤＮＡポリメラーゼｌ　（フレ
ノウ断片）で埋填することにより除去した。発現ベクタ
ーｐＺＥＴ５を独特のＸｂａ１部位において切断するこ
とにより線型化した。得られた５′突出末端を同様に相
補鎖内においてＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウ断片
）により埋填することにより除去した。この埋填ベクタ
ーと内充填ＦＸＩＩＩａ　ｃ　ＤＮＡ断片の連結の結果
、ＦＸＩＩＩａ発現プラスミドｐＺＦ１３が得られた。
ｐＨ３Ｆ１Ｂにおけると同様に、ＦＸＩＩＩａ　ｃ　Ｄ
ＮＡはＳＶ４０初期プロモータの転写制御下にあるが、
しかし、ｍＲＮＡスプライス部位を備えている。
ｐＨ３Ｆ１Ｂ　（第５Ｃ図）ニブラスミドｐ　ＳＶＦ　
１３をＥＣ０ＲＩにより部分的に消化し、約２．９ｋｂ
の大きさのＦＸＩＩＩａ　ｃ　ＤＮＡに引続き初期転写
のためのＳＶ４０ポリアデニル化部位を有する断片を単
離した。この断片を熱衝撃蛋白質７０プロモータの下流
のプラスミドｐＳＰ６Ｈ８９の独特のＥｃｏＲ１部位中
に連結した。
ｃ）ＣＨＯ（支那ハムスター卵巣）ｄｈｆｒ−細胞の共
トランスフェクションのためのＤＨＦＲ発現ベクター ＤＨＰＲベクターｐＳＶ２ｄｈｆ　ｒ　　（り一等、上
掲）或いはプロモータのないＤＨＦＲプラスミドｐｓＶ
ＯＡｄｈｆ　ｒ　（西独特許出願Ｐ３６２４４５３．８
、参考側参照）をＣＨＯｄｈｆｒ−細胞における説明さ
れたＦＸＩＩＩａ発現ベクターによる共トランスフェク
ションに用いた。
両ベクター共、マウスからのＤＨＦＲｃＤＮＡを有する
。
るベクター 説明されたＦＸＩ！ｌａ発現ベクターをＢ　ＨＫ細胞内
でベクターｐ　ＲＭＨ１４０Ｃフジャック等（ｉｌｕｄ
ｚｉａｋ　ｅｔ　ａｌ、）ｃｅｌｌ　３１（１９ｇ２）
、１３７−１４６１て」１ミトランスフエクンヨンを行
なった。
ｅ）ＣＨＯ細胞内におけるＦＸ！Ｉｌａの発現ＤＨＦＲ
ベクターｐＳＶ２ｄｈ　ｆ　ｒによるプラスミドｐＺＦ
１３及び発現プラスミドｐＳＶＦ１３と共にＤＨＦＲベ
クターｐｓＶＯＡｄｈｆｒの共トランスフェクションを
、リン酸力ルンウム沈澱法〔グレアム及びファンデルＥ
　ｂ　（Ｇｒａｈａｍａｎｄｖａｎ　ｄｅｒ　ＩＥｂ　
）　、ライ００ジー（Ｖｌｒｏｌｏｇｙ）５２（１９７
３）　４５Ｂ−４６７）を用いてＣＨＯｄｈｆｒ−細胞
で行なった。これは５μｇのＤＨＦＲベクター（ｐＳＶ
２ｄｈｆｒ或いはｐＳＶＯＡｄｈ　ｆ　ｒ）と混合され
、及び共沈された２０Ｍｇの特定のＦＸＩｌｌａ発現プ
ラスミド（ｐＺＦ１３或いはｐｓＶＦｌＢ）を伴うもの
であった。二〇共沈澱物を上記トランスフェクションに
用いた（２５ＣＪ培養瓶中０．５Ｘ１０６細胞）。３日
後、細胞をトリプシン化し、３個の６０ｍｍのベトリ皿
に移し、選択培地（グリシン、ヒポキサンチン或いはチ
ミジンを含有しない）と混合した。これらの条件下に生
残る細胞はＤＨＦＲ遺伝子と安定なトランスフェクショ
ンを行なったもののみである。トランスフェクトされた
細胞のコロニーは１−３週間後にべ１・り皿上に目に見
えるようになる。この方法により次のトランスフェクシ
ョン速度が達成された： ｐＳＶ２ｄｂ　ｆ　ｒ　　　　５ｘ　１０−”／プレー
トｐｓＶＯＡｄｈｆｒ　　１．ｘｌＯ−５／プレート。
個々のクローンを単離し、グリシン、ヒポキサンチン或
いはチミジンを含有しない培地内で増殖した。
約３５ｎｇ／ｍｌの検出下限を角−する特別のＥＬＩＳ
Ａを用いて個々のクローンの培養上澄液及び細胞溶解物
中のＦＸＩＩＩａを検出した。培ｊ９」−澄液はＥＬ　
Ｉ　ＳＡにおいてそのまま使用した。細胞溶解物は次の
ようにして調製した： ２５ｃ＋ｎ２．培養瓶中の集密細胞を４０ｍＭｔ　　ｒ
　ｉ　ｓ　　　ＨＣ］　　（ｐＨ７，４）、１ｍＭＥＤ
ＴＡ、１５０ｍＭ　　ＮａＣ１中で２回洗浄し、１５０
μｇの０．２５Ｍ　　ｔｒｉｓ−ＨｃＩ（ｐＨ７，８）
　、５ｍＭ　　ＤＴＴ、２％グリセロール、０．２％洗
剤（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　１００）中にとり、及び３回冷
凍及び解凍することにより溶解した。
細胞の不溶性成分は遠心分離により除去した。
この溶解物をＥＬＩＳＡに使用するために１：２．５に
稀釈した。説明された検出方法をプラスミドｐＺＦ１３
／ｐＳＶ２ｄｈ　ｆ　ｒの組合わせに対して１７クロー
ンに適用して、ＦＸＩＩｌａを発現する一つのクローン
（ＣＨＯ５９−５−Ｃ７）が見出された。プラスミドｐ
ｓＶＦ１３／ｐｓＶＯＡｄｈｆｒで共トランスフェクシ
ョン及び１２クローンの分析後、更にＦＸＩＩｌａ−発
現クローン（ＣＨＯ６０−３−Ｃ１）が検出された。
これらの両者の陽性クローンを用いて培地内及び溶解物
中において同一の相対的量でＦＸＩＩＩａを検出するこ
とが可能であった。ＦＸＩＩＩａを生成する系統の発現
速度を定量的に求めるために次の標章的操作を行なった
二 ０．５Ｘ１０”個の細胞を２５ｃｍ２培養瓶内の５ｍｌ
の培地中で培養した。この培地は２４時間後交換した（
　５　ｍｌ　）。更に２４時間後培地を除去し、細胞カ
ウント数を求め溶解物を１凋製した。以後に述べる全て
の発現速度（ｎｇ／１０６１１Ｔ胞／２４時間）に対し
て試験の終りにおける２５ｃｍ２瓶当りの細胞カウント
数は１±０゜２５Ｘ１０６細胞数であった。次の表は、
説明された方法で試験された基本クローンの発現速度を
示す： ／２４時間）７２４時間） ＣＩ＋０５９−５−０７　　　　１．２　　　　　　　
９ＣＩ＋０６０−３−Ｃ１１７１３ ＳＤＳ電気泳動に続いてクローンＣＨＯ５９−５−０７
及びクローンＣＨＯ６０−３−ＣＩの溶解物及び上澄液
のＦＸＩＩＩａ−特異的免疫プロッティングを行なった
ところ、いずれの場合にもヒト胎盤から単離された蛋白
質の分子量を有する一つのバンドか反応を示した。
クローンＣ’　ＨＯ５９−５−Ｃ７を遺伝子増幅のため
にメトトレキセー）（Ｍｔｘ）の増大するｉＱ度に曝し
た。１０ｎＭＭｔｘの濃度及び４移動適応時間で出発し
、培地中のＭｔｘ／ａ度を５０ｎＭに増大した。次の発
現速度が標準的操作において求められた； ７２４時間）７２４時間） １’）ＢＨＫ細胞におけるＦＸＩＩＩａノ発現各々２０
ｕｇのＦＸＩＩｌａ発現プラスミドｐＺＦ１３、ｐＨ５
Ｆ１３及びｐＨ５Ｆ１３をＢ　ＨＫ細胞内において例５
ｅ）において説明されるリン酸カルシウム沈澱法により
５μｇの６４１８耐性をコードするプラスミドｐ　ＲＭ
Ｈ１４０で共トランスフェクションを行なった。３日後
、細胞をトリプシン化し、３個の６０ｍｍベトリ皿に移
し、及び４００μｇ：　／　ｍｌのＧ４１８を含量する
選択培地と混合した。１２日倹約２００−３００の０４
１８耐性コロニーが各ベトリ皿に生育していた。全部の
クローンをトリプシン化し、２５ｃＪ培養瓶中の合一し
たクローン（ＣＣ）（５ｍｌの培地）として転移させた
。
ｐＺＦ１３及びｐＨ５Ｆ１３でトランスフェクションさ
れた細胞の場合には、８０−１００％の集密度に到達し
た際にＦＸＩＩＩａを特異的ＥＬ　Ｉ　ＳＡを用いて培
地中及び関連溶解物中で決定した（例５ｅ）参照）。ｐ
Ｈ５Ｆ１３でトランスフェクションされ同様に８０　＝
　１００％の集密度に到達した合一したクローンを４２
℃に予備加熱した新たな培地と混合し、４２°Ｃで１時
間インキュベートした。培地をもう１回３７℃で平衡化
された新鮮な培地と交換した後、細胞を３７℃で２４時
間維持した。これらの培地及び溶解物を次いで上記の如
くそれらのＦＸＩＩＩａの含量について調べた。下記表
は各種合一クローンに対するＦＸＩＩＩａの細胞分布を
まとめて示すものである。
細胞外細胞内 （ｎ　ｇ）　　（ｎ　ｇ） ＢＩＩＫ−ＭＫＩ（ｐＺＦ１３）　　　６５　　２２１
３ＨＫ−ＭＫ２（ｐＺＰ１３）　　　８０　　２０ＢＩ
ＩＫ−ＭＫ３（ｐＨ５Ｆ１３）　　　８５　　１８ＢＩ
ＩＫ−ＭＫ５（ｐＨ５Ｆ１３）　　　１７０　　１１培
地内に存在するＦＸＩＩＩａに関する発現速度は例５ｅ
）において説明した標準的操作により個々の合一クロー
ンに対して求めた。以下に述べる全ての発現速度（ｎｇ
／１０６細胞／２４時間）に対して試験の終りにおける
２５ｃｍ２瓶当りの細胞カウント数は４゜５±０．５×
１０６細胞であった。
胞／２４時間） ＢＨＫ−ＭＫＩ　（ｐＺＦ１３）　　　　３．４ＢＨＫ
−ＭＫ２　（ｐＺＦ１３）　　　　５．６ＢＨＫ−ＭＫ
５　（ｐＨｓＦ１３）　　　３．８ＢＨＫ−ＭＫ６　（
ｐＨｓＦ１３）　　　３．８これまでに説明されたトラ
ンスフェクションされたＢ　ＨＫ系統は生産しない或い
はそれらの発現速度が異なる細胞を含む混合物であった
ので、引続いてクローンを単離することにより高発現速
度を有する遺伝的に均一な細胞系統を単離する試みがな
された。この目的のためには、特別の合一されたクロー
ンからの細胞を１細胞／ウエル、２細胞／ウエル又は４
細胞／ウエルの濃度でマイクロタイタープレート上に置
いた。１個のみのクローンが生育したウェルからの上澄
液をＦＸｌｌＩａ−特異的ＥＬＩＳＡにより分析した。
最高発現速度のクローンを２５印２培養瓶内で増殖させ
、それらの発現速度を上記一般的操作により検討した。
以下の表はＢＨＫ−ＭＫＩ　（ｐＺＦ１３）を上記方法
により単離することにより得られたクローンの発現速度
を示す。
ＢＨＫ　ＭＫＩ　（ｐＺＰ１３）　　　　　　　３．４
ＢＨＫ　ＭＫＬ−Ａ１２（ｐＺＩ”１３）　　　　　８
ＢＩＩＫ　ＭＫＩ−Ｅ２（１）ＺＦ１３）　　　　２５
ＢＩＩＫ　ＭＫＩ−Ｆ１２（ｐＺＦ１３）　　　　１４
ＢＩＩＫ　ＭＫＬ−Ｃ１（ｐＺＦ１３）　　　　２２Ｂ
ＨＫ細胞系統Ｍ　Ｋ　Ｉ　　Ｅ　２を例にとり、これら
の細胞により合成されたＦＸＩＩｌａ分子が生物学的活
性を育することも示された。用いられたＢ　ＨＫ　　Ｍ
　Ｋ　１−　Ｅ　２系統及び非−トランスフエクテッド
ＢＨＫ系統（陰性対照例）を１．５ｍｌの２％グリセロ
ールを含をする０、　　２５Ｍｔ　ｒ　ｉ　ｓ、ＨＣｌ
　　（ｐＨ７，８）にとった。これらの細胞を３回冷凍
及び解凍することにより溶解した後、Ｄｏｕｎｃｅホモ
ジナイザー内で処理した。不溶性構成成分を遠心分離に
より除去後、溶解物を生物学的活性に用いた（例３参照
）。次のＦＸＩＩＩａ活性が見出された： クションされない） 表１ ２０ｍｅｒプローブ、４８−倍縮重体 アミノ酸　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　
Ａｓｐ　Ｔｈｒ配列 ＤＮＡブ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＡＴＴ　ＡＣＴ　
ＧＡＴ　ＡＣＣジブ　　　　　　　ＣＣＡＣ Ｃ 表　　３ ＡＴＧＴＡ丁ＧＴＴＧＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＴＣＣＣＴ
ＡＴＧＧＣらＴＡＣｌｌＣ６＾ＡＣＣＡｌｌｃｌｉＡＡ
ＡＵＬＬＡＬＩＡＡＡＬＡＧＡＣ　ＡＴＣ＾＾Ｇ　ＡＣ
Ｃ　ＡＧＡ　ＡＧＣ　ＴＧＧ　ＡＧＣＬＡＴ　ＧＧＴク
Ｇ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＧＡＴ工ＣＣユ残≦■りＡＣ＝押
’　ＴＧＣＡＧＣＣＧ７ＧＡＧＧＧＧＴＣＴＧＣＡＡＴ
ＧＧＴＧＡＡＴＧＣＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧＡＡＧＧＴ
ＧＴＣＣＴＣＧＴＴＧＧＡ丁ＣＣＴＲＰ　ＡＳＰ　ＡＳ
ＩＩ　ＩＬＥ　ＴＹＲ　ＡＬＡ　ＴＹＲ　ＧＬＹ　ＶＡ
Ｌ　ＰＲＯ　ＰＲＯ　ＳＥＲ　ＡＬＡ　ＴＲＰ　ＴＩＩ
Ｒ　ＧＬＹ　ＳＥＩＩ　ＶＡＬ　ＡＳＰ　ＩＬＥＴＧＧ
ＧＡＣＡＡＴＡＴＣＴＡＴＧＣＣＴ＾ＴＧＧＣＧＴＣＣ
ＣＣＣＣＡＴＣＧＧＣＣＴＧＧＡＣ丁ＧＧＡＡＧＣＧＴ
ＴＧＡＣＡＴＴＬＥＵ　ＬＥＬＩ　ＧＬＬＩ　ＴＹＲ　
ＡＲＧ　ＳＥＲ　ＳＥＲ　ＧＬＬＩ　ＡＳＩＪ　ＰＲＯ
　ＶＡＬ　ＡＲＧ　ＴＹＲ　ＧＬＹ　ＧＬＩＩ　ＣＹＳ
τＲＰ　ＶＡＬ　ＰｌｌεＡＬＡＣＴＡ　ＴＴＧ　ＧＡ
Ａ　ＴＡＣ　ＣＧＧ　ＡＧＣ　ＴＣＴ　ＧＡＧ　ＡＡＴ
　ＣＣＡ　ＧＴＣ　ＣＧＧ　Ｔ＾τＧＧＣ　ＣＡＡ　Ｔ
ＧＣ　ＴＧＧ　ＧＴＴ　ＴＴＴ　ＧＣＴＧＧＴ　ＧＴＣ
　ＴＴＴ　ＡＡＣ　ＡＣ＾ＴＴＴ　ＴＴＡ　ＣＧＡ　Ｔ
ＧＣ　ＣＴＴ　ＧＧＡ　ＡＴＡ　ＣＣＡ　ＧＣＡ　ＡＧ
Ａ　ＡＴＴ　ＧＴＴ　ＡＣＣ　ＡＡＴ　ＴＡＴＴＴＣＴ
ＣＴＧＣＣＣＡＴＧＡＴＡ＾１Ｇ＾ＴＧＣＣＡＡＴＴＴ
ＧＣＡＡＡ７ＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＧ＾Ａ
ＧＡＴＧＧ［ｉ１々０２ ＬＥＤＩＬＥＴＹＲ！ＬＥＴＩＩＲＡＬＡＬＹＳＬＹＳ
ＡＳＰＧＬＹＴＩＩＲＩＩＩｓＶＡＬＶＡＬＧＬＩＩＡ
ＳＮＶＡＬＡＳＰＡＬＡＴＩＩＲＣＴＣＡＴＴＴＡＣＡ
ＴＴＡＣＡＧＣ丁ＡＡＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡＣＴＣＡ
ＴＧＴＧＧＴＧＧＡ＾＾＾Ｔ［ｌＴＧＧＡＴＧＣＣＡＣ
Ｃ＋１１Ｓ　ＩＬＥ　ＧＬＹ　ＬＹＳ　ＬＥＤ　ＩＬＥ
　ＶＡＬ　ＴＩＩＲ　ＬＹＳ　ＧＬＩＩ　ＩＬＥ　ＧＬ
Ｙ　ＧＬＹ　ＡＳＰ　ＧＬＹ　ＩＩＥＴ　ｌ＋ＥＴ　Ａ
ＳＰ　ＩＬＥ　ＴＩＩＲＣＡＣ　ＡＴ了ＧＧＧ　ＡＡＡ
　ＴＴＡ　ＡＴＴ　ＧＴＧ　ＡＣＣ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　
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ＴＡＣＡＴＣＡＴＡＣＴＴＡＡＣＴ参考例 独国特許出願Ｐ３６　２４・４５３．８からの例１ ａ）動物細胞のための発現ベクターの構成プラスミドｐ
ＳＶ２ｄｈｆ　ｒ　（り一等、１掲）をＨｉｎｄｌｌＩ
及びＥｃｏＲＩで切断し、ＳＶ４０初期プロモータを有
する２、６５ｋｂベクタ一断片を単離した。ｐＵｃ１２
ｓＴＯＰ　（ブローカー及びアマン（Ｂｒｏｋｅｒ　ａ
ｎｄ　Ａ＠ａｎｎ）　、アプライド・マイクロバイオロ
ジカル・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ　、Ｍｌｃｒｏ
ｂｌｏｌ　、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　、）　２３　（
１９８８）　２４９−２９８〕からの６７ｂｐ　　Ｈｉ
ｎｄＩＩ［−ＥｃｏＲＩ断片をこの様にして予備処理さ
れたベクター中に連結し、その結果プラスミドｐｓＶ２
ｓＴＯＰを得た。
ｐＵｃ１２ｓＴＯＰからの６７ｂｐ断片上には全ての三
つの読取枠内に翻訳停止コドンがある。
ｐｓＶ２ｓＴＯＰを５ａｃ　Ｉで線型化し、得られた３
′突出末端をＤＮＡポリメラーゼＩの３′＝５′エキソ
ヌクレアーゼ活性を用いて除去した。
次いでＥｃｏＲＩによる消化を行なった。初期のトラン
スクリプトに対するＳＶ４０ポリアデニル化信号を有す
るｐＢＢ３　［Ｂ、　ブラショト等（Ｂ。
Ｂｏｕｒａｃｈｏｔ　ａｔ　　ａｔ、）、エンボ・ジャ
ーナル（ＥＭＢＯ）、）ｌ（１９ｇ２）８９５−９００
〕からの１３３ｂｐの大きさのＥｃｏＲＩ−Ｈｐａ　Ｉ
断片と連結後、発現ベクターｐＳＶＡ　　５ＴＯＰＩを
得ることが可能であった。
このポリアデニル化部位は又ベクターｐｌＧ６（ブラコ
ット等、１掲）からも単離することができる。全く同一
の方法によりＳＶ４０遺伝子から１３３ｂｐＢａｍＨＩ
−Ｈｐａ　Ｉ断片を単離し、ＢａｍＨＩ切断部位に埋填
し、及びＥｃｏＲＩリンカ−を付着することが可能であ
る。
ｐＳｖＡ　５ＴＯＰ１はこの様にＳＶ４０初期プロモー
タと初期のトランスクリプトに対してＳＶ４０ポリアデ
ニル化信号の間に３個の独特の制限部位（ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ−Ｓａ　ｌ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ）を有するクローニン
グポリリンカー及び全ての三つの読取枠内に翻訳停止を
有する配列を有する。
Ｃ）共トランスフェクションのためのＤＨＦＲ発現ベク
ターの構成 共トランスフェクションに用いられるＤＨＦＲベクター
の出発点はプラスミドｐＭＴＶｄｈｆｒであった（り一
等、１掲）。ｐＭＴＶｄｈｆｒはＢｇｌｎで切断し、Ｄ
ＮＡの突出５′末端をＤＮＡポリメラーゼＩ（フレノウ
断片）を用いて埋填した。ＥｃｏＲＩで消化後、４．４
７ｋｂの大きさの断片を単離し、ｐＢＢ３　（ブラコッ
ト等、１掲）からの１３３ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｈｐａ　Ｉ
断片と連結させた。この新しいプラスミドｐＭＴＶＡｄ
ｈｆ　ｒはＭＭＴＶ−ＬＴＲ及び初期のトランスクリプ
トのためのＳＶ４０ポリアデニル化部位を側面に配置さ
れたマウスＤＨＦＲｃＤＮＡを有する。
ｐｓＶＯＡｄｈｆｒは大きさが１４５０ｂｐでＭＭＴＶ
−ＬＴＲを有するＨｉｎｄｍ断片を削除することにより
ｐＭＴＶＡｄｈｆｒから得られた。
ｐＭＴＶＡｄｈｆｒ或いはｐｓＶＯＡｄｈ　ｆ　ｒはい
づれもｍＲＮＡスプライス部位を有しない。
【図面の簡単な説明】
第１図はＦＸＩＩＩａをコードするｃＤＮＡ（）−ド化
領域を斜線で示す）及びこの下に単離及び特性付けられ
たクローンのＤＮＡ領域を示す説明図である。 第２図は発現プラス゛ミドｐ　ＦＸＩｌｌ−１３の構成
を示す説明図である。明らかにするために、この図にお
いては出発プラスミドｐＩＣ１９Ｈ−１２，１及びｐＩ
Ｃ１９Ｈ−１１，１並びにそれらの直下に位置するＤＮ
Ａ断片は一本鎖断片から構成された生成物ｐ　ＦＸｔｌ
ｔ−１３と同様に二重線で表わされる。 第３図はプラスミドｐＴｒｃ９７Ａの構築を示し、第３
ａ図はｐＴｒｃ９７Ａ及びｐ　ＦＸＩＩＩ−１３からの
ｐＦＸＩＩＩ−Ｃ４（７）構築を示し、第３ｂ図はｐＦ
Ｘｌｌｌ−１３及び公知のプラスミドｐ　ＩＣ２０Ｈ及
びｐＢＤ２からの９ＭＢ２５９の構築を示す説明図であ
る。 第４図はｐ　ＦＸＩｌｌ−１３及び公知のプラスミドｐ
ＡＡＨ５からのプラスミドｐＭＢ２４０のｔｆｉ築を示
す説明図である。 第５図は公知のプラスミドｐＳＶ２ｄｈｆ　ｒ及びプラ
スミドｐＳＶＡ　　５ＴＯＰＩからのｐＺＥＴ４の構築
を示し、第５ａ図はｐＳＶＡＳＴＯＰＩ及びｐＦＸＩＩ
Ｉ−１３からのｐＨ５Ｆ１３の構築を示し、第５ｂ図は
ｐＺＥＴ４及びｐＦＸＩＩｌ−１３からのｐＺＦ１３の
構築を示し、第５ｃ図はｐＨ５Ｆ１３及び公知のプラス
ミドｐＳＰ６Ｈ６９からのｐＨ５Ｆ１３の構築を示す説
明図である。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、因子ＸIIIａをコードし、下記のコード鎖を含有す
    るＤＮＡ配列。 【遺伝子配列があります。】 ２、特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡと緊縮条件下に
    ハイブリダイズするＤＮＡ。 ３、下記のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列。 【遺伝子配列があります】 ４、特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項に記載の
    ＤＮＡを含有する遺伝子構造。 ５、特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項に記載の
    ＤＮＡ配列を含有するベクター。 ６、特許請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４項
    に記載のＤＮＡを含有する形質転換細胞。 ７、特許請求の範囲第６項記載の細胞により発現された
    粗製蛋白質。 ８、特許請求の範囲第７項記載の粗製蛋白質から得られ
    た因子ＸIIIａ。 ９、細菌、酵母或いは動物細胞における発現により得ら
    れた因子ＸIIIａ。 １０、因子ＸIIIａ活性を有し、下記のアミノ酸配列を
    含有する蛋白質、或いはその部分、及びこの蛋白質の変
    異体（ｍｕｔａｎｔ）及び異型体（ｖａｒｉａｎｔ）。 【遺伝子配列があります】 １１、因子ＸIIIａに対して特異的であり、且つ遺伝子
    操作により製造された因子ＸIIIａ或いは抗原活性を有
    するその部分から得られた抗体。 １２、特許請求の範囲の範囲第８項、第９項又は第１０
    項に記載された抗原を含有する診断補助品。 １３、特許請求の範囲第１項、第２項、第３項又は第４
    項に記載のＤＮＡを全部或いは部分的に含有する診断補
    助品。 １４、体液或いは組織或いはそれらから単離された核酸
    を特許請求の範囲第１２項又は第１３項に記載の診断補
    助品と接触させることを特徴とする診断方法。 １５、特許請求の範囲第８項、第９項又は第１０項に記
    載の蛋白質を含有することを特徴とする薬品。
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