JPH01279898A - 第ｘ３因子のアフイニテイクロマトグラフイーによる精製法 - Google Patents
第ｘ３因子のアフイニテイクロマトグラフイーによる精製法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は第ＸＩＩＩ因子のａ−サブユニットのアフイニ
テイクロマトグラフイーによる精製法、治療用組成物お
よび治療用組成物の使用に関する。
テイクロマトグラフイーによる精製法、治療用組成物お
よび治療用組成物の使用に関する。
生体は自身を血液の損失から、ならびに血栓症から保護
するために平衡関係にある２つの系すなわち凝固系およ
び繊維素溶解系を有する。
するために平衡関係にある２つの系すなわち凝固系およ
び繊維素溶解系を有する。
この２種の系の相互作用により、はじめに止血のための
不溶性フィブリンポリマーが形成され、これが創傷が治
癒される間に繊維素溶解なる溶解過程により再び分解さ
れる。
不溶性フィブリンポリマーが形成され、これが創傷が治
癒される間に繊維素溶解なる溶解過程により再び分解さ
れる。
その場合、タンパク分解によりすでに活性化された酵素
がカスケードの後続の酵素を活性化するしくみになって
いる相互にかみ合ったカスケード状に進行する過程の結
果として安定した血栓が凝固過程の最終段階で形成され
るのであり、それにより傷害の発生に対する生体の応答
が増やされる。この過程の決定的に重要な最後の段階が
フィブリンモノマーの重合である。フィブリンモノマー
はそれらが形成されたのち静電力の作用により相互に平
行に並んでいる。しかしながらこの状態においてはそれ
らは水素結合によってのみしか結合されておらず、水素
結合を解離させる試薬、例えば、尿素により再び液化さ
れうる。フィブリンモノマー間の共有Ｍ合はカルシウム
イオンの存在下に七ツマー間にペプチド結合を形成する
ことにより行われる。
がカスケードの後続の酵素を活性化するしくみになって
いる相互にかみ合ったカスケード状に進行する過程の結
果として安定した血栓が凝固過程の最終段階で形成され
るのであり、それにより傷害の発生に対する生体の応答
が増やされる。この過程の決定的に重要な最後の段階が
フィブリンモノマーの重合である。フィブリンモノマー
はそれらが形成されたのち静電力の作用により相互に平
行に並んでいる。しかしながらこの状態においてはそれ
らは水素結合によってのみしか結合されておらず、水素
結合を解離させる試薬、例えば、尿素により再び液化さ
れうる。フィブリンモノマー間の共有Ｍ合はカルシウム
イオンの存在下に七ツマー間にペプチド結合を形成する
ことにより行われる。
このネットワーク形成は第ＸＩ［［ａ因子と呼ばれる活
性化された第Ｘｍ因子により行われる。
性化された第Ｘｍ因子により行われる。
第Ｘｍ因子は血液凝固系の酵素前駆体であり、血漿中な
らびに血小板中に検出されうる。血漿中では相互に共有
結合はしていないａサブユニットとｂサブユニットの複
合体として存在し、一方血小板中に存在するものはａサ
ブユニットからのみ構成されている。第Ｘｍ因子のこの
２種の分子形は同じ酵素的機能を有する。トロンビンお
よびカルシウムにより活性化されてはじめてこの活性化
された第Ｘｍ因子（第Ｘ］ＩＩａ因子）がフィブリン中
の特定のリジンとグルタミン残基との間のペプチド様結
合の形成を触媒し、それによりフィブリンモノマーがネ
ットワーク状に共有結合される。
らびに血小板中に検出されうる。血漿中では相互に共有
結合はしていないａサブユニットとｂサブユニットの複
合体として存在し、一方血小板中に存在するものはａサ
ブユニットからのみ構成されている。第Ｘｍ因子のこの
２種の分子形は同じ酵素的機能を有する。トロンビンお
よびカルシウムにより活性化されてはじめてこの活性化
された第Ｘｍ因子（第Ｘ］ＩＩａ因子）がフィブリン中
の特定のリジンとグルタミン残基との間のペプチド様結
合の形成を触媒し、それによりフィブリンモノマーがネ
ットワーク状に共有結合される。
遺伝的に決定される第Ｘｍ因子の欠乏、または阻害剤に
より第Ｘｍ因子の活性化が減退すると重大な血液凝固障
害を生ずる。このため血漿性ならびに血小板性第ＸＩＩ
Ｉ因子の種々の精製法が開発されてきた。その一部は、
知られたタンパク精製工程、例えば分別エタノール沈澱
、硫酸アンモニウム沈澱およびポリエチレングリコール
沈澱、のみならずイオン交換りσマドグラフィーまたは
ゲルが過に基づく非常に骨の折れる方法である。
より第Ｘｍ因子の活性化が減退すると重大な血液凝固障
害を生ずる。このため血漿性ならびに血小板性第ＸＩＩ
Ｉ因子の種々の精製法が開発されてきた。その一部は、
知られたタンパク精製工程、例えば分別エタノール沈澱
、硫酸アンモニウム沈澱およびポリエチレングリコール
沈澱、のみならずイオン交換りσマドグラフィーまたは
ゲルが過に基づく非常に骨の折れる方法である。
Ｊａｎ ＭｃＤｏｎａｇｈらは（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ
ｅＬ Ｂｉｏｐｈｙ−ｓｉｃａ Ａｃｔａ、 ４４６
（１９７６）、３４５−３５７）アフイニテイクロマト
グラフイーによる第Ｘｍ因子の精製法についてはじめて
記載した。彼らはこの目的にアガロースに結合した安息
香酸水銀を使用している。この方法は血漿第ＸＩＩＩ因
子のａサブユニットの水銀化合物への可逆的結合を提供
するものである。Ｊａｎ ＭｃＤｏｎａｇｈ氏他は、血
漿因子のｂサブユニットはそれ自体何ら遊離のチオール
基を含有しないのでクロマトグラフィーマトリックスと
相互作用できず、従ってこのものはａサブユニットがト
ロンビンによる分解により予備活性化されそして続くカ
ルシウムでの処理により完全に活性化されるまでは非共
有力によりａサブユニットに結合されｔ；ままであると
記載している。それゆえ純粋なａサブユニットは前記著
者らに記載された方法によればカルシウムとトロンビン
での処理後にのみ調製できる。
ｅＬ Ｂｉｏｐｈｙ−ｓｉｃａ Ａｃｔａ、 ４４６
（１９７６）、３４５−３５７）アフイニテイクロマト
グラフイーによる第Ｘｍ因子の精製法についてはじめて
記載した。彼らはこの目的にアガロースに結合した安息
香酸水銀を使用している。この方法は血漿第ＸＩＩＩ因
子のａサブユニットの水銀化合物への可逆的結合を提供
するものである。Ｊａｎ ＭｃＤｏｎａｇｈ氏他は、血
漿因子のｂサブユニットはそれ自体何ら遊離のチオール
基を含有しないのでクロマトグラフィーマトリックスと
相互作用できず、従ってこのものはａサブユニットがト
ロンビンによる分解により予備活性化されそして続くカ
ルシウムでの処理により完全に活性化されるまでは非共
有力によりａサブユニットに結合されｔ；ままであると
記載している。それゆえ純粋なａサブユニットは前記著
者らに記載された方法によればカルシウムとトロンビン
での処理後にのみ調製できる。
その上そこに用いられている水銀化合物は毒性が高い。
従ってそこに記載される方法はヒトの治療剤の調製には
使用できない。
使用できない。
それゆえ本発明の目的は有毒な化合物の使用を回避する
ことができる第Ｘｍ因子のａサブユニットの改良された
精製法を提供することである。
ことができる第Ｘｍ因子のａサブユニットの改良された
精製法を提供することである。
この目的は本発明により、前記した種類の方法において
第Ｘｍ因子のａサブユニットをジスルフイツド交換反応
に適する担体マトリックスに可逆的に結合させ、そして
還元剤との反応により担体マトリックスから取り外すこ
とによって達成された。
第Ｘｍ因子のａサブユニットをジスルフイツド交換反応
に適する担体マトリックスに可逆的に結合させ、そして
還元剤との反応により担体マトリックスから取り外すこ
とによって達成された。
ジスルフイツド交換反応に適する担体マトリックスに第
ＸＩＩＩ因子のａサブユニットを可逆的に結合させるこ
とは有毒なりロマトグラフイー物質の使用を回避できる
という長所がある。その上、第ＸＩＩＩ因子を含有する
溶液中に含有されるすべてのタンパク質は遊離のメルカ
プト基に対する反応性が低いためまたは溶離に際し第Ｘ
ＩＩＩ因子と異なる挙動をする結果、ジスルフイツド結
自を還元する試薬を用いて溶離すると第χｍ因子から分
離されうる。その上本発明方法においては血漿第ＸＩＩ
Ｉ因子のｂサブユニットをａサブユニットから除去でき
る。今驚くべきことに、血漿第ＸＩＩＩ因子複合物はＭ
ｃＤｏｎａｇｈにより提示された意見と反対にトロンビ
ンの非存在下にカルシウムまたはマグネシウムを含有す
る溶液中でインキュベーションすることによりｂサブユ
ニットと生物学的に活性なａサブユニットに分解するこ
とが見出された。ｂサブユニットそれ自体は何ら遊離の
メルカプト基ををせず、システィンにより付与されるす
べてのＳＲ基はｂサブユニット内にジスルフィッド結合
の形で存在するので、これらは担体マトリックスには結
合せず従って洗浄により除去されうる。
ＸＩＩＩ因子のａサブユニットを可逆的に結合させるこ
とは有毒なりロマトグラフイー物質の使用を回避できる
という長所がある。その上、第ＸＩＩＩ因子を含有する
溶液中に含有されるすべてのタンパク質は遊離のメルカ
プト基に対する反応性が低いためまたは溶離に際し第Ｘ
ＩＩＩ因子と異なる挙動をする結果、ジスルフイツド結
自を還元する試薬を用いて溶離すると第χｍ因子から分
離されうる。その上本発明方法においては血漿第ＸＩＩ
Ｉ因子のｂサブユニットをａサブユニットから除去でき
る。今驚くべきことに、血漿第ＸＩＩＩ因子複合物はＭ
ｃＤｏｎａｇｈにより提示された意見と反対にトロンビ
ンの非存在下にカルシウムまたはマグネシウムを含有す
る溶液中でインキュベーションすることによりｂサブユ
ニットと生物学的に活性なａサブユニットに分解するこ
とが見出された。ｂサブユニットそれ自体は何ら遊離の
メルカプト基ををせず、システィンにより付与されるす
べてのＳＲ基はｂサブユニット内にジスルフィッド結合
の形で存在するので、これらは担体マトリックスには結
合せず従って洗浄により除去されうる。
第ＸＩＩＩ因子は第ＸＩＩＩ因子濃度の高い物質のホモ
ジネートから得られるのが好ましい。それらは例えば胎
盤組織および血小板が包含される。
ジネートから得られるのが好ましい。それらは例えば胎
盤組織および血小板が包含される。
この２種の物質から単離された第ＸＩＩＩ因子はａサブ
ユニットからのみ成っている。
ユニットからのみ成っている。
生物学的に活性な第ＸＩ因子も同様に胎盤から得られう
る。しかしながらすでに記載したとおり、血漿第ＸＩＩ
Ｉ因子は非共有的に相互に結合した２種のサブユニット
、すなわちａサブユニットとｂサブユニットの複合体か
ら成っている。
る。しかしながらすでに記載したとおり、血漿第ＸＩＩ
Ｉ因子は非共有的に相互に結合した２種のサブユニット
、すなわちａサブユニットとｂサブユニットの複合体か
ら成っている。
本発明によりこの第ＸＩＩＩ因子複合体から生物学的に
活性なａサブユニットが得られる。
活性なａサブユニットが得られる。
本発明による方法にとって、その超厚に関わりなく第Ｘ
ＩＩＩ因子をアフイニテイクロマトグラフイーによる精
製のために溶液中において入手できる。この目的には、
例えば血液から高分子タンパク質を沈澱または遠心分離
により除去することによるかまたは第ＸＩＩＩ因子を含
有する組織をホモジナイズおよび続いて遠心分離するこ
とにより適当な生物学的物質を調製する。
ＩＩＩ因子をアフイニテイクロマトグラフイーによる精
製のために溶液中において入手できる。この目的には、
例えば血液から高分子タンパク質を沈澱または遠心分離
により除去することによるかまたは第ＸＩＩＩ因子を含
有する組織をホモジナイズおよび続いて遠心分離するこ
とにより適当な生物学的物質を調製する。
Ｃ，Ｇ、 ＣｕｒＬｉｓ他（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１３．１９７４．３７７４−３７８０）により、第Ｘ
ＩＩＩ因子を濁期律表の第１１ａ族の二価イオンの非存
在下にアルキル化剤で処理しても第ＸＩＩＩ因子の生物
学的活性には何の影響も及ぼさないことが開示されてい
る。
１３．１９７４．３７７４−３７８０）により、第Ｘ
ＩＩＩ因子を濁期律表の第１１ａ族の二価イオンの非存
在下にアルキル化剤で処理しても第ＸＩＩＩ因子の生物
学的活性には何の影響も及ぼさないことが開示されてい
る。
この著者らは、ａサブユニット中の第ＸＩＩＩａ因子の
活性システィンは通常保護された形態であることを示す
ことができた。カルシウムイオンを同時に添加してはじ
めてこのシスティンがコンホーメーションの変化により
露出されそれにより同様にアルキル化されうる。かくし
て完全にＳ−アルキル化された第ＸＩＩＩａ因子はトロ
ンビンによる分解後でも不活性である。今驚くべきこと
に、第ＸＩＩＩ因子を含有する溶液をカルシウムまたは
同等のイオンの非存在下にアルキル化剤で処理し統いて
アフィニテイクロマトクラフィー精製することにより生
物学的に活性な高純度の第ＸＩＩＩ因子調製物が得られ
うろことが見出された。
活性システィンは通常保護された形態であることを示す
ことができた。カルシウムイオンを同時に添加してはじ
めてこのシスティンがコンホーメーションの変化により
露出されそれにより同様にアルキル化されうる。かくし
て完全にＳ−アルキル化された第ＸＩＩＩａ因子はトロ
ンビンによる分解後でも不活性である。今驚くべきこと
に、第ＸＩＩＩ因子を含有する溶液をカルシウムまたは
同等のイオンの非存在下にアルキル化剤で処理し統いて
アフィニテイクロマトクラフィー精製することにより生
物学的に活性な高純度の第ＸＩＩＩ因子調製物が得られ
うろことが見出された。
その際アルキル化剤としてヨードアセトアミドまたはヨ
ード酢酸が使用されるのが好ましい。
ード酢酸が使用されるのが好ましい。
しかしながら本発明には同様のアルキル化能力を有する
任意の他の試薬も使用できる。
任意の他の試薬も使用できる。
アルキル化するには、それぞれのアルキル化剤を画業上
知られた操作に従い約５〜２５０ ミリモル／ｌの濃度
で添加すべきである。好ましい態様は５〜５０ミリモル
／ｌの濃度のヨード酢酸で処理することである。
知られた操作に従い約５〜２５０ ミリモル／ｌの濃度
で添加すべきである。好ましい態様は５〜５０ミリモル
／ｌの濃度のヨード酢酸で処理することである。
本発明によればアルキル化はＣａ２＋または同様の作用
を有するイオンの非存在下に実施される。
を有するイオンの非存在下に実施される。
そうでない場合は、ａサブユニットのコンホーメーショ
ンの変化により活性中心もアルキル化を受けることにな
り従って遮断される。それゆえＣａ”＋およびＭｇ ２
＋を含有しない緩衝液を使用することが重要である。
ンの変化により活性中心もアルキル化を受けることにな
り従って遮断される。それゆえＣａ”＋およびＭｇ ２
＋を含有しない緩衝液を使用することが重要である。
好ましい態様においてはアルキル化はキレート形成剤を
添加して実施される。この目的には０．００１〜０．１
モル／ｌの濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
を使用するのが特に好ましい。
添加して実施される。この目的には０．００１〜０．１
モル／ｌの濃度のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
を使用するのが特に好ましい。
本発明によれば第ＸＩＩＩ因子を含有する溶液のアルキ
ル化は第ＸＩＩＩ因子が何ら主要なコンホーメーション
変化を受けないｐＨで実施される。それゆえ生理学的な
ｐＨ値に近いｐＨが用いられるのが好ましい、すなわち
アルキル化はｐＨ６，５〜８．５で実施される。分子の
三次構造がＣａ’＋により誘発されて変化してａサブユ
ニットの活性中心が露出されるのを阻止するためには、
反応泥合物に０．００１〜０．０４モル／ｌのＥＤＴＡ
を添加するのが好ましい。そこでアルキル化は例えば０
．００５〜０．２５モル／ｌのヨード酢酸を用いて実施
される。
ル化は第ＸＩＩＩ因子が何ら主要なコンホーメーション
変化を受けないｐＨで実施される。それゆえ生理学的な
ｐＨ値に近いｐＨが用いられるのが好ましい、すなわち
アルキル化はｐＨ６，５〜８．５で実施される。分子の
三次構造がＣａ’＋により誘発されて変化してａサブユ
ニットの活性中心が露出されるのを阻止するためには、
反応泥合物に０．００１〜０．０４モル／ｌのＥＤＴＡ
を添加するのが好ましい。そこでアルキル化は例えば０
．００５〜０．２５モル／ｌのヨード酢酸を用いて実施
される。
しかしながらそれより高いかまたは低い濃度のヨード酢
酸も使用できる。反応は通常１〜３６０分間行われる。
酸も使用できる。反応は通常１〜３６０分間行われる。
しかしながら露出されているメルカプト基を完全にアル
キル化するには、５分間以上反応させるべきである。反
応時間に限定はないが、遅くとも６０分後には、露出さ
れているメルカプト基が充分にカルボキシメチル化され
ると予測されうる。
キル化するには、５分間以上反応させるべきである。反
応時間に限定はないが、遅くとも６０分後には、露出さ
れているメルカプト基が充分にカルボキシメチル化され
ると予測されうる。
アルキル化を行ったのち、アルキル化物質を再び溶液か
ら除去する。これは当業者に知られた方法、例えばゲル
が過、塩沈澱および／または透析により行う二七ができ
る。アルキル化物質が定量的に溶液から除去されるなら
ば他のいずれの方法もこの目的に等しく用いられうる。
ら除去する。これは当業者に知られた方法、例えばゲル
が過、塩沈澱および／または透析により行う二七ができ
る。アルキル化物質が定量的に溶液から除去されるなら
ば他のいずれの方法もこの目的に等しく用いられうる。
血漿第ＸＩＩＩ因子から活性ａサブユニットを単離する
場合は、これを非共有により会合しているｂサブユニッ
トから分離する必要がある。これは場合によりすでにア
ルキル化されていてもよい血漿第ＸＩＩＩ因子を０．０
５〜０．６モル／ｌ特に好ましくは０．０５〜０．２モ
ル／ｌの濃度のカルシウムイオンまたはマグネシウムイ
オンとインキュベーションすることにより行われるのが
好ましい。
場合は、これを非共有により会合しているｂサブユニッ
トから分離する必要がある。これは場合によりすでにア
ルキル化されていてもよい血漿第ＸＩＩＩ因子を０．０
５〜０．６モル／ｌ特に好ましくは０．０５〜０．２モ
ル／ｌの濃度のカルシウムイオンまたはマグネシウムイ
オンとインキュベーションすることにより行われるのが
好ましい。
カルシウムまたはマグネシウムの存在下に５分から２時
間インキュベーションしたのちにａサブユニットとｂサ
ブユニットが解離状態となる。
間インキュベーションしたのちにａサブユニットとｂサ
ブユニットが解離状態となる。
血漿第ｘ■因子からａサブユニットを単離する場合は、
ジスルフイツド交換反応に適する物質への下記吸着を実
施するのにサブユニットのこの解離が必要な前提条件で
ある。
ジスルフイツド交換反応に適する物質への下記吸着を実
施するのにサブユニットのこの解離が必要な前提条件で
ある。
予備処理されてないかまたは予めアルキル化物質で処理
された第ＸＩＩＩ因子含有溶液を次にジスルフイツド交
換反応に適し、遊離のメルカプト基を含有する担体マト
リックスと接触させる。
された第ＸＩＩＩ因子含有溶液を次にジスルフイツド交
換反応に適し、遊離のメルカプト基を含有する担体マト
リックスと接触させる。
ジスルフイツド交換反応に適する好ましい物質の例をあ
げればチオール−セファロース４Ｂである。この反応は
いわゆるバッチ法および分収用カラムの両方で行うこと
ができる。
げればチオール−セファロース４Ｂである。この反応は
いわゆるバッチ法および分収用カラムの両方で行うこと
ができる。
本発明によれば第ＸＩ［［因子を含有する溶液を好まし
くは０．Ｏ１〜０．２モル／ｌの濃度のカルシウムまた
はマグネシウムイオンの存在下にマトリックスと接触さ
せる。吸着は事実上生理学的ｐＨｓ好ましくはｐＨ６，
５〜８．５で行うべきである。
くは０．Ｏ１〜０．２モル／ｌの濃度のカルシウムまた
はマグネシウムイオンの存在下にマトリックスと接触さ
せる。吸着は事実上生理学的ｐＨｓ好ましくはｐＨ６，
５〜８．５で行うべきである。
本発明によれば、担体マトリックスのメルカプト基をそ
れ自体知られた方法でジ−２−ビリジルジスルフイッド
、２．２’−ジチオビス（ピリジンＮ−オキサイド）、
５．５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、これら
化合物の誘導体またはアゾジカルボン酸の誘導体と反応
させることにより予め活性化しそれにより後程加えられ
る検体とジスルフイツド結合を形成する準備ができる。
れ自体知られた方法でジ−２−ビリジルジスルフイッド
、２．２’−ジチオビス（ピリジンＮ−オキサイド）、
５．５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、これら
化合物の誘導体またはアゾジカルボン酸の誘導体と反応
させることにより予め活性化しそれにより後程加えられ
る検体とジスルフイツド結合を形成する準備ができる。
メルカプト基を含有するマトリックスに第Ｘｍ因子が結
合されたのもこのマトリックスを、０、Ｏ１〜０．２モ
ル／ｌ濃度のカルシウムまたはマグネシウムを含有する
溶液で洗浄する。それ自体何らシスティンを含有しない
ゆえであろうとそれらのメルカプト基が予めアルキル化
されているゆえであろうとマトリックスと相互作用でき
ない第ＸＩＩＩ因子含有溶液中の他のすべての成分は定
量的に溶離され、血漿からの第Ｘｍ因子の場合はカルシ
ウムまたはマグネシウム処理によりａサブユニットから
分離されたｂサブユニットも同様に溶離される。
合されたのもこのマトリックスを、０、Ｏ１〜０．２モ
ル／ｌ濃度のカルシウムまたはマグネシウムを含有する
溶液で洗浄する。それ自体何らシスティンを含有しない
ゆえであろうとそれらのメルカプト基が予めアルキル化
されているゆえであろうとマトリックスと相互作用でき
ない第ＸＩＩＩ因子含有溶液中の他のすべての成分は定
量的に溶離され、血漿からの第Ｘｍ因子の場合はカルシ
ウムまたはマグネシウム処理によりａサブユニットから
分離されたｂサブユニットも同様に溶離される。
続く操作段階において第Ｘｍ因子のａサブユニットがマ
トリックスから溶離される。溶離剤としてはジスルフイ
ツド交換反応に適し、マトリックスに結合された第Ｘｍ
因子ａサブユニットと置換しそして同時にマトリックス
とａサブユニットとの間のジスルフイッド結合を還元す
るものであるあらゆる試薬が用いられうる。好ましい態
様では０．０１〜０．２モル／ｌのＣａ”＋またはＭｇ
２十の存在下に０．００５〜０，０５モル／ｌの還元剤
好ましくはジチオトレイトール、メルカプトエタノール
、エタンジチオール、グルタチオンまたはシスティンを
用いて溶離が行われる。活性なａサブユニットの収量増
大をもたらすものである特に好ましい態様では、溶離剤
に０．１〜０．７ｇ／ｒｘＱのスクロースを添加して実
施される。
トリックスから溶離される。溶離剤としてはジスルフイ
ツド交換反応に適し、マトリックスに結合された第Ｘｍ
因子ａサブユニットと置換しそして同時にマトリックス
とａサブユニットとの間のジスルフイッド結合を還元す
るものであるあらゆる試薬が用いられうる。好ましい態
様では０．０１〜０．２モル／ｌのＣａ”＋またはＭｇ
２十の存在下に０．００５〜０，０５モル／ｌの還元剤
好ましくはジチオトレイトール、メルカプトエタノール
、エタンジチオール、グルタチオンまたはシスティンを
用いて溶離が行われる。活性なａサブユニットの収量増
大をもたらすものである特に好ましい態様では、溶離剤
に０．１〜０．７ｇ／ｒｘＱのスクロースを添加して実
施される。
本方法は天然源から単離された第Ｘｍ因子に対してのみ
ならず、遺伝子工学により細菌、酵母または細胞培養物
において生成された第Ｘｍ因子に対しても同様に適用で
きる。その上この方法は活性中心のシスティンがカルシ
ウムイオンまたは同様の作用を有するイオンの添加によ
るコンホーメーション変化の影響を受は続けるならば、
第ＸＩＩＩ因子活性を有するあらゆるタンパク質にも適
用できる。
ならず、遺伝子工学により細菌、酵母または細胞培養物
において生成された第Ｘｍ因子に対しても同様に適用で
きる。その上この方法は活性中心のシスティンがカルシ
ウムイオンまたは同様の作用を有するイオンの添加によ
るコンホーメーション変化の影響を受は続けるならば、
第ＸＩＩＩ因子活性を有するあらゆるタンパク質にも適
用できる。
本発明方法により精製期間中その活性がほとんど完全に
保持されたまま残る第ＸＩＩＩ因子調製物が得られる。
保持されたまま残る第ＸＩＩＩ因子調製物が得られる。
本発明方法により得られた第Ｘｍ因子は治療用組成物に
使用されうる。
使用されうる。
好ましい組成物は第Ｘｍ因子の他に生理学的に受容され
うる成分例えば塩化ナトリウム、アルブミン、グルコー
スまたはスクロースヲ含有しておりそして注入に適する
ものである第ＸＩＩＩ因子含有溶液である。
うる成分例えば塩化ナトリウム、アルブミン、グルコー
スまたはスクロースヲ含有しておりそして注入に適する
ものである第ＸＩＩＩ因子含有溶液である。
かかる治療剤はとりわけ第ＸＩＩＩ因子欠乏性疾患の治
療に使用できる。本発明により得られた第Ｘｍ因子のも
う一つの好ましい使用法は、例えば保存血または赤血球
濃縮物に混合して、大出血後に輸血される血液の凝固能
力を保持することである。
療に使用できる。本発明により得られた第Ｘｍ因子のも
う一つの好ましい使用法は、例えば保存血または赤血球
濃縮物に混合して、大出血後に輸血される血液の凝固能
力を保持することである。
第Ｘｍ因子を精製するための本発明による方法を以下の
実施例により説明する。
実施例により説明する。
実施例 １
ジ−２−ピリジルジスルフィッド、エルマン試薬または
２．２′−ジチオビス（ピリジンＮ−オキサイト）ヲ用
いるチオール−セファロース４ＢＯの活性化 チオール−セファロース４Ｂ■の５０ｍｍを、０．０３
モル／ｌのメルカプトエタノールを添加した緩衝液Ａ
（０，０５モル／（ｉ ｃ７） トＵ ７． ／ ＨＣ
ｌｐＨ７，５）、０．１５モル／ｌのＮａ（４）と室温
ではじめに３０分間処理した。次に樹脂物質を緩衝液Ａ
で洗い、そして１．５ミリモル／ｌのジ−２−ピリジル
ジスルフィッドをさらに添加したこの緩衝液と反応させ
た。活性化および樹脂マトリックスのメルカプト基の保
護が完結したのちこれを緩衝液Ａで洗いそしてこの樹脂
マトリックスをジスルフィツド交換反応に用いた。
２．２′−ジチオビス（ピリジンＮ−オキサイト）ヲ用
いるチオール−セファロース４ＢＯの活性化 チオール−セファロース４Ｂ■の５０ｍｍを、０．０３
モル／ｌのメルカプトエタノールを添加した緩衝液Ａ
（０，０５モル／（ｉ ｃ７） トＵ ７． ／ ＨＣ
ｌｐＨ７，５）、０．１５モル／ｌのＮａ（４）と室温
ではじめに３０分間処理した。次に樹脂物質を緩衝液Ａ
で洗い、そして１．５ミリモル／ｌのジ−２−ピリジル
ジスルフィッドをさらに添加したこの緩衝液と反応させ
た。活性化および樹脂マトリックスのメルカプト基の保
護が完結したのちこれを緩衝液Ａで洗いそしてこの樹脂
マトリックスをジスルフィツド交換反応に用いた。
ジ−２−ピリジルジスルフイツドの代りに例えば５，５
′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（エルマン試薬
）または２．２′−ジチオビス（ピリジンＮ−オキサイ
ド）を同じモル濃度で活性化に使用することもできる。
′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（エルマン試薬
）または２．２′−ジチオビス（ピリジンＮ−オキサイ
ド）を同じモル濃度で活性化に使用することもできる。
実施例 ２
第ＸＩＩＩ因子を含有する溶液と活性化されたチオール
−セファロース４ＢＯとの反応７００Ｕの第ＸＩＩＩ因
子（第ＸＩＩＩ因子１単位はクエン酸添加した正常血漿
ｌｔＱ中の第ＸＩＩＩ因子含量に相当する）を含有する
溶液５０ｍ１２中に４０％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウ
ムを飽和させた。
−セファロース４ＢＯとの反応７００Ｕの第ＸＩＩＩ因
子（第ＸＩＩＩ因子１単位はクエン酸添加した正常血漿
ｌｔＱ中の第ＸＩＩＩ因子含量に相当する）を含有する
溶液５０ｍ１２中に４０％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウ
ムを飽和させた。
硫酸アンモニウム残留物を緩衝液Ａ（実施例１参照）で
４℃で一夜透析し次に３０ミリモル／ｌのＣａＣＱ ！
を加えた。例えば実施例１に記載されるように活性化さ
れた活性化チオール樹脂を、３０ミリモル／ｌのＣａＣ
ｆｆ、が添加された緩衝液Ａを用いて平衡となした。カ
ルシウムを含有する透析物を予め調製しであるアフイニ
テイマトリックスに加え、次に樹脂を緩衝液Ａ（３０ミ
リモル／ｌＣａＣＱ２含有）で洗いそして１５ミリモル
／ｌのジチオトレイトールおよび３０ミリモル／ｌのＣ
ａＣＱ、を添加した緩衝液Ａを用いて第ＸＩＩＩ因子を
溶離した。溶出液は５００ Ｕの第ＸＩＩＩ因子を含有
していた。
４℃で一夜透析し次に３０ミリモル／ｌのＣａＣＱ ！
を加えた。例えば実施例１に記載されるように活性化さ
れた活性化チオール樹脂を、３０ミリモル／ｌのＣａＣ
ｆｆ、が添加された緩衝液Ａを用いて平衡となした。カ
ルシウムを含有する透析物を予め調製しであるアフイニ
テイマトリックスに加え、次に樹脂を緩衝液Ａ（３０ミ
リモル／ｌＣａＣＱ２含有）で洗いそして１５ミリモル
／ｌのジチオトレイトールおよび３０ミリモル／ｌのＣ
ａＣＱ、を添加した緩衝液Ａを用いて第ＸＩＩＩ因子を
溶離した。溶出液は５００ Ｕの第ＸＩＩＩ因子を含有
していた。
実施例 ３
洗浄緩衝液および溶離緩衝液にさらに０．５９／ｍＱの
スクロースを加える以外は実施例１および２に記載され
るようにしてチオール−セファロース４Ｂを活性化させ
そして第ＸＩＩＩ因子を含有する溶液と反応させた。溶
出液は６００Ｕの第ＸＩＩＩ因子を含有していた。
スクロースを加える以外は実施例１および２に記載され
るようにしてチオール−セファロース４Ｂを活性化させ
そして第ＸＩＩＩ因子を含有する溶液と反応させた。溶
出液は６００Ｕの第ＸＩＩＩ因子を含有していた。
実施例 ４
血漿第ＸＩＩＩ因子を含有する溶液と活性化されたチオ
ール−セファロース４Ｂｏとの反応１０００単位の第Ｘ
ＩＩＩ因子を含有するがトロンビンは何ら含有しない血
漿第ＸＩＩＩ因子含有溶液５０１１１２を緩衝液Ａ（実
施例１）で４°Ｃで一夜透析し次に０．３モル／ｌのＣ
ａ（Ｊ、およびＯ，１ｇ／＋＋＋ｆｆのスクロースを加
えた。４℃で６０分間インキュベートしたのちこの溶液
を例えば実施例１におけるようにして活性化されたチオ
ール樹脂に加え、そして０．０５モル／ｌのトリス／
ＨＣ（２（ｐＨ７，５）、 ０．１５モル／ｌのＮａＣ
Ｑ、 ０．１モル／ｌのＣａＣ４！および０．１ｇ／ｍ
Ｑのスクロースからなる緩衝液Ｂを用いて平衡となした
。次に樹脂物質を緩衝液Ｂで洗い、そして２０ミリモル
／ｌのＬ−システィンを加えた緩衝液Ｂで溶離した。
ール−セファロース４Ｂｏとの反応１０００単位の第Ｘ
ＩＩＩ因子を含有するがトロンビンは何ら含有しない血
漿第ＸＩＩＩ因子含有溶液５０１１１２を緩衝液Ａ（実
施例１）で４°Ｃで一夜透析し次に０．３モル／ｌのＣ
ａ（Ｊ、およびＯ，１ｇ／＋＋＋ｆｆのスクロースを加
えた。４℃で６０分間インキュベートしたのちこの溶液
を例えば実施例１におけるようにして活性化されたチオ
ール樹脂に加え、そして０．０５モル／ｌのトリス／
ＨＣ（２（ｐＨ７，５）、 ０．１５モル／ｌのＮａＣ
Ｑ、 ０．１モル／ｌのＣａＣ４！および０．１ｇ／ｍ
Ｑのスクロースからなる緩衝液Ｂを用いて平衡となした
。次に樹脂物質を緩衝液Ｂで洗い、そして２０ミリモル
／ｌのＬ−システィンを加えた緩衝液Ｂで溶離した。
この溶出液は８２０Ｕの第ＸＩＩＩ因子を含有しており
モしてｂサブユニットは含有していなかっＩこ 。
モしてｂサブユニットは含有していなかっＩこ 。
実施例 ５
第ＸＩＩＩ因子を含有する溶液のアルキル化および続く
活性化チオール−セファロース４Ｂ■との反応 ７００Ｕの第ＸＩＩＩ因子を含有する溶液５Ｑ＋ｉｆｆ
を５ミリモル／ｌのＥＤＴＡを加えた緩衝液Ａで透析し
そして次に１０ミリモル／ｌのヨード酢酸と室温で１時
間インキュベートした。この溶液に４０％（Ｗ／Ｖ）硫
酸アンモニウムを飽和し、そして沈澱を実施例２に記載
されるようにしてさらに処理した。
活性化チオール−セファロース４Ｂ■との反応 ７００Ｕの第ＸＩＩＩ因子を含有する溶液５Ｑ＋ｉｆｆ
を５ミリモル／ｌのＥＤＴＡを加えた緩衝液Ａで透析し
そして次に１０ミリモル／ｌのヨード酢酸と室温で１時
間インキュベートした。この溶液に４０％（Ｗ／Ｖ）硫
酸アンモニウムを飽和し、そして沈澱を実施例２に記載
されるようにしてさらに処理した。
スクロースを添加しない場合は４５０Ｕの第ＸＩＩＩ因
子が溶出液中に、モしてスクロースを添加すると５８０
Ｕの第ＸＩＩＩ因子が洗浄緩衝液および溶出緩衝液中に
回収された。アルキル化後にアフイニテイ樹脂から溶離
された第ＸＩＩＩ因子の純度はアルキル化されてない第
ＸＩＩＩ因子物質のそれに比較して明らかに高かった。
子が溶出液中に、モしてスクロースを添加すると５８０
Ｕの第ＸＩＩＩ因子が洗浄緩衝液および溶出緩衝液中に
回収された。アルキル化後にアフイニテイ樹脂から溶離
された第ＸＩＩＩ因子の純度はアルキル化されてない第
ＸＩＩＩ因子物質のそれに比較して明らかに高かった。
溶液中における第ＸＩＩＩ因子の生物学的活性をＢｅｈ
ｒｉｎｇｗｅｒｋｅ ＡＧ社のフィブリン架橋テストに
より測定した。この目的には検体をｐＨ７、６のジエチ
ルパルピッレート／アセテート緩衝液を用いて１：５．
１：１０、ｌ：２０．１：４０等に連続希釈した。次に
検体希釈物５０μρずつにＣａ／トロンビン／カオリン
溶液０．１ｍＱを加えそしてこの混合物を３７℃で１０
分間インキュベートした。その直後に５％モノクロロ酢
酸溶液１＋Ｊずつを加え、さらに２分間インキユベート
シ、はげしく振盪したのち溶液のカオリン濁度を測定し
た。
ｒｉｎｇｗｅｒｋｅ ＡＧ社のフィブリン架橋テストに
より測定した。この目的には検体をｐＨ７、６のジエチ
ルパルピッレート／アセテート緩衝液を用いて１：５．
１：１０、ｌ：２０．１：４０等に連続希釈した。次に
検体希釈物５０μρずつにＣａ／トロンビン／カオリン
溶液０．１ｍＱを加えそしてこの混合物を３７℃で１０
分間インキュベートした。その直後に５％モノクロロ酢
酸溶液１＋Ｊずつを加え、さらに２分間インキユベート
シ、はげしく振盪したのち溶液のカオリン濁度を測定し
た。
特許出願人 ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼル
シャフト 外２名
シャフト 外２名
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）第ＸIII因子のａサブユニットをジスルフイツド交
換反応に適する担体マトリックスに可逆的に結合させ、
そして還元剤との反応により担体マトリックスから取り
外すことからなる、第ＸIII因子のａサブユニットのア
フイニテイクロマトグラフイーによる精製法。 ２）第ＸIII因子のａサブユニットが胎盤ホモジネート
または血小板ホモジネートから得られることからなる請
求項１記載の方法。 ３）第ＸIII因子のａサブユニットが血漿から得られる
ことからなる請求項１記載の方法。 ４）第ＸIII因子が溶液中に存在することからなる請求
項１〜３のいずれかに記載の方法。 ５）第ＸIII因子、または第ＸIII因子を含有する溶液を
アルキル化剤で予備処理することからなる請求項１〜４
のいずれかに記載の方法。 ６）アルキル化剤がヨードアセトアミドまたはヨード酢
酸であることからなる請求項５記載の方法。 ７）ヨード酢酸が５〜２５０ミリモル／ｌ、好ましくは
５〜５０ミリモル／ｌの濃度で存在することからなる請
求項６記載の方法。 ８）アルキル化がＣａ＾２＾＋およびＭｇ＾２＾＋の非
存在下に行われることからなる請求項５〜７のいずれか
に記載の方法。 ９）アルキル化がキレート形成性物質、好ましくは０．
００１〜０．１モル／ｌ特に好ましくは０．００２〜０
．０２モル／ｌの濃度のエチレンジアミン四酢酸の存在
下に行われることからなる請求項６および／または７の
いずれかに記載の方 法。 １０）第ＸIII因子を含有する溶液を０．００１〜０．
０４モル／ｌのエチレンジアミン四酢酸の存在下にｐＨ
６．５〜８．５で０．００５〜０．２５モル／ｌのヨー
ド酢酸で１〜３６０分、好ましくは５〜６０分処理する
ことからなる請求項９記載の方法。 １１）アルキル化物質がアルキル化が行われた後好まし
くは透析またはタンパク質の塩沈澱により分離されるこ
とからなる請求項５〜１０のいずれかに記載の方法。 １２）血漿第ＸIII因子複合物を０．０５〜０．６モル
／ｌ、好ましくは０．０５〜０．２モル／ｌの濃度のＣ
ａ＾２＾＋またはＭｇ＾２＾＋とインキユベーシヨンす
ることからなる請求項１または３〜１１のいずれかに記
載の方法。 １３）第ＸIII因子を含有する溶液をメルカプト基を含
有する担体マトリックス、好ましくはチオールセフアロ
ース４Ｂと接触させることからなる請求項１〜１２のい
ずれかに記載の方法。 １４）担体マトリツクスへの結合が好ましくは０．０１
〜０．２モル／ｌの濃度のＣａ＾２＾＋またはＭｇ＾２
＾＋の存在下に好ましくはｐＨ６．５〜８．５で行われ
ることからなる請求項１〜１３のいずれかに記載の方法
。 １５）担体マトリックスがジ−２−ピリジルジスルフィ
ツド、２，２′−ジチオビス（ピリジンＮ−オキサイド
）、５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、こ
れら化合物の誘導体またはアゾジカルボン酸の誘導体と
の反応により予め活性化したものである請求項１３また
は１４に記載の方法。 １６）第ＸIII因子を負荷された担体マトリックスを０
．０１〜０．２モル／ｌの濃度のＣａ＾２＾＋またはＭ
ｇ＾２＾＋を含有する溶液で洗浄することからなる請求
項１３〜１５のいずれかに記載の方法。 １７）担体マトリックスに結合された物質を０．０１〜
０．２モル／ｌの濃度のＣａ＾２＾＋またはＭｇ＾２＾
＋および０．００５〜０．０５モル／ｌの還元剤好まし
くはジチオトレイトール、メルカプトエタノール、エタ
ンジチオール、グルタチオンまたはシステイン、および
場合により０．１〜０．７ｇ／ｍｌのスクロースを用い
て溶離することからなる請求項１３〜１６のいずれかに
記載の方法。 １８）第ＸIII因子が天然のタンパク質、遺伝子工学に
より調製された第ＸIII因子またはそのａ−サブユニッ
ト、および／または第ＸIII因子活性を有する任意の天
然または人工的に生成されたタンパク質であることがで
きる請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。 １９）第ＸIII因子のａ−サブユニットの活性がほとん
ど完全に保持されていることからなる請求項１〜１８の
いずれかに記載の方法。 ２０）請求項１〜１９のいずれかに記載の方法により精
製された第ＸIII因子、および慣用の生理学的に受容さ
れうる塩化ナトリウム、アルブミン、グルコースまたは
スクロースのような添加剤を含有することからなる治療
用組成 物。 ２１）第ＸIII因子欠乏により惹起された凝固障害の治
療への請求項２０記載の治療用組成物の使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3808048A DE3808048A1 (de) | 1988-03-11 | 1988-03-11 | Verfahren zum affinitaetschromatografischen reinigen von faktor xiii |
| DE3808048.6 | 1988-03-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01279898A true JPH01279898A (ja) | 1989-11-10 |
| JP2778086B2 JP2778086B2 (ja) | 1998-07-23 |
Family
ID=6349424
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1056556A Expired - Lifetime JP2778086B2 (ja) | 1988-03-11 | 1989-03-10 | 第ｘ▲ｉｉｉ▼因子のアフイニテイクロマトグラフイーによる精製法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5047506A (ja) |
| EP (1) | EP0332985B1 (ja) |
| JP (1) | JP2778086B2 (ja) |
| KR (1) | KR890014731A (ja) |
| AT (1) | ATE82130T1 (ja) |
| AU (1) | AU627450B2 (ja) |
| DE (2) | DE3808048A1 (ja) |
| DK (1) | DK118789A (ja) |
| FI (1) | FI891121A (ja) |
| GR (1) | GR3007030T3 (ja) |
| PT (1) | PT89964B (ja) |
| YU (1) | YU49889A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000059926A1 (fr) * | 1999-04-02 | 2000-10-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de sous-unite de peptide issue d'une proteine de polymere |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5612456A (en) * | 1988-11-14 | 1997-03-18 | Zymogenetics, Inc. | Factor XIII compositions |
| CN1091315A (zh) * | 1992-10-08 | 1994-08-31 | E·R·斯奎布父子公司 | 血纤维蛋白封闭剂组合物及其使用方法 |
| ES2182840T3 (es) * | 1993-03-30 | 2003-03-16 | Hoechst Japan | Factor xiii para el tratamiento de heridas de la piel. |
| JPH08333277A (ja) * | 1995-06-05 | 1996-12-17 | Hoechst Japan Ltd | ヒト血液凝固第ｘｉｉｉ因子の安定化された水性液製剤 |
Citations (2)
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| JPS5746921A (en) * | 1980-09-02 | 1982-03-17 | Green Cross Corp:The | Oral preparation of human blood coagulation factor |
| JPS6339585A (ja) * | 1986-03-12 | 1988-02-20 | ベ−リングベルケ、アクチエンゲゼルシヤフト | 遺伝子操作による因子ＸＩＩＩａの製造 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2063070C3 (de) * | 1970-12-22 | 1975-07-24 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels mit fibrinstabilisierender Wirkung |
| FR2434392A1 (fr) * | 1978-04-28 | 1980-03-21 | Toyo Jozo Kk | Nouveau compose disulfure utile dans la chromatographie de covalence |
| GB8414354D0 (en) * | 1984-06-05 | 1984-07-11 | Biogen Nv | Purifying protein |
| DE3734923C1 (de) * | 1987-10-15 | 1989-01-26 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung einer sterilen Plasmaproteinloesung,die Fibrinogen und den Gerinnungsfaktor XIII enthaelt |
-
1988
- 1988-03-11 DE DE3808048A patent/DE3808048A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-03-07 EP EP89103950A patent/EP0332985B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-07 AT AT89103950T patent/ATE82130T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-03-07 DE DE8989103950T patent/DE58902637D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-09 PT PT89964A patent/PT89964B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-03-09 US US07/321,133 patent/US5047506A/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-03-09 YU YU00498/89A patent/YU49889A/xx unknown
- 1989-03-09 FI FI891121A patent/FI891121A/fi not_active Application Discontinuation
- 1989-03-09 KR KR1019890002872A patent/KR890014731A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-03-10 AU AU31224/89A patent/AU627450B2/en not_active Ceased
- 1989-03-10 JP JP1056556A patent/JP2778086B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-03-10 DK DK118789A patent/DK118789A/da not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-02-11 GR GR920402869T patent/GR3007030T3/el unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5746921A (en) * | 1980-09-02 | 1982-03-17 | Green Cross Corp:The | Oral preparation of human blood coagulation factor |
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| WO2000059926A1 (fr) * | 1999-04-02 | 2000-10-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de sous-unite de peptide issue d'une proteine de polymere |
| US7270972B1 (en) | 1999-04-02 | 2007-09-18 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing subunit peptide originating in polymer protein |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK118789A (da) | 1989-09-12 |
| DE3808048A1 (de) | 1989-09-21 |
| KR890014731A (ko) | 1989-10-25 |
| EP0332985A3 (en) | 1990-05-09 |
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| AU3122489A (en) | 1989-09-14 |
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| FI891121A (fi) | 1989-09-12 |
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| DE58902637D1 (de) | 1992-12-17 |
| ATE82130T1 (de) | 1992-11-15 |
| AU627450B2 (en) | 1992-08-27 |
| US5047506A (en) | 1991-09-10 |
| DK118789D0 (da) | 1989-03-10 |
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| GR3007030T3 (ja) | 1993-07-30 |
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