JPH03155797A - 血液凝固第７因子または活性型血液凝固第７因子の調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 τ 本発明はヒト血液凝固第■因子コンホメーション特異性
モノクローナル抗体、ならびに該抗体を用いる血液凝固
第■因子、または（および）活性型血液凝固第■囚子の
調製法に関する。

４朋Ｊど贋造 血液凝固は、最終的にフィブリンクロットを生じさせる
種々の血液成分または因子の複雑な相互作用からなる過
程である。−最に、凝固カスケードと称される現象に関
与する血液成分は酵素的に不活性なタンパク質である１
０エンザイム（ｐｒｏ−ｅｎｚｙｍｅ）またはザイモゲ
ン（ｚｙ腸ｏｇｅｎ）であり、これらのタンパク質は、
活性化された別の凝固因子の作用によりタンパク質分解
酵素に転換される。こうして転換された凝固因子は一般
に「活性化された因子」と称される。

血液の凝固を助長し、そしてそれによって正常な止血に
関与する２つの独立した系が存在し、これらの系は各々
、　「内因性経路」および「外因性経路」と称されてい
る。内因性経路は血漿中のみ存在する因子の利用を介し
てトロンビンの形成を導く反応を意味する。該経路にお
ける中間的現象として活性型血液凝固第Ｘｌ因子（Ｆ　
Ｘ１ａ）およびカルシウムイオンにより触媒される反応
である血液凝固第Ｘ因子（Ｆ　ＩＸ）の活性化がある０
次に、活性型血液凝固第１Ｘ因子（Ｆ　ＩＸａ）は活性
型血液凝固第Ｖ因子（ＦＶＩＩａ）、リン脂質およびカ
ルシウムイオンの存在下で血液凝固第Ｘ因子（ＦＸ＞の
活性化に関与する。一方、外因性経路は血漿因子、およ
び組織抽出物中に存在する成分が関与する。前述のプロ
エンザイムの１つである血液凝固第■因子（ＦＶＩＩ）
は、活性型血液凝固第■囚子（ＦＶＩＩａ）への変換め
後に、組織因子およびカルシウムイオンの存在下でＦＸ
をＦＸａに転換することにより、血液凝固の外因性経路
に関与する。ＦＸａは次に活性型血液凝固第Ｖ因子（Ｆ
Ｖａ）、カルシウムイオンおよびリン脂質の存在下でプ
ロトロンビンをトロンビンに転換する。

ＦＸのＦＸａへの活性化は内因性経路および外因性経路
の両者に共通の現象であるから、ＦＶＩＩが不足してい
るかまたはＦＶＩＩの阻害物質（インヒビター）を有す
る血友病患者の治療のためにＦＶＩＩａを利用すること
ができる。さらに、ＦＶＩＩａはＦＩＸの活性化におい
て役割を演することにより内因性経路に関与することを
示唆する証拠も存在する。

ＦＶＩＩのＦＶＩＩａへの活性化はいくつかの異なる血
漿プロテアーゼ、例えば、ＦＸａおよび活性型血液凝固
第Ｘ１１因子（Ｆ　Ｘ１ｌａ）等により触媒される。

ところで血友病の補充療法において、ＦＶＩＩおよびＦ
［を投与された個体は、これらのタンパク質に対する抗
体をしばしば生じさせ、該抗体の存在のために止血管理
は甚だ困難となる。この問題を経験する患者は通常、Ｆ
　ｖｒｌａを含有する活性凝固酵素および不活性凝固酵
素の混合物からなることが知られている活性化されたプ
ロトロンビン複合体により治療される。

さらに、最近の研究によれば、投与された少量のＦＶＩ
Ｉａがその血漿中に高レベルの抗ＦＶＩＩ抗体を有する
血友病、・３者の重度の進行性出血を抑制するために有
効であることが明らかになっている（Ｉｌｅｄｎｅｒ、
　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、
　７１．　！１．１８３６（１９８３＞）。

ＦＶＩＩは１本鎖糖蛋白でビタミンに依存性凝固因子（
プロトロンビン、血液凝固第■因子、血液凝固第Ｘ因子
、血液凝固第Ｘ因子、プロティンＣ、プロティンＳ、プ
ロティンＺからなり、これらは構造上の相同性が高くプ
ロトロンビンファミリーとも呼ばれる）の１つである。

生理的には、組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ）
と複合体を形成し、血液凝固の開始反応を担う重要な蛋
白質である。また、Ｆ′ｌ／Ｉ［ａはＦＶＩＩのＡ、ｇ
１５２−１１ｅ１１１結合が限定分解を受け２本鎖にな
った糖蛋白で、その凝固活性はＦＶＩＩと比へ２５倍程
高いことが知られており、前述のように従来その止血管
理が困難とされているＦＶＩＩおよびＦＩＸに対する抗
体を有する血友病患者の治療に有用である。

ＦＶＩＩを調製するためには従来より各種の方法が提案
されており、特に血漿由来のし１・ＦＶＩＩを調製する
べく多くの試みがなされている（Ｐｒｙｄｚ、　Ｊ。

５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅ
ｓｔ、　１　、　ｐ、１０１．　（１９６４）；Ｇｌａ
ｄｈａｕｇ、＾、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｂｉｏｃｈ
ｉｓ、　　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　　Ａｃｔａ２１５、ｐ、
１０５．（１９７０）；　Ｌａａｋｅ、に、、　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｔｈｒａｓｈ。

Ｒｅｓ、　　５．　　ｐ、５３９．　　（１９７４）；
Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ、　　Ｓ、、　　ｅｔ　　ａｌ。

Ｔｈｒｏｌｌｂ　　Ｒｅｓ、　　６　、　　ｐ、２７３
　　（１９７５）；　　０ｓｔｅｒｕｄ、Ｂ、。

ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、＾ｃａ
ｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、＾、　　７４．　　Ｐ。

５２６０　（１９７７））、　　Ｌかしながら、これら
の調製法においてはＦＶＩＩの部分精製にとどまり、Ｆ
ＶＩＩそのものを純粋に物質として単離するまでには至
っていない。このような状況下、塩化バリウムによる吸
着処理ならびに硫酸アンモニウムによる塩析沈澱法、イ
オン交換クロマト法およびゲル濾過法よりなる精製方法
によりＦＶＩＩが良好に調製されることが報告された（
Ｂｒｏｚｅ、Ｊｒ、、Ｇ、Ｊ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、
　ＢｌｏｌＣｈｅｗ、　２５５．ｐ、１２４２　（１９
８０））、　　従来、ＦＶＩＩは血液中の濃度が極めて
低く、また、前述の類似する他のプロトロンビンファミ
リーとの分離が容易ではないため、血漿からＦＶＩＩを
工業的規模で単離することは困難であった。前述の方法
は、血漿からの実験室規模でのＦＶＩＩの調製という点
では優れた方法と考えられるが、工業的規模にこれを適
用することは、なお種々の困難を伴う。

ｌ− 上記問題点を克服するために、ＦＶＩＩに対する抗体を
調製し、該抗体を適当な担体に結合させて用いる免疫吸
着クロマトグラフィーを利用する、ＦＶＩＩまたは（お
よび）ＦＷａの調製方法が試みられた。

特にモノクローナル抗体を用いる免疫吸着法はその特異
性の高さにより有望視されるが、モノクローナル抗体を
免疫吸着法に応用する場合、通常、高濃度のグアニジン
あるいは尿素の様な変性剤を用いて、吸着した目的物質
を溶出しなければならず、この点が大きな問題となって
いた。すなわち。

目的とする溶出物が血液凝固因子のごときプロテアーゼ
等の場合、その活性を消失することが多く、医薬品の工
業的規模の製造に応用するには、なお、克服するべき大
きな障壁が残っていた。

上述の問題点を解決するべく、本願発明者等は鋭意研究
を重ねた結果、金属陽イオンの結合の有無に起因するコ
ンフォメーションの差異を識別するＦＶＩＩおよび（ま
たは）ＦＷａに対するモノクローナル抗体を見い出し、
当該モノクローナル抗体を免疫吸着クロマトグラフィー
に応用して、強力な変性剤を用いることなく、目的とす
るＦＶＩＩおよび（または）　Ｆ　Ｖｌ　ａを溶出し精
製することのできる本願発明を完成するに至った。すな
わち、本発明に用いられるコンフォメーション特異性モ
ノクローナル抗体を免疫吸着体として用いる場合、金属
イオン存在下でＦＶＩＩを吸着させ、次いで吸着させた
ＦＶＩＩから該因子に結合した金属イオンをＥＤＴＡの
様な金属キレート剤により除去すれば、ＦＶＩＩは金属
イオンと結合している時とは異なるコンフォメーション
をとることになり、吸着体に対する親和性が消失し、Ｆ
ＶＩＩが容易にかつ活性を損なうことなく溶出され、精
製取得することができる。

また、本願発明者等は、当該コンフォメーション特異性
モノクローナル抗体が、極めて低濃度の金属番こよるＦ
ＶＩＩまたは（および）ＦＶ！Ｉａのコンフォメーショ
ン変化を認識し得ることを見いだした。従来、出発材料
としてのＦＶＩＩまたは（および）ＦＶＩＩａ３含有す
る血漿は、血漿自体に含有される金属に起因する凝固を
抑制するために、クエン酸塩等の添加によって含有され
る金属は捕捉されている。比較的高濃度域での金属存在
下のコンフォメーション変化を認識する、金属依存性モ
ノクローナル抗体を用いる凝固因子の調製においては、
人為的な金属イオンの添加は不可欠であり、この操作を
行なうことによる目的とする凝固因子への悪影響は避は
難いものであった。

本願発明によって見いだされた低濃度の金属によるＦＶ
ＩＩのコンフォメーション変化を認識し得る当該モノク
ローナル抗体を利用すれば、採取直後の血液にＥＤＴＡ
あるいはＥＧＴＡのような金属キレート剤を添加するこ
とにより、血漿中のカルシウムイオンに代表される金属
イオン濃度は低濃度に制御され、この血漿を前記モノク
ローナル抗体を固定化した免疫吸着体に通液することに
よって、凝固を生じることなく、より天然のものに近い
ＦＶＩＩまたはくおよび）　Ｆ　Ｖｌ　ａを調製するこ
とができる。上述のように、従来、不可能であったＦＶ
ＩＩの好適な工業的調製が、本発明により初めて可能と
なった。

さらに特筆すべきことに、本発明の方法に従えば、新鮮
血漿を陰イオン交換体で処理して得られる、　Ｐｒｏｔ
ｈｒｏｍｂｉｎ　　ｆａｍｉｌｙ　　ｒｉｃｈ　　ｆｒ
ａｃｔｉｏｎ　（ＦＶＩＩベーストと呼ぶ）を原料とし
て一段階でＦＶＩＩのみならずＦＶＩＩａを調製するこ
とができる０例えば、ＦＶＩＩペーストを溶解する時の
温度やプロテアーゼインヒビター（ＡＴｍ−ヘパリン、
ベンズアミジン等）添加の有無等の条件を選択すること
により、コンフォメーション特異性抗ＦＶＩＩおよび（
または）ＦＷａモノクローナル抗体カラム処理後の溶出
画分をＦＶＩＩとして得ることもできるしＦＶ！［ａと
して得ることもできる。すなわち、ＦＶＩＩペーストを
溶解する際にプロテアーゼインヒビターを添加し、かつ
低温下で処理し、該出発原料を低温下で、本発明のコン
フォメーション特異性モノクローナル抗体カラムに適用
すれば溶出画分はＦＶＩＩとして、また、出発原料であ
るＦＶＩＩペーストをプロテアーゼ未添加の条件で室温
下で溶解し、室温条件でコンフォメーション特異性モノ
クローナル抗体カラム処理すると溶出画分はＦＶＩａと
して得ることができる。　Ｆ　Ｖｌ　ａは従来、ＦＶＩ
Ｉ精製後、Ｆ　Ｘ１ｌａあるいはリン脂質、カルシウム
陽イオン共存下ＦＸａで活性化する方法により調製して
いたが、活性化に用いる上記１０テアーゼの調製が煩雑
なうえ、その除去法も大きな問題となる。しかしながら
、上記の方法によれば、原料であるヒト血漿から、ＦＶ
ＩＩのみならずＦ　Ｖｆｉ　ａを本願発明のモノクロー
ナル抗体カラムを用いることにより簡便かつ高収率に得
られるという点で、本発明の方法は従来にない極めて画
期的なものと結論することができよう。

本発明を利用した高純度ＦＶＩＩおよび（または）ＦＶ
ＩＩａの調製方法の諸工程の一例を以下に示す。

■まず、本発明によって得られたカルシウムイオンをは
じめとする金属陽イオンの結合の有無に起因する、ＦＶ
ＩＩおよび（または）ＦＶＩＩａの微細なコンフォメー
ション変化の差異を識別する性質を有するモノクローナ
ル抗体をマトリックス（担体）に固定化したカラムに、
該金属イオンの存在条件下、ト“■および（または）　
Ｆ　Ｖｌｌ　ａを含有する出発材料を通液する。上記出
発材料としては、特に制約はないが例えば、血漿および
組換えＤＮＡ技術によって産生されたＦＶＩＩを含有す
る材料等が適用される。

■次に、カラムに非特異的に結合した夾雑タンパク質を
除去するために、適切な洗浄用［（Ｆ＋液でカラムを充
分洗浄する。

■カラムに結合している活性を有するＦＶＩＩおよび（
または）ＦＶｕａを、ＥＤＴＡ等の金属キレート剤を含
有する溶液で溶出する。

■溶離したＦＶＩＩおよび（または）ＦＶ！Ｉａを含有
する溶出液は、透析やゲルｒ過法により必要に応じて脱
塩、緩衝液置換を行なう。

■該凝固因子含有溶液の濃縮には、既知の方法である限
外濾過法、凍結乾燥法、および陰イオン交換クロマトグ
ラフィー等の方法を用いることができる。

なお、本発明に用いられるＦＶＩＩおよび（または）Ｆ
　ＶＩ［ａに対するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマは工業技術院微生物工業技術研究所（微工研
）に１０８３４号（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０８３４）の寄託
番号で寄託されている。

以下、本発明の特徴をさらに明らかにするため、実施例
に沿って詳述する。

１崖１ コンフォーメーショ・ン特異性抗ＦＶＩＩモノクローナ
ル抗体の調製 ■ 新鮮凍結血漿を３７℃で素早く融解した後、４℃におい
てゆっくり攪拌しながら１／　１０容の塩化バリウムを
滴下し、２時間放置した。　　４０００ｒｐｍ、　　５
分間４℃にて遠心処理を行ない沈澱を回収し、Ｔｒｉｓ
−塩ｌ！！２榎街液に懸濁した。この溶液を３０％〜７
０χの硫酸アンモニウム塩析沈澱を行ない、得られた沈
澱を再懸濁後、ＤＥＡＲ−セファローズクロマトグラフ
ィーを行なった。

９１１６．０のリン酸バッファーで０．０５Ｍ→０．５
Ｍの塩化ナトリウムの濃度勾配でＦＶＩＩを含む両分を
得た。

透析後、この画分をＱＡＥ−セファデックスカラムに通
液し、洗浄後、塩化カルシウム含有ＩＩ衝液で溶出した
。更にセファッデックスａ−ｔｏｏカラムでゲルー過し
、精製後、アミコンの限外濾過器で濃縮した。精製した
ＦＶＩＩは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
で単一バンドを示し、他の凝固因子の混入は認められな
かった。

ロー 上記で得られた精製ＦＶＩＩの５０μ９を５０Δの生理
食塩水に溶解し、アジュバントとしてＤＩＦＣＯ社のフ
ロイントの完全アジュバント１００Ｊを加えて油中水滴
型としたものを基礎免疫抗原とした。また追加免疫用抗
原として上記の精製ＦＶＩＩ５０μ９を５０Δの生理食
塩水に溶かして調製したものを用いた。

ＢＡＬＢ／Ｃマウス７週令（♀）を用い、基礎免疫原を
接種後、追加免疫用抗原を６０日１に免疫したマウスよ
り得られたマウスＩＩ！！！臓細胞を通常の方法により
マウスミエローマ細胞（Ｐ３−Ｘ６３−＾ｇ８−旧）と
融合させクローニングして第■因子特異性モノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ５種を得た。各々をマ
ウス腹腔内で増殖させることによってハイブリドーマを
大量に調製し、これより各モノクローナル抗体を得た。

ム　　　　ロ　　　脅　ゝ １シー二≦ＬΩ」Ｌ定 上記（２）で得られた５種のハイブリドーマが産生ずる
モノクローナル抗体の抗原特異性を次のようにして測定
した。

測定は、次の如＜　ＥＬＩＳＡ法で行なった。

１、抗原のコーティング ２枚のマイクロタイタープレートに１０ｍＭ　トリス塩
酸（ｐＨ＝７．５）１５０ｍＭ　ＮａＣ１で２ｔｔｑ／
−に調製したヒトＦＶＩＩ（上記で精製したのと同じも
の）５０ＩＡを添加し、３７℃で６０分間インキュベー
トした。

２、洗浄 ２ｍＭＣａＣｌ２及び２ｍＭＥＤＴＡをそれぞれ含む、
２通りの１０■Ｍトリスー塩酸（ｐｌ（コア、５〉、０
．５ＭＮａＣ１，０，１％Ｔｗｅｅｎ　２０からなる１
ｌｉｌ液を調製し、　１枚のマイクロタイタープレート
は、２　ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む緩衝液で、もう１枚の
プレートは２＠ＭＥＤＴＡを含む［１１液でそれぞれ、
４回づつ洗浄した。

３ブロツキング １πウシ血清アルブミンを含む１０ｍＭ　）リス−塩酸
（ＰＩ（・７．５）１５０ｍＭ　ＮａＣ＋溶液を調製し
、その２００ＪＡを各プレートに添加し、３７℃で３０
分間インキュベートした。

４、ハイブリドーマ上清添加 ハイブリドーマ上清４０Δを各プレートの列毎に添加し
、３７℃で６０分間インキュベートした。

５、第２抗体及び発色 各プレートにペルオキシダーゼを結合した抗マウスＩｇ
Ｇウサギ抗体５０−を添加し、２５℃で６０分間インキ
ュベートした。その後０−７エニルジアミン溶液を１０
０Ｊ添加し、２５℃で１０分間反応させ、４９２ｎｉ＋
の波長で吸光度を測定した。

結果は、第１表のとおりであり、いずれもＦＶＩＩ特異
性であるが、その中でクローンＮｏ、　３〜Ｎｏ、　５
はＣａ−イオンとの結合によって生じるコンフォメーシ
ョンのみを特異的に認識することが判明した。

なお、イムノグロブリンサブクラスの同定はゲル内沈降
反応により行なった。その結果、今回得られたハイブリ
ドーマより産生される抗体のサブクラスはすべてＩｇＧ
１であった。

第１表 −プレートに３７℃６０分コーティングした。以下、ウ
シ血清アルブミンによるブロッキング、洗浄、モノクロ
ーナル抗体の添加、及び発色の手順は、前記（３）と同
様である。全てのクローンは、２価のカルシウム陽イオ
ンの存在下でＦＶＩＩのみに反応し、他の各凝固因子及
びウシ血清アルブミンとは反応しなかった（第３−１表
参照）、なお、金属キレート剤により系からカルシウム
陽イオンを除去するとクローンＮｏ、　３〜５の第■因
子結合性は消失した（第３−２表参照）。

前記〈２）で得られた各モノクローナル抗体の抗原特異
性を次の様にして更に確認した。実験は前記と同様にＥ
ＬＩＳＡ法で行なった。確認する抗原として、プロトロ
ンビン、ＦＶＩＩ、ＦＩＫ、ＦＸ、プロティンＣ、プロ
ティンＳ及びウシ血清アルブミンを用いた。各々精製し
た抗原を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐＨ＝７．５＞０
．１Ｍ　ＮａＣ１て５μ９／−に調製し、マイクロタイ
タロー コ 第３−１表 モノクローナル抗体の他の凝固因子との反応（Ｃａ”存
在下） 第３−２表 モノクローナル抗体の他の凝固因子との反応（Ｅ　Ｄ　
Ｔ　Ａ存在下） 実験は、前記（３）と同様にＥＬＩＳＡ法で行なった。

前記（１）で精製したＦＶＩＩをマイクロタイタープレ
ートにコーティングした。

ＭｇＣｌ２．５ｒＣ１２、ＢａＣＩ２．　　ＭｎＣ１２
、ＣａＣｌ２（濃度はすべて２　ｓ＋Ｍ　）をそれぞれ
含む５通りの１０１１Ｍトリス塩酸（ｐＨ＝７．５＞　
０．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．Ｂ　Ｔｗｅｅｎ　２０からな
る［１液をｍ製し、マイクロプレートの各列を上記５種
類の金属イオンを含むＭ！！液でそれぞれ４回づつ洗浄
した。以下、ウシ血清アルブミンによるブロッキング、
モノクローナル抗体の第２抗体の添加及び発色の手順は
、前記（３）と同じである。

結果を第４表に示した。

第４表 その結果、金属の結合に起因するコンフォーメーション
を認識するクローンＮ０１３〜５の３種類のクローンの
うちＮｏ、　４および５はＣａ−およびＭｎ’　”に特
異性を有し、Ｎ０１３は表に見られるようにＣａ−をは
じめとする数種類の金属陽イオンが適用され得ることが
判明した。

前記（１）で精製したＦＶＩＩをマイクロタイタープレ
ートにコーティングした。

ＣａＣ１ａをそれぞれの濃度含有するように調整した１
ｈＭ　トリス−塩酸（ｐＨ＝７．５）　０．５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１，０，１篤Ｔｗｅｅｎ　２０からなる緩衝液を調製
し、マイクロプレートの各列を各々の濃度のカルシウム
イオンを含むＩｌｌ液でそれぞれ４回づつ洗浄した。以
下、ウシ血清アルブミンによるブロッキング、モノクロ
ーナル抗体の第２抗体の添加及び発色の手順は、前記（
３）と同じである。１０ｍＭのカルシウムイオン存在下
での結合率を１００％とした場合の、各イオン濃度存在
下での相対結合率を第５表に表す。

第５表 実験は、前記（３）と同様にＥＬＩＳＡ法で行なった。

この結果、本願発明のモノクローナル抗体は、１ｍＭ以
下のカルシウムイオンの存在でＦＶＩＩまたは（および
）ＦＶｌｌａに対して特異的な結合性を有し、該結合性
がカルシウムイオンの当該濃度域で濃度に依存して減少
する特性を有していることが明かになった。

（ｌ）、免疫吸着クロマトグラフィーの調製交差結合ア
ガロースゲルであるセファロースＣＬ４Ｂを担体として
常法、例えばＪ、Ｐｏｒａｔｈ　ｅｔａｌ、、Ｊ、　Ｃ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ、　８６．　ｐ、５３．　（
１９７３＞に記載された方法に準じて、第４表中クロー
ンＮ０９３で規定される（寄託番号ＦＥＲＮ　Ｐ−１０
８３４）ハイブリドーマより産生されるモノクローナル
抗体を固定化した。

（２＞、ＦＶＩＩの調製 クリオプレシピテートを除去したヒト新鮮凍結血漿から
陰イオン交喚処理によりｐｒｏｔｈｒｏ■ｂｉｎｆａｍ
ｉｌｙ　　ｒｉｃｈ画分を溶出し、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）処理により沈澱濃縮した。この沈澱をプ
ロテアーゼインヒビター存在下、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ
、０、１５Ｍ　ＮａＣ１ｐＨ７，４１１街液で溶解し、
最終濃度５ｍＭになるようにＣａＣｌ２を添加し、０．
０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　０．１５ＭＮａＣ１５ｍＭ　ＣａＣ
１ｐ　ｐＨ７、４榎ｍ液で平衡化した（１）で調製した
コンフォメーション特異性抗ＦＶＩＩおよび（または）
ＦＷａモノクローナル抗体カラムに通液し、平衡化緩衝
液で洗浄後、０．０５ＭＴｒｉｓ、０．１５Ｍ　ＮａＣ
＋、１０議ＭＥＤＴＡ、　　ｐＨ７，４［衝液で溶出し
た。溶出画分はＦＶＩＩ以外にわずかな夾雑物を認めた
が、更なるＤＥＡＥ−３ａｐｈａｒｏｓｅクロマト処理
により５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一
バンドのＦＶＩＩとなった。なお、すべての工程は４℃
で行なった。

＜３）、新鮮血漿からのＦＶＩＩの迅速調製新鮮血漿に
ＥＧＴＡを最終濃度２．１３ｍＭになるように添加し、
２００＋＊Ｍマレイン酸でｐＨを６．８に１！１整する
。この時、血漿中の遊離のカルシウムイオン濃度は約３
０μＭに制御される。この状態では血漿は殆ど凝固しな
い、こうして処理された血漿を、３０ＭＭ　ＣａＣｌ２
１５０ｍＭ　　）リスマレイン酸バッファーｐＨ６，８
で平衡化した、上記（１）で調製した免疫吸着体に通液
し、同バッファーで洗浄後、ｌＯｍＭＥＤＴ　Ａ　１５
０■Ｍ　トリスマレイン酸バッファーｐＨ６，８で溶出
すると、５ＤＳ−ＰＡＧＥで均一なバンドを示すより天
然の状態に近いＦＶＩＩが好適に調製される。

（４）、　Ｆ　Ｖｌ　ａの調製 クリオプレシピテートを除去した新鮮凍結血漿から陰イ
オン交換処理によりＰｒｏｔｈｒｏｓｂｉｎ　ｆａｍｉ
ｌｙｒｉｃｈ画分を溶出し、ポリエチングリコール（Ｐ
ＥＧ）処理により沈澱・濃縮した。この沈澱をｐＨ７，
４，０，０５ＭＴｒｊｓＩ街液（０，１５Ｍ　　ＮａＣ
ｌ、　５　ｍＭ　　ＣａＣ＋２含有）により室温で溶解
後、上記緩衝液で平衡化したコンフォメーション特異性
抗ＦＶＩＩおよび（または）ＦＶＩＩａモノクローナル
抗体カラムに通液し、平衡化Ｍ漬液で洗浄後、ｐＨ７，
４０，０５Ｍ　Ｔｒｉｓｌ！衝液　（０漬液１５Ｍ　Ｎ
ａＣｌ、１０ｖＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有）で溶出した。

溶出画分はＦＶＩａ以外にわずかな夾雑物を認めたが、
更なるＤＥＡＥ−３ｅｐｈａｒｏｓｅクロマト処理によ
り、Ｓ［）Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一
バンドのＦＶＩａとなった。

なお、この蛋白がＦ　Ｖｌ［ａであることは以下の証拠
により明かである。

■５０単位／μ９の比活性を有し、これはＦＶＩＩと比
較して２５−３０倍アップしている。

■５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により還元
型で２本鎖となり、その分子量が一致する。

■アミノ酸配列の成績からＡ、ｇ＋ｓ＊−１１ｅ＋ｓ３
の結合の切断が認められる。

なお、血液凝固第■因子の活性測定は以下の方法に従っ
た。

血液凝固第■因子欠乏血漿を用いたプロトロンビン（Ｐ
Ｔ）時間法（参考文献Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
。

８０、２２８−２３７．１９８１）により測定した。す
なわち、欠乏血漿０．１−１希釈試料０．１−１組織ト
ロンボプラスチン溶液０．１−を２分間インキエベート
し、０、０２５Ｍ　ＣａＣ１ｚ溶液０．１１を添加後、
凝固する・までの時間を測定する。予め、希釈試料の代
わりに段階希釈した正常血漿を用いて標準曲線を作成し
これより試料中の第■因子活性を測定する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法に従いＦＶＩＩおよび・（または
）ＦＷａを精製する時のクロマトグラフィーの溶出パタ
ーンを示すものである。 第２図は、本発明の方法に従って調製されたＦＶｌｌａ
の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示
し、ＮＲは非還元状態の試料、Ｒは還元処理後の試料、
ＭＷママ−−は分子量マーカーを表す。 ｏ−一つ Ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ 抗ＦＶＩＩモノクローナル抗Ｉ４：を用いてのイム、／
アフ、″ニティクロ１トゲラフ、−第１図

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）血液凝固第VII因子（ＦVII）または（および）活
   性型血液凝固第VII因子（ＦVIIａ）に対して特異的な結
   合性を有し、且つ該結合性が２価の金属陽イオンの存在
   濃度に依存するモノクローナル抗体。
2. （２）前記金属陽イオンがカルシウムイオン、マンガン
   イオン、バリウムイオン、マグネシウムイオン、ストロ
   ンチウムイオンから選ばれる特許請求の範囲第（１）項
   記載のモノクローナル抗体。
3. （３）１ｍＭ以下のカルシウムイオンの存在下でＦVII
   または（および）ＦVIIａに対して特異的な結合性を有
   し、該結合性がカルシウムイオン濃度に依存する特性を
   有する特許請求の範囲第（１）項記載のモノクローナル
   抗体。
4. （４）工業技術院微生物工業技術研究所に寄託番号１０
   ８３４号（ＦＥＲＭ：Ｐ−１０８３４）で寄託されてい
   るハイブリドーマにより産生される特許請求の範囲第（
   １）項記載のモノクローナル抗体。
5. （５）前記モノクローナル抗体を適当な担体に固定化し
   て吸着体とし、ＦVIIまたは（および）ＦVIIａを含有す
   る出発材料を前記金属陽イオンの存在下、該吸着体に接
   触させてＦVIIまたは（および）ＦVIIａを該モノクロー
   ナル抗体に結合させ、金属キレート剤を含有する溶液を
   用いてＦVIIまたは（および）ＦVIIａを該モノクローナ
   ル抗体から溶離させる工程を含むことを特徴とするＦV
   IIまたは（および）ＦVIIａの調製方法。
6. （６）ＦVIIまたは（および）ＦVIIａを含有する採取直
   後の血漿のカルシウムイオン濃度を１ｍＭ以下に抑制し
   、さらに人為的な金属イオンの添加を行なわずに、過剰
   の金属イオンによるＦVIIまたは（および）ＦVIIａへの
   影響を回避することを特徴とする特許請求の範囲第（５
   ）項記載のＦVIIまたは（および）ＦVIIａの調製方法。
7. （７）ＦVIIまたは（および）ＦVIIａを含有する出発材
   料を前記金属陽イオンの存在下、前記モノクローナル抗
   体を適当な担体に固定化した吸着体に接触させ、ＦVII
   または（および）ＦVIIａを該吸着体に吸着させる工程
   、並びに金属キレート剤を含有する溶液を用いてこれら
   を該モノクローナル抗体から溶離させる工程を室温で行
   なうことによって、特定のＦVIIからＦVIIａへの活性化
   工程を必要としないＦVIIａの調製方法。
8. （８）前記ＦVIIまたは（および）ＦVIIａを含有する出
   発材料がプロトロンビンファミリーを高濃度で含有する
   ペーストをカルシウムイオン含有緩衝液を用いて室温で
   溶解したものである特許請求の範囲第（７）項記載のＦ
   VIIａの調製方法。