JPH0753107B2 - 活性化プロテインｃの製造法 - Google Patents

活性化プロテインｃの製造法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、プロテインＣをプロテ
アーゼで処理するによる活性化プロテインＣの製造法に
関する。
【０００２】
【従来の技術とその課題】プロテインＣはビタミンＫ依
存性の糖タンパク質であり、この糖タンパク質は肝臓で
合成され、血漿中で不活性酵素原(チモーゲン)として４
μg／mlの濃度で循環する。プロテインＣは血管壁の表
面(内皮)上のトロンビン-トロンボモジュリン複合体に
よって活性なセリンプロテアーゼ(活性化プロテインＣ)
に変換される。またヘビ毒因子(プロタックＣ(Protac
C))などいくつかの非生理学的酵素によってプロテイン
Ｃを活性化することもできる。活性化プロテインＣはプ
ラスミノーゲン活性化因子阻害物質の不活化および未知
のプロテインＳ依存性機序ゆえにフィブリン溶解特性を
有することが知られている。またこれは因子Ｘaが誘導
するプロトロンビン活性化(トロンビン生成)の補因子で
ある因子Ｖa、ならびに因子IＸaが誘導する因子Ｘ活性
化の補因子である因子ＶIIIaの両方をタンパク加水分解
的に分解するので、これは抗凝固効果をも有する。
【０００３】プロテインＣの生体内での活性化は、トロ
ンビンの生成における負のフィードバック反応を構成す
る。最適な生物活性を発揮するためには補因子(プロテ
インＳ)が必要である。
【０００４】血漿性プロテインＣの生体外での活性化は
知られており、これはトロンビン、トロンビン-トロン
ボモジュリン複合体あるいはヘビ毒などの活性化物質で
の処理によって行われる。
【０００５】ＥＰ-Ａ-０２８７０２８では、トロンビン
-トロンボモジュリン複合体を添加することによってプ
ロテインＣを活性化している。この反応を抗トロンビン
IIIによるトロンビンの阻害によって停止させ、アフィ
ニティークロマトグラフィーを用いて活性化プロテイン
Ｃを精製する。
【０００６】Thrombosis Research 59,27-35(1990)に
は、溶解したトロンビンまたは固定化トロンビンによる
プロテインＣの活性化、あるいはプロトロンビン複合体
調製物の再カルシウム化によるプロテインＣの活性化が
記述されている。使用されたトロンビンはウシ由来であ
り、したがってウシの物質による生成物の汚染の危険性
を伴う。さらに、この活性化工程は活性化プロテインＣ
に微量のトロンビンが混入し、そのために活性化に続い
て一連のアフィニティークロマトグラフィー精製操作を
必要とするという不都合を有する。
【０００７】本発明の目的は、上に指摘した不都合を伴
わないプロテインＣ活性化の改良法を提供することにあ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】最初に限定した種類の方
法では、本発明に従ってプラスミンでプロテインＣを処
理することによってこの目的が達成される。
【０００９】フィブリン溶解に不可欠な酵素であるプラ
スミンが、完全に新しい活性化法が実現可能なほど迅速
で簡単な様式でプロテインＣの活性化を達成することが
わかった。
【００１０】このプロテインＣ活性化は、８０〜４００
００の範囲のプロテインＣ／プラスミン比(μg／ＣＵ)
で実行することが有利であり、好ましくは４０００〜４
００００の範囲で実行する。最も好ましくは３７℃付近
の温度でこの活性化を行う。ヒトプラスミンはヒトプラ
スミノーゲンから容易に製造でき、また(例えばKabiか
ら)市販されている。
【００１１】本発明の活性化は迅速に、即ち時には数分
以内に起こり、それゆえにこの反応を減速させるために
はカルシウムイオンの添加(５〜５０mmol／l)が有利で
あり得る。
【００１２】プラスミンによるプロテインＣの活性化
は、トロンビンによる場合とは反対に、プロテインＣ調
製物中の微量の活性化剤がこの調製物の抗凝固効果およ
び／またはフィブリン溶解効果を一層増強させるという
利点を有する。
【００１３】プロテアーゼとしてのプラスミンは(とり
わけ高プラスミン濃度では)プロテインＣをさらに分解
し得るので、比較的短いインキュベーション時間後に、
抗トロンビンIIIまたは抗トロンビンIII-ヘパリン複合
体などのプラスミン阻害剤を添加することによってこの
反応を停止させることが有利である。例えば望ましい活
性化度(例：少なくとも０.１５ｄＵ／分 Ｓ２３６６の
活性)に達した時に、この反応を停止させることができ
る。
【００１４】プラスミン処理によって活性化されたプロ
テインＣは、その活性に関して、あるいはそのＳＤＳ-
ＰＡＧＥ分析において、従来のようにトロンビンで活性
化されたプロテインＣと異ならない。
【００１５】以下に本発明をさらに詳細に記述する。
【００１６】
【実施例】実施例１ ：プロテインＣの製造 市販のプロトロンビン複合体濃縮物から得た粗プロテイ
ンＣ画分から、高度に精製したプロテインＣを回収し
た。精製は、モノクローナル抗体を用いるアフィニティ
ークロマトグラフィーによって達成した。モノクローナ
ル抗プロテインＣ抗体を次のように製造した。
【００１７】ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、２週間間隔で腹腔
内注射することによりヒトプロテインＣ １００μgで免
疫化した。６週間後、ヒトプロテインＣをさらに５０μ
g注射し、その３日後に融合を実行した。骨髄腫細胞株
(Ｐ３-Ｘ-６３-ＡＧ８-６５３、１.５ｘ１０7細胞)を
１.７ｘ１０8のマウス脾細胞と混合し、KohlerおよびMi
lesteinの改良法に従って、ＰＥＧ１５００を用いて融
合した(Kohler G.,Milestein C.,Nature 256(1975),495
-497)。
【００１８】ＥＬＩＳＡを用いて検定した陽性クローン
を２回サブクローニングした。プリスタン(Pristan)処
理の２週間後、ＢＡＬＢ／Ｃマウス１匹あたり５ｘ１０
6ハイブリドーマ細胞を注射することによって、腹水産
生を達成した。
【００１９】硫酸アンモニウム沈殿後、ＱＡＥ-セファ
デックスでクロマトグラフィーを行い、さらにセファデ
ックスＧ２００でクロマトグラフィーを行うことによっ
て、腹水から免疫グロブリンを精製した。ネズミ・ウイ
ルスの伝染の危険性を減じるために、固定化に先立って
抗体をさらにウイルス不活化操作に付した。このように
して得たモノクローナル・プロテインＣ抗体をＣＮＢｒ
-活性化セファロース４Ｂ(ファルマシア)に結合させ
た。アフィニティークロマトグラフィーによるプロテイ
ンＣの精製には次の緩衝液を使用した。 吸着緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ、２mM ＥＤＴＡ、０.２
５M ＮａＣｌ、５mM ベンズアミジン； 洗浄緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ、１M ＮａＣｌ、２mM ベ
ンズアミジン、２mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７.４； 溶出緩衝液：３M ＮａＳＣＮ、２０mM Ｔｒｉｓ、１M
ＮａＣｌ、０.５mM ベンズアミジン、２mM ＥＤＴＡ。
【００２０】詳細：プロトロンビン複合体濃縮物を吸着
緩衝液に溶解した(モノクローナル抗体カラム２０mlに
ついて約１０gのプロトロンビン複合体濃縮物を使用し
た)。次いで、溶解したプロトロンビン複合体濃縮物を
濾過し、２００００r.p.m.で１５分間遠心分離し、０.
８μmフィルターを通して滅菌濾過した。溶解し滅菌濾
過したこのプロトロンビン複合体濃縮物を１０ml／時間
の流量でカラムに添加した。次いで、このカラムを洗浄
緩衝液で洗浄することによりタンパク質を除去し、最後
に溶出緩衝液を５ml／時間の流量で流すことによって、
結合したプロテインＣを溶出させ、その分画を集めた。
溶出したプロテインＣを緩衝液(０.２mol／lＴｒｉｓ、
０.１５M グリシン、１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ８.３)に対し
て透析した。プロテインＣ抗原濃縮物をLaurellが記述
した方法を用いて決定し、プロタック(Protac)活性化を
用いてプロテインＣ活性を決定した。
【００２１】このようにして得られたプロテインＣ溶出
液を次の方法で医薬的に適用可能な調製物に仕上げた。
【００２２】この溶出液をまず限外濾過およびダイアフ
ィルトレーション操作にかけた。ダイアフィルトレーシ
ョンは１lあたりＮａＣｌ １５０mmolおよびクエン酸三
ナトリウム・２Ｈ2Ｏ １５mmolを含有する緩衝液(ｐＨ
７.４)で行った。次に、得られた濾液を凍結乾燥し、８
０℃±５℃および１３７５±３５mbarで１時間蒸気処理
することによってウイルスを不活化した。
【００２３】次に、凍結乾燥したウイルス不活化物質を
滅菌等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、存在するかもしれない
抗体または血清アミロイドＰをＱ-セファロースによる
イオン交換クロマトグラフィーを用いて除去した。この
精製溶液を再び限外濾過およびダイアフィルトレーショ
ン操作によって濃縮した。この操作の後、１lあたりア
ルブミン１０g、ＮａＣｌ １５０mmolおよびクエン酸三
ナトリウム１５mmolを得られた溶液に加えた。この溶液
のｐＨは７.５であった。ネズミの免疫グロブリンも因
子II、ＶII、IＸおよびＸも検出できなかった。
【００２４】次いでこの溶液を滅菌濾過し、容器に充填
し、凍結乾燥した。比活性は１４単位プロテインＣ／mg
であった。プロテインＣ活性の１単位を正常血漿１ml中
のプロテインＣ活性と定義し、プロテインＣの第１国際
標準(the first internationalstandard)に対して較正
した。アミド分解検定を活性試験として用いた。この試
験では、プロタック(Protac;ペンタファーム(Pentaphar
m))を用いてプロテインＣを活性化した。
【００２５】実施例２ ：プラスミンによるプロテインＣの活性化 プロテインＣを生理食塩溶液に溶解して４００μg／ml
の溶液を得、１０Ｕ／ml ヒルジン(シグマ)を混合し
た。市販のプラスミン調製物(Kabi)を０.４％クエン酸
ナトリウム／０.７％塩化ナトリウム緩衝液に溶解し、
それぞれ０.０１、０.０２５、０.０５、０.１および
０.５のカゼイン分解プラスミン単位(ＰＭ)／mlを有す
る５種類の溶液に希釈した。
【００２６】プロテインＣを活性化するために、プロテ
インＣ-ヒルジン溶液１００μｌの５試料それぞれを上
記のプラスミン溶液１００μｌと混合した。３７℃で
１、５、１０、３０および６０分間インキュベートした
後、アセプレックス(atheplex)溶液(ＥＰ-Ｂ-０１２９
５３４に従って調製した抗トロンビンIII-ヘパリン複合
体、２３Ｕ抗トロンビンIII／mlおよび１５０Ｕヘパリ
ン／ml ０.９％ＮａＣｌ溶液)の添加によってこのプラ
スミン反応を停止させた。特異的色素原基質(Ｓ２３６
６；Kabi)を用いて活性化プロテインＣの活性をアミド
分解的に測定した。結果は添付の図１より明白である。
図１では時間(分)を横軸上にとり、活性(ｄＵ／分 Ｓ２
３６６)を縦軸上にとっている。図１は、プラスミンに
よるプロテインＣの活性化が時間依存性かつ投与量依存
性であることを立証している。この反応中、プラスミン
に対するプロテインＣの比(μg／ＣＵ)は、それぞれ４
００００：１、１６０００：１、８０００：１、４００
０：１、および８００：１であった。
【００２７】さらに、プラスミンはプロテインＣを活性
化するだけでなく、長時間暴露すると活性化プロテイン
Ｃの分解を引き起こすことがわかった。とりわけプロテ
インＣ／プラスミン比が８０μｇ／ＣＵより低いときに
これが当てはまる。例えばプロテインＣ／プラスミン比
が８μg／ＣＵの場合、６０分間のインキュベーション
で活性化プロテインＣが完全に分解した。
【００２８】実施例３ ：活性化プロテインＣの免疫ブロッティング プラスミンで活性化したプロテインＣおよびトロンビン
で活性化したプロテインＣならびにプロタック(Pentaph
arm)で活性化したプロテインＣを用いて免疫ブロッティ
ングを行った。活性化プロテインＣが活性化の種類とは
無関係に常に同じ免疫ブロットを与えることが立証され
た。
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミンによるプロテインＣ活性化反応の
時間および投与量依存性を表す。横軸は時間(分)を表
し、縦軸は活性(ｄＵ／分 Ｓ２３６６)を表す。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 プロテインＣをプロテアーゼで処理して
    活性化することからなる活性化プロテインＣの製造法で
    あって、該プロテアーゼがプラスミンである活性化プロ
    テインＣの製造法。
  2. 【請求項２】 該活性化を８０〜４００００μｇ／ＣＵ
    の範囲のプロテインＣ／プラスミン比で実行する請求項
    １の製造法。
  3. 【請求項３】 該活性化を４０００〜４００００μｇ／
    ＣＵの範囲のプロテインＣ／プラスミン比で実行する請
    求項１の製造法。
  4. 【請求項４】 該活性化をＣａ2+イオンの存在下で実行
    する請求項１の製造法。
  5. 【請求項５】 さらにプラスミン阻害剤を添加すること
    によって該活性化を停止させることを含む請求項１の製
    造法。
JP4160954A 1991-06-20 1992-06-19 活性化プロテインｃの製造法 Expired - Fee Related JPH0753107B2 (ja)

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