JP4885707B2 - セリンプロテアーゼを含むｇｌａ−残基の生産方法 - Google Patents

セリンプロテアーゼを含むｇｌａ−残基の生産方法 Download PDF

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Description

本発明は、プロテアーゼタンパク質の生産、精製、及び処方の方法に関する。
例えばVII因子、VIII因子、IX因子、Ｘ因子、及びVIII因子を含む、凝固カスケードに関与している多くのタンパク質は、種々の病理学的状態の治療に有用な治療薬であることが判明している。一般に、凝固「カスケード」と称されているものに関与している血液成分は、酵素前駆体またはチモーゲン、それ自身活性化された凝固因子である活性化因子の作用によってタンパク分解性の酵素に転換される酵素的に不活性なタンパク質、である。そのような転換を受け、一般に「活性因子」と称される凝固因子は、小文字「a」の添え字を加えて名付けられる（例えば、活性化された因子VII（FVIIa））。
医薬品の原料としてヒトの血漿を用いることは、多くの不利益を生じるために、組換え系においてそれらのタンパク質を生産することが好ましい。しかしながら凝固タンパク質は、例えば、アスパラギンが結合される（Ｎ−結合）グリコシル化；Ｏが結合されるグリコシル化；及びｇｌｕ残基のγ−カルボキシル化を含む、種々の翻訳同時修飾及び翻訳後修飾を受けやすい。このため、組換えタンパク質を適切に修飾可能な哺乳類細胞中でそれらを生産することが好ましい。
微生物又は細胞株の培養物からの凝固タンパク質の生産における最終生産工程は、回収であり、及び任意に、所望の生産物を濃縮することである。細胞が増殖し、分泌されたタンパク質、特に、所望の細胞内タンパク質を含む細胞溶解産物を含む培養培地は、培地成分や核酸等のような他の混入物とは別に、細胞によって生産された他のタンパク質をも多かれ少なかれ含んでいる。それ故、精製されたタンパク生産物を得るために、所望のタンパク質を、所望のタンパク質を含む粗製物質中の他のタンパク質及びポリペプチド及び他の不純物から分離する必要がある。
米国特許第5,700,914はFVII精製の方法に関し、ここでは少なくとも一つの精製工程において亜鉛が存在する。
伝統的な培養、精製工程の間、及び伝統的な処方において、活性化された凝固タンパク質は、該タンパク質のタンパク質分解性機能のために、自己分解する傾向を有している。従って、当該分野では、凝固タンパク質、特に、組換えヒトVII因子又はVII因子関連ポリペプチドの生産の間、活性化された凝固タンパク質の自己分解を減少させるための培養、精製及び処方の方法を改良することが要求されている。
発明の概要
本発明は、広い見地において、プロテアーゼの精製に関する。本明細書において記載された方法は、凝固因子FXII/FXIIa、FXI/FXIa、FX/FXa、FIX/FIXa、FVII/FVIIa,トロンビン、及び抗凝固性タンパク質Ｃを含む任意のプロテアーゼの精製に適用することができる。好ましくは、該方法は細胞培養条件下で生産された組換えプロテアーゼの精製に用いられる。好ましくは、該方法は、GLA (ガンマ-カルボキシグルタミン酸)残基、ビタミンK-依存性凝固因子VIIa、IXa、Xa、活性化タンパク質C、及びトロンビンを含むセリンプロテアーゼの精製に用いられる。
より好ましくは、前記GLA (ガンマ-カルボキシグルタミン酸)残基を有するドメインを含むセリンプロテアーゼは、IX因子ポリペプチド、例えばFIXaである。さらにより好ましい前記GLA（ガンマ-カルボキシグルタミン酸）残基を有するドメインを含むセリンプロテアーゼは、VII因子ポリペプチド、例えばFVIIaである。
第一の側面において、本発明は、セリンプロテアーゼを含む精製されたGLA-残基の生産方法に関し、該方法は、下記工程を含む：
(i)前記セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を発現する宿主細胞を、培養培地中で前記セリンプロテアーゼを含むGLA-残基の発現に適した条件下で培養すること；
(ii)前記セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を含む培養培地の全て又は一部を回収すること；及び
(iii)前記セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を、該培養培地から精製すること；
ここにおいて、工程(iii)における遊離のカルシウムイオン濃度は、1.2 mMより高いか、又は0.10 mMより低い；及び／又は
ここにおいて、工程(iii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、工程(iii)におけるｐＨは、7.5より低いか又は8.6より高い。
第二の側面において、本発明は、精製されたVII因子ポリペプチドの生産のための方法に関し、該方法は下記工程を含む：
(i)前記VII因子ポリペプチドを発現する宿主細胞を、培養培地中で前記VII因子ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること；
(ii)前記VII因子ポリペプチドを含む培養培地の全て又は一部を回収すること；及び
(iii)前記VII因子ポリペプチドを、該培養培地から精製すること；
ここにおいて、工程(iii)における遊離のカルシウムイオン濃度は、1.2 mMより高いか、又は0.10 mMより低い；及び／又は
ここにおいて、工程(iii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、工程(iii)におけるｐＨは、7.5より低いか又は8.6より高い。
第三の側面において、本発明は、セリンプロテアーゼを含む精製されたGLA-残基の生産方法に関し、該方法は、下記工程を含む：
(i)前記セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を発現する宿主細胞を、培養培地中で前記セリンプロテアーゼを含むGLA-残基の発現に適した条件下で培養すること；
(ii)前記セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を含む培養培地の全て又は一部を回収すること；及び
(iii)前記セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を、該培養培地から精製すること；
ここにおいて、工程(iii)におけるカルシウムイオンとセリンプロテアーゼを含むＧＬＡ-残基のモル比（Ca2+:セリンプロテアーゼを含むGLA-残基）は、20より高くまたは0.50より低い；及び／又は
ここにおいて、工程(iii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、工程(iii)におけるｐＨは、7.5より低いか又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、精製されたVII因子ポリペプチドの生産方法に関し、該方法は、下記を具備する：
(i)前記VII因子ポリペプチドを発現する宿主細胞を、培養培地中で前記VII因子ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること；
(ii)前記VII因子ポリペプチドを含む培養培地の全て又は一部を回収すること；及び
(iii)前記VII因子ポリペプチドを、該培養培地から精製すること；
ここにおいて、工程(iii)におけるカルシウムイオンとVII因子ポリペプチドのモル比（Ca2+:VII因子ポリペプチド）は、20より高くまたは0.50より低い；及び／又は
ここにおいて、工程(iii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、工程(iii)におけるｐＨは、7.5より低いか又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基の精製方法に関し、該方法は下記工程を含む：
(i)セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を含む溶液の全部又は一部を回収すること；及び
(ii)該溶液からセリンプロテアーゼを含むGLA-残基を精製すること；
ここにおいて、工程(ii)におけるカルシウムイオンとセリンプロテアーゼを含むGLA-残基のモル比(Ca2+: セリンプロテアーゼを含むGLA-残基)は、20より高く、又は0.50より低い；及び／又は
ここにおいて、工程(ii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、工程(ii)におけるｐＨは、7.5より低く、又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、VII因子ポリペプチドの精製方法に関し、該方法は下記工程を含む：
(i)VII因子ポリペプチドを含む溶液の全部又は一部を回収すること；及び
(ii)該溶液からVII因子ポリペプチドを精製すること；
ここにおいて、工程(ii)におけるカルシウムイオンとVII因子ポリペプチドのモル比(Ca2+: VII因子ポリペプチド)は、20より高く、又は0.50より低い；及び／又は
ここにおいて、工程(ii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、工程(ii)におけるｐＨは、7.5より低く、又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基の精製方法に関し、該方法は下記工程を含む：
(i)セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を含む溶液の全部又は一部を回収すること；及び
(ii)該溶液からセリンプロテアーゼを含むGLA-残基を精製すること;
ここにおいて、工程(ii)における遊離のカルシウムイオン濃度は、1.2 mM より高く、又は0.10 mMより低い；及び／又は
ここにおいて、工程(ii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、工程(ii)におけるｐＨは、7.5より低く、又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、VII因子ポリペプチドの精製方法に関し、該方法は下記工程を含む：
(i)VII因子ポリペプチドを含む溶液の全部又は一部を回収すること；及び
(ii)該溶液からVII因子ポリペプチドを精製すること;
ここにおいて、工程(ii)における遊離のカルシウムイオン濃度は、1.2 mM より高く、又は0.10 mMより低い；及び／又は
ここにおいて、工程(ii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、工程(ii)におけるｐＨは、7.5より低く、又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基の溶液を多数の精製工程に供することによる、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基の精製方法に関し、該精製工程の少なくとも一つにおける遊離カルシウムイオン濃度は、1.2 mMより高く、又は0.10 mMより低い；及び／又は
ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおける亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度が、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおけるＰＨが、7.5より低く、又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、VII因子ポリペプチドの溶液を多数の精製工程に供することによる、VII因子ポリペプチドの精製方法に関し、該精製工程の少なくとも一つにおける遊離のカルシウムイオン濃度が、1.2 mM より高く、又は0.10 mMより低い；及び／又は
ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおける亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度が、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおけるpHが、7.5より低く、又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基の溶液を多数の精製工程に供することによる、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基の精製方法に関し、ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおけるカルシウムイオンとセリンプロテアーゼを含むGLA-残基のモル比(Ca2+: セリンプロテアーゼを含むGLA-残基)が、20より高く、又は0.50より低い；及び／又は
ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおける亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおけるｐＨは、7.5より低く、又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、VII因子ポリペプチドの溶液を多数の精製工程に供することによるVII因子ポリペプチドの精製方法に関し、ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおけるカルシウムイオンとVII因子ポリペプチドのモル比(Ca2+:FVIIポリペプチド)が、20より高く、又は0.50より低い；及び／又は
ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおける亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおけるｐＨは、7.5より低く、又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を、該セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を含む溶液中で安定化するための方法に関し、該セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を含む該溶液を、下記工程に供することによる方法：
遊離のカルシウムイオン濃度が1.2 mMより高くなるように、或いは0.10 mMより低くなるように、カルシウムを加える工程；及び/又は
亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度が、0.025 mMより高くなるように、亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンを加える工程；及び/又は
セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を含む該溶液のｐＨを、7.5より低く又は8.6より高くするように調製する工程。
さらなる側面において、本発明は、VII因子ポリペプチドを、該VII因子ポリペプチドを含む溶液中で安定化するための方法に関し、該VII因子ポリペプチドを含む該溶液を、下記工程に供することによる方法：
遊離のカルシウムイオン濃度が1.2 mMより高くなるように、或いは0.10 mMより低くなるように、カルシウムを加える工程；及び/又は
亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度が、0.025 mMより高くなるように、亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンを加える工程；及び/又は
VII因子ポリペプチドを含む該溶液のｐＨを、7.5より低く又は8.6より高くするように調製する工程。
さらなる側面において、本発明は、(i)セリンプロテアーゼを含むGLA-残基、(ii) 1.2 mMより高い又は0.10 mMより低い濃度の遊離カルシウムイオン；及び／又は
0.025 mMより高い濃度の亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の遊離の二価金属カチオン；及び／又は
ここにおいて、該組成物のｐＨは、7.5より低く、又は8.6より高い；
を具備する組成物に関する。
さらなる側面において、本発明は、(i)VII因子ポリペプチド、(ii) 1.2 mMより高い又は0.10 mMより低い濃度の遊離カルシウムイオン；及び／又は
0.025 mMより高い濃度の亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の遊離の二価金属カチオン；及び／又は
ここにおいて、該組成物のｐＨは、7.5より低く、又は8.6より高い；
を具備する組成物に関する。
発明の詳細な説明
機能亢進性FVII(a)アナログ、例えば野生型ヒトFVIIa より高いタンパク分解活性を有するFVIIポリペプチドの変異体の自己分解（autodegration）を減少させるために、ａ）精製の間、＞25マイクロモーラーの亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオン、例えばCu2+の存在下で、及び／又はｂ）精製の間、＞1.2 mMのCa2+の存在下で、及び／又はｃ）精製の間、＜0.1 mM のCa2+の存在下で、及び／又はｄ）精製の間、7.5より低いｐＨで、及び／又はｅ）精製の間、8.6より高いｐＨで、処理されて、活性及びライアビリティが減じられる。
機能亢進性FVIIaアナログの自己分解は、中性ｐＨ（ｐＨ＝7.5）で激しく、精製過程を通してかなりの収率の減少をもたらす。従来の解決策には、精製過程に高毒性プロテアーゼ阻害剤、又は高価な「テーラード」阻害剤又はスカベンジャーペプチド／プロテインのいずれかを投入することが含まれる。
培養物上清の安定化、免疫親和性捕獲、及びｐＨ６で行われる陰イオン交換による精製は、既知のFVII精製方法を越える大きな利点を有することが、本発明の発明者らによって示された。
本発明の一つの側面は、VII因子ポリペプチドの精製方法に関し、該方法は下記を具備する：
(i)VII因子ポリペプチドを発現する宿主細胞を、培養培地中でVII因子ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること；
(ii)VII因子ポリペプチドを含む培養培地の全て又は一部を回収すること；及び
(iii)VII因子ポリペプチドを、該培養培地から精製すること；
ここにおいて、工程(iii)における遊離カルシウムイオン濃度は、1.2 mMより高く、又は0.10 mMより低い；及び／又は
ここにおいて、工程(iii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、工程(iii)におけるｐＨは、7.5より低いか又は8.6より高い。
第二の側面において、本発明は、精製されたVII因子ポリペプチドの生産方法に関し、該方法は、下記を具備する：
(i)VII因子ポリペプチドを発現する宿主細胞を、培養培地中で該VII因子ポリペプチドの発現に適した条件下で培養すること；
(ii)前記VII因子ポリペプチドを含む培養培地の全て又は一部を回収すること；及び
(iii)前記VII因子ポリペプチドを、該培養培地から精製すること；
ここにおいて、工程(iii)におけるカルシウムイオンとVII因子ポリペプチドのモル比（Ca2+:VII因子ポリペプチド）は、20より高くまたは0.50より低い；及び／又は
ここにおいて、工程(iii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、工程(iii)におけるｐＨは、7.5より低いか又は8.6より高い。
第三の側面において、本発明は、VII因子ポリペプチドの精製方法に関し、該方法は下記を具備する：
(i)VII因子ポリペプチドを含む溶液の全部又は一部を回収すること；及び
(ii)該溶液からVII因子ポリペプチドを精製すること；
ここにおいて、工程(ii)におけるカルシウムイオンとVII因子ポリペプチドのモル比(Ca2+: VII因子ポリペプチド)は、20より高く、又は0.50より低い；及び／又は
ここにおいて、工程(ii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度が、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、工程(ii)におけるｐＨは、7.5より低く、又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、VII因子ポリペプチドの精製方法に関し、該方法は下記を具備する：
(i)VII因子ポリペプチドを含む溶液の全部又は一部を回収すること；及び
(ii)該溶液からVII因子ポリペプチドを精製すること;
ここにおいて、工程(ii)における遊離のカルシウムイオン濃度が、1.2 mM より高く、又は0.10 mMより低い；及び／又は
ここにおいて、工程(ii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度が、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、工程(ii)におけるｐＨが、7.5より低く、又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、VII因子ポリペプチドの溶液を多数の精製工程に供することによるVII因子ポリペプチドの精製方法に関し、該精製工程の少なくとも一つにおける遊離のカルシウムイオン濃度が、1.2 mM より高く、又は0.10 mMより低い；及び／又は
ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおける亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおけるpHは、7.5より低く、又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、VII因子ポリペプチドの溶液を多数の精製工程に供することによるVII因子ポリペプチドの精製方法に関し、ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおけるカルシウムイオンとVII因子ポリペプチドのモル比(Ca2+:FVIIポリペプチド)が、20より高く、又は0.50より低い；及び／又は
ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおける亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い；及び／又は
ここにおいて、前記精製工程の少なくとも一つにおけるｐＨは、7.5より低く、又は8.6より高い。
さらなる側面において、本発明は、VII因子ポリペプチドを、該VII因子ポリペプチドを含む溶液中で安定化するための方法に関し、該VII因子ポリペプチドを含む該溶液を、下記工程に供することによる方法：
遊離のカルシウムイオン濃度が1.2 mMより高くなるように、或いは0.10 mMより低くなるように、カルシウムを加える工程；及び/又は
亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度が、0.025 mMより高くなるように、亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンを加える工程；及び/又は
VII因子ポリペプチドを含む該溶液のｐＨを、7.5より低く又は8.6より高くするように調整する工程。
さらなる側面において、本発明は、精製されたセリンプロテアーゼを含むGLA-残基の生産方法に関し、該方法は下記を具備する：
(i)前記セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を発現する宿主細胞を、培養培地中で前記セリンプロテアーゼを含むGLA-残基の発現に適した条件下で培養すること；
(ii)前記セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を含む培養培地の全て又は一部を回収すること；及び
(iii)前記セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を、該培養培地から精製すること；
ここにおいて、工程(iii)におけるｐＨの値は、4.5〜6.9であるか、又は8.6〜10である。
さらなる側面において、本発明は、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基の溶液を多数の精製工程に供することによるセリンプロテアーゼを含むGLA-残基の精製方法に関し、該精製工程の少なくとも一つにおけるｐＨが、4.5〜6.9又は8.6〜10であることを特徴とする。
さらなる側面において、本発明は、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を、該セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を含む溶液中で安定化するための方法に関し、
該セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を含む該溶液を、
遊離のカルシウムイオン濃度が1.2 mMより高くなるように、或いは0.10 mMより低くなるように、カルシウムを加える工程；及び/又は
亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度が、0.025 mMより高くなるように、亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンを加える工程；及び/又は
セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を含む該溶液のｐＨを、4.5〜6.9又は8.6〜10に調整する工程；
に供することによる方法。
さらなる側面において、本発明は、ｐＨ値が4.5〜6.9又は8.6〜10である溶液中に、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を含む組成物に関する。
「セリンプロテアーゼを含むGLA-残基」という語は、本明細書で用いられる場合、VII因子ポリペプチド、IX因子ポリペプチド、X因子及びそれらの変異体及び誘導体、プロテインC及びそれらの変異体及び誘導体、及び プロトロンビン/トロンビン及びそれらの変異体及び誘導体、から成る群から選択されるタンパク質を意味し、ここにおいて、該タンパク質は、一以上のガンマ-カルボキシグルタミン酸(GLA)アミノ酸残基を含む。一つの態様において、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基は、活性型のタンパク質であり、例えば、VIIa因子、IXa因子、Xa因子、活性型プロテインC、及びトロンビンである。一つの態様において、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基はヒト型である。
セリンプロテアーゼを含むGLA-残基、例えば、セリンプロテアーゼを含む組成物中のVII因子ポリペプチド又はIX因子ポリペプチドの「安定化」とは、分解の程度、即ち、該組成物中のセリンプロテアーゼの、例えばタンパク分解的又は化学分解的な、時間単位当りの分解産物の量、が減少されることを意味する。好ましくは、本明細書で記載されるGD-FVIIa形成速度（formation velocity）アッセイにおいて測定される分解が、最大GD-FVIIa形成の６０％より低く、例えば最大GD-FVIIa形成の５０％、例えば最大GD-FVIIa形成の４０％、例えば最大GD-FVIIa形成の３０％、例えば最大GD-FVIIa形成の２０％、例えば最大GD-FVIIa形成の１０％である。
組成物中のセリンプロテアーゼを含むGLA-残基の「安定化」とは、収集、捕獲、貯蔵、管理（handling）、処理、精製、バルク予備処方、バルク処方、限外-/ダイアフィルトレーション、イオン交換、陰イオン交換捕獲、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互クロマトグラフィー、沈殿（percipitation）及び親和性精製、から成る群から選択される工程の、組換えタンパク質生産の方法における任意の工程の間、安定性が上昇することを意味すると理解される。
「精製されたセリンプロテアーゼを含むGLA-残基」という語は、本明細書で用いられる場合、真核宿主細胞における発現の後に培養培地中に見出され、その治療的、予防的又は研究的な使用を妨げる、ポリヌクレオチド、脂質、糖及び任意の他の混入したポリペプチド又は他の混入物の少なくとも約50重量％から分離された、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基を意味する。セリンプロテアーゼを含むGLA-残基は、種々の方法論を任意に用いて、培養培地から天然の混入物が実質的に混入していないように精製されることができる。セリンプロテアーゼを含むGLA-残基の精製のための、標準的なクロマトグラフィー的分離技術を、いくつかの精製工程において用いることもできる。
「精製されたVII因子ポリペプチド」という語は、本明細書で用いられる場合、真核宿主細胞における発現の後に培養培地中に見出され、その治療的、予防的又は研究的な使用を妨げる、ポリヌクレオチド、脂質、糖及び任意の他の混入したポリペプチド、又は他の混入物の少なくとも約５０重量％から分離された、VII因子ポリペプチドを意味する。VII因子ポリペプチドは、種々の方法論を任意に用いて、培養培地から天然の混入物が実質的に混入していないように精製されることができる。VII因子ポリペプチドの精製のための、標準的なクロマトグラフィー的分離技術を、いくつかの精製工程において用いることもできる。
ポリペプチド及び一以上の混入物を含む組成物からのポリペプチドの「精製」とは、該組成物から少なくとも一つの混入物を除去する（完全に又は部分的に）ことにより、該組成物中のポリペプチドの純度を上昇させることを意味する。「精製工程」は、結果として「均質な」組成物に成る全体的な精製方法の一部であってよく、これは、本明細書において、該組成物の総重量に基づき、所望のポリペプチドが少なくとも約７０重量％、好ましくは少なくとも約８０重量％で含まれる組成物を指すように用いられる。
「遊離カルシウムイオン濃度」という語は、本明細書で用いられる場合、水分子で囲まれた二価の陽カルシウムイオン(Ca2+)の濃度を意味する。この語は、固体形態のカルシウムを含まない、即ち、結晶構造又は例えばFVIIのようなタンパク質に結合されたカルシウムを含まない。
「亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度」という語は、本明細書で用いられる場合、水分子で囲まれた二価の陽イオンの濃度を意味し、これは、カルシウムイオン又は亜鉛イオンではない。この語は、固体形態の二価陽イオンを含まない、即ち、結晶構造又はタンパク質に結合された二価陽イオンを含まない。
本発明の一つの態様において、該精製工程は、クロマトグラフ的な精製工程である。
本発明の一つの態様において、少なくとも一つの精製工程は、疎水性相互作用的クロマトグラフィーである。
本発明の一つの態様において、少なくとも一つの精製工程は、サイズ排除クロマトグラフィーである。
本発明の一つの態様において、少なくとも一つの精製工程は、陰イオン交換クロマトグラフィーである。
本発明の一つの態様において、少なくとも一つの精製工程は、限外濾過である。
本発明の一つの態様において、少なくとも一つの精製工程は、免疫親和性である。
本発明の一つの態様において、少なくとも一つの精製工程は、ダイアフィルトレーションである。
本発明の一つの態様において、工程(iii)における遊離のカルシウムイオン濃度は、1.2 mMより高い。本発明の一つの態様において、工程(iii)における遊離のカルシウムイオン濃度は、1.3 mMより高く、例えば1.4 mMより高く、例えば1.5 mMより高く、例えば1.6 mMより高く、例えば1.7 mMより高く、例えば1.8 mMより高く、例えば1.9 mMより高く、例えば2.0 mMより高く、例えば2.1 mMより高く、例えば2.2 mMより高く、例えば2.3 mMより高く、例えば2.4 mMより高く、例えば2.5 mMより高く、例えば2.6 mMより高く、例えば3.0 mMより高く、例えば4.0 mMより高く、例えば5.0 mMより高く、例えば6.0 mMより高く、例えば7.0 mMより高く、例えば8.0 mMより高く、例えば9.0 mMより高く、例えば10.0 mMより高く、例えば20 mMより高く、例えば40.0 mMより高く、例えば60.0 mMより高く、例えば80.0 mMより高く、例えば0.1 Mより高く、例えば1 Mより高く、例えば該溶液が飽和するような遊離カルシウムイオン濃度である。
「該溶液が飽和するような遊離カルシウムイオン濃度」という語は、本明細書で用いられる場合、該溶解した遊離カルシウムイオンが、固体形態の非溶解カルシウムイオンと平衡状態にあるときの遊離カルシウムイオンの濃度を意味する。
本発明の一つの態様において、工程(iii)における遊離カルシウムイオン濃度は、0.10 mMより低い。本発明の一つの態様において、工程(iii)における遊離のカルシウムイオン濃度は、0.09より低く、例えば0.08より低く、例えば0.07より低く、例えば0.06より低く、例えば0.05より低く、例えば0.04より低く、例えば0.03より低く、例えば0.02より低く、例えば0.01より低く、例えば0.00より低い。
本発明の一つの態様において、工程(iii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い。本発明の一つの態様において、該二価金属カチオンは、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+、及び Uo2+から成るリストから選択される。本発明の一つの態様において、二価金属カチオンは、Mg2+、Cu2+、及び Mn2+から成るリストから選択される。本発明の一つの態様において、工程(iii)における亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高く、例えば0.03 mMより高く、例えば0.035 mMより高く、例えば0.04 mMより高く、例えば0.045 mMより高く、例えば0.05 mMより高く、例えば0.055 mMより高く、例えば0.06 mMより高く、例えば0.1 mMより高く、例えば0.15 mMより高く、例えば0.2 mMより高く、例えば0.25 mMより高く、例えば0.3 mMより高く、例えば0.5 mMより高く、例えば1.0 mMより高い。
本発明の一つの態様において、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基は、工程(iii)において、さらなる二価金属イオンキレート剤の存在下において精製される。
本発明の一つの態様において、VII因子ポリペプチドは、工程(iii)において、さらなる二価金属イオンキレート剤の存在下において精製される。
「二価金属イオンキレート剤」という語は、本明細書で用いられる場合、例えばカルシウムイオン又は亜鉛イオンのような二価金属イオンを除去又は結合する、任意の薬剤または化合物を意味する。該二価金属イオンキレート剤は、ポリカルボン酸キレート剤、クエン酸、バソクプロイン（bathocuproine）、バソフェナントロリン（bathophenanthroline）、DTPA、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、EGTA、ペニシラミン、TETA、TPEN、及びそれらの誘導体であってよい。
本発明の一つの態様において、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基は、工程(iii)において、7.5より低いｐＨで精製される。本発明の一つの態様において、ｐＨは、7.4より低く、例えば7.3より低く、例えば7.2より低く、例えば7.1より低く、例えば7.0より低く、例えば6.8より低く、例えば6.6より低く、例えば6.4より低く、例えば6.2より低く、例えば6.0より低く、例えば5.5である。
本発明の一つの態様において、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基は、工程(iii)において、8.6より高いｐＨで精製される。本発明の一つの態様において、ｐＨは、8.7より高く、例えば8.8より高く、例えば8.9より高く、例えば9.0より高く、例えば9.1より高く、例えば9.2より高く、例えば9.4より高く、例えば9.6より高く、例えば9.8より高く、例えば10.0より高く、例えば10.2より高く、例えば10.4より高く、例えば10.8より高く、例えば11.0である。
本発明の一つの態様において、VII因子ポリペプチドは、工程(iii)において、7.5より低いｐＨで精製される。本発明の一つの態様において、ｐＨは、7.4より低く、例えば7.3より低く、例えば7.2より低く、例えば7.1より低く、例えば7.0より低く、例えば6.8より低く、例えば6.6より低く、例えば6.4より低く、例えば6.2より低く、例えば6.0より低く、例えば5.5である。
本発明の一つの態様において、VII因子ポリペプチドは、工程(iii)において、8.6より高いｐＨで精製される。本発明の一つの態様において、ｐＨは、8.7より高く、例えば8.8より高く、例えば8.9より高く、例えば9.0より高く、例えば9.1より高く、例えば9.2より高く、例えば9.4より高く、例えば9.6より高く、例えば9.8より高く、例えば10.0より高く、例えば10.2より高く、例えば10.4より高く、例えば10.8より高く、例えば11.0である。
本発明の一つの態様において、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基は、ｐＨ4.5〜6.9で精製される。本発明の一つの態様において、VII因子ポリペプチドは、pH4.5〜6.9で精製される。本発明の一つの態様において、該ｐＨは、4.7〜6.8であり、例えば4.9〜6.7であり、例えば5.1〜6.6であり、例えば5.3〜6.5であり、例えば5.5〜6.4であり、例えば5.7〜6.3であり、例えば5.8〜6.2であり、例えば5.9〜6.1であり、例えば約6.0である。
本発明の一つの態様において、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基は、pH8.6〜10で精製される。本発明の一つの態様において、VII因子ポリペプチドは、pH 8.6〜10で精製される。本発明の一つの態様において、該pHは8.7〜9.9であり、例えば8.8〜9.8であり、例えば8.9〜9.7であり、例えば9.0〜9.6であり、例えば9.1〜9.5であり、例えば8.7〜9.8であり、例えば8.7〜9.7であり、例えば8.7〜9.6であり、例えば8.8〜9.5であり、例えば8.9〜9.4であり、例えば9.0〜9.2であり、例えば約9.2である。
本発明の一つの態様において、セリンプロテアーゼを含むGLA-残基は、ヒスチジンの存在下で精製される。ヒスチジンがｐＨ５〜７又は８〜１０の範囲でバッファーに供給されることは理解されるであろう。
本発明の一つの態様において、VII因子ポリペプチドは、ヒスチジンの存在下で精製される。ヒスチジンがｐＨ５〜７又は８〜１０の範囲でバッファーに供給されることは理解されるであろう。
本発明の一つの態様において、宿主細胞は真核宿主細胞である。
本発明の一つの態様において、真核宿主細胞は哺乳類細胞である。本発明の一つの態様において、哺乳類細胞は、HEK細胞、BHK細胞、CHO細胞、COS細胞、及びSP2-0のような骨髄腫細胞からなる群から選択される。
本発明の一つの態様において、VII因子ポリペプチドは、野生型ヒトVII因子である。
本発明の一つの態様において、VII因子ポリペプチドは、野生型ヒトFVIIaより高いタンパク分解活性を有する。
本発明の一つの態様において、VII因子ポリペプチドは、下記から成る群から選択されるVII因子-関連ポリペプチドである：L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII,及びS336G-FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII、L305V/E296V-FVII、L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、L305V/K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII、L305V/K337A/V158D-FVII、L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII、L305V/V158T/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/K316H-FVII、S314E/K316Q-FVII、S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII、S314E/L305V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII、S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V-FVII、S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、K316H/L305V/K337A/V158D-FVII、K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V-FVII、K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V-FVII、K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D-FVII、K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、F374Y/L305V/E296V-FVII、F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII、F374Y/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII、F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII、F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII、F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII、F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-VII因子、 S60A-VII因子；
R152E-VII因子、 S344A-VII因子、 Gla ドメイン欠損VIIa因子；及びP11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；及び233Thrから240Asnまでのアミノ酸配列中に置換、付加又は欠失を有するFVII、304Argから329Cysまでのアミノ酸配列中に置換、付加又は欠失を有するFVII。
本発明の一つの態様において、工程(iii)におけるカルシウムイオンとVII因子ポリペプチドのモル比(Ca2+:FVIIポリペプチド)は、20より高い。本発明の一つの態様において、工程(iii)におけるカルシウムイオンとVII因子ポリペプチドのモル比(Ca2+:FVIIポリペプチド)は、20より高く、例えば22より高く、例えば24より高く、例えば26より高く、例えば28より高く、例えば30より高く、例えば34より高く、例えば38より高く、例えば42より高く、例えば45より高く、例えば50より高く、例えば55より高く、例えば60より高く、例えば65より高く、例えば70より高く、例えば76より高く、例えば82より高く、例えば90より高く、例えば95より高く、例えば100より高い。
本発明の一つの態様において、工程(iii)におけるカルシウムイオンとVII因子ポリペプチドのモル比(Ca2+:FVIIポリペプチド)は、0.50より低い。本発明の一つの態様において、工程(iii)におけるカルシウムイオンとVII因子ポリペプチドのモル比(Ca2+:FVIIポリペプチド)は、0.50より低く、例えば0.45より低く、例えば0.40より低く、例えば0.35より低く、例えば0.30より低く、例えば0.25より低く、例えば0.20より低く、例えば0.15より低く、例えば0.10より低く、例えば0.05より低く、例えば0.00である。
本発明の一つの態様において、前記精製工程の少なくとも一つにおける遊離カルシウムイオン濃度は、1.2 mMより高い。本発明の一つの態様において、前記精製工程の少なくとも一つにおける遊離カルシウムイオン濃度は、1.3 mMより高く、例えば1.4 mMより高く、例えば1.5 mMより高く、例えば1.6 mMより高く、例えば1.7 mMより高く、例えば1.8 mMより高く、例えば1.9 mMより高く、例えば2.0 mMより高く、例えば2.1 mMより高く、例えば2.2 mMより高く、例えば2.3 mMより高く、例えば2.4 mMより高く、例えば2.5 mMより高く、例えば2.6 mMより高く、例えば3.0 mMより高く、例えば4.0 mMより高く、例えば5.0 mMより高く、例えば6.0 mMより高く、例えば7.0 mMより高く、例えば8.0 mMより高く、例えば9.0 mMより高く、例えば10.0 mMより高く、例えば20 mMより高く、例えば40.0 mMより高く、例えば60.0 mMより高く、例えば80.0 mMより高く、例えば0.1 Mより高く、例えば1 Mより高く、例えば該溶液が飽和するような遊離カルシウムイオン濃度である。
本発明の一つの態様において、前記精製工程の少なくとも一つにおける遊離カルシウムイオン濃度は、0.10 mMより低い。本発明の一つの態様において、前記精製工程の少なくとも一つにおける遊離カルシウムイオン濃度は、0.09より低く、例えば0.08より低く、例えば0.07より低く、例えば0.06より低く、例えば0.05より低く、例えば0.04より低く、例えば0.03より低く、例えば0.02より低く、例えば0.01より低く、例えば0.00より低い。
本発明の一つの態様において、前記精製工程の少なくとも一つにおける亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い。本発明の一つの態様において、二価金属カチオンは、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+、及び Uo2+から成るリストから選択される。本発明の一つの態様において、前記二価金属カチオンは、Mg2+、Cu2+、及び Mn2+から成るリストから選択される。
本発明の一つの態様において、前記精製工程の少なくとも一つにおける亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高く、例えば0.03 mMより高く、例えば0.035 mMより高く、例えば0.04 mMより高く、例えば0.045 mMより高く、例えば0.05 mMより高く、例えば0.055 mMより高く、例えば0.06 mMより高く、例えば0.1 mMより高く、例えば0.15 mMより高く、例えば0.2 mMより高く、例えば0.25 mMより高く、例えば0.3 mMより高く、例えば0.5 mMより高く、例えば1.0 mMより高い。
本発明の一つの態様において、前記VII因子ポリペプチドは、前記精製工程の少なくとも一つにおいて、さらなる二価金属イオンキレート剤の存在下で精製される。
本発明の一つの態様において、前記VII因子ポリペプチドは、前記精製工程の少なくとも一つにおいて、7.5より低いｐＨで精製される。本発明の一つの態様において、該pHは、7.4より低く、例えば7.3より低く、例えば7.2より低く、例えば7.1より低く、例えば7.0より低く、例えば6.8より低く、例えば6.6より低く、例えば6.4より低く、例えば6.2より低く、例えば6.0より低く、例えば5.5である。
本発明の一つの態様において、前記VII因子ポリペプチドは、前記精製工程の少なくとも一つにおいて、8.6より高いｐＨで精製される。本発明の一つの態様において、該pHは、8.7より高く、例えば8.8より高く、例えば8.9より高く、例えば9.0より高く、例えば9.1より高く、例えば9.2より高く、例えば9.4より高く、例えば9.6より高く、例えば9.8より高く、例えば10.0より高く、例えば10.2より高く、例えば10.4より高く、例えば10.8より高く、例えば11.0である。
本発明の一つの態様において、VII因子ポリペプチドは、前記精製工程の少なくとも一つにおいて、ヒスチジンの存在下で精製される。
本発明の一つの態様において、得られた遊離カルシウムイオン濃度は、1.2 mMより高い。本発明の一つの態様において、得られた遊離カルシウムイオン濃度は、1.3 mMより高く、例えば1.4 mMより高く、例えば1.5 mMより高く、例えば1.6 mMより高く、例えば1.7 mMより高く、例えば1.8 mMより高く、例えば1.9 mMより高く、例えば2.0 mMより高く、例えば2.1 mMより高く、例えば2.2 mMより高く、例えば2.3 mMより高く、例えば2.4 mMより高く、例えば2.5 mMより高く、例えば2.6 mMより高く、例えば3.0 mMより高く、例えば4.0 mMより高く、例えば5.0 mMより高く、例えば6.0 mMより高く、例えば7.0 mMより高く、例えば8.0 mMより高く、例えば9.0 mMより高く、例えば10.0 mMより高く、例えば20 mMより高く、例えば40.0 mMより高く、例えば60.0 mMより高く、例えば80.0 mMより高く、例えば0.1 Mより高く、例えば1 Mより高く、例えば該溶液が飽和するような遊離カルシウムイオン濃度である。
本発明の一つの態様において、得られた遊離カルシウムイオン濃度は、0.10 mMより低い。本発明の一つの態様において、得られた遊離カルシウムイオン濃度は、0.09より低く、例えば0.08より低く、例えば0.07より低く、例えば0.06より低く、例えば0.05より低く、例えば0.04より低く、例えば0.03より低く、例えば0.02より低く、例えば0.01より低く、例えば0.00より低い。
本発明の一つの態様において、得られた亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高い。
本発明の一つの態様において、前記二価金属カチオンは、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Co2+、Fe2+、Sm2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Sm2+、及び Uo2+から成るリストから選択される。
本発明の一つの態様において、前記二価金属カチオンは、Mg2+、Cu2+、及び Mn2+から成るリストから選択される。
本発明の一つの態様において、得られた亜鉛イオン及びカルシウムイオン以外の二価金属カチオンの遊離イオン濃度は、0.025 mMより高く、例えば0.03 mMより高く、例えば0.035 mMより高く、例えば0.04 mMより高く、例えば0.045 mMより高く、例えば0.05 mMより高く、例えば0.055 mMより高く、例えば0.06 mMより高く、例えば0.1 mMより高く、例えば0.15 mMより高く、例えば0.2 mMより高く、例えば0.25 mMより高く、例えば0.3 mMより高く、例えば0.5 mMより高く、例えば1.0 mMより高い。
本発明の一つの態様において、VII因子ポリペプチドは、さらなる二価金属イオンキレート剤の存在下において安定化される。
本発明の一つの態様において、VII因子ポリペプチドは、7.5より低いｐＨで安定化される。本発明の一つの態様において、該pHは、7.4より低く、例えば7.3より低く、例えば7.2より低く、例えば7.1より低く、例えば7.0より低く、例えば6.8より低く、例えば6.6より低く、例えば6.4より低く、例えば6.2より低く、例えば6.0より低く、例えば5.5である。本発明の一つの態様において、前記VII因子ポリペプチドは、8.6より高いｐＨで安定化される。本発明の一つの態様において、前記ｐＨは、8.7より高く、例えば8.8より高く、例えば8.9より高く、例えば9.0より高く、例えば9.1より高く、例えば9.2より高く、例えば9.4より高く、例えば9.6より高く、例えば9.8より高く、例えば10.0より高く、例えば10.2より高く、例えば10.4より高く、例えば10.8より低く、例えば11.0である。
本発明の一つの態様において、VII因子ポリペプチドは、ヒスチジンの存在下において安定化される。
「IX因子ポリペプチド」という語は、本明細書で用いられる場合、野生型IX因子、IX因子-関連ポリペプチド、並びにIX因子誘導体及びIX因子接合体と比較して、実質的に同じか改良された生物活性を示す、ヒト型の野生型IX因子並びにIX因子の変異体を意味する。「IX因子」という語は、IX因子ポリペプチドを、それらの未切断(チモーゲン)形態で、並びに、それらのそれぞれの生理活性形態（これはIXa因子と命名される）を産するようにタンパク分解的に処理された形態で含むように意図される。そのようなIX因子の変異体は、ヒトIX因子と比較して、安定性、リン脂質結合、変化した比活性などを含む、異なる性質を示し得る。
「VII因子ポリペプチド」という語は、本明細書で用いられる場合、野生型VII因子（即ち、米国特許第4,784,950号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド）、並びに、野生型VII因子、VII因子-関連ポリペプチド、並びにVII因子誘導体及びVII因子接合体と比較して、実質的に同じか又は改良された生物活性を示すVII因子変異体を意味する。「VII因子」という語は、VII因子ポリペプチドを、それらの未切断(チモーゲン)形態で、並びに、それらのそれぞれの生理活性形態（これはVIIa因子と命名される）を産するようにタンパク分解的に処理された形態で含むように意図される。典型的には、VII因子は、残基152と153の間で切断されてVIIa因子を産する。そのようなVII因子の変異体は、ヒトVII因子と比較して、安定性、リン脂質結合、変化した比活性などを含む、異なる性質を示し得る。
本明細書で用いられる場合、「VII因子-関連ポリペプチド」は、そのVIIa因子の生物活性が、野生型VIIa因子の活性と比較して、実質的に改変されたか又は減少された変異体を含むポリペプチドを包含する。それらのポリペプチドは、これに限定されないが、そのポリペプチドの生理活性を改変又は混乱させる特異的なアミノ酸配列変化が導入されたVII因子又はVIIa因子を含む。
「VII因子誘導体」という語は、本明細書で用いられる場合、野生型VII因子、その親ペプチドの一以上のアミノ酸が化学的に、例えばアルキル化、PEG化、アシル化、エステル形成又はアミド形成などによって改変された、野生型VII因子及びVII因子関連ポリペプチドと比較して実質的に同じか又は改良された生物活性を示すVII因子変異体を示すように意図される。これは、PEG化されたヒトVIIa因子、システイン-PEG化されたヒトVIIa因子及びそれらの変異体を含むが、これらに限定されない。
「PEG化された（PEGylated）ヒトVIIa因子」という語は、ヒトVIIa因子ポリペプチドに接合したPEG分子を有するヒトVIIa因子を意味する。PEG分子は、VIIa因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基又は糖分子を含む、VIIa因子ポリペプチドの任意の部分に結合し得ることが理解されよう。「システイン-PEG化されたヒトVIIa因子」という語は、ヒトVIIa因子に導入されたシステインのスルフヒドリル基に接合したPEG分子を有するVIIa因子を意味する。
血液凝固におけるVIIa因子の生物活性は、(i)組織因子(TF)に結合する、及び(ii)IX因子又はX因子のタンパク分解的切断を触媒して活性型IX因子又はX（それぞれIXa因子又はXa）を生成する、その能力に由来する。本発明の目的のために、VIIa因子の生物活性を、VII因子欠損血漿及びトロンボプラスチンを用いて、例えば米国特許第5,997,864号に開示されているように、製剤が血液凝固を促進する能力を測定することによって定量化し得る。このアッセイにおいて、生物活性は、コントロールサンプルに対する凝固時間の減少として表され、1 ユニット/ml VII因子活性を含むプールヒト血清標準と比較して、「VII因子ユニット」に変換される。或いは、VIIa因子の生物活性は、(i)脂質膜に包埋されたTF及びX因子を含む系において、VIIa因子のXa因子を生成する能力を測定する(Persson et al.、J. Biol. Chem. 272:19919-19924、1997)；(ii)水系において、X因子の加水分解を測定する；(iii)表面プラズモン共鳴に基づく機器を用いて、TFへのその物理的な結合を測定する（Persson、FEBS Letts. 413:359-363、1997) 並びに(iv)合成基質の加水分解を測定する；によって定量化されることができる。
野生型VIIa因子と比較して実質的に同じか又は改良された生物活性を有するVII因子変異体は、上記した凝固アッセイ、タンパク分解アッセイ、又はTF結合アッセイの一以上で試験したとき、同じ細胞タイプで生産されたVIIa因子の比活性の、少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、及び最も好ましくは少なくとも約９０％を示すものを包含する。野生型VIIa因子と比較して実質的に減少した生物活性を有するVII因子変異体は、上記した凝固アッセイ、タンパク分解アッセイ、又はTF結合アッセイの一以上で試験したとき、同じ細胞タイプで生産された野生型VIIa因子の比活性の、少なくとも約２５％より少なく、好ましくは少なくとも約１０％より少なく、より好ましくは少なくとも約５％より少なく、最も好ましくは少なくとも約１％より少なく示すものである。野生型VII因子と比較して実質的に改変された生物活性を有するVII因子変異体は、これらに限定されないが、TF-非依存性Ｘ因子タンパク分解活性を示すVII因子変異体及びTFに結合するがＸ因子を切断しないものを含む。
VII因子の変異体は、野生型VII因子と実質的に同じか又はより良い生物活性を示すか否かに関わらず、また或いは、野生型VII因子と比較して実質的に改変されたか又は減少した生物活性を示すか否かに関わらず、これらに限定されないが、挿入、欠損、又は一以上のアミノ酸の置換によって野生型VII因子の配列と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
野生型VII因子と実質的に同じ生物活性を有するVII因子変異体の非限定的な例は、S52A-FVIIa、S60A-FVIIa ( Lino et al.，Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192、1998)；米国特許第5,580,560に開示された、上昇したタンパク分解的安定性を示すFVIIa変異体；残基290と291の間で、又は残基315と316の間でタンパク分解的に切断されたVIIa因子(Mollerup et al.，Biotechnol. Bioeng. 48:501-505、1995)；酸化型の形態のVIIa因子(Kornfelt et al.，Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54、1999)；PCT/DK02/00189に開示されたFVII変異体；及び、WO 02/38162に開示された、上昇したタンパク分解的安定性を示すFVII変異体(Scripps Research Institute)；WO 99/20767に開示された、修飾されたGla-ドメインを有し、増強された膜結合を示すFVII変異体(University of Minnesota)；及び、WO 01/58935に開示されたFVII変異体(Maxygen ApS)を含む。
野生型FVIIaと比較して上昇した生物活性を有するFVII変異体の非限定的な例は、WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、PCT/DK02/00635、デンマーク特許出願PA 2002 01423、デンマーク特許出願PA 2001 01627に開示されたFVII変異体；WO 02/38162 (Scripps Research Institute)；及び、JP 2001061479に開示された、増強された活性を有するFVIIa変異体(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)を含む。
野生型VII因子と比較して実質的に減少されたか又は改変された生物活性を有するVII因子変異体の非限定的な例は、R152E-FVIIa (Wildgoose et al.，Biochem 29:3413-3420、1990)、S344A-FVIIa (Kazama et al.，J. Biol. Chem. 270:66-72、1995)、FFR-FVIIa (Holst et al.，Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 15:515-520、1998)、及びGlaドメイン欠損VIIa因子、(Nicolaisen et al.，FEBS Letts. 317:245-249、1993)を含む。
VII因子又はVII因子-関連ポリペプチドの例は、これらに限定されないが、野生型VII因子、L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII,及びS336G-FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII、L305V/E296V-FVII、L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、L305V/K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII、L305V/K337A/V158D-FVII、L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII、L305V/V158T/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/K316H-FVII、S314E/K316Q-FVII、S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII、S314E/L305V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII、S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V-FVII、S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、K316H/L305V/K337A/V158D-FVII、K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V-FVII、K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V-FVII、K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D-FVII、K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、F374Y/L305V/E296V-FVII、F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII、F374Y/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII、F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII、F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII、F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII、F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-VII因子、S60A-VII因子；
R152E-VII因子、S344A-VII因子、Glaドメイン欠損VIIa因子；及びP11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；及び233Thrから240Asnまでのアミノ酸配列中に置換、付加又は欠失を有するFVII、304Argから329Cysまでのアミノ酸配列中に置換、付加又は欠失を有するFVIIを含む。
用いたアミノ酸置換の用語法は、以下の通りである。最初の文字は、ヒト野生型FVIIの位置に天然に存在するアミノ酸を表す。続く数字は、ヒト野生型FVIIにおける位置を表す。二番目の文字は、天然のアミノ酸と置換する（交換する）異なるアミノ酸を表す。例として、M298Qは、ヒト野生型FVIIの位置298のメチオニンがグルタミンによって置換される。他の例として、V158T/M298Qでは、同じVII因子ポリペプチドにおいて、ヒト野生型FVIIの位置158のバリンがスレオニンによって置換され、またヒト野生型FVIIの位置298のメチオニンがグルタミンによって置換される。
本発明のさらなる態様において、VII因子ポリペプチドは、VII因子ポリペプチドの活性と野生型ヒトVIIa因子の活性の間の比が、少なくとも約1.25であるポリペプチドである。一つの態様において、VII因子ポリペプチドの活性と野生型ヒトVIIa因子の活性との間の比が、少なくとも約2.0である。さらなる態様において、VII因子ポリペプチドの活性と野生型ヒトVIIa因子の活性の間の比が、少なくとも約4.0である。
本発明のさらなる態様において、VII因子ポリペプチドは、VII因子ポリペプチドの活性と野生型ヒトVIIa因子の活性との間の比が、VIIa因子活性アッセイで試験されたとき、少なくとも約1.25であるポリペプチドである。一つの態様において、VII因子ポリペプチドの活性と野生型ヒトVIIa因子の活性との間の比が、VIIa因子活性アッセイで試験されたとき、少なくとも約2.0である。さらなる態様において、VII因子ポリペプチドの活性と野生型ヒトVIIa因子の活性との間の比が、VIIa因子活性アッセイで試験されたとき、少なくとも約4.0である。VIIa因子活性は、「アッセイ」で記載したアッセイによって測定され得る。
本発明のさらなる態様において、VII因子ポリペプチドは、VII因子ポリペプチドの活性と野生型ヒトVIIa因子との活性との間の比が、「インビトロ加水分解アッセイ」で試験されたとき、少なくとも約1.25であるポリペプチドである。一つの態様において、VII因子ポリペプチドの活性と野生型ヒトVIIa因子の活性との間の比が、「インビトロ加水分解アッセイ」で試験された時、少なくとも約2.0である。さらなる態様において、VII因子ポリペプチドの活性と野生型ヒトVIIa因子の活性との間の比が、「インビトロ加水分解アッセイ」で試験された時、少なくとも約4.0である。
本発明のさらなる態様において、VII因子ポリペプチドは、VII因子ポリペプチドの活性と野生型ヒトVIIa因子の活性との間の比が、「インビトロタンパク分解アッセイ」で試験されたとき、少なくとも約1.25であるポリペプチドである。一つの態様において、VII因子ポリペプチドの活性と野生型ヒトVIIa因子の活性との間の比が、「インビトロタンパク分解アッセイ」で試験されたとき、少なくとも約2.0である。さらなる態様において、VII因子ポリペプチドの活性と野生型ヒトVIIa因子の活性の間の比が、「インビトロタンパク分解アッセイ」で試験されたとき、少なくとも約4.0である。さらなる態様において、VII因子ポリペプチドの活性と野生型ヒトVIIa因子の活性の間の比が、「インビトロタンパク分解アッセイ」で試験されたとき、少なくとも約8.0である。
本発明は、野生型と比較して上昇された活性を有するVII/VIIa因子変異体に適している。上昇された活性を有するVII/VIIa因子変異体は、以下に記載した適切なアッセイで試験することによって発見できる。これらのアッセイは、単純な予備的インビトロ試験として行われうる。よって、「アッセイ」部は、本発明のVIIa因子変異体の活性のための単純な試験（表題「インビトロ加水分解アッセイ」）を開示する。その上に基づき、特に目的のVIIa因子変異体は、該変異体の活性と野生型VII因子の活性の間の比が、「インビトロ加水分解アッセイ」で試験したとき、1.0以上であり、例えば少なくとも約1.25であり、好ましくは少なくとも約2.0であり、例えば少なくとも約3.0であり又は、より一層好ましくは少なくとも約4.0であるような変異体である。
変異体の活性は、生理学的な基質、例えばX因子(「インビトロタンパク分解アッセイ」) (「アッセイ」参照)を用いて、100-1000 nMの濃度で適切に測定されることもでき、ここで、適切な色素産生の基質(例えばS-2765)の添加の後に、生成したXa因子が測定される。さらに、該活性アッセイは、生理学的温度で実施され得る。
VIIa因子変異体のトロンビン生成能力も、すべての関連する凝固因子及び阻害剤を生理学的濃度(血友病Ａ状況を模倣したときのマイナスVIII因子)で、及び活性型血小板(Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99、542-547、の543頁に記載されており、本明細書において参考として援用される)を含むアッセイで測定されることができる。
本明細書に記載されるVII因子ポリペプチドは、組換え核酸技術によって生産され得る。一般に、クローン化された野生型VII因子核酸配列は、所望のタンパク質をコードするように改変される。この改変された配列は、次いで、発現ベクター中に挿入され、これは次に宿主細胞に形質転換又は形質移入される。高等真核細胞、特に培養哺乳類細胞が、宿主細胞として好ましい。ヒトVII因子の完全な核酸及びアミノ酸配列は周知である(米国勅許第4,784,950参照、クローニング及び組換えヒトVII因子の発現が開示されている)。ウシVII因子配列は、タケヤら（Takeya et al.、J. Biol. Chem. 263:14868-14872 (1988))に開示されている。
アミノ酸配列変化は、種々の技術によって達成されることができる。核酸配列の修飾は、サイト特異的突然変異誘発によってもよい。サイト特異的突然変異誘発の技術は、当該分野で周知であり、例えば、ゾーラー及びスミス（Zoller及びSmith (DNA 3:479-488、1984)）、又は「伸長オーバーラップによるスプライシング」（ Horton et al.、Gene 77、1989、pp. 61-68）に開示されている。それ故、VII因子の核酸及びアミノ酸配列を用い、選択された変更を導入することが可能である。同様に、特異的プライマーを用いるポリメラーゼ鎖反応を用いたＤＮＡ構築物の調製は、当該分野の技術者に周知である（例えば、PCRプロトコール、1990、Academic Press、San Diego、California、USA)。
本発明のVII因子ポリペプチドをコードする核酸構築物は、適切にはゲノム又はcDNA起源であり、例えば、ゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、標準的な技術(例えば、Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、New York、1989)に従って、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションによりポリペプチドの全部又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることによって得られる。
VII因子ポリペプチドをコードする核酸構築物は、確立された標準的な方法、例えば、ボウケージ及びカルサー（Beaucage及びCaruthers、Tetrahedron Letters 22 (1981)、1859 - 1869によって開示されたホスホアミジト（phosphoamidite）方法、又は、マッスら（Matthes et al.、EMBO Journal 3 (1984)、801 - 805）によって開示された方法、によって、合成的に調製されることもできる。ホスホアミジト方法に従って、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機、精製、アニール、ライゲート、及び適切なベクターにクローン化されて合成される。
さらに、該核酸構築物は、合成の、ゲノムの又はｃＤＮＡ源の断片を、この断片は全核酸構築物の種々の部分に対応する断片であるが、標準的な技術に従って（適切に）ライゲーションすることによって調製された、合成とゲノムの混合物、合成とｃＤＮＡの混合物、又はゲノムとｃＤＮＡ源の混合物であってもよい。
核酸構築物は、好ましくはＤＮＡ構築物である。本発明に従ってVII因子ポリペプチドを生産するために用いられるＤＮＡ配列は、典型的には、適切な翻訳後処理（例えば、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化）を得るためにVII因子のアミノ末端でプレ-プロポリペプチドをコードし、宿主細胞から分泌される。プレ-プロポリペプチドはVII因子又は他のビタミンＫ依存性血漿タンパク質であり得、例えばIX因子、X因子、プロトロンビン、タンパク質C又はタンパク質Sである。当該分野の技術者によって理解されるように、追加の修飾がVII因子ポリペプチドのアミノ酸配列に行われることができ、ここで、それらの修飾は凝固剤として作用するためのタンパク質の能力を著しくは障害しない。例えば、VII因子ポリペプチドは、米国特許第5,288,629号に一般的に開示されているように、チモーゲンVII因子をその活性型二本鎖形態に転換することを阻害するように活性化切断サイトにおいて修飾され得る。
VIIa因子変異体の発現に用いるための発現ベクターは、クローン化された遺伝子又はｃＤＮＡの転写を指示することが出来るプロモーターを備える。培養哺乳類細胞中で用いるのに好ましいプロモーターは、ウイルスプロモーター及び細胞性プロモーターを含む。ウイルスプロモーターは、SV40プロモーター(Subramani et al.、Mol. Cell. Biol. 1:854-864、1981)及びCMVプロモーター(Boshart et al.、Cell 41:521-530、1985)を含む。特に好ましいウイルスプロモーターは、アデノウイルス２の主要な遅発方プロモーター（major lateプロモーター）(Kaufman及びSharp、Mol. Cell. Biol. 2:1304-1319、1982)である。細胞性プロモーターは、マウスカッパ遺伝子プロモーター(Bergman et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7041-7045、1983)及びマウスＶＨプロモーター(Loh et al.、Cell 33:85-93、1983)を含む。特に好ましい細胞性プロモーターは、マウスメタロチオネイン-Iプロモーター(Palmiter et al.、Science 222:809-814、1983)である。また、発現ベクターは、VII因子配列自体に、プロモーターの下流及び挿入サイトの上流に位置するＲＮＡスプライスサイトを含む。好ましいＲＮＡスプライスサイトは、アデノウイルス及び／又は免疫グロブリン遺伝子から得られる。発現ベクターには、ポリアデニル化シグナルもまた、挿入サイトの下流に位置して含まれる。特に好ましいポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０からの早期又は遅延型ポリアデニル化シグナル(Kaufman及びSharp、ibid.)、アデノウイルス５ Elb領域からのポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター(DeNoto et al. Nucl. Acids Res. 9:3719-3730、1981)又はヒトVII因子遺伝子又はウシVII因子遺伝子からのポリアデニル化シグナルを含む。発現ベクターは、プロモーター及びＲＮＡスプライスサイトの間に位置する、例えばアデノウイルス２三者間（tripartite）リーダーのような非コーディングウイルスリーダー配列；並びに、エンハンサー配列、例えばＳＶ４０エンハンサーをも含む。
クローン化されたＤＮＡ配列は、例えばカルシウムリン酸-媒介形質移入(Wigler et al.、Cell 14:725-732、1978；Corsaro及びPearson、Somatic Cell Genetics 7:603-616、1981；Graham及びVan der Eb、Virology 52d:456-467、1973)又は電気穿孔法(Neumann et al.、EMBO J. 1:841-845、1982)によって、培養哺乳類細胞中に導入される。外来性ＤＮＡを発現する細胞を確認及び選択するため、通常、選択可能な表現型を与える遺伝子（選択可能マーカー）を、目的の遺伝子又はｃＤＮＡと共に細胞中に導入する。好ましい選択可能マーカーは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びメトトレキセートのような薬剤に耐性を与える遺伝子を含む。選択可能マーカーは、増幅可能な選択可能マーカーであってもよい。好ましい増幅可能な選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）配列である。選択可能マーカーは、シリー（Thilly、Mammalian Cell Technology、Butterworth Publishers、Stoneham、MA、incorporated herein by reference)によって概説されている。当該分野の技術者には、適切な選択可能マーカーを容易に選択することが出来るであろう。
選択可能マーカーは、別々のプラスミド上で、目的の遺伝子と同時に細胞に導入されてもよく、或いは、それらは同じプラスミド上に導入されてもよい。同じプラスミド上である場合、選択可能マーカー及び目的の遺伝子は、異なるプロモーターの制御下にあるか、又は同じプロモーターの制御下にあり、後者は、ジシストロンのメッセージを生じる配列である。このタイプの構築物は、当該分野で周知である（例えば、Levinson及びSimonsen、米国特許第4,713,339号）。「キャリアーＤＮＡ」として知られるさらなるＤＮＡを、細胞中に導入されるその混合物に添加することも有利である。細胞がＤＮＡを取り込んだ後、それらは適切な成長培地中で、典型的には１〜２日間増殖され、目的の遺伝子の発現を始める。細胞の培養に用いる培地は、宿主細胞の成長に適する任意の従来の培地でよく、例えば適切な補充を含む最小培地又は完全培地であってよい。適切な培地は、商業的な供給者から入手可能であり、或いは、公表されている（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログで）レシピによって調製してもよい。培地は、当該分野で周知の方法を用いて調製する（例えば、references for bacteria及びyeast；Bennett、J.W.及びLaSure、L.、editors、More Gene Manipulations in Fungi、Academic Press、CA、1991参照）。成長培地は一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質及び増殖因子を含む。ガンマ-カルボキシレル化されたVII因子ポリペプチドの生産のために、培地は好ましくは約0.1 mg/ml 〜約 5 mg/mlの濃度で、ビタミンＫを含む。薬剤選択は、安定した様式で選択可能マーカーを発現している細胞の成長を選択するのに適用される。増幅可能マーカーを形質移入された細胞のために、薬剤濃度は、クローン化された配列の、上昇されたコピー数を選択するために上昇されてよく、それによって、発現レベルが上昇される。安定に形質移入された細胞のクローンは、次いで、所望のVII因子ポリペプチドの発現をスクリーニングされる。
好ましい哺乳類細胞株は、CHO (ATCC CCL 61)、COS-1 (ATCC CRL 1650)、ベビーハムスター腎(BHK)及び293 (ATCC CRL 1573；Graham et al.、J. Gen. Virol. 36:59-72、1977)細胞株を含む。好ましいBHK細胞株は、tk- ts13 BHK 細胞株 (Waechter及びBaserga、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110、1982)であり、これ以後、BHK 570細胞と称する。 BHK 570細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（12301 Parklawn Dr.、Rockville、MD 20852）から ATCC 受付番号 CRL 10314で入手可能である。tk- ts13 BHK 細胞株もまた、ATCCから受付番号 CRL 1632で入手可能である。さらに、Rat Hep I (Rat hepatoma；ATCC CRL 1600)、Rat Hep II (Rat hepatoma；ATCC CRL 1548)、TCMK (ATCC CCL 139)、ヒト肺 (ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1)及び DUKX 細胞 (Urlaub及びChasin、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220、1980)を含む他の多くの細胞株を用いることができる。
トランスジェニック動物技術を、本発明のVII因子ポリペプチドを生産するために用いることができる。宿主メス哺乳類の乳腺内でタンパク質が生産されることが好ましい。乳腺中での発現、続いて目的のタンパク質の乳への分泌は、タンパク質を他の源から単離する際に遭遇する多くの困難を克服する。乳は容易に集められ、大量に入手可能であり、生化学的に良く性質決定されている。更にその上、主要な乳たんぱく質は、乳中に高濃度（典型的には約１〜１５ g/l）で存在する。
商業的な観点から、宿主として大量の乳産出量を有する種を用いることが、明らかに好ましい。マウスやラットのようなより小さな動物を用いることもできるが（原理的段階の証明では好ましい）、家畜哺乳類を用いることが好ましく、これらに限定されないが、ブタ、ヤギ、ヒツジ、及びウシが含まれる。ヒツジは、この種におけるトランスジェニックの従来のヒストリーのため、乳産出量、コスト及びヒツジ乳の収集のための装備が容易に入手可能であることなどの要因のために、特に好ましい（例えば、宿主種の選択に影響する要因の比較のために、WO 88/00239を参照）。搾乳に使うために育種された宿主動物の品種、例えばイースト・フリースランド・シープ（East Friesland sheep）を選択することが一般に望ましく、又は、トランスジェニック系統の育種によって、乳系統（dairy stock）を後日に導入することが望ましい。何れの場合でも、既知の、健康状態の良い動物が用いられるべきである。
乳腺中で発現させるために、乳タンパク質遺伝子からの転写プロモーターを用いる。乳タンパク質遺伝子は、カゼイン（米国特許第5,304,489参照）、ベータ・ラクトグロブリン、ラクトアルブミン、及び乳清酸性タンパク質をコードする遺伝子を含む。ベータ・ラクトグロブリン(BLG)プロモーターが好ましい。ヒツジのベータ・ラクトグロブリン遺伝子の場合、該遺伝子の５’フランキング配列の少なくとも近位406 bpの領域が通常は用いられるが、約5 kbpまでの５’フランキング配列のより大きな部分が好ましく、例えば、ベータ・ラクトグロブリン遺伝子の５’フランキングプロモーター及びの非コーディング部分を包含する、〜4.25 kbpのＤＮＡセグメント(Whitelaw et al.、Biochem. J. 286: 31 39 (1992)参照)が好ましい。他の種からのプロモーターＤＮＡの類似する断片もまた適当である。
発現される遺伝子のゲノム領域と同じように、ベータ・ラクトグロブリン遺伝子の他の領域も構築物に組み入れることができる。例えばイントロンを欠く構築物は、そのようなＤＮＡ配列を含むものと比較して貧弱に発現することが、当該分野で一般に認められている(Brinster et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836 840 (1988)；Palmiter et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478 482 (1991)；Whitelaw et al.、Transgenic Res. 1: 3 13 (1991)；WO 89/01343；及び WO 91/02318参照、それぞれ本明細書に参考として援用される)。これに関して、可能であれば、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の天然のイントロンの全部又は一部を含むゲノム配列を用いることが一般に好ましく、従って、例えばベータ・ラクトグロブリン遺伝子の少なくとも幾つかのイントロンを更に含むことが好ましい。そのような領域の一つは、ヒツジベータ・ラクトグロブリン遺伝子の３’非コーディング領域からの、イントロンスプライシング及びＲＮＡポリアデニル化を提供するＤＮＡセグメントである。遺伝子の天然の３’非コーディング配列の代わりの場合、このヒツジベータ・ラクトグロブリンセグメントは、目的のタンパク質及びポリペプチドの発現レベルを増強し、また安定化する。他の態様の中でも、さまざまなVII因子配列の開始ＡＴＧを囲む領域が、乳特異的タンパク質遺伝子からの対応する配列で置換された。そのような置換は、発現を増強するための、推定上の組織特異的開始環境を提供する。全体のVII因子変異体プレプロ及び５’非コーディング配列が、例えば、ＢＬＧ遺伝子のそれらと置換されることは、より小さい領域が置換され得るにも関わらず、都合がよい。
トランスジェニック動物中でVII因子ポリペプチドを発現するために、VII因子変異体をコードするＤＮＡセグメントが、発現ユニットを生成するためにその発現が望まれる追加のＤＮＡセグメントに操作的に結合される。そのような追加のセグメントは、上記のプロモーター、並びに、転写の終結及びｍＲＮＡのポリアデニル化を提供する配列を含む。発現ユニットは、さらに、修飾されたVII因子をコードするセグメントに操作的に結合された分泌性シグナル配列をコードするＤＮＡセグメントを含む。
分泌性シグナル配列は、天然VII因子分泌シグナル配列であってよく、或いは、他のタンパク質、例えば乳タンパク質のものであってよい(例えば、von Heijne、Nucl. Acids Res. 14: 4683 4690 (1986)；and Meade et al.、U.S. 4,873,316を参照、本明細書中に参考として援用される)。
トランスジェニック動物において使用するための発現ユニットの構築物は、追加のＤＮＡセグメントを含むプラスミド又はファージベクターの中に、変異体VII因子配列を挿入することによって都合よく実行されるが、発現ユニットは必須な任意のライゲーション配列によって構築され得る。乳タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを含むベクターを提供すること、及び、該乳タンパク質のコーディング配列をVII因子ポリペプチド変異体のものと置換することは、特に都合がよい；それによって、乳タンパク質遺伝子の発現制御配列を含む遺伝子融合を作製する。いずれの場合においても、プラスミド又は他のベクター中の発現ユニットのクローニングは、変異体VII因子配列の増幅を促進する。増幅は、細菌（例えば大腸菌）宿主細胞中で都合よく実行され、従ってベクターは、典型的には複製開始点及び細菌宿主細胞中の選択可能マーカー機能を含む。次いで、この発現ユニットは、選択された宿主種の受精卵（初期胚を含む）中に導入される。異種性ＤＮＡの導入は、マイクロインジェクション(例えば、米国特許第4,873,191号)、レトロウイルス感染(Jaenisch、Science 240: 1468 1474 (1988)) 又は胚幹(ES)細胞を用いたサイト定方向（directed）組込み (Bradley et al.、Bio/Technology 10: 534 539 (1992)によって概説される)を含む幾つかのルートの一つによって達成することができる。次いで卵を偽妊娠のメスの卵管又は子宮に移植し、期間をおいて発達させる。導入されたＤＮＡをその生殖系列に保持する子孫は、それらの子孫に正常なメンデルの様式で該ＤＮＡを渡すことができ、トランスジェニック家畜の発展を可能にする。トランスジェニック動物を生産する一般的な方法は、当該分野で周知である（例えば、Hogan et al.、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1986；Simons et al.、Bio/Technology 6: 179 183 (1988)；Wall et al.、Biol. Reprod. 32: 645 651 (1985)；Buhler et al.、Bio/Technology 8: 140 143 (1990)；Ebert et al.、Bio/Technology 9: 835 838 (1991)；Krimpenfort et al.、Bio/Technology 9: 844 847 (1991)；Wall et al.、J. Cell. Biochem. 49: 113 120 (1992)；U.S. 4,873,191；U.S. 4,873,316；WO 88/00239、WO 90/05188、WO 92/11757；及び GB 87/00458を参照）。外来性ＤＮＡを哺乳類及びそれらの胚細胞に導入する技術は、最初にマウスで発達した(例えば、Gordon et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380 7384 (1980)；Gordon及びRuddle、Science 214: 1244 1246 (1981)；Palmiter及びBrinster、Cell 41: 343 345 (1985)；Brinster et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438 4442 (1985)；and Hogan et al. (ibid.)を参照)。これらの技術は、続いて家畜種を含むより大きな動物(例えば、WO 88/00239、WO 90/05188,及びWO 92/11757；and Simons et al.、Bio/Technology 6: 179 183 (1988)を参照)での使用に適応された。概要を述べると、トランスジェニックマウス又は家畜の産生において現在用いられている最も効率的な経路において、目的のＤＮＡの数千の直鎖状の分子が、確立された技術に従って、受精卵の前核の一つの中に注入される。接合体（zygote）の細胞質へのＤＮＡの注入も行われることができる。
トランスジェニック植物の生産も行うことができる。発現は、一般化されるか又は特定の器官、例えば、塊茎(Hiatt、Nature 344:469 479 (1990)；Edelbaum et al.、J. Interferon Res. 12:449 453 (1992)；Sijmons et al.、Bio/Technology 8:217 221 (1990)；and EP 0 255 378を参照)に方向付けられる。
本発明のVII因子ポリペプチドは、細胞培養培地又は乳から回収される。本発明のVII因子ポリペプチドは、当該分野で既知の種々の方法によって精製されてよく、例えば、これらに限定されないが、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、疎水性、等電点電気泳動、及びサイズ排除)、電気泳動的な方法(例えば、予備の等電点電気泳動(IEF)、示差溶解度(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)、又は抽出法(例えば、Protein Purification、J.-C. Janson及びLars Ryden、editors、VCH Publishers、New York、1989を参照)を含む。好ましくは、抗-VII因子抗体カラムの親和性クロマトグラフィーによって精製される。カルシウム依存性モノクローナル抗体の使用は、ワカバヤシら（Wakabayashi et al.、J. Biol. Chem. 261:11097-11108、(1986)）及びチムら（Thim et al.、Biochemistry 27: 7785-7793、(1988)）によって開示されている。さらなる精製を、高速液体クロマトグラフィーのような従来の化学的精製手段によって達成してもよい。クエン酸バリウム沈殿を含む他の精製方法は、当該分野で周知であり、本明細書に記載した新規のVII因子ポリペプチドの精製に適用されることができる（例えば、Scopes、R.、Protein Purification、Springer-Verlag、N.Y.、1982を参照）。
治療的な目的のために、本発明のVII因子ポリペプチドは実質的に純粋であることが好ましい。従って、本発明の好ましい態様において、本発明のVII因子ポリペプチドは、少なくとも約９０〜９５％の均一性に精製され、好ましくは少なくとも約９８％の均一性に精製される。純度は、例えばゲル電気泳動法及びアミノ末端アミノ酸シークエンシングによって評価されてよい。
VII因子ポリペプチドは、二本鎖形態に転換されるために、その活性化サイトで切断される。活性化は、当該分野で既知の方法、例えばオステルドら（Osterud、et al.、Biochemistry 11:2853-2857 (1972)）；トーマス（Thomas、米国特許第4,456,591）；ヘッドナー及びキシエル（Hedner及びKisiel、J. Clin. Invest. 71:1836-1841 (1983)）；又はキシエル及びフジカワ（Kisiel及びFujikawa、Behring Inst. Mitt. 73:29-42 (1983)）によって開示されている方法に従って行われる。或いは、ビョーエンら（Bjoern et al. Research Disclosure、269 September 1986、pp. 564-565)によって開示されているように、VII因子は、モノ Q (Pharmacia fine Chemicals)などのようなイオン交換クロマトグラフィーを通すことによって活性化され得る。得られた活性型VII因子ポリペプチドは、次いで処方され、下記に記載したように投与される。
＜アッセイ＞
インビトロ加水分解アッセイ
野生型(天然)VIIa因子及びVIIa因子変異体(何れもこれ以後、「VIIa因子」と称す)を、それらの比活性を直接比較するために同時にアッセイした。このアッセイは、マイクロタイタープレート(MaxiSorp、Nunc、Denmark)上で行った。色素産生基質 D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド(S-2288、Chromogenix、Sweden)、最終濃度1 mMを、 pH 7.4、0.1 M NaCl、 5 mM CaCl2及び1 mg/mlウシ血清アルブミンを含む、50 mM Hepes中のVIIa因子(最終濃度100 nM)に加えた。405 nmでの吸光度を、SpectraMax（登録商標） 340 プレートリーダー(Molecular Devices、USA)で連続的に測定した。酵素を含まないブランクウェルにおける吸光度を減算した後、２０分のインキュベーションの間に発達した吸光度を、VIIa因子の変異体と野生型の間の活性の比を算出するのに用いた：
比 ＝ (A405 nm VIIa因子変異体)/(A405 nm VIIa因子野生型)。
インビトロタンパク分解アッセイ
野生型(天然)VIIa因子及びVIIa因子変異体(何れもこれ以後、「VIIa因子」と称す)を、それらの比活性を直接比較するために同時にアッセイした。このアッセイは、マイクロタイタープレート(MaxiSorp、Nunc、Denmark)上で行った。0.1 M NaCl、5 mM CaCl2及び1 mg/ml ウシ血清アルブミンを含む100 マイクロＬ 50 mM Hepes、pH 7.4中のVIIa因子 (10 nM)及びX因子(0.8 マイクロM)を、１５分インキュベートした。次いで、0.1 M NaCl、20 mM EDTA及び1 mg/ml ウシ血清アルブミンを含む、50 マイクロL 50 mM Hepes、pH 7.4 を加えて、X因子の切断を停止した。Xa因子の生成量を、色素産生基質Z-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド (S-2765、Chromogenix、Swe-den)を最終濃度0.5 mMで加えて測定した。405 nmでの吸光度を、SpectraMax 340プレートリーダー(Molecular Devices、USA)で連続的に測定した。VIIa因子を含まないブランクウェルにおける吸光度を減算した後、１０分の間に発達した吸光度を、VIIa因子の変異体と野生型の間のタンパク分解活性の比を算出するのに用いた：
比 ＝ (A405 nm VIIa因子変異体)/(A405 nm VIIa因子野生型)。
GD-FVIIa 形成速度アッセイ
GD-FVIIa (GLAドメイン欠失FVIIa、39-406断片)形成速度は、所定の期間に渡り、GD-FVIIa含量に相対する上昇として測定される。GD-FVIIa形成速度が測定されるFVIIa溶液は、二回試料採取される。一つは最初の試料であり、一つは調査される環境（ｐＨ、濃度、温度など）でのインキュベーション後の試料である。試料を採取した直後に、試料バッファーと共に煮沸し、分析中のさらなる分解を停止させる。二つの試料は、非還元性ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析し、GD-FVIIaバンド領域をFVIIaに対して測定される。次いで、開始及び終了サンプルの時間中のインキュベーションの間のGD-FVIIaの上昇をインキュベーション時間で割り、GD-FVIIa形成速度を得る。およそFVIIa濃度１ mg/mlの試料でＳＤＳ-ＰＡＧＥを行い、これは、当量のローディングバッファーと混合し、５分間煮沸した。試料を、MOPSランニングバッファー中の12% NuPAGE Bis-Tris中の試料ウェルに移した。試料の先端がゲルの底面に移動するまで電場をかけた。ゲルカセットを取り外し、ゲルが乾燥する前に、ゲルを移動し、固定クーマシー染色用液に移し、最後に脱染溶液に移した。
125 マイクロモーラー CaCl2、75 mM NaCl、10 mM グリシルクリシン、pH 8,6から成るバッファー中の、1,3 mg/ml FVIIa溶液は、最初は１０％のGD-FVIIa含量を有し、２４時間のインキュベートの後、GD-FVIIa 含量は70%まで上昇した。これゆえ、形成速度は60 % GD-FVIIa / 24時間であった。2,5 mMの濃度のCaCl2による同様のサンプルは、２４時間の間に、6,6%から8,2%までのGD-FVIIa含量の上昇を示し、1,6 % GD-FVIIa / 24 時間のGD-FVIIa形成速度を得た。
ここで開示された態様は、本発明の幾つかの側面を説明するためのものであって、本明細書に記載した発明及び請求の範囲は、ここで開示された特定の態様によって範囲が限定されるものではない。任意の等価な態様が、本発明の範囲内であるよう意図される。実際、本明細書中で示されたものに加えられる本発明の種々の改変は、前記から当該分野の技術者には明らかである。そのような改変もまた、従属請求項の範囲内であるように意図される。コンフリクトの場合は、定義に含まれる本発明の開示によって規制される。
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは本発明の範囲を限定するように構成するものではない。
以下の実施例における方法が、本発明に従った任意のFVIIポリペプチドのために用いられ得ることが理解されるであろう。さらに、実施例２〜１９において行われた工程は、純度が保証されたFVIIポリペプチドを得るために任意に組み合わされてよい。
[実施例1]
２００マイクロモーラーCu2+に調整することによる、細胞培養物収集の安定化
20 mg/lの濃度のFVIIaアナログを含むBHK-21細胞培養物の上清の一部500 mlを、デッドエンド４５ミクロンフィルターによって濾過した。2 mMの濃度の遊離のCa2+を含む収集は、２００マイクロモーラーのCu2+の濃度にまで硝酸銅（II）を添加することにより、さらに安定化した。安定化された培養物上清は、さらなる処理の前に５℃で保存した。
[実施例2]
Cu2+の存在下でのHICによるFVIIポリペプチドの精製及び低pH条件下での溶出
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を、Toyopearl MD-G Butyl樹脂を充填したカラム(1 cm 内径× 7 cm長= 5.5 ml)で行った。カラムを35 mM CaCl2、0.1 mM Cu(NO3)2*3 H2O、1,5 M NaCl、10 mM tris、pH 7,5の10 CVで平衡化した。平衡化の後、0.1 mg/ml FVIIaを含む42 mlの溶液をカラムにロードした。ローディングの後、カラムを10 CVの平衡化バッファーで洗浄した。結合したFVII(a)を、20 mM EDTA、50 mM ヒスチジン、pH 6.0を用いて溶出した。
［実施例3］
Cu2+の存在下でのサイズ排除クロマトグラフィーの実施
サイズ排除クロマトグラフィーを、pH 6.0のヒスチジンバッファー溶液中の機能亢進性FVIIaアナログのサンプル(1 mg/ml) 3 mlで行った。サンプルは１ミクロン・デッドエンドフィルターで濾過した後に、50 mM NaCl、0.1 mM 硝酸銅(II),10 mM ヒスチジンから構成されるpH 6.0のバッファーで平衡化したToyopearl HW-55F (1 cm 内径×100 cm 長＝79 ml CV)にアプライした。ランニングバッファーは、平衡化バッファーと同じであった。精製の全てのセグメントは、流速12 cm/時及び温度5℃で行った。
［実施例4］
ｐＨ６に調整することによる、細胞培養物の収集の安定化
FVIIaアナログ濃度50 mg/lの、CHO K1細胞培養物上清の一部 500 mlを、ヒスチジンを濃度 20 mMに加えて安定化し、続いてｐＨを６．０に調整した。安定化された培養物上清を、デッドエンド４５ミクロンフィルターで濾過し、さらなる処理まで５℃で貯蔵した。
［実施例5］
pH 6での陰イオン交換クロマトグラフィーの実施
陰イオン交換クロマトグラフィーを、ファルマシア・Q-セファロース・ファスト・フローを充填し、5 mM EDTA、10 mM ヒスチジンを含むpH 6.0の溶液 5 CVで平衡化したカラム(1 cm 内径×10 cm 長 = 7,85 ml カラム容積(CV))で行った。1 mg/ml FVIIa アナログを含む濾過溶液40 CVsをロードし、続いて50 mM NaCl、10 mM ヒスチジン、pH 6.0を5 CV用いて洗浄した。溶出は、10 mM ヒスチジンでpH 6.0に緩衝した、勾配 50 mM NaCl〜 750 mM NaClの40 CV NaClで行った。全精製は流速 20 CV/h及び温度5℃で行った。
［実施例6］
pH 9での陰イオン交換クロマトグラフィーの実施
陰イオン交換クロマトグラフィーを、ファルマシア・Q-セファロース・ファスト・フローを充填し、5 mM EDTA、10 mM ヒスチジンを含むpH 9.0の溶液5 CVで平衡化したカラム(1 cm 内径×10 cm 長 = 7,85 ml カラム容積(CV))で行った。1 mg/ml FVIIa アナログを含む濾過溶液40 CVsをロードし、続いて50 mM NaCl、10 mM ヒスチジン、pH 9.0を5 CV用いて洗浄した。溶出は、10 mM ヒスチジンでpH 9.0に緩衝した、40 CV NaCl 勾配 50 mM NaCl〜 750 mM NaClで行った。全精製は流速 20 CV/h及び温度5℃で行った。
［実施例7］
pH 6でのサイズ排除クロマトグラフィーの実施
サイズ排除クロマトグラフィーを、pH 6.0 ヒスチジン緩衝溶液中の機能亢進性FVIIa アナログのサンプル (1 mg/ml) 1,5 mlで行った。サンプルを４５ミクロン・デッドエンドフィルターで濾過した後、 50 mM NaCl、10 mM CaCl2、10 mM ヒスチジンから構成されるｐＨ6.0のバッファーで平衡化したファルマシアスペルデクス200カラム(1 cm 内径×60 cm 長 = 47 ml CV)にアプライした。ランニングバッファーは、平衡化バッファーと同じであった。精製の全セグメントは、流速0.3 CV/時及び温度5℃で行った。
［実施例8］
pH 9でのサイズ排除クロマトグラフィーの実施
サイズ排除クロマトグラフィーを、pH 9.0 ヒスチジン緩衝溶液中の機能亢進性FVIIa アナログのサンプル (1 mg/ml) 1,5 mlで行った。サンプルを４５ミクロン・デッドエンドフィルターで濾過した後、 50 mM NaCl、10 mM CaCl2、10 mM ヒスチジンから構成されるｐＨ9.0のバッファーで平衡化したファルマシアスペルデクス200カラム(1 cm 内径×60 cm 長 = 47 ml CV)にアプライした。ランニングバッファーは、平衡化バッファーと同じであった。精製の全セグメントは、流速0.3 CV/時及び温度5℃で行った。
［実施例9］
pH 6での限外濾過の実施
機能亢進性FVIIa アナログを含む HEK293培養物上清の限外濾過を、Millipore lab scale Tangential Flow Filtration (TFF) システムで、50 cm2 30 kDa バイオマックス（Biomax）・フィルトレーション・カセットを用いて行った。デッドエンド濾過した収集物を、ヒスチジンを濃度20 mMに添加し、pHを6.0に調整して安定化した。デッドエンド濾過し安定化した 500グラムの収集物を、2 barsの膜貫通圧(TMP)で、約25 gの最終保持質量（final retentate mass）まで限外濾過した。機能亢進性FVIIa アナログの20倍濃度相当が達成された。全てのプロセスは、環境温度(20℃)で行った。
［実施例10］
pH 6での免疫親和性精製の実施
HEK293 培養物上清の一部1500 mlに、カルシウムを10 mM Ca2+濃度に加え、ヒスチジン バッファーを10 mM濃度に加えて安定化し、HClでpH 6.0に調整し、45 ミクロンのデッドエンド・フィルターで濾過した。安定化された培養物上清を、Ca2+-依存性抗FVIIa モノクローナル抗体を充填されたカラム(1.6 cm 内径×10 cm 長 = 20 ml CV)にロードし、ファルマシア・セファロース4Bに固定化した。ローディングより前に、カラムを5 CVの 10 mM CaCl2、10 mM ヒスチジン、pH 6.0で平衡化した。ローディング後に、カラムを2 M NaCl、10 mM CaCl2、10 mM ヒスチジン、pH 6.0、 10 CVで洗浄した。結合したFVII(a)を、10 CV の30 mM EDTA、50 mM ヒスチジン、pH 6.0で溶出した。精製の間を通して、流速12 CV/h及び温度５℃を用いた。
［実施例11］
pH 9での免疫親和性精製の実施
HEK293 培養物上清の一部1500 mlに、カルシウムを10 mM Ca2+濃度に加え、及び、ヒスチジン バッファーを10 mM濃度に加えて安定化し、HClでpH 9.0に調整し、45 ミクロンのデッドエンド・フィルターで濾過した。安定化された培養物上清を、Ca2+-依存性抗FVIIa モノクローナル抗体を充填されたカラム(1.6 cm 内径×10 cm 長 = 20 ml CV)にロードし、ファルマシア・セファロース4Bに固定化した。ローディングより前に、カラムを5 CVの 10 mM CaCl2、10 mM ヒスチジン、pH 9.0で平衡化した。ローディング後に、カラムを2 M NaCl、10 mM CaCl2、10 mM ヒスチジン、pH 9.0、 10 CVで洗浄した。結合したFVII(a)を、10 CV の30 mM EDTA、50 mM ヒスチジン、pH 9.0で溶出した。精製の間を通して、流速12 CV/h及び温度５℃を用いた。
［実施例12］
細胞培養物の収集物の、Ca2+ 濃度 10 mMに調整することによる安定化
FVIIa アナログ 濃度50 mg/ml及びカルシウムイオン濃度約2 mMを含む、HEK293細胞培養物上清の一部450 mlを、CaCl2 溶液を最終濃度 10 mM Ca2+に加えることによって安定化した。溶液を４５ミクロンのデッドエンド・フィルターで濾過し、さらなる処理まで５℃で貯蔵した。
［実施例13］
20 mM Ca2+の存在下での限外濾過及びダイアフィルトレーションの実施
機能亢進性FVIIaアナログの限外濾過を、Millipore lab scale Tangential Flow Filtration (TFF)システムで、50 cm2 30 kDa バイオマックス・フィルトレーション・カセットを用いて行った。FVIIaアナログ溶出物を、カルシウム溶液を20 mM Ca2+濃度に、ヒスチジンを10 mM濃度に加え、pHを6.0に調整して安定化した。安定化したFVIIaアナログ 400 グラムを、2 barsの膜貫通圧(TMP)で、最終保持質量約25 gまで限外濾過した。これは16-倍濃度に相当した。限外濾過に続いて、20 mM CaCl2、10 mM ヒスチジン、pH 6.0 バッファーで３容積ターンオーバーのダイアフィルトレーションを行った。同様のTMPを両者の操作に用いた。全てのプロセスは、環境温度(20℃)で行った。
［実施例14］
20 mM Ca2+の存在下における免疫親和性精製の実施
BHK-21 培養物上清の一部 1000 mlに、カルシウムを濃度10 mM Ca2+に添加し、またトリスバッファーを濃度10 mMに添加し、続いてHClでpHを8に調整して安定化した。これを４５ミクロンのデッドエンド・フィルターで濾過した。安定化された培養物上清を、Ca2+依存性抗-FVIIaモノクローナル抗体で充填されたカラム(1.6 cm 内径×10 cm 長 = 20 ml CV)にロードし、ファルマシア・セファロース4Bに固定化した。ローディングの前に、カラムを5 CVの 10 mM CaCl2、10 mM tris、pH 8で平衡化した。ローディングの後に、カラムを10 CV の2 M NaCl、10 mM CaCl2、10 mM tris、pH 8で洗浄した。結合したFVII(a)を、10 CVの30 mM EDTA、50 mM tris、pH 8で溶出した。精製の間、流速12 CV/h、及び温度 5℃を用いた。溶出物は、塩化カルシウムを最終濃度 59 mMで加えて直ちに安定化した。
［実施例15］
20 mM Ca2+の存在下におけるロード及び洗浄、続くｐＨ６での溶出の実施
CHO K１培養物上清の一部 800 mlを、カルシウムを濃度10 mM Ca2+に添加して安定化した。続いて、トリスバッファーを10 mM濃度で添加し、HClでpH 7.5に調整し、４５ミクロン・デッドエンドフィルターで濾過した。安定化された培養物上清を、Ca2+-依存性抗FVIIaモノクローナル抗体で充填されたカラム(1.6 cm 内径2 cm 長 = 4 ml CV)にロードし、ファルマシア・セファロース4Bに固定化した。ローディングに先立ち、カラムを5 CV の 10 mM CaCl2、10 mM tris、pH 7.5で平衡化した。ローディング後に、カラムを10 CV の2 M NaCl、10 mM CaCl2、10 mM tris、pH 7.5で洗浄し、続いて10 CVの2 M NaCl、10 mM CaCl2、10 mM ヒスチジン、pH 6.0で二回目の洗浄を行った。結合したFVII(a)を、10 CV の30 mM EDTA、50 ヒスチジン、pH 6.0で溶出した。精製の間、流速 12 CV/h及び温度5℃を用いた。
［実施例16］
Ca2+の存在下におけるサイズ排除クロマトグラフィーの実施
サイズ排除クロマトグラフィーを、pH 6.0 ヒスチジンバッファー溶液中の 5 mlサンプル(1 mg/ml)の機能亢進性FVIIaアナログで行った。サンプルを、1ミクロン・デッドエンドフィルターで濾過した後、50 mM NaCl、35 mM CaCl2、10 mM ヒスチジン、pH 6.0から成るバッファーで平衡化した、ファルマシアスペルデクス（Pharmacia Superdex）200 (1 cm 内径×80 cm 長 = 63 ml CV)にアプライした。ランニングバッファーは平衡化バッファーと同じであった。精製の全てのセグメントを、流速15 cm/hr及び温度 5 ℃で行った。
［実施例17］
pH 6における、高Ca2+での限外濾過及びダイアフィルトレーションの実施
機能亢進性FVIIaアナログを含むHEK293培養物上清の限外濾過を、50 cm2 30 kDa バイオマックス・フィルトレーション・カセットを用いたミリポア lab スケール・タンゼンシャル・フロー・フィルトレーション(TFF)システムで行った。デッドエンド・フィルターの収集物を、ヒスチジンを濃度20 mMに加え、pHを6.0に調整して安定化した。デッドエンド濾過され安定化された500グラムの収集物に、カルシウムを濃度35 mMに加え、2 barsの膜貫通圧(TMP)で、約２５ｇの最終貯留質量（これは機能亢進性FVIIa アナログの２０倍濃度に匹敵する）に達するまで限外濾過した。限外濾過に続いて、35 mM CaCl2、10 mM ヒスチジン、pH 6.0 バッファーでの、３倍量のターンオーバー・ダイアフィルトレーションを行った。両方の操作で同じＴＭＰを用いた。全ての処理は、環境温度（２０℃）で行った。
［実施例18］
pH 6に調整及びCu2+の添加の両者を用いた収集物の安定化
FVIIaアナログ濃度 50 mg/lであるCHO-K1 細胞培養物上清 500 mlを、デッドエンド45ミクロンフィルターで濾過した。 2 mM Ca2+を含む収集物に、ヒスチジンを濃度 10 mMに加え、続いてHClでpHを6.0に調整した。収集物をさらに、硝酸銅(II)溶液を濃度200マイクロモーラーCu2+に加えて安定化した。安定化された培養物上清は、さらなる処理の前に、５℃で貯蔵した。
［実施例19］
pH 6に調整及びCu2+の添加の両者を用いた収集物の安定化
FVIIaアナログ濃度 50 mg/l及びカルシウムイオン濃度約 2 mMを含むHEK293細胞培養物上清 1000 mlを、CaCl2溶液を最終濃度10 mM Ca2+に添加することによって安定化した。ヒスチジンを濃度10 mMに添加し、続いてHClでpH 6.0に調整した。この溶液を45ミクロンのデッドエンド・フィルターで濾過し、さらなる処理の前に、５℃で貯蔵した。
［実施例20］
VII因子ポリペプチドの安定化におけるCu2+の効果は、精製されたVII因子ポリペプチドを、変化するCu2+濃度のもとでQ-セファロースFFマトリクスに吸着させる実験で試験される。500 μｇのFVIIポリペプチドを、800μｌのバッファー（10 mM Tris、50 mM NaCl、2 mM CaCl2及び種々の濃度の硝酸銅(II)、1.5 mlテストチューブ中）中で50μｌのQ-セファロースFFと共にインキュベートした。１時間及び２時間の後、マトリクスを遠心分離によって定着させ、上清を除去した。800μｌのバッファー10 mM Tris、50 mM NaCl、25 mM CaCl2 pH 8.0を加え、攪拌し、上清の遠心分離サンプルを回収し、SDS-PAGEで分析した。
［実施例21］
FVIIポリペプチドの精製及び活性化を、次の４つのクロマトフラフィーの工程により行った。
工程１:
FVIIポリペプチド を含む細胞培養物培地を希釈してイオン強度10 mS/cm未満に調整し、バッファーA: 10 mM trihydroxymethylaminomethan (Tris)；150 mM NaCl pH 8で予め平衡化したQ-セファロースカラムにアプライした。
175 mM NaClの同じバッファーによる洗浄工程の後、FVIIポリペプチドをバッファーB: 10 mM Tris；150 mM NaCl；25mM CaCl2 pH 8で溶出した。
工程２：
104 mg/lのFVIIポリペプチドを含む溶出液を最終組成：10 mM Tris；1M NaCl；25mM CaCl2；70 μM 硝酸銅(II) pH 7.5に調整し、固体化された抗-FVIIモノクローナル抗体と共にセファロースカラムにアプライした。
抗体カラムは、バッファー C: 10 mM Tris；100 mM NaCl；20mM CaCl2；70 μM 硝酸銅(II) pH 7.5で予め平衡化した。次いでカラムを、10 mM Tris ; 2 M NaCl；20mM CaCl2；70 μM 硝酸銅(II) pH 7.5 、続いてバッファーCで洗浄した。その後、バッファー: 75 mM Tris；30 mMクエン酸三ナトリウム；70 μM 硝酸銅(II) pH 7.5をアプライしてFVIIポリペプチドを溶出した。
工程３：
溶出物を直ちに、バッファー: 10 mM Tris；150 mM NaCl；70 μM 硝酸銅(II) pH 8.6で予め平衡化したQ-セファロースカラム にアプライした。
カラムを同じバッファーで洗浄し、FVIIポリペプチドをバッファー Aからバッファー D: 10 mM Tris；500 mM NaCl；70 μM 硝酸銅(II) pH 8.6 の直線勾配で溶出した。
工程４：
FVIIポリペプチドを含む画分を希釈し、イオン強度10 mS/cm 未満に調整し、直ちに、バッファー: 10 mM グリシルグリシン；150 mM NaCl；70 μM 硝酸銅(II) pH 8.6で予め平衡化したQ-セファロースカラムにアプライした。
バッファー: 10 mM グリシルグリシン；175 mM NaCl；70 μM 硝酸銅(II) pH 8.6；及びバッファー E: 10 mM グリシルグリシン；100 mM NaCl；70 μM 硝酸銅(II)、pH 8.6で洗浄した後、FVIIポリペプチドをバッファーEからバッファー: 10 mM グリシルグリシン；100 mM NaCl；15 mM CaCl2；70 μM 硝酸銅(II)、pH 8.6までの直線勾配で溶出した。流速 1 vol./hr。
［実施例22］
FVIIポリペプチドの精製及び活性化を、次の４つのクロマトグラフィーの工程により行った。
工程１:
FVIIポリペプチド を含む細胞培養物培地を希釈してイオン強度10 mS/cm未満に調整し、バッファーA: 10 mM trihydroxymethylaminomethan (Tris)；150 mM NaCl pH 8で予め平衡化したQ-セファロースカラムにアプライした。
175 mM NaClの同じバッファーによる洗浄工程の後、FVIIポリペプチドをバッファーB: 10 mM Tris；150 mM NaCl；25mM CaCl2 pH 8で溶出した。
工程２：
104 mg/lのFVIIポリペプチドを含む溶出液を最終組成：10 mM Tris；1M NaCl；25mM CaCl2；70 μM 硝酸銅(II) pH 7.5に調整し、固体化された抗-FVIIモノクローナル抗体と共にセファロースカラムにアプライした。
抗体カラムは、バッファー C: 10 mM Tris；100 mM NaCl；20mM CaCl2；70 μM 硝酸銅(II) pH 7.5で予め平衡化した。次いでカラムを、10 mM Tris ; 2 M NaCl；20mM CaCl2；70 μM 硝酸銅(II) pH 7.5 、続いてバッファーCで洗浄した。その後、バッファー: 75 mM Tris；30 mMクエン酸三ナトリウム；70 μM 硝酸銅(II) pH 7.5をアプライしてFVIIポリペプチドを溶出した。
工程３：
溶出物を直ちに、バッファー: 10 mM Tris；150 mM NaCl；70 μM 硝酸銅(II) pH 8.6で予め平衡化したQ-セファロースカラム にアプライした。
カラムを同じバッファーで洗浄し、FVIIポリペプチドをバッファー Aからバッファー D: 10 mM Tris；500 mM NaCl；70 μM 硝酸銅(II) pH 8.6 の直線勾配で溶出した。
工程４：
FVIIポリペプチドを含む断片を希釈して2 mM エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)及びイオン強度10 mS/cm未満に調整し、バッファー: 10 mM グリシルグリシン；150 mM NaCl pH 8.6で予め平衡化した直ちにQ-セファロースカラムにアプライした。
バッファー: 10 mM グリシルグリシン；175 mM NaCl pH 8.6及びバッファー E: 10 mM グリシルグリシン；100 mM NaCl pH 8.6で洗浄した後、FVIIポリペプチドをバッファーE からバッファー: 10 mM グリシルグリシン；100 mM NaCl；15 mM CaCl2 pH 8.6 までの直線勾配で溶出した。流速 1 vol./hr。
［実施例23］
FVIIポリペプチドの精製及び活性化を、次の４つのクロマトフラフィーの工程により行った。
工程１:
FVIIポリペプチド を含む細胞培養物培地を希釈してイオン強度10 mS/cm未満に調整し、バッファーA: 10 mM trihydroxymethylaminomethan (Tris)；150 mM NaCl pH 8で予め平衡化したQ-セファロースカラムにアプライした。
175 mM NaClの同じバッファーによる洗浄工程の後、FVIIポリペプチドをバッファーB: 10 mM Tris；150 mM NaCl；25mM CaCl2 pH 8で溶出した。
工程２：
104 mg/lのFVIIポリペプチドを含む溶出液を最終組成：10 mM Tris；1M NaCl；25mM CaCl2；70 μM 硝酸銅(II) pH 7.5に調整し、固体化された抗-FVIIモノクローナル抗体と共にセファロースカラムにアプライした。
抗体カラムは、バッファー C: 10 mM Tris；100 mM NaCl；20mM CaCl2；70 μM 硝酸銅(II) pH 7.5で予め平衡化した。次いでカラムを、10 mM Tris ; 2 M NaCl；20mM CaCl2；70 μM 硝酸銅(II) pH 7.5 、続いてバッファーCで洗浄した。その後、バッファー: 75 mM Tris；30 mMクエン酸三ナトリウム；70 μM 硝酸銅(II) pH 7.5をアプライしてFVIIポリペプチドを溶出した。
工程３：溶出物を2 mM EDTAに調整し、直ちに、バッファー: 10 mM Tris；150 mM NaCl pH 8.6で予め平衡化したQ-セファロースカラムにアプライした。
カラムを同じバッファーで洗浄し、FVIIポリペプチドを、バッファー A からバッファー D: 10 mM Tris；500 mM NaCl pH 8.6の直線勾配で溶出した。
工程４：
FVIIポリペプチドを含む画分を希釈してイオン強度10 mS/cm未満に調整し、直ちに、バッファー: 10 mM グリシルグリシン；150 mM NaCl pH 8.6で予め平衡化されたQ-セファロースカラムにアプライした。
バッファー: 10 mM グリシルグリシン；175 mM NaCl pH 8.6.及びバッファー E: 10 mM グリシルグリシン；100 mM NaCl pH 8.6で洗浄した後、FVIIポリペプチドを、バッファー E からバッファー: 10 mM グリシルグリシン；100 mM NaCl；15 mM CaCl2 pH 8.6までの直線勾配で溶出した。流速 1 vol./hr。
［実施例24］
VII因子ポリペプチドの限外濾過及びダイアフィルトレーション
VII因子ポリペプチドを含む130リットルの CHO細胞培養物上清を収集した。収集物にヒスチジンを10 mMに添加して安定化し、pHを6.0に調整し、1 mM CaCl2を加えた。上清を3.0 μｍ、1.0μｍ及び0.3μｍの Millipore clarigard フィルターを含むフィルター・トレイン（filter train）で濾過した。清澄な上清を、10×容量減少まで0.2 m2 のMillipore Biomax 50 膜を通して限外濾過した。限外濾過は、32 psi のTMP セットポイント及び600 ml/分のクロスフローセットポイントを用いて行った。所望の保持容量に達した後、３容積ターンオーバーのダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションバッファーは、5 mM ヒスチジン、20 mM NaCl、1 mM CaCl2、0.07 g/l Tween 80、pH 6.0から成る。
wt-FVIIaの限外濾過及びダイアフィルトレーション
ヒト野生型 FVIIaを含むCHO細胞培養物上清100 リットルを収集し、ヒスチジンを濃度10 mMに加えて安定化し、pHを6.0に調整し、1 mM CaCl2を加えた。上清を濾過し、10×容量減少まで、0.2 m2 のMillipore Biomax 50 膜で限外濾過した。所望の保持容量に達したとき、３容積ターンオーバーのダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーションバッファーは、5 mM ヒスチジン、20 mM NaCl、1 mM CaCl2、0.07 g/l Tween 80、pH 6.0から成る。
GLAドメイン(GD-FVIIa)のないFVIIaのフォーメーション。図は、GD-FVIIa形成対FVIIaのCa2+ モル比(カルシウム当量＝FVIIa:Ca2+)の速度を示す。条件: 1,3 mg/ml FVIIa、75 mM NaCl、10 mM グリシルグリシン、pH 8,5。

Claims (37)

  1. VII因子ポリペプチドを、該VII因子ポリペプチドを含む溶液中で安定化するための方法であって、
    該VII因子ポリペプチドを含む該溶液を、カルシウムイオンとVII因子ポリペプチドのモル比（Ca2+:FVIIポリペプチド）が０．５より低くなるようにカルシウムを加える工程；及び
    該VII因子ポリペプチドを含む溶液のｐＨを、４．５〜６．９又は８．６〜１０に調整する工程；
    に供することによる方法。
  2. 前記モル比が０．４５より低いことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記モル比が０．４０より低いことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 前記モル比が０．３５より低いことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  5. 前記モル比が０．３０より低いことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. 前記モル比が０．２５より低いことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  7. 前記モル比が０．２０より低いことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  8. 前記モル比が０．１５より低いことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  9. 前記モル比が０．１０より低いことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  10. 前記モル比が０．０５より低いことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  11. 前記VII因子ポリペプチドが、野生型ヒトVII因子である、請求項１〜１０に記載の方法。
  12. 前記VII因子ポリペプチドが、野生型ヒトFVIIa因子より高いタンパク分解活性を有することを特徴とする、請求項１〜１１に記載の方法。
  13. 前記VII因子ポリペプチドが、下記から成る群から選択されるVII因子-関連ポリペプチドである、請求項１２に記載の方法： L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII,及びS336G-FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII、L305V/E296V-FVII、L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、L305V/K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII、L305V/K337A/V158D-FVII、L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII、L305V/V158T/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/K316H-FVII、S314E/K316Q-FVII、S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII、S314E/L305V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII、S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V-FVII、S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、K316H/L305V/K337A/V158D-FVII、K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V-FVII、K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V-FVII、K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D-FVII、K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、F374Y/L305V/E296V-FVII、F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII、F374Y/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII、F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII、F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII、F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII、F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-VII因子、S60A-VII因子；
    R152E-VII因子、S344A-VII因子、Glaドメイン欠損VIIa因子；及び P11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVII；及び233Thrから240Asnまでのアミノ酸配列において置換、付加又は欠失を有するFVII、304Argから329Cysまでのアミノ酸配列において置換、付加又は欠失を有するFVII。
  14. 前記VII因子ポリペプチドが、ｐＨ４．５〜６．９で精製されることを特徴とする、請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法。
  15. 前記ｐＨが４．７〜６．８であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ｐＨが４．９〜６．７であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記ｐＨが５．１〜６．６であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  18. 前記ｐＨが５．３〜６．５であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  19. 前記ｐＨが５．５〜６．４であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  20. 前記ｐＨが５．７〜６．３であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  21. 前記ｐＨが５．８〜６．２であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  22. 前記ｐＨが５．９〜６．１であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  23. 前記ｐＨが６．０であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  24. 前記VII因子ポリペプチドが、ｐＨ８．６〜１０で精製されることを特徴とする、請求項１〜１３の何れか一項に記載の方法。
  25. 前記ｐＨが、８．７〜９．９であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ｐＨが８．８〜９．８であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記ｐＨが８．９〜９．７であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
  28. 前記ｐＨが９．０〜９．６であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
  29. 前記ｐＨが９．１〜９．５であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
  30. 前記ｐＨが８．７〜９．８であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
  31. 前記ｐＨが８．７〜９．７であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
  32. 前記ｐＨが８．７〜９．６であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
  33. 前記ｐＨが８．８〜９．５であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
  34. 前記ｐＨが８．９〜９．４であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
  35. 前記ｐＨが９．０〜９．２であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
  36. 前記ｐＨが９．２であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
  37. 前記VII因子ポリペプチドが、ヒスチジンの存在下において安定化されることを特徴とする、請求項１〜３６の何れか一項に記載の方法。
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