JP2006527216A - 新規調合物 - Google Patents

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JP2006527216A
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パーソン、エゴン
ハンセン、カーステン・ボルグンド
Original Assignee
ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト
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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46Hydrolases (3)
    • A61K38/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/482Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A61K38/4846Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents

Abstract

本発明は、凝固因子FVIIaを含む組成物に関する。

Description

本発明は、第VIIa凝固因子を含む新規調合物、並びに第VIIa凝固因子の投与方法に関する。
凝固カスケードに関与する多くのタンパク質、たとえば第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、および第XIII因子は、種々の病理学的症状を治療するのに有効な治療剤であることが証明されている。一般に、凝固「カスケード」と称されるものに関与する血液成分は、プロ酵素またはチモーゲンであり、これらは、それ自体が活性凝固因子であるアクチベーターの作用によりタンパク分解酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質である。かかる変換が行われ、一般に「活性因子」と称される凝固因子は、小文字「a」の添え字を追加することにより示される(たとえば、活性化第VII因子(FVIIa))。
FVIIaは、他の相同なセリンプロテアーゼとは対照的に、エネルギー的に好ましくない活性コンフォメーションを有する。その結果、同種の膜結合補因子組織因子(TF)に結合することにより劇的に増大する遊離の野生型ヒト第VIIa因子の最適な酵素活性には程遠い。自然環境において、遊離の野生型ヒト第VIIa因子のチモーゲン性(zymogenicity)は、血管損傷とそれに付随するTF露出により、FVIIaの止血活性のタイムリーな誘発と適切な位置の選定を保証する。
従来のFVII調合物は、野生型ヒトFVIIaを含有するのみである。野生型ヒト第VIIa因子と比較して高い活性または異なる活性を有するFVIIポリペプチドを野生型ヒトFVIIaに追加した改良型FVII調合物に対する必要性が当該技術分野に存在する。
発明の概要
本発明は、広い側面において、野生型ヒトFVIIaを含む薬学的組成物に関する。
第一の側面において、本発明は、野生型ヒトFVIIaおよび第VII因子関連ポリペプチドを含む組成物に関する。
第二の側面において、本発明は、被検体における出血の発症の治療のため、または正常な止血システムの増大のための方法であって、その必要がある被検体に対して、
a)野生型ヒトFVIIaおよび第VII因子関連ポリペプチドを含む組成物;または
b)野生型ヒトFVIIaを含む第一の組成物および第VII因子関連ポリペプチドを含む第二の組成物
を、治療的または予防的に効果的な量で投与することを含む方法に関する。
第三の側面において、本発明は、野生型ヒトFVIIaおよび第VII因子関連ポリペプチドを含む組成物を調製する方法であって、水性媒体中で野生型ヒトFVIIaを第VII因子関連ポリペプチドと混合する工程を含む方法に関する。
更なる側面において、本発明は、被検体における出血の発症の治療のため、または正常な止血システムの増大のための医薬を調製するための、野生型ヒトFVIIaおよび第VII因子関連ポリペプチドを含む組成物の使用に関する。
発明の詳細な説明
FVIIaの活性を調節するメカニズムについて我々の理解が近年進展したことにより、遊離の酵素においてチモーゲン性(zymogenicity)決定因子として機能する側鎖の位置が正確に示されている。これらアミノ酸残基を置換することにより、固有の(TF-非依存性)触媒効率が改良されたFVIIa分子が得られる。これらFVIIa変異体の幾つかの比較的高い固有活性は、遊離の第VIIa因子のチモーゲン様コンフォメーションが、限られた数の重要なアミノ酸残基により影響を受けることを示唆する。158、296および298の位置に変異を有するこれらスーパー活性なFVIIa変異体の一つは、遊離のFVIIaよりむしろTF-結合FVIIaに似た幾つかの特性を示す。これらFVIIa変異体は、野生型FVIIaと比較して高い固有の酵素活性および阻害剤感受性に加えて、カルシウムイオン要求性が低下し、Asp343と塩橋を形成するプロテアーゼドメインN−末端(Ile153)がより深く包埋される。
本発明は、止血の治療のための薬学的組成物において、野生型ヒトFVIIaと、野生型ヒトFVIIaと比較して異なる特性を有する第VII因子関連ポリペプチド、たとえば野生型ヒトFVIIaと比較して高いタンパク分解活性を有するFVIIa変異体とを組み合わせることが有利であることを発見したことに関する。
既述のとおり、野生型ヒトFVIIaと、野生型ヒトFVIIaと比較して高いタンパク分解活性を有するFVIIa変異体は、異なる特性を有する。遊離の野生型ヒトFVIIaは、チモーゲン様コンフォメーションを有するが、野生型ヒトFVIIaと比較して高いタンパク分解活性を有するFVIIa変異体は、TF結合FVIIaに似た幾つかの特性を示す。
望ましい効力の止血剤組成物を得るために、野生型ヒトFVIIaとその変異体の混合物を考えることができる。たとえば、野生型ヒトFVIIaの5倍の特異的FVIIa活性を有する薬学的組成物が最適であると考えるが、この特異的活性を有するFVIIa変異体が入手できない場合、野生型ヒトFVIIa(活性=1)と相対活性9のその変異体とを等量混合することにより、これを達成することができる。このアプローチは、単に5倍多い用量のFVIIaを投与したり、相対活性10のFVIIa変異体を2分の1の用量で投与したりするより正確である。
更に、他のパラメーター、たとえば薬物動態、および/または膜結合FVIIa、溶液中の遊離FVIIaおよびTF結合FVIIaの分布が、用量の変化により影響を受けることがある。同じ量のトータルFVIIaポリペプチドタンパク質を薬学的組成物において使用することにより、膜結合FVIIa、溶液中の遊離FVIIaおよびTF結合FVIIaの分布を一定に維持することができる。
よって、本発明は、オーダーメードの効力および効率を備えたFVIIaベースの止血剤組成物を作成する能力を提供する。
本発明の一つの態様において、野生型ヒトFVIIaと第VII因子関連ポリペプチドとのモル比は、約1:99〜約99:1である。
本発明の更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドは、野生型ヒトFVIIaより高いタンパク分解活性を有する。
本発明の更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドは、以下のものから成る群より選択される:L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、
F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、
V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、
V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、
E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、および
S336G-FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII、L305V/E296V-FVII、
L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、
L305V/K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII、L305V/K337A/V158D-FVII、
L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII、L305V/V158T/M298Q-FVII、
L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、
L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、
L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、
L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/K316H-FVII、S314E/K316Q-FVII、
S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、
S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、
K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、
K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、
K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、
S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII、S314E/L305V/M298Q-FVII、
S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII、
S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII、
S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、
S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII、
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K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、
K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、
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K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/K337A-FVII、
K316Q/L305V/V158D-FVII、K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/M298Q-FVII、
K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、
K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、
K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、
K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII、
K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、
K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、
K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、
K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、
K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、
F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、
F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、
F374Y/L305V/E296V-FVII、F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、
F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、
F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、
F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、
F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、
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F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII、
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F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、
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F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、
F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、
F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-第VII因子、
S60A-第VII因子; R152E-第VII因子、S344A-第VII因子、
Glaドメインを欠く第VIIa因子; およびP11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、
K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、
K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; および233Thrから240Asnまでのアミノ酸配列に置換、付加または欠失を有するFVII、304Argから329Cysまでのアミノ酸配列に置換、付加または欠失を有するFVII。本発明の一つの態様において、第VII因子関連ポリペプチドは、ペプチドの活性化FVIIa型である。
本発明の更なる態様において、野生型ヒトFVIIaと第VII因子関連ポリペプチドとのモル比は、約10:90〜約90:10、たとえば約20:80〜約80:20、たとえば約30:70〜約70:30、たとえば約40:60〜約60:40である。
本発明の更なる態様において、野生型ヒトFVIIaと第VII因子関連ポリペプチドとのモル比は、約1:99〜約10:90、たとえば約10:90〜約20:80、たとえば約20:80〜約30:70、たとえば約30:70〜約40:60である。
本発明の更なる態様において、野生型ヒトFVIIaと第VII因子関連ポリペプチドとのモル比は、約99:1〜約90:10、たとえば約90:10〜約80:20、たとえば約80:20〜約70:30、たとえば約70:30〜約60:40である。
本発明の更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドのタンパク分解活性と野生型ヒト第VIIa因子のタンパク分解活性との比は、本明細書に記載されるアッセイ1で試験したときに、少なくとも約1.25である。
本発明の更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドのタンパク分解活性と野生型ヒト第VIIa因子のタンパク分解活性との比は、本明細書に記載されるアッセイ1で試験したときに、少なくとも約2.0、たとえば少なくとも約4.0である。
本発明の更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドのタンパク分解活性と野生型ヒト第VIIa因子のタンパク分解活性との比は、本明細書に記載されるアッセイ2で試験したときに、少なくとも約1.25である。
本発明の更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドのタンパク分解活性と野生型ヒト第VIIa因子のタンパク分解活性との比は、本明細書に記載されるアッセイ2で試験したときに、少なくとも約2.0、たとえば少なくとも約4.0である。
本明細書で使用される「野生型ヒトFVIIa」は、米国特許第4,784,950(図1)に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、本明細書において組換えヒトFVIIa(rhFVIIa)とも称される。
本明細書で使用される「第VII因子関連ポリペプチド」は、野生型ヒトFVIIaとは異なる第VII因子ポリペプチドをいう。これには、野生型第FVII因子に対して実質的に同等であるかまたは改良された生物学的活性を示す第VII因子変異体、並びに第VII因子誘導体および第VII因子コンジュゲートが含まれる。「第VII因子」の用語は、未切断(チモーゲン)の形態の第VII因子ポリペプチド、並びにタンパク分解処理を受け、それぞれの生物活性な形態を産生した第VII因子ポリペプチド(これは、第VIIa因子と称される)を含むことが意図される。典型的には、第VII因子は、152残基と153残基の間で切断されて第VIIa因子を産生する。かかる第VII因子変異体は、ヒト第VII因子に対して、安定性、リン脂質結合、変化した特異的活性など、異なる特性を示してもよい。
本明細書で使用される「第VII因子誘導体」の用語は、野生型第VII因子、野生型第VII因子に対して実質的に同等であるかまたは改良された生物学的活性を示す第VII因子変異体、および親ペプチドのアミノ酸の一以上が(たとえばアルキル化、PEG化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成などにより)化学的に改変された第VII因子関連ポリペプチドを指し示すことが意図される。これには、PEG化ヒト第VIIa因子、システイン−PEG化ヒト第VIIa因子およびその変異体が含まれるが、これに限定されない。
「PEG化ヒト第VIIa因子」の用語は、PEG分子をヒト第VIIa因子ポリペプチドにコンジュゲートさせたヒト第VIIa因子を意味する。PEG分子は、第VIIa因子ポリペプチドの任意の部分、たとえば第VIIa因子ポリペプチドの何れかのアミノ酸残基または炭水化物部分に結合し得ることが理解される。「システイン−PEG化ヒト第VIIa因子」の用語は、ヒト第VIIa因子に導入されたシステインのスルフヒドリル基にPEG分子をコンジュゲートさせた第VIIa因子を意味する。
血液凝固における第VIIa因子の生物学的活性は、(i)組織因子(TF)に結合する能力、および(ii)第IX因子または第X因子のタンパク分解性切断を触媒し、活性化第IX因子または第X因子(それぞれ第IXa因子または第Xa因子)を産生する能力に由来する。本発明の目的のために、第VIIa因子の生物学的活性は、たとえば米国特許第5,997,864号に記載されるとおり、第VII因子が欠損した血漿およびトロンボプラスチンを使用して、血液凝固を促進する調製物の能力を測定することによって定量することができる。このアッセイにおいて、生物学的活性は、コントロール試料に対する凝固時間の減少として表され、1ユニット/mLの第VII因子活性を含むプールされたヒト血清スタンダードと比較することにより「第VII因子ユニット」に変換される。あるいは、第VIIa因子の生物学的活性は、(i)脂質膜に包埋されたTFおよび第X因子を含む系において、第VIIa因子が第Xa因子を産生する能力を測定することにより(Persson et al.、J. Biol. Chem. 272: 19919-19924、1997);(ii)水性系において第X因子の加水分解を測定することにより;(iii)表面プラスモン共鳴に基づいた機器を使用して、第VIIa因子のTFに対する物理的結合を測定することにより(Persson、FEBS Letts. 413: 359-363、1997);および(iv)合成基質の加水分解を測定することにより、定量することができる。
野生型第VIIa因子に対して実質的に同等であるかまたは改良された生物学的活性を有する第VII因子変異体は、上述の凝固アッセイ、タンパク分解アッセイ、またはTF結合アッセイの一以上で試験したときに、同じ細胞タイプで産生された第VIIa因子の特異的活性の少なくとも約25%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは少なくとも約75%、最も好ましくは少なくとも約90%の特異的活性を示すものを包含する。
第VII因子変異体は、それが野生型第VII因子と実質的に同等の生物活性を示すか、または優れた生物活性を示すかにかかわらず、1つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換により野生型第VII因子の配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むが、これに限定されない。
本明細書で使用される「変異体(variant)」または「変異体(variants)」の用語は、親タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸が別のアミノ酸により置換された、および/または親タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸が欠失した、および/または1つまたは複数のアミノ酸がタンパク質に挿入された、および/または1つまたは複数のアミノ酸が親タンパク質に付加された、野生型ヒトFVIIの配列を有する第VII因子を指し示すことが意図される。かかる付加は、親タンパク質のN末端またはC末端の何れか、または両末端で起こる。この定義内の「変異体(variant)」または「変異体(variants)」は、その活性化形態においてFVII活性をなお保持する。一つの態様において、変異体は、野生型ヒトFVIIの配列と70%同一である。一つの態様において、変異体は、野生型ヒトFVIIの配列と80%同一である。別の態様において、変異体は、野生型ヒトFVIIの配列と90%同一である。更なる態様において、変異体は、野生型ヒトFVIIの配列と95%同一である。
野性型第VII因子と実質的に同等の生物学的活性を有する第VII因子変異体の非限定的な例には、以下のものが含まれる:S52A-FVIIa、S60A-FVIIa (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); 米国特許第5,580,560号に開示されるタンパク分解安定性の増大を示すFVIIa変異体; 290残基と291残基の間または315残基と316残基の間でタンパク分解により切断された第VIIa因子 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48: 501-505, 1995); 第VIIa因子の酸化型 (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363: 43-54、1999); PCT/DK02/00189に開示されるFVII変異体; およびWO 02/38162 (Scripps Research Institute) に開示されるタンパク分解安定性の増大を示すFVII変異体; WO 99/20767 (University of Minnesota) に開示される、改変Gla-ドメインを有し膜結合の増大を示すFVII変異体; およびWO 01/58935 (Maxygen ApS) およびWO 04/029091 (Maxygen ApS) に開示されるFVII変異体。
野生型FVIIaと比較して生物学的活性が増大したFVII変異体の非限定的な例には、以下のものが含まれる:WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、PCT/DK02/00635、デンマーク特許出願PA 2002 01423、デンマーク特許出願PA 2001 01627; WO 02/38162 (Scripps Research Institute) に開示されるFVII変異体; およびJP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.) に開示される活性の増大したFVIIa変異体。
第VII因子または第VII因子関連ポリペプチドの変異体の例には、以下のものが含まれるがこれに限定されない:L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、
L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、
M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、
V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、
E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、および
S336G-FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII、L305V/E296V-FVII、
L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、
L305V/K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII、L305V/K337A/V158D-FVII、
L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII、L305V/V158T/M298Q-FVII、
L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、
L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、
L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、
L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/K316H-FVII、S314E/K316Q-FVII、
S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、
S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、
K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、
K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、
K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、
S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII、S314E/L305V/M298Q-FVII、
S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII、
S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII、
S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、
S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII、
S314E/L305V/V158T/E296V-FVII、S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII、
S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、
S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、
S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、
S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/K337A-FVII、
K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、
K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、
K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、
K316H/L305V/K337A/V158D-FVII、K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII、
K316H/L305V/V158D/E296V-FVII、K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII、
K316H/L305V/V158T/E296V-FVII、K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII、
K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、
K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、
K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、
K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/K337A-FVII、
K316Q/L305V/V158D-FVII、K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/M298Q-FVII、
K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、
K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、
K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、
K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII、
K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、
K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、
K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、
K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、
K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、
F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、
F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、
F374Y/L305V/E296V-FVII、F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、
F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、
F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、
F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、
F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、
F374Y/E296V/S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII、F374Y/E296V/M298Q-FVII、
F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII、
F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII、
F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII、
F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII、
F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、
F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII、
F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII、
F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII、
F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII、
F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、
F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、
F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII、
F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII、
F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII、
F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、
F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、
F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII、
F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、
F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、
F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、
F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、
F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、
F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、
F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、
F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、
F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、
F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、
F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、
F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、
F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、
F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、
F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-第VII因子、
S60A-第VII因子; R152E-第VII因子、S344A-第VII因子、
Glaドメインを欠く第VIIa因子; およびP11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、
K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、
K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; および233Thrから240Asnまでのアミノ酸配列に置換、付加または欠失を有するFVII、304Argから329Cysまでのアミノ酸配列に置換、付加または欠失を有するFVII。
使用されるアミノ酸置換に関する専門用語は、以下のとおりである。最初の文字は、ヒト野生型FVIIの位置に天然に存在するアミノ酸を表す。次の数字は、ヒト野生型FVIIにおけるその位置を表す。二番目の文字は、天然のアミノ酸と置き換わる(置換する)異なるアミノ酸を表す。一つの例はM298Qであり、ここではヒト野生型FVIIの298の位置にあるメチオニンがグルタミンに置換されている。別の例、V158T/M298Qでは、同じ第VII因子ポリペプチドにおいて、ヒト野生型FVIIの158の位置にあるバリンがトレオニンに置換され、ヒト野生型FVIIの298の位置のメチオニンがグルタミンに置換されている。
本発明の更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドは、第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型ヒト第VIIa因子の活性との比が少なくとも約1.25であるポリペプチドである。一つの態様において、第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型ヒト第VIIa因子の活性との比は、少なくとも約2.0である。更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型ヒト第VIIa因子の活性との比は、少なくとも約4.0である。
本発明の更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドは、第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型ヒト第VIIa因子の活性との比が、第VIIa因子活性アッセイで試験したときに少なくとも約1.25であるポリペプチドである。一つの態様において、第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型ヒト第VIIa因子の活性との比は、第VIIa因子活性アッセイで試験したときに少なくとも約2.0である。更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型ヒト第VIIa因子の活性との比は、第VIIa因子活性アッセイで試験したときに少なくとも約4.0である。第VIIa因子の活性は、例1に記載されるアッセイにより測定することができる。
本発明の更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドは、第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型ヒト第VIIa因子の活性との比が、「インビトロ加水分解アッセイ(In Vitro Hydrolysis Assay)」で試験したときに少なくとも約1.25であるポリペプチドである。一つの態様において、第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型ヒト第VIIa因子の活性との比は、「インビトロ加水分解アッセイ」で試験したときに少なくとも約2.0である。更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型ヒト第VIIa因子の活性との比は、「インビトロ加水分解アッセイ」で試験したときに少なくとも約4.0である。
本発明の更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドは、第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型ヒト第VIIa因子の活性との比が、「インビトロタンパク分解アッセイ(In Vitro Proteolysis Assay)」で試験したときに少なくとも約1,25であるポリペプチドである。一つの態様において、第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型ヒト第VIIa因子の活性との比は、「インビトロタンパク分解アッセイ」で試験したときに少なくとも約2.0である。更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型ヒト第VIIa因子の活性との比は、「インビトロタンパク分解アッセイ」で試験したときに少なくとも約4.0である。更なる態様において、第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型ヒト第VIIa因子の活性との比は、「インビトロタンパク分解アッセイ」で試験したときに少なくとも約8.0である。
本発明は、野生型ヒト第VIIa因子と比較して増大した活性を有する第VII/VIIa因子変異体に適している。増大した活性を有する第VII/VIIa因子変異体は、以下に記載の適切なアッセイで試験することにより見出すことができる。これらアッセイは、インビトロ試験において簡単な予備試験として実行することができる。よって、例1は、本発明の第VIIa因子変異体の活性のための(インビトロ加水分解アッセイと称される)簡単な試験を開示する。これに基づいて、特に関心のある第VII因子変異体は、変異体の活性と野生型ヒト第VII因子の活性との比が、「インビトロ加水分解アッセイ」で試験したときに1.0を超える、たとえば少なくとも約1.25、好ましくは少なくとも約2.0、たとえば少なくとも約3.0、または更に好ましくは、少なくとも約4.0である変異体である。
また、変異体の活性は、生理学的な基質、例えば第X因子(「インビトロ加水分解アッセイ」)(例1参照)を、適切には100〜1000 nMの濃度で使用して測定することができ、この場合、第Xa因子の生成を、適切な色素生産性基質(例えば、S-2765)を添加した後に測定する。加えて、活性アッセイは、生理学的な温度で実行することができる。
また、第VIIa因子変異体がトロンビンを生成する能力は、生理学的濃度の全ての関連の凝固因子および阻害剤(血友病Aの症状を模倣するときには第VIII因子を除く)および活性化された血小板を含むアッセイで測定することができる(参照により本明細書に組み込まれる、Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547の543ページに記載される)。
当該技術分野で公知の「同一性」の用語は、配列を比較することにより決定される、二以上のポリペプチド分子または二以上の核酸分子の配列の間の関係をいう。また、当該技術分野において「同一性」は、場合によっては、一続きの二以上のヌクレオチド残基または二以上のアミノ酸残基の間での適合数により決定される、核酸分子の間またはポリペプチドの間の配列の関連性(relatedness)の程度を意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム(すなわち「アルゴリズム」)により処理された(存在する場合には)ギャップアラインメントを備えた二以上の配列の短い方の間で、同一の適合パーセントを測る。
「類似性」の用語は、「同一性」と関連のある概念であるが、それとは対照的に、同一の適合と保存的置換の適合の両方を含む配列の関係をいう。二つのポリヌクレオチド配列が、たとえば(分数(10/20))の同一のアミノ酸を有し、残りがすべて非保存的置換である場合、パーセント同一性および類似性は、いずれも50%である。同じ例において、保存的置換が5個の位置で存在する場合、パーセント同一性は50%のままであるが、パーセント類似性は75%である(分数(15/20))。したがって、保存的置換が存在する場合、二つのポリペプチドの間の類似性の程度は、二つのポリペプチドの間のパーセント同一性より高くなる。
「単離されたポリペプチド」の用語は、(1)少なくとも約50%のポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または天然に関連した他の材料(すなわち夾雑物)から分離された本発明のポリヌクレオチド、(2)「単離されたポリペプチド」が天然に結合するポリペプチドのすべてまたは一部に共有結合しない本発明のポリヌクレオチド、(3)天然に共有結合しないポリペプチドに機能的に共有結合した本発明のポリヌクレオチド、または(4)天然に存在しない本発明のポリヌクレオチドをいう。好ましくは、単離されたポリペプチドは、その治療、診断、予防または研究の用途を妨害する、天然環境に見出される任意の他の混入ポリペプチドまたは他の夾雑物から実質的にフリーである。
野生型ヒトFVIIのアミノ酸配列に対する保存的改変(およびコーディングヌクレオチドに対する対応の改変)は、天然に存在するFVIIポリペプチドに類似した機能的および化学的特性を有するFVIIポリペプチドを産生する。対照的に、(a)置換の領域における分子骨格の構造、たとえばシートまたはヘリックスのコンフォメーション、(b)ターゲット部位における分子の電荷または疎水性、または(c)側鎖の大きさ、を維持することに対する効果が有意に異なる野生型ヒトFVIIのアミノ酸配列の置換を選択することにより、FVIIポリペプチドの機能的および/または化学的特性の実質的な改変を達成することができる。
たとえば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に対する影響がほとんどまたは全くないように、天然のアミノ酸残基を非天然の残基に置換することを含む。更に、ポリペプチドにおける任意の天然の残基は、「アラニンスキャニング突然変異誘発(alanine scanning mutagenesis)」について以前に記載されるとおり、アラニンで置換してもよい(たとえば、アラニンスキャニング突然変異誘発について説明する、MacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35: 1-24を参照)。
(保存的であろうと非保存的であろうと)望ましいアミノ酸置換は、かかる置換を望むときに当業者により決定することができる。たとえば、アミノ酸置換は、第VII因子ポリペプチドの重要な残基を同定するため、または本明細書に記載の第VII因子ポリペプチドの親和性を増大または減少させるために使用することができる。
天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいてクラスに分けることができる:
1) 疎水性: ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、lie;
2) 中性親水性: Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
3) 酸性: Asp、Glu;
4) 塩基性: His、Lys、Arg;
5) 鎖の配向に影響を及ぼす残基: Gly、Pro; および
6) 芳香族: Trp、Tyr、Phe。
たとえば、非保存的置換は、これらクラスの一つのメンバーを別のクラスのメンバーに交換することを含む。このように置換される残基は、非ヒト第VII因子ポリペプチドと相同なヒト第VII因子ポリペプチドの領域、または当該分子の非相同な領域に導入することができる。
かかる変更をする際、アミノ酸の疎水親水指数を考慮することができる。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水親水指数が割り当てられており、以下のとおりである:イソロイシン(+4.5); バリン(+4.2); ロイシン(+3.8); フェニルアラニン(+2.8); システイン/シスチン(+2.5); メチオニン(+1.9); アラニン(+1.8); グリシン(-0.4); トレオニン(-0.7); セリン(-0.8); トリプトファン(-0.9); チロシン(-1.3); プロリン(-1.6); ヒスチジン(-3.2); グルタミン酸塩(-3.5); グルタミン(-3.5); アスパラギン酸塩(-3.5); アスパラギン(-3.5); リジン(-3.9); およびアルギニン(-4.5)。
タンパク質に双方向の(interactive)生物学的機能を付与する際の疎水親水アミノ酸指数の重要性は、当該技術分野において理解されている。Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982)。ある種のアミノ酸は、同様の疎水親水指数またはスコアを有する他のアミノ酸と置換して、同様の生物学的活性をなお保持し得ることが知られている。疎水親水指数に基づいて変更をする際、疎水親水指数が±2以内のアミノ酸の置換が好ましく、±1以内の置換がとりわけ好ましく、±0.5以内の置換が更にとりわけ好ましい。
また、類似のアミノ酸置換により作成される生物学的に機能等価なタンパク質またはペプチドが、本ケースのように免疫学的態様で使用することが意図されている場合は特に、親水性に基づいて、類似のアミノ酸置換を効果的に実施可能であることが当該技術分野において理解されている。近隣のアミノ酸の親水性より支配されるタンパク質の最大局所平均親水性は、免疫原性および抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と関連がある。
以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン(+3.0); リジン('3.0); アスパラギン酸塩(+3.0±1); グルタミン酸塩(+3.0±1); セリン(+0.3); アスパラギン(+0.2); グルタミン(+0.2); グリシン(0); トレオニン(-0.4); プロリン(-0.5±1); アラニン(-0.5); ヒスチジン(-0.5); システイン(-1.0); メチオニン(-1.3); バリン(-1.5); ロイシン(-1.8); イソロイシン(-1.8); チロシン(-2.3); フェニルアラニン(-2.5); トリプトファン(-3.4)。よく似た親水性値に基づいて変更をする際、親水性値が±2以内のアミノ酸の置換が好ましく、±1以内の置換がとりわけ好ましく、±0.5以内の置換が更にとりわけ好ましい。また、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これら領域は、「エピトープコア領域」とも称される。
当業者は、周知の技術を用いて野生型ヒトFVIIで記述されるとおりポリペプチドの適切な変異体を決定することができる。活性を壊すことなく変更することができる分子の適切な領域を同定するにあたり、当業者は、活性にとって重要と考えられない領域をターゲットにしてもよい。たとえば、同一の種または他の種に由来する同様の活性を有する類似のポリペプチドが知られている場合、当業者は、第VII因子ポリペプチドのアミノ酸配列をかかる類似のポリペプチドと比較してもよい。かかる比較により、当業者は、類似のポリペプチドの間で保存された分子の残基および部分を同定することができる。かかる類似のポリペプチドに対して保存されていない第VII因子ポリペプチドの領域の変更は、第VII因子ポリペプチドの生物学的活性および/または構造にあまり悪影響を及ぼさないことが認識されている。また、当業者は、比較的保存された領域であっても、活性を保持しながら天然存在の残基を化学的に類似のアミノ酸に置換できること(保存的アミノ酸残基置換)も認識している。従って、生物学的活性または構造にとって重要であり得る領域であっても、生物学的活性を破壊することなく、またポリペプチドの構造に悪影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換の対象とすることができる。
加えて、当業者は、活性または構造にとって重要である類似のポリペプチドの残基を同定する構造−機能研究を検討することができる。かかる比較を考慮して、当業者は、類似のポリペプチドの活性または構造にとって重要であるアミノ酸残基に対応する第VII因子ポリペプチドのアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このように予測された第VII因子ポリペプチドの重要なアミノ酸残基を、化学的に類似のアミノ酸で置換することを選択してもよい。
また、当業者は、類似のポリペプチドの構造に関して、三次元構造およびアミノ酸配列を分析することができる。その情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に関して第VII因子ポリペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを予測してもよい。当業者は、タンパク質の表面にあることが予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るため、かかるアミノ酸残基を劇的に変更しないように選択してもよい。更に、当業者は、望ましい各アミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含有するテスト変異体を作成してもよい。このとき、本明細書に記載されるように活性アッセイを用いて変異体をスクリーニングすることができる。かかる変異体は、適切な変異体に関する情報を収集するために使用することができる。たとえば、特定のアミノ酸残基に対する変更が、活性の破壊、望ましくない活性の低下、または不適切な活性につながることを当業者が見出した場合、かかる変更を備えた変異体は避けられる。言い換えれば、かかるルーチンの実験から収集された情報に基づいて、当業者は、更なる置換を単独で避けるべきアミノ酸、または他の突然変異との組合せで避けるべきアミノ酸を容易に決定することができる。
多くの科学文献が、二次構造の予測に向けられている。Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47: 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276およびChou et al., Biophys. J., 26: 367-384 (1979) を参照されたい。更に、コンピュータープログラムは、二次構造の予測を支援するのに現在有用である。二次構造を予測する一つの方法は、ホモロジーモデリングに基づくものである。たとえば、30%より高い配列同一性または40%より高い類似性を有する二つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば類似の構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース(PDB)の近年の進展により、ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の折りたたみの予想数を含めて、二次構造の予測精度が高まった。Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1): 244-247 (1999) を参照されたい。所定のポリペプチドまたはタンパク質において折りたたみの数は限られていること、並びに重大な構造の数が一旦解明されると、構造の予測が非常に正確に得られることが示唆されている(Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997))。
二次構造を予測する追加の方法は、以下のものを含む:「スレッディング(threading)」 (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-9 (1996))、「プロファイル分析(profile analysis)」 (Bowie et al., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzymol., 183: 146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13): 4355-4358 (1987))、および「進化的つながり(evolutionary linkage)」 (Home, 同上, およびBrenner, 同上を参照)。
関連のポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法により容易に計算することができる。かかる方法には、以下に記載される方法が含まれるが、これに限定されない:Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)。
同一性および/または類似性を決定する好ましい方法は、試験される配列の間に最大の適合を与えるようにデザインされる。同一性および/または類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムに記載される。二つの配列の間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータープログラム法には、以下のものが含まれるが、これに限定されない:GAPを含むGCGプログラムパッケージ (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12: 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990))。BLASTXプログラムは、the National Center for Biotechnology Information (NCBI) および他の入手源から公的に入手可能である(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., 同上)。また、周知のSmith Watermanアルゴリズムを、同一性を決定するために使用してもよい。
二つのアミノ酸配列を配置するためのある種のアラインメントスキームは、二つの配列のごく短い領域を適合させることがあり、このように配置された小さな領域は、二つの全長配列の間に有意な関係がなかったとしても、非常に高い配列同一性を示すことがある。よって、好ましい態様において、選択されるアラインメント法(GAPプログラム)は、ターゲットポリペプチドの少なくとも50の連続アミノ酸にわたるアラインメントという結果になる。
たとえば、コンピューターアルゴリズムGAP(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)を用いて、パーセント配列同一性を決定すべき二つのポリペプチドを、それぞれのアミノ酸を最適に適合させるように配置する(アルゴリズムにより決定される「適合スパン(matched span)」)。ギャップオープニングペナルチィ(これは3倍の平均ダイヤゴナルとして計算される;「平均ダイヤゴナル」は、使用される比較マトリクスのダイヤゴナルの平均である;「ダイヤゴナル」は、特定の比較マトリクスによりそれぞれの完全アミノ酸適合に割り当てられたスコアまたは数である)、およびギャップ伸長ペナルティー(これは、ギャップオープニングペナルティーの通常(分数(1/10))倍である)、並びに比較マトリクス、たとえばPAM250またはBLOSUM62は、アルゴリズムと共に使用される。また、標準の比較マトリクス(PAM 250比較マトリクスに関するDayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978); BLOSUM 62比較マトリクスに関するHenikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 10915-10919 (1992) を参照)も、アルゴリズムにより使用される。
ポリペプチドの配列比較のための好ましいパラメーターは、以下のものを含む:
アルゴリズム: Needleman et al., J. Mol. Biol, 48: 443-453 (1970); 比較マトリクス: BLOSUM 62 from Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919 (1992); ギャップペナルティー: 12, ギャップ長ペナルティー: 4, 類似性の閾値: 0。
GAPプログラムは、上記パラメーターを用いて有用である。上述のパラメーターは、GAPアルゴリズムを用いた(末端ギャップのペナルティーなしで)ポリペプチドの比較のためのデフォルトパラメーターである。
核酸分子の配列比較のための好ましいパラメーターは、以下のものを含む:
アルゴリズム: Needleman et al., J. Mol Biol., 48: 443-453 (1970); 比較マトリクス: 適合(matches) = +10, ミスマッチ = 0, ギャップペナルティー: 50, ギャップ長ペナルティー: 3。
GAPプログラムは、上記パラメーターを用いても有用である。上述のパラメーターは、核酸分子の比較のためのデフォルトパラメーターである。
他の模範的アルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップ伸長ペナルティー、比較適合、類似性の閾値などを、Program Manual, Wisconsin Package, Version 9, September, 1997に記載されるものを含めて、使用してもよい。なすべき特定の選択は、当業者に明らかであり、なすべき具体的な比較、たとえばDNAとDNA、タンパク質とタンパク質、タンパク質とDNAの比較に依存し、更に、その比較が所定の配列ペアの間であるか(この場合GAPまたはBestFitが一般に好ましい)、あるいはある配列と大きなデータベースの配列との間であるか(この場合FASTAまたはBLASTAが好ましい)に依存する。
野生型第VII因子に対して実質的に改変された生物学的活性を有する第VII因子変異体には、TF-非依存性第X因子タンパク分解活性を示す第VII因子変異体が含まれるが、これに限定されない。
上述のとおり、本発明は、被検体における出血の発症の治療のため、または正常な止血システムの増大のための方法であって、その必要がある被検体に対して、野生型ヒトFVIIaを含む第一の組成物および第VII因子関連ポリペプチドを含む第二の組成物を、治療的または予防的に効果的な量で投与することを含む方法に関する。
被検体は、同じ出血または一連の出血について治療されることを理解すべきである。一つの態様において、野生型ヒトFVIIaを含む組成物を最初に投与する。別の態様において、第VII因子関連ポリペプチドを含む組成物を最初に投与する。
野生型ヒトFVIIaを含む第一の組成物および第VII因子関連ポリペプチドを含む第二の組成物は、同時またはほぼ同時に投与されてもよい。あるいは、野生型ヒトFVIIaを含む第一の組成物および第VII因子関連ポリペプチドを含む第二の組成物は、第一および第二の組成物が一定の時間間隔を空けて被検体に投与されるように投与されてもよい。野生型ヒトFVIIaを含む第一の組成物および第VII因子関連ポリペプチドを含む第二の組成物の投与の時間間隔は、約1分〜約24時間、たとえば約5分〜約20時間、たとえば約10分〜約10時間、たとえば約10分〜約5時間、たとえば約10分〜約2時間とすることができる。一つの態様において、野生型ヒトFVIIaを含む第一の組成物および第VII因子関連ポリペプチドを含む第二の組成物の投与の時間間隔は、約1分〜約10分である。
「正常な止血システムの増大」の用語は、トロンビンを生成する能力の増大を意味する。
本明細書で使用される「出血性障害」の用語は、出血で顕在化する、細胞または分子由来の、先天性、後天性または誘導性の任意の欠陥を意味する。たとえば、凝固因子欠損症(たとえば血友病AおよびB、または第XI凝固因子または第VII凝固因子の欠損症)、凝固因子阻害剤、血小板機能不全、血小板減少症またはフォン・ヴィレブランド病などである。
「出血の発症」の用語は、外科手術および他の形態の組織損傷と関連した大きな問題である、制御されていない出血および過度の出血を含むことを意図する。制御されていない出血および過度の出血は、正常な凝固システムを有する被検体および凝固性または出血性障害を有する被検体で起こり得る。凝固因子欠損症(血友病AおよびB、第XI凝固因子または第VII凝固因子の欠損症)または凝固因子阻害剤は、出血性障害の原因となり得る。また、過度の出血は、正常に機能する血液凝固カスケードを備えた(凝固因子の欠損もなく、いずれの凝固因子に対する阻害剤もない)被検体で起こり、血小板機能不全、血小板減少症またはフォン・ヴィレブランド病により引き起こされ得る。かかるケースにおいて出血は、止血システムが血友病のように欠損しているか、または大出血を引き起こすような異常な必須凝固「化合物」(たとえば血小板またはフォン・ヴィレブランド因子タンパク)を有しているため、血友病に起因する出血に例えることができる。外科手術または大きな外傷と関連して広範囲の組織損傷を被っている被検体では、正常な止血メカニズムが、即座の止血要求により圧倒され、正常な止血メカニズムにもかかわらず出血を発症するかもしれない。また、満足な止血を達成することは、出血が脳、内耳領域および眼などの外科的止血の可能性が限られた器官で起こったときの課題である。同じ課題は、種々の器官(肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管)からバイオプシーを採取するプロセスにおいて、並びに腹腔鏡下手術において起こり得る。これらすべての状況において、外科的技術(縫合、クリップなど)により止血を提供する難しさは共通であり、出血が広範囲である場合(出血性胃炎および大量の子宮の出血)もその難しさは共通である。また、急性および大量の出血は、抗凝固療法により不完全な止血が誘導された抗凝固療法中の被検体で起こり得る。かかる被検体は、抗凝固効果を急速に打ち消さなければならない場合、外科的介入を必要とすることがある。根治的な恥骨後の前立腺切除術は、局在性前立腺癌の被検体に対して一般に行われる手法である。その手術は、顕著で時には大量の失血をしばしば伴う。前立腺切除術の間の相当の失血は、外科的止血が容易に利用できないような密集して血管新生化した種々の部位を伴う複雑な解剖学的状況と主に関連しており、これは、大きな領域からの広範囲の出血という結果につながるかもしれない。不満足な止血の症例において問題を引き起こし得る別の状況は、正常な止血メカニズムを備えた被検体に血栓塞栓症を予防するために抗凝固療法を施した場合である。かかる療法には、ヘパリン、他の形態のプロテオグリカン、ワルファリンまたは他の形態のビタミンK−アンタゴニスト、並びにアスピリンおよび他の血小板凝集阻害剤を含んでもよい。
本発明の一つの態様において、出血は、血友病と関連する。別の態様において、出血は、獲得性の阻害剤を備えた血友病と関連する。別の態様において、出血は、血小板減少症と関連する。別の態様において、出血は、フォン・ヴィレブランド病と関連する。別の態様において、出血は、重篤な組織損傷と関する。別の態様において、出血は、重篤な外傷と関連する。別の態様において、出血は、外科手術と関連する。別の態様において、出血は、腹腔鏡下手術と関連する。別の態様において、出血は、出血性胃炎と関連する。別の態様において、出血は、大量の子宮の出血である。別の態様において、出血は、機械的止血の可能性が限られた器官で起こる。別の態様において、出血は、脳、内耳領域または眼で起こる。別の態様において、出血は、バイオプシーを採取するプロセスと関連する。別の態様において、出血は、抗凝固療法と関連する。
本明細書で使用される「被検体」の用語は、任意の動物、とりわけ哺乳類、たとえばヒトを意味するものであり、適切な箇所においては、「患者」という用語と置き換え可能に使用してもよい。
本明細書に記載される第VII因子ポリペプチドは、組換え核酸技術により作成することができる。一般に、クローニングされた野生型第VII因子の核酸配列を、所望のタンパク質をコードするように改変する。この改変された配列を、その後、発現ベクターに挿入し、それを次いで、宿主細胞に形質転換するかまたはトランスフェクトする。高等な真核細胞、とりわけ哺乳類培養細胞が宿主細胞として好ましい。ヒト第VII因子の完全なヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は公知である(組換えヒト第VII因子のクローニングおよび発現について記載するU.S. 4,784,950を参照)。ウシ第VII因子の配列は、Takeya et al., J. Biol. Chem. 263: 14868-14872 (1988) に記載される。
アミノ酸配列の変更は、種々の技術により達成することができる。核酸配列の改変は、部位特異的突然変異誘発により行うことができる。部位特異的突然変異誘発の技術は、当該技術分野において周知であり、たとえば、Zoller and Smith (DNA 3: 479-488, 1984) または“Splicing by extension overlap”, Horton et al., Gene 77, 1989, pp. 61-68に記載される。このように、第VII因子のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を用いて、選択した変更を導入することができる。同様に、特定のプライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応を利用してDNA構築物を調製する手法は、当業者に周知である(PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USAを参照)。
本発明の第VII因子ポリペプチドをコードする核酸構築物は、適切にはゲノムまたはcDNA由来であり、たとえば、ゲノムまたはcDNAライブラリーを調製し、標準的技術に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイズさせることによりポリペプチドの全てまたは一部をコードするDNA配列をスクリーニングすることにより、調製することができる(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照)。
また、第VII因子ポリペプチドをコードする核酸構築物は、確立された標準的方法、たとえば、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869に記載されるホスホアミダイト法、またはMatthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805に記載される方法により、合成で調製することができる。ホスホアミダイト法により、たとえば自動DNA合成機でオリゴヌクレオチドを合成し、精製し、アニーリングし、ライゲートし、適切なベクターにクローニングする。
更に、核酸構築物は、合成由来とゲノム由来の混合物、合成由来とcDNA由来の混合物、またはゲノム由来とcDNA由来の混合物であってもよく、これらは、完全な核酸構築物の種々の部分に対応する、(必要に応じて)合成由来、ゲノム由来またはcDNA由来のフラグメントを、標準的技術に従ってライゲートすることにより調製される。
核酸構築物は、好ましくはDNA構築物である。本発明の第VII因子ポリペプチドを作成する際に使用されるDNA配列は、典型的には、第VII因子のアミノ末端においてプレ−プロポリペプチドをコードし、適切な翻訳後プロセシング(たとえば、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化)と宿主細胞からの分泌を達成する。プレ−プロポリペプチドは、第VII因子または別のビタミンK−依存性血漿タンパク質、たとえば第IX因子、第X因子、プロトロンビン、プロテインCまたはプロテインSであり得る。当業者に理解されるとおり、凝固薬として機能するタンパク質の能力が改変により有意に損なわれないような追加の改変を、第VII因子ポリペプチドのアミノ酸配列に行うことができる。たとえば、第VII因子ポリペプチドは、一般にU.S. 5,288,629に記載されるように、二本鎖の活性化型へのチモーゲン第VII因子の変換を阻害するように、活性化切断部位で改変することもできる。
第VIIa因子変異体を発現する際に使用される発現ベクターは、クローニングされた遺伝子またはcDNAの転写を指示することができるプロモーターを含む。哺乳類培養細胞で使用される好ましいプロモーターには、ウイルス性プロモーターおよび細胞性プロモーターが含まれる。ウイルス性プロモーターには、SV40プロモーター (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854-864, 1981) およびCMVプロモーター (Boshart et al., Cell 41: 521-530, 1985) が含まれる。特に好ましいウイルス性プロモーターは、アデノウイルス2由来の主要な後期プロモーターである (Kaufman and Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304-1319, 1982)。細胞性プロモーターには、マウスのカッパ遺伝子プロモーター (Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7041-7045, 1983) およびマウスのVHプロモーター (Loh et al., Cell 33: 85-93, 1983) が含まれる。特に好ましい細胞性プロモーターは、マウスのメタロチオネイン-Iプロモーターである (Palmiter et al., Science 222: 809-814, 1983)。発現ベクターは、プロモーターより下流に位置し、かつ第VII因子配列自体の開始部位より上流に位置する一セットのRNAスプライス部位を含有していてもよい。好ましいRNAスプライス部位は、アデノウイルスおよび/または免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。また、発現ベクターには、ポリアデニル化シグナルが開始部位の下流に位置して含有される。特に好ましいポリアデニル化シグナルには、SV40由来の初期または後期ポリアデニル化シグナル(Kaufman and Sharp, 同上)、アデノウイルス5 Elb領域由来のポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター(DeNoto et al. Nucl. Acids Res. 9: 3719-3730, 1981)、またはヒト第VII因子遺伝子またはウシ第VII因子遺伝子由来のポリアデニル化シグナルが含まれる。発現ベクターは、非コードウイルス性リーダー配列、たとえばプロモーターとRNAスプライス部位との間に位置するアデノウイルス2の3部構成のリーダー;およびエンハンサー配列、たとえばSV40エンハンサーを含んでいてもよい。
クローニングされたDNA配列は、たとえばリン酸カルシウム媒介トランスフェクション(Wigler et al., Cell 14: 725-732, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603-616, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52d: 456-467, 1973)またはエレクトロポレーション(Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982)により、哺乳類培養細胞に導入される。外来性DNAを発現する細胞を同定し選択するために、一般には、選択可能な表現型を付与する遺伝子(選択マーカー)を、対象の遺伝子またはcDNAとともに細胞に導入する。好ましい選択マーカーには、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬剤に対して抵抗性を付与する遺伝子が含まれる。選択マーカーは、増幅可能な(amplifiable)選択マーカーとすることができる。好ましい増幅可能な選択マーカーは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)の配列である。選択マーカーは、Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA、参照により本明細書に組み込まれる) に概説される。当業者であれば、適切な選択マーカーを容易に選択することができる。
選択マーカーは、対象の遺伝子と同時に、別々のプラスミド上で細胞に導入されてもよいし、同一のプラスミド上で導入されてもよい。同一のプラスミド上の場合、選択マーカーと対象の遺伝子は、異なるプロモーターの制御下であっても、同一のプロモーターの制御下であってもよく、後者の配置はジシストロンメッセージを産生する。このタイプの構築物は、当該技術分野で公知である(たとえば、Levinson and Simonsen, U.S. 4,713,339)。また、細胞に導入される混合物に、「キャリアDNA」として公知の追加のDNAを添加することも好都合である。細胞がDNAを取り込んだ後、それを適切な増殖培地で典型的には1〜2日間増殖させて、対象の遺伝子の発現を開始させる。細胞を培養するために用いられる培地は、宿主細胞の増殖に適した任意の慣用的な培地、たとえば適切なサプリメントを含有する最少または完全培地とすることができる。適切な培地は、商業的な供給業者から入手可能であるが、公表された配合に従って調製してもよい(たとえばAmerican Type Culture Collectionのカタログ)。培地は、当該技術分野で公知の手法を用いて調製される(たとえば、細菌および酵母に関する参照文献; Bennett, J.W. and LaSure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991を参照)。増殖培地は、一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、必須の糖、ビタミン、塩、リン脂質、タンパク質および増殖因子を含む。ガンマ−カルボキシル化第VII因子ポリペプチドの産生のためには、培地は、好ましくは約0.1 mg/mL〜約5 mg/mLの濃度でビタミンKを含有する。ここで、薬剤選択を適用して、選択マーカーを安定して発現する細胞の増殖について選択する。増幅可能な(amplifiable)選択マーカーでトランスフェクトした細胞に関しては、薬剤濃度を増大させて、コピー数の増大により発現レベルの増大したクローン化配列を選択してもよい。ここで、安定してトランスフェクトされた細胞のクローンが、所望の第VII因子ポリペプチドの発現ためにスクリーニングされる。
好ましい哺乳類細胞株には、CHO (ATCC CCL 61)、COS-1 (ATCC CRL 1650)、ベビーハムスター腎 (BHK) および293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977) 細胞株が含まれる。好ましいBHK細胞株は、tk- ts13 BHK細胞株 (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982) であり、これ以降BHK 570細胞と称する。BHK 570細胞株は、American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852から、ATCCアクセッションナンバーCRL 10314で入手可能である。また、tk- ts13 BHK細胞株は、ATCCからアクセッションナンバーCRL 1632で入手可能である。加えて、ラットHep I (ラットヘパトーム; ATCC CRL 1600)、ラットHep II (ラットヘパトーム; ATCC CRL 1548)、TCMK (ATCC CCL 139)、ヒト肺 (ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) およびDUKX細胞 (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1980) など、多くの他の細胞株を使用してもよい。
トランスジェニック動物技術は、本発明の第VII因子ポリペプチドを産生するために採用することができる。宿主メス哺乳類の乳腺内でタンパク質を産生することが好ましい。対象のタンパク質の乳腺での発現およびその後のミルクへの分泌は、他の供給源からタンパク質を単離する際に遭遇する多くの問題を解消する。ミルクは容易に回収され、大量に入手可能であり、生化学的に充分に特徴づけられている。更に、主要な乳タンパク質は、高濃度(典型的には約1〜15 g/L)でミルク中に存在する。
商業的な観点からは、ミルク収量が高い種を宿主として使用することが明らかに好ましい。マウスおよびラットなどの小動物を使用することができる(原理段階の証明では好ましい)が、ブタ、ヤギ、ヒツジおよびウシを含むがこれらに限定されない家畜哺乳類を使用することが好ましい。ヒツジは、この種での遺伝子導入の前歴、ミルク収量、コスト、およびヒツジのミルクを回収するための装置の入手しやすさなどのファクターにより、とりわけ好ましい(宿主種の選択に影響を及ぼすファクターの比較に関しては、たとえばWO 88/00239を参照)。酪農用に飼育されている宿主動物の品種、たとえばEast Frieslandヒツジを選択すること、またはトランスジェニック系統のブリーディングにより搾乳用家畜を後日導入することが一般に望ましい。いずれにしても、公知の健康な状態の動物を使用すべきである。
乳腺で発現させるために、乳タンパク質遺伝子由来の転写プロモーターを使用する。乳タンパク質遺伝子には、カゼイン(U.S. 5,304,489参照)、ベータラクトグロブリン、ラクトアルブミン、および乳漿酸性蛋白をコードする遺伝子が含まれる。ベータラクトグロブリン(BLG)プロモーターが好ましい。ヒツジのベータラクトグロブリン遺伝子の場合、遺伝子の5’フランキング配列の少なくとも近接406 bpの領域が一般に使用されるが、約5 kbpまでの5’フランキング配列のより大きな部分が好ましく、たとえばベータラクトグロブリン遺伝子の5’フランキングプロモーターおよび非コード部分を包含する〜4.25 kbp DNAセグメントが好ましい(Whitelaw et al., Biochem. J. 286: 31 39 (1992) を参照)。また、他の種に由来するプロモーターDNAの同様の断片も適している。
また、発現されるベータラクトグロブリン遺伝子のゲノム領域のように、ベータラクトグロブリン遺伝子の他の領域を構築物に組み込んでもよい。たとえばイントロンを欠く構築物が、かかるDNA配列を含有するものと比較して、不十分にしか発現しないことは当該技術分野において一般に認められている(Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836 840 (1988); Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478 482 (1991); Whitelaw et al., Transgenic Res. 1: 3 13 (1991); WO 89/01343; およびWO 91/02318を参照、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる)。この点に関して、対象のタンパク質コード遺伝子またはポリヌクレオチドの天然のイントロンの全てまたは幾つかを含有するゲノム配列を使用することは、可能な場合には一般に好ましく、このため、たとえばベータラクトグロブリン遺伝子に由来する少なくとも幾つかのイントロンを更に含有させることが好ましい。かかる領域の一つは、ヒツジのベータラクトグロブリン遺伝子の3’非コード領域に由来する、イントロンスプライシングとRNAポリアデニル化を提供するDNAセグメントである。このヒツジのベータラクトグロブリンのセグメントは、遺伝子の天然の3’非コード配列の代わりに用いた場合、対象のタンパク質またはポリペプチドの発現レベルを増大させ、かつ安定化させることができる。他の態様においては、変異体第VII因子配列の開始ATGの周辺領域が、ミルク特異的なタンパク質遺伝子に由来する対応の配列と置き換えられる。かかる置換により、発現を増大させるための推定の組織特異的な開始環境が提供される。変異体第VII因子プレプロ(pre pro)および5’非コード配列の全体を、たとえばBLG遺伝子のものと置き換えることが便利であるが、より小さな領域を置き換えてもよい。
トランスジェニック動物において第VII因子ポリペプチドを発現させるためには、変異体第VII因子をコードするDNAセグメントを、発現に必要な追加のDNAセグメントに動作可能に連結して、発現ユニットを作成する。かかる追加のセグメントには、上記プロモーター、並びに転写の終結およびmRNAのポリアデニル化を提供する配列が含まれる。発現ユニットは、改変第VII因子をコードするセグメントに動作可能に連結された分泌シグナル配列をコードするDNAセグメントを更に含む。分泌シグナル配列は、天然の第VII因子分泌シグナル配列であっても、別のタンパク質のもの、たとえば乳タンパク質のものであってもよい(たとえば、von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 4683 4690 (1986); およびMeade et al., U.S. 4,873,316を参照、これらは参照により本明細書に組み込まれる)。
トランスジェニック動物で使用するための発現ユニットの構築は、追加のDNAセグメントを含有するプラスミドまたはファージベクターに変異体第VII因子配列を挿入することにより簡便に行われるが、発現ユニットは、本質的に任意の配列のライゲーションにより構築されてもよい。乳タンパク質をコードするDNAセグメントを含有するベクターを提供し、乳タンパク質のコーディング配列を変異体第VII因子ポリペプチドのものと置き換え;これにより乳タンパク質遺伝子の発現制御配列を含む遺伝子融合体を作成することが特に便利である。いずれにしても、プラスミドまたは他のベクターにおける発現ユニットのクローニングにより、変異体第VII因子配列の増幅が容易になる。増幅は、細菌(たとえばE.coli)宿主細胞で簡便に行われるため、ベクターは、細菌宿主細胞で機能的な複製起点および選択マーカーを典型的に含む。その後、発現ユニットは、選択した宿主種の受精卵(初期胚を含む)に導入される。異種DNAの導入は、幾つかのルートのうちの一つ、たとえばマイクロインジェクション(たとえばU.S. Patent No. 4,873,191)、レトロウイルス感染(Jaenisch, Science 240: 1468 1474 (1988))または胚幹(ES)細胞を用いた部位指定の組込み(Bradley et al., Bio/Technology 10: 534 539 (1992)により概説される)により行うことができる。その後、卵を、偽妊娠のメスの卵管または子宮に移植し、出産予定日まで発達させる。導入されたDNAを生殖細胞系に保持する子は、通常のメンデルの法則の形態でその子孫にDNAを伝達し、トランスジェニック集団を発達させることができる。トランスジェニック動物を作成するための一般的手法は、当該技術分野で公知である(たとえば、Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6: 179 183 (1988); Wall et al., Biol. Reprod. 32: 645 651 (1985); Buhle
r et al., Bio/Technology 8: 140 143 (1990); Ebert et al., Bio/Technology 9: 835 838 (1991); Krimpenfort et al., Bio/Technology 9: 844 847 (1991); Wall et al., J. Cell. Biochem. 49: 113 120 (1992); U.S. 4,873,191; U.S. 4,873,316; WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757; およびGB 87/00458を参照)。外来DNA配列を哺乳動物およびその生殖細胞に導入するための技術は、もともとはマウスで発展した(たとえば、Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380 7384 (1980); Gordon and Ruddle, Science 214: 1244 1246 (1981); Palmiter and Brinster, Cell 41: 343 345 (1985); Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438 4442 (1985); およびHogan et al. (同上) を参照)。これら技術は、家畜種を含む大きな動物で使用するためにその後改変されている(たとえば、WO 88/00239, WO 90/05188, およびWO 92/11757; およびSimons et al., Bio/Technology 6: 179 183 (1988) を参照)。要約すると、トランスジェニックマウスまたは家畜を作成する際に今日まで用いられている多くの有効なルートでは、数百の直鎖状分子の対象DNAが、確立された技術に従って受精卵の前核の一つに注入される。また、接合体の細胞質へのDNAの注入を採用することもできる。
また、トランスジェニック植物における作成を採用してもよい。発現は、全体的であってもよいし、塊茎などの特定の器官に向けられていてもよい(Hiatt, Nature 344: 469 479 (1990); Edelbaum et al., J. Interferon Res. 12:449 453 (1992); Sijmons et al., Bio/Technology 8: 217 221 (1990); およびEP 0 255 378を参照)。
本発明の第VII因子ポリペプチドは、細胞培養培地またはミルクから回収される。本発明の第VII因子ポリペプチドは、当該技術分野において公知の種々の手法により精製することができ、たとえば、クロマトグラフィー(たとえば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、等電点クロマトグラフィー、およびサイズ排除)、電気泳動法(たとえば、プレパレイティブ等電点電気泳動(IEF))、ディファレンシャル溶解度(たとえば、硫安沈殿)、または抽出(たとえば、Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照)が挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、抗第VII因子抗体カラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。カルシウム依存性モノクローナル抗体の使用は、Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261: 11097-11108, (1986) およびThim et al., Biochemistry 27: 7785-7793, (1988) に記載されている。更なる精製を、高性能液体クロマトグラフィーなどの慣用的な化学的精製手段により行ってもよい。クエン酸バリウム沈殿などの他の精製方法が、当該技術分野で公知であり、本明細書に記載の新規第VII因子ポリペプチドの精製に適用してもよい(たとえば、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982を参照)。
治療目的のためには、本発明の第VII因子ポリペプチドが実質的に純粋であることが好ましい。このため、本発明の好ましい態様において、本発明の第VII因子ポリペプチドは、少なくとも約90〜95%の均質性、好ましくは少なくとも約98%の均質性まで精製される。純度は、たとえばゲル電気泳動およびアミノ末端アミノ酸配列決定により評価することができる。
第VII因子ポリペプチドは、それを二本鎖形態に変換するためにその活性化部位で切断される。活性化は、当該技術分野で公知の手法、たとえば、Osterud, et al., Biochemistry 11: 2853-2857 (1972); Thomas, U.S. Patent No. 4, 456, 591; Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841 (1983); またはKisiel and Fujikawa, Behring Inst. Mitt. 73: 29-42 (1983) に開示される手法に従って行うことができる。あるいは、Bjoern et al. (Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565) に記載されるとおり、第VII因子は、それをイオン交換クロマトグラフィーカラム、たとえばMono Q (Pharmacia fine Chemicals) などを通過させることにより活性化されてもよい。その後、得られた活性化第VII因子ポリペプチドを、以下に記載されるとおり処方し投与することができる。
実施例1
アッセイ1:
インビトロ加水分解アッセイ
野生型(天然)第VIIa因子および第VIIa因子変異体(いずれも、これ以降「第VIIa因子」と称する)は、特異的活性を直接的に比較するために並行してアッセイされる。アッセイは、マイクロタイタープレートで行われる (MaxiSorp, Nunc, Denmark)。0.1 M NaCl、5 mM CaCl2および1 mg/ml ウシ血清アルブミンを含有する50 mM Hepes, pH 7.4中で、色素生産性基質D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド (S-2288, Chromogenix, Sweden)、最終濃度1 mMを、第VIIa因子 (最終濃度100 nM) に添加する。405 nmにおける吸光度を、SpectraMax(登録商標) 340プレートリーダー(Molecular Devices, USA) で連続して測定する。20分インキュベーションの間に発色した吸光度を、酵素を含有しないブランクウェルでの吸光度を差し引いた後、変異体と野生型第VIIa因子の活性の間の比を計算するために使用する:
比=(A405 nm 第VIIa因子変異体)/(A405 nm 第VIIa因子野生型)。
アッセイ2:
インビトロタンパク分解アッセイ
野生型(天然)第VIIa因子および第VIIa因子変異体(いずれも、これ以降「第VIIa因子」と称する)は、特異的活性を直接的に比較するために並行してアッセイされる。アッセイは、マイクロタイタープレートで行われる (MaxiSorp, Nunc, Denmark)。0.1 M NaCl, 5 mM CaCl2および1 mg/ml ウシ血清アルブミンを含有する 100 microL 50 mM Hepes, pH 7.4中で、第VIIa因子 (10 nM) および第X因子 (0.8 microM) を15分間インキュベートする。その後、0.1 M NaCl, 20 mM EDTAおよび1 mg/ml ウシ血清アルブミンを含有する50 microL 50 mM Hepes, pH 7.4を添加することにより、第X因子の切断を停止させる。生成した第Xa因子の量を、色素生産性基質Z-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド (S-2765, Chromogenix, Sweden)、最終濃度0.5 mMを添加することにより測定する。405 nmにおける吸光度を、SpectraMax(登録商標) 340プレートリーダー (Molecular Devices, USA) で連続して測定する。10分の間に発色した吸光度を、FVIIaを含有しないブランクウェルの吸光度を差し引いた後、変異体と野生型第VIIa因子のタンパク分解活性の間の比を計算するために使用する:
比:(A405 nm 第VIIa因子変異体)/(A405 nm 第VIIa因子野生型)。
本明細書に開示される特定の態様は、本発明の幾つかの側面を例証することを意図するため、本明細書で記載され請求される発明は、本明細書に開示される特定の態様により範囲が限定されるべきではない。任意の等価な態様が、本発明の範囲内にあることが意図される。実際、本明細書で示され記載されるものの他に本発明の種々の改変が、前述の記載から当業者に明らかになるでしょう。かかる改変もまた、添付の請求の範囲内に入ることを意図する。矛盾する場合、定義を含む本開示がコントロールするでしょう。
例2
以下の液体、水性薬学的組成物の処方が考えられる:
A)
rhFVIIa 0.9 mg/mL (約 50,000 IU/mL)
V158D/E296V/M298Q-FVIIa 0.1 mg/mL
PIPES 15.12 mg/mL (50 mM)
Poloxamer 188 1.0 mg/mL
塩化ナトリウム 2.92 mg/mL (50 mM)
塩化カルシウム2H2O 1.47 mg/mL (10 mM)
メチオニン 0.5 mg/mL
1 M NaOH pH 6.5まで添加
注射用蒸留水 (WFI) ad 2.0 mL
B)
rhFVIIa 0.8 mg/mL (約 50,000 IU/mL)
V158D/E296V/M298Q-FVIIa 0.2 mg/mL
PIPES 15.12 mg/mL (50 mM)
Poloxamer 188 1.0 mg/mL
塩化ナトリウム 2.92 mg/mL (50 mM)
塩化カルシウム2H2O 1.47 mg/mL (10 mM)
メチオニン 0.5 mg/mL
1 M NaOH pH 6.5まで添加
注射用蒸留水 (WFI) ad 2.0 mL
C)
rhFVIIa 0.9 mg/mL (約 50,000 IU/mL)
V158D/E296V/M298Q-FVIIa 0.1 mg/mL
PIPES 15.12 mg/mL (50 mM)
Poloxamer 188 1.0 mg/mL
塩化ナトリウム 2.92 mg/mL (50 mM)
塩化カルシウム2H2O 1.47 mg/mL (10 mM)
1 M NaOH pH 6.5まで添加
注射用蒸留水 (WFI) ad 2.0 mL
D)
rhFVIIa 0.8 mg/mL (約 50,000 IU/mL)
V158D/E296V/M298Q-FVIIa 0.2 mg/mL
PIPES 15.12 mg/mL (50 mM)
Poloxamer 188 1.0 mg/mL
塩化ナトリウム 2.92 mg/mL (50 mM)
塩化カルシウム2H2O 1.47 mg/mL (10 mM)
1 M NaOH pH 6.5まで添加
注射用蒸留水 (WFI) ad 2.0 mL。
続いて、薬学的組成物A-Dを、窒素またはアルゴンを注いだ滅菌バイアルまたはカートリッジに移し、その後、気密性アルミニウムラミネートプラスチック袋に包むことができる。
例3
0.1 mg/mL V158D/E296V/M298Q-FVIIaを含有し、グリシルグリシン、塩化ナトリウムおよび塩化カルシウムを後述の濃度で予め含有する0.9 mg/mL rFVIIaのバルク溶液の混合物に、10 mM ヒスチジン、10 mM 酢酸ナトリウムおよび50 mM ベンズアミジン (調合物EおよびFのみ) を添加することにより、他の薬学的調合物を調製する。1 M 水酸化ナトリウムを用いて、pHをそれぞれ6.5および7.0に最終的に調整する。
E)
0.9 mg/mL rhFVIIa
0.1 mg/mL V158D/E296V/M298Q-FVIIa
10 mM ヒスチジン
10 mM 酢酸ナトリウム
10 mM グリシルグリシン
50 mM 塩化ナトリウム
10 mM 塩化カルシウム
50 mM ベンズアミジン
pH = 6.5
F)
0.9 mg/mL rhFVIIa
0.1 mg/mL V158D/E296V/M298Q-FVIIa
10 mM ヒスチジン
10 mM 酢酸ナトリウム
10 mM グリシルグリシン
50 mM 塩化ナトリウム
10 mM 塩化カルシウム
50 mM ベンズアミジン
pH = 7.0
G)
0.9 mg/mL rhFVIIa
0.1 mg/mL V158D/E296V/M298Q-FVIIa
10 mM 酢酸ナトリウム
10 mM グリシルグリシン
50 mM 塩化ナトリウム
10 mM 塩化カルシウム
10 mM ヒスチジン
pH = 6.5
H)
0.9 mg/mL rhFVIIa
0.1 mg/mL V158D/E296V/M298Q-FVIIa
10 mM ヒスチジン
10 mM 酢酸ナトリウム
10 mM グリシルグリシン
50 mM 塩化ナトリウム
10 mM 塩化カルシウム
pH = 7.0。
例4
野生型ヒトFVIIaおよび第VII因子関連ポリペプチドを含む典型的な組成物を示す。典型的な賦形剤およびその典型的な量を示す。
表1は、組成物が液体形態である場合、すなわち製造を完了させる(たとえば凍結乾燥を完了させる)前の組成物である場合、または再構成溶液である場合の、活性成分および賦形剤の濃度を示す。
表2は、組成物が固体形態である場合、すなわち凍結乾燥形態である場合の、活性成分および賦形剤の濃度を示す。
Figure 2006527216
Figure 2006527216
例5
ヒト野生型第VIIa因子を、出血の発症、たとえば外傷を治療するための単回投与効果的な量(single-dose-effective amount)を含む単回投与として、または出血の発症、たとえば外傷を治療するための効果的な量を一緒に含む段階的な(staged)一連の投与で、患者に投与することができる。ヒト野生型第VIIa因子の効果的な量とは、単回投与で、または複数回投与の集合で投与したとき、あるいは任意の他のタイプの規定の治療プログラムの一部として投与したときに、外傷と関連した臨床パラメーターの少なくとも一つが測定可能なほどに改善されるヒト野生型第VIIa因子の量をいう。
単回投与の投与は、約5分未満の期間にわたってボーラスとしてヒト野生型第VIIa因子の全量を投与することをいう。幾つかの態様では、その投与は、約2.5分未満の期間にわたって行われ、また幾つかの態様では、約1分未満にわたって行われる。典型的には、単回投与効果的な量は、少なくとも約40 ug/kgのヒト第VIIa因子または対応量の第VIIa因子の等価物、たとえば少なくとも約50 ug/kg、75 ug/kg、または90 ug/kg、または少なくとも150 ug/kgの第VIIa因子を含む。
本発明の一つの側面を実施する場合、効果的な量のヒト野生型第VIIa因子が達成されない場合、第VII因子関連ポリペプチド、たとえばV158D/E296V/M298Q-FVIIaを、ヒト野生型第VIIa因子の投与に引き続いて投与する。
野生型ヒト第VII凝固因子のアミノ酸配列。 野生型ヒト第VII凝固因子のアミノ酸配列。

Claims (24)

  1. 野生型ヒトFVIIaおよび第VII因子関連ポリペプチドを含む組成物。
  2. 前記野生型ヒトFVIIaと前記第VII因子関連ポリペプチドとのモル比が、約1:99〜約99:1である、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記第VII因子関連ポリペプチドが、野生型ヒトFVIIaより高いタンパク分解活性を有する、請求項1または2の何れか1項に記載の組成物。
  4. 前記第VII因子関連ポリペプチドが、以下のものから成る群より選択される、請求項1〜3の何れか1項に記載の組成物:L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、
    L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、
    M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、
    V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、
    E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、および
    S336G-FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII、L305V/E296V-FVII、
    L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、
    L305V/K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII、L305V/K337A/V158D-FVII、
    L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII、L305V/V158T/M298Q-FVII、
    L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、
    L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、
    L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、
    L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/K316H-FVII、S314E/K316Q-FVII、
    S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、
    S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、
    K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、
    K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、
    K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、
    S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII、S314E/L305V/M298Q-FVII、
    S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII、
    S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII、
    S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、
    S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII、
    S314E/L305V/V158T/E296V-FVII、S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII、
    S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、
    S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、
    S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、
    S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/K337A-FVII、
    K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、
    K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、
    K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、
    K316H/L305V/K337A/V158D-FVII、K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII、
    K316H/L305V/V158D/E296V-FVII、K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII、
    K316H/L305V/V158T/E296V-FVII、K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII、
    K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、
    K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、
    K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、
    K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/K337A-FVII、
    K316Q/L305V/V158D-FVII、K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/M298Q-FVII、
    K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、
    K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、
    K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、
    K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII、
    K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、
    K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、
    K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、
    K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、
    K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、
    F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、
    F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、
    F374Y/L305V/E296V-FVII、F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、
    F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、
    F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、
    F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、
    F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、
    F374Y/E296V/S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII、F374Y/E296V/M298Q-FVII、
    F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII、
    F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII、
    F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII、
    F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII、
    F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII、
    F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII、
    F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、
    F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、
    F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII、
    F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII、
    F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII、
    F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、
    F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、
    F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、
    F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-第VII因子、
    S60A-第VII因子; R152E-第VII因子、S344A-第VII因子、
    Glaドメインを欠く第VIIa因子; およびP11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、
    K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、
    K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; および233Thrから240Asnまでのアミノ酸配列に置換、付加または欠失を有するFVII、304Arg to 329Cysまでのアミノ酸配列に置換、付加または欠失を有するFVII。
  5. 前記野生型ヒトFVIIaと前記第VII因子関連ポリペプチドとのモル比が、約10:90〜約90:10、たとえば約20:80〜約80:20、たとえば約30:70〜約70:30、たとえば約40:60〜約60:40である、請求項1〜4の何れか1項に記載の組成物。
  6. 前記野生型ヒトFVIIaと前記第VII因子関連ポリペプチドとのモル比が、約1:99〜約10:90、たとえば約10:90〜約20:80、たとえば約20:80〜約30:70、たとえば約30:70〜約40:60である、請求項1〜4の何れか1項に記載の組成物。
  7. 前記野生型ヒトFVIIaと前記第VII因子関連ポリペプチドとのモル比が、約99:1〜約90:10、たとえば約90:10〜約80:20、たとえば約80:20〜約70:30、たとえば約70:30〜約60:40である、請求項1〜4の何れか1項に記載の組成物。
  8. 前記第VII因子関連ポリペプチドのタンパク分解活性と前記野生型ヒト第VIIa因子のタンパク分解活性との比が、インビトロ加水分解アッセイ(In Vitro Hydrolysis Assay)で試験したときに、少なくとも約1.25である、請求項1〜7の何れか1項に記載の組成物。
  9. 前記第VII因子関連ポリペプチドのタンパク分解活性と前記野生型ヒト第VIIa因子のタンパク分解活性との比が、インビトロ加水分解アッセイ(In Vitro Hydrolysis Assay)で試験したときに、少なくとも約2.0、たとえば少なくとも約4.0である、請求項8に記載の組成物。
  10. 前記第VII因子関連ポリペプチドのタンパク分解活性と前記野生型ヒト第VIIa因子のタンパク分解活性との比が、インビトロタンパク分解アッセイ(In Vitro Proteolysis Assay)で試験したときに、少なくとも約1.25である、請求項1〜9の何れか1項に記載の組成物。
  11. 前記第VII因子関連ポリペプチドのタンパク分解活性と前記野生型ヒト第VIIa因子のタンパク分解活性との比が、インビトロタンパク分解アッセイ(In Vitro Proteolysis Assay)で試験したときに、少なくとも約2.0、たとえば少なくとも約4.0である、請求項10に記載の組成物。
  12. 被検体における出血の発症の治療のため、または正常な止血システムの増大のための方法であって、その必要がある被検体に対して、
    a)野生型ヒトFVIIaおよび第VII因子関連ポリペプチドを含む組成物;または
    b)野生型ヒトFVIIaを含む第一の組成物および第VII因子関連ポリペプチドを含む第二の組成物
    を、治療的または予防的に効果的な量で投与することを含む方法。
  13. 前記野生型ヒトFVIIaと前記第VII因子関連ポリペプチドとのモル比が、約1:99〜約99:1である、請求項12に記載の方法。
  14. 前記第VII因子関連ポリペプチドが、野生型ヒトFVIIaより高いタンパク分解活性を有する、請求項12または13の何れか1項に記載の方法。
  15. 前記第VII因子関連ポリペプチドが、以下のものから成る群より選択される、請求項12〜14の何れか1項に記載の方法:L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、
    L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、
    K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、
    V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、
    V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、およびS336G-FVII、L305V/K337A-FVII、
    L305V/V158D-FVII、L305V/E296V-FVII、L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、
    L305V/K337A/V158T-FVII、L305V/K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII、
    L305V/K337A/V158D-FVII、L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII、
    L305V/V158T/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII、
    L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、
    L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、
    L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、
    L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    S314E/K316H-FVII、S314E/K316Q-FVII、S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、
    S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、
    K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、
    K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、
    K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、
    S314E/L305V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII、
    S314E/L305V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII、
    S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII、
    S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、
    S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII、
    S314E/L305V/V158T/E296V-FVII、S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII、
    S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、
    S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、
    S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、
    S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/K337A-FVII、
    K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、
    K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、
    K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、
    K316H/L305V/K337A/V158D-FVII、K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII、
    K316H/L305V/V158D/E296V-FVII、K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII、
    K316H/L305V/V158T/E296V-FVII、K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII、
    K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、
    K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、
    K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、
    K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/K337A-FVII、
    K316Q/L305V/V158D-FVII、K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/M298Q-FVII、
    K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、
    K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、
    K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、
    K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII、
    K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、
    K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、
    K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、
    K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、
    K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、
    F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、
    F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、
    F374Y/L305V/E296V-FVII、F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、
    F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、
    F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、
    F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、
    F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、
    F374Y/E296V/S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII、F374Y/E296V/M298Q-FVII、
    F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII、
    F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII、
    F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII、
    F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII、
    F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII、
    F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII、
    F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、
    F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、
    F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII、
    F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII、
    F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII、
    F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、
    F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、
    F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、
    F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、
    F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-第VII因子、
    S60A-第VII因子; R152E-第VII因子、S344A-第VII因子、
    Glaドメインを欠く第VIIa因子; およびP11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、
    K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、
    K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; および233Thrから240Asnまでのアミノ酸配列に置換、付加または欠失を有するFVII、304Argから329Cysまでのアミノ酸配列に置換、付加または欠失を有するFVII。
  16. 前記野生型ヒトFVIIaと前記第VII因子関連ポリペプチドとのモル比が、約10:90〜約90:10、たとえば約20:80〜約80:20、たとえば約30:70〜約70:30、たとえば約40:60〜約60:40である、請求項12〜15の何れか1項に記載の方法。
  17. 前記野生型ヒトFVIIaと前記第VII因子関連ポリペプチドとのモル比が、約1:99〜約10:90、たとえば約10:90〜約20:80、たとえば約20:80〜約30:70、たとえば約30:70〜約40:60である、請求項12〜15の何れか1項に記載の方法。
  18. 前記野生型ヒトFVIIaと前記第VII因子関連ポリペプチドとのモル比が、約99:1〜約90:10、たとえば約90:10〜約80:20、たとえば約80:20〜約70:30、たとえば約70:30〜約60:40である、請求項12〜15の何れか1項に記載の方法。
  19. 前記第VII因子関連ポリペプチドのタンパク分解活性と前記野生型ヒト第VIIa因子のタンパク分解活性との比が、インビトロ加水分解アッセイ(In Vitro Hydrolysis Assay)で試験したときに、少なくとも約1.25である、請求項12〜18の何れか1項に記載の方法。
  20. 前記第VII因子関連ポリペプチドのタンパク分解活性と前記野生型ヒト第VIIa因子のタンパク分解活性との比が、インビトロ加水分解アッセイ(In Vitro Hydrolysis Assay)で試験したときに、少なくとも約2.0、たとえば少なくとも約4.0である、請求項19に記載の方法。
  21. 前記第VII因子関連ポリペプチドのタンパク分解活性と前記野生型ヒト第VIIa因子のタンパク分解活性との比が、インビトロタンパク分解アッセイ(In Vitro Proteolysis Assay)で試験したときに、少なくとも約1.25である、請求項12〜20の何れか1項に記載の方法。
  22. 前記第VII因子関連ポリペプチドのタンパク分解活性と前記野生型ヒト第VIIa因子のタンパク分解活性との比が、インビトロタンパク分解アッセイ(In Vitro Proteolysis Assay)で試験したときに、少なくとも約2.0、たとえば少なくとも約4.0である、請求項21に記載の方法。
  23. 請求項1〜11の何れか1項に記載の組成物を調製する方法であって、野生型ヒトFVIIaを第VII因子関連ポリペプチドと混合する工程を含む方法。
  24. 被検体における出血の発症の治療のため、または正常な止血システムの増大のための医薬を調製するための、請求項1〜11の何れか1項に記載の組成物の使用。
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