JP2001515460A - 血漿タンパク質液体製剤の製造法と使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は血漿タンパク質液体製剤、特に血液凝固因子液体製剤の製造と使用に関する。より具体的には、本発明は、血中に一定なレベルの凝固因子を与えるために注射または注入によって投与することができる因子VIIIおよび因子IXの安定な液体製剤に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 血漿タンパク質液体製剤の製造法と使用法 I. 発明の分野 本発明は血漿タンパク質の液体製剤、特に血液凝固因子液体製剤の製造法と使 用法に関する。より具体的に述べると、本発明は、因子VIIIおよび因子IXの安定 な液体製剤、および血中の当該凝固因子レベルが一定となるようにそれら製剤を 持続的に注射または注入することによる先天性または後天性血漿タンパク質欠乏 症の処置に関する。 II. 発明の背景 A. 凝固 血液の凝固は、タンパク質分解的活性化のカスケードで一定の血液タンパク質 が相互作用し、最終的に可溶性フィブリノーゲンを不溶性フィブリンに変換する "内因系経路"または"外因系経路"によって起こる。これらのフィブリン繊維は架 橋して血餅の足場を形成する。フィブリン生成がなければ、凝固は起こり得ない 。 内因系経路は次に挙げる７段階からなる：(1)因子XIIのタンパク質分解的活性 化；(2)活性型因子XIIが因子XIを切断してそれを活性化する；(3)活性型因子XI が因子IXを切断することにより、それを活性化する；(4)活性型因子IXが活性型 因子VIIIと相互作用することにより因子Ｘを切断、活性化する；(5)活性型因子 Ｘが膜表面の活性型因子Ｖに結合し、その複合体がプロトロンビンをタンパク質 分解的に切断してトロンビンを生成させる；(6)トロンビンがタンパク質分解的 にフィブリノーゲンを切断してフィブリンを生成させる；(7)フィブリン単量体 が会合してフィブリルになり、それが因子XIIIによって架橋される。 外因系経路は次の段階からなる：(1)血管が破裂すると、因子VIIが血管系外の 組識中に存在するリポタンパク質である組識因子に結合する；(2)因子VIIはタン パク質分解的切断により因子VIIaに活性化される；(3)因子VIIa-組識因子複合体 が因子Ｘを切断、活性化する。外因系経路のその後は内因系経路と同じである。 すなわちこれら２つの経路は、上述の最後の３段階を共有する。 血漿タンパク質の一つ、凝固因子IX（"CFIX"）は、肝臓で肝細胞により415ア ミノ酸ポリペプチドとして合成された後、補因子としてビタミンＫを要求するカ ルボキシラーゼにより分子量56,000ダルトンの糖タンパク質に翻訳後修飾される 。したがってCFIXは"ビタミンＫ依存性"血漿タンパク質群の一つである。 因子VIIは、CFIXに似たサイズと構造を持つもう１つのビタミンＫ依存性凝固 タンパク質である。 非ビタミンＫ依存性タンパク質因子VIIIは、はるかに大きいタンパク質で、30 0,000ダルトン（300kDa）ちかい分子量を持つ。これはトロンビンによって活性 化される。トロンビンは因子VIIIを数箇所で切断することにより、因子VIIIa（ 活性型）を生成させる。血漿中では、因子VIIIはフォン・ヴィレブランド因子（v WF）に結合し、不安定な因子VIII分子を安定化するvWFとの複合体として循環す る。 内因系経路に関与するカスケードの平衡が乱されると、種々の凝固障害が起こ る。段階(4)の内因系因子Ｘ活性化成分（"テナーゼ(tenase)"）の欠損または減 少は、血友病として知られる凝固欠陥状態をもたらす。最も一般的な血友病Ａは 因子VIII遺伝子中の突然変異によって起こり、クリスマス病とも呼ばれる血友病 Ｂは因子IX遺伝子中の突然変異によって起こる。血友病Ｂは血友病Ａと同様にＸ 連鎖性で、血友病症例の約12％を占める。その症状は血友病Ａの症状と同じで、 損傷時の過剰な出血と自然出血（特に体重保持関節、軟部組識および粘膜への自 然出血）である。関節内への出血を繰り返すと関節血症が起こって、肢体を不自 由にする有痛性の関節症となり、これはしばしば関節置換術を必要とする。軟部 組識内の血腫は壊死性血塊からなる擬似腫瘍をもたらし得る。それらは隣接する 器官を閉塞、圧迫し、あるいは隣接する器官内に破裂し、感染症につながりうる 。いったん生成した血腫は外科手術を行なっても治療することが難しい。圧迫後 の神経の回復は不十分で、麻痺状態をもたらす。胃腸路、中枢神経系または気道 /腹膜後隙空でこれらの出血エピソードが起こると、たとえ検出されなくても、 死に至ることがある。頭蓋内出血は血友病患者の主な死因である。 現在行われているこれら症状の治療は、因子VIIIまたは因子IX濃縮物の静脈 内補充療法からなる。大きな出血エピソードの治療は濃縮物のボーラス注射によ って行われる。しかし上述のように、直ちに検出し治療したとしても、組識損傷 は残る。この痛みと衰弱を予防するには、予防的処置が推奨される。因子IXを注 射すると、その50％は直ちに血管内皮細胞に結合し、かつ／または、血管外腔に 拡散する。残りの50％は循環系内で約24時間の半減期を持つ。因子IXはこのよう な注入動態を持つので、血漿中に最低限の治療レベルを維持するには、毎週１回 か２回あるいはそれ以上の頻度で注射を行なう必要がある。この措置は患者にと っては不便でありストレスにもなるのだが、それでも十分に有効なわけではない 。治療を開始する前に起こった各出血エピソードごとに、累進的累積的な組識損 傷が続く。 B. ビタミンＫ依存性血漿タンパク質 ビタミンＫ依存性血漿タンパク質を含むグループは、現在までのところ、因子 II、因子VII、因子IX、因子Ｘ、プロテインＣ、プロテインＳ、およびプロテイ ンＺからなる。。これらのタンパク質は遺伝子構成、アミノ酸配列（一次構造） 、タンパク質の折りたたみ（二次構造）、翻訳後修飾、活性化、および機能のど のレベルでも、かなりの相同性を示す（C.R.Scriverら共編,Metabolic Basis of Inherited Disease（遺伝性疾患の代謝的基礎）,第６版(出版社McGraw-Hill,ニ ューヨーク州ニューヨーク)(1989)の第84章,HednerおよびDavie著，Introductio n to Hemostasis and the Vitamin K-Dependent Coagulation Factors（止血と ビタミンＫ依存性凝固因子の概説）,p2107-2134）。次の表は、よく特徴づけら れた６つのビタミンＫ依存性血漿タンパク質の特性を比較したものである（プロ テインＺはその性質と機能に関する情報が十分でないので、この比較から除外し た）： "gla"ドメインは、ビタミンＫを要求する膜結合型複合体がアミノ酸であるグ ルタミン酸をカルボキシル化することによって形成される複数のγ-カルボキシ グルタミン酸残基を持つ最初の40〜45アミノ酸残基からなる。これらは、リン脂 質表面に対するそのタンパク質のカルシウム依存的結合に必要である。 "EGF"ドメインは、上皮細胞増殖因子（EGF）とその前駆体にかなり似た配列を 持つ40〜50アミノ酸からなる。これらの各タンパク質中の最初のEGFドメインは 、β-ヒドロキシアスパラギン酸変異を含有する。プロテインＳはこれらのEGFド メインを含有しないが、３つのβ-ヒドロキシアスパラギン酸残基と１つのβ-ヒ ドロキシアスパラギン残基を含有する。プロトロンビンとも呼ばれる因子IIは、 これらEGFドメインの代わりに２つのクリングル領域を含有する。これらのクリ ングルドメインは、ビタミンＫ依存性タンパク質ではないがタンパク質分解活性 を持ち凝固に関与する血漿タンパク質因子XII，プラスミノーゲン、組織プラス ミノーゲン活性化因子およびウロキナーゼにも認められる。 上記６つのビタミンＫ依存性血漿タンパク質のうち５つは、先行する凝固カス ケード成分によってタンパク質分解的に切断される。３つのビタミンＫ依存性血 漿タンパク質は２ヶ所で切断され、触媒ドメインを遮蔽していた活性化ペプチド を放出する。因子IXaによる因子Ｘの活性化は、この２本鎖タンパク質の重鎖か ら活性化ペプチドを放出させる単切断を伴う。因子VIIは、そのポリペプチドの 一本鎖の単切断によって、活性化ペプチドを放出することなく活性化される。 上記６つのビタミンＫ依存性血漿タンパク質のうち５つは、活性化されるとセ リンプロテアーゼになる。これらのプロテアーゼはその触媒ドメイン内の類似す る位置にヒスチジン、アスパラギン酸およびセリン残基を持つ。プロテインＳは プロテインＣの補因子であり、それ自身が触媒ドメインを持つことは現在のとこ ろ知られていない。 上記６つのビタミンＫ依存性血漿タンパク質は2〜4個のＮ結合型グリコシル化 部位をそのEGFドメインと触媒ドメインおよび/または活性化ペプチド内に持つ糖 タンパク質である。 これらのビタミンＫ依存性血漿タンパク質はきわめてよく似た特徴を持つので 、その精製法のほとんどで同時精製される。６つのビタミンＫ依存性血漿タンパ ク質はすべて、一般に使用される精製法のどちらでも、ほとんどの段階で同じ画 分中に認められる。コーン画分をクエン酸バリウムまたは水酸化アルミニウム吸 着によって精製すると、因子II、VII、IXおよびＸならびにプロテインＣが同時 精製される。凍結乏血漿をDEAE-セファデックスやDEAE-セファロースのような樹 脂での陰イオン交換クロマトグラフィーにかけると、因子II、IXおよびＸが痕跡 量の因子VIIおよびプロテインＣと共に同時精製される。 C. 現行の因子IX製剤 米国市場に因子IX濃縮物を出している２社は、それらを凍結乾燥体として提供 している。Armour Pharmaceuticals社（現在Centeon社）が生産しているモノニ ン（Mononine）は、滅菌注射水（WFI）で復元した後、0.01モル/リットル（mol/ L）ヒスチジン,pH7.05、0.066mol/L塩化ナトリウム、3％マンニトールの組成で 送達される。アルファナインSD(AlphaNine SD)はAlpha Therapeutics社が製造し ており、これは滅菌WFIで復元した後、0.04単位ヘパリン/単位-因子IXと１mgブ ドウ塘/単位-因子IXを含む組成で送達される。モノニンのあるロットは、復元す ると37℃で13日間の試験管内半減期を持つことがわかった。現行の予防療法に認 められるような侵襲的処置の反復を避けるには、37℃で少なくとも30日間、4℃ で少なくとも365日間の安定性が必要である。 D. 現行の因子VIII製剤 ３社が米国市場用のアフィニティー精製血漿因子VIII濃縮物を生産しており、 それらはいずれも凍結乾燥製品である。Baxter Healthcare/Hyland Division社 は同じ方法で２つの製品を製造している。すなわち、抗血友病因子（ヒト）Ｍ法 モノクローナル精製品（Antihemophilic Factor(Human),Method M，Monoclonal Purified;AHF-M）は米国赤十字社（ARC）が集めた献血血漿からARCのために生産 されており、ヘモフィルＭ（Hemophil M）は商業的な血漿交換血漿から生産され ている。これらの製品は、滅菌WFIで復元した後、12.5mg/mLヒトアルブミン、1. 5mg/mL PEG、0.030Mグリシンおよび0.055Mヒスチジンという組成で送達される。 Armour/Centeon社が生産しているモノクレイト（Monoclate）は、滅菌WFIで復元 した後、10〜20mg/mLヒトアルブミン、0.30〜0.45M塩化ナトリウム、2〜5mM塩化 カルシウム、0.8％マンニトールおよび1.2mMヒスチジンという組成で送達される 。Alpha Therapeutic Corporation社が製造しているアルファネイト（Alphanate ）は、滅菌WFIで復元した後、ヒトアルブミンが0.5〜10mg/mLであり、かつ、10m Mカルシウム、２μ/mLヘパリン、0.055Mヒスチジンおよび0.3Mアルギニンを超え ない組成で送達される。 また、２つの凍結乾燥組換え因子VIII製品も現在市場に出されている。リコネ イト（Recombinate）はBaxter HealthCare社が、コージネイト（Kogenate）はBa yer Corporation社がそれぞれ生産している。 E. その他の安定な水系血漿タンパク質製剤 フィブリン封鎖剤（シーラント）またはフィブリン接着剤の成分は、トロンビ ン濃縮物成分もフィブリノーゲン濃縮物成分も、その半減期が4℃で６ヶ月以上 の液体として製剤化されている（Chabbatら，Thrombos.Res.76:525-533(1994)） 。トロンビン成分は、アルギニン1.6ミリモル/リットル（mmol/L）、ベンズアミ ジン1mg/L未満、グルコン酸1.7mmol/L、カルシウム22mmol/L、pH6.6の製剤中に ある。フィブリノーゲン濃縮成分は、アプロチニン250Kiu/ミリリットル（Kiu/m L）、グリシン1.2グラム/リットル（g/L）、エタノール0.1g/L未満、pH7.6の製 剤中にある。 P. 非水系液体タンパク質製剤 非水系液体製剤中の医薬的に重要なタンパク質製剤はほとんど先例がない。し かし、フィブリンシーラント（Fibrin Sealant）の成分であるフィブリノーゲン とトロンビン（活性型因子II）は、それらの成分が早期活性化を起こすことなく 一送達単位ずつ容易に保存および送達できるように、非水系エタノール溶液中に 調剤されている。 G. 持続注入による医薬製剤の送達 液体製剤中の医薬の持続送達にはポンプが使われてきた。インスリン、抗生物 質、化学療法剤、ホルモンの送達には、米国内外で、体外型シリンジ送達ポンプ が使用されている。これらのポンプは静脈内、皮下または腹腔内に、必要に応じ てプログラムされた持続投与もしくはボーラス注射として、液体を送達できる。 貯蔵槽の容量は１ミリリットルから1500ミリリットルの範囲にわたる。これらの ポンプは2〜3ヶ月の寿命を持つ電池で駆動される。したがって因子IX液体製剤は 、現行の予防療法のように週２回ではなく、月に１回医師の監督を受ければすむ ように、37℃で少なくとも30日の安定性を持つことが望ましい。このタイプの体 外装着ポンプは、予防措置を講じなければ侵襲的処置によって起こってしまうか もしれない過剰な出血を予防するために手術前後の短期予防として、因子VIIIと 因子IXを血友病患者に送達するのに使用されてきた。 また、ヒト体内で使用できる移植用ポンプも２種類あるが、これらは血友病患 者に凝固因子を送達するためには使用されていない。これらのポンプは、腹膜、 肝動脈または脊髄周辺アクセス用に固定された排出力テーテルと共に胸壁または 腹部に外科的に移植され、皮下脂肪で保護されるように設計されている。これら のポンプは外部から注射によって皮膚を通して充填される。アローモデル3000移 植用ポンプ（Arrow Model 3000 Implantable Pump；Arrow Therix社,メリーラン ド州ウォルポール）は臨床使用が認可されており、主として鎮痛剤や肝臓癌用化 学療法剤の送達に利用されている。これは30mLの容量を持つチタン製ベローによ って稼動し、設定流速0.5、1.0および2.0mL/日の３種類を入手することができる 。ミニメッド2001（MiniMed 2001；MiniMed Technologies社，カリフオルニア州 シルマー）はインスリンの送達に使用するための認可を待っていると ころである。この蠕動ポンプは容量15〜18mLのチタン製貯蔵槽をもち、プログラ ム可能な発信機で外部から制御することができので、必要な時に流速の変更やボ ーラスオーバーライドが可能である。 ヒドロゲル、特にキチンヒドロゲルやキトサンヒドロゲルは、過去に薬物の徐 放に使用されたことがある（ChandyおよびSharma,Biomat.Art.Cells.& Immob.Bi otech.19:745-760(1991)）。最近になって、因子IXが組み込まれた負に荷電した キトサン誘導体N,O-カルボキシメチルキトサン（NOCC）の皮下注射剤から因子IX を生体内で放出させると、そのヒドロゲルからの緩慢な拡散的放出によって因子 IXが血漿中に現れ、しかも、その極大レベルは因子IXをこのヒドロゲルなしで直 接皮下注射した場合より低く、正常レベルに近くなることがわかった。またこれ によって、臨床的に有意なレベルの因子IXがより長期間送達された（1995年６月 11日にイスラエルのエルサレムで開催された第15回血栓症と止血に関する国際学 会（XVth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemost asis）での口頭発表）。 III. 発明の要旨 したがって本発明の目的は、一定した循環レベルの凝固因子を与えるために個 体に投与することができる因子VIIIと因子IXの安定な液体製剤を提供することで ある。本発明のその他の目的、特徴および利点は、後述の好ましい態様の詳細な 説明に記述する。またその一部は、その記述から明らかになるだろうし、あるい は本発明を実施すればわかるだろう。本発明のこれらの目的と利点は、本明細書 の説明とその請求の範囲に詳述する組成物および方法によって実現され、達成さ れる。 本発明液体製剤の有効性は、そのタンパク質そのものに固有の特徴と、生物活 性を決定するそれらの特徴を維持する本発明製剤の能力によって決まる。 一態様として、本発明は、安定な液体製剤中に血漿タンパク質を含む組成物を 提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質が凝固因子II、VII、I X、Ｘ、プロテインＣ、ＳおよびＺなどのビタミンＫ依存性血漿タンパク質の酵 素前 駆体型または活性型である組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質が非ビタミンＫ依存性 血漿タンパク質である組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質が凝固因子VIII、フォ ン・ヴィレブランド因子などである組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質を水系液体製剤として 提供する組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質を非水系液体製剤とし て提供する組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質を親水性非水系液体製 剤として提供する組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質を水系/非水系混合液 体製剤として提供する組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質を体温またはその付近 で機能的に安定にする組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質を冷蔵温度またはその 付近で機能的に安定にする組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質を前もって水和するこ となく送達できるようにする組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質を注射によって送達で きるようにする組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質をキチンヒドロゲルや キトサンヒドロゲルのような生物起源の生体再吸収性ヒドロゲルによって送達で きるようにする組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質を鼻腔内に送達できる ようにする組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質を吸入によって送達で きるようにする組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その血漿タンパク質を経口的に送達できる ようにする組成物を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、血漿タンパク質の先天性または後天性欠乏 症を、その欠乏血漿タンパク質の送達によって治療する方法を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その欠乏タンパク質の送達が持続注射また は持続注入によってなされる血漿タンパク質欠乏症の治療法を提供する。 もう１つの態様として、本発明は、その欠乏タンパク質の持続的送達が、キト サンヒドロゲルやNOC-キトサンヒドロゲルのような生物起源の生体再吸収性ヒド ロゲルからの拡散によってなされる血漿タンパク質欠乏症の治療法を提供する。 上記の総論と下記の詳細な説明は、どちらも単なる例示的説明に過ぎず、請求 の範囲に記載される本発明をさらに説明しようとするものであると解釈すべきで ある。 IV. 図面の簡単な説明 図1．因子IX安定性のCaCl₂濃度依存性 0〜10mMの範囲の様々な濃度のCaCl₂を 含む0.01Mヒスチジン、0.1M NaCl(pH6.8)中100単位/mLの因子IX-M試料を、37℃ で50日間まで保温し、実施例１の方法に従って因子IX活性をアッセイした。試験 した各CaCl₂濃度について半減期（単位：日）を、その濃度に対してプロットし た。安定性は、2mM CaCl₂によって急激に上昇し、5mM CaCl₂で最高となり、10mM CaCl₂まで同一水準だった。 図2．滅菌溶液中の因子IX-M（100単位/mL）の37℃における安定性 実施例3に 要約するデータをグラフにしたものである。CaCl₂の添加は、カルシウムを含ま ない同じ緩衝液と比較して因子IXの安定性を著しく増大させるが、ショ糖を添加 しても安定性はそれ以上増大しない。カルシウム/ショ糖製剤にリジンを加えたO ctapharma社の処方は、因子IXの安定性をリジンなしの処方より有意に減少させ る。 図3．因子IX-M安定性+/-10mM CaCl₂のpH依存性 10mM CaCl₂を含むまたは含ま ない様々なpHの0.01Mヒスチジン、0.01M NaCl中100単位/mLの因子IX-M試料を、3 7℃で0〜42日間保温し、実施例１の方法に従って因子IX活 性をアッセイした。その半減期（単位：日）をpHに対してプロットした。安定性 はいずれのpHについてもカルシウム存在下の方がカルシウム不在下よりもはるか に高かった。各カルシウムレベル内では、中性pHに近いほど安定性が高く、カル シウムの存在下pH6.0〜6.8で最大の安定性を示した。 図4．因子IXは高濃度で保温すると活性化の証拠を示す 0.01Mヒスチジン、0. 1M NaCl、10mM CaCl₂（pH6.8）中の因子IX-M試料を、10単位(u)/mLから600u/mL までの様々な因子IX濃度で、37℃で保温した。各濃度について初期活性に対する パーセントを37℃で日数に対してプロットした。10u/mLから100u/mLまでの低い 因子IX濃度では、安定性に対する濃度の影響は認められなかった。因子IXの濃度 を増大させた場合、活性はいったん増大した後、低下し、その活性ピークは因子 IX濃度が高いほど早く現われた。これは、因子IXが高濃度で活性化を示し、活性 のスパイク（棘波）を示した後、いったん活性化すると因子IXが安定性を失うの で活性が低下することを示している。 図5A,5B．高濃度では因子IX-Mの安定性がpH6.0〜6.2で最大になる 0.01Mヒス チジン、0.1M NaCｌ、10mM CaCl₂、pH6.0または6.8中600u/mLの因子IX-M試料を3 7℃で0〜50日間保温し、実施例１の方法に従って因子IX活性をアッセイした。初 期活性に対するパーセントと無損傷FIX-Mパーセントを37℃での日数に対してプ ロットした。pH6.2（図5A）では、無損傷パーセントと活性パーセントがどちら も40〜45日の半減期を持った。pH6.8（図5B）では、活性率は15〜20日にスパイ クを示し、40〜45日の半減期で低下するが、無損傷パーセントは14日で０まで低 下した。高因子IX濃度では、高い方のpHでこのタンパク質が不安定化し、低い方 のpHで安定性が増大する。 図6．37 ℃で保温したPPG、グリセロールおよびPMS製剤中の因子IX 実施例４ で得たデータをグラフにしたものである。安定性はPPGによって最大となり、そ の半減期は37℃で14日である。元の物質を水またはグリセロールで復元した場合 、得られる半減期はそれぞれ２日および４日短かった。PMSによって得られる安 定性は最も低く、その半減期は5.5日だった。 図7．37 ℃における因子VIII PPG製剤と因子VIII PEG製剤 実施例５で得 たデータをグラフにしたものである。因子IXと同様に、PPGが因子VIIIに最大の 安定性を与える。水で復元すると安定性がいくらか低くなり、PEGでは活性が著 しく不安定化する。 図8．10mM CaCl₂ を伴う因子IXの37℃における安定性 実施例６で得たデータ をグラフにしたものである。試験した３つのpH値での結果をそれぞれプロットす ると、凝固活性の半減期は38日から58日まで変動し、pH6.2では活性化を示唆す るわずかに二相性の曲線を与えた。安定性はpH6.0〜6.2の範囲で最大だった。 図9．30mM CaCl₂ を伴う因子IXの37℃における安定性 実施例６で得たデータ をグラフにしたものである。試験した３つのpH値での結果をそれぞれプロットす ると、pH6.2で活性化の証拠が観察された。安定性はpH5.8〜6.2の範囲で最大だ った。 図10．100mM CaCl₂ を伴う因子IXの37℃における安定性 実施例６で得たデー タをグラフにしたものである。試験した３つのpH値での結果をそれぞれプロット すると、pH6.0とpH6.2で40日後に活性化の証拠がわずかに観察された。 安定性はpH5.8で最大だった。 図11．様々なCaCl₂濃度を伴う因子IXのpH5.8温度37℃における安定性 図６で 得たデータをグラフにしたものである。 図12．様々なCaCl₂濃度を伴う因子IXのpH6.0温度37℃における安定性 図６で 得たデータをグラフにしたものである。100mM CaCl₂で観察される浅い減衰曲線 は、活性化を反映しているのかもしれない。 図13．様々なCaCl₂濃度を伴う因子IXのpH6.2温度37℃における安定性 図６で 得たデータをグラフにしたものである。100mM CaCl₂で観察される浅い減衰曲線 は、活性化を反映していると思われ、30mM CaCl₂では明らかな活性化が観察され た。 図14A〜14D．SDS-PAGE 実施例６で得たデータを示す。試験したpH/CaCl₂の全 組合わせに関し、クーマシーブルー染色したSDS-PAGEゲルを、０日と56日ついて 図14Aに、また全ての時点について図14B、14Cおよび14D（還元ゲル） に示す。 図14A内のレーンは次の通りである：レーン1，広範囲分子量（MW）標品；レー ン2，空；レーン3,10mM Ca,pH5.8；レーン4,10mM Ca,pH6.0；レーン5,10mM Ca,p H6.2；レーン6,30mM Ca,pH5.8；レーン7,30mM Ca,pH6.0；レーン8,30mM Ca,pH6. 2；レーン9,100mM Ca,pH5.8；レーン10,100mM Ca,pH6.0；レーン11,100mM Ca,pH 6.2。図14B〜14D内のレーンは次の通りである：レーン1，広範囲ＭＷ標品；レー ン2，空；レーン3，第０日；レーン4，第21日；レーン5，第28日；レーン6，第3 5日；レーン7，第42日；レーン8，第49日；レーン9，第56日；レーン10，空；レ ーン11，広範囲MW標品。 ０時点では、因子IXが全ての製剤で同じに見えた。例外として、100mM CaCl₂ では還元ゲルに高分子量スメアが認められたが、これはおそらく非特異的塩効果 によるものだろう。100mM CaCl₂試料を水で希釈した場合には、高分子量スメア は認められなかった（図14D）。56日目には、全ての試料で断片化が認められ、 還元ゲルではそれがとりわけ明白だった。図14Aのレーン3、5および8（pH5.8とp H6.0の10mM CaCl₂およびpH6.2の30mM CaCl₂）では、より多くの断片化が認めら れる。 図15．10mM CaCl₂ を伴う因子IXの4℃における安定性 実施例７で得たデータ をグラフにしたものである。最初の100％値を越える凝固活性の上昇（これは活 性化を示す）が、600単位/mL（70日）、300単位/mL（140日）、200単位/mL（210 日）および100単位/mL（410日）で観察される。25単位/mLと50単位/mLでは410日 後まで活性化の証拠は観察されない。これらの試料には410日時点で活性の80％ 以上が残っていた。 図16．凍結乾燥因子VIIIの非水系液体製剤中37℃における安定性 実施例８で 得たデータをグラフにしたものである。 図17．因子VIIIの安定性はポリプロピレンオリゴマーサイズと相関する PPG オリゴマーサイズ（すなわちそのポリプロピレングリコールを構成するモノマー 単位の数）に対してプロットすると、観察される半減期は、PPG1000（これは平 均17個のモノマー単位を含有する）までオリゴマーサイズとほぼ比例する。 図18，図19．凍結乾燥因子IXの非水系液体製剤中37℃における安定性 実施例 ９で得たデータをグラフにしたものである。図18は水、トリプロピレングリコー ルおよび種々のポリエチレングリコールで得られたデータを示す。図19は種々の ポリプロピレングリコールで得られたデータを示す。 図20．アローモデル3000移植用ポンプを用いた因子VIII（AHF-M）の試験管内 放出 実施例10で得たデータをグラフにしたものである。このグラフからわかる ように、因子VIII活性は第６日までにその95％が失われた。しかしその原因は、 AHF-M溶液をポンプに充填する工程中に滅菌性が損なわれたときの細菌の混入に よるものであることがわかった（細菌の混入は寒天平板コロニーおよび培養評価 によって確認した）。 図21．アローモデル3000移植用ポンプを用いた37℃における因子IXの試験管内 放出 実施例10で得たデータをグラフにしたものである。このグラフからわかる ように、ポンプからの流出液中の因子IX活性は、13日間の稼動中、比較的一定し て減少した。半減期は18〜20日で、ポリプロピレン管中で観察された半減期の約 半分だった。13日目に、流出する活性は出発活性の60％だった。因子IX流出液中 に細菌は検出されなかった。 図22．アローモデル3000移植用ポンプを用いて試験管内に送達される因子IX-M の単位数 実施例10で得たデータをグラフにしたものである。流出量は正確に2m L/日に維持された。送達される因子IXの一日あたりの単位数は最初の５日間は18 5〜210単位で、第6〜11日の間は160〜170単位に減少し、最後の２日間はさらに1 10〜140単位に減少した。 図23．アローモデル3000移植用ポンプ中37℃におけるAHF-Mの安定性 実施例1 1で得たデータをグラフにしたものである。ポンプから流出させた因子VIII試料 の活性と、静止状態のポンプ貯蔵槽から採取した因子VIII試料の活性は、有意に 相違しなかった（ポンプ流出液の第１試料が示す急落は、ポンプの管系をパージ するのに使用した食塩水溶液で流出液が希釈されたためである）。この結果は、 ガラス表面とゴム表面が、ポンプを出た因子VIIIの活性を変化させないことを示 唆している。 図24．ポリプレピレン管中と比較したアローモデル3000移植用ポンプ中37℃に おけるAHF-Mの安定性 実施例11で得たデータをグラフにしたものである。静止 状態のチタン製ポンプ貯蔵槽から採取した因子VIIIに関する減衰曲線を、以前の 実験でポリプロピレン管中で保温した因子VIIIに関する減衰曲線と比較したとこ ろ、減衰はポリプロピレン管中よりポンプ中の方が速かった。因子VIIIをアロー モデル3000ポンプのチタン製貯蔵槽中37℃で保温した時に観察される安定性が、 因子VIIIをポリプロピレン管中37℃で保温した時に観察される安定性より低いと いうことは、これら２つの材質の因子VIIIとの生物適合性に相違があることを示 唆している。 図25．アローモデル3000移植用ポンプ中37℃における因子IX-Mの安定性 実施 例12で得たデータをグラフにしたものである。ポンプから流出させた因子IX試料 の活性と、静止状態のポンプ貯蔵槽から採取した因子IX試料の活性は、有意に相 違しなかった。因子VIIIの場合と同様に、ポンプ貯蔵槽内に静置された因子IXと ガラス/シリコーンゴム排出力テーテルを通して排出された因子IXの間には相違 が認められず、ガラスとシリコーンゴムがポンプから出た因子IXの効力を変化さ せないことが示された。 図26．ポリプロピレン管中と比較したアローモデル3000移植用ポンプ中37℃に おけるヒスチジン/NaCl/CaCl₂溶液中の因子XI-M 実施例12で得たデータをグラ フにしたものである。静止状態のチタン製ポンプ貯蔵槽から採取した因子IXに関 する減衰曲線を、以前の実験でポリプロピレン管中で保温した因子IXに関する減 衰曲線と比較したところ、ポリプロピレン管中での半減期が約35日であったのに 対し、チタン製貯蔵槽内での生体外半減期は約25日だった。チタン製貯蔵槽内で の因子IXの半減期が短いのは、第１アッセイ時点（第２日）における因子IX活性 の初期低下（約25％）によるものと思われ、このことは、因子IXの一部がポンプ 貯蔵槽の内表面に結合するものの、残りの部分は影響を受けないことを示唆して いる。 V. 好ましい態様の詳細な説明 A. 定義 特に断わらない限り、本明細書で使用するすべての技術用語と科学用語は、本 発明が属する技術分野の技術者が一般に理解する意味と同じ意味を持つ。本明細 書で言及する特許と刊行物はすべて参考文献として本明細書の一部を構成する。 本明細書において「血漿」とは、凝固前に認められるようなヒトまたは動物の 血液の液体非細胞成分を指す。これは凝固後に得られる血清とは区別される。 本明細書において「血漿タンパク質」とは、正常なヒトまたは動物の血漿中に 認められる可溶性タンパク質を指す。これらは凝固タンパク質、抗体、アルブミ ン、リポタンパク質、補体タンパク質などを包含するが、これらに限るわけでは ない。 本明細書において「ビタミンＫ依存性血漿タンパク質」とは、正常な個人また は動物の血漿中に認めらるタンパク質であって、凝血原または抗凝血因子として 凝固カスケードの一部を構成し、その合成にビタミンＫの存在が必要なものを指 す。これらは酵素前駆体型または活性型として存在する。ビタミンＫ依存性血漿 タンパク質には、因子II、因子VII、因子IX、因子Ｘ、プロテインＣ、プロテイ ンＳ、およびプロテインＺが含まれる。 本明細書において「非ビタミンＫ依存性血漿タンパク質」とは、正常な個人ま たは動物の血漿中に認められるタンパク質であって、凝血原、抗凝固因子または 補因子として凝固カスケードの一部を構成し、その合成にビタミンＫの存在が必 要でないものを指す。これらは酵素前駆体型、非活性補因子型または活性型とし て存在する。非ビタミンＫ依存性血漿タンパク質には因子VIIIとフォン・ヴィレ ブランド因子が含まれる。 本明細書において「因子IX」（または「凝固因子IX」）とは、内因系凝固経路 の一構成要素で、血液凝固に必須な血漿糖タンパク質を指す。生理活性因子IXの 先天性Ｘ連鎖欠乏症は、生命にかかわる可能性のある疾患、血友病Ｂをもたらす 。 本明細書において「因子VIII」（または「凝固因子VIII」）とは、内因系凝固 経路の一構成要素で、血液凝固に必須な血漿糖タンパク質を指す。生理活性因子 IXの先天性Ｘ連鎖欠乏症は、生命にかかわる可能性のある疾患、血友病Ａをも たらす。 本明細書において「液体製剤」とは、そこに含まれる構成分子が自由運動しつ つも分離する傾向がないことを特徴とする、液体として認められる組成物を指す 。液体製剤には、水系液体と非水系液体が含まれる。 本明細書において「水系液体製剤」とは、水を一成分として含有する液体組成 物を指す。 本明細書において「非水系液体製剤」とは、水を一成分として含まない液体組 成物を指す。 本明細書において「親水性非水系液体製剤」とは、水を一成分として含まず、 しかも、水に対して強い親和性を持つ液体を含有する液体組成物を指す。 本明細書において「水系/非水系混合液体製剤」とは、水ともう１つの液体組 成物の混合物を含有する液体組成物を指す。 本明細書において「体温」とは、ヒトまたは動物の正常時の生理学的温度を指 す。ヒトの平均体温は摂氏37度（37℃）である。 本明細書において「冷蔵温度」とは、凍結が不可能な冷蔵温度を指す。摂氏4 度（4℃）は冷蔵温度の一つである。 本明細書において「復元」とは、液体の添加により固体物質を液体の溶液また は懸濁液に溶解または再懸濁することを指す。 本明細書において「再水和」とは、水の添加による液体状態への復元を指す。 本明細書において「予防」とは、症状の発生を防止する処置の適用を指す。 本明細書において「持続的送達」とは、ヒトまたは動物の体内に物質を連続的 に導入することを指す。 本明細書において「注射」とは、ヒトまたは動物の体内に液体を力で押し込む ことを指す。 本明細書において「ヒドロゲル」とは、相当部分が水からなり、その中にポリ マーまたはその混合物が溶解または分散している半固形組成物を指す。 本明細書において「鼻腔内送達」とは、鼻腔および副鼻腔の粘膜を通した吸収 によってヒトまたは動物の体内に物質を導入することを指す。 本明細書において「吸入送達」とは、胚を通した吸収によってヒトまたは動物 の体内に物質を導入することを指す。 本明細書において「経口送達」とは、口を通した摂取によってヒトまたは動物 の体内に物質を導入することを指す。 本明細書において「非経口送達」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮 下および関節内注射ならびに注入を含む投与法を指す。 本明細書において「安定性」とは、ある物質の活性および/または機能を決定 する特徴の保持を指す。 本明細書において「医薬的に許容できる担体」とは、無毒性の固体、半固体ま たは液体賦形剤、希釈剤、封入材料または任意のタイプの製剤補助剤を指す。 本明細書において「患者」とは、医療および/または処置を受けるヒトまたは 動物の個体を指す。 本明細書において「先天性欠乏症」とは、正常な個体中に認められる化合物を 遺伝の結果として欠く個体の状態を指す。先天性欠乏症は、現時点では保証され た治療法でない移植術や遺伝子的介入を行なわなければ、いつまでも続く。 本明細書において「後天性欠乏症」とは、正常な個体中に認められる化合物を 先天的でない作用の結果として欠く個体の状態を指す。後天性欠乏症は他の状態 またはそれらの処置の一時的結果である場合も多いが、それでもなお消耗性であ り、生命を脅かす。 B. 好ましい態様 本発明の第１の好ましい態様は、１種またはそれ以上の血漿タンパク質を含有 する安定な液体製剤に向けられる。本発明の安定液体製剤は安定であること、す なわちその製剤に含まれる血漿タンパク質の活性の少なくとも50％は、37℃で少 なくとも１日（24時間）、より好ましくは少なくとも13日間、最も好ましくは少 なくとも30日間維持され、もしくは4℃で少なくとも540日間維持されることが好 ましい。血漿タンパク質の活性は、当業者に知られる方法および技術のいずれで 測定してもよい。 本発明のこの態様によれば、どの血漿タンパク質がその安定液体製剤に含まれ ていてもよい。これらの血漿タンパク質は、まだ活性化されていない酵素前駆体 または補因子の形態にあってもよいし、あるいは活性型であってもよい。好適な 血漿タンパク質は、ヒトまたは哺乳動物の血漿から当業者に知られ当業者が利用 できる精製法によって、または一般的な組換えDNA技術に従って導入されたヒト または哺乳動物の血漿タンパク質を発現させる遺伝子を含有する組換え組織培養 、ウイルス、酵母、細菌などの上清またはペーストから、または一般的なトラン スジェニック技術に従って導入されたヒト血漿タンパク質を発現させる遺伝子を 含有するトランスジェニック動物の体液（例えば血液、乳、リンパ液、尿など） から得ることができる。本発明液体製剤は、所望に応じてさらに１種またはそれ 以上の追加タンパク質を含有してもよく、その追加タンパク質としては、他の血 漿タンパク質、トロンビン阻害剤のようなプロテアーゼ阻害剤、担体タンパク質 （フォン・ヴィレブランド因子を含むが、これに限らない）、ペプチド、および それらの誘導体が挙げられる。 特に好ましい本発明の態様では、その血漿タンパク質がビタミンＫ依存性血漿 タンパク質である。そのようなビタミンＫ依存性血漿タンパク質の具体例には、 因子II、因子VII、因子IX、因子Ｘ、プロテインＣ、プロテインＳおよびプロテ インＺがあるが、これらに限るわけではない。そのビタミンＫ依存性血漿タンパ ク質は、因子IXであることが好ましい。 本発明の特に好ましいもう１つの態様では、その血漿タンパク質が非ビタミン Ｋ依存性血漿タンパク質である。非ビタミンＫ依存性血漿タンパク質には、因子 VIIIとフォン・ヴィレブランド因子が含まれるが、これらに限らない。その非ビ タミン依存性血漿タンパク質は因子VIIIであることが好ましい。 本発明の特に好ましいさらなる態様では、その液体製剤が水系液体製剤である 。その水系液体製剤は、その製剤のpHが予定したレベル、例えば5.8〜6.8の範囲 に維持されるように、１種またはそれ以上のpH緩衝化合物を含有することが好ま しい。本水系液体製剤に使用されるpH緩衝化合物は、アミノ酸またはアミノ酸の 混合物であることが好ましく、そのpH緩衝化合物がヒスチジンまたはヒスチジン と他のアミノ酸との混合物であれば、より好ましい。 あるいは、上記pH緩衝化合物が製剤のpHを予定のレベル、例えば5.8〜6.8の範 囲に維持し、かつ、カルシウムイオンをキレートしない薬剤であることも好まし い。そのようなpH緩衝化合物の具体例としては、イミダゾールと酢酸イオンが挙 げられるが、これらに限るわけではない。 pH緩衝化合物は、本水系液体製剤のpHを予定のレベルに維持するのに適した任 意の量で存在できる。pH緩衝化合物がアミノ酸である場合は、そのアミノ酸の濃 度が0.1ミリモル/リットル（0.1mM）〜1000mM（1M）であることが好ましい。ま た、このアミノ酸の濃度は5mM〜100mMであることがより好ましく、10mM〜50mMが 最も好ましい。 pH緩衝化合物は、本水系製剤のpHを少なくとも4.0のレベルに維持することが 好ましい。血漿タンパク質が因子IXである場合は、pH緩衝化合物がpHを5.5から8 .0までのレベルに維持することがより好ましく、それが5.5から6.8までのレベル であればさらに好ましく、5.8から6.2までのレベルであれば最も好ましい。 また本発明水系液体製剤が、１種またはそれ以上の浸透性調節剤、すなわちそ の製剤の浸透性（例えば張性、オスモル濃度および/または膨張圧）を、受容す る個体の血流および血球に合ったレベルに調節する化合物を含有することも好ま しい。この浸透性調節剤はカルシウムイオンをキレートしないことが好ましい。 この浸透性調節剤は、本製剤の浸透性を調節する化合物であれば、当業者に知 られ当業者が利用できるいずれの化合物であってもよい。当業者は、ある与えら れた浸透性調節剤が本発明製剤での使用に適しているかどうかを実験的に決定す ることができる。好適なタイプの浸透性調節剤の具体例としては、塩化ナトリウ ムや酢酸ナトリウムなどの塩、ショ糖やマンニトールなどの糖類、グリシンなど のアミノ酸、これらの薬剤および/またはこれら薬剤タイプの１またはそれ以上 の混合物が挙げられるが、これらに限るわけではない。 浸透性調節剤は、その製剤の浸透性を調節するに足る任意の濃度で存在できる 。浸透性調節剤は本発明製剤のオスモル濃度を50〜1000ミリオスモル/L（mOsm/L ）に調節できる量で存在することが好ましく、それが100〜 500mOsm/Lであればより好ましく、150〜350mOsm/Lであれば最も好ましい。 塩または塩の組み合わせを浸透性調節剤として使用する場合は、その総濃度が 1mM〜1Mであることが好ましく、25mM〜500mMであればさらに好ましく、50mM〜15 0mMが最も好ましい。 本水系液体製剤は、さらにカルシウムイオンのような多価金属イオンの発生源 を含有することが好ましい。本発明形態製剤の安定化に役立ち、受容する個体に 有害な影響を与えないものであれば、いずれの多価金属イオンも使用できる。好 適な金属イオンは、これら２つの基準に基づいて当業者が実験的に決定できる。 また、そのような金属イオンの好適な発生源は知られていて、無機塩や有機塩が それに含まれる。 本水系液体製剤はカルシウムイオン、マグネシウムイオンおよび/またはマン ガンイオンのような二価金属イオンの発生源を含有することが好ましい。より好 ましくは、本水系液体製剤は塩化カルシウムのようなカルシウムイオンの発生源 を含有する。 本水系液体製剤中のカルシウムイオンのような二価金属イオンの濃度は、0.1m M〜1Mであることが好ましく、より好ましくは2mM〜200mM、最も好ましくは10mM 〜100mMである。 本発明水系液体製剤の好ましい態様では、その血漿タンパク質が因子IX、pH緩 衝化合物がアミノ酸であるヒスチジン、浸透性調節剤が塩化ナトリウムであり、 カルシウムイオンの発生源が塩化カルシウムである。ヒスチジンの濃度は約10mM 、NaClの濃度は約100mMであることが好ましく、カルシウムイオンの濃度はその 製剤のpHによって変動する。水系製剤のpHが約6.2である場合は塩化カルシウム 濃度が約10mMであることが好ましく、pHが約6.0である場合はCaCl₂濃度が10mMと 30mMの間にあることが好ましく、pHが約5.8である場合はCaCl₂濃度が10mMと100m Mの間にあることが好ましい。 本発明の特に好ましいもう１つの態様では、その液体製剤が非水系液体製剤で ある。本発明のこの態様では、それがその製剤に含まれる血漿タンパク質に安定 性を与えるものである限り、好適な非水系液体のいずれを使用してもよい。この 非水系液体は親水性液体であることが好ましい。好適な非水系液体の具体例とし ては、グリセロール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ポリジメチルシロキサン （PMS）、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコー ル、ポリエチレングリコール（"PEG"）200、PEG300あるいはPEG400のようなエチ レングリコール類、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、ポリ プロピレングリコール（"PPG"）425、PPG725、PPG1000、PPG2000、PPG3000ある いはPPG4000のようなプロピレングリコール類が挙げられる。 好ましくは、非水系液体製剤への混和に先立って血漿タンパク質を凍結乾燥す る。その血漿タンパク質は凍結乾燥因子VIIIまたは凍結乾燥因子IXであることが より好ましい。 本発明非水系液体製剤の極めて好ましい態様では、その血漿タンパク質が因子 IXであり、非水系液体がPEG200のようなエチレングリコールであるか、トリプロ ピレングリコール、PPG425、PPG725、PPG1000あるいはPPG2000などのプロピレン グリコールである。本発明非水系液体製剤の極めて好ましいもう１つの態様では 、その血漿タンパク質が因子VIIIであり、非水系液体がPPG425、PPG725またはPP G1000などのプロピレングリコールである。 本発明の特に好ましいもう１つの態様では、その液体製剤が水系/非水系混合 液体製剤である。本発明のこの態様では、その水系/非水系液体製剤がそこに含 まれる血漿タンパク質に安定性を与える限り、上述のような任意の好適な非水系 液体液体製剤を上述のような任意の水系液体製剤と共に使用できる。このような 製剤中の非水系液体は親水性液体であることが好ましい。好適な非水系液体の具 体例としては、グリセロール、DMSO、PMS、あるいはPEG200、PEG300またはPEG40 0のようなエチレングリコール類、あるいはPPG425、PPG725、PPG1000、PPG2000 、PPG3000またはPPG4000のようなプロピレングリコール類が挙げられる。 本発明の安定液体製剤によれば、１種またはそれ以上の血漿タンパク質を凍結 状態または非凍結液体状態で貯蔵することができる。本安定液体製剤は少なくと も−170℃の温度で保存されることが好ましく、より好ましくは少なくとも0℃、 さらに好ましくは0.1℃から42℃までの温度、最も好ましく4℃から37℃までの温 度で保存される。 本発明の安定液体製剤は、非凍結状態で少なくとも24時間の間、その血漿タン パク質の活性の少なくとも50％を維持する。好ましくは、活性の少なくとも50％ が少なくとも２日間保たれ、より好ましくは少なくとも30日間、さらに好ましく は少なくとも180日間、さらに好ましくは少なくとも540日間、最も好ましくは少 なくとも３年間保たれる。 個体内の１種またはそれ以上の血漿タンパク質の標準レベルまたは正常レベル が低下することによって起こる血友病のような状態が（血友病Ａ治療用の）因子 VIIIや（血友病Ｂ治療用の）因子IXのような１種またはそれ以上の血漿タンパク 質を投与することによって治療できることは理解されるだろう。したがって、本 発明の第２の好ましい態様は、１種またはそれ以上の血漿タンパク質が欠乏して いる患者の治療法であって、本発明の安定液体製剤をその患者に投与することか らなる方法に向けられる。 持続投与は、当業者に知られている任意の方法および技術に従って行なうこと ができ、そのような方法には、アローモデル3000（Arrow International社，マ サチューセッツ州ウォルポール）やミニメッド2001（MiniMed Technologies社， カリフォルニア州シルマー）のような外科的に移植できるポンプを用いる持続注 射または持続注入；ミニメッド504S（MiniMed Technologies社）やH-トロンV100 （H-Tron V100;Disetronic Medical Systems社，ミネソタ州ミネトンカ）のよう な体外装着型ポンプを用いる注射または注入；キトサンヒドロゲルやN,O-カルボ キシメチルキトサン（NOC-キトサン）ヒドロゲルのような生物起源の生体再吸収 性ヒドロゲル単体からの拡散、もしくはそれらヒドロゲルをヒドロゲルの多孔性 および/またはヒドロゲルの安定性および/またはタンパク質放出の速度を調節す るポリリジンやポリプロピレングリコールなどの荷電または非荷電ポリマー剤と 組み合わせたものからの拡散；あるいは、ポリプロピレングリコールのような合 成生体再吸収性ヒドロゲル単体からの拡散、またはそれらヒドロゲルをヒドロゲ ルの多孔性および/またはヒドロゲルの安定性および/またはタンパク質 放出の速度を調節するポリリジンのような荷電または非荷電ポリマー剤と組み合 わせたものからの拡散がある。 持続投与用の血漿タンパク質は、個々の患者の臨床状態、その組成物の送達部 位、投与法、投与スケジュールと、従事者が知るその他の要素を考慮して、適切 な医療行為となるような方法で、製剤化し、投与することが好ましい。本発明の 目的に関して血漿タンパク質の「有効量」は上述のような考慮をして、そのよう に決定される。 非経口的に投与される血漿タンパク質の総医薬有効量は、好ましくは、血漿タ ンパク質を約１単位/mLから約2000単位/mLまでの濃度で提供することができる量 になるだろう。この投与量は、約50単位/mLから約1500単位/mLまでの濃度を与え るに足る量であることがより好ましく、それが約100単位/mLから約1000単位/mL であればさらに好ましくは、約600単位/mLが最も好ましい。適切な投与量を選択 する際の要因は、それによって得られる結果（例えば循環系内の血漿タンパク質 レベルの増大によって測定されるような結果）である。変化を観察するのに必要 な処置の長さと、応答が起こるのに必要な処置後の期間は、所望する効果と治療 される個体によって変動するだろう。 一般的な提案として、本発明にしたがって調剤される血漿タンパク質の純度は 、好ましくは、そのタンパク質に最適な安定性をもたらすことが通常の当業者に 知られているような適当な純度だろう。例えば、その血漿タンパク質が因子IXで ある場合、その因子IXは超高純度であることが好ましい。その血漿タンパク質は 、その血漿タンパク質が製造、貯蔵および/または使用中に断片化、活性化及お よび/または分解する原因となる物質を除去するために、複数のクロマトグラフ ィー精製段階（例えばアフィニティークロマトグラフィーや、好ましくは免疫ア フィニティークロマトグラフィーなど）にかけられていることが好ましい。精製 によって除去することが好ましいそのような物質の具体例には、トロンビンと因 子IXa；インターαトリプシンインヒビターやプレアルファトリプシンインヒビ ターのようなその他のタンパク質夾雑物；脂質のような非タンパク質夾雑物；リ ポタンパク質のようなタンパク質夾雑物と非タンパク質夾雑物の混合物がある。 本発明の製剤に使用される血漿タンパク質の濃度は、当業者が実験的に決定し たときにその血漿タンパク質の安定性が最大となるように選択することが好まし い。例えば、その血漿タンパク質が因子IXである場合、本発明製剤中の因子IXの 安定性は低濃度で最大となり、因子IX濃度が増大するにつれて減少する傾向があ る。例えば、本発明製剤の一態様（0.01Mヒスチジン、0.10M塩化ナトリウム、0. 01M塩化カルシウム、pH6.8）では、約100単位/mL（0.4mg/mL）未満の因子IX濃度 において、ARCが調製した因子IX免疫アフィニティー精製品は、37℃で56日間保 温しても、因子IXaへの活性化の証拠を示さなかった。しかし、より高い因子IX 濃度（200〜600単位/mL）では、同じ因子IX免疫アフィニティー精製品を37℃で 保温した時に、活性化の証拠が認められ、その活性化の程度はタンパク質濃度が 増大するにつれて増加した（図4）。本発明製剤のより酸性な態様（例えばpH5.8 〜6.2）で、600単位/mL（2.4mg/mL）の同じ因子IX免疫アフィニティー精製品を 保温したところ、その活性化はあったとしてもはるかに低かった（図５および図 8〜14）。 本発明の好ましい態様では、１種またはそれ以上の血漿タンパク質が医薬的に 許容できる担体に含有される。この担体は、等張性と化学的安定性を増進させる 物質などの添加剤を少量含有することが好ましい。これらの物質は使用する投与 量と濃度で受容者にとって無毒性であり、これらには次に挙げるものが含まれる ：リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、乳酸、酒石酸、その他の有機酸またはそ れらの塩のような緩衝剤；トリスヒドロキシメチルアミノメタン（TRIS）、重炭 酸塩、炭酸塩、その他の有機塩基およびそれらの塩；アスコルビン酸などの抗酸 化剤；低分子量（例えば約10残基未満の）ポリペプチド、例えばポリアルギニン 、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸など；タンパク質、例え ば血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えばポ リビニルピロリドン（PVP）、ポリプロピレングリコール（PPG）、ポリエチレン グリコール（PEG）など；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラ ギン酸、ヒスチジン、リジン、またはアルギニンなど；セルロースまたはその誘 導体、グルコース、マンノース、ショ糖、デキストリン、あるいはヘパリ ン、硫酸コンドロイチン、硫酸デキストランのような硫酸炭水化物誘導体を含む 単糖類、二糖類、その他の炭水化物；多価金属イオン、例えばカルシウムイオン 、マグネシウムイオン、マンガンイオンを含む二価金属イオンなど；EDTAのよう なキレート剤；マンニトールやソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムや アンモニウムのような対イオン；および/またはポリソルベートやポロキサマー のような非イオン界面活性剤。 このような組成物は、経口投与、直腸内投与、非経口投与、皮下投与、大槽内 投与、腟内投与、腹腔内投与、局所投与（散剤、軟膏、滴剤または経皮吸収パッ チなどによる）、頬腔内投与することができ、また経口スプレーまたは鼻スプレ ーとして肺に投与したり、吸入剤として投与できる。医薬的に許容できる担体は 、キチンヒドロゲルやキトサンヒドロゲルのような生物起源の生体再吸収性ヒド ロゲルであることが好ましい。 １種またはそれ以上の血漿タンパク質を徐放系によって投与するのもよいだろ う。徐放性組成物の好適例としては、フィルムやマイクロカプセルのような成型 品の形態にある半透過性ポリマー基盤が挙げられる。徐放性基盤には、ポリ乳酸 （米国特許第3,773,919号；欧州特許第58,481号）、L-グルタミン酸とγ-エチル -L-グルタメート（U.Sidmanら,Biopolymers 22:547-556(1983)）またはポリ(メ タクリル酸2-ヒドロキシエチル)またはエチレンビニルアセテート(R.Langerら,J . Biomed. Mater.Res.15:167-277(1981);R.Langer,Chem.Tech.12:98-105(1982) ）のコポリマー、あるいはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸（欧州特許第133,988号 ）などがあるが、これらに限るわけではない。徐放性血漿タンパク質組成物には 、リポソームに封入した血漿タンパク質も含まれる。１種またはそれ以上の血漿 タンパク質を含有するリポソームは、当業者に知られている方法、例えばDE 3,2 18,121；Epsteinら,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82:3688-3692(1985)；Hwangら，P roc.Natl.Acad.Sci.(USA)77:4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,0 46；EP 143,949；EP 142,641；特願昭58-118008；米国特許第4,485,045号および 同第4,544,545号；EP 102,324に記述されているような方法のいずれで調製して もよい。リポソームは通常、小さい（約200〜800 オングストローム）単層型であり、その脂質含量は約30モル％コレステロール以 上で、その比率はその治療法が最適となるように選択される。 治療的投与に使用される１種またはそれ以上の血漿タンパク質を含有する組成 物は滅菌状態でなければならない。滅菌性は滅菌ろ過膜（例えば0.2ミクロン膜 ）を通してろ過するか、γ線照射によって、あるいは当業者に知られているその 他の適当な手段によって容易に達成することができる。治療用ポリペプチド組成 物は一般的には、例えば滅菌アクセス口を持つ容器や、皮下注射針で突き刺せる 栓を持つ静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。 これらの組成物は通常、単位用量容器または多用量容器、例えば密閉したアン プルやバイアルに、水溶液として、あるいは復元用の凍結乾燥製剤として保存さ れるだろう。凍結乾燥製剤の一例として、10mLバイアルに滅菌ろ過した1％(w/v) 血漿タンパク質水溶液（例えば因子IXまたは因子VIIIの水溶液）5mLを充填し、 得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、その凍結乾燥物質を滅菌注射水（ WFI）で復元することによって調製される。 さらに本発明は、本発明医薬組成物の１またはそれ以上の成分で満たされた１ またはそれ以上の容器を含む医薬パックまたはキットをも提供する。そのような 容器には、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機 関によって規定された形式で、ヒト投与に関する製造、使用または販売の該機関 による認可を反映する情報を付すことができる。さらに、本発明の組成物を他の 治療用化合物と組み合わせて使用してもよい。 本発明の好ましい態様は、安定な液体中の血漿タンパク質を、キットの一部と して提供する。より好ましい態様は、安定な液体中の血漿タンパク質を、注射に よってその血漿タンパク質を送達するためのキットとして提供する。より好まし いもう１つの態様は、安定な液体中の血漿タンパク質を、注射器および/または 針による注射用のキットとして提供し、そのキットには注射器および/または針 が含まれるが、それらに限るわけではない。より好ましいもう１つの態様は、安 定な液体中の血漿タンパク質を、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内または鼻 腔内送達用の持続注射または持続注入システムの貯蔵槽にその液体を注入するた めの キットとして提供する。 さらに好ましいもう１つの態様は、安定な液体中の血漿タンパク質を、その液 体をヒドロゲル内に組み込んだ後、その血漿タンパク質含有ヒドロゲルを皮下注 射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射などの注射によって、あるいは皮膚表面 、粘膜などを通した頬腔吸収、経皮、鼻腔内局所投与によって、あるいは吸入に よって鼻および/または肺に導入するためのキットとして提供する。より好まし いもう１つの態様は、注射または移植（皮下、経皮、筋肉内、腹腔内注射などの 注射を含むが、これらに限らない）用の微小球またはヒドロゲルに入った安定な 液体中の血漿タンパク質を送達するためのものである。 本発明のこれら様々な態様は、従来使用されてきた組成物および方法より有利 な点をいくつか持っている。 第１の利点は、本発明の血漿タンパク質製剤が、現場で調製しなくても、その まま使用できることである。これにより、そのタンパク質は、再水和が必要な凍 結乾燥製剤よりも速やかに送達できる。 第２の利点は、本発明が溶液状態の血漿タンパク質の安定性を増大させるとい うことである。本発明の製剤によれば、溶液状態の当該タンパク質を、従来使用 されてきた製剤を再水和した場合に可能な期間よりも長く、ある与えられた活性 レベルで貯蔵することができる。この安定性は冷蔵下および体温での貯蔵時に向 上する。体温で安定であることから、持続注射または持続注入送達システム内の 、皮下または体表面の貯蔵槽中に、その血漿タンパク質を保持しておくことがで きる。またこれは、本発明の組成物を注射または注入前にヒドロゲルに組み入れ 、その添加物を含むヒドロゲルからの拡散によって送達することをも可能にする 。 本発明の第３の利点は、余分な経費をかけたり冷蔵（冷凍）の制約を伴うこと なく、その血漿タンパク質を保存できるということである。本発明は、一例とし て、因子IXが冷蔵下4℃で活性を失うことなく１年以上にわたる長期間保存でき ることを立証すると共に、体温37℃で１ヶ月以上保存できることをも立証する。 冷蔵が不可能な状況の場合、本発明によれば、予防用または緊急用として、調製 済注射用血漿タンパク質を室温で保存しておくことができる。 第４の利点は、先天性または後天性血漿タンパク質欠乏症を、正常血漿中に認 められるレベルにより近く、かつ、正常な止血が達成されるレベルの血漿タンパ ク質を持続的に与えるような形で、予防的に処置できるということである。患者 をいつまでも衰弱させる累進的累積的回復不可能な組織損傷を防止するのは、絶 え間ない正常な止血状態である。出血エピソードとその結果起こる損傷の危険を 排除することにより、患者とその家族にとって人生の質が向上し、若い患者は小 さな子供にとって通常な活動により完全に参加することが可能になり、また年配 の患者は仕事を続け、社会に貢献することができる。 下記の実施例は単なる例示であって、添付の請求の範囲によって定義される本 発明の範囲を限定しようとするものではない。本発明の方法に本発明の思想と範 囲から逸脱することなく様々な変更や改良を加えうることは、当業者には明らか だろう。したがって本発明は、それらが添付の請求項とそれに相当するものの範 囲に含まれる限り、本発明を変更または改良したものをも包含するものとする。 本明細書で言及する特許と刊行物はすべて明白に、参考文献として本明細書の 一部を構成する。 VI. 実施例 A. 材料 凝固因子IX熱処理品（CFIX-HT）：プールヒト血漿から、陰イオン交換クロマ トグラフィーでビタミンＫ依存性凝固因子を捕捉した後、硫酸デキストランクロ マトグラフィーでそれらの因子を分離し、凍結乾燥し、ウイルス感染力を減少さ せるために乾熱処理することによって調製した中純度因子IX濃縮物。 Baxter/Hyland社（カリフォルニア州グレンデール）がARCのために製造したもの 。製品は10〜20％因子IXと、極めて少量の因子IIおよびＸからなる。そのタンパ ク質の大部分（70〜80％）は、インターαトリプシンインヒビター（IaI）であ る。 凝固因子IX溶媒/洗剤処理品（CFIX-SD）：CFIX-HTと同じクロマトグラフィー 段階（ただし、最後のクロマトグラフィー段階に先立って、ウイルスを失活させ るためにリン酸トリ-n-ブチル（TNBP）とトリトンX-100で処理した）を行 うことによって調製した中純度因子IX濃縮物。その他の点はCFIX-HTと同様。 因子IX-M（Hyland）：カリフォルニア州グレンデールのBaxter/Hyland社にお けるパイロットスケール生産にて、プールヒト血漿から調製された超高純度濃縮 物。その生産には、陰イオン交換クロマトグラフィー、溶媒/洗剤処理、固定化 金属イオン依存性抗ヒト因子IXモノクローナル抗体（抗FIX-Mab）の7.5リットル カラムでの免疫アフィニティークロマトグラフィー、および最終的な陰イオン交 換仕上げ段階を使用する。 因子IX-M（JHL）：メリーランド州ロックヴィルのARCジェローム・ホランド研 究所（ARC Jerome Holland Laboratory）で調製された超高純度濃縮。CFIX-SDを 復元し、40mM MgCl₂の存在下に抗FIX Mab樹脂１リットルにのせ、1M NaC/I10mM MgCl₂で洗浄し、クエン酸/NaCl緩衝液で溶出した。、"DEAE後"と呼ぶ調製物は、 マウスIgGとその他の夾雑物のレベルを下げるためにさらに陰イオン交換カラム で精製した。比活性とSDS-PAGEは、FIX-M調製品の純度がいずれも95％かそれ以 上であったことを示す。 アルファナイン（ARC/A9）：Alpha Pharmaceuticals社が、彼らの特許精製法 に従って、プールヒトARC血漿から得たDEAE溶出液をクエン酸バリウム吸着、溶 媒/洗剤処理、および硫酸デキストランアガロースでの２段階のアフィニテイー クロマトグラフィーにかけることによってARCのために調製したもので、Alpha社 の特許製剤中凍結乾燥体として提供された高純度因子IX濃縮物。安定性試験のた めにARC製剤中に透析したもの。 モノニン（ARC/M9）：この高純度因子IX濃縮物は、固定化した抗因子IXモノク ローナル抗体上での免疫アフィニティークロマトグラフィーと、その後のヘキシ ルアミンアガロースでのクロマトグラフィーを含む方法によって、Armour Pharm aceuticals社が製造した。 B. 実施例1：緩衝液、二価カチオンおよびその他の賦形剤が凝固因子IXの安 定性に与える影響 CFIX-M（JHL）/DEAEを0.01Mヒスチジン,0.1M NaCl,pH6.8(ヒスチジン-食塩水 ）に透析するか、0.02Mクエン酸ナトリウム（NaCit）,0.11 NaCl,pH6.8 （クエン酸-食塩水）中に放置した。その溶液の一部を、等容量の2×添加剤（適 当な緩衝液（ヒスチジン-食塩水またはクエン酸-食塩水）中に所望の最終濃度の ２倍で調製したもの）と混合した。調剤した溶液を滅菌ろ過し、滅菌チューブに 無菌的に分注し、37℃または4℃で指定した期間保温し、この試験が終わるまで 凍結し、最後に各試料を溶解し、アッセイした。 因子IX凝固アッセイは、コンタクト（Kontakt）ブランドAPTT（Pacific Haemo stasis社）と先天性因子IX欠乏血漿（George KingまたはUniversal Reagents社 ）を用いる一段階法で行なった。標品は凍結乾燥CFIX-SD濃縮物とした。因子IX の作業希釈液は、タンパク質が表面で損失および変性するのを防ぐために0.1M N aCl、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）および0.01％トゥイーン20を含有する0.0 5Mイミダゾール緩衝液(pH7.3)中に調製した。各試料をMLAエレクトラ900自動凝 固時間計（Electra 900 Automatic Coagulation Timer）でアッセイした。どの 実験にも、２つまたはそれ以上の検量線を含めた。 試験管内半減期（T_1/2）、すなわち因子IX凝固活性が元の活性の50％まで低下 する時間を日数で表わしたものを、初期活性に対する残存％の対数を保温日数に 対してプロットした直線片対数プロットから決定した。 結果 各試料の安定性を次の表１に示す。 表 １ pH6.8における因子IX凝固活性（100単位/ml）の試験管内半減期（T_1/2,日） 因子IX-M（JHL）DEAE仕上げカラム後 実施例１が示すところは次の通りである。 （1）ヒスチジンは、特に4℃で、クエン酸より高い安定性を与える（１番と４番 の対比）。 （2）カルシウムをマグネシウムに置き換えることはできない(３番と２番の対比 )。 （3）ヘパリンの存在は因子IXの安定性を向上させない（６番，７番）。 C. 実施例2：種々の賦形剤がヒスチジン-食塩水中の凝固因子IXの安定性に与 える影響 クエン酸-食塩水中のCFIX-M（JHL）を0.01Mヒスチジン,0.1M NaCl,pH6.8（ヒ スチジン-食塩水）で1:10に希釈して、0.009Mヒスチジン、0.002Mクエン酸、0.1 M NaCl、pH6.8（緩衝液A）の最終組成にするか、ヒスチジン緩衝液（緩衝液B)に 対して透析した。その後、試料を上記実施例１と同様に、ただし次の変更を加え て処理した： （1）下記の表に示すように、試料を37℃で保温した。 （2）因子IX凝固アッセイをランサーコアギュライザーII(Lancer Coagulyzer II )で行なった。 結果 各試料の安定性を次の表２に示す。 表 ２ 37℃における因子IX-Mの凝固活性の試験管内半減期（T_1/2,日） 因子IX-M（JHL）DEAE仕上げカラム前 この結果からまずわかることは、次の通りである。 （1）カルシウムが存在しないと因子IXの安定性が抑制されうる。 （2）他の被検賦形剤（グリシン、ポリエチレングリコール（PEG）、アルブミン またはトゥイーン）の添加は、カルシウムの不在を補うことができない。 （3）因子IXはアルブミンによって不安定化される。 D. 実施例3：pH、純度および賦形剤が凝固因子IXの安定性に及ぼす影響 DEAE仕上げを行なった因子IX-M（JHL）、DEAE仕上げを行なっていない因子IX- M（JHL）、CFIX-SD、およびARC製剤中のアルファナイン（ARC/A9）を上記実施例 ２と同様に処理した。 結果 各試料の安定性を次の表３に示す。 表 ３ 37℃における因子IXの凝固活性の試験管内半減期（T_1/2,日） FIX-M＝因子IX-M（JHL）DEAE仕上げカラム前 DEAE＝因子IX-M（JHL）DEAE仕上げカラム後 ARC/A9＝ARCアルファナイン-SD CFIX-SD＝ARC CFIX-SD 表３のデータをグラフにして図２に示す。 実施例３が示すところは次の通りである。 （1）因子IXは不純物によって不安定化される；CFIX-SDはCaCl₂を含む場合も含 まない場合もFIX-M/DEAEよりはるかに安定性が低い（5、６番と1、２番の対比） ；ARC/A9はCaCl₂を含む場合も含まない場合もFIX-M/DEAEよりはるかに安定性が 低い（7、８番と1、２番の対比）；DEAE仕上げを施していないFIX-MはDEAE仕上 げを施したものより安定性が低い（14番と２番の対比）。 （2）因子IXはリジンとグリシンによって不安定化する。 （3）Octapharma社が言及した緩衝液（13番、WO91-10439参照）は、本発明の安 定性を与えない（13番）。 （4）因子IXの安定性が最も高くなるpH範囲は6.0〜6.8である。 E. 実施例4：非水系液体製剤中の凝固因子IXの安定性 CFIX-M（JHL）は、次に挙げる成分の凍結乾燥混合物として調剤される： （1）38ミリグラム（mg）凝固因子IX （2）70mg NaCl （3）290mgグリシン （4）8.8mg CaCl₂ （5）6mgヒスチジン。 この乾燥混合物の一部（100mg）を、溶媒の一つ（ポリプロピレングリコール(分 子量425)(PPG)；ポリ(ジメチルシロキサン)(PMS)；グリセロール；または水）90 0〜1000マイクロリットルに、注射器で再懸濁および/または溶解した。次に、そ れらを100マイクロリットル試料として10本のバイアルに分注し、密閉し、37℃ で保温した。因子IX凝固アッセイを実施例１に記述したように行なった。 結果 各試料の安定性を次の表４に示す。 表 ４ 非水系液体製剤中の因子IXの試験管内安定性 表４のデータをグラフ化して図６に示す。 これらの結果は次のことを示している： （1）PPGは凝固因子IXに最も高い安定性を与える。 （2）PMSは凝固因子IXに最も低い安定性を与える。 F. 実施例5：非水系液体製剤中の凝固因子VIIIの安定性 凝固因子VIII（Baxter社 AHFM）は凍結乾燥混合物として提供され、これは7.5 mL中に次の最終組成を与える： （1）1000〜1200単位の凝固因子VIII（133〜160単位/mL） （2）ヒトアルブミン,16.7mg/mL （3）ポリエチレングリコール,2.0mg/mL （4）73ミリモル/リットル ヒスチジン （5）40ミリモル/リットル グリシン。 この粉末100mgを2.5mLの溶媒（ポリプロピレングリコール(分子量425)(PPG)；ポ リエチレングリコール(分子量300)(PEG)；または水）に注射器-注射器混合によ って再懸濁および/または溶解し、100マイクロリットルずつに分けた。次に、そ のバイアルを37℃で保温した。 因子VIII活性アッセイは実施例１で因子IXに使用した方法に従って、ただし因 子IX標品の代わりに因子VIII標品としてメガI（Mega I;Office of Biologics Re search and Review，メリーランド州ベセズダ）を使用し、因子IX欠乏血漿の代 わりに因子VIII枯渇血漿（Universal Reagents社）を使用して行なった。 結果 各試料の安定性を次の表５に示す。 表 ５ 非水系液体溶媒中の因子VIIIの試験管内安定性 表５のデータをグラフ化して図７に示す。 これらの結果から、PPGと水がどちらも第７日に活性スパイクを示した後、著 しい減少を示すことがわかる。PEGを溶媒にすると、因子VIIIがほとんど直ち に失活し、それに先立って活性スパイクが認められることはない。 この実施例と、非水系液体製剤中の因子IXを用いた上記実施例４は、凝固因子 の安定化に非水系溶媒を使用するという考えを検証するための予備実験とみなす ことができる。PPGまたは水中の因子VIIIと、PPG中の因子IXで認められた第７日 における活性のスパイクは、注射器-注射器混合中にこれらの物質が細菌に汚染 されることによって起こった活性化が原因だろう。この実験技術は、下記実施例 8（表7、図16および図17）および実施例9（図18と図19）に記述するこれ以降の 非水系液体製剤での実験では改良、改善された。 G. 実施例6：37℃における因子IX用水系製剤の最適化 pHとカルシウム濃度を最適化するために、DEA仕上げを行なった高純度因子IX- Mを比較的高濃度（2.4mg/mL；600単位/mL）に調製した。これは、このタンパク 質が37℃で長期間保温している間に活性化され、断片化される傾向を示す条件で ある。これらの製剤は10mMヒスチジン、0.1M塩化ナトリウム、および次に挙げる 濃度の塩化カルシウムを含有する：10mM、30mMまたは100mM。各製剤のpH値を次 のいずれかに調節した：5.8、6.0、6.2。その製剤を滅菌ろ過し、オートクレー ブしたポリプロピレン管に無菌的に分注し、37℃で保温した。 各製剤の試料を１週間間隔で採取し、−80℃で凍結した。56日後、すべての試 料を融解し、因子IX欠乏血漿を基質とする１段階APTT凝固アッセイにより、因子 IX凝固活性を分析した。活性パーセントを保温時間に対してプロットし、試験管 内半減期（T_1/2）を、その曲線が50％活性ラインと交叉する時間（日数）として 決定した。 結果 初期凝固活性に対するパーセントの減衰曲線を図8〜10に示す。上記３つの各p H値での結果を10mM CaCl₂についてプロットすると（図8）、凝固活性の半減期は 38日と58日の間で変動し、曲線がわずかに二相性を示す（当初数週間にわたって 安定した減少を示した後、曲線が徐々に上昇または傾きが変化する）ことから、 pH6.2で活性化が起こったのではないかと思われる。また、30mM CaCl₂では、活 性化の明らかな証拠がpH6.2試料に現われた（図9）。100mM CaCl₂ では、40日後にpH6.0とpH6.2で、活性化と思われるわずかな徴候がある（図10） 。下記表６はこれらの半減期値を要約したものであり、減衰曲線のわずかな二相 性に基づいて、活性化が起こったと思われるところを示している。 図11、12および13は、上記３つのCaCl₂濃度を各pH値で比較したものである。p H6.0とpH6.2の両方で100mM CaCl₂に認められる浅い減衰曲線は、因子IXの活性化 を反映しているのかもしれない。この最大濃度のCaCl₂は、長期安定性には不利 かもしれない。また、pH6.2では30mM CaCl₂に活性化の明らかな証拠があり、こ の条件も最適ではないかもしれない。 37℃で保温したこれら９種類のpH/CaCl₂の組み合わせについて、クーマシーブ ルー染色したSDS-PAGEゲルを、０日と56日について図14Aに、またすべての時点 について図14B、14Cおよび14D（還元ゲル）に示す。ゲルは、還元状態と非還元 状態（断片を互いに拘束しあうジスルフィド結合を解くための2-メルカプトエタ ノールを入れたものと、入れないもの）で操作した。０時点では、100mM CaCl₂ で還元ゲルに高分子量スメアがあった点を除いて（これは非特異的塩効果による ものと思われる）、因子IXはいずれの製剤中でも同じに見えた。その100mM CaCl₂ 試料を水で希釈した場合、高分子量スメアは認められなかった（図14D）。第56 日では、すべての試料に断片化が認められたが、図14Aの還元ゲルでは、試料間 の明らかな相違がはっきりわかった。最も断片化が少なく無傷の単量体の量が最 大となる最良の条件は、レーン6〜7（pH5.8〜6.0で30mM Ca）とレーン9〜10（pH 5.8〜6.0で100mM Ca）に現われた。図14B〜14Dの時間的検討から、30mM Caまた はそれ以上かつpH5.8〜6.0で、断片化の量が最も少なかったことが確認される。 凝固活性によれば、最適なCaCl₂濃度は30〜100mMであると思われる。しかしpH 5.8と6.0において、因子IXの安定性（T_1/2）は、CaCl₂濃度が増大するにつれて 増大した。高いCaCl₂濃度で観察された浅い曲線は、おそらく因子IXの活性化よ りもむしろ安定性の向上を示しているのだろう。SDS-PAGEデータは、30mM以上の CaCl₂濃度がpH5.8または6.0で最良であることを示唆している。過去の結果（非 掲載のデータ）は、因子IXの安定性がpH5.5で極めて短いこと を示している。 表 ６ pH5.8〜6.2で10〜100mM CaCl₂を含有する液体製剤中37℃で高純度因子IX（600単 位/mL）を保温した場合の因子IX凝固活性T_1/2値と考えうる活性化 H. 実施例7：4℃における因子IX水系製剤の評価 製剤の取扱いとアッセイは実施例６と同様に行なった。様々な濃度の因子IX（ 25単位/mL〜600単位/mL）を含有する６種類の製剤を、10mMヒスチジン，0.1M Na Cl,10mM CaCl₂,pH6.8を使って調製した。各製剤の試料を低温室(4℃)で保存し、 凍結し、凝固活性をアッセイした。 結果 図15は4℃で保温した試料の減衰曲線である。最初の100％活性を超える凝固活 性の上昇（これは活性化を示す）が、600単位/mL(70日)、300単位/mL（140日） 、200単位/mL（210日）および100単位/mL（410日）で観察される。20単位/mLと5 0単位/mLでは、410日後まで活性化の証拠は認められなかった。これらの試料に は410日の時点で、初期活性の80％以上が残っていた。 I. 実施例8：因子VIII用非水系製剤 この実施例で使用した凍結乾燥因子VIIIは、Baxter Healthcare社Hyland部門 （カリフォルニア州グレンデール）が米国赤十字社献血血漿から調製したヒト抗 血友病因子・M法溶媒/洗剤処理品(Antihemophilic Factor,Human,Method M,Solve nt and Detergent Treated;AHF-M)である。各実験について、未開封バイアル中 の因子VIII凍結乾燥粉末に皮下針で溶媒を無菌的に添加し、その懸濁液を液化さ せることにより、1バイアルのAHF-M（約1000単位）を10mLの非水系 溶媒に懸濁した。試験した溶媒には、グリセロール、ジメチルスルホキシド（DM SO）、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、 ポリエチレングリコール（PEG）200、PEG300、PEG400、ジプロピレングリコール 、トリプロピレングリコール、ポリプロピレングリコール（PPG）425、PPG725、 PPG1000、PPG2000、PPG3000およびPPG4000が含まれる。各懸濁液を滅菌ポリプロ ピレン管に無菌的に分注した。そのチューブを37℃で保温し、様々な時点で採取 し、希釈し、凝固活性をアッセイした。 結果 いくつかの非水系溶媒（グリセロール、DMSO、エチレングリコール）では、無 保温の０時間対照でさえ検出不可能な活性レベルであることから、因子VIII活性 が迅速に失活するようであった（表7）。これらの溶媒は、因子VIII希釈試料中 に存在する濃度に希釈した場合、この凝固アッセイを阻害しないことがわかった 。 ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコールおよびポリエチレングリ コール中の因子VIIIの凝固活性も迅速に失われ、これら溶媒中での半減期は4日 またはそれ以下だった。 これに対し、PPG425、PPG725およびPPG1000中では、因子VIII活性が水に溶解 した因子VIIIの活性と同程度に、あるいはそれ以上に維持された（図16；表7） 。水溶液中の因子VIIIの半減期が34日であったのに対し、PPG425中での半減期は 42日、PPG725中では60日以上、PPG1000中では90日以上であった。 因子VIII凝固活性の半減期をPPGオリゴマーサイズに対してプロットすると、 その半減期は約PPG1000（17モノマー単位のオリゴマー）までオリゴマーサイズ にほぼ比例した（図17）。より大きいPPGポリマー（PPG2000とPPG3000）も高い 安定性を与えたが、これらのポリマーは粘度が高く、試料体積を正確に測定する ことが困難なので変動が生じた。PPG4000では、安定性が低くなるようだった。 PEG400（オリゴマーサイズ＝４モノマー単位）までのPEGは、因子VIIIの 安定化には無効だった（図16；表7）。より高分子量のPEGオリゴマーは室温で固 体であるので、評価しなかった。 表 ７ 37℃の非水系液体製剤に懸濁した因子VIII凍結乾燥品（AHF-M）の 試験管内半減期（T_1/2,日） J. 実施例9：因子IX用非水系製剤 因子IX免疫アフィニティー精製品をVirtis社の凍結乾燥器中2.5mLずつ凍結乾 燥した。各実験につき、7mgの因子IX乾燥品を10mLの非水系溶媒に懸濁した。試 験した溶媒は次の通りである：PEG200、PEG300、PEG400、トリプロピレングリコ ール、PPG425、PPG725、PPG1000、PPG2000、PPG3000およびPPG4000。各懸濁液を 滅菌ポリプロピレン管に無菌的に分注し、それを37℃で様々な時間保温し、採取 し、希釈し、凝固活性をアッセイした。 図18に示すように、実施例８で因子VIIIについて得た結果とは対照的に、ポリ エチレングリコールは因子IXをいくらか安定化した。PEG300とPEG400がそれぞれ ５日未満の半減期を与えたのに対し、PEG200（テトラエチレングリコール）での 半減期は17日（これは水溶液中でのT_1/2の半分未満である）だった。 ポリプロピレングリコールは因子IXをかなり安定化した。水溶液中での半減期 が39日であるのに対して、トリプロピレングリコール中では、半減期が約56 日だった。PPG425、PPG725、PPG1000およびPPG2000中では、半減期が56日以降に 達しなかった(図19;不規則性はおそらく試料採取誤差によるのだろう)。 K. 実施例10：移植用ポンプによる凝固因子の試験管内送達 30mLの貯蔵槽容量と2mL/日の送達速度を持つ２つのアローモデル3000ポンプ（ Arrow International社，マサチューセッツ州ウォルポール）を使用した。これ らのポンプは、くも膜下腔内または肝動脈アクセスを伴う腹部への移植が、米国 において認可されている。 因子VIII（AHF-M）と因子IXの水溶液を、一般的なポンプ充填プロトコールに 従ってポンプ隔壁/注入口内に注入した。ポンピング機構を作動させるために各 ポンプを37℃の水槽に設置し、内容物を、内部滅菌フィルターを通して排出管経 由で収集管内に送った。試料を13日間毎日集め、体積と凝固活性を測定した。 結果 流出液体積はどちらのポンプについても正確に2mL/日に保たれた（図20と図21 ）。 因子VIII活性は第６日までに95％失われた(図20)。しかしその原因は、AHF-M 溶液をポンプに充填する工程中に滅菌性が損なわれたときの細菌の混入によるも のであることがわかった（細菌の混入は寒天平板コロニーおよび培養評価によっ て確認した）。 ポンプからの流出液中の因子IX活性は13日間の作動中つねに比較的一定して減 少した（図21）。その半減期は18〜20日で、ポリプロピレン管中で観察された半 減期の約半分だった。第13日の時点で、流出する活性は出発活性の60％だつた。 １日あたりの送達された因子IX単位数は、最初の５日間は185〜210単位で、第６ 日〜第11日の間は160〜170単位に減少し、最後の２日間はさらに110〜140単位に 減少した（図22）。細菌は、因子IX流出液中には検出されなかった。 L. 実施例11：移植用ポンプと因子VIIIの生物適合性および移植用ポンプによ る因子VIIIの送達 1mL/日の送達速度を持つ２つのアローモデル3000ポンプ（Arrow International社，カリフォルニア州ウォルポール）に、因子VIIIの滅菌水溶液 （復元したAHF-M,ロット番号29355011AA；80因子VIII凝固単位/mL）を無菌的に 充填した。実施例10に記述したように、一方のポンプを37℃の水槽に設置してポ ンピング機構を作動させ、その内容物を0.2ミクロンフィルター、ガラス製流量 絞りおよびシリコーンゴム排出力テーテルを通して収集管中に送った。流出した 試料を1〜4日毎に集め、凝固活性を１段階APTTアッセイで測定した。 チタン製ポンプ貯蔵槽と因子VIIIの生物適合性を決定するために、充填した第 ２のポンプの排出力テーテルに結び目を作って溶液が流出しないようにし、30mL の因子VIII溶液すべてを貯蔵槽内に留めた。その貯蔵槽から滅菌皮下注射針で1 〜4日ごとに試料を無菌的に採取し、因子VIII凝固活性を上述のように測定した 。 結果 ポンプから流出させた因子VIII試料の活性と、静止状態のポンプ貯蔵槽から採 取した因子VIII試料の活性は、有意に相違しなかった（図23）。ポンプ流出液の 第１試料が示す急落は、ポンプの管系をパージするのに使用した食塩水溶液で流 出液が希釈されたためである。 静止状態のチタン製ポンプ貯蔵槽から採取した因子VIIIに関する減衰曲線を、 以前の実験でポリプロピレン管中で保温した因子VIIIに関する減衰曲線と比較し たところ、減衰はポリプロピレン管中よりポンプ中の方が速かった（図24）。ポ リプロピレン管内での半減期が約38日であるのに対し、チタン製貯蔵槽内での生 体外半減期は約22日だった。ポンプ貯蔵槽中での減衰の方が速いというこの結果 は、試験に使用した条件で貯蔵槽のチタン表面の存在下に因子VIIIの結合、変性 または断片化が増大することを反映しているのかもしれない。あるいは、試験管 のポリプロピレン表面が、なんらかの未知の機序で因子VIIIを実際に安定化する のかもしれない。 因子VIIIをアローモデル3000ポンプのチタン製貯蔵槽中37℃で保温した時に観 察される安定性が、因子VIIIをポリプロピレン管中37℃で保温した時に観察され る安定性より低いということは、これら２つの素材の因子VIIIとの生物適合性に 相違があることを示唆している。しかし、ポンプ貯蔵槽内で静置保温した因 子VIIIの安定性と、ガラス/シリコーンゴム排出力テーテルを通して排出された 因子VIIIの安定性には相違は認められなかった。このことから、ガラス表面とゴ ム表面は、ポンプを出た因子VIIIの活性を変化させないことが示唆される。 M. 実施例12：移植用ポンプと因子IXの生物適合性および移植用ポンプによる 因子IXの送達 実施例11と同様に、1mL/日の送達速度を持つ２つのアローモデル3000ポンプ（ Arrow International社，マサチューセッツ州ウォルポール）に、10mMヒスチジ ン,0.10M NaCl,10mM CaCl₂,pH6.2に溶解した因子IX免疫精製品（100因子IX凝固 単位/mL）の滅菌ろ過水溶液を無菌的に充填した。上述のように、一方のポンプ を37℃の水槽に設置してポンピング機構を作動させ、その内容物を0.2ミクロン フィルター、ガラス製流量絞りおよびシリコーンゴム排出力テーテルを通して収 集管に送った。溶出した試料を1〜2ごとに集め、因子IX凝固活性を一段階APTTア ッセイで測定した。 チタン製ポンプ貯蔵槽と因子IXの生物適合性を決定するために、充填した第２ のポンプの排出力テーテルを結んで溶液が流出しないようにし、30mLの因子IX溶 液すべてを貯蔵槽内に留めた。1〜2日毎に滅菌皮下注射針で試料を貯蔵槽から無 菌的に採取し、因子VIII凝固活性を上述のように測定した。 結果 ポンプから流出させた因子IX試料の活性と、静止状態のポンプ貯蔵槽から採取 した因子IX試料の活性は、有意に相違しなかった（図25）。どちらの減衰曲線も 、約25日の半減期値に外挿する。 静止状態のチタン製ポンプ貯蔵槽から採取した因子XIに関する減衰曲線を、以 前の実験でポリプロピレン中で保温した因子IXに関する減衰曲線と比較したとこ ろ、ポリプロピレン管中での半減期が約35日だったのに対し、チタン製貯蔵槽内 での生体外半減期は約25日だった（図26）。チタン製貯蔵槽内での半減期の方が 短いが、減衰速度はチタン製貯蔵槽でもポリプロピレン管でも同様に見える（す なわち減衰曲線の傾きはほぼ同じである）。チタン製貯蔵槽内で因子IXの半減期 が短いのは、第１アッセイ時点（第２日）における因子IX活性の初期 低下（約25％）によるものと思われ、このことは、因子IXの一部がポンプ貯蔵槽 の内表面に結合するものの、残りの部分は影響を受けないということを示唆して いる。 因子VIIIの場合と同様に、ポンプ貯蔵槽内に静置された因子IXとガラス/シリ コーンゴム排出力テーテルを通して排出された因子IXの間には相違が認められず 、ガラスとシリコーンゴムがポンプから出た因子IXの効力を変化させないことが 示された。チタン製貯蔵槽中37℃で保温した因子IXの半減期は、ポリプロピレン 管中37℃で保温した因子IXの半減期より短いが、これはポンプ貯蔵槽内の因子IX 内容物の初期低下によるものと思われ、その後はどちらの素材についてもほぼ同 じ速度で減衰した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｐ 43/00 43/00 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 ミエッカ，シャーリー・アイ アメリカ合衆国20878メリーランド州 ゲ イザーズバーグ、クローバー・ノウル・ロ ード11905番 (72)発明者 ドローハン，ウィリアム・エヌ アメリカ合衆国22152バージニア州 スプ リングフィールド、オークフォード・ドラ イブ8417番 (72)発明者 ジェイムソン，トーマス・アール アメリカ合衆国20879メリーランド州 ゲ イザーズバーグ、グレイジング・ウェイ 20238番 (72)発明者 テイラー，ジョン・アール・ジュニア アメリカ合衆国10012ニューヨーク州 ニ ューヨーク、イースト・シックスティエイ ス・ストリート12番 (72)発明者 シン，マニッシュ アメリカ合衆国92122カリフォルニア州 サンディエゴ、ショアーライン・ドライブ 7234番、ナンバー150 (72)発明者 マックフィー，マーティン・ジェイ アメリカ合衆国20879メリーランド州 ゲ イザーズバーグ、レイク・ランディング・ ロード9971番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1.（a）血漿タンパク質、(b)pH緩衝化合物、（c）多価金属イオンの発生源、 （d）浸透性調節剤および（c）水を含む、血漿タンパク質の安定な水系液体製剤 。 2. 多価金属イオンの発生源がカルシウムイオンの発生源である請求項１の製 剤。 3. 該血漿タンパク質がビタミンＫ依存性血漿タンパク質である請求項１の製 剤。 4. 該ビタミンＫ依存性血漿タンパク質が、因子II、因子VII、因子IX、因子 Ｘ、プロテインＣ、プロテインＳおよびプロテインＺからなる群より選択される 請求項３の製剤。 5. 該血漿タンパク質が非ビタミンＫ依存性血漿タンパク質である請求項１の 製剤。 6. 該非ビタミンＫ依存性血漿タンパク質が、因子VIIIおよびフォン・ヴィレ ブランド因子からなる群より選択される請求項５の製剤。 7. 該pH緩衝化合物がアミノ酸である請求項１の製剤。 8. 該アミノ酸がヒスチジンである請求項７の製剤。 9. 浸透性調節剤が塩化ナトリウム（NaCl）である請求項１の製剤。 10. 該カルシウムイオンの発生源が塩化カルシウム（CaCl₂）である請求項２ の製剤。 11.（a）血漿タンパク質および（b）非水系液体を含む、血漿タンパク質の安 定な非水系液体製剤。 12. 該非水系液体が親水性非水系液体である請求項11の製剤。 13. 該非水系液体が、グリセロール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、エチ レングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、PEG200、PE G300、PEG400、ジプロピレングリコール、トリプロピレングリコール、PPG425、 PPG725、PPG1000、PPG2000、PPG3000およびPPG4000からなる群より選択される請 求項11の製剤。 14. 該血漿タンパク質がビタミンＫ依存性血漿因子である請求項11の製剤。 15. 該ビタミンＫ依存性血漿タンパク質が、因子II、因子VII因子IX、因子Ｘ 、プロテインＣ、プロテインＳおよびプロテインＺからなる群より選択される請 求項14の製剤。 16. 該血漿タンパク質が非ビタミンＫ依存性血漿タンパク質である請求項11 の製剤。 17. 該非ビタミンＫ依存性血漿タンパク質が、因子VIIIおよびフォン・ヴィレ ブランド因子からなる群より選択される請求項16の製剤。 18.（a）血漿タンパク質、（b）非水系液体および（c）水を含む、血漿タンパ ク質の安定な水系/非水系混合液体製剤。 19. 先天性または後天性血漿タンパク質欠乏症の治療法であって、その必要 がある患者に請求項1、請求項11および請求項18のいずれかの製剤を投与するこ とからなる方法。 20. 該投与が持続注射または持続注入によってなされる請求項19の方法。 21. 該投与が生体再吸収性ヒドロゲルからの拡散によってなされる請求項19 の方法。