KR20060059849A

KR20060059849A - 혈소판 다혈장의 조제 방법

Info

Publication number: KR20060059849A
Application number: KR1020057001113A
Authority: KR
Inventors: 에미 스미다; 쇼헤이 카수가이; 카주나리 아키요시; 야스히코 이와사키
Original assignee: 에미 스미다; 도레이 가부시끼가이샤
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2003-08-01
Publication date: 2006-06-02
Also published as: CA2493795A1; WO2004012750A1; US20050170327A1; JPWO2004012750A1; EP1547606A4; AU2003252316A1; EP1547606A1

Abstract

본 발명의 과제는, 활성이 높은 혈소판 다혈장을 용이하고 저렴하게 제공하는 것이다.

채혈하여 얻어진 전혈에 수용성 고분자를 첨가하는 공정을 포함하는 혈소판 다혈장의 조제 방법에 의한다. 예를 들면, 폴리-L-글루타민산 등의 폴리아민, 히알루론산 등의 산성 다당류, 비닐 폴리머를 전혈에 첨가하고, 일정 시간 그대로 둠으로써, 적혈구를 선택 촉진적으로 응집 침강시켜, 상청에는 혈소판 외에, 피브리노겐을 많이 포함하는 혈장 성분이나 백혈구를 포함하는 활성이 높은 혈소판 다혈장을 얻을 수 있다. 본 발명은, 그 혈소판 다혈장 및 그 조직 및/또는 기관 수복 촉진제 등의 사용, 그리고 혈소판 다혈장 조제용 키트에도 이른다.

혈소판, 혈장, 수용성 고분자, 적혈구, 아미노산, 산성 다당류, 비닐 폴리머

Description

혈소판 다혈장의 조제 방법{Method of Preparing Platelet Rich Plasma}

본 출원은, 참조에 따라 여기에 원용되는 바의, 일본 특허출원번호 2002-226277로부터의 우선권을 청구한다.

본 발명은, 의료 분야에서 사용되는 혈소판 다혈장(platelet-rich plasma) 및 그 조제 방법에 관한 것이다.

현재, 손상된 조직의 재생 분야에 있어서, 의학, 공학은 점차 진보를 이루고 있다.

하지만, 최근, 의료용으로 사용되고 있는 혈액 제제나 동물(특히 소)로부터 만들어진 생리적 활성 물질을 사용함에 따라, 이들에 혼입되는 바이러스, 프리온 등에 의한 감염에 의해 안전을 위협받는 사건이 다수 일어나고 있어, 사회적 문제가 되고 있다. 이와 같은 이유로, 의료 전체에 대한 안전성에 대해 매우 관심이 높아지고 있다.

또, 일상의 임상 응용의 장에 있어서는, 안전할 뿐만 아니라, 그 조작이 확실하고 간편한 것 또한 중요한 것이다.

이와 같은 배경에서, 이전부터 수술 후의 지혈, 창상 치유 촉진제로서 효과가 인정되어 온 피브린 제제로부터 발전시켜, 자기의 혈액 성분을 사용하여 창상 치유를 앞당기는 치료 방법이 각광을 받게 되었다. 예를 들면, 활성화된 혈소판은, 창상 치유 조기에 세포의 유주, 분화를 유도하는 물질을 분비하기 때문에, 수술 전에 자기의 혈액으로부터 혈소판을 농축한 혈장(혈소판 다혈장:platelet-rich plasma, 이하, 「PRP」라 하는 경우도 있다.)을 만들어 두고, 수술 부위에 혈소판을 활성화시킨 PRP를 도포하여, 치유의 촉진을 도모하고자 하는 것이다. 다수의 임상가에 의해, 이 방법에 의한 창상 치유의 촉진이 도모되었음이 보고되었다(R. E. Marx 등, Oral Surgery Oral Medicen Oral Pathology, Vol. 85, 638-646, 1998, A. K. Garg 등, The Nippon Dental Review, 62권, No. 10, 131-143, 2002). 자기의 혈액을 사용하는 것은, 매우 안전한 방법인데다 확실한 성과를 얻을 수 있다.

하지만, 자기의 혈액을 사용하는 것은, 그 조작법의 복잡함, 위험성, 노력과 시간, 숙련된 인력을 필요로 하는 점, 고가의 기구의 구입, 보수 경비의 증대 등의 문제가 있다.

임상 검사에 사용하는 혈소판 다혈장은, 전완정중정맥(median antebrachial vein)으로부터 채혈하고, 3.1w/v% 구연산나트륨을 1.5mL 포함하는 플라스틱 튜브에 전혈을 4.5mL씩 가하여, 전도 혼화한 것을 50g 15분간 22℃에서 원심한 상청에 의해 얻어진다(임상검사법 제요 제 31판 400페이지). 조직 치유의 촉진을 위한 PRP의 채취도, 채혈량이나 원심 분리 조건에 차이는 있지만 기본적으로 본 법에 준하여 취득된다. 혈소판은 매우 반응성이 풍부하므로, 분리 과정에서 응집 반응이나 방출 반응을 일으켜 그 기능을 소실하기 쉽다. 이로 인해, 분리 작업에서는 숙련자가 특별히 주의를 기울이면서 조제할 필요가 있다. 또, 다른 혈구 성분에 비해, 혈소판 은 시간의 경과에 따른 기능 저하가 현저하기 때문에, 채혈 후 가능한 한 빠른 시간에 분리할 필요가 있는 것도, 취급성을 현저히 저하시키는 원인의 하나였다.

최근, 조직 치유의 촉진에 사용하는 PRP를 간편하게 취득하기 위한 키트가 판매되고 있다. 하지만, 종래의 PRP의 취득 방법은, 기본적으로 원심 분리 기술을 이용한 것으로(호소카와 다카시(細川隆司)) 등, Dental Outlook, 100권, No. 6, 1230-1243, 2002), 상기의 조작의 번잡함의 개선은 충분하지는 않았다. 실제로, 조작의 번잡함에 대해서는 본 발명자들만이 실감한 것이 아니며, 호소카와 등도 상기 논문의 1239페이지 도12의 설명문에서 「조작은 다소 번잡하다」고 명기하고 있다. 그리고, 이러한 원심 분리법에 의해 취득한 PRP에서는, 적혈구의 분리는 충분하지만, 전혈 중에 포함되는 백혈구도 분리되기 때문에 조제된 PRP 중에는 백혈구는 거의 포함되지 않고, 피브리노겐 등의 중요한 혈장 성분의 일부도 원심 분리되어 버리기도 하였다.

수술 후의 지혈, 창상 치유 촉진제로서 사용하는 혈소판 다혈장에 요구되는 특성으로서는, 조직 치유의 지연을 초래하는 적혈구가 적은 것, 혈소판이 많이 포함되어 있는 것, 혈소판의 활성이 높게 유지되는 것, 혈소판과 함께 백혈구나 피브리노겐 등의 혈액 성분을 많이 포함하는 것을 들 수 있으며, 이와 같은 활성이 높은 혈소판 다혈장을 간편하게 취득하는 방법의 개발이 요청되고 있다.

본 발명의 과제는, 활성이 높은 혈소판 다혈장을 간편하게 취득하여 이를 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 열의적으로 검토를 거듭한 결과, 수용성 고분자 화합물 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염을 전혈 등의 적혈구를 포함하는 혈장에 첨가하면, 혈소판 다혈장을 신속하고 간편하게 분리할 수 있을 뿐만 아니라, 이와 같이 하여 얻어진 혈소판 다혈장이, 종래 방법에서 얻은 것에 비해, 매우 높은 조직 치유 활성을 보임을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은,

1. 혈액으로부터, 적혈구를 선택 촉진적으로 응집 침강시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈소판 다혈장의 조제 방법,

2. 혈액이, 채혈하여 얻어진 전혈인 전 항 1에 기재된 혈소판 다혈장의 조제 방법,

3. 적혈구를 선택 촉진적으로 응집 침강시키는 방법이, 혈액에 수용성 고분자 화합물을 첨가하는 공정을 포함하는 전 항 1 또는 2에 기재된 조제 방법,

4. 혈액에 수용성 고분자 화합물을 첨가하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈소판 다혈장의 조제 방법,

5. 상기 수용성 고분자 화합물이 분자량 1000~500만의 고분자 화합물인 전 항 3 또는 4에 기재된 조제 방법,

6. 상기 수용성 고분자 화합물을, 혈액량에 대해 0.0001~10w/v% 첨가하는 전 항 3 또는 4에 기재된 조제 방법,

7. 상기 수용성 고분자 화합물이, 이하에 나타내는 화합물로부터 선택되는 적어도 전 항 3 또는 4에 기재된 조제 방법:

1) 아미노산 및/또는 아미노산의 약리학적으로 허용되는 염을 포함하는 폴리아미노산

2) 산성 다당류 및/또는 그 약리학적으로 허용되는 염

3) 비닐 폴리머

8. 상기 폴리아미노산이, 폴리글루타민산, 폴리아스파라긴산, 폴리히스티딘 또는 폴리아스파라긴으로부터 선택되는 적어도 1종인 전 항 7에 기재된 조제 방법,

9. 상기 폴리아미노산을 구성하는 아미노산 또는 아미노산의 약리학적으로 허용되는 염이, 글루타민산, 아스파라긴산, 히스티딘 및 아스파라긴으로부터 선택되는 적어도 1종 이상 또는 이들의 약리학적으로 허용되는 염을 포함하는 폴리아미노산인 전 항 7에 기재된 조제 방법,

10. 상기 폴리아미노산을 구성하는 아미노산 중, 적어도 20% 이상이 글루타민산 및/혹은 아스파라긴산 또는 이들의 약리학적으로 허용되는 염인 전 항 9에 기재된 조제 방법,

11. 상기 폴리아미노산이, 산성 폴리아미노산인 전 항 9 또는 10에 기재된 조제 방법,

12. 상기 산성 다당류 및/또는 그 약리학적으로 허용되는 염이, 덱스트란 유도체, 글리코사미노글리칸, 셀룰로오스 유도체, 키토산 유도체, 갈락투론산 및 알긴산으로부터 선택되는 적어도 1종 또는 그 약리학적으로 허용되는 염인 전 항 7에 기재된 조제 방법,

13. 상기 산성 다당류 및/또는 그 약리학적으로 허용되는 염이, 히알루론산 또는 그 약리학적으로 허용되는 염인 전 항 7에 기재된 조제 방법,

14. 상기 비닐 폴리머가, 산성 폴리머 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 포함하는 화합물로부터 선택되는 적어도 1종인 전 항 7에 기재된 조제 방법,

15. 전 항 1~14에 기재된 어느 방법으로 조제된 혈소판 다혈장,

16. 전 항 15에 기재된 혈소판 다혈장을 포함하는 조직 및/또는 기관 수복 촉진제,

17. 전 항 15에 기재된 혈소판 다혈장을 포함하는 조직 및/또는 기관 수복 촉진제, 치과 임플란트 주위의 골 조성의 첨가제, 골 결손부에 대한 골 또는 인공 골 이식시의 첨가제, 창상 치유 촉진제, 형성 및/또는 미용을 목적으로 한 치료 후 혹은 처치 후의 조직 치유 촉진제, 피부 질환 치료제, 피부 궤양 치료제, 신경조직 수복제 및/또는 외과 수술 후의 조직 수복제,

18. 전 항 15에 기재된 혈소판 다혈장을 투여함에 따른 이하에 나타내는 어느 치료 방법 또는 처치 방법:

1) 치과 임플란트 주위의 골 조성

2) 피부 질환

3) 형성 및/또는 미용을 위한 조직 수복

4) 골 결손부 수복

5) 신경조직 수복

6) 외과 수술 후의 조직 수복

19. 혈액에 수용성 고분자 화합물을 첨가하는 공정을 포함하는 방법에 의해 혈소판 다혈장을 조제하기 위해 사용하는 수용성 고분자 화합물 중, 이하에 나타내는 적어도 1종 이상의 성분을 포함하는 혈소판 다혈장 조제용 시약 또는 시약 키트:

2) 산성 다당류 및/또는 그 약리학적으로 허용되는 염

3) 비닐 폴리머

20. 혈액에, 이하에 나타내는 수용성 고분자 화합물 중 적어도 1종 이상의 성분을 첨가함으로써 혈소판 다혈장을 조제하기 위한 기구:

2) 산성 다당류 및/또는 그 약리학적으로 허용되는 염

3) 비닐 폴리머

21. 전 항 19에 기재된 시약 또는 시약 키트 및 전 항 20에 기재된 기구를 포함하는 혈소판 다혈장 조제 키트로 이루어진다.

본 발명의 혈소판 다혈장은, 혈소판 뿐만 아니라, 피브리노겐을 많이 포함하는 혈장 성분을 포함하는 것이 바람직하고, 또 백혈구를 포함한 혈액 성분을 포함하고 있는 것이 보다 바람직하다. 혈소판은 손상된 내피하조직에 점착·응집하여 혈전을 형성하고, 또, 지혈시에, 다른 세포를 유주, 분화 유도하는 물질의 저장, 방출에 관련하여 매우 중요한 역할을 하고 있다. 피브린은, 혈장 중의 피브리노겐에 트롬빈이 작용하여 생기는 것으로, 혈액 응고의 마지막 단계에 관여하는 것이다. 그리고, 조직 수복을 위해 세포가 침윤하여 세포 분화하기 위한 발판으로서도 중요하다. 또, 백혈구는 세균이나 유해한 미생물 등의 침입을 막는 작용이 있어, 면역 기능이나 살균 기능을 가지며, 손상 조직을 보호함으로써 조직 수복을 촉진한다. 백혈구 중에서도 단구/매크로파지는, 조직 수복에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

혈소판은, 자극이나 채혈로부터의 시간의 경과와 함께 급속히 기능을 잃는다. 이로 인해, 혈소판에 대한 자극이 적고 단시간에 분리 가능한 원심 분리 이외의 방법으로는, 높은 기능을 유지한 혈소판을 얻는 것은 불가능하였다. 전혈을 그대로 두면 점차 적혈구가 침강하지만, 통상 이 속도는 매우 느리기 때문에, 고도의 염증 반응시 등의 병적인 혈액 이외에는, 수시간 이상 방치해도 혈소판을 포함하는 혈장은 얻을 수 없음이 알려져 있다.

본 발명의 혈소판 다혈장을 조제하는 방법에 의해, 전혈로부터 선택 촉진적으로 적혈구를 침강시킬 수 있고, 상청 중에 혈소판 뿐만 아니라 백혈구, 피브리노겐 등의 조직 수복에 불가결한 성분을, 높은 기능을 유지한 채로 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 선택 촉진적으로 적혈구를 응집 침강시키는 공정이란, 처리 개시후 3시간 이내, 바람직하게는 2시간 이내, 보다 바람직하게는 1시간 이내, 더욱 바람직하게는 30분 이내에, 전혈에 포함되는 적혈구를 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상을 응집시킴으로써 침강시켜, 전혈액량의 적어도 15% 이상의 혈소판 다 혈장을 얻는 공정을 말한다.

본 발명의 혈소판 다혈장의 조제에 사용하는 전혈은, 사람 또는 사람을 제외한 동물에 있어서 통상적으로 채혈하는 방법에 따라 취득하면 된다. 또, 채혈한 전혈은 그대로 두면 응고해 버리므로, 채혈후 항응고제를 미리 가해 두는 것이 바람직하다. 항응고제로서는, 통상 사용되는 것으로, 생체에 대해 독성을 보이지 않는 것이면 되고, 예를 들면, 구연산나트륨, ACD, EDTA, 헤파린, 저분자 헤파린, 후산(futhan), 히루딘, 아르가트로반 등, 일반적으로 사용되는 것이면 된다.

본 발명의 혈소판 다혈장을 조제하기 위한 처리 혈액의 양은 특별히 제한되지 않고 그 용도에 따라 다르며, 사용 목적, 사용량에 따라 적절한 양을 선택할 수 있다. 본 발명의 방법은, 예를 들면, 자기의 혈액을 채혈한 것에 대해 적용시킬 수 있고, 헌혈 등으로 얻어진 혈액에도 적용시킬 수 있다. 본 발명은, 이와 같이 높은 활성을 갖는 혈소판을 간편하게 얻는 방법이므로, 혈소판 제제의 조제에도 사용할 수 있다.

(수용성 고분자 화합물)

채취하여 얻어진 혈액으로부터 본 발명의 혈소판 다혈장을 조제하기 위해, 수용성 고분자 화합물을 그 혈액에 첨가하고 그대로 두면 된다.

본 발명에 있어서의 수용성 고분자 화합물은, 상온인 25℃에서 증류수 또는 생리식염수에 0.01w/v%가 녹은 것이면 된다. 그 수용성 고분자 화합물의 분자량은 높은 것이 바람직하지만, 용해액이 고점도가 되어 혼화되기 어려운 등의 문제도 있 어, 구체적으로는 평균 분자량으로서 1000~500만, 바람직하게는 3000~100만, 보다 바람직하게는 1만~30만의 범위에서 선택되며, 더욱 바람직하게는 약 2만~15만이다. 또, 본 발명에 있어서의 분자량은, 분자량이 정해진 덱스트란을 표준물질로 하고, 용매를 증류수로 한 GPC법에 의해 측정하기로 한다.

본 발명에 있어서의 수용성 고분자 화합물은, 합성물이어도 되고 천연물이어도 되며, 또 천연물을 화학적으로 변형한 것이어도 된다.

본 발명에 있어서의 수용성 고분자 화합물은, 1) 아미노산 및/또는 아미노산의 약리학적으로 허용되는 염을 포함하는 폴리아미노산, 2) 산성 다당류 및/또는 그 약리학적으로 허용되는 염, 3) 비닐 폴리머로 나타내어지는 화합물로부터 선택된다. 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 상기에 나타낸 화합물 중 1종 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 약리학적으로 허용할 수 있는 염으로서는, 예를 들면, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염, 마그네슘염, 칼슘염 등의 알칼리토류 금속염, 암모늄염 등의 무기염기와의 사이에서 형성된 염, 또는 디에탄올아민염, 시클로헥실아민염, 아미노산염 등의 유기염기를 선택하여 사용할 수 있다.

(폴리아미노산)

본 발명에서 사용하는 폴리아미노산 또는 그 약리학적으로 허용할 수 있는 염으로서는, 예를 들면, 아스파라긴산, 글루타민산, 아스파라긴, 히스티딘 등의 α-아미노산, β-아미노산, γ-아미노산 등이 펩티드 결합에 의해 결합된 단일 중합 체 또는 공중합체를 예시할 수 있으며, D체, L체, DL체는 특히 불문한다. 구체적으로는, 폴리아스파라긴산, 폴리글루타민산, 폴리아스파라긴, 폴리히스티딘 및 이들의 약리학적으로 허용할 수 있는 염을 예시할 수 있다.

또, 본 발명에 있어서는, 그 분자의 주 사슬 또는 측 사슬 중에, 20종류의 단백질을 구성하는 아미노산 외에도, L-오르니틴, 일련의 α-아미노산, β-알라닌, γ-아미노낙산, 산성 아미노산의 ω-에스테르, 염기성 아미노산의 N치환체, 아스파라긴산-L-페닐알라닌 2량체(아스파테임) 등의 아미노산 및 아미노산 유도체, L-시스테인산 등의 아미노술폰산 등을 포함해도 된다.

또, 이들 폴리아미노산은, 선상 구조를 갖는 것이어도, 분기상 구조를 갖는 것이어도 된다.

본 발명에서 사용할 수 있는 폴리아미노산의 평균 분자량으로서는, 바람직하게는 1000~500만의 범위이며, 보다 바람직하게는 1000~100만이다.

또, 폴리아미노산의 분자량은, 중합 조건의 조정(온도, 시간, 용매, 촉매 등)으로 컨트롤 가능한 것 외에, 디시클로카르보디이미드(DCC) 등을 사용한 중합 후에 중합체 끼리를 재결합시킴으로써 조정할 수도 있다.

또 본 발명에서는, 무수 폴리 산성 아미노산, 예를 들면, 폴리아스파라긴산의 무수물, 폴리글루타민산의 무수물 등을 사용하는 것도 가능하다. 이들 중, 공업적 입수가 쉬운 점에서, 폴리아스파라긴산의 무수무인 폴리호박산이미드가 바람직하게 사용된다.

본 발명에 있어서, 산성 폴리아미노산은 특히 바람직하게 사용할 수 있다. 여기에서 말하는 산성 폴리아미노산은, 생리조건적인 pH 조건 하에서 음으로 하전하고 있는 폴리아미노산을 가리킨다. 대전의 상황은 등전점 전기영동이나 적정(titration) 등의 방법으로 파악할 수 있다. 간편하게는, 산성 폴리아미노산을, 분자 중의 카르복시기와 아미노기의 수의 비율에 있어서, 카르복시기의 수가 아미노기의 수보다 많은 폴리아미노산으로 하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서의 폴리아미노산에서는, 그 구성 아미노산 중에, 글루타민산 및/또는 아스파라긴산을 20% 이상 함유하는 것, 바람직하게는 30%, 보다 바람직하게는 50% 이상 함유하는 것이 사용된다. 특히, 폴리아스파라긴산 또는 폴리글루타민산은, 구조가 간단하고 합성하기 쉽기 때문에, 특히 바람직하게 사용된다.

글루타민산 및/또는 아스파라긴산은, 분자 중에 랜덤하게 분포해도, 또는 블럭 형상으로 분포해도 된다. 또, 그래프트·공중합체도 사용할 수 있다.

본 발명의 폴리글루타민산은, 폴리-L-글루타민산이어도, 폴리-D-글루타민산 또는 그 혼합물이어도 된다. 또, L체 D체의 공중합체도 사용할 수 있다. 또, 마찬가지로 본 발명에서의 폴리아스파라긴산은, 폴리-L-아스파라긴산이어도, 폴리-D-아스파라긴산 또는 그 혼합물이어도 된다. 또, L체 D체의 공중합체도 사용할 수 있다.

여기에서, 폴리아스파라긴산이 주 사슬의 기본 골격인 경우에는, 주 사슬 중의 아미드 결합이, α결합인 경우와 β결합인 경우가 있다. 즉, 폴리아스파라긴산 및 그 공중합체의 경우에는, 아스파라긴산 또는 공중합체 단위의 아미노기와, 아스파라긴산의 α위(位)의 카르복시기와 결합한 경우가 α결합이고, 아스파라긴산의 β위(位)의 카르복시기와 결합한 경우가 β결합이다. 본 발명에서는, 그 결합 양식은 특별히 한정되지 않고, α결합, β결합이 각각 단독이어도 혼재해도 된다.

또 마찬가지로, 폴리글루타민산의 경우의 주 사슬 기본 골격은, 주 사슬 중의 아미드 결합이 α결합인 경우와 γ결합, 그리고 양자가 혼재하는 경우가 있는데, 마찬가지로 본 발명에서는 그 결합 양식은 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에 사용하는 폴리아미노산 중, 예를 들면, 폴리아스파라긴산 또는 그 염은, 폴리호박산이미드를 가수분해한 것, 발효법 혹은 효소법에 의해 제조한 것, 아스파라긴산-4-에스테르의 N-카르복시-α-아미노산 무수물(NCA)을 중합하고 에스테르기를 제거하는 등의 방법으로 제조할 수 있다. 폴리호박산이미드는, 통상 주 사슬의 일부 또는 전부가 이미드 고리이므로, 이 이미드 고리를 알칼리나 구핵제와 반응시켜 개환시킴으로써, 폴리아스파라긴산 또는 그 염을 얻을 수 있다.

폴리-α-글루타민산은, 예를 들면 글루타민산γ벤질에스테르의 N-카르복시산 무수물을 중합시키고, 브롬화수소로 탈벤질화함으로써 얻을 수 있다.

또, 본 발명에 있어서의 폴리아미노산은, 미생물에 의해 생합성된 것이어도 된다. 예를 들면, 폴리-γ-글루타민산은, 낫토균으로 대표되는 미생물에 의한 발효법에 의해서도 만들 수 있다.

(산성 다당류)

본 발명에 있어서의 산성 다당류란, 생리적 pH 조건 하에서 음으로 하전하고 있는 것을 말한다. 하전의 상황은, 전기 영동이나 적정 등의 방법으로 용이하게 파 악할 수 있다. 구체적 예로서는, 글리코사미노글리칸, 갈락투론산 및 알긴산 등을 들 수 있다. 글리코사미노글리칸은, 「유리 상태 또는 단백질과 결합하여, 넓게 결합 조직에 존재하는 아미노당을 포함하는 한 군의 산성 다당으로, 뮤코 다당이라고도 불리운다. 구조적으로는 아미노당과 우론산(또는 락토오스)으로 이루어지는 2당의 반복 긴 사슬 구조를 가지며, 황산화되어 있는 것과 황산화되어 있지 않은 것이 있다」(생화학사전 제2판 동경화학동인)고 한다. 글리코사미노글리칸의 대표예로서, 히알루론산, 콘드로이틴, 콘드로이틴 황산, 황산 더마탄, 헤파린, 헤파란 설페이트, 케타란 황산을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 혈액 중에 넣었을 때, 혈소판을 분리하는 작용 이외에 강한 작용을 갖지 않는 것이 바람직하고, 히알루론산은 이 조건을 만족하므로 특히 바람직하게 사용된다.

다른 산성 다당류로서, 덱스트란 황산, 카르복시화 덱스트란 등의 덱스트란 유도체, 카르복시메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 카르복시메틸키토산 등의 키토산 유도체나 구아폴리카르복시산 등이 바람직하게 사용된다.

또, 식품이나 화장품용 등으로서 시판되고 있는 조제품(예를 들면, 식품급 콘드로이틴 황산인 『무코테인-DK』 등)을 이용하는 것도 가능하다. 그리고 본 발명에서는, 산성 다당류의 약리학적으로 허용되는 염도 물론 바람직하게 사용된다.

(수용성 비닐 폴리머)

본 발명의 수용성 비닐 폴리머의 예로서, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴산, 폴리아크릴산나트륨이나 폴리아크릴산암모늄 등의 폴리아크릴염, 폴리메타크릴산 및 그 염, 폴리스틸렌술폰산 및 그 염, 폴리비닐술폰산, 폴리비닐초산, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐아민, 폴리아릴아민, 폴리아릴알콜, 폴리비닐알콜, 에틸렌이민계 폴리머산염, 폴리아미딘, 폴리이소프렌술폰산, 또 각각의 유도체도 사용할 수 있다. 더 예시할 수 있으며 특별히 한정되지 않는다.

수용성 비닐 폴리머 중, 산성 비닐 폴리머 및 그 약리학적으로 허용되는 염은 보다 바람직하게 사용된다. 여기에서 말하는 산성 비닐 폴리머란, 생리적 pH 조건에서 음으로 하전하는 비닐 폴리머를 가리키며, 구체적으로는, 분자 중에, 카르복시기, 술폰산성, 인산기 등의 산성기를 포함하는 비닐 폴리머, 예를 들면, 폴리아크릴산, 폴리아크릴산나트륨, 폴리아크릴산암모늄, 폴리메타크릴산 및 그 염, 폴리스틸렌술폰산 및 그 염, 폴리비닐술폰산, 폴리이소프렌술폰산이 바람직하다.

(혈소판 다혈장의 조제 방법)

본 발명의 혈소판 다혈장을 조제하기 위해, 항응고제를 포함하는 혈액량 1.5mL에 대해, 상기 수용성 고분자 화합물을, 0.0015~150mg, 바람직하게는 0.15~45mg, 보다 바람직하게는 1.5~4.5mg 첨가할 수 있다. 환산하면, 약 0.0001~10w/v%, 바람직하게는 0.01~3w/v%, 보다 바람직하게는 0.1~0.3w/v%가 된다. 보다 다량의 혈소판 다혈장을 조제하는 경우에는, 혈액량을 증가시키고, 상기와 같은 비율로 수용성 고분자 화합물을 첨가할 수 있다.

상기 수용성 고분자 화합물은, 채혈한 혈액을 넣는 용기에 가해 둘 수도 있고, 채혈용 주사통에 직접 가해 둘 수도 있다.

상기의 범위에서 선택되는 양의 수용성 고분자 화합물을, 항응고제를 포함하는 혈액에 첨가하고, 그 화합물이 혈액 전체에 퍼지도록 서서히 혼화한 후 그대로 둠에 따라, 선택 촉진적으로 적혈구의 침강이 인정되고, 상청에서는 혈소판 뿐만 아니라 혈장 성분이나 백혈구 등의 혈액 성분을 포함하는 혈소판 다혈장을 얻을 수 있다. 적혈구의 침강은, 늦어도 3시간, 바람직하게는 2시간 이내에서 인정되고, 빠르면 처리 개시후 10분 정도에 인정되며, 20분 내지 30분 정도에, 본 발명의 목적의 혈소판 다혈장을 얻을 수 있다.

또, 적혈구의 분리가 불충분한 경우나 보다 단시간에서의 분리가 필요한 경우에는, 종래의 적혈구의 응집을 일으키지 않을 정도의 약한 원심 분리를 더 행할 수도 있다. 구체적으로는, 142G에서 5분 이하의 원심 분리를 가할 수 있다.

(본 발명의 혈소판 다혈장의 사용)

본 발명의 방법에 의해 조제된 혈소판 다혈장은, 창상 치유제, 치과 임플란트 주위의 골 조성의 첨가제, 골 결손부에 대한 골 또는 인공 골 이식시의 첨가제, 창상 치유 촉진제, 피부 질환 치료제, 피부 궤양 치료제, 형성 또는 미용을 목적으로 한 치료 혹은 처치 후의 조직 치유 촉진제, 외과 수술 후의 조직 수복제, 정형외과 영역의 수술 후의 조직 수복제, 신경조직 수복제 등 모든 조직, 기관에 있어서의 치유 촉진제로서 적용하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명의 혈소판 다혈장에 의해, 상기의 질환이나 피부 또는 조직의 손상 등을 치료할 수 있다.

본 발명의 혈소판 다혈장은, 사람 뿐만 아니라, 사람을 제외한 포유류에도 적용할 수 있다. 포유류의 예로서는, 특히 지상에 생식하는 동물을 들 수 있고, 일반적으로 애완동물로서 사육되는 개, 고양이, 햄스터 등에도 적용할 수 있다. 또, 경주마나 투우용 소와 같이, 스포츠에 활용되는 동물 등에 대해서도 적용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해, 자기의 혈액으로부터 조제된 혈소판 다혈장은, 상기의 치료 또는 처치의 목적으로 사용할 수 있다. 또, 혈액형이 적합하면 자기의 혈액 유래가 아니더라도 사용하는 것 물론 가능하다.

사용 방법으로서, 구체적으로는 창상 부위에 본 발명의 혈소판 다혈장을 필요량 도포하거나 주입하는 등의 투여 방법을 적용할 수 있다.

(조제용 시약, 기구 및 키트)

본 발명의 혈소판 다혈장은, 상술한 바와 같이, 자기의 혈액으로부터 간편하고 용이하게, 치료 등에 효과적인 혈소판 다혈장을 조제할 수 있다는 것이 최대의 특징이다. 간편하고 용이하게 조제하기 위해서는, 본 발명의 조제 방법에 사용하는 수용성 고분자 화합물을 시약으로 구비해 둠으로써 달성된다.

구체적으로는, 상기 「수용성 고분자 화합물」란에서 설명한 각종 수용성 고분자 화합물을, 바이알이나 앰플 등의 적당한 용기에 충진한 시약, 이들 시약을 복수 개 포함하는 것, 또는 용해액 등을 포함하는 시약 키트 등도 본 발명에 포함된다. 그리고, 본 발명의 조제 방법에 사용되는 기구, 구체적으로는, 채혈에 사용하는 실린지나 채혈관, 나아가서는 채혈된 혈액에 수용성 고분자 화합물을 첨가하기 위한 멸균 처리된 플라스틱 등의 용기 또는 시험관 등을 들 수 있다. 본 발명의 혈소판 다혈장 조제 키트는, 상기 예시한 시약이나 기구로부터 선택되는 시약 및 기구를 키트화한 것을 들 수 있다. 본 키트를 사용함으로써, 채혈한 베드사이드 등으로 용이하게 본 발명의 혈소판 다혈장을 용이하게 조제할 수 있다.

그리고, 본 발명의 수용성 고분자를, 채혈시에 사용하는 실리지나 용기에 미리 충진한 것도 바람직하게 사용된다. 항응고제로서 널리 사용되는 구연산나트륨이나 ACD 중에, 본 수용성 고분자를 녹여 두고, 이를 상술한 실린지나 용기에 충진한 것도 특히 바람직하게 사용된다.

도 1은, 말초혈의 미분 간섭 현미경 사진의 모식도이다(실시예1).

도 2는, 말초혈 상청의 미분 간섭 현미경 사진의 모식도이다(실시예1).

도 3은, 시료2에서 얻어진 상청의 상의 모식도이다(실시예1).

도 4는, 혈액 응고가 보여진 시료1의 상청의 상의 모식도이다(실시예1).

도 5는, 시료4의 상의 모식도이다(실시예1).

도 6은, 각종 폴리아미노산을 첨가하여 1시간 가만히 두었을 때의 효과를 나타낸 도이다(실시예4).

도 7은, 각 중량의 히알루론산을 첨가하여 40분 가만히 두었을 때의 효과를 나타낸 도이다(실시예5).

도 8은, 각종 수용성 고분자를 첨가하여 30분 가만히 두었을 때의 결과를 나타낸 도이다(실시예7).

도 9은, 각종 수용성 고분자를 첨가하여 30분 가만히 두었을 때의 결과를 나타낸 도이다(실시예8).

도 10은, 본 발명법 PRP의 창상 치유 효과를 나타낸 도이다(실시예4).

도 11은, 수술 후 4일째의 본 발명법 PRP의 창상 치유 효과와 종래법 PRP의 창상 치유 효과를 나타낸 도이다(실시예5).

도 12는, 수술 후 4일째의 종래법 PRP와 종래법 PRP에 백혈구를 가한 경우의 창상 치유 효과를 나타낸 도이다(실시예6).

부호의 설명

① 적혈구

② 백혈구

③ 혈소판

④ 무처리(컨트롤)

⑤ 본 발명법 PRP 투여

⑥ 종래법 PRP 투여

⑦ 종래법 PRP에 백혈구를 가한 것을 투여

이하에 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예1

(목적)

본 실시예는, 전혈(말초혈)에 대한 폴리-L-글루타민산나트륨(분자량 21,270)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품)의 첨가에 따른 적혈구의 침강에 대한 영향과 상청의 출현, 및 그 상청 중의 세포 수의 계측, 미분 간섭 현미경에 의한 세포의 형태 관찰을 목적으로 한다.

(재료와 방법)

적침 속도의 차를 비교하기 위해, 다음의 방법으로 4종의 시료를 조제하였다. 항응고제로서의 구연산나트륨 용액은 3.13w/v%가 되도록 조제하였다.

시료1 : 혈액 1.5mL에, 2mg의 폴리-L-글루타민산나트륨을 첨가한다.

시료2 : 구연산나트륨 용액 0.15mL에 혈액을 1.35mL 가하여 전체를 1.5mL로 한 것에, 2mg의 폴리-L-글루타민산나트륨을 첨가한다.

시료3 : 구연산나트륨 용액 0.15mL에 혈액을 1.35mL 가하여 전체를 1.5mL로 한다.

시료4 : 인산 완충액(PBS) 1.5mL에, 2mg의 폴리-L-글루타민산나트륨을 첨가한다.

(결과)

1) 적혈구의 침강에 대하여

상기 각 시료를 30분간 그대로 둔 후의 적혈구의 침강 상황은 다음과 같다.

시료1에서는 관찰 도중에 혈액이 응고되어 버려 적혈구의 침강은 인정되지 않았다. 시료3에 비해, 시료2는 폴리-L-글루타민산나트륨을 혼입함에 따라, 적혈구의 침강이 촉진되었음이 인정되었고, 상청이 관찰되었다.

2) 혈소판 수

상기 각 시료를 30분간 그대로 둔 후의 상청 중의 혈소판 수를 일본광전주식회사(NIHON KOHDEN CORPORATION) 제품 전자동 혈구 측정기 Celltacα(MEC-6318)에 의해 계측하였다. 각 시료의 상청에서의 혈소판 수(10⁴/μl)를 표1에 나타내었다.ㅎ

(표1)

	전혈 (말초혈)	시료1	시료2	시료3
혈소판 수	19.5	1	31.7	12.8

3) 현미경 관찰에 대하여(도1~도5)

각 시료의 상청 부분을 낙사 형광, 미분 간섭 현미경(Nikon ECLIPSE E600)으로 관찰하고 사진촬영하였다.

도1은 말초혈을 나타내고, 도2는 시료3의 상청 부분을 나타낸 배율 1000배에서의 미분 간섭 현미경 사진을 모식적으로 나타낸 도이다. 이 현미경 관찰에 의해, 크기, 색 및 형태로부터 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 비교적 용이하게 분류할 수 있었다.

도3은 시료2에서 얻어진 상청의 상의 모식도이다. 도1에 비해, 적혈구가 적고, 혈소판 및 백혈구가 많이 관찰되었다.

도4는 혈액 응고가 보여진 시료1의 상청의 상의 모식도로, 혈소판은 전혀 인정되지 않았다.

도5는, 시료4의 상의 모식도로, 아무것도 인정되지 않았다.

이들 결과에 의해, 항응고제를 포함하는 전혈에 폴리-L-글루타민산나트륨을 혼입함에 따라, 적침의 상청에 혈소판을 많이 포함하는 혈구 성분이 존재하는 것이 시사되었다.

실시예2

(목적)

본 실시예는, 첨가하는 폴리-L-글루타민산나트륨(분자량 21,270)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품)에 대해, 같은 분자량이지만 첨가량을 바꾼 경우의 효과를 알아보는 것을 목적으로 한다.

(재료와 방법)

다음의 방법으로 5종의 시료를 조제하였다. 항응고제로서 구연산나트륨 3.13w/v%를 혼입한 수용액 0.15mL에 혈액을 1.35mL 가하여 전체를 1.5mL로 한 것을 전혈 시료로 하였다. 각 전혈 시료에 각 중량의 폴리-L-글루타민산나트륨(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품)을 첨가하였다.

시료1 : 폴리-L-글루타민산나트륨 1mg

시료2 : 폴리-L-글루타민산나트륨 2mg

시료3 : 폴리-L-글루타민산나트륨 2.5mg

시료4 : 폴리-L-글루타민산나트륨 3mg

시료5 : 폴리-L-글루타민산나트륨 4mg

(결과)

1) 적혈구의 침강에 대하여

상기 각 시료를 30분간 그대로 둔 후의 적혈구의 침강은, 폴리-L-글루타민산나트륨을 3mg 첨가한 경우에 가장 효과적으로 인정되었다. 그 경우의 상청의 양은 0.8mL이었다.

2) 혈소판 수

상기 각 시료를 30분간 그대로 둔 후의 상청 중의 혈소판 수를 실시예1과 동일하게 계측하였다. 전혈 시료(말초혈)의 혈소판 수는 19.7(10⁴/μl)이었던 것에 반해, 각 시료의 상청에 있어서의 혈소판 수는 34.5(10⁴/μl) 내지 37.0(10⁴/μl)으로 약 2배로 증가하였다.

실시예3

(목적)

본 실시예는, 분자량이 다른 폴리-L-글루타민산나트륨을 혈액에 첨가한 경우의 효과를 알아보는 것을 목적으로 한다.

(재료와 방법)

항응고제로서 구연산나트륨 3.8w/v%를 혼입한 수용액 0.15mL에 혈액을 1.35mL 가하여 전체를 1.5mL로 한 것을 전혈 시료로 하였다. 이것에 분자량이 다른 폴리-L-글루타민산나트륨(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품)을 각각 3mg 첨가하여, 5종의 시료를 조제하였다. 상기 각 시료를 30분간 그대로 둔 경우의 적혈구의 침강을 비교하였다.

시료1 : 폴리-L-글루타민산나트륨 무첨가(컨트롤)

시료2 : 폴리-L-글루타민산나트륨 (분자량 5,800)

시료3 : 폴리-L-글루타민산나트륨 (분자량 17,500)

시료4 : 폴리-L-글루타민산나트륨 (분자량 21,270)

시료5 : 폴리-L-글루타민산나트륨 (분자량 42,000)

(결과)

1) 적혈구의 침강

적혈구의 침강 모습을 관찰한 결과, 폴리-L-글루타민산나트륨의 분자량이 큰 것이 침강을 빠르게 하였음이 인정되었고, 많은 상청량이 확인되었다.

2) 혈구 측정

상청의 혈소판의 농도는, 시료4 및 시료5를 비교한 바, 분자량이 큰 시료5가 높았다.

(표2)

	혈소판 (10⁴/μl)	백혈구 (10²/μl)	적혈구 (10⁴/μl)	상청의 혈액 전체에 차지하는 체적(%)
컨트롤(혈액)^*	20.7	69	424
컨트롤(상청)^**	45.1	118	26	11.2
시료2	44.6	141	6	11.4
시료3	47.5	147	3	14.3
시료4	37.0	90	3	48.9
시료5	38.6	77	2	50

* 말초혈

** 말초혈의 적침후의 상청

실시예4

(목적)

본 실시예는, 각종 폴리아미노산을 혈액에 첨가한 경우의 효과를 알아보는 것을 목적으로 한다.

(재료와 방법)

다음의 방법으로 5종의 시료를 조제하였다.

항응고제로서 구연산나트륨 3.8w/v%를 혼입한 수용액 0.15mL에, 채혈하여 얻은 혈액을 1.35mL를 가하여 전체를 1.5mL로 한 것을 전혈 시료로 하였다. 피험자A 및 피험자B로부터 얻은 혈액에 대해 각각 전혈 시료를 5종씩 조제하고, 각 전혈 시료에 각 중량의 이하의 폴리아미노산을 첨가하였다.

시료1 : 폴리아미노산 무첨가 (컨트롤)

시료2 : 폴리-L-히스티딘

(분자량 20,000)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 3mg

시료3 : 폴리-L-아스파라긴산나트륨

(분자량 8,300)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 3mg

시료4 : 폴리-L-아스파라긴산나트륨

(분자량 35,700)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 3mg

시료5 : 폴리-L-글루타민산나트륨

(분자량 53,785)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 3mg

상기 각 시료를 30분간 그대로 둔 후의 상청의 출현과 혈소판 수를 비교하였 다.

(결과)

1) 상청에 대하여

상기 각 시료를 30분간 그대로 둔 후에 시료2~4 모두에서 상청이 인정되었고, 그 양은 시료5, 3, 4, 2의 순으로 많이 인정되었다. 피험자A의 각 시료를 1시간 그대로 두었을 때의 결과를 도 6에 나타내었다.

2) 혈소판 수

상기 상청 중의 혈소판 수를 실시예1과 동일하게 측정하여, 그 결과를 표 3에 나타내었다. 그 결과, 시료2~4 모두에 대해, 상청 중에 혈소판이 많이 인정되었다.

(표3)

	시료1 (말초혈)	시료2	시료3	시료4	시료5
피험자A	18.7	44.1	38.4	43.5	37.5
피험자B	24.3	44.3	39.2	45.8	37.1

혈소판 수(10⁴/μl)

실시예5

(목적)

본 실시예는, 산성 다당류의 일종인 히알루론산나트륨을 혈액에 첨가한 경우의 효과를 알아보는 것을 목적으로 한다.

(재료와 방법)

항응고제로서 ACD 3.8w/v%를 혼입한 수용액 0.15mL에 혈액을 1.35mL 가하여 전체를 1.5mL로 한 것을 전혈 시료로 하였다. 이것에 각 양의 히알루론산나트륨(계관 유래 : WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. 제품)을 첨가하여, 5종의 시료를 조제하였다.

시료1 : 히알루론산나트륨 무첨가(컨트롤)

시료2 : 히알루론산나트륨 1mg

시료3 : 히알루론산나트륨 2mg

시료4 : 히알루론산나트륨 3mg

시료5 : 히알루론산나트륨 4mg

상기 각 시료를 40분간 그대로 둔 후의 상청의 출현과 혈소판 수를 비교하였다.

(결과)

1) 상청에 대하여

40분간 그대로 둔 후의 상청량을 관찰한 결과, 히알루론산나트륨의 첨가량이 많을수록 상청량은 많았지만, 폴리-L-글루타민산나트륨에 비하면 적었다. 40분간 그대로 두었을 때의 결과를 도 7에 나타내었다.

2) 혈소판 수에 대하여

상기 각 시료를 40분간 그대로 둔 후의 상청 중의 혈소판 수를 실시예1과 동일하게 계측하여, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

(표4)

	시료1 (말초혈)	시료2	시료3	시료4	시료5
혈소판 수 (10⁴/μl)	18.7	23.6	18.5	24.3	20.8

실시예6

(목적)

본 실시예는, 폴리-L-글루타민산나트륨, 폴리아크릴산을 혈액에 첨가하였을 때의 효과를 알아보는 것을 목적으로 한다.

(재료와 방법)

항응고제로서 ACD 3.8w/v%를 혼입한 수용액 0.15mL에 혈액을 1.35mL 가하여 전체를 1.5mL로 한 것을 전혈 시료로 하였다. 이것에 폴리아크릴산 또는 폴리-L-글루타민산나트륨을 첨가하여, 4종의 시료를 조제하였다.

시료1 : 수용성 고분자 화합물 무첨가(컨트롤)

시료2 : 폴리아크릴산

(분자량 2,000)(ALDRICH CHEM. CO 제품) 3mg

시료3 : 폴리아크릴산

(분자량 2,000)(ALDRICH CHEM. CO 제품) 4mg

시료4 : 폴리-L-글루타민산나트륨

(분자량 53,785)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 3mg

상기의 각 시료를 그대로 두고, 30분 후 및 50분 후의 상청의 출현, 및 2시간 후의 상청 중의 혈소판 수를 측정하였다.

(결과)

1) 상청에 대하여

30분 후에는, 시료2 및 3에서는, 컨트롤과의 차는 관찰되지 않았지만, 시료4는 컨트롤에 비해 다량의 상청이 관찰되었다.

50분 후에는, 시료2 및 3의 폴리아크릴산을 첨가한 경우에도 컨트롤과 비교하여 상청의 양이 많았다.

2) 혈소판 수

상기 각 상청 중의 혈소판을 실시예1과 동일하게 계측하여, 표 5에 나타내었다. 시료2~4 모두에서 혈소판 수는 시료1에 비해 많았는데, 특히 시료2 및 3에서 많이 인정되었다.

(표 5)

	시료1 (말초혈)	시료2	시료3	시료4
혈소판 수 (10⁴/μl)	19.6	51.1	52.5	32.2
5시간 후의 상청/혈액 전체의 체적(%)		30.8	30.8	50

실시예7

(목적)

본 실시예는, 각종 수용성 고분자 화합물을 혈액에 첨가하였을 때의 효과를 알아보는 것을 목적으로 한다.

(재료와 방법)

항응고제로서 ACD 3.8w/v%를 혼입한 수용액 0.15mL에 혈액을 1.35mL 가하여 전체를 1.5mL로 한 것을 전혈 시료로 하였다. 각 전혈 시료에 각 중량의 각종 고분자 화합물을 첨가하여, 11종의 시료를 조제하였다.

시료1 : 수용성 고분자 화합물 무첨가(컨트롤)

시료2 : 폴리-L-글루타민산나트륨

(분자량 53,785)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 3mg

시료3 : 폴리아스파라긴산나트륨

(분자량 35,700)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 3mg

시료4 : 폴리아스파라긴

(분자량 10,700)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 3mg

시료5 : 폴리-L-글루타민산나트륨

(분자량 53,785)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 1.5mg과

폴리아스파라긴산나트륨

(분자량 35,700)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 2.5mg의 혼합

시료6 : 폴리-L-글루타민산나트륨

(분자량 53,785)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 2.25mg과

폴리아스파라긴산나트륨

(분자량 35,700) 0.75mg의 혼합

시료7 : 폴리(글루타민산나트륨-티로신(4:1))

(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 2mg

시료8 : 폴리(글루타민산나트륨-티로신(4:1))

(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 4mg

시료9 : 카르복시메틸셀룰로오스나트륨(CMC50)

(GOTOKU CHEMICAL COMPANY LTD. 제품) 2mg

시료10 : 히알루론산나트륨

(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. 제품) 1.5mg과

폴리-L-글루타민산나트륨

(분자량 53,785)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 1.5mg의 혼합

시료11 : 히알루론산나트륨

(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. 제품) 1.8mg과

폴리-L-글루타민산나트륨

(분자량 53,785)(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 1.2mg의 혼합

상기 각 시료를 30분간 그대로 둔 후의 상청의 출현과 혈소판 수를 비교하였다.

(결과)

1) 상청에 대하여

상기 각 시료를 30분간 그대로 둔 후의 상청은, 시료4의 폴리아스파라긴을 첨가한 경우에는 거의 인정되지 않았지만, 그 밖의 시료에 있어서는, 폴리글루타민산나트륨과 동일한 정도 또는 약간 적은 양이 인정되었다. 그대로 둔 후 2시간에서는 시료4에서도 상청이 인정되었다.

30분 그대로 둔 후의 결과를 도 8-1, 2에 나타내었다.

2) 혈소판 수에 대하여

상기 각 시료를 30분간 그대로 둔 후의 상청 중의 혈소판 수를 실시예1과 동일하게 계측하여, 표6에 나타내었다.

(표 6)

시료	1	2	3	4	5	6	7
혈소판 수 (10⁴/μl)	18.5	35.8	38.8	36.5	22.4	31.1	39.8
시료	8	9	10	11
혈소판 수 (10⁴/μl)	36.4	19.9	33.2	31.8

실시예8

(목적)

본 실시예는, 각종 수용성 고분자 화합물을 혈액에 첨가한 경우의 효과를 알아보는 것을 목적으로 한다.

(재료와 방법)

다음의 방법으로 8종의 시료를 조제하였다. 항응고제로서 ACD 3.8w/v%를 혼입한 수용액 0.15mL에 혈액을 1.35mL 가하여 전체를 1.5mL로 한 것을 전혈 시료로 하였다. 각 전혈 시료에 각 중량의 이하의 고분자 화합물을 첨가하였다.

시료1 : 수용성 고분자 화합물 무첨가(컨트롤)

시료2 : 폴리-L-글루타민산나트륨

(분자량 53,785) (SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 3mg

시료3 : 폴리아스파라긴산나트륨

(분자량 35,700) (SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 3mg

시료4 : 히알루론산나트륨

(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. 제품) 3mg

시료5 : 황산덱스트란(MDS Kowa 주(注))

(KOWA COMPANY, LTD. 제품) 6mg

시료6 : 폴리갈락투론산나트륨(SIGMA CHEMICAL. CO. 제품) 3mg

시료7 : 폴리γ-DL-글루타민산나트륨(직쇄형)

(MEIJI SEIKA KAISHA, LTD. 제품) 3mg

시료8 : 폴리γ-DL-글루타민산나트륨염(가교형)

(MEIJI SEIKA KAISHA, LTD. 제품) 3mg

(결과)

1) 상청에 대하여

상기 각 시료를 30분간 그대로 둔 후에는, 시료5 및 6 이외의 시료에서 상청이 관찰되었다. 30분 그대로 둔 후의 결과를 도9-1, 2, 3에 나타내었다. 2시간 후에는, 시료5 및 6에서도 상청이 관찰되었다.

2) 혈소판 수에 대하여

상기 각 시료를 30분간 그대로 둔 후의 상청 중의 혈소판 수(시료5, 6에서는 처리후 약 2시간)를 실시예1과 동일하게 계측하였다.

(표 7)

시료	1	2	3	4	5	6	7
혈소판 수 (10⁴/μl)	20.6	35.1	40.9	33.4	43.5	46	23.2
시료	8
혈소판 수 (10⁴/μl)	29.1

실험예1

(목적)

본 실험예는, 본 발명법에 의해 얻어진 혈소판 다혈장 중의 혈소판의 기능을 알아보는 것을 목적으로 한다. 높은 기능을 갖는 혈소판은 응집하여, 피브린 덩어리와 함께 침강하므로, 이와 같은 혈소판을 포함하는 (상청의) 시료는 투과율이 크다. 이 원리를 이용하여 혈소판 기능의 계측을 수행한다.

(재료와 방법)

본 발명법에 의해 얻어진 혈소판 다혈장 390μL에 염화칼슘을 10μL(12.21g/L), ADP를 40μL(0.2mmol) 첨가한 것을 측정용 시료로 하였다. 이 본 발명법에 의해 채취되는 상청을, 분광 광도계(MCM HEMA TRACER 212(MCMEDICAL))로 파장 690nm에서의 투과율을 측정하였다. 여기에서, 본 발명법에 의해 얻어진 혈소판 다혈장이란, 상기 출발원료에 폴리-L-글루타민산나트륨(3mg)을 첨가하고, 30분간 그대로 두어 얻어진 상청을 말한다.

(결과)

본 발명법에 의해 채취되는 상청은, 백혈구, 혈소판 등을 많이 포함하며, 상당히 현탁되어 있으므로, 이 상청을 142G(1200rpm)에서 10분간 원심하여 혈구 성분을 침강시킨 상층부를 기준 투과율(100%)로 하였다.

염화칼슘, ADP를 첨가하여 30분 그대로 둔 후에 얻은 상청부의 투과율은 100%에 달하여, 본 발명법으로 얻어진 혈소판은 높은 응집 기능을 유지함이 밝혀졌다.

실험예2

(목적)

본 실험예는, 본 발명법 및 종래법으로 얻어진 상청 중(혈소판 다혈장 중) 피브리노겐 양을 측정하는 것을 목적으로 한다. 세포 유주시의 발판이 되는 피브린의 전구체 피브리노겐의 존재는 매우 중요하다. 본 발명법, 종래법에 의해 조제된 혈소판 다혈장의 피브리노겐 양을 측정하였다.

(재료와 방법)

항응고제로서 구연산나트륨 3.8w/v%를 혼입한 수용액 0.15mL에 전혈을 1.35mL 가하여 전체를 1.5mL로 한 것을 출발원료로 한다. 여기에서, 본 발명법에 의해 얻어진 혈소판 다혈장이란, 상기 출발원료에 폴리-L-글루타민산나트륨염(3mg)을 첨가하고, 30분간 그대로 두어 얻어진 상청을 말한다.

시료1 : 본 발명법에 의해 채취한 상청

시료2 : 출발원료를 1회 원심한 후의 혈장 상층(빈혈소판 혈장 : PPP)

(원심 조건 : 1000G×10분)

시료3 : 출발원료를 2회 원심한 후의 혈장(다혈소판 혈장 : PRP)

(원심 조건 : 1000G×10분 및 700G×8분)

각 시료를 0.5mL 채취하여, 광산란법의 측정방법에 의해 피브리노겐 양의 측정을 수행하였다.

(결과)

그 결과, 시료1에서 222mg/dL, 시료2의 PPP에서 252mg/dL, 시료3의 PRP에서 178mg/dL의 피브리노겐이 측정되었다. 이 결과로부터, 본 발명법에 의해 얻어진 상청(혈소판 다혈장) 중의 피브리노겐 양은, 종래법에 의해 제작된 PRP 중의 그것보다 많음이 판명되었다.

실험예3

(목적)

본 실험예는, 종래법에 의해 조제된 혈소판 다혈장(이하 : 종래법 PRP)과 본 발명법에 의해 조제된 혈소판 다혈장(이하 : 본 발명법 PRP)의 각 혈구 수와 혈소판 회수율을 계측하는 것을 목적으로 한다.

(재료와 방법)

종래법 PRP는, 항응고제로서 ACD 3.8w/v%를 혼입한 수용액 0.85mL에 혈액을 가하여 전체를 8.5mL로 한 것을 출발원료로 하고, PRP 키트(크라상주식회사 제품)를 사용하여 조제하였다. 원심기는 Heraeus Labofuge 300을 사용하였다. 1회째 원 심은 3600rpm으로 15분, 2회째 원심은 2400rpm으로 10분 수행하고 상청을 분취하여, 약 0.7ml의 혈소판 다혈장을 채취하였다.

본 발명법 PRP는, 항응고제로서 ACD 3.8w/v%를 혼입한 수용액 0.15mL에 혈액을 1.35mL 가하여 전체를 1.5mL로 한 것을 출발원료로 하고, 출발원료에 폴리-L-글루타민산나트륨염(분자량 53,785)을 3mg 첨가하고, 30분 그대로 두어 상청을 분취하여, 약 0.75ml의 혈소판 다혈장을 채취하였다.

(결과)

각 측정 결과를 표 8에 나타내었다. 혈소판의 회수율은, 다음 식에 따라 구하였다. 그 결과, 본 발명법에 의해 얻어진 혈소판 다혈장은, 종래법에 의한 것보다 더 적은 혈액에서, 효율적으로 혈소판 다혈장이 얻어졌음이 확인되었다.

회수율의 계산 방법=

(회수한 혈소판 수/채혈시의 혈소판 수)×(채취한 PRP량/채혈량)

(표 8)

	컨트롤	종래법 PRP	본 발명법 PRP
백혈구 (10²/μl)	52	53.5	80
적혈구 (10⁴/μl)	351	8	2
혈소판 (10⁴/μl)	18	67.2	33
혈소판 회수율		30.7%	91.7%

실험예4

(목적)

본 실험예는, 본 발명법 PRP를 누드마우스에 적용시키고(본 발명군), 아무것도 투여하지 않는 군(대조군)과 치유효과를 비교하는 것을 목적으로 한다.

(재료와 방법)

본 발명법 PRP는, 실험예3의 방법에 따라 조제하였다.

면역부전마우스 BALB/c-nu/nu(6-11주)를 합계 10마리 사용하여 다음의 처리를 하였다.

1) 마우스의 등에 10mm의 절개를 2개소 넣고, 거기에서부터 상피를 외측으로 5mm 박리하여, 절개창을 만들었다(도 10-1).

2) 사진 우측의 절개창에, 사람의 혈액으로부터 채취한 본 발명법 PRP(약 0.7ml)에 5% 염화칼슘(약 0.07ml)을 가하여 활성화시키고, 응고한 혈소판 다혈장을 50mg 삽입하고, 그 후 나일론사(4-0)로 2침 봉합하였다.

3) 사진 좌측의 절개창에는 아무것도 첨가하지 않고 2침 봉합하여, 대조군으로 하였다.

(결과)

수술 후 4일째부터 7일째에 걸쳐, 본 발명군이 대조군에 비해, 창부의 길이, 폭 모두 작아, 치유촉진효과가 명확히 인정되었다(도 10-2).

실험예5

(목적)

본 실험예는, 본 발명법 PRP를 누드마우스에 적용시키고, 종래법 PRP 투여예 와 치유효과를 비교하는 것을 목적으로 한다. 각 혈소판 다혈장은, 실험예3의 방법에 따라 조제하였다.

(재료와 방법)

면역부전마우스 BALB/c-nu/nu(11주)를 합계 2마리 사용하였다.

1) 마우스의 등에 10mm의 절개를 4개소 넣고, 거기에서부터 상피를 외측으로 5mm 박리하여, 절개창을 만들었다.

2) 2마리의 마우스의 사진 상부 우측의 절개창에, 사람의 혈액으로부터 채취한 본 발명법 PRP를 실험예4와 동일하게 활성화시키고, 응고한 혈소판 다혈장을 50mg 삽입하고, 그 후 나일론사(4-0)로 2침 봉합하였다(도 11-1). 사진 하부 우측의 절개창에는 종래법 PRP를 활성화시키고, 동량을 창부에 첨가하였다(도 11-2).

3) 사진 상부 하부의 좌측의 절개창은 아무것도 첨가하지 않고 봉합하여, 대조군으로 하였다.

(결과)

본 발명법 PRP를 첨가한 절개창이, 상처의 길이, 폭 모두 작아, 종래법 PRP에 비해 높은 치유촉진효과가 보여졌다(도 11-1, 2).

실험예6

(목적)

본 실험예는, 종래법 PRP와 이것에 백혈구를 가한 것의 치유촉진효과를 비교하는 것을 목적으로 한다. 종래법 PRP는, 실험예3의 방법에 따라 조제하였다.

본 발명법 PRP는, 혈소판의 양뿐만 아니라 백혈구의 양도 증가하여, 이것이 치유촉진효과를 더욱 높이는 것으로 예상된다. 이에 따라, 종래법 PRP에도 백혈구를 첨가하여, 첨가한 백혈구가 어떻게 치유에 영향을 주는지 확인하였다.

(재료와 방법)

면역부전마우스 BALB/c-nu/nu(11주)를 합계 4마리 사용하였다.

2) 2마리의 마우스의 사진 상부 우측의 절개창에, 사람의 혈액으로부터 제작한 종래법 PRP를 실험예5와 동일하게 활성화시키고, 응고한 혈소판 다혈장을 50mg 삽입하고, 그 후 나일론사(4-0)로 2침 봉합하였다(도 12-1). 다른 2마리의 마우스에는 동일하게 종래법 PRP에 백혈구를 혼입한 종래법 PRP+백혈구(WBC)를 활성화시키고, 동량을 창부에 첨가하였다(도 12-2).

도 12-1에 나타낸 마우스의 사진 우측의 절개창에, 종래법 PRP를 첨가하였다. 종래법 PRP의 조성은 백혈구 수 53×10²/μl, 혈소판 수 67.1×10⁴/μl이었다.

도 12-2에 나타낸 마우스의 사진 우측의 절개창에, 종래법 PRP+백혈구(WBC)를 첨가하였다. 종래법 PRP에 백혈구(WBC)를 가하였을 때의 조성은 백혈구 수 180×10²/μl, 혈소판 수 68.7×10⁴/μl이었다.

(결과)

백혈구가 많은 혈소판 다혈장(종래법 PRP+백혈구(WBC))이 상처의 길이, 폭 모두 작아, 높은 치유촉진효과가 보여졌다(도 12-1, 2).

실험예7

(목적)

본 실험예는, 종래법에 의해 조제된 혈소판 다혈장(이하 : 종래법 PRP)과 본 발명법에 의해 얻어진 혈소판 다혈장(이하 : 본 발명법 PRP) 중에 포함되는 백혈구의 살균 및 소화능을 알아보는 것을 목적으로 한다. 백혈구의 살균 및 소화능은 마이엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase, MPO) 활성을 지표로 하여 측정한다.

(재료와 방법)

종래법 PRP는, ACD 3.8w/v%를 혼입한 수용액 1.5mL에 혈액을 가하여 전체를 15mL로 한 것을 출발원료로 하고, 실온하 1100rpm, 12분간의 원심분리 후에 상청을 분취하여, 약 7mL의 혈소판 다혈장을 조제하였다.

본 발명법 PRP는, ACD 3.8w/v%를 혼입한 수용액 1.5mL에 혈액을 가하여 전체를 15mL로 한 것을 출발원료로 하고, 출발원료에 폴리-L-글루타민산나트륨염(분자량 53,785)을 30mg 첨가하고, 30분 그대로 둔 후에 상청을 분취하여, 약 7mL의 혈소판 다혈장을 조제하였다.

종래법 PRP와 본 발명법 PRP 각각 2mL를 측정용 시료로 하여, 3회의 동결 융해후, 0.167mg/mL o-디아니시딘 및 0.0005% 과산화수소수와 반응시켜 450nm의 흡광 도 변화를 측정하고, 사람 MPO 표준품(SIGMA사 제품)을 사용하여 정량화하였다.

(결과)

종래법 PRP는 0.045U/mL, 본 발명법 PRP는 0.72U/mL의 MPO 활성을 보여, 본 발명법에 의해 얻어진 PRP 중의 MPO 활성이 종래법에 의해 제작된 PRP의 그것보다 분명하게 높은 것이 판명되었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 혈소판 다혈장의 조제 방법에 의해, 활성이 높은 혈소판 다혈장을 간편하게 제공할 수 있다. 특히, 자기의 혈액 성분을 원료로 하여 본 발명의 방법에 의해 얻어진 혈소판 다혈장이, 조직 및/또는 기관 수복 촉진제, 구체적으로는 치과 임플란트 주위의 골 조성의 첨가제, 골 결손부에 대한 골 또는 인공 골 이식시의 첨가제, 창상 치유 촉진제, 형성 및/또는 미용을 목적으로 한 치료 혹은 처치 후의 조직 치유 촉진제, 피부 질환 치료제, 피부 궤양 치료제, 신경조직 수복제 및/또는 외과 수술 후의 조직 수복제로서 의료의 현장에서 활용될 수 있다.

Claims

혈액으로부터, 적혈구를 선택 촉진적으로 응집 침강시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈소판 다혈장의 조제 방법.
제 1항에 있어서,

혈액이, 채혈하여 얻어진 전혈인 혈소판 다혈장의 조제 방법.
제 1 또는 2항에 있어서,

적혈구를 선택 촉진적으로 응집 침강시키는 방법이, 혈액에 수용성 고분자 화합물을 첨가하는 공정을 포함하는 조제 방법.
혈액에 수용성 고분자 화합물을 첨가하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 혈소판 다혈장의 조제 방법.
제 3 또는 4항에 있어서,

상기 수용성 고분자 화합물이 분자량 1000~500만의 고분자 화합물인 조제 방법.
제 3 또는 4항에 있어서,

상기 수용성 고분자 화합물을, 혈액량에 대해 0.0001~10w/v% 첨가하는 조제 방법.
제 3 또는 4항에 있어서,

상기 수용성 고분자 화합물이, 이하에 나타내는 화합물로부터 선택되는 적어도 1종인 조제 방법:

1) 아미노산 및/또는 아미노산의 약리학적으로 허용되는 염을 포함하는 폴리아미노산

2) 산성 다당류 및/또는 그 약리학적으로 허용되는 염

3) 비닐 폴리머
제 7항에 있어서,

상기 폴리아미노산이, 폴리글루타민산, 폴리아스파라긴산, 폴리히스티딘 또는 폴리아스파라긴으로부터 선택되는 적어도 1종인 조제 방법.
제 7항에 있어서,

상기 폴리아미노산을 구성하는 아미노산 또는 아미노산의 약리학적으로 허용되는 염이, 글루타민산, 아스파라긴산, 히스티딘 및 아스파라긴으로부터 선택되는 적어도 1종 이상 또는 이들의 약리학적으로 허용되는 염을 포함하는 폴리아미노산인 조제 방법.
제 9항에 있어서,

상기 폴리아미노산을 구성하는 아미노산 중, 적어도 20% 이상이 글루타민산 및/혹은 아스파라긴산 또는 이들의 약리학적으로 허용되는 염인 조제 방법.
제 9 또는 10항에 있어서,

상기 폴리아미노산이, 산성 폴리아미노산인 조제 방법.
제 7항에 있어서,

상기 산성 다당류 및/또는 그 약리학적으로 허용되는 염이, 덱스트란 유도체, 글리코사미노글리칸, 셀룰로오스 유도체, 키토산 유도체, 갈락투론산 및 알긴산으로부터 선택되는 적어도 1종 또는 그 약리학적으로 허용되는 염인 조제 방법.
제 7항에 있어서,

상기 산성 다당류 및/또는 그 약리학적으로 허용되는 염이, 히알루론산 또는 그 약리학적으로 허용되는 염인 조제 방법.
제 7항에 있어서,

상기 비닐 폴리머가, 산성 폴리머 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 포함하는 화합물로부터 선택되는 적어도 1종인 조제 방법.
청구의 범위 제 1~14항에 기재된 어느 방법으로 조제된 혈소판 다혈장.
청구의 범위 제 15항에 기재된 혈소판 다혈장을 포함하는 조직 및/또는 기관 수복 촉진제.
청구의 범위 제 15항에 기재된 혈소판 다혈장을 포함하는 조직 및/또는 기관 수복 촉진제, 치과 임플란트 주위의 골 조성의 첨가제, 골 결손부에 대한 골 또는 인공 골 이식시의 첨가제, 창상 치유 촉진제, 형성 및/또는 미용을 목적으로 한 치료 후 혹은 처치 후의 조직 치유 촉진제, 피부 질환 치료제, 피부 궤양 치료제, 신경조직 수복제 및/또는 외과 수술 후의 조직 수복제.
청구의 범위제 15항에 기재된 혈소판 다혈장을 투여함에 따른 이하에 나타내는 어느 치료 방법 또는 처치 방법:

1) 치과 임플란트 주위의 골 조성

2) 피부 질환

3) 형성 및/또는 미용을 위한 조직 수복

4) 골 결손부 수복

5) 신경조직 수복

6) 외과 수술 후의 조직 수복
혈액에 수용성 고분자 화합물을 첨가하는 공정을 포함하는 방법에 의해 혈소판 다혈장을 조제하기 위해 사용하는 수용성 고분자 화합물 중, 이하에 나타내는 적어도 1종 이상의 성분을 포함하는 혈소판 다혈장 조제용 시약 또는 시약 키트:

1) 아미노산 및/또는 아미노산의 약리학적으로 허용되는 염을 포함하는 폴리아미노산

2) 산성 다당류 및/또는 그 약리학적으로 허용되는 염

3) 비닐 폴리머
혈액에, 이하에 나타내는 수용성 고분자 화합물 중 적어도 1종 이상의 성분을 첨가함으로써 혈소판 다혈장을 조제하기 위한 기구:

1) 아미노산 및/또는 아미노산의 약리학적으로 허용되는 염을 포함하는 폴리아미노산

2) 산성 다당류 및/또는 그 약리학적으로 허용되는 염

3) 비닐 폴리머
청구의 범위 제 19항에 기재된 시약 또는 시약 키트 및 청구의 범위 제 20항에 기재된 기구를 포함하는 혈소판 다혈장 조제 키트.