CN107405391B - 治疗外伤患者中的出血的血小板微粒的全身和局部应用 - Google Patents

Abstract

本公开涉及包含血小板微粒的凝血组合物、使用所述组合物的方法以及制备所述组合物的方法。

Description

治疗外伤患者中的出血的血小板微粒的全身和局部应用

相关申请的交叉参考

本申请要求2015年3月4日提出的美国临时申请序列号62/127,890的优先权，所述临时申请的内容以引用的方式整体并入本文中。

发明背景

血小板是从血管系统中循环的骨髓巨核细胞脱落的无核细胞片段。血小板在止血中起到两个重要作用：粘附受损血管的壁，从而形成血小板栓；以及活化血小板依赖性血液凝固途径，此对于纤维蛋白凝块的形成来说是必要的。因此，血小板是凝血开始和控制患者因损伤、外伤、出血性病症或医学干预引起的出血(即流血)的关健。

凝血开始是从血小板粘附受损血管壁开始。在形成初始血小板凝块的损伤部位，冯·维勒布兰德因子(von Willebrand factor，“vWF”)结合于血小板并帮助血小板附接至周围组织中存在的胶原蛋白。纤维蛋白原(一种可溶性血浆蛋白)由酶凝血酶(由活化的因子X活化)转化成不溶纤维蛋白束。凝血酶还将因子XIII转化成活化的因子XIIIa。接着纤维蛋白纤丝经因子XIIIa交联，形成纤维蛋白-血小板网，称为纤维蛋白凝块。

凝血因子X可以由两个不同的途径活化，此两个途径称为外部途径和内部途径。外部途径由内皮下组织因子(“TF”)活化，所述因子正常不存在于完整血管的内腔中。血管的破环导致循环的凝结因子暴露于TF。因子VII被活化成因子VIIa，因子VIIa又将因子X活化成因子Xa。相比之下，内部途径的活化不是始终需要TF，特别是体外。内部途径通过与带负电的物质接触，例如在体内与内皮下胶原蛋白或在体外与玻璃接触而活化-因子XII被活化成因子XIIa，因子XIIa将因子XI转化成因子XIa。在钙离子存在下，因子XIa将因子IX活化成IXa，因子IXa又与因子VIII组合，将循环的因子X活化。因此，凝血的活化取决于若干凝血因子的级联以及血小板的活性。另外，可以进行一个或多个凝血因子测试，以评估特定凝血因子(即纤维蛋白原、vWF、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子XI和因子XII)的浓度和/或活性。

因而，患者的止血常通过分析患者血液样品的血小板数、涉及凝血的多种标记物和凝块形成能力来评估，包括凝结开始所花费的时间量。测量凝血酶原时间(“PT”)和部分促凝血酶原激酶时间(“PTT”)或另称为活化部分促凝血酶原激酶时间(“aPTT”)的凝固分析分别用于评估外部凝固途径和内部凝固途径。凝血弹性描记法(“TEG”)是另一种测试凝血效率的方法。其主要用于外科和麻醉学，并已经被确定为若干临床背景下止血功能的灵敏测试。TEG通过触发凝块形成，接着进行计算机化凝固分析来测量凝血因子活性、血小板功能、凝块强度以及纤维蛋白溶解。这些分析允许检测由疾病、治疗、损伤、外科手术和/或外伤引起的凝血疾病、病症或并发症。

虽然过度凝结会引起血管闭塞，但凝结不够或薄弱可能导致失血过度。血小板不足(称为血小板减少症的病状)的治疗涉及输送存储的血小板、浓缩的血小板、由供血单位制备的血小板。在输送前冷冻血小板会抑制血小板功能并迅速从循环中清除(Murphy等人,“Effect of Storage Temperature on Maintenance of Platelet Viability-Deleterious Effect of Refrigerated Storage”,N Engl.J.Med.280:1094-1098(1969))。因此，血小板最好存储在室温下。因为室温存储具有促进细菌生长的缺点，所以血小板存储通常限于最长5天，使得血小板库存管理受到极大挑战(Kaufman RM,“Platelets:Testing,Dosing,and the Storage Lesion-Recent Advances,”HematologyAm.Soc.Hematol.Educ.Program.1:492-6(2006))。

存储的血小板在输送后存活下来并发挥功能，取得了不同程度的成功。已经轻轻制备并紧接着输血，没有显著存储时间间隔(在捐献后24-48小时内)的血小板统一高度恢复，存活良好，并且功能保存。然而，事实上这是不可能的，因为血液制品在输送前必须清除掉任何感染性疾病；这个过程花费长达48小时。因此，最早的血小板输送是至少48小时。相比之下，在存储7天后，偶有血小板单元实际上将变得无活性，使得这些血小板事实上在输血后显示无存活(Rinder等人,“In Vitro Evaluation of Stored Platelets:Is ThereHope for Predicting Posttransfusion Platelet Survival and Function？”Transfusion.43:2-6(2003))。

在严重pH和代谢紊乱后最常见到无活性。在存储期间，血小板继续在代谢上是活性的。例如乳酸盐等代谢产物积聚，并且pH值下降。已经展示如果pH值降到低于6.0-6.2，那么将严重减少体内存活。在存储期间血小板对许多促效剂的凝聚反应也显著下降(KaufmanRM,“Platelets:Testing,Dosing,and the Storage Lesion-Recent Advances,”Hematology Am.Soc.Hematol.Educ.Program.1:492-6(2006))。然而，尚未证实有体外分析能够可靠地预测体外血小板存活(Kaufman RM,“Platelets:Testing,Dosing,and theStorage Lesion-Recent Advances,”Hematology Am.Soc.Hematol.Educ.Program.1:492-6(2006))。

血小板像其它细胞类型一样，脱落其质膜的0.1-1微米的小片段(称为微粒)。具体地说，血小板微粒(“PMP”)占循环中的总微粒(“MP”)的大约70-90％。健康个体中循环中的PMP的平均浓度是大约2×10⁴PMP/μl。在存储期间，存在于血小板制剂中的PMP的数目随时间而增加，使得大量的PMP与血小板一起输入(Heijnen等人,“Activated PlateletsRelease Two Types of Membrane Vesicles:Microvesicles by Surface Shedding andExosomes Derived from Exocytosis of Multivesicular Bodies and AlphaGranules,”Blood.94:3791-94(2000))。在体内，已经在与血小板活化和促凝血活性有关的临床情况(即肝素诱发的血小板减少症、动脉血栓形成、特发性血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少症以及镰刀形红细胞病)中观测到PMP(Hughes等人,“Morphological Analysisof Microparticle Generation in Heparin-Induced Thrombocytopenia,”Blood.96:188-94(2000)和Mallat等人,“Elevated Levels of Shed Membrane Microparticleswith Procoagulant Potential in the Peripheral Circulating Blood of Patientswith Acute Coronary Syndromes,”Circulation.101:841-3(2000))，表明PMP在凝固、细胞信号传导、血管损伤以及体内平衡中的作用(Hargett等人,“On the Origin ofMicroparticles:From‘Platelet Dust’to Mediators of IntercellularCommunication,”Pulm.Circ.3:329-40(2013))。

先前已经在文献中描述了用于分离血小板微粒的方法。举例来说，颁予Chao的国际专利公布WO 1990/012581公开了一种用于从存储的血液产生PMP的方法。颁予Ho等人的美国专利申请公布2006/0034809公开了包含冻干血小板和冻干血小板微粒的组合物。此外，颁予Jy等人的美国专利8,105,632公开了三种用于产生PMP的替代方法。所述方法包括酸化存储的血小板浓缩物、新分离或存储的血小板进行超声处理以及在钙存在下用钙离子载体处理血小板以诱发血小板活化和PMP产生。

虽然许多团体已经研发出制造分离的血小板微粒组合物的方法，但需要改良的PMP组合物，所述组合物可以使出血患者恢复正常止血，新鲜制备，适合长期存储(长达12个月)，并且从制备开始超过5天的时期内仍然有效。

本文中的公开内容克服本领域中的这些和其它不足。

发明内容

第一方面针对一种凝血组合物，所述组合物包含分离的血小板微粒；一种或多种选自纤维蛋白原、冯·维勒布兰德因子、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子XI和因子XII的凝血因子；以及药物载体。

第二方面针对一种凝血组合物，所述组合物包含当使用凝血弹性描记法测量时有效实现少于两分钟的凝血开始时间的浓度的分离的血小板微粒；和药物载体。

其它方面针对伤口敷料，所述伤口敷料包含一种或多种本发明的凝血组合物和伤口敷料材料。

第三方面针对一种制备具有凝固活性的血小板微粒的组合物的方法。此方法包括获得新鲜的富血小板血浆的样品；使所述样品经历一次或多次冻融循环；对经历过冻融循环的样品进行超声处理以诱发样品中产生血小板微粒；将血小板微粒部分与经过超声处理的样品中的其它组分分离；以及使分离的血小板微粒再悬浮于等渗溶液中。

已经在文献中描述了包含血小板微粒的若干凝血组合物。然而，这些所制备的组合物中无一种组合物像本文中描述的制剂一样有效地恢复正常止血，适合于长期存储(长达12个月)，并且从制备开始超过5天的时期内仍然有效。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以存储在-20℃下1年并维持治疗特性。在一个实施方案中，本发明的组合物可以存储在-80℃下7年并维持治疗特性。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以根据适当应用类型的需要进行稀释。可以稳定剂加入本发明的组合物中。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以是病原体失活的。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以呈液体形式，包括(但不限于)湿绷带、喷雾(例如皮肤损伤或出血部位)、、注射器、IV溶液等等。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以呈任何期望的形式，包括(但不限于)粉末、凝胶、泡沫等等。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以用于任何治疗位置，包括(但不限于)局部应用在受伤/外伤表面、出血患者中IV输注、由麻醉/外科医生局部应用在出血部位上。

附图说明

图1A-1F是血小板血液样品的凝血弹性描记法(“TEG”)图。图1A展示在基线处正常的血小板供体样品的TEG追踪。图1B是血小板减少的样品的TEG追踪。图1D-1F是用存储的血小板(图1D)、存储的血小板微粒(图1E)或冻融的血小板微粒(图1F)处理(比率是8:2)的血小板减少的样品的代表性TEG追踪。图1F中所示的TEG追踪展示α角显著增加，指示纤维蛋白原的浓度较高。

图2A-2C是显示用于分离PMP的方法的比较的影像。

图3是概述凝血酶产生分析数据的影像。图3展示与新鲜供体PRP相比，使用本发明的组合物更佳/更强烈地形成作为活化因子II的凝血酶。

图4是展示TGA结果的影像。

具体实施方式

本文中的公开一般涉及包含血小板微粒(“PMP”)的凝血组合物、使用此类组合物的方法以及制备此类组合物的方法。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以由通用的O供体产生。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以是病原体减少的或病原体失活的。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以经过洗涤并在静脉内施用。

在一个实施方案中，本发明的组合物可以在无特定必要条件下长时间存储，并仍维持生物活性。

在一个实施方案中，本发明的组合物改善和加快凝结过程。

在一个实施方案中，本发明的组合物是一种浓缩产物。

在一个实施方案中，组合物包含约1.0×10⁴-1.0×10¹²个粒子/毫升的浓度的PMP。在一个实施方案中，组合物包含约1.0×10⁵-1.0×10¹¹个粒子/毫升的浓度的PMP。在一个实施方案中，组合物包含约1.0×10⁶-1.0×10¹⁰个粒子/毫升的浓度的PMP。在一个实施方案中，组合物包含约1.0×10⁷-1.0×10⁹个粒子/毫升的浓度的PMP。在一个实施方案中，组合物包含如NanoSight测量，约3.9×10⁸-5.5×10⁸个粒子/毫升的浓度的PMP。在一个实施方案中，组合物包含如流式细胞计测量，约4.0×10⁷-5.0×10⁷个粒子/毫升的浓度的PMP。

在一个实施方案中，每个PMP的尺寸大约10-1000nm。在一个实施方案中，每个PMP的尺寸大约50-750nm。在一个实施方案中，每个PMP的尺寸大约75-500nm。在一个实施方案中，每个PMP的尺寸大约100-400nm。在一个实施方案中，每个PMP的尺寸大约200-300nm。在一个实施方案中，每个PMP的尺寸大约260-290nm。在一个实施方案中，每个PMP的尺寸大约276nm。

在一个实施方案中，组合物的pH值大约7.0-10.0。在一个实施方案中，组合物的pH值大约7.5-9.0。在一个实施方案中，组合物的pH值大约8.0-8.5。在一个实施方案中，组合物的pH值大约8.1-8.4。在一个实施方案中，组合物的pH值大约8.2。

在一个实施方案中，组合物包含约1.0×10³-1.0×10¹⁰μL^-1的血小板(PLT)数。在一个实施方案中，组合物包含约1.0×10⁴-1.0×10⁹μL^-1的PLT数。在一个实施方案中，组合物包含约1.0×10⁵-1.0×10⁸μL^-1的PLT数。在一个实施方案中，组合物包含约1.0×10⁶-1.0×10⁷μL^-1的PLT数。

在一个实施方案中，组合物包含约0-1.0×10⁵μL^-1的白细胞数(WBC)。在一个实施方案中，组合物包含约0-1.0×10⁴μL^-1的WBC。在一个实施方案中，组合物包含约0-1.0×10³μL^-1的WBC。在一个实施方案中，组合物包含约0-0.2×10³μL^-1的WBC数。

在一个实施方案中，组合物包含约10-1000毫克/分升(dL)的浓度的纤维蛋白原(Fib或因子I)。在一个实施方案中，组合物包含约50-500mg/dL的浓度的Fib。在一个实施方案中，组合物包含约100-400mg/dL的浓度的Fib。在一个实施方案中，组合物包含约150-375mg/dL的浓度的Fib。在一个实施方案中，组合物包含约180-368mg/dL的浓度的Fib。

在一个实施方案中，因子V(FV)以约0.5-2.0国际单位(IU)存在于组合物中。在一个实施方案中，FV以约0.6-1.5IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FV以约0.7-1.25IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FV以约0.81-0.94IU存在于组合物中。FV的正常范围是约0.67-1.39IU。

在一个实施方案中，因子VII(FVII)以约0.5-4.0IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FVII以约0.75-3.0IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FVII以约1.0-2.5IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FVII以约1.5-2.25IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FVII以约1.57-2.08IU存在于组合物中。FVII的正常范围是约0.66-1.59IU。

在一个实施方案中，因子VIII(FVIII)以约0.2-2.0IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FVIII以约0.3-1.0IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FVIII以约0.4-0.9IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FVIII以约0.5-0.85IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FVIII以约0.6-0.8IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FVIII以约0.65-0.78IU存在于组合物中。FVIII的正常范围是约0.68-1.56IU。

在一个实施方案中，因子IX(FIX)以约0.5-3.0IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FIX以约0.6-2.0IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FIX以约0.7-1.75IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FIX以约0.8-1.5IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FIX以约0.82-1.45IU存在于组合物中。FIX的正常范围是约0.92-1.61IU。

在一个实施方案中，因子XI(FXI)以约0.5-3.0IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FXI以约0.7-2.0IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FXI以约0.9-1.75IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FXI以约1.0-1.5IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FXI以约1.02-1.49IU存在于组合物中。FXI的正常范围是约0.69-1.54IU。

在一个实施方案中，因子XII(FXII)以约1.0-7.0IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FXII以约1.25-6.0IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FXII以约1.5-5.5IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FXII以约1.75-5.0IU存在于组合物中。在一个实施方案中，FXII以约1.95-4.53IU存在于组合物中。FXII的正常范围是约0.57-1.63IU。

在一个实施方案中，组合物中冯·维勒布兰德因子(vW):Ag的活性百分比是约100-300％。在一个实施方案中，组合物中vW:Ag的活性百分比是约120-250％。在一个实施方案中，组合物中vW:Ag的活性百分比是约140-200％。在一个实施方案中，组合物中vW:Ag的活性百分比是约146-191％。vW:Ag的活性百分比的正常范围是约44-166％活性。

在一个实施方案中，组合物中vW:Act的活性百分比是约10-100％。在一个实施方案中，组合物中vW:Act的活性百分比是约15-80％。在一个实施方案中，组合物中vW:Act的活性百分比是约20-60％。在一个实施方案中，组合物中vW:Ag的活性百分比是约23-40％。vW:Ag的活性百分比的正常范围是约37-174％活性。

在一个实施方案中，组合物中蛋白C(PC)的活性百分比是约25-300％。在一个实施方案中，组合物中PC的活性百分比是约50-250％。在一个实施方案中，组合物中PC的活性百分比是约75-200％。在一个实施方案中，组合物中PC的活性百分比是约100-150％。在一个实施方案中，组合物中PC的活性百分比是约105-142％。PC的活性百分比的正常范围是约37-174％活性。

在一个实施方案中，组合物中蛋白S(PS)的活性百分比是约10-150％。在一个实施方案中，组合物中PS的活性百分比是约20-100％。在一个实施方案中，组合物中PS的活性百分比是约30-80％。在一个实施方案中，组合物中PS的活性百分比是约40-70％。在一个实施方案中，组合物中PS的活性百分比是约50-65％。在一个实施方案中，组合物中PS的活性百分比是约54-62％。PS的活性百分比的正常范围是约37-174％活性。

在一个实施方案中，组合物中抗凝血酶III(ATIII)的活性百分比是约25-250％。在一个实施方案中，组合物中ATIII的活性百分比是约50-200％。在一个实施方案中，组合物中ATIII的活性百分比是约70-150％。在一个实施方案中，组合物中ATIII的活性百分比是约80-125％。在一个实施方案中，组合物中ATIII的活性百分比是约85-105％。ATIII的活性百分比的正常范围是约37-174％活性。

在一个实施方案中，组合物包含约0-1mg/dL的浓度的Hgb。在一个实施方案中，组合物包含约0-0.5mg/dL的浓度的Hgb。在一个实施方案中，组合物包含约0mg/dL的浓度的Hgb。

在一个实施方案中，组合物包含约0-1％的血细胞比容(Hct)。在一个实施方案中，组合物包含约0-0.5％的Hct。在一个实施方案中，组合物包含约0％的Hct。

定义

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所了解相同的含义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或同等的任何方法和材料都可以用于实践或测试本发明，但描述优选的方法和材料。

一般来说，本文中使用的命名法和细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验程序是本领域中众所周知并通用的命名法和实验程序。

标准技术用于核酸和肽合成。技术和程序一般根据本领域和多种通用参考文献中的常规方法进行(例如Sambrook和Russell,2012,Molecular Cloning,A LaboratoryApproach,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY；以及Ausubel等人,2012,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY)，所述方法在该文献通篇中提供。

本文中使用的命名法和在本文中其它地方描述的用于分析化学和有机合成的实验程序是本领域中众所周知和通用的命名法和实验程序。标准技术或其修改用于化学合成和化学分析。

如本文所用，每个以下术语都具有在本节中与其有关的含义。

冠词“一(a/an)”在本文中用于指一个或超过一个(即至少一个)所述物品的语法宾语。举例来说，“一个要素”意谓一个要素或超过一个要素。

如本文所用的“约”在提及例如数量、短暂持续时间等可测量值时，意图涵盖在适合进行所公开的方法时指定值±20％或±10％或±5％或±1％或±0.1％的变化。

术语“异常”在用于生物体、组织、细胞或其组分的上下文中时是指至少一种可观测或可检测的特征与展现“正常”(预期)对应特征的那些生物体、组织、细胞或其组分不同的那些生物体、组织、细胞或其组分。对于一种细胞或组织类型来说正常或预期的特征可能对于不同的细胞或组织类型来说是异常的。

“凝血因子”意指与形成血液凝块的凝血级联中涉及的蛋白质成员至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列一致的多肽、类似物或其片段。示例性凝血因子包括因子VIII、因子IX、因子XI和因子XII。凝血病症包括血友病，其是由因子VIII或因子IX不足引起。

“有效量”或“治疗有效量”在本文中可以互换使用，并指如本文中描述的化合物、制剂、物质或组合物有效实现具体生物学结果的量。此类结果可能包括(但不限于)如通过本领域中适合的任何方式测定的病毒感染的抑制。

如本文所用，“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在生物体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。

如本文所用，“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统引入或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。

如本文所用，“说明材料”包括可以用于传达本发明的组合物和方法的有用性的出版物、记录、图表或任何其它表达媒体。本发明的试剂盒的说明材料可以例如附着至含有本发明的核酸、肽和/或组合物的容器，或与含有核酸、肽和/或组合物的容器一起运送。或者，说明材料可以与容器分开运送，意图说明材料和化合物由接受者协同使用。

“分离”意指从自然状态改变或去除。举例来说，天然存在于活的动物中的核酸或肽不是“分离”，但部分或完全与其自然状态的共存物质分开的相同核酸或肽是“分离”。分离的核酸或蛋白质可以呈基本上纯化形式存在，或可以存在于非自然环境中，例如宿主细胞。

如本文所用，术语“药物组合物”是指至少一种本发明化合物与例如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂等其它化学组分的混合物。药物组合物促进化合物施用至生物体。本领域中存在施用化合物的多种技术，包括(但不限于)静脉内、经口、气雾剂、肠胃外、经眼、经肺和局部施用。

“药学上可接受”是指在组成、配制、稳定性、患者接受度和生物利用度方面，从药理学/毒物学观点，对于患者来说可接受，以及从物理/化学观点，对于制造药物化学家来说可接受的性质和/或物质。“药学上可接受的载体”是指不干扰活性成分的生物活性的有效性并且对其施用的宿主来说无毒的介质。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的物质、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或囊封材料，所述物质参与将本发明内有用的化合物在患者内运载或运输或运载或运输到患者，使得化合物可以发挥其预期功能。典型地，此类构筑体是从一种器官或身体部分运载或运输到另一器官或身体部分。每种载体必须在与制剂的其它成分(包括本发明内有用的化合物)相容的意义上是“可接受的”，并且对患者无害。可以充当药学上可接受的载体的物质的一些实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；褐藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer’s solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及用于药物制剂的其它无毒相容物质。如本文所用，“药学上可接受的载体”还包括与本发明内有用的化合物的活性相容并且对患者来说是生理学上可接受的任何和所有包衣、抗菌剂和抗真菌剂以及吸收延迟剂等等。补充的活性化合物也可以并入组合物中。“药学上可接受的载体”可以进一步包括本发明内有用的化合物的药学上可接受的盐。可以包括在用于实践本发明的药物组合物中的其它额外成分是本领域中已知的，并且描述于例如Remington'sPharmaceutical Sciences(Genaro编辑,Mack Publishing Co.,1985,Easton,PA)，其以引用的方式并入本文中。

“血小板”意指在巨核细胞中形成并在所有哺乳动物的血液中发现的无核圆盘形细胞。血小板经常参与血液凝固。

如本文所用的“样品”或“生物样品”意指来自受试者的生物材料，包括(但不限于)器官、组织、外来体、血液、血浆、唾液、尿和其它体液。样品可以是从受试者获得的材料的任何来源。

术语“受试者”、“患者”、“个体”等等在本文中可以互换使用，并且是指可进行本文中描述的方法的任何动物或其细胞，不管在体外还是原位。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人类。

“治疗有效量”是当施用至患者时本发明的化合物改善疾病症状的量。组成“治疗有效量”的本发明化合物的量将视化合物、疾病病况以及其严重程度、待治疗的患者年龄等等而变化。治疗有效量可以通过本领域的一般技术人员，考虑其自身知识和本公开，按常规来确定。

术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指本文中描述的治疗性或预防性措施。“治疗”方法采用向需要此类治疗的受试者，例如罹患疾病或病症的受试者或最终可能患上此类疾病或病症的受试者施用本发明的组合物，以预防病症或复发病症、治愈病症、延迟病症、降低病症的一种或多种症状的严重程度或改善病症的一种或多种症状，或延长受试者的存活超过在缺乏此类治疗下预期的存活。

范围：在本公开通篇中，本发明的多个方面可以呈范围格式呈现。应了解，呈范围格式的描述仅仅为了方便和简洁起见，并且不应视为对本发明的范围的强硬的限制。因此，范围的描述将视为明确地公开所有可能的子范围以及该范围内的个别数值。举例来说，例如1至6等范围的描述应视为明确地公开例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子范围，以及该范围内的个别数目，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围宽度如何，此都施用。

描述

因此，第一方面涉及一种凝血组合物，所述组合物包含分离的血小板微粒；一种或多种选自纤维蛋白原(因子I)、冯·维勒布兰德因子、因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI和因子XII的凝血因子；以及药物载体。

在一个实施方案中，凝血组合物包含表3中阐述的组分。

另一方面涉及一种凝血组合物，所述组合物包含当使用凝血弹性描记法测量时有效实现少于两分钟的凝血开始时间的浓度的分离的血小板微粒，和药学上可接受的载体。

血小板微粒(“PMP”)是与血小板活化、应激或细胞凋亡相关，从血小板释放的约0.1-1微米微粒，其内容包括血小板粒状蛋白，例如P-选择素，以及多种血小板表面膜糖蛋白，例如糖蛋白(GP)IbAX或GPIIb/IIIa。

本发明组合物的分离的血小板微粒可以从任何来源获得，所述来源包括(但不限于)哺乳动物，例如人类、犬或其它犬科动物、猫或其它猫科动物、小鼠、大鼠或其它啮齿类动物；猪、马、绵羊、山羊、牛或其它家畜；以及猴子、黑猩猩、猿或其它灵长类动物。也就是说，组合物可以包含来自任何哺乳动物物种的血小板微粒，包括(但不限于)人类、灵长类动物、犬科动物、猫科动物、牛类动物、羊类动物、猪科动物、马科动物和啮齿类动物。另外，血小板微粒相对于在本文公开的方法中与其混合的组合物的其它血液组分可以是自体的或异源的。血小板微粒可以(但不一定)与组合物的其它血液组分从相同患者获得(即自体血小板)。然而，在一些实施方案中，血小板从除患者外的一个或多个个体获得(即异源血小板)。在某些实施方案中，血小板微粒来源于从两个或更多个供体获得的一池血小板微粒。

本文所述的组合物中血小板微粒的浓度可以>10¹²个微粒/微升、>5×10¹²个微粒/微升、>10¹³个微粒/微升或>5×10¹³个微粒/微升。在一个实施方案中，本文所述的凝血组合物中血小板微粒的浓度>10¹⁴个微粒/微升。举例来说，组合物中微粒的浓度可以介于1-9×10¹⁴个微粒/微升之间、2-8×10¹⁴个微粒/微升之间、3-7×10¹⁴个微粒/微升之间或4-6×10¹⁴个微粒/微升之间。

本文所述的组合物的血小板微粒可以在用于治疗受试者前进行多种处理。一般来说，从富血小板血浆或从全血获得血小板微粒。其可以通过任何合适方法浓缩，包括(但不限于)如本文中描述的离心和过滤。除浓缩外，其可以用盐水或另一合适溶液洗涤一次或多次，以去除一些或所有其它血液组分。同样，其可以呈包装浓缩物来维持，很少或基本上没有液体介质包围其，或悬浮在可以含有稳定剂或与血小板微粒相容的其它物质的合适水溶液或缓冲液中。其也可以过滤或从过滤产物制备，并且可以进行病原体处理，以使许多病毒和细菌失活；这是一种意图减少在全身使用的应用中非常关键的输血传播感染的风险的方法。局部抗生素也可以加入局部使用的应用中以使污染风险最小。

本文所述的凝血组合物可以含有至少一种或多种凝血因子。合适的凝血因子包括天然存在或重组产生的预防或减少受试者体内出血事件持续时间的任何分子或其类似物。示例性凝血因子包括(但不限于)纤维蛋白原、冯·维勒布兰德因子、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、激肽原、激肽释放酶原、激肽释放酶、组织因子、凝血酶和凝血酶原。在一个实施方案中，凝血组合物包含至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或至少六种选自纤维蛋白原、冯·维勒布兰德因子、因子V、因子VII、因子VIII和因子XI的凝血因子。另外，组合物可以进一步包含一种或多种对于凝血因子功能而言具有重要意义的辅因子。举例来说，组合物可以包含钙、磷脂和维生素K。

凝血组合物的一种或多种凝血因子可以是人类凝血因子，或例如来源于非人类灵长类动物或任何哺乳动物的非人类凝血因子。一种或多种凝血因子还可以是嵌合凝血因子，例如凝血因子可以包含一部分人类凝血因子和一部分任何非人类凝血因子或一部分第一非人类凝血因子和一部分第二非人类凝血因子。

本文所述的凝血组合物的一种或多种凝血因子可以是活化凝血因子。或者，一种或多种凝血因子可以呈非活性形式，例如酶原。非活性凝血因子可以在施用至受试者后活化。或者，非活性凝血因子可以在施用前活化。

凝血组合物的凝血因子以有效促进凝血的浓度或活性水平存在于凝血组合物中。举例来说，组合物中纤维蛋白原的浓度在172-409mg/dL的正常参考范围内，此表明正常凝结活性。同样，冯·维勒布兰德(vW)因子和其它凝血因子以对应于有效形成血液凝块的水平的浓度或活性水平存在于组合物中，例如vW抗原活性的参考范围是正常的44-166％活性(其中100％是正常)，vW因子瑞斯托菌素辅因子活性的参考范围是正常活性的37-174％，因子V凝血活性的参考范围是正常活性的67-139％，因子VII凝血活性的参考范围是正常活性的66-159％，因子VIII凝血活性的参考范围是正常活性的68-159％，并且因子XI活性的参考范围是正常活性的69-154％。测量多种因子的凝血活性水平或其浓度的实验测试是本领域中众所周知的并且按常规进行。

本文所述的凝血组合物的药学上可接受的载体组分包含任何可接受的物质、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料，例如脂质体、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇化脂质体、纳米粒子等等，所述物质参与将主题化合物或治疗剂从一种器官或身体部分运载或运输到另一器官或身体部分。每种载体必须在与制剂的其它成分相容的意义上是“可接受的”，并且对患者无害。示例性药物载体描述于例如Remington’sPharmaceutical Sciences”和“Encyclopedia of Pharmaceutical Technology”,J.Swarbrick和J.C.Boylan(编辑),Marcel Dekker,Inc:New York(1988)。可以充当药学上可接受的载体的物质的一些实例包括：(i)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(ii)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(iii)纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(iv)粉末状黄芪胶；(v)麦芽；(vi)明胶；(vii)滑石；(viii)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(ix)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(x)二醇，例如丙二醇；(xi)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(xii)酯，例如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；(xiii)琼脂；(xiv)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(xv)褐藻酸；(xvi)无热原水；(xvii)等渗盐水；(xviii)林格氏溶液；(xix)乙醇；(xx)磷酸盐缓冲溶液；以及(xxi)用于药物制剂的其它无毒相容物质。最佳药学上可接受的载体可以视投药途径和所需剂量而变化。药学上可接受的载体将优选产生液体或半液体(例如凝胶)凝血组合物。

在一个实施方案中，本文所述的凝血组合物具有在正常参考范围内的凝血酶原时间。如在本申请的其它地方描述，凝血酶原时间(“PT”)是凝血外部途径的尺度，并评估凝血因子VII、X、V、II和纤维蛋白原。凝块形成时间所花费的时间是PT。PT的正常参考范围代表住在特定区域的健康人的平均值，且该范围可以在区域之间并随时间而变化。正常参考范围可以视实验室和测试而变化。然而，PT的正常参考范围通常介于9.0-14.0秒之间。PT的正常范围也可以呈代表称为国际标准化比率(INR)的比率的数目给出。正常INR是0.9-1.1。

在另一个实施方案中，本文所述的凝血组合物具有在正常参考范围内的部分促凝血酶原激酶时间。如在本申请的其它地方描述，部分促凝血酶原激酶时间(“PTT”)或活化部分促凝血酶原激酶时间(“APTT”)是凝血内部途径的尺度，并评估凝血因子XII、XI、IX、VIII、X、V、II(凝血酶原)和纤维蛋白原以及激肽释放酶原(“PK”)和高分子量激肽原(“HK”)。形成凝块所花费的时间是部分促凝血酶原激酶时间(“PPT”)。正常参考范围视区域和进行测试的实验室变化。然而，PPT的典型参考范围是25-50秒。

本文所述的凝血组合物的血液凝固、血小板功能、凝结强度和纤维蛋白溶解的效力还可以使用凝血弹性描记法(“TEG”)评估。TEG包括将全血样品加入旋转比色皿，在旋转比色皿中低剪切环境模拟缓慢流动。附接于扭丝的塑料销下降至比色皿中。当血液凝结时，在比色皿与销之间形成纤维蛋白束且线的扭转改变。由线扭转的变化计算形成凝块的速度和强度，产生雪茄形图。可以从凝血弹性图的形状很快地评估止血的总体异常。针对以下分析TEG图：反应时间(“R-时间”)，其代表初始纤维蛋白形成的速率；凝块形成速度(K-时间)，其是从R结束开始，直到凝块到达20毫米的时间；α-角，其是当到达K时，形成的曲线的切线；以及最大振幅(“MA”)，其与凝块的绝对强度相关。α-角是凝血酶产生和纤维蛋白形成的速率的尺度。由制造商确定的数学公式可以用于确定凝血指数(CI)(或凝固性的总体评估)，此公式将此4个值的每一个的相对贡献考虑至1个等式内。TEG值的正常参考范围如下：R-时间是5-10分钟；K-时间是1-3分钟；α-角是53-72°；MA是50-70mm；以及CI是-3至3。在一个实施方案中，本文所述的凝血组合物具有在正常参考范围内的TEG值。

在一个实施方案中，当使用凝血弹性描记法测量时，本文所述的凝血组合物具有少于三分钟的凝血开始时间(R-时间)。在另一个实施方案中，当使用凝血弹性描记法测量时，本文所述的凝血组合物具有少于两分钟的凝血开始时间。在另一个实施方案中，凝血组合物的R-时间少于150秒、少于140秒、少于130秒、少于120秒、少于110秒、少于105秒、少于100秒、少于90秒、少于80秒、少于70秒或少于60秒。

举例来说，图1A-1F说明血小板血液样品的TEG图。具体地说，图1B说明血小板减少的样品的TEG图，图1C显示具有供体的新鲜血小板的血小板减少的样品的TEG图，且图1E显示经存储的PMP处理的血小板减少的样品的TEG图。注意与图1C的R-时间相比，图1E中的R-时间极低。这些图说明经新鲜与存储的血小板制剂处理的血小板减少的样品之间凝固时间的差异。

凝血组合物可配制用于局部施用。示例性局部制剂包括(不限于)可以局部应用至需要治疗的区域的喷雾、粉末、乳膏、凝胶、软膏、洗剂、膏药、绷带、薄膜、敷料或生物可吸收的贴片。或者，凝血组合物配制用于全身性施用。举例来说，凝血组合物可以配制成液体(例如溶液、分散液、悬浮液或乳液)。

本文所述的凝血组合物的配制将在很大程度上取决于所选施用形式。用于本发明的凝血组合物的生理学上可接受的载体、媒介物和/或赋形剂可以由本领域技术人员针对特定用途按照惯例选择。这些包括(但不限于)溶剂、缓冲剂、惰性稀释剂或填充剂、悬浮剂、分散或润湿剂、防腐剂、稳定剂、螯合剂、乳化剂、消泡剂、软膏基质、穿透增强剂、湿润剂、软化剂和皮肤保护剂。

溶剂的实例包括水、林格氏溶液、U.S.P.、等渗氯化钠溶液、醇、植物油、海洋油和矿物油、聚乙二醇、丙二醇、甘油和液体聚烷基硅氧烷。惰性稀释剂或填充剂可以是蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠。

缓冲剂的实例包括柠檬酸、乙酸、乳酸、氢磷酸和二乙胺。合适悬浮剂包括例如天然存在的树胶(例如刺槐、阿拉伯胶、黄原胶和黄蓍胶)、纤维素(例如羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素)、褐藻酸盐和脱乙酰壳多糖。分散剂或润湿剂的实例是天然存在的磷脂(例如卵磷脂或大豆磷脂)、环氧乙烷与脂肪酸或长链脂肪族醇的缩合产物(例如聚氧化乙烯硬脂酸酯、聚氧化乙烯山梨糖醇单油酸酯以及聚氧化乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。

防腐剂可加入本文所述的凝血组合物以预防可能影响制剂稳定性并在患者中引起感染的微生物污染。防腐剂的合适实例包括对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丁酯和对羟基苯甲酸异丙酯)、山梨酸钾、山梨酸、苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯氧乙醇、溴硝醇、溴多斯(bronidox)、MDM乙内酰脲、碘丙炔基丁基氨基甲酸酯、苯扎氯铵(benzalconiumchloride)、溴化十六烷基三甲铵和苯甲醇。螯合剂的实例包括EDTA钠和柠檬酸。

凝胶基质或增粘剂的实例是液体石蜡、聚乙烯、脂肪油、胶态二氧化硅或铝、甘油、丙二醇、羧乙烯聚合物、硅酸镁铝、亲水聚合物(例如淀粉或纤维素衍生物)、水可膨胀的水状胶体、角叉莱胶、透明质酸盐和褐藻酸盐。适用于本发明的药物组合物中的软膏基质可以是疏水性或亲水性的；并且特定实例包括石蜡、羊毛脂、液体聚烷基硅氧烷、鲸蜡醇、鲸蜡醇棕榈酸酯、植物油、脂肪酸的脱水山梨糖醇酯、聚乙二醇以及脂肪酸的脱水山梨糖醇酯、环氧乙烷之间的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)和聚山梨酸酯。

在某些实施方案中，或者或另外，本文所述的凝血组合物可以包含其它类型赋形剂，包括增稠剂、生物粘附聚合物和穿透增强剂。

增稠剂一般用于增加粘性并改善药物组合物的生物粘附性。增稠剂的实例包括(但不限于)纤维素、聚乙二醇、聚氧化乙烯、天然存在的树胶、明胶、刺梧桐树胶、果胶、褐藻酸和聚维酮。在某些实施方案中，增稠剂因其触变性而选择(即粘性在震荡或搅拌下降低)。凝血组合物中此类试剂的存在允许组合物粘性在施用时降低，从而促进其涂覆，例如涂覆至待修复的皮肤区域，并在涂覆后粘性增加，使得组合物保持在施用部位。

本公开的另一方面涉及一种伤口敷料，所述伤口敷料包含如本文中描述的凝血组合物和伤口敷料材料。伤口敷料材料包含应用至伤口以保护、吸收、排水等的任何材料。举例来说，伤口敷料材料可以包含纱布薄膜(例如聚氨基甲酸酯薄膜)、水状胶体(结合于聚氨酯泡沫的亲水性胶体粒子)、水凝胶(含有约至少60％水的交联聚合物)、泡沫(亲水性或疏水性)、褐藻酸钙(来自褐藻酸钙的纤维的无纺合成物)、赛珞玢(具有增塑剂的纤维素)、褐藻酸盐、多糖浆糊、颗粒和/或珠粒。合适伤口敷料材料为本领域中已知并包括(不限于)颁予Rische的美国专利公布No.2007/0270730、颁予Penegor的美国专利公布No.2004/0243044、颁予Johnson的美国专利No.7,652,190和颁予Altshuler的美国专利No.4,363,319中公开的材料，这些文献以引用的方式整体并入本文中。

根据此方面，伤口敷料材料可以用本文所述的凝血组合物涂布。或者，伤口敷料材料可以浸有本文所述的凝血组合物。

本公开的凝血组合物和/或伤口敷料还可以含有其它凝血加速剂，例如多磷酸盐，以及抗生素、抗真菌剂、抗感染剂、抗菌剂、消炎剂、止痛剂、抗组胺剂和其组合。

本文所述的凝血组合物适用于促进个体体内血液凝块形成。因此，另一方面针对一种促进出血的个体体内血液凝块形成的方法。此方法包括向所述受试者施用有效促进血液凝块形成的浓度的凝血组合物。

根据此方面，受试者可以是任何动物，包括(但不限于)哺乳动物。举例来说，受试者可以是人类、灵长类动物、狗、猫、啮齿类动物、鸟、母牛、绵羊、马、山羊、猪等等。在一个实施方案中，受试者是人类受试者。

在一个实施方案中，受试者的出血是由伤口或外伤引起。在另一个实施方案中，受试者的出血是由外科手术引起。将凝血组合物施用至受试者增强或增加受试者的凝血速率以减慢或停止出血。因此，凝血组合物以有效诱发或增强所需凝血的合适剂量施用。本文所述的凝血组合物的施用有时可以完全终止出血，或在其它情况下，减少或抑制出血量，从而有助于正常的凝块形成过程。优选利用可以促进所需凝血的最低有效剂量。最佳应用剂量和频率将视伤口或外科手术部位而变化，并可以使用本领域技术人员容易知道的技术确定。

在另一个实施方案中，受试者罹患出血病症或疾病，例如免疫或特发性血小板减少性紫癜、药物和化学疗法诱发的血小板减少症以及其它血小板减少症、冯·维勒布兰德病、血友病和其它遗传性或后天性凝固障碍。血小板减少症由多种原因引起，例如特发性血小板减少性紫癜、治疗上或意外暴露于引起血小板减少症的细胞毒性剂(例如癌症化学疗法)或由药物或全身性疾病或先天性或后天性形式引起的血小板功能削弱。在此实施方案中，向受试者施用凝血组合物增强或增加受试者的凝血速率以减慢出血或随时终止出血，例如由例如拔牙、较小伤口等较常规的程序导致的出血情况。在此实施方案中，凝血组合物以有效战胜出血病症以诱发或增强所需凝血的合适剂量施用。最佳应用剂量和频率将视病症和出血来源而变化，但可以使用本领域技术人员容易知道的技术确定。

可以通过其他人，例如保健医生向受试者施用凝血组合物，或可以由受试者向受试者施用，即自投。组合物可以通过例如使用本文中描述的伤口敷料，直接局部施用至出血部位或紧邻出血部位的部位来施用。或者，组合物可以通过输注或注射施用。

本文所述的凝血组合物为本领域中已知和目前临床实践中可用的血小板组合物提供了若干优点。值得注意地，在输送血小板后，由所需大体积血浆(每个血小板单元约250ml)引起的不良反应是常见的(据报导发生率在5％至31％范围内)。针对本文中描述的全身性使用设计的血小板微粒凝血组合物不含供体血浆，排除了此不良反应。另一方面，并为了得益于产物中存在的浓缩凝血因子，去除供体血浆在局部施用中并不重要，因为预期这里的不良反应极小，几乎可以忽略；暴露非常有限。因此，本文所述的组合物可以显著减少输送血小板的需要，改善血小板库存，并且最重要地，减少不良输血反应。表1概述与本领域中已知的已存在的血小板产品(即血库血小板单元)相比，本公开的凝血组合物的益处。

表1：PMP组合物与本领域中已知的血库血小板单元的比较。

另一方面针对一种制备具有凝固活性的血小板微粒的组合物的方法。一般说来，此方法包括以下步骤：获得新鲜的富血小板血浆的样品；使所述样品经历一次或多次冻融循环；对经历过冻融循环的样品进行超声处理以诱发样品中产生血小板微粒；将血小板微粒部分与经过超声处理的样品中的其它组分分离；以及使分离的血小板微粒再悬浮于等渗溶液中。

如在本申请的其它地方所述，可以从任何来源获得本发明的分离的血小板微粒。一般说来，可以从新鲜供体血液获得新鲜的富血小板血浆，短于一天。因此，举例来说，新鲜的富血小板血浆可以在收集供体血液后立即获得。优选地，在收集供体血液后不到24小时、20小时、15小时、10小时、5小时、2小时、1小时、0.5小时或0.25小时，获得富血小板血浆。

富血小板血浆可以进行一次或多次冻融循环。在一个实施方案中，富血小板血浆进行一次冻融循环。一般说来，富血小板血浆在低于冰点的温度下培育至少足够使样品冷冻的时间。接着样品在较高温度下培育至少足够使样品解冻的时间。如本文所用，术语“冻融循环”意指首先通过冷却来冷冻样品并接着通过加热来解冻的过程。举例来说，新鲜收集的富血小板血浆冷冻在-20℃下至少一小时到至少过夜或更长时间。或者，新鲜收集的富血小板血浆冷冻在-80℃下至少一小时到至少过夜或更长时间。一旦冷冻，样品可以在37℃下解冻，历时不到一小时、不到45分钟、不到30分钟、不到15分钟、不到10分钟或不到5分钟。

在一个实施方案中，除血小板微粒外，分开的微粒部分包含有效量的一种或多种凝血因子。示例性凝血因子描述于上文中并包括(不限于)纤维蛋白原、冯·维勒布兰德因子、因子V、因子VII、因子VIII和因子XI。

根据此方面，制备微粒组合物的方法包括将冻融的富血小板血浆样品超声处理，以诱发血小板微粒产生。如本文所用，“超声处理”是指施加高频声能(以搅动粒子)，例如(但不限于)超声波。此类暴露可以通过采用例如并不限于约10kHz至约1,000kHz的声波频率来进行。对于超声处理，可以利用熟练技术人员众所周知的多种市售仪器作为用于本发明的方法的声波来源。超声处理可以连续或以多次循环进行，其中每次循环包括一定持续时间的“打开”状态和一定持续时间的“关闭”状态。在本发明的一优选实施方案中，制备微粒组合物的方法包含脉冲式超声处理。

制备微粒组合物的此方法进一步包括将血小板微粒部分与超声处理的样品中的其它组分分开。举例来说，血小板微粒可以通过任何合适方法，包括(但不限于)过滤、离心或超速离心来与超声处理的样品中的其它组分分开。在一个实施方案中，制备微粒组合物的方法包括将样品超速离心超过10分钟、超过20分钟、超过30分钟、超过40分钟、超过50分钟或超过60分钟以产生血小板微粒小球。

分开的血小板微粒再悬浮于等渗溶液中。如本领域中已知，适合于再次悬浮血小板的溶液包括若干盐溶液，包括(但不限于)包含氯化钠(NaCl)和氯化钾(KC1)的溶液，例如PBS。

实施例

通过参考以下实验实施例，进一步详细描述本发明。除非另作说明，否则这些实施例仅仅出于说明的目的来提供，并且不意图限制。因此，本发明决不应视为限于以下实施例，而应视为涵盖作为本文中提供的讲授内容的结果，显而易见的任何和所有变体。

未进一步描述，咸信本领域的技术人员可以使用先前描述及以下例示性实施例制备和利用本发明的化合物并实施所主张的方法。因此，以下实施例明确指出本发明的优选实施方案，且不应视为以任何方式限制本公开的其余部分。

实施例1：从存储的血液产生血小板微粒

为了产生浓缩的PMP组合物，使用新颖的技术，利用新鲜收集的血小板来分离血小板。从正常的供体收集血液后，将富血小板血浆样品加工并立即在-20℃下冷冻过夜。接着冷冻样品在37℃下解冻5分钟。使血小板微粒与血清样品中的其它组分分开并再悬浮于等渗溶液中。

实施例2：来自存储血液的PMP的凝血弹性描记法分析

为评估未经超声处理的血小板微粒(“PMP”)组合物介导凝固活性的能力，本领域中已知的方案用于制备新鲜血小板(“PLT”)和存储血小板组合物。使用凝血弹性描记法(“TEG”)评估PMP、新鲜PLT和存储PLT的五个供体样品。值得注意地，在正常PLT数(250-300×10⁹/L)的样品上进行所有实验。

在基线下、在血小板减少状态下和在以8:2的比率用新鲜PLT、存储PLT和PMP处理血小板减少样品后，测试样品。图1A-E展示由存储PLT产生的PMP对凝块动力学的有益作用显著大于存储PLT自身。虽然在存储PLT(洗涤或未洗涤)与PMP之间凝块强度(由TEG的最大振幅(“MA”)参数指示)未有不同，但PMP显著地减少凝块开始时间(R-时间更短)，并增加凝血酶产生和纤维蛋白形成的速率(α角增加)(表2)。凝血指数(“CI”)是样品凝固性的整体评估。这些发现表明主要含有PLT膜的PMP在PLT输血中是必不可少的，且或许在控制出血上比存储PLT自身更重要。

表2：血小板和PMP组合物的凝血弹性描记法分析。

*p＝0.006；**通过学生t检验(t-Student test)并与存储PLT比较，p<0.001。

实施例3：从新鲜血液产生经过超声处理的血小板微粒

从新鲜供体血液制备富血小板血浆(“PRP”)，短于一天。PRP以250×g离心12分钟。接着将前列腺素I2(1μl/ml PRP)加入样品。样品在800×g下再离心10分钟。从顶部去除超过一半体积的乏血小板血浆(“PPP”)。血小板再悬浮于剩余PPP中，形成浓缩物(1000×10³)。接着样品冷冻在-80℃下过夜，在37℃下解冻5分钟，放在冰上，并超声处理(打开/关闭4秒，3次)，以诱发血小板微粒产生。通过在2,100×g下离心12分钟，接着在18,000×g下离心60分钟，将血小板微粒与血清样品中的其它组分分开。接着去除上清液并将PMP再悬浮于一半体积的无阳离子Tyrodes缓冲液。PMP存储在冰上，直到使用。

在一些情况下，如下产生PMP组合物：

·来自正常供体的新鲜PRP(PC或单采血液成分术)

·浓缩至特定PLT数(离心)

·浓缩PLT可以使用稳定剂/稀释剂在此步骤洗涤(需要时)

·立即冷冻在-20℃下，至少24小时

·在37℃水浴下解冻5-10分钟

·在50瓦下超声处理(3mm探针直径)，打开2秒，关闭2秒，4次(VibraCell探针超声波仪，型号VC50，Sonics and Materials Inc.,Danbury,CT)

·通过超滤、超速离心或冻干，浓缩最终溶液

表3：最终产物的组分

组分	值范围(单元)
		通过NanoSight，PMP浓度	3.9-5.5×10<sup>8</sup>个粒子/毫升
通过FlowCytometry，PMP浓度	4-5×10<sup>7</sup>/mL
		PMP尺寸*	276±14.3nm
pH	8.2
		PLT数	1×10<sup>6-7</sup>/μL
WBC	0-0.2×10<sup>3</sup>/μL
		Hgb	0mg/dL
Hct	0％
		Fib	180-368mg/dL
FV	0.81-0.94IU
		FVII	1.57-2.08IU
FVIII	0.65-0.78IU
		FIX	0.82-1.45IU
FXI	1.02-1.49IU
		FXII	1.95-4.53IU
vW Ag	146-191％
		vW Act	23-40％
PC	105-142％
		PS	54-62％
ATIII	85-105％

实施例4：来自新鲜血液的经过超声处理的PMP的凝血弹性描记法分析

将包含从新鲜血液分离的经过超声处理的PMP的血小板微粒制剂与新鲜PLT比较。简单地说，通过TEG评估六个PLT供体样品。在基线下、在血小板减少状态下和在以8:2的比率用新鲜PLT和解冻的经过超声处理的新鲜PLT的PMP处理血小板减少样品后，测试样品。数据展示为平均值±SEM。表2展示通过加工来自新鲜血液的富血小板血浆和添加超声处理步骤，进一步提高PMP组合物的效力。在正常血小板数(250-300×10⁹/L)的样品中进行所有实验。

实施例5：与现有技术组合物相比本发明血小板微粒组合物的效力

为测试本文所述的PMP组合物的效力，将本发明的组合物与本领域中已知的PMP组合物比较。现有技术组合物和其制备方法详细描述于颁予Chao的WO 1990012581 A1(“Chao”)、颁予Ho等人的2006/0034809 A1(“Ho”)和颁予Jy等人的美国专利第8,105,632号(“Jy”)，其以引用的方式整体并入本文中。

Chao描述从存储的血液产生血小板微粒。为产生Chao的PMP组合物，存储的血小板浓缩物汇集在血袋中并在22℃下以1,000rpm离心11分钟以去除污染的红细胞和白细胞。接着将含有血小板的上清液转移至新的血袋并在22℃下以3,000rpm离心25分钟以将血小板从血浆分开。挤出贫血小板血浆并使每一所得血小板小球轻轻再悬浮于100mL 0.9％NaCl溶液(生理盐水)中，并通过在22℃下以3,000rpm离心20分钟来形成小球。去除上清液，且通过重复重悬浮和离心，将血小板小球用生理盐水洗涤两次。最终，经过洗涤的血小板再悬浮于生理盐水中，并通过重复冷冻(-80℃下至少六小时)和解冻(25℃下至少一小时)三次来破坏。冷冻和解冻的悬浮液用生理盐水稀释并以3,000rpm离心30分钟以收集血小板血影小球。此血小板血影小球再悬浮于生理盐水中并通过重复重悬浮和离心来洗涤两次。洗涤的血影小球再悬浮于生理盐水中并加热到100℃，历时五分钟。在热处理期间出现显著沉淀物。通过用超声波仪在20kHz下脉冲5分钟48秒(2秒循环，1.4秒开，0.6关)，使此经过热处理的血小板血影悬浮液均质化。接着经过超声处理的制剂在室温下以3,000rpm离心30分钟以将沉淀物质与所形成的血小板膜微粒分开，血小板膜微粒保持在上清液中。去除上清液并存储在密封容器中4℃下。

美国专利申请公布2006/0034809 A1描述了含有稳定血小板和血小板微粒的冻干制剂的产生，该制剂作为组织再生和非输注止血剂。为了产生Chao的PMP组合物，通过低速离心(135×g，15分钟)获得富血小板血浆(PRP)。通过加入酸柠檬酸葡萄糖，将经过离心的PRP(无红细胞)酸化至pH 6.6-6.8，接着通过以1500×g离心15分钟形成小球。将贫血小板血浆倾析，去除含有血浆蛋白的残液，并使积层细胞再悬浮于1ml pH 6.8下含有50mM海藻糖的无阳离子的Tyrodes缓冲液。血小板浓度调节至1.25×10⁹/ml。接着将混合物在37℃下培育2小时，每半小时混合一次。

Jy描述了产生PMP的三种替代方法，每一种方法都准备用于如在本文其它地方所述的此比较实例。

Jy的第一种方法涉及从存储的血液制备血小板微粒。为了产生Jy的此组合物，在室温下以200×g离心10分钟沉积到期1-5天的血小板。去除上清液并通过加入PBS/柠檬酸盐稀释至两倍体积，接着通过8,000×g离心30分钟使微粒沉积。PMP再悬浮于盐水中并冷藏存储。

Jy描述的第二种方法涉及使用超声波法制备PMP。为产生Jy的此组合物，新鲜或最近到期的血小板在具有1mM EDTA/5mM MgSO₄的PBS缓冲液中洗涤两次，并在50mL聚丙烯管中在室温下超声处理3-5个突发脉冲，各3-5秒。残余血小板和部分通过以200×g离心10分钟来去除，并通过以8,000×g离心30分钟使上清液中的PMP沉积。小球用具有1mM EDTA/5mMMgSO₄的PBS洗涤。

Jy描述的第三种方法涉及使用钙活化法制备PMP。为产生Jy的此组合物，1.0mL经过洗涤的血小板以2.5×10⁵/uL悬浮于HEPES/盐水pH 7.4中。血小板用凝血酶/胶原蛋白组合活化并在室温下轻轻搅动二十分钟。样品以200×g离心10分钟，并通过以8,000×g离心30分钟，从上清液回收PMP，再悬浮于PBS/柠檬酸盐溶液中，并在使用前洗涤。

图2比较制备本文所述的PMP组合物的方法(实例3)与Chao、Ho和Jy的方法。

如在本文其它地方所述，患者止血常通过分析患者血液样品的血小板数、涉及凝血的多种标记物和凝块形成能力来评估，包括凝块开始所花费的时间量。测量凝血酶原时间(“PT”)和部分促凝血酶原激酶时间(“PTT”)或另称为活化的部分促凝血酶原激酶时间(“aPTT”)的凝血分析分别用于评估外部凝血途径和内部凝血途径。凝血弹性描记法(“TEG”)通过触发凝块形成，接着进行计算机化凝血分析来测量凝血因子活性、血小板功能、凝块强度以及纤维蛋白溶解。

将本文所述的凝血组合物与现有技术的凝血组合物比较以证明本文公开的组合物提高的效力。具体地说，通过TEG分析评估血液凝固，且所有组合物的结果概述在本文中其它地方的图2C中。还分析和比较凝血酶原时间(PT)和部分促凝血酶原激酶时间(PTT)(凝固时间的两种其它量度)。最终，还在多种组合物中测量若干凝血因子的存在和活性。

如图2C所示，本文所述的血小板微粒凝血组合物是唯一呈现在正常范围内的PT、PTT和TEG值的组合物。多种凝血分析预期的值和TEG的正常范围也提供于图2C中。重要地，本公开的组合物是纤维蛋白原、vW抗原、因子V、因子VII、因子VIII和因子XI活性在正常范围内的唯一组合物。因此，本公开的凝血组合物清楚地显著改善现有技术组合物。

实施例6：用于局部施用的浓缩血小板微粒凝血组合物的研发

为测试在血小板输送后，出血患者中止血得到改善与在血小板收集、制备和存储期间产生的血小板微粒的浓度相关的假设；将制备浓缩PMP产物。将研发浓缩PMP产物用于局部施用，并含有悬浮在0.9％盐水中的经过洗涤的新鲜人类PMP，呈允许长期存储(长达12个月)的格式。

血小板减少小鼠模型将用于评估本发明的PMP凝血组合物在体内的效力。将向这些动物施用有效的血小板抑制剂，以根除任何可能的内部血小板功能。测试将在对照动物(各6只动物)与2个不同损伤位置(胸或腹部和大腿)、2个深度(浅和中度；包括肌肉)和3个长度(1/2、1和2cm)的组合中进行。诱发局部皮肤损伤后，将用最小压力局部应用本发明的PMP组合物(浸泡绷带)。研究动物与对照动物之间的出血量和持续时间的差异将通过对治疗不知情的动物专门实验室研究辅助人员评估。生理盐水浸泡的绷带将用于对照动物中。将在所有动物之间控制损伤特征(长度、深度和位置)和预期产物应用的持续时间。

实施例7：用于全身施用的浓缩血小板微粒凝血组合物的研发

还将研发用于全身施用的浓缩PMP产物。此组合物将在本文其它地方描述的血小板减少小鼠模型中测试。两组不同动物将进行一致的小肠外科手术。所提议的产物将局部应用在手术部位上。将在研究组与对照组之间评估小肠的出血量和持续时间(生理盐水浸泡的绷带将用于对照臂)。

下一组实验将包括IV注射不同浓度的所提议PMP产物至出血动物。将在接受IV输注存储PLT产物的研究动物与对照动物(仅仅此组实验中)之间比较临床结果。

实施例8：评估本发明的PMP组合物的长期存储潜能

将评估浓缩PMP产物在20℃下存储长时段后维持止血有效性的能力。

实施例9：血小板减少模型

实验旨在发展一种严重血小板减少出血模型。PMP产物可以依2:8比率向血小板减少模型施用。可以利用多种分析，例如凝血弹性描记法(TEG)、活化凝固时间(ACT)、凝血酶产生分析(TGA)、全血聚集(WB-Agg)等等进行实验以评估从基线开始的变化和血小板减少模型。

还可以进行实验以通过NanoSight测量PMP尺寸和浓度。可以通过流式细胞计评估PMP的鉴别和PMP活性的测量。

Claims (15)

1.一种凝血组合物，所述组合物包含：

从新鲜血液中获得的分离的血小板微粒；

纤维蛋白原(凝血因子I)、冯·维勒布兰德因子(von Willebrand factor)、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、凝血因子XII、蛋白C (PC)、蛋白S (PS)、抗凝血酶III (ATIII)；以及药物载体；

其中

纤维蛋白原为10-1000毫克/分升(dL)，凝血因子V为0.5-2.0国际单位(IU)，凝血因子VII为0.5-4.0 IU，凝血因子VIII为0.2-2.0 IU，凝血因子IX为0.5-3.0 IU，凝血因子XI为0.5-3.0 IU，凝血因子XII为1.0-7.0 IU，蛋白C (PC)为25-300%活性，蛋白S (PS)为10-150%活性，抗凝血酶III (ATIII)为25-250%活性。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有在9.0至14.0秒之间的正常参考范围内的凝血酶原时间。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物具有在25至50秒之间的正常参考范围内的活化部分凝血活酶时间。

4.如权利要求1所述的组合物，其中当使用凝血弹性描记法测量时，所述组合物具有少于三分钟的凝血开始时间(R-时间)。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物中血小板微粒的浓度>10¹⁴个微粒/微升。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物被配制用于局部施用。

7.如权利要求6所述的组合物，其中所述组合物被配制成喷雾、粉末或软膏。

8.如权利要求7所述的组合物，其中所述组合物被配制成乳膏或凝胶。

9.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物被配制用于全身施用。

10.一种伤口敷料，所述伤口敷料包含：

如权利要求1所述的凝血组合物以及

伤口敷料材料。

11.如权利要求10所述的伤口敷料，其中所述伤口敷料材料包含纱布。

12.如权利要求1所述的组合物在用于制备促进出血的受试者的血凝块形成的药物中的用途。

13.如权利要求12所述的用途，其中所述受试者的所述出血是由伤口或外伤引起。

14.如权利要求12所述的用途，其中所述受试者的所述出血是由外科手术引起。

15.如权利要求12所述的用途，其中将所述组合物局部施用至出血部位。

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