ES2924134T3 - Composición de RMP y métodos de uso - Google Patents
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Abstract
La divulgación proporciona una composición que comprende micropartículas derivadas de glóbulos rojos (RMP) que demuestran características clínicamente ventajosas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composición de RMP y métodos de uso
Referencia cruzada a la aplicación relacionada
Esta solicitud reivindica la prioridad para la solicitud de patente provisional de EE. UU. núm. 62/428,155, presentada el 30 de noviembre de 2016.
Campo técnico de la invención
La descripción se relaciona con una composición que comprende micropartículas derivadas de glóbulos rojos (RMP) y métodos de uso.
Antecedentes
El sangrado excesivo se encuentra entre las complicaciones potencialmente mortales más comunes en traumatismos y complicaciones de sangrados. Las transfusiones de sangre son el pilar para tratar la pérdida excesiva de sangre. Las terapias dirigidas a las causas subyacentes de los trastornos de sangrado difieren en dependencia de la etiología. La transfusión de plaquetas o las intervenciones que elevan el recuento de plaquetas se emplean para detener el sangrado debido al recuento bajo de plaquetas (trombocitopenia). En el caso de trastornos de la coagulación, normalmente se administra reemplazo de factor sanguíneo. En la hemofilia A, el factor VIII se administra a un sujeto, mientras que la hemofilia B requiere tratamiento con factor IX.
Las terapias existentes adolecen de importantes inconvenientes. Por ejemplo, la sangre donada para transfusiones es cada vez más escasa y costosa debido a la creciente demanda, la oferta limitada y las regulaciones más estrictas. De acuerdo con la Cruz Roja Estadounidense, solo en los EE. UU. se necesitan aproximadamente 36 000 unidades de glóbulos rojos por día. Consulte www.redcrossblood.org/learn-about-blood/blood-facts-and-statistics. El costo hospitalario por efectos adversos relacionados con transfusiones supera los $10 mil millones por año. Hannon & Gjerde: The contemporary economics of transfusions. En Perioperative Transfusion Medicine; Speiss R D, Spence R K, Shander A (eds.), Lippincott Williams y Wilkins, pág. 13 (2006). Las transfusiones también están asociadas con muchas complicaciones a corto y largo plazo, que incluyen anafilaxia, reacciones hemolíticas, inmunosupresión inducida por transfusión, enfermedad de injerto contra huésped y lesión pulmonar aguda relacionada con transfusión (TRALI). La MP de plaqueta (PMP) y las plaquetas enteras liofilizadas (LioPLT) tienen desventajas tales como, por ejemplo, alto costo, escasez de plaquetas, riesgo de trombogénesis e inmunorreactividad. Las plaquetas son altamente inmunogénicas debido a HLA, ABO, Rh y antígenos específicos de plaquetas, que no son prácticos para la compatibilidad cruzada, por lo que las reacciones adversas son frecuentes. Además, se sabe que las plaquetas portan factor tisular (TF) que es trombogénico.
Persiste la necesidad en la técnica de agentes que puedan administrarse de forma segura e inmediatamente después de la detección de un sangrado excesivo, y a un costo razonable.
Resumen de la invención
La descripción proporciona una composición que comprende micropartículas derivadas de glóbulos rojos (RMP) que demuestran una actividad de acetilcolinesterasa (AchE) de menos de 350 pmol/min/106 partículas (por ejemplo, menos de 200 pmol/min/106 partículas). En varios aspectos, del 20 %-50 % de las RMP presentan fosfatidilserina en la composición. Opcionalmente, la composición acorta el tiempo hasta la formación inicial del coágulo medido por tromboelastografía (TEG) en sangre total y plasma, por ejemplo, en al menos dos minutos. También opcionalmente, el diámetro medio de las RMP es de aproximadamente 0,40-0,6 pm. Además se proporciona un método para tratar el sangrado excesivo en el sujeto, el método comprende administrar al sujeto la composición de RMP descrita en la presente descripción.
Descripción de las figuras
La Figura 1 es un gráfico de barras que compara la actividad de acetilcolinesterasa (AChE) (pM/min/106 RMP; eje y) expresada en las RMP-1, RMP-2 y RMP-3 que se describen en los Ejemplos.
La Figura 2 es un gráfico de barras que compara el acortamiento del tiempo de coagulación (minutos; eje y) mediado por 5 pM (barra izquierda) o 10 pM (barra derecha) de las RMP-1, RMP-2 y RMP-3 que se describen en los Ejemplos.
La Figura 3 es un gráfico de barras que compara la resistencia del coágulo (aumento de TEG MA; eje y) mediado por las RMP-1, RMP-2 y RMP-3 que se describen en los Ejemplos.
La Figura 4 es un gráfico de barras que compara la fibrinólisis mediada por anti-tPA (aumento de TG respecto al control (mm/min); eje y) inducida por las RMP-1, RMP-2 y RMP-3 que se describen en los Ejemplos.
Descripción detallada de la invención
En la presente descripción se proporcionan composiciones mejoradas de micropartículas derivadas de glóbulos rojos (RMP) y métodos de uso para la reducción del sangrado en un sujeto. Las RMP tienen muchas ventajas como agentes hemostáticos, que incluyen (pero no se limitan a) facilidad y economía de producción e inmunogenicidad mínima. Los glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés) son el tipo de glóbulos más abundante, lo que garantiza una fuente esencialmente ilimitada y económica para la producción de RMP. Las RMP tienen una vida útil indefinida con almacenamiento a temperatura ambiente y no requieren almacenamiento en bancos de sangre, lo que los hace particularmente ventajosos para situaciones de emergencia. Además, las RMP producidas a partir de glóbulos rojos Rh negativos de tipo O (RMP universales) se puede administrar inmediatamente sin pruebas cruzadas.
La descripción se basa, al menos en parte, en la sorprendente identificación de una subpoblación de RMP con características que son particularmente ventajosas para aplicaciones terapéuticas. La subpoblación particular que presenta las características descritas en la presente descripción es nueva y proporciona ventajas técnicas sobre las poblaciones de RMP descritas previamente en términos de, por ejemplo, eficacia y toxicidad reducida. Los productos de la degradación de glóbulos rojos, que incluyen las RMP, se han relacionado con respuestas proinflamatorias, toxicidad y efectos secundarios intensos. Véase, por ejemplo, Danesh y otros, Blood. 2014;123(5):687-696; y Zwicker y otros, Br J Haematol. 2013; 160(4): 530-537. De hecho, MP elevada se han implicado en una variedad de afecciones trombofílicas tales como la enfermedad de células falciformes (Camus y otros, Blood. 2012; 120(25):5050) y trombocitopenia trombótica (TTP) (Galli y otros, Thromb Haemost 1996. 75(3):427-31), y se han implicado en eventos tóxicos después de transfusiones de sangre (Donadee y otros, Circulation 2011; 124:465-476). Las composiciones de RMP descritas previamente conllevaban un riesgo de acontecimientos adversos. Sorprendentemente, la subpoblación de RMP descrita en la presente descripción reduce de eficientemente el sangrado mientras minimiza significativamente la toxicidad y los efectos secundarios adversos.
La descripción en la presente descripción describe varios aspectos de la subpoblación de RMP que se proporcionan en la composición. Las composiciones que comprenden r Mp que presentan cualquiera, cualquier combinación o todas las características descritas en la presente descripción están contempladas y abarcadas por la invención.
En un aspecto, la descripción proporciona una composición que comprende RMP derivadas de glóbulos rojos que demuestran una actividad de acetilcolinesterasa (AchE) significativamente reducida. La reducción en la actividad de AchE se correlaciona con la reducción de la toxicidad de las RMP in vivo. En varias modalidades, las RMP demuestran en la composición una actividad de AchE de menos de 20 000 pmol/min/106 partículas (por ejemplo, entre 20 000 pmol/min/106 partículas y 50 pmol/min/106 partículas, en donde 50 pmol/min/106 partículas o 25 pmol/min/106 partículas es un límite inferior opcional para cualquiera de los rangos descritos en la presente descripción). En modalidades preferidas, las RMP demuestran una actividad de AchE de menos de 10000 pmol/min/106 partículas, menos de 5000 pmol/min/106 partículas, menos de 2500 pmol/min/106 partículas, menos de 1000 pmol/min/106 partículas, menos de 500 pmol/min/106 partículas, menos de 350 pmol/min/106 partículas, menos de 250 pmol/min/106 partículas, menos de 200 pmol/min/106 partículas o menos de 150 pmol/min/106 partículas. En un aspecto ejemplar, las RMP demuestran una actividad de AchE de menos de 350 pmol/min/106 partículas. Los métodos para detectar la actividad de AchE se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Ellman y otros, Biochemical Pharmacology 1961; 7(2):88-95; Xie y otros, J. Biol. Chem. 2007; 282:11765-11775; Wolkmer y otros, Experimental Parasitology 2014; 132(4):546-549) y se describen en los Ejemplos que se proporcionan en la presente descripción.
Alternativamente o además, las RMP comprenden un nivel significativamente reducido de balsas lipídicas o componentes de las mismas en comparación con las poblaciones de RMP descritas previamente. Las balsas lipídicas, también llamadas "membranas resistentes a detergentes" (DRM), son microdominios de membrana ricos en colesterol y esfingolípidos. Esencialmente, todas las micropartículas (MP) derivadas de células naturales consisten principalmente en balsas lipídicas. Sorprendentemente, la composición de la presente descripción, en varias modalidades, comprende menos contenido de balsas lipídicas (que no se limita a balsas lipídicas intactas, sino que incluye componentes de balsas lipídicas) que el logrado previamente. Simplemente por conveniencia en la descripción de este aspecto de la descripción, el contenido de balsas lipídicas de las RMP se puede comparar con el contenido de balsas lipídicas de los glóbulos rojos enteros (es decir, no fragmentados). En varios aspectos, el contenido de balsa lipídica de las RMP de la composición es del 10 % o menos (por ejemplo, 5 % o menos, 3 % o menos, 2 % o menos, 1 % o menos, 0,5 % o menos (tales como 0,1 % o 0,05 %)) que la del contenido de lípidos de los glóbulos rojos enteros. Si bien no se desea estar sujeto a ninguna teoría en particular, la AChE puede servir como medida sustituta de las balsas lipídicas, ya que la proteína está anclada en las membranas celulares por una proteína transmembrana PRiMA (anclaje de membrana rico en prolina) y está integrada en microdominios de balsas lipídicas. Véase, por ejemplo, Xie y otros, J. Biol. Chem. 2010; 285(15): 11537-11546, el cual también proporciona materiales y métodos para determinar el contenido de balsas lipídicas en una muestra biológica. Los marcadores alternativos de balsas lipídicas incluyen, pero no se limitan a, estomatina, flotilina y caveolas. Las balsas lipídicas también se pueden caracterizar con el uso de métodos proteómicos. Véase, por ejemplo, Foster y Chan, Subcell Biochem. 2007;43:35-47.
Alternativamente o además, 20 %-50 % de las RMP en la composición presentan fosfatidilserina. Por ejemplo, opcionalmente, 30 %-45 % de las RMP en la composición presentan fosfatidilserina. En este sentido, la composición
proporciona una subpoblación de RMP con un nivel óptimo de actividad de fosfatidilserina para promover la hemostasia (por ejemplo, promover la coagulación, reducir el sangrado) mientras minimiza el potencial trombogénico. La fosfatidilserina se puede medir de varias maneras. Por ejemplo, una medida sustituta de la fosfatidilserina incluye la detección de la unión de la Anexina V mediante citometría de flujo. Véase, por ejemplo, Koopman y otros, "Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis". Blood 1994; 84(5):1415-20. En un método ejemplar, se determina la relación de células que se unen a Anexina V+ a CD235a+ (un marcador general de RMP). En varios aspectos, la relación de AnV+/CD235a+ es 0,2-0,5, tal como 0,3-0,4.
Opcionalmente, la densidad interna de las RMP de la composición es menor que el 3,5 % de la densidad interna de los glóbulos rojos intactos. En algunos aspectos, las RMP tienen una densidad interna de aproximadamente 0,1 %-3,5 % (por ejemplo, aproximadamente 0,5 %-3 %, aproximadamente 0,5 %-2,5 % o aproximadamente 1 %-2 %) de la densidad interna de los glóbulos rojos enteros. La densidad interna de las RMP se puede determinar con el uso de una variedad de técnicas que incluyen, pero sin limitarse a, la señal de dispersión lateral de citometría de flujo, como se describe en la presente descripción. Si bien no se desea estar sujeto a ninguna teoría en particular, se cree que la densidad interna reducida está asociada con un contenido de hemoglobina reducido. La hemoglobina libre puede ser tóxica in vivo y provocar, por ejemplo, insuficiencia renal. Véase, por ejemplo, Gladwin y otros, J Clin Invest.
2012;122(4): 1205-1208. Las RMP de la composición de la descripción demuestran una toxicidad reducida.
En varias modalidades, la composición acorta el tiempo hasta la formación inicial del coágulo medido por tromboelastografía (TEG) en sangre total y plasma. En este sentido, la composición opcionalmente acorta el tiempo hasta la formación inicial del coágulo, medido mediante tromboelastografía, en al menos dos minutos (por ejemplo, al menos tres minutos o al menos cuatro minutos). En varias modalidades, la composición acorta el tiempo hasta la formación inicial del coágulo medido por tromboelastografía (TEG) en sangre total y plasma en aproximadamente dos a aproximadamente cinco minutos. De hecho, en varias modalidades, la composición restaura la coagulación normal, como lo indica un tiempo de coagulación más corto, una formación de coágulos más rápida o un desarrollo de coágulos más estable, medido por TEG o tromboelastometría rotacional (ROTEM) en sangre total y plasma.
Alternativamente o además, las RMP en la composición presentan un diámetro medio de aproximadamente 0,40-0,70 |jm, tal como aproximadamente 0,40-0,60 jm o aproximadamente 0,40-0,50 jm . Opcionalmente, el diámetro medio de las RMP es de aproximadamente 0,45-0,50 jm . El tamaño de RMP se puede determinar con el uso de cualquiera de una variedad de técnicas de laboratorio de rutina, que incluyen los métodos descritos en el Ejemplo.
Las RMP son productos de degradación de los RBC. Las RMP se pueden producir a partir de glóbulos rojos frescos (es decir, RBC aislados de muestras de sangre dentro de las 24 horas de producción de RMP) o RBC almacenados. En este sentido, los RBC se congelan opcionalmente antes de la producción de las RMP. Por ejemplo, en varios aspectos, los RBC se han congelado hasta un mes, hasta dos meses, hasta tres meses, hasta cuatro meses o más. Las RMP se pueden generar con el uso de cualquiera de una serie de técnicas para romper las membranas de los glóbulos rojos, que incluyen ultrasonidos, la centrifugación, el calentamiento y el tratamiento con ionóforos. En varias modalidades, las RMP se producen al forzar a los glóbulos rojos a través de una abertura para producir glóbulos rojos rotos y fragmentar aún más los glóbulos rojos rotos mediante el bombardeo sobre una superficie sólida. El esfuerzo cortante creado al forzar los glóbulos rojos a través de una abertura a una presión de, por ejemplo, al menos 25 000 psi (tales como una presión de aproximadamente 35000 psi) corta los glóbulos rojos, y el paso de bombardeo posterior fragmenta aún más los glóbulos rojos para producir una población de RMP con la(s) característica(s) descrita(s) en la presente descripción. La RMP en la composición puede ser fresca (es decir, preparada a partir de RBC dentro de las 24 horas de administración a un sujeto) o almacenada. Dado que las RMP tienen una vida útil prolongada, la composición se puede almacenar durante períodos de tiempo prolongados. Las RMP producidas a partir de sangre caducada son tan eficaces como las RMP de sangre muy fresca; por lo tanto, la descripción proporciona un medio para utilizar donaciones de sangre que, de otro modo, podrían no ser adecuadas para uso clínico.
También se proporciona un método para tratar el sangrado excesivo en el sujeto. El método comprende administrar al sujeto la composición que comprende las RMP descritas en la presente descripción. Por ejemplo, el método comprende administrar una composición que comprende RMP que demuestran una actividad de acetilcolinesterasa (AchE) de menos de 350 pmol/min/106 partículas y/o que tienen un diámetro medio de aproximadamente 0,40-0,6 jm y/o en donde 20 %-50 % de las RMP en la composición presentan fosfatidilserina y/o en donde la composición acorta el tiempo hasta la formación inicial del coágulo medido por tromboelastografía (TEG) en sangre total y plasma (por ejemplo, en al menos dos minutos).
Como se usa en la presente descripción, "tratar" y "tratamiento" se refiere a cualquier reducción del sangrado en un sujeto. "Tratar" y "tratamiento" incluye medidas terapéuticas y profilácticas. Un experto en la técnica apreciará que cualquier grado de protección o mejora del sangrado excesivo es beneficioso para un sujeto, tal como un paciente humano. En consecuencia, el método en un aspecto se realiza tan pronto como sea posible después de que se haya determinado que un sujeto está en riesgo de pérdida anormal de sangre (por ejemplo, antes de la cirugía en un sujeto que padece o corre el riesgo de padecer un trastorno de coagulación o de plaquetas) o tan pronto como sea posible después de que ocurra un episodio de sangrado.
El sangrado excesivo puede ser causado por una variedad de trastornos o afecciones, y puede ser congénito o adquirido (por ejemplo, provocado por otros agentes terapéuticos). El sujeto puede padecer (es decir, el sangrado excesivo es causado por), por ejemplo, un trastorno plaquetario o un trastorno de la coagulación. Los trastornos de la coagulación incluyen trastornos de sangrado causados por una actividad deficiente del factor de coagulación sanguínea. Los factores de coagulación sanguínea incluyen, pero no se limitan a, Factor V (FV), FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXIII, FII (responsable de la hipoprotrombinemia) y el factor de von Willebrand. El sujeto puede padecer una enfermedad hepática crónica. Los trastornos plaquetarios son causados por una función plaquetaria deficiente o un número anormalmente bajo de plaquetas en circulación. El recuento bajo de plaquetas puede deberse, por ejemplo, a una producción insuficiente, secuestro de plaquetas o destrucción de plaqueta descontrolada. La trombocitopenia (deficiencia de plaquetas) puede estar presente por varias razones, que incluyen quimioterapia y otra terapia farmacológica, radioterapia, cirugía, pérdida accidental de sangre y otras enfermedades. Por ejemplo, la trombocitopenia se asocia opcionalmente con insuficiencia de la médula ósea, anemia aplásica, síndrome mielodisplásico o leucemia. Los trastornos plaquetarios también incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Von Willebrand, disfunción plaquetaria paraneoplásica, trombastenia de Glanzman y enfermedad de Bernard-Soulier. El sangrado excesivo también puede ser causado por condiciones hemorrágicas inducidas por un traumatismo; una deficiencia en uno o más factores de contacto, tales como FXI, FXII, precalicreína y cininógeno de alto peso molecular (HMWK); deficiencia de vitamina K; un trastorno del fibrinógeno, que incluye afibrinogenemia, hipofibrinogenemia y disfibrinogenemia; y deficiencia de alfa2-antiplasmina. En varias modalidades, el sangrado excesivo es causado por cirugía, traumatismo, hemorragia intracerebral, enfermedad hepática, enfermedad renal, trombocitopenia, disfunción plaquetaria, hematomas, hemorragia interna, hemartrosis, hipotermia, menstruación, embarazo y dengue hemorrágico.
Opcionalmente, el sangrado excesivo es causado por un tratamiento farmacológico. Por ejemplo, en varias modalidades, el sangrado excesivo es causado por un anticoagulante, anticoagulantes tales como Coumadin (warfarina, que también es un antagonista de la vitamina K), heparina (por ejemplo, heparina de bajo peso molecular, tal como enoxaparina o dalteparina), un inhibidor del complejo de protrombinasa (por ejemplo, fondaparinux o rivaroxabán), un inhibidor de FXa (por ejemplo, apixabán (Eliquis)) o un inhibidor de la trombina (por ejemplo, dabigatrán). El sangrado excesivo también puede ser causado por aspirina (que inhibe la función plaquetaria y puede provocar sangrado grave, especialmente en combinación con otros trastornos o medicamentos), clopidogrel (PLAVIX) y similares. Estos anticoagulantes no tienen antídotos, y las complicaciones hemorrágicas derivadas de estos anticoagulantes son peligrosas para los pacientes. La composición de la descripción es eficaz para tratar y/o prevenir el sangrado excesivo en estos contextos.
En varias modalidades, el sujeto se somete a terapia con un anticoagulante (o el tratamiento con anticoagulantes se ha interrumpido dentro de un período de tiempo tal que los efectos biológicos del anticoagulante permanecen). Una ventaja de la composición de la invención es que las RMP de la presente composición corrigen los defectos hemostáticos inducidos por los anticoagulantes, incluso cuando están presentes anticoagulantes. La composición de la descripción demuestra una actividad hemostática universal y, como tal, es adecuada para tratar sangrado en pacientes que padecen múltiples defectos hemostáticos.
La composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) se formula con un portador, tampón, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable (es decir, farmacológicamente aceptable). El portador particular empleado está limitado únicamente por consideraciones físico-químicas, tales como la solubilidad y la falta de reactividad con las RMP, y por la vía de administración. Los portadores fisiológicamente aceptables se conocen bien en la técnica. Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen, sin limitación, soluciones o dispersiones acuosas estériles. Las formulaciones inyectables se describen adicionalmente en, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Filadelfia. Pa., Banker y Chalmers. eds., páginas 238-250 (1982), y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4ta ed., páginas 622-630 (1986)). Una composición farmacéutica que comprende RMP que se porporciona en la presente descripción se coloca opcionalmente dentro de contenedores, junto con material de envasado que proporciona instrucciones sobre el uso de tales composiciones farmacéuticas. Generalmente, tales instrucciones incluyen una expresión tangible que describe la concentración del reactivo, así como, en ciertas modalidades, las cantidades relativas de los ingredientes o diluyentes del excipiente que pueden ser necesarios para diluir la composición farmacéutica.
Si se desea, la composición comprende uno o más agentes farmacéuticamente eficaces adicionales. Alternativamente o además, la composición se proporciona como un régimen terapéutico que incluye la administración de otros agentes farmacéuticamente eficaces (concurrentemente o separados por tiempo). La composición se puede administrar en combinación con otras sustancias y/u otras modalidades terapéuticas para lograr un efecto biológico adicional o aumentado. Los cotratamientos incluyen, pero no se limitan a, factores de coagulación recombinantes o derivados del plasma, tratamientos de profilaxis de la hemofilia, inmunosupresores, antagonistas de anticuerpos inhibidores del factor plasmático (es decir, antiinhibidores), antifibrinolíticos, antibióticos, terapia hormonal, agentes antiinflamatorios (por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) o sustancias antiinflamatorias esteroideas), procoagulantes, anticoagulantes y analgésicos. En un aspecto, la administración de la composición permite una reducción en la dosis de coterapéutico requerida para lograr una respuesta biológica deseada.
Por lo tanto, la invención incluye administrar a un sujeto la composición de la descripción en combinación con una o más sustancias adecuadas adicionales, cada una de las cuales se administra de acuerdo con un régimen adecuado para ese medicamento. Las estrategias de administración incluyen administración concurrente (es decir, administración sustancialmente simultánea) y administración no concurrente (es decir, administración en diferentes momentos, en cualquier orden, superpuestos o no) de la composición de RMP y uno o más agentes adicionales adecuados. Se apreciará que los diferentes componentes se administran opcionalmente en la misma composición o en composiciones separadas, y por la misma vía de administración o por vías diferentes.
Un régimen de administración particular para un sujeto particular dependerá, en parte, de la cantidad de composición administrada, la vía de administración, la dolencia particular que se trata, las consideraciones relevantes para el receptor y la causa y el alcance de cualquier efecto secundario. La cantidad de composición administrada a un sujeto (por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano) y las condiciones de administración (por ejemplo, momento de la administración, vía de administración, régimen de dosificación) son suficientes para afectar la respuesta biológica deseada durante un período de tiempo razonable. Únicamente a modo de ilustración, en un aspecto, el método comprende administrar, por ejemplo, desde aproximadamente 1x1010 RMP/kg hasta aproximadamente 3x1011 RMP/kg a un sujeto (por ejemplo, aproximadamente 5x1010 RMP/kg hasta aproximadamente de 2*1011 RMP/kg).
El método comprende, en varios aspectos, la administración de la composición para tratar una afección aguda (por ejemplo, sangrado causado por cirugía o traumatismo) durante un período de tratamiento relativamente corto, por ejemplo, de uno a 14 días. También se contempla que la composición pueda administrarse durante un ciclo de tratamiento más prolongado (por ejemplo, que dure semanas o meses) si la naturaleza del estado del paciente requiere un tratamiento prolongado. El método en varias modalidades comprende múltiples administraciones de la composición a un sujeto (por ejemplo, una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día o más).
Los métodos adecuados para administrar una composición fisiológicamente aceptable, tal como una composición que comprende RMP como se describe en la presente descripción, se conocen bien en la técnica. Aunque se puede usar más de una vía para administrar una composición, una vía particular puede proporcionar una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía. En un aspecto, la composición de la descripción se administra por vía intravenosa, intraarterial o intraperitoneal para introducir RMP en circulación. La administración no intravenosa también es apropiada, particularmente con respecto a los agentes terapéuticos de bajo peso molecular. En ciertas circunstancias, es conveniente suministrar una composición farmacéutica que comprende RMP como se describe en la presente descripción por vía vaginal, rectal, pulmonar; mediante inyección por vía intracerebral (intraparenquimatosa), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraportal, intralesional, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intranasal, uretral o enteral; por sistemas de liberación sostenida; o por dispositivos de implantación. Si se desea, la composición se administra regionalmente mediante administración intraarterial o intravenosa que alimenta una región de interés, por ejemplo, a través de la arteria femoral para el suministro a la pierna. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo en un aspecto se implanta en cualquier tejido adecuado, y el suministro de la composición se realiza en varios aspectos mediante difusión, bolo de liberación controlada o administración continua. En otros aspectos, la composición se administra directamente al tejido expuesto durante los procedimientos quirúrgicos o el tratamiento de lesiones, o se administra mediante procedimientos de transfusión de sangre.
En vista de lo anterior, la invención proporciona la composición descrita en la presente descripción para su uso en un método para el tratamiento de un sujeto, tal como un método para el tratamiento de un trastorno en el que las RMP son beneficiosos. En un aspecto, la descripción proporciona la composición descrita en la presente descripción para su uso en el tratamiento del sangrado excesivo o la pérdida de sangre en un sujeto que lo necesite. El método comprende administrar al sujeto la composición de la invención en una cantidad y en condiciones eficaces para tratar o prevenir, total o parcialmente, la pérdida excesiva de sangre. La invención proporciona además RMP que tienen una o más (o todas) de las características descritas en la presente descripción para su uso en la fabricación de un medicamento. Por ejemplo, las RMP se pueden usar en la fabricación de un medicamento (por ejemplo, una composición) para el tratamiento del sangrado excesivo o la pérdida de sangre en un sujeto que lo necesite.
Ejemplos
Las micropartículas (MP) derivadas de células son pequeñas vesículas (<1 um) liberadas en la activación celular o apoptosis. En dependencia del estímulo, las MP pueden ser heterogéneas en fenotipo y actividades funcionales, tales como hemostática, trombogénica y proinflamatoria. En este estudio, se produjeron tres poblaciones de RMP, que presentaban diferentes combinaciones de características estructurales y funcionales. Las características estudiadas incluyen PCA (representante de actividad hemostática), actividad de acetilcolinesterasa (AchE) y toxicidad.
Se identificó una subpoblación de RMP que demostró características particularmente ventajosas relacionadas con una eficacia mejorada y una toxicidad reducida que afecta a otras composiciones de RMP.
Se produjo una población de RMP al forzar glóbulos rojos a través de una abertura (35000 psi) tres veces (con el uso del disruptor de células de Constant System) para producir glóbulos rojos rotos y fragmentar aún más los glóbulos rojos rotos mediante el bombardeo sobre una superficie sólida (RMP-1). La RMP resultante se lavó y se recogió por
centrifugación. Se produjo una segunda población de RMP mediante el tratamiento de RBS con ionóforo de calcio (RMP-2). Los sobrenadantes de RBC frescos expuestos a Ca2+/ionóforo (A23187) (10 j M) durante 30 minutos se centrifugaron para recolectar las RMP. Una tercera población se liberó de células empaquetadas (PC) después del almacenamiento hasta 42 días (RMP-3); se tomaron RBC de PC almacenadas a intervalos de hasta 42 días (almacenadas a 4 °C), luego se centrifugaron para recuperar RMP.
Los recuentos de citometría de flujo se realizaron mediante la unión de CD235a (glicoforina A) y anexina V (AnV). El marcaje con CD235a de RMP se realizó mediante la adición de 20 j l de muestra de RMP a 4 j l de mAb marcado con fluorescencia y la incubación durante 20 min a temperatura ambiente con agitación orbital. A continuación, las mezclas se diluyeron con 1000 j l de solución salina/HEPES fría (pH 7,4) y se mantuvieron en hielo hasta que estuvieran listas para la citometría de flujo. Para el marcador anexina V, se incubaron 20 j l de muestra de RMP con 3 j l de solución de CaCl20,2 M más 2 j l de anexina V-FITC (10 jg/m l) durante 20 min, luego 500 j l de HEPES/solución salina y luego se procesó como arriba. A continuación, se analizó MP en las muestras en un citómetro de flujo Beckman Coulter FC-500, calibrado con perlas Megamix para establecer el voltaje de amplificación adecuado para Fs , SS, FL1 y FL2 y una activación adecuada para MP. El tiempo de ejecución fue de 30 segundos y el caudal se calibró como se describió previamente (Jy y otros, Thromb Haemost. 20l3;110(4):751-60). El conteo de eventos se activó mediante la señal fluorescente (FL1 o FL2) en lugar de por la dispersión frontal (FS), lo que mejoró la eficiencia de detección. El portal de MP se ajustó para un tamaño <1 um. La unión no específica de mAb se evaluó mediante IgG isotípica marcada con fluorescencia.
Las pruebas funcionales incluyeron tromboelastografía (TEG); se compararon recuentos iguales de cada tipo de muestra, en base a CD235a, y se diluyeron según fuera necesario con plasma combinado libre de partículas (PFP). TEG mide el desarrollo de la coagulación al monitorear el par creciente transmitido a un pin central que se sumerge en la copa de muestra; la copa oscila periódicamente /- 4,5°. Los parámetros registrados para el presente estudio fueron: R (retraso en la formación de fibrina), MA (amplitud máxima, reflejo de la función plaquetaria) y TTG (generación total de trombos). Para cada prueba, se mezclaron 330 j l de PFP con 5 o 10 j l de RMP (2*109 partículas/ml) durante 5 min, luego se añadieron 20 j l de calcio (100 mM) para iniciar la coagulación.
La actividad de acetilcolinesterasa (AchE), un marcador en las balsas lipídicas de la membrana plasmática de los glóbulos rojos, se ensayó mediante un método colorimétrico (una versión adaptada del ensayo AChE de Ellman). La RMP se diluyó con el uso de tampón de fosfato (pH 7,5; 0,1 M). Se añadieron 10,6 j l de DTNB 0,01 M y 10,6 j l de yoduro de acetiltiocolina 12,5 mM y se mezclaron con 150 j l de la RMP diluida. Las muestras se leyeron a 405 nm a intervalos de 1 min, 3 min y 6 min.
La toxicidad de RMP se evaluó en conejos machos New Zealand bñancos (media de 3,8 kg) y en ratas macho Sprague Dawley (media de 280 g). Todos se anestesiaron con isoflurano al 2 %. Se canularon la arteria y la vena femorales y se administró solución salina de mantenimiento a 3 ml/h. Las muestras de RMP se infundieron mediante la vena femoral canulada y la sangre se recogió mediante la arteria femoral canulada en diferentes intervalos de tiempo. Los signos vitales, que incluyen la presión arterial, la frecuencia cardíaca, la frecuencia respiratoria y los niveles de O2 y CO2 en sangre, se monitorearon continuamente. Se sacrificaron algunos animales 4 horas después de la inyección de RMP para obtener los órganos principales para el examen patológico. Algunos animales se suturaron y devolvieron al centro de cuidado de animales para un seguimiento a largo plazo. Su comportamiento, movilidad, ingesta de alimentos y agua, temperatura corporal, etc. se monitorearon diariamente durante la primera semana, luego semanalmente durante las 5 semanas restantes.
RMP-1 se asoció con el mayor rendimiento de producto terapéutico, seguido de RMP-2, que produjo aproximadamente 3 veces más producto terapéutico que RMP-3.
La unión de AnV se expresó como la relación AnV+/CD235+, y es un marcador de fosfolípido procoagulante. Esta relación fue menor en RMP-1 (0,28), seguida de RMP-2 (0,48) y RMP-3 (0,98).
El tamaño (diámetro medio) de RMP detectado por dispersión frontal (FS) fue de 0,57 jm en RMP-3. El valor fue algo mayor que RMP-1 (0,42 jm ) y RMP-2 (0,45 jm ). El porcentaje de densidad interna de RMP a RBC medido por dispersión lateral fue más bajo en RMP-1 (1,5 %), seguido de RMP-2 (4,8 %) y RMP-3 (10,3 %).
La actividad de la acetilcolinesterasa (AChE) fue mucho más alta en RMP-3 (15643 pmoles/min, por 106 partículas) frente a 3362 pmoles/min, por 106 partículas para RMP-2 y 149 pmoles/min, por 106 partículas para RMP-1. Al presentar los datos de forma alternativa, la actividad de AChE fue más baja en RMP-1 (149 pmoles/min, por 106 partículas), que es 22 y 104 veces menor que la de RMP-2 (3362 pmoles/min, por 106 partículas) y RMP-3 (15 643 pmoles/min, por 106 partículas), respectivamente.
La actividad procoagulante se estimó con el uso de TEG. El tiempo de coagulación (tiempo R) mostró el mayor acortamiento con RMP-3 (10,2 min), seguido de RMP-2 (6,7 min) y Rm P-1 (3,6 min).
La actividad antifibrinolítica se analizó en presencia de 0,4 |jg/ml de activador del plasminógeno tisular (tPA). Las tres especies de RMP inhibieron eficazmente la fibrinólisis mediada por t-PA medida por los parámetros TEG, que incluyen m A, Ly30 y TTG (formación total de trombos). RMP-3 fue el más eficaz, seguido de RMP-2 y RMP-1.
La administración de RMP-1 a conejos y ratas en dosis de 1*1010 a 1,2 *1012 RMP/kg no causó ningún acontecimiento adverso dentro de las seis semanas de observación posterior a la administración. Los signos vitales, que incluyen la frecuencia cardíaca, la presión arterial, la frecuencia respiratoria, los niveles de oxígeno en sangre y la temperatura corporal, permanecieron normales durante una hora después de la infusión de RMP. El seguimiento a largo plazo (6 semanas) mostró un comportamiento, apetito y movilidad normales. A la dosis más alta (1,2x1012 RMP/kg), todas las ratas analizadas permanecieron vivas y aumentaron de peso durante y al final del período de observación de seis semanas. Con estas dosis, el tiempo de sangrado se acortó sustancialmente y se redujo la pérdida total de sangre, en tres modelos animales de sangrado diferentes.
En la Tabla 1 se presenta un resumen de las características de varias subpoblaciones de RMP descritas en la presente descripción. La primera fila es el rendimiento de RMP por ml de PC. La segunda fila es la relación entre el recuento de RMP detectado por anti-glicoforina (CD235a) y el recuento de RMP detectado por la unión de anexina V en el citómetro de flujo. La tercera fila es el tamaño del RMP, calculado a partir de las dispersiones frontales del ensayo de citometría de flujo calibrado con tres tamaños diferentes de perlas. La última fila es el porcentaje de densidad interior de RMP a los RBC, calculado a partir de las dispersiones laterales (SS) del ensayo de citometría de flujo. Todos los valores son Media ± SEM.
Tabla 1: Propiedades de las poblaciones de RMP
Los resultados en la presente descripción demuestran las ventajas de un tipo único de RMP caracterizado en la presente descripción. Este tipo de RMP exhibe características de superficie y actividades funcionales distintivas. Los resultados demuestran diferencias claras y decisivas en las propiedades funcionales, fenotípicas y toxicológicas de las tres especies comparadas. RMP-2 y RMP-3 son de mayor tamaño, mayor unión a AnnV y mayor expresión de AChE en comparación con RMP-1. RMP-2 y RMP-3 demostraron mayor actividad procoagulante que RMP-1, pero RMP-1 demostró actividad procoagulante; la actividad de RMP-2 y RMP-3 fue mayor en este sentido. RMP-1 se asoció con mayores cantidades de producto terapéutico generado por ml de RBC empaquetados.
De todos los parámetros comparados, la diferencia más llamativa entre estas tres especies de RMP es la actividad de AchE. La actividad de AchE de RMP-1 es aproximadamente 25 y 150 veces menor que la de RMP-2 y RMP-3, respectivamente. Se cree que AchE está unida covalentemente a las balsas lipídicas y, como tal, sirve como marcador sustituto de las balsas lipídicas. En base a los datos de AchE, RMP-3 está prácticamente desprovisto de balsas lipídicas, que están compuestas por muchos mediadores proinflamatorios, tales como adhesinas y ligandos para la activación celular, lípidos y citocinas proinflamatorias, complementos, complejos inmunológicos, etc.
Antes de la descripción, se creía que la eficacia hemostática y la toxicidad estaban inseparablemente unidas. Los resultados descritos anteriormente demuestran que el tipo único de RMP identificado en la presente descripción, sorprendentemente no demuestra toxicidad perceptible, pero conserva una eficacia hemostática robusta.
También se exploraron las características de RMP producida a partir de RBC previamente congelados. Se adquirieron RBC empaquetados O+, reducidos en leucocitos, en OneBlood.org. Cada bolsa de RBC empaquetados se dividió en cuatro partes iguales (70 - 75 ml). Una parte de los RBC se almacenó a 4 °C y se usó para producir RMP dentro de los siete días posteriores a la recepción del envío. Las tres partes restantes se congelaron a -20 °C y se descongelaron 1, 2 o 3 meses después de la congelación inicial para producir RMP. Los RMP se produjeron mediante extrusión a alta presión, como se describe en la presente descripción, con el uso de un disruptor de células de Constant System a una presión interna de 35 000 psi. El recuento de RMP (rendimiento) se midió mediante citometría de flujo con el uso de anticuerpo monoclonal anti-glicoforina A marcado con PE como marcador. La actividad procoagulante de RMP se determinó mediante tromboelastograma (TEG). Como se muestra en la Tabla 2, las composiciones resultantes de las RMP producidas a partir de glóbulos rojos congelados y no congelados no fueron significativamente diferentes en
términos de rendimiento, actividad procoagulante y unión a la anexina V. El uso de RBC previamente congelados permite aumentar la producción de RMP.
Tabla 2: Producción de RMP a partir de RBC congelados frente a no congelados Fuente de RBC Rendimientos de Actividad procoagulante / Unión de anexina V RMP (recuentos/ml 7*107 RMP (% del RMP total) ____________________________de sangre)__________________________________________________ RBC descongelado (control) 7,0*109 : 100 % : 38 % RBC congelado durante 1 mes 7,2*109 : 106 % : 40 % RBC congelado durante 2 meses 7,3*109 : 113 % 
: 42 % RBC congelado durante 3 meses 6,9*109 : 111 % : 43 %
El uso de los términos "un" y "un" y "el/la" y referencias similares en el contexto de describir la descripción (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que en la presente descripción quede indicado de otro modo o claramente contradicho por el contexto. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significan "que incluye, pero sin limitarse a") a menos que se indique de otro modo. A través de la descripción, cuando se describe que las formulaciones incluyen componentes o materiales, se contempla que las formulaciones también pueden consistir esencialmente en, o consistir en, cualquier combinación de los componentes o materiales enumerados, a menos que se describa de otro modo. Asimismo, cuando se describe que los métodos incluyen pasos particulares, se contempla que los métodos también pueden consistir esencialmente en, o consistir en, cualquier combinación de los pasos enumerados, a menos que se describa de otro modo. La invención descrita de forma ilustrativa en la presente descripción puede practicarse adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o paso que no se describa específicamente en la presente descripción. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las variantes posibles de los mismos está incluida en la descripción, a menos que se indique de otro modo en la presente descripción o se contradiga claramente por el contexto.
La enumeración de los rangos de valores en la presente descripción tiene la intención meramente de servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del rango y cada punto final, a menos que se indique de otro modo en la presente descripción, y cada valor y punto final por separado se incorpora a la descripción como si se mencionaran individualmente en la presente descripción. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en la presente descripción tiene la intención meramente de esclarecer mejor la descripción y no plantea una limitación en el alcance de la descripción a menos que se reivindique de otro modo. Ningún lenguaje en la descripción debe interpretarse como indicativo de ningún elemento no reivindicado sea esencial para la práctica de la descripción.
Claims (15)
1. Una composición que comprende micropartículas derivadas de glóbulos rojos (RMP) que demuestran una actividad de acetilcolinesterasa (AchE) de menos de 350 pmol/min/106 partículas/pl.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde las RMP demuestran una actividad de acetilcolinesterasa (AchE) de menos de 200 pmol/min/106 partículas/pl.
3. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde del 20 %-50 % de las RMP en la composición presentan fosfatidilserina.
4. La composición de la reivindicación 3, en donde del 30 %-45 % de las RMP en la composición presentan fosfatidilserina.
5. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la composición acorta el tiempo hasta la formación inicial del coágulo medido por tromboelastografía (TEG) en sangre total y plasma en al menos dos minutos.
6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el diámetro medio de las RMP es de 0,40 a 0,6 pm.
7. La composición de la reivindicación 6, en donde el diámetro medio de las RMP es de 0,40 a 0,5 pm.
8. La composición de la reivindicación 7, en donde el diámetro medio de las RMP es de 0,47 pm.
9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la densidad interna de las RMP es inferior al 3,5 % de la densidad interna de los glóbulos rojos enteros.
10. La composición de la reivindicación 9, en donde la densidad interna de las RMP es de 0,5-3,0 % de la densidad interna de los glóbulos rojos enteros medida mediante señal de dispersión lateral de citometría de flujo.
11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que las RMP se producen al forzar glóbulos rojos a través de una abertura para producir glóbulos rojos rotos y fragmentar aún más los glóbulos rojos rotos mediante bombardeo sobre una superficie sólida.
12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para el uso en un método para tratar el sangrado excesivo en un sujeto, en donde el método comprende administrar la composición al sujeto.
13. La composición para el uso de la reivindicación 12, en donde el sangrado excesivo es causado por trombocitopenia o disfunción plaquetaria.
14. La composición para el uso de la reivindicación 13, en donde la disfunción plaquetaria es causada por un tratamiento farmacológico.
15. La composición para el uso de la reivindicación 12, en donde el sangrado excesivo es causado por un anticoagulante, opcionalmente Coumadin, heparina de bajo peso molecular, un inhibidor del complejo protrombinasa, un inhibidor de FXa o un inhibidor de trombina.
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