ES2253763T3 - Metodo para la estabilizacion de plaquetas. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION TRATA DE PREPARACIONES DE PLAQUITAS FUNCIONALMENTE ACTIVAS Y DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA ESTABILIZACION DE TALES PLAQUITAS FUNCIONALMENTE ACTIVAS MEDIANTE LIOFILIZACION.
Description
Método para la estabilización de plaquetas.
La presente invención se refiere a preparaciones
de plaquetas funcionalmente activas, y a un procedimiento para
estabilizar estas plaquetas funcionalmente activas mediante la
adición de inhibidores de la función plaquetaria y posterior
liofilización.
Las plaquetas funcionalmente activas son útiles
desde el punto de vistadiagnóstico y terapéutico. Un aspecto de la
utilidad de un preparado de plaquetas funcionalmente activas es, por
ejemplo, su empleo como material de control para el diagnóstico de
la función plaquetaria. En este diagnóstico, la agregometría
desempeña el papel más importante. Se mide aquí la reacción de
plaquetas frescas, que por regla general se presentan como plasma
rico en plaquetas, con diversos inductores, sobre todo ADP,
adrenalina, ácido araquidónico, colágeno y trombina. La medida de la
reacción se realiza usualmente mediante los métodos turbidimétricos
conocidos. Los inductores (salvo la adrenalina) originan
primeramente un cambio de forma de las células, que se puede
detectar por un incremento transitorio de la extinción. Acto seguido
tiene lugar la agregación. A menudo se producen curvas de agregación
bifásicas. La segunda fase está estrechamente relacionada con la
reacción de liberación y con la síntesis de prostaglandinas. El
ácido araquidónico y el colágeno inducen sólo curvas de agregación
monofásicas como expresión de una agregación irreversible.
Por motivos de racionalización y precisión, hoy
en día el análisis de la función plaquetaria está considerablemente
automatizado. Para evaluar los resultados es absolutamente necesaria
una estrategia de control de calidad. La única posibilidad para el
control de dicho diagnóstico consistía hasta hoy en el empleo de un
combinado de muestras de donantes "normales" (Abernathy y otros
(1978) Thromb. Haemostas. 39, página 246). Este es un
material de control muy laborioso de preparar en un laboratorio.
Sería deseable una preparación de plaquetas estable y funcionalmente
activa, con propiedades definidas y constantes, para el control de
la función plaquetaria, pero hasta la fecha no se encontraba
disponible.
Otro aspecto del empleo de plaquetas estables y
funcionalmente activas es su utilización en procedimientos de ensayo
diagnóstico, en los cuales las plaquetas son uno de los reactivos a
utilizar. Son un ejemplo de ello los ensayos para determinar la
trombocitopenia asociada a la heparina (siglas inglesas HAT). Es
ésta una rara (aprox. 5%) pero grave complicación de la terapia
antitrombótica con heparinas. Se distinguen formas no inmunológicas
(HAT I) de formas con origen inmunológico (HAT II). Contrariamente a
lo que ocurre en otras trombocitopenias inducidas
medicamentosamente, que producen por regla general complicaciones
hemorrágicas, en el caso de la HAT se originan complicaciones
tromboembólicas, que pueden llegar hasta la obstrucción de grandes
vasos. Diversos preparados de diagnóstico sirven para la detección
temprana de una HAT de tipo II. Además del recuento de las
plaquetas, que es un primer ensayo exploratorio, y del ensayo de
liberación de serotonina como método de referencia, entra en
consideración, sobre todo, un ensayo de agregación plaquetaria
inducida por heparina (siglas inglesas HIPA), que se aproxima al
método de referencia en cuanto a sensibilidad y especificidad
(Greinacher y otros (1991) Thromb. Haemostas. 66(6),
734, 1991, Greinacher y otros (1994) Transfusion 34, página
381). En este ensayo se investiga si el plasma del paciente puede
hacer agregarse a trombocitos de pacientes sanos, en condiciones
adecuadas (baja concentración de heparina). La obtención de los
trombocitos, que requiere la combinación de plasma rico en plaquetas
de varios donantes sanos, resulta muy costosa para el laboratorio, y
ha impedido hasta hoy la incorporación del ensayo a la rutina del
laboratorio. Una preparación de trombocitos estables, que sigan
siendo aún funcionalmente activos, y que puedan agregarse en
condiciones adecuadas, simplificaría y aceleraría considerablemente
la ejecución de esta prueba.
Terapéuticamente, se pueden emplear concentrados
de plaquetas para tratar trastornos de la función plaquetaria de
origen diverso. Cuando la concentración de plaquetas se sitúa en
valores inferiores a 70 000 por microlitro, se habla de
trombocitopenias. Las trombocitopenias están originadas, o bien por
una producción de plaquetas insuficiente, o bien por una destrucción
acelerada de estas células, o bien por una distribución anormal
(Colman y otros (1987) Haemostasis and Thrombosis (J.B. Lipincott
Co.) 2ª edición, capítulo 28). Una función plaquetaria insuficiente
puede ser debida fundamentalmente a causas genéticas (por ejemplo la
tromboastenia de Glanzmann o el síndrome de
Bernard-Soulier) o bien ser adquirida (por ejemplo
la insuficiencia medular en las afecciones malignas, la
quimioterapia, la coagulación intravasal diseminada). Una serie de
sustancias, medicamentos y radiaciones ionizantes pueden conducir a
trombocitopenias adquiridas.
Los pacientes que sufren una trombocitopenia
presentan una tendencia a la hemorragia similar a la que ocurre en
la hemofilia. Las hemorragias se producen por regla general en los
vasos capilares; son típicas, por ejemplo, pequeñas hemorragias en
las mucosas (petequias). En una situación normal, las plaquetas que
se aglutinan cierran las pequeñas lesiones de las paredes de los
capilares.
Hasta hoy, los pacientes con bajo número de
plaquetas son tratados mediante la infusión de concentrados de
plaquetas. Estos concentrados contienen típicamente 6 x 10^{10}
plaquetas en aproximadamente 50 ml de plasma. Se preparan
centrifugando de manera escalonada sangre tratada con
anticoagulantes, y resuspendiendo en plasma el precipitado de
plaquetas. De manera alternativa, se pueden preparar concentrados de
plaquetas mediante un aparato de aféresis, con el cual se pueden
separar directamente las plaquetas de la sangre. Los concentrados de
plaquetas se pueden conservar en condiciones apropiadas (temperatura
ambiente) hasta 7 días. Durante el almacenamiento, las bolsas que
contienen el concentrado deben estar permanentemente en movimiento.
Sería deseable un período de conservación más prolongado de los
concentrados de plaquetas, pero no se ha conseguido hasta la
fecha.
Una primera estrategia posible para conseguir un
mayor período de conservación de concentrados de plaquetas con fines
diagnósticos o terapéuticos consiste en la interrupción de
determinados mecanismos de activación de las plaquetas. Esto debe
asegurar que las plaquetas no se activen prematuramente durante el
proceso de su enriquecimiento y conservación, segreguen sustancias
componentes, y se agreguen. Se encuentran descritas en la
bibliografía diversas estrategias de este tipo; abarcan desde
determinados procedimientos de lavado hasta la adición de
inhibidores específicos:
- -
- El calcio, activador de la agregación plaquetaria, puede ser acomplejado mediante un agente quelante, por ejemplo EDTA.
- -
- El activador ADP puede ser degradado por completo a AMP mediante la adición de la enzima apirasa.
- -
- Los factores plasmáticos que pueden contribuir a la activación de las plaquetas pueden ser eliminados mediante el lavado de las plaquetas.
- -
- La trombina puede ser inhibida mediante la adición de hirudina o de heparina/antitrombina III.
- -
- La adición de prostaciclina (PGI_{2}) inhibe la agregación plaquetaria a través de la estimulación de la adenilatociclasa celular.
- -
- La aspirina o la indometacina inhiben la ciclooxigenasa de las plaquetas, e interrumpen así irreversiblemente la ruta de síntesis de tromboxano.
Sin embargo, en la práctica se ha evidenciado que
la adición de inhibidores daña irreversiblemente a las plaquetas o
inhibe fuertemente su función.
El documento
WO-A-9323997 describe plaquetas
estabilizadas por fijación y liofilización. Sin embargo, dependiendo
de la fijación y del activador, entre 25 y 85% de las plaquetas no
son capaces de agregarse.
Sería deseable un procedimiento para estabilizar
de manera suave estas células, sin afectar sustancialmente a su
función.
Cualquier procedimiento de estabilización debe
asegurar que las plaquetas conserven una cierta actividad funcional
durante todo el proceso, y ello implica, por ejemplo, que las
plaquetas no cambien de forma ya durante la preparación y la
estabilización del concentrado, no segreguen activadores, ni se
agreguen. En una preparación estable de plaquetas, las mismas deben
presentarse como células individuales con forma predominantemente
discoidal. La actividad funcional presupone la conservación de
determinados orgánulos celulares (por ejemplo los gránulos
"a"), y en el plano molecular, la conservación de determinados
receptores en la superficie celular, por ejemplo la glicoproteína
Ib/IX, que sirve como receptor para el factor de
von-Villebrand, o de la glicoproteína IIb/IIIa, que
sirve como receptor para el fibrinógeno. Es necesario, además, que
permanezcan intactas determinadas rutas metabólicas, que liberan
sustancias mensajeras intracelulares como reacción a la fijación de
ligandos a los receptores, y desencadenan determinados procesos
fisiológicos, por ejemplo la segregación de gránulos "a".
Se han descrito ya plaquetas estabilizadas por
liofilización que, sin embargo, reaccionan sólo de acuerdo con la
activación por factor de von-Villebrand.
Por tanto, la presente invención se ha basado en
la tarea de poner a disposición un preparado de plaquetas que
satisfaga los requisitos antes mencionados.
Se ha hallado, sorprendentemente, que tras la
adición de inhibidores de la función plaquetaria y posterior
liofilización, se han podido obtener plaquetas que aparecen
separadas individualmente, y que son funcionalmente activas.
En el sentido de la presente invención,
"funcionalmente activo" significa que las plaquetas
estabilizadas y reconstituidas reaccionan con la segregación de
sustancias propias a las plaquetas, modificación de su forma
geométrica, aglutinación o agregación, al menos a la adición de cada
una de las siguientes sustancias: ADP, calcio, colágeno, ácido
araquidónico, trombina, anticuerpos contra componentes plaquetarios,
y activadores plaquetarios de la cascada de coagulación.
Se prefieren también plaquetas que reaccionan de
manera especial a algunas de estas sustancias, o a combinaciones
seleccionadas de las mismas. Se prefieren especialmente plaquetas
que reaccionan a la adición de heparina.
La invención se refiere, por tanto, a un
procedimiento para obtener plaquetas funcionalmente activas, en el
cual primeramente se extrae sangre y se mezcla con un
anticoagulante. Entran aquí en consideración anticoagulantes
habituales en general, tales como citrato o EDTA, a la concentración
habitualmente empleada. En el medio de extracción pueden estar
incluidos otros inhibidores. Resulta ventajosa, por ejemplo, la
inclusión de inhibidores de trombina en una concentración que
garantice que sea inhibida de manera segura toda la trombina que
pueda haberse formado en la sangre. Resulta particularmente
ventajoso el empleo de hirudina a una concentración final de 1 a 10
unidades/ml. Sorprendentemente, además de los inhibidores
específicos de la función plaquetaria antes mencionados, resulta
apropiada como inhibidor de dicha función plaquetaria la sustancia
sulfato de hidroxicloroquina. La cloroquina y la hidroxicloroquina
son conocidas como agentes antimaláricos. Se trata de sustancias
anfífilas catiónicas que pueden atravesar sin obstáculos las
membranas. Son adecuadas para estabilizar las plaquetas
concentraciones milimolares de sulfato de hidroxicloroquina,
preferentemente 0,1 a 5 g/litro, y de manera especialmente
preferente 5 g/litro. De las reivindicaciones 2 a 17 se pueden
deducir otras formas de realización de la invención.
De la sangre tratada con anticoagulantes se
separan las plaquetas mediante centrifugación secuencial, por
procedimientos en sí conocidos para un técnico. En un primer paso se
lleva a cabo, por ejemplo, una centrifugación a 3000 x g durante 45
minutos; las plaquetas se obtienen separando la capa leucocítica, y
se resuspenden en una solución tamponada de anticoagulante. Se
centrifuga este material durante 20 minutos a 200 x g para separar
otras células sanguíneas; el sobrenadante está constituido por
plaquetas.
A continuación se lavan varias veces estas
plaquetas con un exceso de tampón de lavado. El tampón de lavado
contiene anticoagulantes, sustancias tamponadoras y estabilizadores.
Entran en consideración como anticoagulantes, por ejemplo, el EDTA o
el citrato. El efecto amortiguador se puede conseguir también con
citrato o con otros sistemas tamponadores (HEPES, fosfato). Un
tampón de lavado puede tener, preferentemente, la siguiente
composición: citrato sódico 32,2 g/litro, sulfato de
hidroxicloroquina 5 g/litro, pH 7,4.
A continuación, a la suspensión de plaquetas se
le añade además un formador de torta para la liofilización. Es,
ventajosamente, un polisacárido tal como manita, por ejemplo, o una
proteína, por ejemplo poligelina o albúmina sérica. Se emplea
preferentemente albúmina sérica a una concentración final de 0,1 a
100 g/litro, muy preferentemente de 10 a 70 g/litro, y de manera
especialmente preferente 50 g/litro.
Finalmente, se ajustan las plaquetas a una
concentración entre 10^{4}/\mul y 10^{8}/\mul,
preferentemente 10^{7}/\mul.
Se incuban las plaquetas a temperatura ambiente
(de 10 a 40°C, preferentemente de 20 a 25°C) ventajosamente durante
5 a 60 minutos, preferentemente durante 10 a 40 minutos, y muy
preferentemente durante unos 30 minutos, y acto seguido se
liofilizan de manera tal que se ajusta una humedad residual entre 0%
y 10%, con preferencia en torno al 3%.
Resulta especialmente ventajosa la adición
combinada de un inhibidor y de un formador de torta. De este modo
las plaquetas quedan manifiestamente estabilizadas de modo tal que
tras la congelación y la liofilización pueden ser activadas por
activadores fisiológicos.
Para reconstituir el concentrado de plaquetas
liofilizado, ventajosamente se le reconstituye en tampón para
activación. Este contiene, por ejemplo:
- -
- glucosa a una concentración entre 0 g/litro y 100 g/litro, preferentemente de 1 g/litro a 10 g/litro, y de manera especialmente preferente en torno a 2,4 g/litro.
- -
- una sal de magnesio, preferentemente cloruro magnésico, a una concentración entre 0 g/litro y 100 g/litro, preferentemente de 1 g/litro a 5 g/litro, y de manera especialmente preferente en torno a 1,2 g/litro.
- -
- una sal de potasio, preferentemente cloruro potásico, a una concentración entre 0 g/litro y 100 g/litro, preferentemente de 1 g/litro a 5 g/litro, y de manera especialmente preferente en torno a 1,6 g/litro.
- -
- una sal de sodio, preferentemente cloruro sódico, a una concentración entre 0 g/litro y 100 g/litro, preferentemente de 0,5 g/litro a 5 g/litro, y de manera especialmente preferente en torno a 0,6 g/litro.
Para eliminar inhibidores de la función
plaquetaria se pueden lavar las plaquetas en el tampón de activación
antes mencionado, por ejemplo extrayéndolas y separándolas por
centrifugación a aproximadamente 2400 x g.
Tras estos pasos, se puede emplear el concentrado
de plaquetas como material patrón para análisis de la función
plaquetaria o como reactivo en pruebas diagnósticas.
Las plaquetas liofilizadas se pueden conservar a
+4°C durante 6 meses, como mínimo. La reactividad de las plaquetas,
medida agregométricamente, frente a activadores tales como colágeno
o trombina, no se ve afectada durante el almacenamiento. Por tanto,
se obtiene una mejora de la conservabilidad frente a concentrados
líquidos de plaquetas (7 días) en un factor de al menos 30
veces.
Las plaquetas liofilizadas se pueden emplear
también como medicamento para el tratamiento de las deficiencias de
plaquetas o para trastornos de la función plaquetaria.
Para preparar una composición terapéuticamente
útil se deben formular las plaquetas en una forma adecuada. Sirven
para ello sistemas vehiculantes farmacéuticamente utilizables, que
son en sí conocidos para un técnico. Las plaquetas se administran
preferentemente por vía intravenosa, como suspensión estéril. El
material liofilizado contiene plaquetas activables como material
terapéuticamente activo, junto a sulfato de hidroxicloroquina y
albúmina sérica como estabilizadores. Al ser resuspendido en Aqua
ad injectabile (agua para inyección) estéril, resulta ya un
medicamento que desde el punto de vista farmacéutico es directamente
utilizable. Tanto para la hidroxicloroquina como para la albúmina
sérica existe una amplia experiencia en el uso en seres humanos. El
sulfato de hidroxicloroquina es un agente conocido desde hace tiempo
en la terapia de la malaria (Webster (1990) en: The Pharmacological
Basis of Therapeutics; compilado por L.S. Goodman y A. Gilman, 8ª
edición). La vía de administración es usualmente la oral, pero
también es posible la administración por vía intravenosa (White
(1998) Eur. J. Clin. Pharm. 34(1), páginas
1-14). A la concentración de sulfato de
hidroxicloroquina empleada con preferencia, aproximadamente 5
g/litro, y con una concentración de plaquetas de 10^{7}/\mul, la
infusión del número de plaquetas que está contenido normalmente en
un litro de sangre corresponde a una ingesta de 250 mg de sulfato de
hidroxicloroquina. En la terapia antimalárica se emplean hasta 500
mg de sustancia al día. Una administración intravenosa de 0,8 mg por
kg y por hora es toxicológicamente inocua (White 1988). Se puede
deducir de esto, por tanto, que la adición de sulfato de
hidroxicloroquina a las plaquetas es toxicológicamente inocua.
La albúmina sérica humana es un estabilizador
conocido y toxicológicamente inocuo, que está contenido en muchos
medicamentos aprobados.
Además de la infusión de las plaquetas
liofilizadas inmediatamente tras la disolución en agua para
inyección estéril, también son posibles otras formulaciones de las
plaquetas para su uso en pacientes. Así, por ejemplo, se puede
eliminar el sulfato de hidroxicloroquina mediante lavado,
eventualmente repetido varias veces, de las plaquetas originalmente
resuspendidas en agua. Para ello se separan por centrifugación a
2400 x g las plaquetas, y después se suspenden en un medio
farmacéuticamente adecuado. Entran en consideración para ello, en
principio, todas las soluciones en sí conocidas para un técnico
tales como, por ejemplo, soluciones salinas estériles (por ejemplo
NaCl isotónico u otras), soluciones tampón estériles (citrato, Tris,
HEPES), y soluciones estériles de estabilizadores (proteínas tales
como albúmina sérica humana u otras, azúcares tales como manita y
otros).
Los siguientes ejemplos deben ilustrar la
invención.
Ejemplo
1.1
Se extrae sangre de donantes sanos mediante
punción venosa, y se mezcla directamente con anticoagulante. Para
ello se introducen 500 ml de sangre, evitando la formación de
espuma, en un frasco en el que se habían dispuesto previamente 50 ml
de tampón de citrato concentrado (citrato sódico 39,6 g/litro +
ácido cítrico 0,26 g/litro, pH 7). Para conseguir una mezcla
homogénea se mueve cuidadosamente el frasco. Se transfiere la sangre
a un vaso de acero inoxidable, y se centrifuga durante 45 minutos a
3000 x g, a una temperatura de 12-18°C. Se desecha
el plasma sobrenadante. Se toma en tampón de lavado (citrato sódico
32,2 g/litro, sulfato de hidroxicloroquina 5 g/litro, pH 7,4) la
siguiente capa celular contando hacia abajo (capa leucocítica), y se
centrifuga dos veces durante 20 minutos a 200 x g. El sobrenadante
está constituido por una suspensión de trombocitos. A continuación
se lavan de nuevo las células dos veces más con tampón de lavado.
Para ello primeramente se centrifuga la suspensión durante 20
minutos con 2400 x g, y después se resuspende en cada caso en tampón
de lavado.
Ejemplo
1.2
Se prepara una suspensión de plaquetas según el
Ejemplo 1.
Se determina la densidad de plaquetas con ayuda
de un aparato de recuento automático (Mölab, Hilden, Alemania). A
continuación se ajusta la suspensión, con tampón de lavado, a una
concentración de 5 x 10^{7}/\mul.
Se añaden 50 mg de albúmina sérica de bovino por
cada ml de suspensión. A continuación se envasa la suspensión y se
liofiliza cuidadosamente. La temperatura más alta seleccionada son
40°C, y la duración total del secado son 25 horas. El proceso se
lleva a cabo de manera tal que se ajusta una humedad residual de
aprox. 1-2%.
Ejemplo
2
Se prepararon plaquetas de acuerdo con el Ejemplo
1, y se liofilizaron. Se reconstituye el liofilizado en el volumen
inicial de agua destilada.
Se separan por centrifugación las plaquetas (10
minutos a 2500 x g), se resuspenden en el mismo volumen de solución
isotónica de cloruro sódico, y se lavan dos veces más en esta
solución. A continuación se resuspenden las plaquetas en tampón de
activación (glucosa 2,4 g/litro, NaCl 0,6 g/litro, MgCl_{2} 1,2
g/litro, KCl 1,6 g/litro), y se ajustan con este tampón a una
concentración de 4,6 x 10^{5}/\mul. El recuento de plaquetas se
realiza con un aparato de recuento automático (razón social Mölab,
Hilden, Alemania).
Sirve como control positivo plasma de citrato
rico en plaquetas (combinado de donantes sanos), que se ajusta con
plasma pobre en plaquetas a una concentración de 4,8 x
10^{5}/\mul. Sirven como control negativo plaquetas que habían
sido fijadas en formol al 4%, y liofilizadas a continuación. Se
reconstituyen estas plaquetas en solución isotónica de NaCl, y se
ajustan a una concentración de 4,9 x 10^{5}/\mul.
Se mezclan 1000 \mul de plaquetas, o bien con
100 \mul de colágeno procedente de placenta humana (1 mg/ml,
Behring Diagnostics, Marburg, Alemania), o bien con 100 \mul de
NaCl isotónico como testigo, y se incuban durante 15 minutos a 37°C.
A continuación se centrifugan las mezclas, para separar los
agregados, durante 10 minutos a 40 x g.
Se determinó en cada caso la densidad de
plaquetas en el sobrenadante, que constituye una medida de la
fracción de plaquetas no agregables.
| Activador | NaCl (control negativo) | Colágeno |
| Plasma rico en plaquetas (control positivo) | 85 | 9 |
| Plaquetas fijadas (control negativo) | 77 | 74 |
| Plaquetas estabilizadas y liofilizadas | 70 | 3 |
Se pone de manifiesto que, en las condiciones
elegidas, las plaquetas procedentes de plasma rico en plaquetas y
las plaquetas liofilizadas se presentan casi por completo en forma
de agregados separables, mientras que, por el contrario, las
plaquetas fijadas con formol no son agregables.
Ejemplo
3
Se prepararon plaquetas de acuerdo con el Ejemplo
1, y se liofilizaron. Se reconstituye el liofilizado en el volumen
inicial de agua destilada.
Se separan por centrifugación las plaquetas (10
minutos a 2500 x g), se resuspenden en el mismo volumen de solución
isotónica de cloruro sódico, y se lavan dos veces más en esta
solución. A continuación se resuspenden las plaquetas en tampón de
activación (glucosa 2,4 g/litro, NaCl 0,6 g/litro, MgCl_{2} 1,2
g/litro, KCl 1,6 g/litro), y se ajustan con este tampón a una
concentración de 4,6 x 10^{5}/\mul. El recuento de plaquetas se
realiza con un aparato de recuento automático (razón social Mölab,
Hilden, Alemania).
Sirven como control negativo plaquetas que habían
sido fijadas en formol al 4%, y liofilizadas a continuación. Se
reconstituyen estas plaquetas en solución isotónica de NaCl, y se
ajustan a una concentración de 4,7 x 10^{5}/\mul.
Se preincuban 1000 \mul de plaquetas durante 5
minutos a 37°C. A continuación se añaden, o bien trombina de bovino
purificada (100 \mul 3 UI/ml; Behring Diagnostics), o bien 100
\mul de NaCl isotónico. Se incuban durante 15 minutos a 37°C. A
continuación se centrifugan las mezclas, para separar los agregados,
durante 10 minutos a 40 x g.
Se determinó en cada caso la densidad de
plaquetas en el sobrenadante, que constituye una medida de la
fracción de plaquetas no agregables.
| Activador | NaCl (control negativo) | Trombina |
| Plaquetas fijadas (control negativo) | 64 | 64 |
| Plaquetas estabilizadas y liofilizadas | 65 | 19 |
Se pone de manifiesto que, en las condiciones
elegidas, las plaquetas liofilizadas se presentan en aproximadamente
dos terceras partes en forma de agregados separables, mientras que,
por el contrario, las plaquetas fijadas con formol no son
agregables.
Claims (21)
1. Plaquetas estabilizadas por liofilización,
funcionalmente activas, caracterizadas porque se han obtenido
por adición de inhibidores de la función plaquetaria y posterior
liofilización.
2. Plaquetas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque son aisladas de la sangre de animales
mamíferos.
3. Plaquetas según la reivindicación 2,
caracterizadas porque se mezcla la sangre extraída con un
medio de extracción, y el medio de extracción contiene un
anticoagulante.
4. Plaquetas según la reivindicación 3,
caracterizadas porque al medio de extracción se le añade al
menos un inhibidor de la agregación plaquetaria.
5. Plaquetas según la reivindicación 4,
caracterizadas porque el medio de extracción contiene
hirudina a una concentración final entre 0,1 U/ml y 10 U/ml, con
preferencia de 1 U/ml a 4 U/ml, y de manera especialmente preferente
en torno a 2 U/ml.
6. Plaquetas según la reivindicación 4,
caracterizadas porque el medio de extracción contiene una de
las sustancias cloroquina, hidroxicloroquina, camoquina, quinacrina,
y procaína.
7. Plaquetas según la reivindicación 6,
caracterizadas porque la hidroxicloroquina se utiliza en una
concentración entre 0,1 g/litro y 100 g/litro, con preferencia de 1
g/litro a 10 g/litro, y de manera especialmente preferente en torno
a 5 g/litro.
8. Plaquetas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque son lavadas antes de la
liofilización.
9. Plaquetas según la reivindicación 8,
caracterizadas porque el tampón de lavado contiene
anticoagulante, con preferencia citrato, a una concentración entre 1
g/litro y 50 g/litro, con preferencia de 2 g/litro a 10 g/litro, y
de manera especialmente preferente en torno a 3,8 g/litro.
10. Plaquetas según la reivindicación 8,
caracterizadas porque el tampón de lavado contiene un
inhibidor del grupo de las siguientes sustancias: cloroquina,
hidroxicloroquina, camoquina, quinacrina, y procaína.
11. Plaquetas según la reivindicación 10,
caracterizadas porque la hidroxicloroquina se utiliza en una
concentración entre 0,1 g/litro y 100 g/litro, con preferencia de 1
g/litro a 10 g/litro, y de manera especialmente preferente hasta en
torno a 5 g/litro.
12. Plaquetas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque antes de la liofilización se les añade
al menos un estabilizador.
13. Plaquetas según la reivindicación 12,
caracterizadas porque se añade como estabilizador una de las
siguientes sustancias: albúmina sérica en una concentración entre 1
g/litro y 100 g/litro, con preferencia de 20 g/litro a 60 g/litro, y
de manera especialmente preferente en torno a 50 g/litro, un hidrato
de carbono, preferentemente manita, en una concentración entre 1
mg/litro y 100 g/litro, con preferencia de 5 g/litro a 30 g/litro, y
de manera especialmente preferente en torno a 10 g/litro, poligelina
en una concentración entre 1 mg/litro y 100 g/litro, con preferencia
de 5 g/litro a 30 g/litro, y de manera especialmente preferente 10
g/litro.
14. Plaquetas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque antes de la liofilización se les ajusta
a una concentración entre 10^{4}/\mul y 10^{9}/\mul.
15. Plaquetas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque la liofilización se lleva a cabo de
manera tal que se ajusta una humedad residual entre 0% y 10%, con
preferencia en torno a 3%.
16. Plaquetas según la reivindicación 1,
caracterizadas porque tras la liofilización son
reconstituidas en tampón de activación.
17. Plaquetas según la reivindicación 16,
caracterizadas porque el tampón de activación contiene las
siguientes sustancias: glucosa a una concentración entre 1 mg/litro
y 100 g/litro, con preferencia de 0,1 g/litro a 5 g/litro, y de
manera especialmente preferente en torno a 2,4 g/litro, y además una
sal de magnesio, preferentemente cloruro magnésico, a una
concentración entre 1 mg/litro y 100 g/litro, con preferencia de 0,1
g/litro a 5 g/litro, y de manera especialmente preferente en torno a
1,2 g/litro, y además una sal de potasio, preferentemente cloruro
potásico, a una concentración entre 1 mg/litro y 100 g/litro, con
preferencia de 0,1 g/litro a 5 g/litro, y de manera especialmente
preferente en torno a 1,6 g/litro, y una sal de sodio,
preferentemente cloruro sódico, a una concentración entre 1 mg/litro
y 100 g/litro, con preferencia de 0,1 g/litro a 5 g/litro, y de
manera especialmente preferente en torno a 0,6 g/litro.
18. Reactivo caracterizado porque contiene
plaquetas de acuerdo con la reivindicación 1.
19. Reactivo según la reivindicación 18,
caracterizado porque sirve como patrón o material de control
para pruebas de la función plaquetaria.
20. Reactivo según la reivindicación 18,
caracterizado porque se emplea para la detección de la
trombocitopenia inducida por heparina.
21. Composición farmacéutica para el tratamiento
de una función plaquetaria insuficiente en pacientes,
caracterizada porque contiene una cantidad terapéutica de
plaquetas de acuerdo con la reivindicación 1, y un material de
vehículo farmacéuticamente aceptable.
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