JP3038006B2 - 敗血症または敗血症ショックの処置または予防のための組成物および方法 - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は敗血症または敗血症ショックの処置または予
防のための組成物および方法に関する。注目すべき特徴
において、本発明は存在する細菌感染の処置に加えて、
更に敗血症ショックに寄与する凝血システムにおける障
害を軽減する組成物および方法に関する。

敗血症は主として入院患者であって、通常疾患を有し
ている者についてその疾患が患者に血流侵入を起こり易
くすることによって発生する。殆どの敗血症の場合に、
支配的な病原菌はエシェリヒア・コリ（Escherichia co
li）、引き続いてクレブシェラ−エンテロバクター−セ
ラティア族（Klebsiella−Enterobacter−Serratia gro
up）、そしてシェードモナス（Pseudomonas）である。
性尿器路が最も一般的な感染の部位であり、胃腸路およ
び呼吸路が次に最も頻度の高い敗血症源である。その他
の一般的な病巣は創傷、火傷および骨盤感染ならびに静
脈内カテーテルである。

グラム陰性菌は病院の患者における宿命的な細菌感染
の主要な原因となる。抗生物質の利用および積極的な支
援技術にも拘らず、グラム陰性菌罹患患者の死亡率は過
去20年間に40％に接近していた。これらの細菌は、医薬
に対し比較的不浸透性である隔膜および全てのグラム陰
性菌により生成される内毒素ではあるが、たとえ細菌細
胞が破壊された後であっても致死の毒性を残すものによ
って区別される。このように、グラム陰性菌感染の致死
性は生活力のある細菌の制御できない成長および内毒素
の解放の両者に起因する。

非常に大きな構造的多様性を有し、かつグラム陰性菌
に特有である内毒素は細菌細胞の外層膜のリポ多糖
（“LPS"）成分と関連している。異なった細菌種からの
LPSは構造的に類似である。

グラム陰性菌菌血症の容易ならぬ結果は屡々敗血症シ
ョックを引き起こす。敗血症ショックは不適切な組織灌
流、組織に対する不十分な酸素供給を導くこと、低血圧
症および減尿症によって特徴づけられる。敗血症ショッ
クは細菌生成物、主としてLPSが細胞膜ならびに凝集、
補体、繊維素溶解（fibrinolytic）およびブラジキニン
系の成分と反応して凝固を活性化し、これが細胞を損傷
し、かつ血液の流れを特に毛細血管において変更するも
のである。凝血システムに関する微生物感染の様々な影
響が図面の第１図に概略的に示されている。微生物は屡
々古典的補体経路を活性化し、そして内毒素は第二経路
を活性化する。好中球に対する内毒素の補体活性、ロイ
コトリエンの生成およびその直接作用は肺内のこれら炎
症を起こした細胞の蓄積、それら酵素の解放および毒性
酸素基の生成をもたらし、これが肺動脈の内皮を損傷
し、かつ急性呼吸困難症候群（“ARDS"）を引き起こ
す。ARDSは敗血症ショックを伴う患者における死の主要
原因であり、また呼吸器の鬱血、顆粒球の凝集、出血お
よび毛細血管トロンビ（capillary thrombi）により特
徴づけられる。

凝固システムの活性化は数多くの組織内の微細な循環
において、トロンビンの生成および血小板トロンビの形
成をもたらす。この症候群の発病はXII因子による固有
の凝固システムの活性化を伴う。活性化XII因子は固有
の凝固カスケードを起こし、また最後にはフィブリノー
ゲンがフィブリンに変換され、そして血餅が生ずる。通
常ショックを伴う、凝固についての制御されない活性化
は血栓症を招来し、かつ凝固II、ＶおよびVIII因子の消
耗をもたらす。撒き散らされた脈管内の凝固に関する幾
つかの一般的な合併症は、重大な臨床的出血、血栓症、
組織の虚血および壊死、溶血ならびに臓器破損である。

同時に、凝固が内毒素によって明らかに引き起こされ
ると、カウンターヴィーン（countervening）機序もま
た血餅、すなわち繊維素溶解システムの活性化によって
活性化されて出現する。活性化XII因子はプラスミノー
ゲン・プロ活性化因子をプラスミノーゲン活性化因子に
変換するが、これは引き続いてプラスミノーゲンをプラ
スミンに変換し、それによって血餅溶解の仲介役を勤め
る。従って、血漿繊維素溶解システムの活性化もまた出
血の傾向に寄与する可能性がある。

エンドトクセミア（Endotoxemia）は組織プラスミノ
ーゲン活性化因子インヒビター（“PAI"）の循環レベル
における増加に関連している。このインヒビターは組織
プラスミノーゲン活性化因子（“tPA"）を急速に不活性
化し、それによってその能力を妨げて、プラスミノーゲ
ンからプラスミンへの活性化を通じて繊維素溶解を促進
する。繊維素溶解の阻害は血管内に繊維素の沈着を生ず
る可能性があり、その結果、敗血症ショックに関連する
撒き散らされた脈管内の凝固に寄与することになる。

撒き散らされた脈管内の凝固はグラム陰性菌感染だけ
に限られた合併症ではない。それはまた、グラム陽性
菌、カビ類およびウイルス性感染においても観察されて
来た。

グラム陰性菌の処置における抗生物質の限定された効
果に鑑みて、努力は抗体製剤を用いグラム陰性菌感染と
戦うことに傾けられて来た。研究は、ポリクローナル免
疫グロブリンが日和見の病院グラム陰性菌の罹病率、特
に免疫屈従（immunocompromised）患者におけるそれの
減少に関して有効であることを示して来た。ポリクロー
ナル免疫グロブリンは細菌生体を破壊するのには有効で
あるが、この種の製剤は敗血症ショックを処置するには
一般的に不満足であることが立証されて来た。

1988年10月12日に出願され、かつ本願と同一の譲受人
に対し譲渡された同時係属米国特許出願第257,445号
（特開平２−134329号公報に対応）は、グラム陰性菌血
症または内毒素ショックの予防または処置において使用
するための組成物を開示している。これらの組成物はヒ
トのポリクローナル免疫グロブリンであって、グラム陰
性菌の抗原に対抗する抗体を含むものと、モノクローナ
ル抗体であって、様々なグラム陰性菌のリポ多糖のリピ
ドＡ部分と共通であるエピトープに関して特異であるも
のとの組合せを含んで構成されるものである。前記出願
の開示はここに参考として引用するものとする。同時係
属出願中に記載される組成物は存在する細菌感染および
敗血症ショックの苛酷さを抑制し、あるいは減少させる
ために非常に有用であることが判明している。

Ｃ−蛋白質として知られる血漿蛋白質がグラム陰性菌
感染に対する防御に際して自然の過程に従った役割を果
たすことが示唆されて来た。テイラー他（Taylor et a
l.）の「J.Clin.Invest.」79、918−925（1987年）参
照。この論文の著者はエシェリヒア・コリの生きている
培地を注入した動物において、活性化されたＣ−蛋白質
の高い投薬量が有効な生体内坑凝固剤として機能し得る
こと、そしてその動物を細菌の致死的な影響から保護し
得ることを論証して来た。グラム陰性菌に対抗する蛋白
質がテイラー他によって示されたけれども、Ｃ−蛋白質
の非常に高い投薬量を必要として来た。更に、Ｃ−蛋白
質は存在する細菌感染に影響を及ぼすことはなく、単に
その感染に関連する敗血症障害にのみ作用するものであ
る。米国心臓協会（American Heart Association）の19
88年11月15日の第61回年次例会における最近の発表に際
して、テイラーは細菌関連の凝固障害を処置するための
Ｃ−蛋白質の投薬量を、それをＳ−蛋白質および組織因
子に対するモノクローナル抗体との組合せにおいて使用
することにより減少せしめる可能性のあることを示唆し
た。この種のアプローチの実現可能性は未だ確立されて
いない。

従って、グラフ陰性菌血症および敗血症ショックの処
置または予防のための組成物および方法であって、存在
する感染ならびに疾病を伴う広範囲におよぶ脈管内の凝
固の両者に対して有効なものに関するニーズが存在して
いる。

発明の要約 本発明によれば、グラム陰性菌血症および敗血症ショ
ックの処置または予防のための組成物は、単一の投薬形
態において、殺菌剤として有効量の、グラム陰性菌の抗
原に対する抗体を含有するヒトのポリクローナル免疫グ
ロブリンと、血餅溶解有効量の活性化合Ｃ−蛋白質とを
含んで構成される。詳細な実施態様において、この組成
物は更にモノクローナル抗体であって、様々なグラム陰
性菌のリポ多糖のリピドＡ部分と共通であるエピトープ
に関して特異であるものを含んで構成される。

更に、本発明はグラム陰性菌血症または敗血症ショッ
クの処置または予防のための方法中に存在し、これはグ
ラム陰性菌によって感染した患者に対し、殺菌剤として
有効量の、グラム陰性菌の抗原に対する抗体を含有する
ヒトのポリクローナル免疫グロブリンおよび血餅溶解有
効量の活性化Ｃ−蛋白質を投与することを含んで構成さ
れる。詳細な実施態様において、この方法は更にこの種
の患者に対し、モノクローナル抗体であって、様々なグ
ラム陰性菌のリポ多糖のリピドＡ部分と共通であるエピ
トープに関して特異であるものを投与することを含んで
構成される。

敗血症および現実の、もしくは切迫している敗血症シ
ョックは屡々、緊急状態として医師に対し提示される。
このような状況において、患者の生活状態および生存は
迅速な処置に左右される。従って、更に他の実施態様に
おいて、本発明は、たとえば緊急状況において医師によ
り使用されるための治療用キット中に存在する。この種
の治療用キットは、敗血症または敗血症ショックの処置
のための非経口的投与に適した形態および投与量におけ
るポリクローナル免疫グロブリンと活性化Ｃ−蛋白質の
別個の容器を有するパッケージを含んで構成される。好
ましい実施態様において、これらの容器はガラス瓶であ
り、それは再構成に適したポリクローナル免疫グロブリ
ンの滅菌し、凍結乾燥した製剤を含有している。

図面の簡単な説明 第１図は、グラム陰性菌の侵入によって開始される酵
素反応のカスケードであって、これは敗血症ショックに
関連する脈管内凝固の撒き散らしをもたらすものについ
ての該略図である。

発明の詳細な説明 本発明の組成物および方法は活性化Ｃ−蛋白質を用い
ている。血漿のビタミンＫ依存蛋白質であるＣ−蛋白質
は主要な生理学的重要性を有する蛋白質である。Ｃ−蛋
白質は他の蛋白質の協力して坑凝固剤として、また繊維
素溶解剤として両機能を果たす。

Ｃ−蛋白質の活性化形態の作用の機序および不活性チ
モーゲンの活性化機序は近年になって明らかになった。
検討のために、ジェー・イー・ガーディナーおよびジェ
ー・エッチ・グリフィン（J.E.Gardiner and J.H.Griff
in）の「血液学における進歩（Progress in Hematolog
y）」Vol.XIII、pp.265−278、エルマー・ビー・ブラウ
ン編集、グルン・アンド・ストラットン・インコーポレ
ーテッド（Grune and Stratton,Inc.）、1983年を参照
されたい。

活性化Ｃ−蛋白質は、活性化凝固補因子、V a因子お
よびVIII a因子を選択的に加水分解することによって強
力な坑凝固剤として機能する。活性化Ｃ−蛋白質は単に
これら凝固因子の不活性前駆体を最小限分解するに過ぎ
ない。

活性化Ｃ−蛋白質は迅速−作用組織プラスミノーゲン
活性化因子インヒビター（“PAI−1"）を中和すること
により繊維素溶解剤として機能するものと考えられる。
エンドトクセミア中には、報告によればPAI−１の増強
されたレベルが存在する。このようにして、外因的に投
与したＣ−蛋白質はプラスミノーゲン活性化因子の循環
レベルを増大させ、それによって繊維素溶解の速度を増
加させる。

本発明の組成物および方法は更にＣ−蛋白質補因子
を、そのＣ−蛋白質の活性を増加させるに足る量をもっ
て使用してもよい。活性化Ｃ−蛋白質のための重要な補
因子はＳ−蛋白質、他のビタミンＫ−依存血漿蛋白質で
ある。Ｓ−蛋白質はV aおよびVIII a因子について活性
化Ｃ−蛋白質を仲介した加水分解を実質的に増加させ
る。

カルシウムイオンもまた、Ｃ−蛋白質のための補因子
として必要である。適切なカルシウムイオン濃度は血漿
中に存在しているので、カルシウム塩を本発明の組成物
中に供給する必要はない。カルシウムイオンは活性化Ｃ
−蛋白質を安定させることが判明しており、従ってそれ
らは安定化量をもって該組成物中に含まれるのが好まし
い。

本明細書中で使用される場合、「Ｃ−蛋白質」および
「Ｓ−蛋白質」はその蛋白質の充分に発達した、活性化
形態のものならびにその生物学的に活性なフラグメン
ト、相似体および誘導体を包含することを意図するもの
である。これら酵素のチモーゲンをも使用してよいが、
それらは好ましいものではない。それはそれらを活性化
させる患者の能力についての有り得る減少の故である。
この種の蛋白質は天然に由来するものであっても、ある
いは組換え体DNA技法によって生成されるものであって
もよい。Ｃ−蛋白質活性を有する活性組換え体蛋白質の
例はバング他（Bang et al.）の米国特許第4,775,624号
中に記載されている。

本発明の組成物および方法はまた、ヒトのポリクロー
ナル免疫グロブリンであって、グラム陰性菌に対する抗
体を含むものを使用する。本発明の組成物および方法に
おいて有用なポリクローナル免疫グロブリンは精製Ig
G、IgM、IgAまたはその免疫グロブリンのクラスの組合
せを含んで構成することができる。IgG免疫グロブリン
が好ましい。通常または高レベルの特異ポリクローナル
抗体を含有するヒト血漿を使用することができる。抗体
を高レベルにすることは数種類の方法のうちの何れの一
方向によっても達成可能である。１種類以上の特異抗
原、たとえばシュードモナス・アエルギノーサ（P.aerg
inosa）に対する高力価の抗体を含有する血漿を得るた
めにドナーに免疫性を与えることができる。或いは、人
口の可成りの部分からの血漿は自然にグラム陰性菌に対
抗する高レベルの抗体を含有していることが知られてい
る。従って、ドナー血漿は関心のある１種類以上の抗原
に対する高力価の自然生成抗体ならびにこの種の高力価
血漿から抽出された免疫グロブリンに関して選別するこ
とが可能である。本発明の目的に関して、もし、これら
抗体の力価が、生体内試験により測定されたとき、通常
の血漿のそれよりも少なくとも５倍高ければ、血漿はグ
ラム陰性菌に対し「高力価」の抗体を含有するものと考
える。望ましくは、この種の血漿から調製された免疫グ
ロブリンが、通常の血漿プールにおける抗体レベルの10
倍を超えるグラム陰性菌に対する抗体の力価を有するこ
とである。

ポリクローナル免疫グロブリン濃縮物は、冷エタノー
ル沈殿、透析、イオン交換吸着および限外濾過による濃
縮を含む当該技術分野において知られる手順を利用する
ことによって血漿から得ることができる。別の手順であ
るが、これらに限定されないものには、ポリエチレング
リコール、ポリプロピレングリコール、無機塩類（たと
えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウム）を使用
する沈殿法、カルボキシメチル、ジエチルアミノエチル
または第四アミノエチル官能基を含有する媒質によるイ
オン交換吸着、免疫吸着、親和力吸着、等電沈殿、表面
吸着またはゲル濾過がある。

酸性pHにおけるインキュベーション、酸性pHにおける
微量のペプシンによるインキュベーション、ペプシンま
たはプラスミンによるインキュベーション、還元および
アルキル化、スルホン化、Ｂ−プロピオラクトンによる
処理またはヒドロキシエチル澱粉による処理によって生
成されたポリクローナル静脈管内免疫グロブリンもま
た、血漿誘導ポリクローナル免疫グロブリンであって、
これに対しハイブリドーマ誘導モノクローナル抗体が付
加されるものの供給源として使用することができる。或
いは、ポリクローナル免疫グロブリンはまた、ポリヒド
ロキシ化合物、たとえばマルトースまたはソルビトール
の存在あるいは不存在下で低pH（たとえば、3.5−5.5）
において配合してもよい。

次いで、このポリクローナル免疫グロブリン溶液は従
来の手順に従って滅菌することが可能である。次に、こ
の免疫グロブリンを安定化させ、そして液状または凍結
乾燥状態において貯蔵することができる。安定なポリク
ローナル免疫グロブリンは一般に約10mg/ml乃至約200mg
/mlの範囲におよぶ濃度を有しており、これらは筋肉
内、腹腔内および静脈内注射に適している。望ましくな
い副反応は、IgG凝集体、血管に作用する、または潜在
的な凝集物質、たとえばPKAまたはトロンビンによる汚
染物を除去すること、またはその他の非IgG蛋白質、た
とえばIgAおよびIgEの大幅な減少によって回避される。

本発明において使用可能であるポリクローナル免疫グ
ロブリン製剤は市販されている。この種製剤の一つは商
標「Gammagard^(R)IVIG」の下にカリフォルニア州、デュ
アートのバクスター・ヘルスケア・コーポレーション
（Baxter Healthcare Corp.）のハイランド・ラボラト
リーズ・ディヴィジョンにより販売されている。

本発明の組成物および方法は血餅溶解有効量のＣ−蛋
白質を使用している。この種の量は疾病の苛酷さ、患者
の凝血および繊維素溶解システムの状態ならびに（も
し、あるとすれば）それに対し外因性Ｃ−蛋白質補因子
が使用される範囲によって変化してもよい。一般に、患
者はＣ−蛋白質約300乃至約6000国際単位（“IU"）／体
重kg/日を受けることになる。好ましい投薬量範囲は約1
000乃至約3000 IU/kg/日である。Ｃ−蛋白質は非経口的
に、好ましくは静脈内、筋肉内または腹腔内注射によっ
て投与される。最も好ましいルートは静脈内注射であ
る。

本発明の組成物および方法は有効殺菌剤量のポリクロ
ーナル免疫グロブリンを用いている。この種の量は感染
の苛酷さおよびタイプ、使用される特定の免疫グロブリ
ン製造および補助治療、たとえば抗生物質投与が行われ
ているか否かによって変化する。一般に免疫グロブリン
約100乃至約500mg/体重kg/日、好ましくは約200乃至約4
00mg/体重kg/日が投与される。Ｃ−蛋白質と同様に、免
疫グロブリンもまた非経口的に、たとえば静脈内、筋肉
内または腹腔内注射によって投与される。投与の好まし
いルートは静脈内注射である。

Ｃ−蛋白質およびポリクローナル免疫グロブリンは別
々に、若しくは薬学的に受容可能な投薬形態における組
合せにおいて投与される。それらは滅菌した注射可能な
液体、場合により従来の薬剤上の賦形剤を含有して溶解
または懸濁させるのが好ましい。適切な注射可能キャリ
ヤーの例には生理学的に緩衝化させた等張食塩水、落花
生油等がある。この組成物は、たとえば注射用の滅菌食
塩水で再構成するために凍結乾燥した粉末状で薬局およ
び医師に供給すればよい。これらの凍結乾燥させた粉末
は安定剤、たとえばカルシウム塩およびヒト血清アルブ
ミンを含むのが有利である。適切なカルシウム塩には、
たとえば塩化カルシウムがあり、0.1mM乃至約10mMの範
囲におよぶ濃度をもって存在するのが望ましい。ヒト血
清アルブミンの望ましい濃度は一般に組成物の重量基準
で約0.1％乃至１％の範囲内にある。

本発明による組成物の単位投薬形態は滅菌した注射可
能薬剤的キャリヤー中にＣ−蛋白質約150乃至約3000 IU
/mlおよびポリクローナル免疫グロブリン約50乃至約150
mg/mlを一般に含有している。好ましい単位投薬形態は
滅菌した注射可能薬剤的キャリヤー中にＣ−蛋白質約30
0乃至約1500 IU/mlおよびポリクローナル免疫グロブリ
ン約75乃至約100mg/mlを含有している。

上で特に述べたように、本発明による組成物および方
法は、1988年10月12日に出願された同時係属米国特許出
願第257,445号（特開平２−134329号公報に対応）中に
記載されるように、LPS内毒素成分に対するモノクロー
ナル抗体を使用してもまた有利である。使用するのなら
ば、このモノクローナル抗体はＣ−蛋白質およびポリク
ローナル免疫グロブリンと別々に、または組み合わせて
投与すればよい。このモノクローナル抗体はポリクロー
ナル免疫グロブリンの殺菌剤効果に対し寄与するのに有
効である投薬量において投与するのが有利である。ポリ
クローナル免疫グロブリンの有効投薬量が変化した場
合、この投薬量は変化してよい。このモノクローナル抗
体投薬量は一般に約0.1mg乃至約3mg/患者体重kg/日、好
ましくは約0.25乃至1mg/kg/日の範囲に及んでいる。

注射可能薬学的組成物は一般にモノクローナル抗体約
0.25乃至約1mg/ml、好ましくは約0.5乃至約1mg/mlを含
んでいる。

本発明による組成物および方法はまた、有効量のＳ−
蛋白質を有利に含んでいてもよい。このＳ−蛋白質はＣ
−蛋白質と同じ方法において、別々にあるいはＣ−蛋白
質と組み合わせて投与される。Ｓ−蛋白質の有効投薬量
は変化するが、一般的に約0.1乃至約10mg/患者体重kg/
日の範囲に及んでいる。Ｓ−蛋白質の好ましい投薬量は
約１乃至約5mg/kg/日の範囲に及ぶ。

更に本発明において意図されているのは、たとえば緊
急事態において医師により使用されるための治療用キッ
トである。この種のキットは病院の薬局および迅速かつ
便利な使用のために救急室にストックされるとよい。一
般に、この種のキットは投薬形態および直接あるいは再
構成に関する非経口的投与のための適切な量において、
ポリクローナル免疫グロブリンおよびＣ−蛋白質の別個
の容器を含有するパッケージを含んで成っている。この
キットはまた、その使用に関する医師またはヘルスケア
の専門家に対するインストラクションをも含むことにな
る。好ましいのは、これらの容器がガラス瓶であって、
これらが滅菌した注射可能ビヒクル、たとえば通常の食
塩水により再構成されるための無菌凍結乾燥した粉末状
のポリクローナル免疫グロブリンおよびＣ−蛋白質を含
有していることである。再構成可能な、凍結乾燥状態の
蛋白質は一般に溶液より一層安定であり、従って都合の
良い貯蔵寿命を有している。このキットはまた、注射可
能なビヒクルを収容する別のガラス瓶を備えていてもよ
く、場合により更に適切なサイズの滅菌した針を含むも
のとする。これらのガラス瓶は各成分について少なくと
も１投薬量を含んでおり、そして好ましくは開封または
再構成後、製品の貯蔵寿命内に投与されるであろう以上
の投薬量を含まないものとする。

この種のキットは、たとえば静脈内免疫グロブリンに
ついて４本のガラス瓶（ガラス瓶ごとに2.5g）および活
性化Ｃ−蛋白質について１本のガラス瓶（100mg）を収
容することができる。IGIVは、適切な容量の希釈剤によ
って再構成される場合、塩化ナトリウム約１％、グルコ
ース20mg/ml未満、PEG 0.2g/dl未満および安定剤として
0.3のグリシンを含有している。活性化Ｃ−蛋白質は、
そのサンプルを注射用の適切なビヒクル、たとえば緩衝
液（りん酸塩類、塩化ナトリウム等）、等張剤、賦形剤
（たとえば、マンニトール、デキストラン等）、安定剤
（たとえば、アルブミン）と混合し、そしてこの混合物
を蒸留水中に溶解し、次いでこの溶液を凍結乾燥して組
成物を得て、これが注射用のガラス瓶内に充填されるこ
とによって、注射可能製剤中に配合することができる。
IGIVおよびAPCについて投与の主要ルートは静脈内の注
入によるが、これは注入バッグまたはボトル内に収容さ
れたそのぞれの非経口的溶液をもって行うことができ
る。これらの溶液は注入ポンプの使用によりＹ−接続部
を経由して患者に対し同時に送り出すことができる。本
実施態様において、IGIVの全投薬量は10gであって、200
mg/kgにおいて投与され、またAPCの投薬量は100mgで、2
mg/kgにおいて投与された。

本発明は、限定を意図するものではない下記の実施例
によって更に例示されるものとする。

実施例 １ 治療用混合物の調製 a.ヒトＣ−蛋白質の精製 Ｃ−蛋白質は、商標「Proplex」の下にカリフォルニ
ア州、デュアートのハイランド・ラボラトリーズから得
た市販のIX因子濃縮物から免疫アフィニティークロマト
グラフィーによって精製した。

各Ｃ−蛋白質製剤について、瓶10本の「Proplex」濃
縮物をそれぞれ0.02Mトリス5ml、pH7.4の0.15M塩化ナト
リウム（トリス−緩衝化食塩水）中に懸濁させた。この
懸濁液を、抗体濃度2mg乃至5mg/樹脂mlにおいて「Sepha
rose CL−4B」とカップルさせた（coupled）アンチＣ−
蛋白質モノクローナル12mlのカラムに適用した。流量30
ml/時間におけるサンプル適用の後、このカラムを６容
量のトリス緩衝化食塩水で洗浄した。Ｃ−蛋白質は引き
続いて、トリス−緩衝化食塩水中の3Mチオシアン酸カリ
ウムを使用してモノクローナル抗体カラムから溶離させ
た。

この方法で溶離されたＣ−蛋白質をトリス−緩衝化食
塩水に抗して徹底的に透析してチオシアン酸塩を除去
し、そして0.02％アジ化ナトリウムの存在下に＋５℃に
おいて貯蔵した。

b.C−蛋白質の活性化 Ｃ−蛋白質を二つの異なった方法の何れかにより活性
化した。

（ｉ）トロンビン活性化 上記のように免疫アフィニティにより調製されたＣ−
蛋白質をpH 8.0の0.05Mトリス/H₃PO₄に抗して透析し、
次いでトロンビン4mg/C−蛋白質100mgの割合においてヒ
トのトロンビンと混合した。この混合物を37゜で90分間
インキュベートし、次いで0.1M H₃PO₄を用いてそのpHを
6.5に調節した。次に、このサンプルをpH 6.5の0.5Mり
ん酸ナトリウム緩衝液で予め平衡化させた「Ｓ−Sephar
ose」のカラムに対し適用した。活性化Ｃ−蛋白質はこ
れらの条件下で樹脂と結合することはなく、そしてフロ
ー・スルー（flow−through）中で収集された。トロン
ビンはpH 6.5の0.3Mりん酸ナトリウム緩衝液の存在下で
溶離させることが出来た。

c.精製したＣ−蛋白質製剤のアッセイ 上記したように、「Proplex」濃縮物から精製したＣ
−蛋白質を二つの法法のそれぞれにおいて測定した。

（ｉ）クロモジェニック（Chromogenic）・アッセイ クロモジェニック・アッセイは本質的に文献（マルテ
ィノリ・ジェー・エルおよびケー・ストッカー（Martin
oli,J.L.,and K.Stocker）の「Thromb.Res.43:253［198
6年］、フランシス・アール・ビー・ジュニアおよびユ
ー・セイファート（Francis.R.B.,Jr.and U.Seyfert）
の「Am.J.Clin.Pathol.」87:619［1987年］）中に記載
されるように、Ｃ−蛋白質の活性化物質として「Prota
c」（Agkistrodon contortrix contortrixの毒液からの
特異かつ迅速なＣ−蛋白質活性化物質）を使用して行っ
た。このアッセイにおいて、適切に希釈したサンプル10
μを96個の個々の容器−貯蔵器microtiterプレート内
に配置した。次いで、「Protac」または通常の食塩水50
μを各容器に添加し、そしてこのプレートを室温で15
分間インキュベートした。この時点でpH 8.3のイミダゾ
ール／トリス緩衝液100μを各容器に添加し、そして
このプレートを更に５分間インキュベートした。次に、
濃度2mMにおける基質（Ｓ−2366）50μを各サンプル
に添加し、そしてそのプレートを室温において25分間放
置した。その最終工程は、この反応を50％（w/v）酢酸5
0μをもって停止させることを包含する。次いで、こ
のA₄₀₅−A₄₉₂を96個の貯蔵器microtiterプレート・リー
ダー内で測定し、そして未知のサンプル中のＣ−蛋白質
の濃度を、知られた標準Ｃ−蛋白質の吸光度と比較する
ことにより決定した。

（ii）免疫電気泳動 免疫精製した（immunopurified）製剤中のＣ−蛋白質
の濃度を更に、Ｃ−蛋白質抗原を測定するための免疫電
気泳動法を利用して測定した。これは基本的に刊行され
た文献中に記載されるように行った。グリフィン・ジェ
ー・エッチ他（Griffin,J.H.,et al.,）の「J.Clin.Inv
est.」68:1370（1981年）を参照されたい。

（iii）Ｃ−蛋白質活性化物質（PCA）の活性化 Ｃ−蛋白質活性化物質を文献中に記載されるように調
製した。オースナー・シー・エル他（Orthner,C.L.,et
al.）の「Thromb.Haemastas」58:アブストラクト＃1014
（1978年）。活性化に先立って、説明したように免疫ア
フィニティクロマトグラフィーにより単離されたＣ−蛋
白質を0.05Mトリス、pH 7.5の20mM塩化ナトリウムに抗
して透析した。次いで、この透析したプールを活性化物
質対Ｃ−蛋白質1:1000の比率をもってＣ−蛋白質と混合
した。

d.注射用活性化Ｃ−蛋白質の調製 活性化Ｃ−蛋白質の全てのプールを限外濾過を利用し
て約2mg/mlに濃縮し、そしてトリス緩衝化食塩水に抗し
て徹底的に透析した。次いで、各製剤をしてポリミキシ
ンのカラムを横切らせて発熱物質を除去した。活性化Ｃ
−蛋白質製剤の平均内毒素濃度は＞1EU/mlであった。

実施例 ２ 活性化Ｃ−蛋白質／ポリクローナル免疫グロブリン製剤
の効力についての生体内例証 使用した攻撃細菌はエシェリヒア・コリ（2735）菌株
であった。これはカリフォルニア州、デュアートのシテ
ィ・オブ・ホープ・ナショナル・メディカル・センター
からの臨床単離物（clinical isolate）である。

各10匹のCFW雌マウス３グループに対しエシェリヒア
・コリのコロニー生成単位１×10⁶、１×10⁷または１×
10⁸を含有する選択されたサンプルを静脈内注射した。
これらの投与量はLD₅₀の計算を容易とするために選択し
た。各マウスに対し約20gを計り分け、そして各マウス
は合計容量0.33mlを受けた。

これらの攻撃グループは下記の製剤を受けた。

1.トリス緩衝化食塩水中の１％ヒト血清アルブミン 2.1％HSA中ヒトトロンビン１μｇ 3.1％HSA中Ｃ−蛋白質活性物質（PCA）0.4μｇ 4.静脈内ポリクローナル免疫グロブリン（「Gammagard
^(R)」IVIG）15mg 5.「Gammagard」15mg＋トロンビン１μｇ 6.「Gammagard」15mg PCA 0.4μｇ 7.トロンビン−活性化Ｃ−蛋白質200μｇ 8.トロンビン−活性化Ｃ−蛋白質400μｇ 9.トロンビン−活性化Ｃ−蛋白質200μｇ＋「Gammagar
d」15mg 10.トロンビン−活性化Ｃ−蛋白質400μｇ＋「Gammagar
d」15mg 11.PCA−活性化Ｃ−蛋白質200μｇ 12.PCA−活性化Ｃ−蛋白質400μｇ 13.PCA−活性化Ｃ−蛋白質200μｇ＋「Gammagard」15mg 14.PCA−活性化Ｃ−蛋白質400μｇ＋「Gammagard」15mg ７日後、実験を終結した。これらのデータを多くの方
法において分析した。第一に、２×２分割表の組合せか
ら成る強化したカイ二乗試験を用いた。第二に、素量的
応答（quantal response）のアッセイに関するスペアー
マン−カーバー（Spearman−Karber）法を利用してLD₅₀
の検討を行った。

第１表に示すように、ヒトトロンビンによって活性化
されたＣ−蛋白質は生きたエシェリヒア・コリにより攻
撃されたマウスの生存を改良した。この特定の実験にお
いては、「Gammagard」ポリクローナル免疫グロブリン
製剤をポジティブ対照として使用し、そしてポリクロー
ナル免疫グロブリンと組み合わせた場合の活性化Ｃ−蛋
白質の効果は研究されなかった。

活性化Ｃ−蛋白質を静脈内免疫グロブリンと組み合わ
せた場合の別の実験においては、製剤を受けている生存
体の数は、活性化Ｃ−蛋白質またはポリクローナル免疫
グロブリン製剤のいずれかのみが投与された場合に生存
したマウスの数よりも多かった。更に、Ｃ−蛋白質がト
ロンビンか、あるいは蛇毒液から単離したＣ−蛋白質活
性化物質により活性化されたか否かによってＣ−蛋白質
の治療効果は明らかであった。

これらの結果は、細菌感染により引き起こされた敗血
症および／または敗血症ショックの処置において活性化
Ｃ−蛋白質とポリクローナル免疫グロブリンとの組合せ
の効果的であることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グリフィス、ミカエル ジェイ. アメリカ合衆国、91711 カリフォルニ ア州、クレモント、ウエスト バトラー コート 173 (72)発明者 アルペルン、メレイン アメリカ合衆国、90808 カリフォルニ ア州、ロングビーチ、ジュリアン アベ ニュー 3270 (56)参考文献 特開 昭61−69796（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−204200（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−72800（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−500035（ＪＰ，Ａ) 米国特許4587121（ＵＳ，Ａ) Ｊ．Ｃｈｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏ ｌ．79（1987），ｐ．918−925 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 39/00 - 39/44 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (20)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】単一の投薬形態で、殺菌剤有効量の、グラ
   ム陰性菌の抗原に対する抗体を含有するヒトのポリクロ
   ーナル免疫グロブリンおよび血餅溶解有効量の活性化Ｃ
   −蛋白質を含んで構成される、グラム陰性菌血症および
   敗血症ショックの処置または予防のための組成物。
2. 【請求項２】ポリクローナル免疫グロブリンが、グラム
   陰性菌の１種類以上の抗原に対する抗体の力価を、通常
   の血漿において見出される値の少なくとも５倍の範囲に
   おいて有している、請求項１記載の組成物。
3. 【請求項３】ポリクローナル免疫グロブリンが、グラム
   陰性菌の１種類以上の抗原に対する抗体の力価を、通常
   の血漿において見出される値の少なくとも10倍の範囲に
   おいて有している、請求項１記載の組成物。
4. 【請求項４】ポリクローナル免疫グロブリンが、グラム
   陰性菌抗原ワクチンをもってワクチン接種されたヒトド
   ナーから得られた血漿より単離される、請求項３記載の
   組成物。
5. 【請求項５】ポリクローナル免疫グロブリンが、少なく
   とも１種類のグラム陰性細菌に対し自然に抗体を有して
   いるヒトドナーから得られた血漿より単離される、請求
   項３記載の組成物。
6. 【請求項６】Ｃ−蛋白質が天然由来の活性化Ｃ−蛋白質
   である、請求項１記載の組成物。
7. 【請求項７】Ｃ−蛋白質が組換え体活性化Ｃ−蛋白質で
   ある、請求項１記載の組成物。
8. 【請求項８】ポリクローナル免疫グロブリンおよびＣ−
   蛋白質が、滅菌した注射可能液体中に溶解または懸濁さ
   れる、請求項１記載の組成物。
9. 【請求項９】ポリクローナル免疫グロブリンの濃度が50
   乃至150mg/mlであり、またＣ−蛋白質の濃度は150乃至3
   000IU/mlである請求項８記載の組成物。
10. 【請求項１０】ポリクローナル免疫グロブリンの濃度が
    75乃至100mg/mlであり、またＣ−蛋白質の濃度は300乃
    至1500IU/mlである請求項８記載の組成物。
11. 【請求項１１】更に、Ｃ−蛋白質の生物学的活性を増加
    させるに足る量でＳ−蛋白質を含んで構成される、請求
    項９記載の組成物。
12. 【請求項１２】Ｓ−蛋白質の濃度が0.1乃至10mg/mlであ
    る、請求項９記載の組成物。
13. 【請求項１３】Ｓ−蛋白質の濃度が1mg/ml乃至5mg/mlで
    ある、請求項９記載の組成物。
14. 【請求項１４】更に、殺菌剤有効量で、グラム陰性菌の
    リポ多糖のリピドＡ部分に対するモノクローナル抗体を
    含んで構成される、請求項９記載の組成物。
15. 【請求項１５】モノクローナル抗体の濃度が0.25乃至1m
    g/mlである、請求項14記載の組成物。
16. 【請求項１６】モノクローナル抗体の濃度が0.5乃至1mg
    /mlである、請求項14記載の組成物。
17. 【請求項１７】滅菌した、注射可能液体によって再構成
    するために、シールされた容器内で凍結乾燥状態にあ
    る、請求項１記載の組成物。
18. 【請求項１８】敗血症または敗血症ショックの処置のた
    めの非経口的投与に適した形態および投薬量のポリクロ
    ーナル免疫グロブリンと活性化Ｃ−蛋白質の別個の容器
    を有するパッケージを含んで構成される、治療用キッ
    ト。
19. 【請求項１９】これらの容器が、再構成に適したポリク
    ローナル免疫グロブリンの滅菌し、凍結乾燥した製剤を
    含有するガラス瓶である、請求項18記載の治療用キッ
    ト。
20. 【請求項２０】更に、製品使用のためのインストラクシ
    ョン、ならびに凍結乾燥したＣ−蛋白質およびポリクロ
    ーナル免疫グロブリンを再構成するための滅菌したビヒ
    クルの容器を含んで構成される、請求項19記載の治療用
    キット。