BR112019010981A2

BR112019010981A2 - composição de rmp e métodos de uso

Info

Publication number: BR112019010981A2
Application number: BR112019010981A
Authority: BR
Inventors: L Horstman Lawrence; Pamukcu Rifat; Jy Wenche; S Ahn Yeon
Original assignee: Rxmp Therapeutics Llc; Univ Miami
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2019-10-15
Also published as: RS63537B1; IL266957B; RU2768743C2; RU2019120008A; MX2019006354A; CN110799199A; KR20240049569A; RU2019120008A3; WO2018102409A2; EP3548092A4; CA3045144A1; HRP20220892T1; HUE059678T2; SI3548092T1; PL3548092T3; EP3548092B1; AU2017367084B2; IL266957A; ES2924134T3; JP2020508963A

Abstract

a revelação fornece uma composição que compreende micropartículas derivadas de glóbulos vermelhos (rmps) que demonstram características clinicamente vantajosas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPOSIÇÃO DE RMP E MÉTODOS DE USO”.

Referência Cruzada a Pedido Relacionado [1] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório n^Q U.S. 62/428.155, depositado em 30 de novembro de 2016, que é incorporado a este documento a título de referência em sua totalidade.

Campo Técnico da Invenção [2] A revelação é relacionada a uma composição que compreende micropartículas derivadas de glóbulos vermelhos (RMPs) e métodos de uso.

Antecedentes [3] O sangramento excessivo está dentre os mais comuns de complicações de risco de vida em trauma e complicações de sangramento. Transfusões sanguíneas são a base para tratar perda sanguínea excessiva. Terapias que têm como alvo as causas subjacentes de distúrbios de sangramento diferem dependendo da etiologia. A transfusão de plaquetas ou intervenções que elevam a contagem de plaquetas são empregadas para conter o sangramento devido às baixas contagens de plaquetas (trombocitopenia). No caso de distúrbios de coagulação, a substituição de fator sanguíneo é tipicamente administrada. Em hemofilia A, o Fator VIII é administrado a um indivíduo, enquanto a hemofilia B necessita de tratamento com Fator IX.

[4] Terapias existentes sofrem de desvantagens significativas. Por exemplo, o sangue doado para transfusões é se torna cada vez mais escasso e caro devido à crescente demanda, suprimento limitado, e mais regulamentos rígidos. De acordo com a Cruz Vermelha Americana, aproximadamente 36.000 unidades de glóbulos vermelhos são necessárias diariamente somente nos E.U.A. Consultar www.redcrossblood.orq/learn-about-blood/blood-facts-and-statistics· O

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2/23 custo hospitalar para efeitos adversos relacionados à transfusão excede $10 bilhões por ano. Hannon & Gjerde: The contemporary economics of transfusions. In Perioperative Transfusion Medicine; Speiss R D, Spence R K, Shander A (eds.), Lippincott Williams e Wilkins, p. 13 (2006). Transfusões também são associadas a muitas complicações de curto e longo prazo que incluem anafilase, reações hemolíticas, transfusão induzida por supressão imune, doença de enxerto versus hospedeiro, e lesão pulmonar aguda relacionada à transfusão (TRALI). MP de plaqueta (PMP) e plaquetas totais liofilizadas (LyoPLT) têm desvantagens tais como, por exemplo, alto custo, escassez de plaquetas, risco de trombogênese, e imunorreatividade. Plaquetas são altamente imunogênica devido a HLA, ABO, Rh, e antígenos específicos de plaqueta, que são impraticáveis para prova cruzada, portanto, reações adversas são frequentes. Ademais, plaquetas são conhecidas por transportar fator tissular (TF) que é trombogênico.

[5] Permanece uma necessidade na técnica para agentes que possam ser administrados de forma segura e imediata após a detecção de sangramento excessivo, e em custos razoáveis.

Sumário da Invenção [6] A revelação fornece uma composição que compreende micropartículas derivadas de glóbulos vermelhos (RMPs) que demonstram atividade de acetilcolinesterase (AchE) de menos do que 350 pmol/min/10⁶ partículas (por exemplo, menos do que 200 pmol /min/10⁶ partículas). Em vários aspectos, 20% a 50% das RMPs na composição exibem fosfatidilserina. Opcionalmente, a composição encurta o tempo para formação de coágulo inicial conforme medido por tromboelastografia (TEG) no sangue total e plasma, por exemplo, em pelo menos dois minutos. Também opcionalmente, o diâmetro médio das RMPs é cerca de 0,40 a 0,6 pm. É também fornecido um método para tratar sangramento excessivo no indivíduo, sendo que o método

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3/23 compreende administrar ao indivíduo a composição de RMP descrita no presente documento.

Descrição das Figuras [7] A Figura 1 é um gráfico de barra que compara atividade de acetilcolinesterase (AChE) (μΜ/min/W⁶ RMP; eixo geométrico y) expresso em RMP-1, RMP-2 e RMP-3 descritos nos Exemplos.

[8] A Figura 2 é um gráfico de barra que compara encurtamento de tempo de coagulação (minutos; eixo y) mediado por 5 μΜ (barra esquerda) ou 10 μΜ (barra direita) do RMP-1, RMP-2 e RMP-3 descritos nos Exemplos.

[9] A Figura 3 é um gráfico de barra que compara força de coágulo (Aumento de MA de TEG; eixo y) mediado por RMP-1, RMP-2 e RMP-3 descritos nos Exemplos.

[10] A Figura 4 é um gráfico de barra que compara a fibrinólise mediada por anti-tPA (aumento de TG de controle (mm/min); eixo y) induzido por RMP-1, RMP-2 e RMP-3 descritos nos Exemplos.

Descrição Detalhada da Invenção [11] São fornecidas no presente documento composições aprimoradas de micropartículas derivadas por glóbulos vermelhos (RMPs) e métodos de uso para reduzir o sangramento em um indivíduo. RMPs têm muitas vantagens como agentes hemostáticos, incluindo (porém, sem limitação) facilidade e economia de produção e imunogenidade mínima. Glóbulos vermelhos (RBCs) são o tipo mais abundante de células sanguíneas, garantindo uma fonte essencialmente ilimitada e econômica para produção de RMP. RMP têm uma vida de prateleira indefinida com armazenamento em temperatura ambiente e não exigem armazenamento em bancos de sangue, tornando as mesmas particularmente vantajosas para situações de emergência. Adicionalmente, RMP produzida de glóbulos vermelhos de tipo O Rh negativo (RMP universal) pode ser administrada imediatamente sem prova cruzada.

Petição 870190050149, de 29/05/2019, pág. 29/60 [12] A revelação é baseada, pelo menos em parte, na identificação surpreendente de uma subpopulação de RMPs com características que são particularmente vantajosas para aplicações terapêuticas. A subpopulação particular que exibe as características descritas no presente documento é inovadora e fornece vantagens técnicas através de populações anteriormente descritas de RMPs em termos de, por exemplo, eficácia e toxicidade reduzida. Produtos de degradação de RBC, incluindo RMPs, foram ligados a respostas pró-inflamatórias, toxicidade, e efeitos colaterais severos. Consultar, por exemplo, Danesh et al., Blood. 2014;123(5):687-696; e Zwicker et al., Br J Haematol. 2013; 160(4): 530-537. De fato, MP elevadas foram implicadas em uma variedade de afecções trombofílicas, tais como doença falciforme (Camus et al., Blood. 2012; 120(25):5050) e trombocitopenia trombótica (TTP) (Galli et al., Thromb Haemost 1996. 75(3):427-31), e implicadas em eventos tóxicos seguindo as transfusões sanguíneas (Donadee et al., Circulation 2011; 124:465-476). Composições de RMP anteriormente descritas tinham um risco de eventos adversos. De modo notável, a subpopulação de RMPs descritas no presente documento reduz de forma eficiente o sangramento enquanto minimiza significativamente a toxicidade e efeitos colaterais adversos.

[13] A revelação no presente documento descreve vários aspectos da subpopulação de RMPs fornecidas na composição. Composições que compreendem RMPs que exibem qualquer um, qualquer combinação, ou todas as características descritas no presente documento são contempladas e abrangidas pela invenção.

[14] Em um aspecto, a revelação fornece uma composição que compreende RMPs derivadas de glóbulos vermelhos que demonstram atividade de acetilcolinesterase (AchE) significativamente reduzidas. A redução em atividade de AchE se correlaciona com a toxicidade reduzida das RMPs in vivo. Em várias modalidades, as RMPs na composi

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5/23 ção demonstram uma atividade de AchE de menos do que 20.000 pmol/min/10⁶ partículas (por exemplo, entre 20.000 pmol/min/10⁶ partículas e 50 pmol/min/10⁶ partículas, em que 50 pmol/min/10⁶ partículas ou 25 pmol/min/10⁶ partículas é um limite inferior opcional para qualquer uma das faixas descritas no presente documento). Em modalidades preferenciais, as RMPs demonstram uma atividade de AchE de menos do que 10.000 pmol/min/10⁶ partículas, menos do que 5.000 pmol/min/10⁶ partículas, menos do que 2.500 pmol/min/10⁶ partículas, menos do que 1.000 pmol/min/10⁶ partículas, menos do que 500 pmol/min/10⁶ partículas, menos do que 350 pmol/min/10⁶ partículas, menos do que 250 pmol/min/10⁶ partículas, menos do que 200 pmol/min/10⁶ partículas, ou menos do que 150 pmol/min/10⁶ partículas. Em um aspecto exemplificador, as RMPs demonstram uma atividade de AchE de menos do que 350 pmol/min/10⁶ partículas. Métodos de detecção de atividade de AchE são conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Ellman et al., Biochemical Pharmacology 1961; 7(2):88-95; Xie et al., J. Biol. Chem. 2007; 282:11765-11775; Wolkmer et al., Experimental Parasitology 2014; 132(4):546-549) e descritos no Exemplo fornecido no presente documento.

[15] Alternativa ou adicionalmente, as RMPs compreendem um nível significativamente reduzido de balsas lipídicas ou componentes das mesmas em comparação a populações de RMP anteriormente descritas. Balsas lipídicas, também chamadas de “membranas resistentes a detergente” (DRM), são microdomínios de membrana ricos em colesterol e esfingolipídios. Essencialmente, todas as micropartículas derivadas de células naturais (MP) consistem principalmente em balsas lipídicas. De modo notável, a composição da presente revelação, em várias modalidades, compreende menos teor de balsa lipídica (que não é limitada a balsas lipídicas intactas, mas inclui componentes de balsas lipídicas) do que anteriormente alcançado. Meramente para

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6/23 conveniência de descrição desse aspecto da revelação, o teor de balsa lipídica das RMPs pode ser comparado ao teor de balsa lipídica dos glóbulos vermelhos totais (isto é, não-fragmentados). Em vários aspectos, o teor de balsa lipídica das RMPs da composição é 10% ou menos (por exemplo, 5% ou menos, 3% ou menos, 2% ou menos, 1% ou menos, 0.5% ou menos (tais como 0,1% ou 0,05%)) daquele do teor lipídico de glóbulos vermelhos totais. Embora não seja desejado se limitar a nenhuma teoria particular, AChE pode servir como medida provisória de balsas lipídicas, visto que a proteína é ancorada em membranas celulares por uma proteína de transmembrana PRiMA (âncora de membrana rica em prolina) e é integrada em microdomínios de balsa lipídica. Consultar, por exemplo, Xie et al., J. Biol. Chem. 2010; 285(15): 11537-11546, que também fornece materiais e métodos para determinar o teor de balsa lipídica em uma amostra biológica. Marcadores alternativos de balsa lipídica incluem, porém, sem limitação, estomatina, flotilina e cavéolas. Balsas lipídicas também podem ser caracterizadas com o uso de métodos de proteômica. Consultar, por exemplo, Foster e Chan, Subcell Biochem. 2007;43:35-47.

[16] Alternativa ou adicionalmente, 20% a 50% das RMPs na composição exibem fosfatidilserina. Por exemplo, opcionalmente, 30% a 45% das RMPs na composição exibem fosfatidilserina. Em relação a isso, a composição fornece uma subpopulação de RMPs com um nível ideal de atividade de fosfatidilserina para promover hemóstase (por exemplo, promover a coagulação, reduzir o sangramento) enquanto minimiza o potencial trombogênico. Fosfatidilserina pode ser medida em uma variedade de maneiras. Por exemplo, uma medida provisória de fosfatidilserina inclui detectar ligação de Anexina V por meio de citometria de fluxo. Consultar, por exemplo, Koopman et al., Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood 1994; 84(5):1415-20. Em um méto-

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7/23 do exemplificador, a razão de ligação de Anexina V+ à CD235a+ (um marcador geral de RMPs) é determinada. Em vários aspectos, a razão de AnV+/CD235a+ é 0,2 a 0,5, tais como 0,3 a 0,4.

[17] Opcionalmente, a densidade interna das RMPs da composição é menos do que 3,5% da densidade interna de glóbulos vermelhos intactos. Em alguns aspectos, as RMPs têm uma densidade interna de cerca de 0,1% a 3,5% (por exemplo, cerca de 0,5% a 3%, cerca de 0,5% a 2,5%, ou cerca de 1% a 2%) da densidade interna de glóbulos vermelhos totais. A densidade interna de RMPs pode ser determinada com o uso de uma variedade de técnicas que inclui, porém, sem limitação, sinal de dispersão lateral de citometria de fluxo, conforme descrito no presente documento. Embora não seja desejado se limitar a nenhuma teoria particular, acredita-se que a densidade interna reduzida seja associada ao teor reduzido de hemoglobina. Hemoglobina livre pode ser tóxica in vivo, causando, por exemplo, insuficiência renal. Consultar, por exemplo, Gladwin et al., J Clin Invest. 2012;122(4):1205-1208. As RMPs da composição da revelação demonstram toxicidade reduzida.

[18] Em várias modalidades, a composição encurta o tempo para a formação de coágulo inicial conforme medido por tromboelastografia (TEG) no sangue total e plasma. Em relação a isso, a composição opcionalmente encurta o tempo para formação de coágulo inicial, conforme medido por tromboelastografia, em pelo menos dois minutos (por exemplo, em pelo menos três minutos ou em pelo menos quatro minutos). Em várias modalidades, a composição encurta o tempo para a formação de coágulo inicial conforme medido por tromboelastografia (TEG) no sangue total e plasma em cerca de dois a cerca de cinco minutos. De fato, em várias modalidades, a composição restaura a coagulação normal, conforme indicado por tempo de coagulação mais curto, formação de coágulo mais rápida, ou desenvolvimento de coágulo

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8/23 mais estável, conforme medido por TEG ou tromboelastometria rotational (ROTEM) no sangue total e plasma.

[19] Alternativa ou adicionalmente, as RMPs na composição exibem um diâmetro médio de cerca de 0,40 a 0,70 pm, tais como cerca de 0,40 a 0,60 pm ou cerca de 0,40 a 0,50 pm. Opcionalmente, o diâmetro médio das RMPs é cerca de 0,45 a 0,50 pm. O tamanho de RMP pode ser determinado com o uso de qualquer de uma variedade de técnicas laboratoriais de rotina, incluindo os métodos descritos no Exemplo.

[20] RMPs são produtos de degradação de RBCs. As RMPs podem ser produzidas de RBCs recentes (isto é, RBCs isolados de amostras sanguíneas dentro de 24 horas de produção de RMP) ou RBCs armazenados. Em relação a isso, os RBCs são opcionalmente congelados antes da produção das RMPs. Por exemplo, em vários aspectos, os RBCs foram congelados por até um mês, até dois meses, até três meses, até quatro meses, ou por mais tempo. RMPs podem ser gerados com o uso de qualquer dentre várias técnicas para interromper membranas de glóbulo vermelho, incluindo sonicação, centrifugação, aquecimento, e tratamento com ionóforos. Em várias modalidades, as RMPs são produzidas forçando-se glóbulos vermelhos através de uma abertura para produzir glóbulos vermelhos rompidos, e fragmentar adicionalmente os glóbulos vermelhos rompidos por bombardeamento em uma superfície sólida. O estresse por cisalhamento criado forçando-se os RBCs através de uma abertura em uma pressão de, por exemplo, pelo menos 172,368 Mpa (25.000 psi) (tais como uma pressão de cerca de 241,316 Mpa (35.000 psi)) cisalhamento dos RBCs, e a etapa de bombardeamento subsequente fragmenta também os RBCs para produzir uma população de RMPs com a característica (ou características) descrita no presente documento. A RMP na composição pode ser recente (isto é, preparadas a partir de RBCs dentro

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9/23 de 24 horas de administração a um indivíduo) ou armazenadas. Visto que RMPs estenderam a vida de prateleira, a composição pode ser armazenada por períodos estendidos de tempo. RMP produzidas a partir de sangue vencido são tão eficazes quanto RMP de sangue muito recente; desse modo, a revelação fornece um meio para utilizar doações de sangue que podem ser de outro modo inadequadas para uso clínico.

[21] É também fornecido um método para tratar sangramento excessivo no indivíduo. O método compreende administrar no indivíduo a composição que compreende RMPs descritas no presente documento. Por exemplo, o método compreende administrar uma composição que compreende RMPs que demonstram atividade de acetilcolinaesterase (AchE) de menos do que 350 pmol/min/10⁶ partículas e/ou que tem diâmetro médio de cerca de 0,40 a 0,6 pm e/ou em que 20% a 50% das RMPs na composição exibem fosfatidilserina e/ou em que a composição encurta o tempo para a formação de coágulo inicial conforme medido por tromboelastografia (TEG) no sangue total e plasma (por exemplo, em pelo menos dois minutos).

[22] Conforme usado no presente documento, tratar e tratamento se refere a qualquer redução de sangramento em um indivíduo. Tratar e tratamento inclui medidas terapêuticas e profiláticas. Um elemento de habilidade comum na técnica verificará que qualquer grau de proteção de, ou melhoramento de sangramento excessivo é benéfico a um indivíduo, tal como um paciente humano. Consequentemente, o método em um aspecto é realizado o mais rápido possível depois que foi determinado que um indivíduo está em risco de perda de sangue anormal (por exemplo, antes da cirurgia em um indivíduo que sofre de ou está em risco de sofrer de um distúrbio de coagulação ou plaqueta) ou o mais rápido possível depois que um episódio de sangramento ocorre.

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10/23 [23] O sangramento excessivo pode ser causado por uma variedade de distúrbios ou afecções, e pode ser congênito ou adquirido (por exemplo, comandado por outros agentes terapêuticos). O indivíduo pode sofrer de (isto é, o sangramento excessivo é causado por), por exemplo, um distúrbio de plaqueta ou um distúrbio de coagulação. Distúrbios de coagulação incluem sangramento distúrbios causados por atividade de fator de coagulação sanguínea deficiente. Fatores de coagulação sanguínea incluem, porém, sem limitação, Fator V (FV), FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXIII, Fll (responsável por hipoprotrombinemia), e fator de von Willebrand. O indivíduo pode sofrer de doença hepática crônica. Distúrbios de plaqueta são causados em função de plaqueta deficiente ou número de plaquetas anormalmente baixo em circulação. A baixa contagem de plaquetas pode ser devido a, por exemplo, subprodução, sequestro de plaquetas, ou destruição patente descontrolada. A trombocitopenia (deficiências de plaqueta) pode estar presente por várias razões, incluindo quimioterapia e outra terapia de fármaco, terapia de radiação, cirurgia, perda sanguínea acidental, e outras afecções de doença. Por exemplo, a trombocitopenia é opcionalmente associada à falência de medula óssea, anemia aplástica, síndrome mielodisplástica, ou leucemia. Distúrbios de plaqueta também incluem, porém, sem limitação, Doença de Von Willebrand, disfunção de plaqueta paraneoplástica, trombastenia de Glanzman, e doença de Bernard-Soulier. Sangramento excessivo também pode ser causado por afecções hemorrágicas induzidas por trauma; uma deficiência em um ou mais fatores de contato, tais como FXI, FXII, précalicreína, e cininogênio de alto peso molecular (HMWK); deficiência de vitamina k; um distúrbio de fibrinogênio, incluindo afibrinogenemia, hipofibrinogenemia e disfibrinogenemia; e deficiência de alfa2antiplasmina. Em várias modalidades, o sangramento excessivo é causado por cirurgia, trauma, hemorragia intracerebral, doença hepáti

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11/23 ca, doença renal, trombocitopenia, disfunção de plaqueta, hematomas, hemorragia interna, hemartroses, hipotermia, menstruação, gravidez, e febre hemorrágica de Dengue.

[24] Opcionalmente, o sangramento excessivo é causado por tratamento com fármaco. Por exemplo, em várias modalidades, o sangramento excessivo é causado por um anticoagulante, tal como diluentes de sangue tais como Coumadin (varfarina, que é também um antagonista de vitamina K), heparina (por exemplo, heparina de baixo peso molecular, tal como enoxaparina ou dalteparina), um inibidor de complexo de protrombinase (por exemplo, fondaparinux ou rivaroxabana), um inibidor de FXa (por exemplo, apixaban (Eliquis)), ou um inibidor de trombina (por exemplo, dabigatrana). O sangramento excessivo também pode ser causado por aspirina (que inibe a função de plaqueta e pode resultar em sangramento sério, especialmente em combinação com outros distúrbios ou medicações), clopidogrel (PLAVIX) e similares. Esses anticoagulantes não têm antídotos, e complicações hemorrágicas decorrente desses anticoagulantes são perigosos aos pacientes. A composição da revelação é eficaz em tratar e/ou evitar o sangramento excessivo nesses contextos.

[25] Em várias modalidades, o indivíduo passa por terapia com um diluente sanguíneo (ou diluente sanguíneo tratamento foi descontinuado dentro de um período de tempo de modo que os efeitos biológicos do diluente sanguíneo permaneçam). Uma vantagem da composição da invenção é que RMPs da presente composição corrigem defeitos hemostáticos induzidos por diluentes de sangue, mesmo quando diluentes de sangue estão presentes. A composição da revelação demonstra atividade hemostática universal e, sendo assim, é adequada para tratar sangramento em pacientes que sofrem de múltiplos defeitos hemostáticos.

[26] A composição (por exemplo, composição farmacêutica) é

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12/23 formulada com um carreador, tampão, excipiente ou diluente fisiologicamente aceitável (isto é, farmacologicamente aceitável). O carreador particular empregado é limitado somente por considerações quimiofísicas, tais como solubilidade e falta de reatividade com as RMPs, e pela via de administração. Carreadores fisiologicamente aceitáveis são conhecidos na técnica. Formas farmacêuticas ilustrativas adequadas para uso injetável incluem, sem limitação, soluções ou dispersões aquosas estéreis. Formulações injetáveis são adicionalmente descritas, por exemplo, em Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Filadélfia. Pa., Banker e Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982), e ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4^Q Ed., páginas 622630 (1986)). Uma composição farmacêutica que compreende RMPs fornecidos no presente documento é opcionalmente colocada dentro de recipientes, junto com material de empacotamento que fornece instruções relacionadas ao uso de tais composições farmacêuticas. Em geral, tais instruções incluem uma expressão tangível que descreve a concentração reagente, assim como, em determinadas modalidades, quantidades relativas de ingredientes excipientes ou diluentes que podem ser necessários para diluir a composição farmacêutica.

[27] Se for desejado, a composição compreende um ou mais agentes farmaceuticamente eficazes adicionais. Alternativa ou adicionalmente, a composição é fornecida como um regime terapêutico que inclui administração de outros agentes farmaceuticamente eficazes (simultaneamente ou separados por tempo). A composição pode ser administrada em combinação com outras substâncias e/ou outras modalidades terapêuticas para alcançar um efeito biológico adicional ou aumentado. Cotratamentos incluem, porém, sem limitação, fatores de coagulação derivados de plasma ou recombinantes, tratamentos de profilase de hemofilia, imunossupressores, antagonistas de anticorpo inibidores de fator de plasma (isto é, anti-inibidores), antifibrinolíticos,

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13/23 antibióticos, terapia hormonal, agentes anti-inflamatórios (por exemplo, Fármacos Anti-inflamatórios não Esteroidais (NSAIDs) ou substâncias anti-inflamatórios esteroidais), pró-coagulantes, diluente sanguíneo, e aliviadores de dor. Em um aspecto, a administração da composição permite uma redução na dose de coterapêuticos necessários para alcançar uma resposta biológica desejada.

[28] A invenção desse modo inclui administrar a um indivíduo a composição da revelação em combinação com um ou mais substâncias adicionalmente adequadas, sendo cada uma administrada de acordo com um regime adequado para esse medicamento. Estratégias de administração incluem administração simultânea (isto é, administração substancialmente simultânea) e administração não simultânea (isto é, administração em tempos diferentes, em qualquer ordem, seja em sobreposição ou não) da composição de RMP e um ou mais adicionalmente agentes adequados. Será verificado que diferentes componentes são opcionalmente administrados nas mesmas composições ou em composições separadas, e pelas mesmas vias ou por vias diferentes de administração.

[29] Um regime de administração particular para um indivíduo particular dependerá, em parte, da quantidade de composição administrada, a via de administração, da aflição particular que é tratada, considerações relevantes ao recipiente, e a causa e a extensão de quaisquer efeitos colaterais. A quantidade de composição administrada a um indivíduo(por exemplo, um mamífero, tal como um humano) e as condições de administração (por exemplo, momento de administração, via de administração, regime de dosagem) são suficientes para afetar a resposta biológica desejada por um quadro de tempo razoável. Puramente a título de ilustração, em um aspecto, o método compreende administrar, por exemplo, de cerca de 1x10¹⁰ RMPs/kg a cerca de 3x10¹¹ RMPs/kg a um indivíduo (por exemplo, cerca de 5x10¹⁰

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RMPs/kg a cerca de 2x10¹¹ RMPs/kg).

[30] O método compreende, em vários aspectos, administração da composição para tratar uma condição aguda (por exemplo, sangramento causado por cirurgia ou trauma) para um período de tratamento relativamente curto, por exemplo, um a 14 dias. É também contemplado que a composição pode ser administrada por um curso de tratamento mais longo (por exemplo, durando semanas ou meses) caso a natureza da afecção do paciente necessite de tratamento prolongado. O método em várias modalidades compreende múltiplas administrações de composição a um indivíduo (por exemplo, uma vez ao dia, duas vezes ao dia, três vezes por dia, quatro vezes por dia ou mais).

[31] Métodos adequados de administração de uma composição fisiologicamente aceitável, tal como uma composição que compreende RMPs conforme descrito no presente documento, são conhecidos na técnica. Embora mais do que uma via possa ser usada para administrar uma composição, uma via particular pode fornecer uma reação mais imediata e mais eficaz do que outra via. Em um aspecto, a composição da revelação é administrada de modo intravenoso, intraarterial, ou intraperitoneal para introduzir RMPs em circulação. A administração não intravenosa também é apropriada, particularmente em relação a terapêuticos de baixo peso molecular. Em determinadas circunstâncias, é desejável entregar uma composição farmacêutica que compreende RMPs conforme descrito no presente documento por via vaginal, retal, pulmonar; através de injeção por meio intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intra-ocular, intraportal, intralesional, intramedular, intratecal, intraventricular, transdermal, subcutânea, intranasal, uretral ou enteral; por sistemas de liberação prolongada; ou por dispositivos de implantação. Se for desejado, a composição é administrada regionalmente por meio de intra-arterial

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15/23 ou administração intravenosa que alimenta uma região de interesse, por exemplo, por meio da artéria femoral para entrega à perna. Onde um dispositivo de implantação for usado, o dispositivo em um aspecto é implantado em qualquer tecido adequado, e entrega da composição se dá em vários aspectos por meio de difusão, bolo de liberação temporizada, ou administração contínua. Em outros aspectos, a composição é administrada diretamente a tecido exposto durante procedimentos cirúrgicos ou tratamento de lesões, ou é administrada por meio de transfusão de procedimentos sanguíneos.

[32] Em vista do supracitado, a invenção fornece a composição descrita no presente documento para uso em um método para o tratamento de um indivíduo, tais como um método para o tratamento de um distúrbio em que RMPs são benéficos. Em um aspecto, a revelação fornece a composição descrita no presente documento para uso em tratar sangramento excessivo ou perda de sangue em um indivíduo em necessidade da mesma. O método compreende administrar ao indivíduo a composição da invenção em uma quantidade e sob condições eficazes para tratar ou prevenir, no todo ou em parte, perda de sangue excessiva. A invenção fornece adicionalmente RMPs que têm uma ou mais (ou todas) das características descritas no presente documento para uso na fabricação de um medicamento. Por exemplo, as RMPs podem ser usadas na fabricação de um medicamento (por exemplo, uma composição) para o tratamento de sangramento excessivo ou perda de sangue em um indivíduo em necessidade do mesmo. Exemplos [33] Micropartículas derivadas de célula (MP), são pequena vesícula (<1um) liberada em ativação celular ou apoptose. Dependendo do estímulo, MPs podem ser heterogêneas em fenótipo e atividades funcionais, tais como hemostática vs. trombogênica vs. próinflamatória. Nesse estudo, três populações de RMPs foram produzi

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16/23 das, que exibiram diferentes combinações de características estruturais e funcionais. Características estudadas incluem PCA (proxy de atividade hemostática), atividade de acetilcolinaesterase (AchE) e toxicidade.

[34] Uma subpopulação de RMPs foi identificada que demonstrou características particularmente vantajosas ligadas à eficácia aprimorada e toxicidade reduzida que afligem outras composições de RMP.

[35] Uma população de RMPs foi produzida forçando-se RBCs através de uma abertura (241,316 Mpa (35.000 psi)) três vezes (com o uso de Disruptor de Célula de Sistema Constante) para produzir glóbulos vermelhos rompidos, e também fragmentar os glóbulos vermelhos rompidos por bombardeamento em uma superfície sólida (RMP-1). As RMPs resultantes foram lavadas e coletadas por centrifugação. Uma segunda população de RMPs foi produzida por tratamento com ionóforo de cálcio de RBCs (RMP-2). Sobrenadantes de RBC recente expostos a Ca2+/ionóforo (A23187) (10 μΜ) por 30 minutos foram centrifugados para coletar RMPs. Uma terceira população foi liberada de células empacotadas (PC) seguindo armazenamento até 42 dias (RMP-3); RBCs foram tomados de PC armazenados em intervalos até 42 dias (armazenados em 4°C), então centrifugados para recuperar RMP.

[36] As contagens citométricas de fluxo foram por CD235a (glicoforina A) e ligação de anexina V (AnV). A marcação de CD235a de RMP foi realizada pela adição de 20 μΙ de amostra de RMP a 4 μΙ de mAb marcado com fluorescência e incubação por 20 min em temperatura ambiente com agitamento orbital. As misturas foram então diluídas com 1.000 μΙ de HEPES frio/salino (pH 7,4), e mantidas em gelo até que estivesse pronto para citometria de fluxo. Para anexina V marcadora, 20 μΙ de amostra de RMP foi incubada com 3 μΙ de 0,2 M de solução de CaCE mais 2 μΙ de anexina V-FITC (10 pg/ml) por 20 min,

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17/23 então 500 μΙ de HEPES/salino, então processada conforme acima. As amostras então foram avaliadas para MP em um citômetro de fluxo Beckman Coulter FC-500, calibradas por microesferas Megamix para definir tensão de amplificação apropriada para FS, SS, FL1, e FL2 e comutação adequada para MP. O tempo de execução foi de 30 segundos e a taxa de fluxo foi calibrada conforme anteriormente descrito (Jy et al., Thromb Haemost. 2013;110(4):751-60). A contagem de evento foi disparada por sinal fluorescente (FL1 ou FL2) em vez de por difusão para frente (FS), gerando eficiência de detecção aprimorada. A porta de MP foi definida para o tamanho <1 um. Ligação não específica de mAb foi avaliada por IgG isotípico marcado com fluorescência.

[37] Testes funcionais incluíram Tromboeslastografia (TEG); contagens iguais de cada tipo de amostra foram comparadas, com base em CD235a, e diluídos conforme necessário com plasma agrupado livre de partícula (PFP). TEG mede o desenvolvimento de coagulação monitorando-se o torque crescente transmitido a um pino central imerso no copo de amostra; o copo oscila periodicamente através de +/4,5°. Parâmetros registrados para o presente estudo foram: R (atraso para formação de fibrina), MA (amplitude máxima, que reflete a função de plaqueta), e TTG (geração de tromba total). Para cada teste, 330 pL de PFP foram misturados com 5 ou 10 μΙ de RMP (2 x 10⁹ partículas/ml) por 5 min, então 20 μΙ de cálcio (100 mM) foi adicionado para iniciar a coagulação.

[38] A atividade de acetilcolinaesterase (AchE), um marcador nas balsas lipídicas de membrana de plasma de glóbulo vermelho, foi avaliada por um método colorimétrico (uma versão adaptada de ensaio de AChe de Ellman). A RMP foi diluída com o uso de tampão de fosfato (pH 7,5, 0,1 M). 10,6 μΙ de 0,01 M de DTNB e 10,6 μΙ de 12,5 mM de iodeto de acetilticocolina foi adicionada e misturada com 150 μΙ da RMP diluída. As amostras foram lidas em 405 nm em intervalos de 1

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18/23 min, 3 min e 6 min.

[39] A toxicidade de RMP foi avaliada em coelhos Brancos Machos da Nova Zelândia (meio 3,8 kg) e ratos Sprague Dawley machos (meio 280 g). Todos foram anestesiados com 2% de isoflurano. A artéria femoral e veia foram canuladas, e salino de manutenção foi administrado a 3 ml/h. As amostras de RMP foram infundidas por meio de veia femoral canulada, e o sangue foi coletado por meio de artéria femoral canulada em intervalos de tempo diferentes. Sinais vitais incluem pressão sanguínea, taxa cardíaca, taxa respiratória, níveis de O2 e CO2 no sangue foram continuamente monitorados. Alguns animais foram sacrificados 4 horas após a injeção de RMP para obter os órgãos principais para examinação patológica. Alguns animais foram suturados e retornados à instalação de cuidado com os animais para acompanhamento a longo prazo. Seu comportamento, mobilidade, entrada de alimento e água, temperatura corporal, etc. foram monitoradas diariamente na primeira semana, então semanalmente pelas 5 semanas restantes.

[40] RMP-1 foi associado ao maior rendimento de produto terapêutico, seguido por RMP-2, que produziu cerca de 3X mais produto terapêutico do que RMP-3.

[41] A ligação de AnV foi expressa como razão AnV+/CD235+, e é um marcador de fosfolipídio pró-coagulante. Essa razão foi menor em RMP-1 (0,28), seguida por RMP-2 (0,48) e RMP-3 (0,98).

[42] O tamanho (diâmetro médio) de RMP detectado por difusão para frente (FS) foi 0,57 pm em RMP-3. O valor foi de certa forma, maior do que RMP-1 (0,42 pm) e RMP-2 (0,45 pm). A porcentagem de densidade interna de RMP para RBC medido por difusão lateral foi a menor em RMP-1 (1,5%), seguida por RMP-2 (4,8%) e RMP-3 (10,3%).

[43] A atividade de acetilcolinesterase (AChE) foi de longe a

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19/23 maior em RMP-3 (15,643 pmoles /min, por 10⁶ partículas) versus 3,362 pmoles/min, por 10⁶ partículas para RMP-2, e 149 pmoles/min, por 10⁶partículas para RMP-3. Apresentando os dados de modo alternativo, a atividade de AChE foi a menor em RMP-1 (149 pmoles/min, por 10⁶partículas), que é 22 e 104 vezes menor do que a de RMP-2 (3,362 pmoles/min, por 10⁶ partículas) e RMP-3 (15,643 pmoles /min, por 10⁶partículas), respectivamente.

[44] A atividade de pró-coagulante foi estimada com o uso de TEG. O tempo de coagulação (tempo R) mostrou o maior encurtamento com RMP-3 (10,2 min), seguido por RMP-2 (6,7 min), e RMP-1 (3,6 min).

[45] A atividade antifibrinolítica foi testada na presença de 0,4 pg/ml de ativador de plasminógeno de tecido (tPA). Todas as três espécies de RMP inibiram de modo eficaz a fibrinólise mediada por t-PA medida por parâmetros de TEG, incluindo MA, Ly30 e TTG (formação de trombo total). RMP-3 foi o mais eficaz seguido por RMP-2, e RMP-

1.

[46] A administração de RMP-1 para coelhos e ratos em dosagens de 1x10¹⁰ a 1,2x10¹² RMP/kg não causou nenhum evento adverso dentro de seis semanas de observação pós-administração. Sinais vitais incluindo taxa cardíaca, pressão sanguínea, taxa respiratória, sangue níveis de oxigênio e temperatura corporal permaneceram normais durante uma hora após infusão de RMP. O acompanhamento a longo prazo (6 semanas) mostrou comportamento normal, apetite e mobilidade. Na dosagem mais alta (1,2x10¹² RMP/kg), todos os ratos testados permaneceram vivos e ganhando peso durante e ao fim do período de observação de seis semanas. Nessas dosagens, o tempo de sangramento foi substancialmente encurtado e a perda total de sangue foi reduzida, em três modelos de sangramento de animal diferentes.

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20/23 [47] Um resumo das características das várias subpopulações de RMP descritas no presente documento são apresentadas na Tabela 1. A primeira fileira é o rendimento de RMP por ml de PC. A segunda fileira é a razão entre a contagem de RMP detectada por antiglicoforina (CD235a) e a contagem de RMP detectada por ligação de Anexina V no citômetro de fluxo. A terceira fileira é o tamanho das RMP, calculados a partir de difusões para frente do ensaio citométrico de fluxo calibrado com três diferentes tamanhos de microesferas. A última fileira é a porcentagem de densidade interior das RMP ao RBC, calculada a partir das difusões laterais (SS) do ensaio citométrico de fluxo. Todos os valores são Mean±SEM.

Tabela 1: Propriedades de Populações de RMP

Características	RMP-1 (n=10)	RMP-2 (n=2)	RMP-3 (Semana 6) (n=10)	valor p
Rendimento (x10⁷RMP/ml RBC)	1525±64	325±15	4,4±0,6	1 vs. 2: 0,014 1 vs. 3: <0,001 2 vs. 3: 0,030
Razão (Anexina V⁺MP:CD235a⁺ MP)	0,28±0,03	0,48±0,05	0,99±0,02 (n=20)	1 vs. 2: 0,0016 1 vs. 3: <0,001 2 vs. 3: <0,001
Diâmetro Médio (pm)	0,42±0,009	0,45±0,003	0,57±0,001	1 vs. 2: NS 1 vs. 3: <0,001 2 vs. 3: <0,001
% de Densidade Interior a RBC	1,5±0,07	4,8±0,03	10,3±0,52	1 vs. 2: <0,001 1 vs. 3: <0,001 2 vs. 3: 0,039

[48] Os resultados no presente documento demonstram as vantagens de um tipo exclusivo de RMP caracterizado no presente documento. Esse tipo de RMP exibe características de superfície distintivas e atividades funcionais. Os resultados demonstram diferenças claras e decisivas em propriedades funcionais, fenotípicas, e toxicológicas das três espécies comparadas. RMP-2 e RMP-3 são maiores em tamanho, maiores em ligação de AnnV, e expressão de AChE comparados a

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RMP-1. RMP-2 e RMP-3 demonstraram maior atividade de prócoagulante do que RMP-1, mas RMP-1 demonstrou atividade de prócoagulante; atividade de RMP-2 e RMP-3 foram maiores em relação a isso. RMP-1 foram associados a números maiores de produto terapêutico gerados por ml de RBC empacotado.

[49] De todos os parâmetros comparados, a diferença mais notória entre essas três espécies de RMP é a atividade de AchE. A atividade de AchE DE RMP-1 é cerca de 25 e 150 vezes menor do que a de RMP-2 e RMP-3, respectivamente. Acredita-se que AchE seja ligado de modo covalente às balsas lipídicas e, sendo assim, serve como um marcador substituto de balsas lipídicas. Com base nos dados de AchE, RMP-3 são praticamente desprovidos de balsas lipídicas, que são compostos de muitos mediadores de pró-inflamatória, tais como adesinas e ligantes para ativação celular, lipídios pró-inflamatórios e citocinas, complementos, complexos imunes etc.

[50] Antes da revelação, acredita-se que a eficácia hemostática e toxicidade foram ligadas de modo inseparável. Os resultados descritos acima demonstram que o tipo exclusivo de RMP identificado no presente documento, de modos surpreendente, demonstram nenhuma toxicidade discernível, ainda retêm eficácia hemostática robusta.

[51] As características de RMP produzida de RBCs anteriormente congelados também foram exploradas. Leuco-reduzidos, RBCs empacotados de 0+ de foram adquiridas de OneBlood.org. Cada bolsa de RBCs empacotados foram divididas em quatro partes iguais (70 a 75 ml). Uma parte dos RBCs foi armazenada em 4°C e foi usada para produzir RMPs dentro de sete dias depois de receber o envio. As três partes restantes foram congeladas a -20°C e foram descongeladas em 1, 2, ou 3 meses após o congelamento inicial para produzir RMPs. RMPs foram produzidas por extrusão de alta pressão, conforme descrito no presente documento, com o uso de um Disruptor de Célula de

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Sistema Constante em 241,316 Mpa (35.000 psi) de pressão interna. A contagem de RMP (rendimento) foi medida por citometria de fluxo com o uso de anticorpo monoclonal A antiglicoforina marcada com PE como um marcador. A atividade de RMP de pró-coagulante foi determinada por tromboelastograma (TEG). Conforme mostrado na Tabela 2, as composições resultantes de RMPs produzidas a partir de RBCs descongelados e congelados não foram significativamente diferentes em termos de rendimento, atividade de pró-coagulante, e ligação de Anexina V. O uso de RBCs anteriormente congelados permite o escalonamento de produção de RMPs.

Tabela 2: Produção de RMP de RBCs Congelados vs. RBCs Descongelados

Fonte de RBC	Rendimentos de RMP (contagens/ml de sangue)	Atividade de prócoagulante/ 7x10⁷ RMP	Ligação de Anexina V (% de RMP total)
RBC Descongelado (Controle)	7,0 x10⁹	100%	38%
RBC congelado por 1 mês	7,2 x 10⁹	106%	40%
RBC congelado por 2 meses	7,3 x 10⁹	113%	42%
RBC congelado por 3 meses	6,9 x10⁹	111%	43%

[52] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente, e patentes, citados no presente documento são incorporadas a este documento a título de referência à mesma extensão como se cada referência fosse individual e especificamente indicada como incorporada a título de referência e foram apresentadas em sua totalidade no presente documento.

[53] O uso dos termos “um” e “uma”, “o” e “a” e referentes similares no contexto de descrever a revelação (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) devem ser considerados a cobrir tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outro modo no presente documento ou claramente contradito pelo contexto. Os termos “compreender”, “ter”, “incluir”, e “conter” devem ser considerados

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23/23 como termos de final aberto (isto é, significando “incluindo, porém, sem limitação,”) a menos que notado de outro modo. Por todo o relatório descritivo, onde formulações forem descritas como incluindo componentes ou materiais, é contemplado que as formulações também podem consistir essencialmente em, ou consistir em qualquer combinação dos componentes ou materiais citados, a menos que descrito de outro modo. De modo similar, onde métodos são descritos como incluindo etapas particulares, é contemplado que os métodos também podem consistir essencialmente em, ou consistir em qualquer combinação das etapas citadas, a menos que descrito de outro modo. A invenção revelada de modo ilustrativo no presente documento possa ser adequadamente praticada na ausência de qualquer elemento ou etapa que não é especificamente revelada no presente documento. Ademais, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis dos mesmos é abrangida pela revelação a menos que indicado de outro modo no presente documento ou claramente contradito de outro modo pelo contexto.

[54] A recitação de faixas de valores no presente documento é meramente destinada para servir como um método resumido para se referir individualmente a cada valor separado que está dentro da faixa e cada ponto final, a menos que indicado de outro modo no presente documento, e cada valor separado e ponto final é incorporado ao relatório descritivo como se o mesmo fosse individualmente citado no presente documento. O uso de quaisquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplificadora (por exemplo, “tal/tais como”) fornecida no presente documento, se destina meramente a iluminar melhor a revelação e não representa uma limitação no escopo da revelação a menos que reivindicado de outro modo. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando nenhum elemento não reivindicado como essencial à prática da revelação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição caracterizada por compreender micropartículas derivadas de glóbulos vermelhos (RMPs) que demonstram atividade de acetilcolinesterase (AchE) de menos do que 350 pmol/min/10⁶partículas/μΙ.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as RMPs demonstram atividade de acetilcolinesterase (AchE) inferior a 200 pmol/min/10⁶ partículas/μΙ.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que 20% a 50% das RMPs na composição exibem fosfatidilserina.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que 30% a 45% das RMPs na composição exibem fosfatidilserina.
5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a composição encurta o tempo para formação de coágulo inicial conforme medido por tromboelastografia (TEG) no sangue total e plasma em pelo menos dois minutos.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o diâmetro médio das RMPs é cerca de 0,40 a 0,6 pm.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o diâmetro médio das RMPs é cerca de 0,40 a 0,5 pm.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o diâmetro médio das RMPs é cerca de 0,47 pm.
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a densidade interna das

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RMPs é menos do que 3,5% da densidade interna dos glóbulos vermelhos totais.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a densidade interna das RMPs é cerca de 0,5 a 3,0% da densidade interna de glóbulos vermelhos totais conforme medido por sinal de dispersão lateral de citometria de fluxo.
11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que as RMPs são produzidas forçando-se os glóbulos vermelhos através de uma abertura para produzir glóbulos vermelhos rompidos e fragmentando-se também os glóbulos vermelhos rompidos por bombardeamento em uma superfície sólida.
12. Método para tratar sangramento excessivo no indivíduo, sendo que o método é caracterizado por compreender a administração ao indivíduo a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o sangramento excessivo é causado por trombocitopenia ou disfunção de plaqueta.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a disfunção de plaqueta é causada por tratamento com fármaco.
15. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o sangramento excessivo é causado por um anticoagulante.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o anticoagulante é Coumadin, heparina de baixo peso molecular, um inibidor de complexo de protrombinase, um inibidor de FXa, ou um inibidor de trombina.