CN110799199A - Rmp组合物及使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了包含红细胞衍生微粒(RMP)的组合物，所述RMP显示出临床上有利的特征。

Description

RMP组合物及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年11月30日提交的美国临时专利申请号62/428,155的优先权，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及包含红细胞衍生微粒(RMP)的组合物及使用方法。

背景技术

过度出血是创伤和出血并发症中最常见的危及生命的并发症之一。输血是治疗过度失血的主要方法。针对出血性疾病根本原因的疗法因病因而异。提高血小板计数的血小板输注或干预措施用于阻止由于低血小板计数(血小板减少症)引起的出血。在凝血障碍的情况下，通常给予血液因子替代。在血友病A中，将因子VIII给予受试者，而血友病B则要求因子IX治疗。

现有疗法具有显著的缺点。例如，由于需求增加、供应有限以及更严格的法规，用于输血的捐献血液变得越来越稀缺且昂贵。根据美国红十字会的统计，仅在美国每天就需要大约36000个单位的红细胞。参见www.redcrossblood.org/learn-about-blood/blood-facts-and-statistics。输血相关不良反应的住院费用每年超过100亿美元。Hannon&Gjerde：The contemporary economics of transfusions。在Perioperative TransfusionMedicine；Speiss R D，Spence R K，ShanderA(编辑)，Lippincott Williams和Wilkins，p.13(2006)中。输血也与许多短期和长期并发症有关，包括过敏反应、溶血反应、输血诱导的免疫抑制、移植物抗宿主病和输血相关的急性肺损伤(TRALI)。血小板MP(PMP)和冻干的全血小板(LyoPLT)具有缺点，例如成本高、血小板稀缺、血栓形成的风险和免疫反应性。由于HLA、ABO、Rh和血小板特异性抗原，血小板具有高度免疫原性，这对于交叉匹配是不切实际的，因此不良反应是常见的。此外，已知血小板携带血栓形成的组织因子(TF)。

本领域仍然需要能够在检测到过度出血后以合理的成本安全且立即施用的药剂。

发明内容

本公开提供了包含红细胞衍生微粒(RMP)的组合物，所述RMP显示小于350pmol/min/10⁶个颗粒(例如小于200pmol/min/10⁶个颗粒)的乙酰胆碱酯酶(AchE)活性。在各个方面，组合物中20％-50％的RMP展示磷脂酰丝氨酸。任选地，该组合物将通过全血和血浆中的血栓弹性描记术(TEG)测量的初始凝块形成的时间缩短例如至少两分钟。还任选地，RMP的平均直径为约0.40-0.6μm。还提供了治疗受试者过度出血的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的RMP组合物。

附图说明

图1是比较实施例中描述的RMP-1、RMP-2和RMP-3中表达的乙酰胆碱酯酶(AChE)活性(μM/min/10⁶RMP；y-轴)的条形图。

图2是比较实施例中描述的由5μM(左侧条)或10μM(右侧条)RMP-1、RMP-2和RMP-3介导的凝固时间缩短(分钟；y轴)的条形图。

图3是比较实施例中描述的由RMP-1、RMP-2和RMP-3介导的凝块强度(TEG MA的增加；y轴)的条形图。

图4是比较实施例中描述的由RMP-1、RMP-2和RMP-3诱导的抗tPA介导的纤维蛋白溶解(TG相比对照的增加(mm/min)；y轴)的条形图。

具体实施方式

本文提供了红细胞衍生微粒(RMP)的改进组合物和用于减少受试者出血的方法。RMP作为止血剂具有许多优点，包括(但不限于)易于和经济生产以及最小的免疫原性。红细胞(RBC)是最丰富的血细胞类型，确保了RMP生产的基本上无限和经济的来源。RMP在室温储存下具有无限的保质期，不需要储存在血库中，这使得它们在紧急情况下特别有利。另外，可以立即施用由O型Rh阴性红细胞(通用RMP)产生的RMP而不用交叉匹配。

本公开至少部分地基于对RMP亚群的惊人鉴定，其具有对治疗应用特别有利的特征。显示本文所述特征的特定亚群是新颖的，并且在例如功效和降低毒性方面提供优于先前描述的RMP群的技术优势。RBC降解产物(包括RMP)已与促炎反应、毒性和严重副作用有关。参见例如Danesh等人，Blood.2014；123(5)：687-696；和Zwicker等人，Br JHaematol.2013；160(4)：530-537。实际上，MP升高已涉及多种血栓形成疾病，如镰状细胞病(Camus等人，Blood.2012；120(2)：5050)和血栓性血小板减少症(TTP)(Galli等人，ThrombHaemost 1996.75(3)：427-31)，并且涉及输血后的毒性事件(Donadee等人，Circulation2011；124：465-476)。先前描述的RMP组合物具有不良事件的风险。值得注意的是，本文所述的RMP亚群有效地减少了出血，同时显著降低了毒性和不良副作用。

本文的公开描述了组合物中提供的RMP亚群的各个方面。包含显示本文所述任一种、任何组合或所有特征的RMP的组合物是本发明所包括和涵盖的。

在一个方面，本公开提供了包含红细胞衍生的RMP的组合物，其显示出显著降低的乙酰胆碱酯酶(AchE)活性。AchE活性的降低与RMP在体内的毒性降低相关。在各种实施方式中，组合物中的RMP表现出小于20000pmol/min/10⁶个颗粒的AchE活性(例如20000pmol/min/10⁶个颗粒和50pmol/min/10⁶个颗粒，其中对于本文所述的任何范围，50pmol/min/10⁶个颗粒或25pmol/min/10⁶个颗粒是任选的下限。在优选的实施方式中，RMP表现出小于10000pmol/min/10⁶个颗粒，小于5000pmol/min/10⁶个颗粒，小于2500pmol/min/10⁶个颗粒，小于1000pmol/min/10⁶个颗粒，小于500pmol/min/10⁶个颗粒，小于350pmol/min/10⁶个颗粒，小于250pmol/min/10⁶个颗粒，小于200pmol/min/10⁶个颗粒，或小于150pmol/min/10⁶个颗粒的AchE活性。在一个示例性方面，RMP表现出小于350pmol/min/10⁶个颗粒的AchE活性。检测AchE活性的方法是本领域已知的(参见例如Ellman等人，Biochemical Pharmacology1961；7(2)：88-95；Xie等人，J.Biol.Chem.2007；282：11765-11775；Wolkmer等人，Experimental Parasitology 2014；132(4)：546-549)并在本文提供的实施例中描述。

可选地或另外地，与先前描述的RMP群体相比，RMP包含显著降低水平的脂筏或其组分。脂筏也称为“耐洗涤剂膜”(DRM)，是富含胆固醇和鞘脂的膜微结构域。基本上所有天然细胞衍生的微粒(MP)主要由脂筏组成。值得注意的是，在各种实施方式中，本公开的组合物包含比先前实现的更少的脂筏含量(其不限于完整的脂筏，而是包括脂筏的组分)。仅为了方便描述本公开的这一方面，可以将RMP的脂筏含量与全(即非碎片的)血红细胞的脂筏含量进行比较。在各个方面，组合物的RMP的脂筏含量为全血红细胞的脂质含量的10％或更低(例如5％或更低，3％或更低，2％或更低，1％或更低，0.5％或更低(例如0.1％或0.05％))。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但AChE可以作为脂筏的替代指标，因为蛋白质通过跨膜蛋白PRiMA(富含脯氨酸的膜锚)锚定在细胞膜中并且整合在脂筏微结构域中。参见例如Xie等人，J.Biol.Chem.2010；285(15)：11537-11546，其还提供了用于确定生物样品中脂筏含量的材料和方法。脂筏的替代标记物包括但不限于红细胞膜整合蛋白(stomatin)，浮筒蛋白(flotillin)和细胞膜穴样内陷(caveolae)。脂筏也可以使用蛋白质组学方法表征。参见例如Foster和Chan，Subcell Biochem.2007；43：35-47。

可选地或另外地，组合物中20％-50％的RMP展示磷脂酰丝氨酸。例如，任选地，组合物中30％-45％的RMP展示磷脂酰丝氨酸。在这方面，该组合物提供具有最佳磷脂酰丝氨酸活性水平的RMP亚群，以促进止血(例如促进凝血，减少出血)，同时使血栓形成潜力最小化。磷脂酰丝氨酸可以多种方式测量。例如，磷脂酰丝氨酸的替代指标包括通过流式细胞术检测膜联蛋白V结合。参见例如Koopman等人，“Annexin V for flow cytometricdetection of phosphatidylserine expression on B cell cells during apoptosis”.Blood 1994；84(5)：1415-20。在一个示例性方法中，测定膜联蛋白V结合+与CD235a+(RMP的一般标记)细胞的比率。在各个方面，AnV+/CD235a+的比率为0.2-0.5，例如0.3-0.4。

任选地，组合物的RMP的内部密度小于全血红细胞内部密度的3.5％。在一些方面，RMP的内部密度为全血红细胞内部密度的约0.1％-3.5％(例如约0.5％-3％，约0.5％-2.5％或约1％-2％)。RMP的内部密度可使用多种技术确定，包括但不限于流式细胞术侧散射信号，如本文所述。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但认为降低内部密度与降低的血红蛋白含量有关。游离血红蛋白在体内可能是有毒的，导致例如肾衰竭。参见例如Gladwin等人，J Clin Invest.2012；122(4)：1205-1208。本公开的组合物的RMP显示出降低的毒性。

在各种实施方式中，通过全血和血浆中的血栓弹性描记术(TEG)测量，组合物缩短了初始凝块形成的时间。在这方面，如通过血栓弹性描记法测量，组合物任选地将初始凝块形成的时间缩短至少两分钟(例如至少三分钟或至少四分钟)。在各种实施方式中，如通过全血和血浆中的血栓弹性描记法(TEG)测量，组合物将初始凝块形成的时间缩短约2至约5分钟。实际上，在各种实施方式中，如通过全血和血浆中的TEG或旋转血栓弹力测定法(ROTEM)测量，通过较短的凝块时间、更快的凝块形成或更稳定的凝块发展所表明，组合物恢复正常凝固。

可选地或另外地，组合物中的RMP显示平均直径为约0.40-0.70μm，例如约0.40-0.60μm或约0.40-0.50μm。任选地，RMP的平均直径为约0.45-0.50μm。RMP大小可以使用各种常规实验室技术中的任一种来确定，包括实施例中描述的方法。

RMP是RBC的降解产物。RMP可以由新鲜RBC(即在RMP生产的24小时内从血液样品中分离的RBC)或储存的RBC产生。在这方面，RBC在生产RMP之前任选地冷冻。例如，在各个方面，RBC已经冷冻长达一个月，长达两个月，长达三个月，长达四个月或更长。RMP可以使用许多技术中的任一种来破坏红细胞膜，包括超声处理，离心，加热和用离子载体处理。在各种实施方式中，通过迫使红细胞通过孔以产生破裂的红细胞，并通过在固体表面上轰击破碎破裂的红细胞来产生RMP。通过在例如至少25000psi的压力(例如约35000psi的压力)下迫使RBC通过孔而产生的剪切应力剪切RBC，并且随后的轰击步骤进一步使RBC碎裂以产生具有本文所述特征的RMP。组合物中的RMP可以是新鲜的(即在给予受试者的24小时内由RBC制备)或储存的。由于RMP具有延长的保质期，因此组合物可以长期储存。从过期血液中产生的RMP与来自非常新鲜血液的RMP一样有效；因此，本公开提供了一种利用可能不适合临床使用的献血的手段。

还提供了治疗受试者过度出血的方法。该方法包括向受试者施用包含本文所述RMP的组合物。例如，该方法包括给予包含RMP的组合物，其表明乙酰胆碱酯酶(AchE)活性小于350pmol/min/10⁶个颗粒和/或平均直径为约0.40-0.6μm和/或其中组合物中20％-50％的RMP展示磷脂酰丝氨酸和/或其中如通过全血和血浆中的血栓弹性描记术(TEG)测量的组合物缩短初始凝块形成的时间(例如缩短至少两分钟)。

如本文所用，“治疗”是指受试者出血的任何减少。“治疗”包括治疗性和预防性措施。本领域普通技术人员将理解，过度出血的任何程度的保护或改善过度出血对受试者(例如人类患者)是有益的。因此，在已确定受试者具有异常失血风险之后尽快(例如在患有或有风险患有凝血或血小板病症的受试者中进行手术之前)或在出血事件发生后尽快执行该方法的一方面。

过度出血可以由多种病症或病症引起，并且可以是先天性的或获得性的(例如由其它治疗剂引起)。受试者可能患有例如血小板病症或凝血障碍(即由其引起过度出血)。凝血障碍包括由血液凝固因子活性不足引起的出血性疾病。血液凝固因子包括但不限于因子V(FV)，FVII，FVIII，FIX，FX，FXI，FXIII，FII(负责低凝血酶原血症)和冯维勒布兰德因子。受试者可能患有慢性肝病。血小板疾病是由血小板功能缺乏或血液中血小板数量异常低引起的。血小板计数低可能是由于例如生产不足、血小板螯合或不受控制的明显破坏。血小板减少症(血小板缺乏)可能由于各种原因而存在，包括化学疗法和其它药物疗法，放射疗法，手术，意外失血和其它疾病。例如，血小板减少症任选地与骨髓衰竭，再生障碍性贫血，骨髓增生异常综合征或白血病相关。血小板疾病还包括但不限于血管性血友病，副肿瘤性血小板功能障碍，格兰兹曼血小板功能不全和伯纳德-苏莱尔病。创伤引起的出血性疾病也可能导致出血过多；缺乏一种或多种接触因子如FXI，FXII，前激肽释放酶和高分子量激肽原(HMWK)；维生素K缺乏症；纤维蛋白原疾病，包括纤维蛋白原血症，低纤维蛋白原血症和纤维蛋白原血症；和α2-抗纤溶酶缺乏症。在各种实施方式中，过度出血是由手术，创伤，脑内出血，肝病，肾病，血小板减少症，血小板功能障碍，血肿，内出血，关节积血，体温过低，月经，怀孕和登革热出血热引起的。

任选地，过度出血是由药物治疗引起的。例如，在各种实施方式中，过度出血是由抗凝血剂引起的，例如血液稀释剂如香豆素(华法林，其也是维生素K拮抗剂)，肝素(例如低分子量肝素，例如依诺肝素或达肝素)，凝血酶原酶复合物抑制剂(例如磺达肝素或利伐沙班)，FXa抑制剂(例如阿哌沙班(Eliquis))或凝血酶抑制剂(例如达比加群)。过度出血也可能由阿司匹林(其抑制血小板功能并可导致严重出血，特别是与其它疾病或药物组合)和氯吡格雷(PLAVIX)等引起。这些抗凝剂没有解毒剂，并且这些抗凝血剂引起的出血性并发症对患者是危险的。在这些情况下，本公开的组合物可有效治疗和/或预防过度出血。

在各种实施方式中，受试者正在接受血液稀释剂治疗(或血液稀释剂治疗已在一段时间内停止，使得血液稀释剂的生物学效应保持不变)。本发明组合物的一个优点是即使存在血液稀释剂，本发明组合物的RMP也能校正由血液稀释剂诱导的止血缺陷。本发明的组合物显示出通用的止血活性，因此适用于治疗患有多种止血缺陷的患者的出血。

用生理学上可接受的(即药理学上可接受的)载体，缓冲剂，赋形剂或稀释剂配制组合物(例如药物组合物)。所用的特定载体仅受化学-物理因素的限制，例如溶解度和与RMP的反应性不足，以及受施用途径的限制。生理学上可接受的载体是本领域熟知的。适于注射使用的示例性药物形式包括但不限于无菌水溶液或分散液。可注射制剂进一步描述于例如Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia.Pa.，Banker和Chalmers.ed，第238-250页(1982)和ASHP Handbook on Injectable Drugs，Toissel，4th ed.，第622-630页(1986))。包含本文提供的RMP的药物组合物任选地与包装材料一起放置在容器内，所述包装材料提供关于此类药物组合物的使用的说明。通常，这些说明书包括描述试剂浓度的有形表达，以及在某些实施方式中，包括稀释药物组合物可能需要的赋形剂成分或稀释剂的相对量。

如果需要，该组合物包含一种或多种另外的药学上有效的药剂。可选地或另外地，组合物作为治疗方案提供，包括施用其它药学上有效的药剂(同时或间隔时间)。组合物可以与其它物质和/或其它治疗方式组合施用，以实现额外的或增强的生物效应。共处理包括但不限于血浆衍生或重组凝血因子，血友病预防治疗，免疫抑制剂，血浆因子抑制抗体拮抗剂(即抗抑制剂)，抗纤维蛋白溶解剂，抗生素，激素疗法，抗炎剂(例如非甾体抗炎药(NSAID)或甾体抗炎物质)，促凝血剂，血液稀释剂和止痛药。在一个方面，组合物的施用允许减少实现期望的生物反应所需的共治疗剂的剂量。

因此，本发明包括向受试者施用本公开的组合物与一种或多种另外合适的物质的组合，每种物质根据适合于该药物的方案施用。施用策略包括RMP组合物与一种或多种另外合适的药剂的同时施用(即基本上同时施用)和非同时施用(即在不同时间以任何顺序施用，无论是否重叠)。应当理解，不同的组分任选地以相同或不同的组合物施用，并且通过相同或不同的施用途径施用。

特定受试者的具体施用方案将部分取决于施用的组合物的量，施用途径，所治疗的特定疾病，与接受者有关的考虑因素，以及任何副作用的原因和程度。给予受试者(例如哺乳动物，例如人)的组合物的量和施用条件(例如施用时间，施用途径，施用方案)足以在合理的时间框内影响所需的生物反应。纯粹通过举例说明，在一方面，该方法包括向受试者施用例如约1×10¹⁰RMP/kg至约3×10¹¹RMP/kg(例如约5×10¹⁰RMP/kg至约2×10¹¹RMP/kg)。

在各个方面，该方法包括给予组合物以治疗急性病症(例如由手术或创伤引起的出血)持续相对短的治疗期，例如1至14天。还预期如果患者病症的性质需要延长治疗，则可以在更长的治疗过程(例如持续数周或数月)内施用组合物。各种实施方式中的方法包括向受试者多次施用组合物(例如每天一次，每天两次，每天三次，每天四次或更多次)。

施用生理学上可接受的组合物(例如包含如本文所述的RMP的组合物)的合适方法是本领域熟知的。尽管可以使用多于一种途径来施用组合物，但是特定途径可以提供比另一种途径更直接和更有效的反应。在一个方面，通过静脉内、动脉内或腹膜内施用本公开的组合物以将RMP引入循环中。非静脉内施用也是合适的，特别是对于低分子量治疗。在某些情况下，希望在阴道，直肠，肺部；通过脑内(实质内)，脑室内，肌肉内，眼内，门内，病灶内，髓内，鞘内，心室内，透皮，皮下，鼻内，尿道或肠内注射；通过持续释放系统；或通过植入装置递送包含如本文所述的RMP的药物组合物。如果需要，通过动脉内或静脉内施用局部给予组合物，例如通过股动脉喂养感兴趣区域以递送至腿部。在使用植入装置的情况下，将一个方面的装置植入任何合适的组织中，并且通过扩散、定时释放推注或连续施用在各个方面递送组合物。在其它方面，组合物在外科手术或损伤治疗期间直接施用于暴露的组织，或通过输血方法施用。

鉴于以上所述，本发明提供了本文所述的组合物，其用于治疗受试者的方法，例如治疗RMP有益的病症的方法。在一个方面，本公开提供了本文所述的组合物，其用于治疗有此需要的受试者的过度出血或失血。该方法包括以有效治疗或预防全部或部分过量失血的量和条件向受试者施用本发明的组合物。本发明进一步提供了具有本文所述的一种或多种(或所有)特征的RMP，其用于制备药物。例如，RMP可用于制备药物(例如组合物)，用于治疗有此需要的受试者的过度出血或失血。

实施例

细胞衍生的微粒(MP)是在细胞活化或凋亡中释放的小囊泡(＜1um)。根据刺激，MP在表型和功能活动方面可以是异质的，例如止血与血栓形成与促炎症。在该研究中，产生了三个RMP群体，其显示出结构和功能特征的不同组合。研究的特征包括PCA(代谢止血活性)、乙酰胆碱酯酶(AchE)活性和毒性。

鉴定了RMP的亚群，其证明了与困扰其它RMP组合物的功效改善和毒性降低相关的特别有利的特征。

通过迫使RBC穿过孔(35000psi)三次(使用恒定系统细胞破碎器)以产生破裂的红细胞，并通过在固体表面上的轰击进一步破碎破裂的红细胞来产生一个RMP群体(RMP-1)。洗涤所得的RMP并通过离心收集。通过钙离子载体处理RBC(RMP-2)产生第二个RMP群体。将暴露于Ca2+/离子载体(A23187)(10μM)30分钟的新鲜RBC的上清液离心以收集RMP。第三个群体在储存42天后从包装细胞(PC)中释放出来(RMP-3)；RBC以间隔长达42天从储存的PC中取出(储存在4℃)，然后离心以回收RMP。

流式细胞计数通过CD235a(血型糖蛋白A)和膜联蛋白V(AnV)结合进行。通过向4μL荧光标记的mAb中加入20μLRMP样品并在室温下用轨道振荡孵育20分钟来进行RMP的CD235a标记。然后将混合物用1000μL冷HEPES/盐水(pH 7.4)稀释，并保持在冰上直至准备用于流式细胞术。对于标记膜联蛋白V，将20μL RMP样品与3μL0.2M CaCl₂溶液加2μL膜联蛋白V-FITC(10μg/mL)孵育20分钟，然后500μL HEPES/生理盐水孵育，然后如上处理。然后在Beckman Coulter FC-500流式细胞仪上测定样品的MP，用Megamix珠校准以设定FS，SS，FL1和FL2的适当放大电压以及MP的合适门控。运行时间为30秒，并如前所述校准流速(Jy等人，Thromb Haemost.2013；110(4)：751-60)。事件计数由荧光信号(FL1或FL2)而不是前向散射(FS)触发，从而提高了检测效率。MP门的尺寸小于1微米。通过荧光标记的同种型IgG评估mAb的非特异性结合。

功能测试包括血栓弹性成像(TEG)；基于CD235a比较每种样品类型的相等计数，并根据需要用无颗粒混合血浆(PFP)稀释。TEG通过监测传递到浸入样品杯的中心销的增加扭矩来测量凝血发展；杯子周期性地振动+/-4.5°。本研究记录的参数为：R(滞后于纤维蛋白形成)，MA(最大振幅，反映血小板功能)和TTG(总血栓生成)。对于每个测试，将330μL PFP与5或10μL RMP(2×10⁹个颗粒/mL)混合5分钟，然后加入20μL钙(100mM)以引发凝结。

通过比色法(Ellman的AChE测定的改编版本)测定乙酰胆碱酯酶(AchE)活性，红细胞质膜脂筏上的标记物。使用磷酸盐缓冲液(pH 7.5，0.1M)稀释RMP。加入10.6μL 0.01MDTNB和10.6μL 12.5mM乙酰硫代胆碱碘化物并与150μL稀释的RMP混合。以1分钟、3分钟和6分钟的间隔在405nm处读取样品。

在雄性新西兰白兔(平均3.8kg)和雄性Sprague Dawley大鼠(平均280g)中评估RMP的毒性。全部用2％异氟烷麻醉。将股动脉和静脉插管，并以3mL/h的速度给予维持生理盐水。通过插管的股静脉输注RMP样品，并且以不同的时间间隔通过插管的股动脉收集血液。持续监测生命体征，包括血压，心率，呼吸频率，血氧和二氧化碳水平。在注射RMP后4小时处死一些动物以获得用于病理学检查的主要器官。将一些动物缝合并返回动物护理设施进行长期随访。在第一周每天监测它们的行为，活动性，食物和水摄入量，体温等，然后在每周监测其余5周。

RMP-1与治疗产物的最高产量相关，其次是RMP-2，其产生比RMP-3多约3倍的治疗产物。

AnV结合表示为比率AnV+/CD235+，并且是促凝血磷脂的标记物。该比率在RMP-1(0.28)中最小，其次是RMP-2(0.48)和RMP-3(0.98)。

通过前向散射(FS)检测的RMP的大小(平均直径)在RMP-3中为0.57μm。该值略大于RMP-1(0.42μm)和RMP-2(0.45μm)。通过侧向散射测量的RMP与RBC的内部密度百分比在RMP-1(1.5％)中最低，其次是RMP-2(4.8％)和RMP-3(10.3％)。

目前，乙酰胆碱酯酶(AChE)活性在RMP-3中最高(每10⁶个颗粒为15643pmol/min)，而对于RMP-2，每10⁶个颗粒为3362pmol/min，对于RMP-3，每10⁶个颗粒为149pmol/min。以另一种方式提供数据，AChE活性在RMP-1中最低(每10⁶个颗粒为149pmol/min)，比RMP-2(每10⁶个颗粒为3362pmol/min)和RMP-3(每10⁶个颗粒为15643pmol/min)分别低22和104倍。

使用TEG估计促凝血活性。凝血时间(R-时间)显示用RMP-3(10.2分钟)为最大缩短，然后是RMP-2(6.7分钟)和RMP-1(3.6分钟)。

在0.4μg/mL组织纤溶酶原激活物(tPA)的存在下测试抗纤维蛋白溶解活性。通过TEG参数测量所有三种RMP均有效抑制t-PA介导的纤维蛋白溶解，包括MA，Ly30和TTG(总血栓形成)。RMP-3最有效，其次是RMP-2和RMP-1。

以1×10¹⁰至1.2×10¹²个RMP/kg的剂量向兔和大鼠施用RMP-1，在施用后观察的六周内未引起任何不良事件。在输注RMP后一小时内，包括心率，血压，呼吸频率，血氧水平和体温在内的生命体征仍然正常。长期随访(6周)表现出正常的行为，食欲和活动能力。在最高剂量(1.2×10¹²个RMP/kg)下，所有测试的大鼠在六周观察期期间和结束时保持存活并且体重增加。在这些剂量下，在三种不同的动物出血模型中，出血时间显著缩短并且总失血量减少。

本文描述的各种RMP亚群的特征概述列于表1中。第一行是每mL PC的RMP产量。第二行是通过抗血型糖蛋白(CD235a)检测到的RMP计数与通过流式细胞仪中膜联蛋白V结合检测到的RMP计数之间的比率。第三行是由用三种不同大小的珠子校准的流式细胞术测定的前向散射计算的RMP大小。最后一行是由流式细胞术测定的侧向散射(SS)计算的RMP与RBC的内部密度百分比。所有值均为平均值±SEM。

表1：RMP群体的性质

本文的结果证明了本文表征的独特类型的RMP的优点。这种类型的RMP具有独特的表面特征和功能活性。结果表明，三种物种的功能、表型和毒理学特性存在明显和决定性的差异。与RMP-1相比，RMP-2和RMP-3的大小更大，AnnV结合更高，并且AChE表达更高。RMP-2和RMP-3表现出比RMP-1更高的促凝血活性，但RMP-1表现出促凝血活性；在这方面，RMP-2和RMP-3的活性更高。RMP-1与每mL填充的RBC产生的更高数量的治疗产物相关。

在所比较的所有参数中，这三种RMP中最显著的差异是AchE活性。RMP-1的AchE活性分别比RMP-2和RMP-3低约25至150倍。据信AchE与脂筏共价连接，因此，它充当脂筏的替代标记物。基于AchE数据，RMP-3实际上没有脂筏，其由许多促炎介质组成，例如粘附素和细胞活化配体，促炎脂质和细胞因子，补体，免疫复合物等。

在本公开之前，认为止血功效和毒性被不可分割的联系。上述结果表明，本文鉴定的独特类型的RMP令人惊讶地证明没有可辨别的毒性，但仍保持稳健的止血功效。

还研究了由先前冷冻的RBC产生的RMP的特征。Leuko-减少，O+包装的RBC购自OneBlood.org。将每袋包装的RBC分成四等份(70-75mL)。红细胞的一部分储存在4℃，并在收到货物后七天内用于生产制冷剂管理计划。剩余的三部分在-20℃冷冻，并在初始冷冻后1，2或3个月解冻，产生RMP。如本文所述，使用恒定系统细胞破碎器在35000psi内压下通过高压挤出生产RMP。使用PE标记的抗血型糖蛋白A单克隆抗体作为标记，通过流式细胞术测量RMP计数(产量)。通过血栓弹力图(TEG)测定RMP的促血清活性。如表2所示，由未冷冻和冷冻的RBC产生的RMP的所得组合物在产量，促凝血活性和膜联蛋白V结合方面没有显著差异。使用先前冷冻的RBC可以扩大RMP的产量。

表2：从冷冻与未冷冻的RBC产生RMP

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利均通过引用并入本文中，其程度如同每个参考文献被单独且具体地指出通过引用并入并且在本文中完整地阐述。

在描述本公开的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用术语“一个”和“一种”和“该”以及类似的指示物应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含”，“具有”，“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。在整个说明书中，当制剂被描述为包括组分或材料时，除非另有说明，否则预期制剂也可基本上由所述组分或材料的任何组合组成或由其组成。同样地，在将方法描述为包括特定步骤的情况下，除非另有说明，否则预期所述方法也可基本上由所述步骤的任何组合组成或由其组成。本文说明性地公开的本发明可适当地在不存在本文未具体公开的任何要素或步骤的情况下实施。此外，除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本公开涵盖上述元件的所有可能变型的任何组合。

除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围和每个端点的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值和端点被并入说明书中作为如它在这里单独列举。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本公开，并且不对本公开的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未声明的要素对于本公开的实践是必不可少的。

Claims (16)

1.一种包含红细胞衍生微粒(RMP)的组合物，所述RMP显示出小于350pmol/min/10⁶个颗粒/μL的乙酰胆碱酯酶(AchE)活性。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述RMP显示出小于200pmol/min/10⁶个颗粒/μL的乙酰胆碱酯酶(AchE)活性。

3.根据权利要求l或权利要求2所述的组合物，其中，所述组合物中20％-50％的所述RMP展示磷脂酰丝氨酸。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述组合物中30％-45％的所述RMP展示磷脂酰丝氨酸。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中，如通过全血和血浆中的血栓弹性描记术(TEG)测量，所述组合物将初始凝块形成的时间缩短至少两分钟。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中，所述RMP的直径为约0.40μm-0.6μm。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中，所述RMP的直径为约0.40μm-0.5μm。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中，所述RMP的直径为约0.47μm。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中，所述RMP的内部密度小于全血红细胞内部密度的3.5％。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中，如通过流式细胞术侧散射信号测量，所述RMP的内部密度为全血红细胞内部密度的约0.5％-3.0％。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中，所述RMP通过迫使红细胞通过孔以产生破裂的红细胞并通过在固体表面上的轰击进一步破碎所述破裂的红细胞而产生。

12.一种用于治疗受试者的过度出血的方法，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1-11中任一项所述的组合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述过度出血是由血小板减少症或血小板功能障碍引起的。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述血小板功能障碍是由药物治疗引起的。

15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述过度出血是由抗凝血剂引起的。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述抗凝血剂是香豆素、低分子量肝素、凝血酶原酶复合物抑制剂、FXa抑制剂或凝血酶抑制剂。

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