ES2468225T3 - Estimuladores del factor X activado como nuevos agentes antihemorr�gicos de uso t�pico - Google Patents

Abstract

Factor Tisular (FT) lipidado, o un fragmento funcional lipidado del mismo, para usar en el tratamiento tópico de hemorragias en un sujeto, con la condición que: (i) el FT lipidado no es un FT de mamífero recombinante o un fragmento funcional del mismo obtenido de plantas transgénicas, y (ii) el FT lipidado no es un FT lipidado que tiene un 70% de PC y un 30% de PS y que comprende un FT producido en E. coli que tiene la secuencia.

Description

Estimuladores del factor X activado como nuevos agentes antihemorr�gicos de uso t�pico

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con el tratamiento t�pico de hemorragias en un sujeto mediante el uso de estimuladores de FXa. Esta invención est� basada en el descubrimiento de que el Factor Tisular (FT) lipidado ejerce un nuevo papel regulador estimulando todas las actividades proteol�ticas (actividad hidrol�tica de protrombina y amidol�tica) de ambas formas de FXa, la soluble y la unida al complejo protrombinasa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

1. Fisiología de la coagulación

La hemostasis es el mecanismo por el que los seres vivos responden ante una hemorragia e implica la participación de dos procesos que adquieren funcionalidad inmediatamente después de una lesión y se mantienen activos durante un largo período de tiempo. El primero de ellos se conoce como hemostasia primaria y se caracteriza por la aparición de vasoconstricci�n en el punto de la lesión vascular y la formación del agregado plaquetario. El segundo se conoce como hemostasia secundaria, siendo la fase en la que se forma el coágulo de fibrina por la acción de las diferentes enzimas proteol�ticas de la cascada de la coagulación.

El agregado plaquetario juega un papel clave en la hemostasis de los capilares, teniendo especial relevancia en las hemorragias mucocut�neas. Por el contrario, la formación del coágulo de fibrina es mucho más importante en la hemostasia de los grandes vasos, adquiriendo mayor relevancia en las hemorragias internas (gastrointestinales, cerebrales, etc.). Durante la formación del agregado plaquetario se pueden distinguir las siguientes fases: (i) adhesión de las plaquetas a la superficie del sub-endotelio expuesta por la lesión; (ii) liberación del contenido granular de las plaquetas, como respuesta a su activación; (iii) agregación de las plaquetas con el consiguiente secuestro y concentración de más plaquetas en el lugar de la lesión; y (iv) unión del fibrin�geno, as� como de otras proteínas de coagulación a la superficie de las plaquetas para producir trombina y formar el coágulo de fibrina que permitir� que las plaquetas se fusionen y consoliden, estabilizando de ese modo el coágulo hemost�tico. Además, es bien conocido que la cantidad de plaquetas es crítica para la formación del coágulo de fibrina; contajes de plaquetas por debajo de 20.000 por μl est�n acompañados de episodios de sangrado severos.

En la segunda fase del proceso de coagulación sanguínea, participan diversas enzimas proteol�ticas y cofactores, referidos todos ellos como factores de coagulación, y consiste en varias fases que finalizan con la formación de fibrina a partir de la hidrólisis del fibrin�geno por la acción de la trombina. Adicionalmente, la producción de trombina potencia el agregado plaquetario al aumentar la activación y agregación de más plaquetas. La trombina es previamente formada por la hidrólisis proteol�tica de un apoenzima, la protrombina. Esta prote�lisis es realizada por la FXa serinproteasa que se une a la superficie de las plaquetas activadas y sólo en presencia de su cofactor, el Factor de coagulación V activado (FVa), e iones calcio, esta serinproteasa es capaz de hidrolizar la protrombina. FXa puede ocurrir por dos vías separadas, la vía intrínseca y la vía extrínseca.

La vía intrínseca consiste en una serie de reacciones que involucran principalmente el Factor de coagulación VIII (FVIII), el Factor de coagulación IX (FIX) y el Factor de coagulación XI (FXI), en las que cada proenzima es hidrolizada dando lugar a su forma prote�sica activa (FVIIIa, FIXa y FXIa). En cada paso, la enzima proteol�tica recién formada catalizar� la activación de la siguiente proenzima para dar lugar sucesivamente a la forma activa. La activación de los diferentes factores de la coagulación implicados en la vía intrínseca tiene lugar; por tanto, a modo de cascada, una deficiencia de cualquiera de las proteínas de la vía intrínseca bloquea la activación del siguiente paso, impidiendo la formación del coágulo y aumentando la tendencia hemorrágica. Deficiencias en distintos factores de coagulación, por ejemplo, en FVIII, FIX o FXI causan síndromes hemorrágicos severos, tales como la Hemofilia A, B y C, respectivamente.

En la vía extrínseca de coagulación sanguínea, el FT expuesto por las células de la adventicia en el lugar de la lesión, se une al Factor de coagulación VII/Factor de coagulación VII activado (FVII/FVIIa) circulante para formar el complejo FT::FVIIa y, en presencia de calcio, actuar como sustrato para la activación del FX. La vía extrínseca es considerada actualmente como la vía de mayor relevancia en la coagulación sanguínea y se acepta que, ante una hemorragia producida por una lesión vascular, la coagulación se desencadena por la activación de la vía extrínseca, que implica la interacción del FT con su ligando, FVII/FVIIa.

Otro de los papeles asignados al complejo FT::FVIIa en la coagulación es el de actuar como substrato para que tenga lugar la activación del FX por el FVIIa. Como consecuencia, aumentan los niveles basales de FXa (<150pM), que inicialmente son insuficientes para generar la formación del coágulo de fibrina. Este aumento en las concentraciones basales del FXa en presencia de su cofactor, FVa, y de una superficie procoagulante celular, s� que sería capaz de producir la trombina necesaria para la formación del coágulo de fibrina. Actualmente se acepta que las plaquetas una vez activadas, juegan un papel clave en la coagulación sanguínea. Aportan la superficie procoagulante rica en fosfol�pidos ani�nicos y, por otro, exponen los factores FVa y FXa almacenados en su interior. Todo ello permite el correcto ensamblaje de los diferentes agentes implicados en la coagulación sobre la superficie de sus membranas plasm�ticas formando el bien conocido complejo protrombinasa (que incluye FXa, FVa, protrombina, y una superficie fosfolip�dica plaquetaria procoagulante ani�nica).

La teoría de la activación de la vía extrínseca es capaz de explicar cómo comienza la coagulación a través del papel que se le ha atribuido al complejo FT::FVIIa. Un ejemplo que ilustra la relevancia biológica del complejo FT::FVIIa en el proceso de coagulación sanguínea es el Síndrome de Coagulación Intravascular Diseminada (DIC). Esta condición clónica est� asociada con la liberación intravascular del FT y puede ocurrir en el curso de condiciones clónicas severas (shock, sepsis, paro cardiaco, trauma mayor, enfermedades del hígado, cirugía mayor, quemaduras, etc.)

Evidentemente, en un contexto en que el FVIIa no est� presente, como ocurre en una deficiencia congénita de este factor, la coagulación hipotéticamente nunca tendr� lugar ya que FX no se activar� a niveles suficientes y, como consecuencia, las manifestaciones hemorrágicas ser�n fatales. Modelos murinos confirman esta teoría y la deficiencia en FVII es incompatible con la vida, estando acompañada de hemorragias fatales severas. Sin embargo, hasta ahora las deficiencias de FVII congénitas descritas en humanos hasta ahora, no siempre est�n acompañadas de hemorragias. Se ha informado de casos de deficiencia completa de FVII sin ningún síntoma cl�nico y que ocurren en individuos sanos sin complicaciones hemorrágicas. Todo esto sugiere que deben existir en los humanos otros mecanismos desencadenantes de la coagulación independientes del FVII.

El FT es una glicoprote�na integral de membrana perteneciente a la superfamilia de receptores de citocinas clase II que se une específicamente al FVII/FVIIa y juega un papel relevante en la vía extrínseca de coagulación sanguínea. Las funciones fisiológicas asignadas al FT son bien conocidas; por un lado, es un receptor específico para el FVIIa y, una vez se ha formado el complejo FT::FVIIa, actúa como substrato para que tenga lugar la activación de FX. De hecho, después de una lesión vascular, el FT, que normalmente est� secuestrado en la superficie de las células de la adventicia que rodean externamente a los vasos sanguíneos, entra en contacto e interacciona con su ligando, el FVII presente en la sangre, para formar el complejo FT::FVII. Una vez formado este complejo tiene lugar la autoactivaci�n de FVII dando su forma activa FVIIa. Actualmente se dispone de amplia información sobre la estructura del complejo FT::FVII. Los principales sitios de unión de FVII que participan en la interacción con FT se localizan en el primer dominio similar al del factor de crecimiento epid�rmico (EGF) y en el dominio prote�sico. Por otro lado, también se ha descrito que participan otros sitios de unión con menor relevancia (dominio rico en 4carboxiglutamato (dominio Gla) y el segundo dominio EGF). Los sitios de unión presentes en el FT se localizan en los dos dominios de fibronectina tipo III y en la región intermedia entre ambos dominios.

Estudios recientes han permitido identificar que son los residuos Lisina 165 y Lisina 166 del FT los que interaccionan con el dominio Gla del FX, tanto en la forma activada como en la forma no activada. Sin embargo, al contrario de lo que sucede con la información referente al complejo FT::FVIIa, poco se sabe de la interacción de FT con FX y FXa. Primero, los datos sugieren que los residuos de Lisina (165 y 166) actúan como sustrato para la activación de FX. Por otro lado, recientemente se ha descrito que el FT puede actuar como cofactor de FXa para la activación de FVII. Es decir, que la unión del FVII a FT estimula la autoactivaci�n de FVIIa y la activación de FX. Después, el FXa unido al FT estimula la activación de FVII el cual, a su vez, aumentar� la activación de FX y, como consecuencia, la hidrólisis de la protrombina y la formación del coágulo de fibrina.

Los inventores han descubierto que el papel postulado del FT como cofactor de FXa es mucho más relevante, llegando a ser crítico para la hemostasis. A pesar del papel aceptado del FT como receptor de membrana para el FVII, los inventores han demostrado que el FT es también un potente estimulador del FXa. El FT actúa como estimulador del FXa produciendo un aumento significativo de su actividad proteol�tica. “Estimuladores del FXa” como se usa en la presente descripción hace referencia a todas las formas del FXa, tales como el FXa soluble y el FXa unido al complejo protrombinasa.

Es bien conocido que el FXa a concentraciones picomolares es incapaz de producir cualquier efecto en la coagulación, incluso en presencia de su bien conocido cofactor, el FVa (ver Tabla 9). Por lo tanto, bajo estas condiciones el complejo protrombinasa no est� activo. Sorprendentemente, en presencia de FT (es decir, administración end�gena o daño), el FXa en concentraciones picomolares (es decir, concentraciones fisiológicas basales o administradas de forma ex�gena) causa hidrólisis de protrombina, conduciendo a la formación del coágulo de fibrina, incluso en la ausencia de FVII/FVIIa (Tabla 7).

En la presente solicitud de patente los inventores describen que la interacción FT::FXa es un nuevo mecanismo desencadenante del mecanismo de coagulación independiente de los complejos FT::FVIIa y la vía de coagulación extrínseca.

Finalmente, es bien conocido que hay ciertas enfermedades plaquetarias que ocurren con trastornos en la agregación plaquetaria y una mayor tendencia de episodios hemorrágicos, entre las que destacan la enfermedad de Glanzmann y el Síndrome de Bernard-Soulier, en donde se han descrito defectos congénitos que afectan al receptor de fibrin�geno o al receptor Gp1b, respectivamente. Por otro lado, est�n presentes episodios hemorrágicos severos en trastornos trombocitop�nicos adquiridos y congénitos cuando el contaje de plaquetas desciende por debajo de

20.000 por μl.

En la presente solicitud de patente, los inventores han demostrado que el FT lipidado es también efectivo en el tratamiento de hemorragias presentes en enfermedades plaquetarias adquiridas, congénitas y en trastornos trombocitop�nicos severos (por debajo de 9.000 por μl).

2. Patología de la coagulación

Las deficiencias congénitas de cada factor de coagulación se pueden asociar con la aparición de hemorragias y generalmente involucran una sola proteína; as�, por ejemplo, la Hemofilia A es una enfermedad hemorrágica hereditaria que afecta a FVIII. Las enfermedades de coagulación adquiridas aparecen en individuos sin historial previo de sangrado y pueden tener múltiples orígenes; a modo ilustrativo, la presencia de inhibidores específicos para factores de coagulación puede aparecer en individuos que se han sometido a muchas transfusiones. Aunque las deficiencias adquiridas de factores de coagulación son una entidad etiol�gica desconocida que también provocan graves problemas hemost�ticos, son también uno de los problemas más importantes en la politransfusi�n a la que se ven sometidos pacientes con coagulopat�as congénitas. Otra fuente importante de trastornos en la coagulación adquiridos son las terapias anticoagulantes, tales como los fármacos heparina y warfarina. Un porcentaje significativo de los pacientes tratados con fármacos anticoagulantes (5-10%) presentan episodios de sangrado, la mayoría de ellos difíciles de manejar.

Como se ha mencionado previamente, los trastornos plaquetarios adquiridos y congénitos también pueden estar asociados a hemorragias. Descensos en el contaje de plaquetas (por debajo de 20.000 por μl) pueden causar impedimento del coágulo de fibrina frecuentemente acompañado de episodios de sangrado severos.

El arsenal terapéutico disponible actualmente ante una hemorragia de carácter leve/moderado o grave/mortal (por cirugía o trauma externo), es muy limitado. Existen diferentes agentes hemost�ticos que son capaces de acelerar la coagulación sanguínea y prevenir hemorragias, por ejemplo, (1) productos sanguíneos derivados de humanos, como el col�geno fibrilar, pegamento de fibrina y concentrados de complejo protrombina; (2) proteínas humanas recombinantes; (3) fármacos antifibrinol�ticos, tales como ácido aminocaproico, ácido tranex�mico; y (4) agentes hemost�ticos locales inorgánicos, tales como superficies de caolín y sílice.

Se ha informado de las siguientes limitaciones críticas:

(1)

Administración intravenosa

(2)

Requerimiento de un dispositivo especial para la administración

(3)

Enfoque terapéutico estrecho

(4)

Tratamiento molesto o inapropiado a ser administrado en episodios de sangrado específicos

(5)

Carencia de efecto agudo

(6)

Inestabilidad del coágulo de fibrina

(7)

Efectos secundarios muy peligrosos

(8)

Tratamiento caro

Productos sanguíneos derivados de humanos (factores de coagulación y concentrados plaquetarios)

El tratamiento que siempre se debe administrar de forma intravenosa es muy caro y est� poco disponible. Tiene un enfoque terapéutico muy estrecho, es sólo útil para tratar su deficiencia específica. No es adecuado para el tratamiento t�pico de cualquier episodio de sangrado. No es útil para tratar con agudeza una hemorragia porque requiere protocolos de administración prolongada para que sea eficaz y, sobre todo, es un tratamiento muy peligroso: el 20% de los pacientes hemofílicos han desarrollado hepatitis, 5% HIV, y hasta el 15% presentan anticuerpos plasm�ticos contra FVIII o FIX (hemofilia adquirida) que requiere tratamientos de sustitución muy caros y especiales (inmunosupresores, altas dosis de factores de coagulación, plasmaf�resis, etc.). Por estas razones, las organizaciones de salud pública (WHO, FDA, EMEA, etc.) est�n muy interesadas en el desarrollo de nuevos agentes hemost�ticos mejor que los concentrados de factor de coagulación.

Agentes hemost�ticos locales

Es un tratamiento caro, inapropiado para ser administrado en algunos episodios de sangrado (es decir, epistaxis), molesto para el tratamiento dental, forma un coágulo de fibrina inestable, y como concentrados de factor de coagulación tienen los mismos efectos secundarios peligrosos potenciales. No deberían usarse en pacientes que nunca han recibido productos sanguíneos derivados de humanos o aquellos que est�n recibiendo tratamiento con FIX o FVIII recombinantes debido al riesgo potencial de trasmisión viral humana.

Prote�nas recombinantes humanas

Es el tratamiento más caro (un coste medio de 6.000 euros) sólo disponible para los países desarrollados. Como concentrados de factor de coagulación, siempre debe ser administrado intravenosamente, tiene un enfoque terapéutico muy estrecho porque es sólo útil para tratar su deficiencia específica, es inapropiado para tratar típicamente hemorragias, no es útil para tratar con agudeza una hemorragia porque también requiere protocolos de administración prolongados para ser efectivo y, aunque no se ha informado de trasmisión viral humana, se ha descrito el mismo porcentaje de hemofilia adquirida (hasta el 15% presentan anticuerpos anti FVIII o FIX). Como concentrados de factor de coagulación, las autoridades públicas limitan mucho su uso.

F�rmacos antifibrinol�ticos

Tienen un estrecho enfoque terapéutico, siendo esta su limitación más relevante. Estos fármacos requieren formación previa del coágulo de fibrina para ser efectivos. Por lo tanto, son sólo útiles en sujeto sanos, sin embargo cuando el coágulo de fibrina se forma de manera inapropiada (es decir, coagulopat�as congénitas, tales como hemofilia, deficiencia de FVII) su eficacia terapéutica disminuye dramáticamente. Además, no son útiles para tratar de forma aguda una hemorragia porque también requieren protocolos de administración prolongados para ser efectivos.

Agentes hemost�ticos locales inorgánicos

La restricción más importante para el uso de estos agentes hemost�ticos es que son inapropiados para ser administrados en muchos tipos de hemorragias, tal como epistaxis, dental y quirúrgica. Además, se ha informado de una reacción exot�rmica dolorosa, que reduce de manera significativa su uso solo para el sangrado mucocut�neo en situaciones críticas (guerras).

En conclusión, sorprendentemente hoy en día todavía no se dispone de fármacos útiles para el tratamiento t�pico de un simple episodio de epistaxis o de un sangrado gingival dental después del cepillado dental o simplemente ante una herida cotidiana producida por el afeitado, por la punci�n venosa en una extracción sanguínea, o por la herida de una caída fortuita en el calle. El problema se agudiza aún más en el caso de pacientes con di�tesis hemorrágicas, por ejemplo, con coagulopat�as congénitas del tipo de hemofilia o de la enfermedad de von Willebrand o pacientes con alteraciones plaquetarias congénitas, del tipo de la Enfermedad de Glanzmann o del Síndrome de Bernard-Soulier, o coagulopat�as adquiridas. Estos pacientes tienen serios problemas para afrontar el día a día, y ante una sencilla extracción dental o ante cualquier pequeño trauma que ocasione una herida sangrante, no disponen de ningún tratamiento m�dico que les mejore su calidad de vida. Evidentemente el problema se transforma en otro mucho mayor cuando estos pacientes sufren un trauma externo o un accidente sangrante grave ya que su vida corre un serio peligro. Ante todas estas situaciones tan solo se dispone, como herramienta farmacol�gica, de la administración de plasma humano que contiene factores deficientes o el factor recombinante humano específico para cada factor de coagulación. Todas estas terapias comportan la utilización de la vía parenteral y, por tanto, no est�n ideadas para ser utilizadas con elevada frecuencia, como debería de ser, por ejemplo ante cualquier sangrado cotidiano de leve o moderada importancia. Finalmente, est� ampliamente aceptado que nuevos agentes hemost�ticos locales sin las limitaciones previamente descritas, representarán una mejora significativa del presente tratamiento que reducir� tanto el coste como la alta prevalencia de los efectos secundarios.

3. Antecedentes de la invención

Hasta ahora se ha aceptado que el FT es el principal elemento responsable de desencadenar la coagulación sanguínea. Para el comienzo de la coagulación, es absolutamente necesaria la activación del FX a FXa para comenzar la hidrólisis de protrombina. La fuente de este FXa ha sido atribuida principalmente a la interacción del FVIIa con su receptor, FT. Aunque se ha descrito que FXa est� presente en los gránulos plaquetarios y que puede estar expuesto en la superficie cuando tiene lugar su activación, las concentraciones fisiológicas de FXa (<150 pM) presentes en sangre son insuficientes para comenzar la formación de trombina, incluso en presencia de su cofactor, FVa y de una superficie procoagulante plaquetaria (figura 1). Por tanto, actualmente se acepta que la coagulación puede comenzar solo cuando las concentraciones basales de FXa se incrementan de manera significativa. La fuente del incremento de las concentraciones basales de FXa se ha atribuido siempre a ambos, el complejo FT::FVIIa y las actividades proteol�ticas de FIXa (figura 2).

Prote�nas recombinantes de FT lipidado solo han sido capaces de acelerar la coagulación en condiciones in vitro, tanto en muestras de sangre hemofílica como sana, atribuyendo esta acción al papel clásico asignado al FT como receptor de FVIIa. Sin embargo, en las mismas condiciones experimentales, el FT no lipidado ha demostrado ausencia completa de efecto, lo que indica que la lipidaci�n es necesaria para alcanzar la funcionalidad del FT (apartado 6.1 de los resultados).

Nunca se ha descrito el uso del FT lipidado como agente hemost�tico t�pico como tratamiento único para sangrados letales, severos o leves (hemorragias quirúrgicas venosas o arteriales y traumáticas).

La patente europea EP266993 describe el uso del FT no lipidado como agente hemost�tico para el tratamiento parenteral de síndromes hemorrágicos. Sin embargo, la misma patente describe las diferencias importantes en actividad entre el FT no lipidado reivindicado por EP266993 y el FT lipidado objeto de la presente solicitud de patente.

De hecho, es bien conocido que el FT lipidado es activo en condiciones in vitro y su administración parenteral inicia inmediatamente la coagulación intravascular diseminada con fatales consecuencias. Por el contrario, el FT no lipidado no es activo en condiciones in vitro, sin embargo se ha reivindicado (EP266993) para el tratamiento de coagulopat�as por administración parenteral.

Hasta la fecha, no hay datos sobre el efecto de ambos, el FT lipidado y no lipidado en el tratamiento t�pico individual de episodios de sangrado. En la presente solicitud de patente, usando el modelo de transecci�n de cola de rata, los inventores han demostrado que el FT no lipidado era incapaz de detener el sangrado. Por el contrario, los inventores han demostrado por primera vez que el FT lipidado es un agente hemost�tico útil en el tratamiento t�pico de todo tipo de hemorragias, que incluyen condiciones patológicas (animales tratados con heparina y warfarina) y saludables (ratas control sin alteración de la coagulación). En conjunto, indica que el FT lipidado y no lipidado son compuestos claramente diferentes. Como consecuencia, el uso de FT lipidado como un agente para el tratamiento t�pico individual de hemorragias no es obvio para el experto en la materia.

Por otro lado, EP266993 se llev� a cabo según el estado de la técnica que postula que la FVII serinproteasa se activa solo cuando se une a su receptor, FT. Por tanto, según EP266993 y el estado de la técnica, cuando FVII/FVIIa no est� presente, el FT no debe estar activo. No era obvio pensar para cualquier experto en la materia que el FT (lipidado y no lipidado) podía ser efectivo en el tratamiento de pacientes deficientes en FVII. Los inventores han descubierto que incluso en ausencia de FVIIa, FT actúa como cofactor para FXa. Este descubrimiento es fundamental para comprender que el FT no lipidado también puede actuar como agente hemost�tico parenteral para hemorragia en pacientes deficientes en FVII.

La solicitud de patente internacional WO94/02172 enseña que la inhibición temporal de uno o más anticoagulantes naturales mediante administración sist�mica de un inhibidor de un anticoagulante natural (un anticuerpo) puede inhibir el sangrado microvascular. Opcionalmente, el inhibidor puede administrarse en combinación con una administración típica de trombina o FT lipidado. Es importante señalar que el uso de ambos compuestos fue siempre como tratamientos adyuvantes opcionales y nunca como tratamiento individual. Además, WO94/02172 reivindica el uso de estos tratamientos sin�rgicos solo en el sangrado capilar (sangrado microvascular, es decir, quemaduras, superficies viscerales inflamadas, superficie de hígado sangrante…) y nunca para hemorragias letales

o severas causadas por trauma externo o cirugía que implican daño venoso y arterial. Sin embargo, los inventores de WO94/02172 admiten que, aunque observaron un efecto sin�rgico cuando administraron típicamente trombina en combinación con el tratamiento sist�mico, no se observ� dicho efecto sin�rgico cuando se administraba FT de manera típica (WO94/02172, figura 3 y página 22, líneas 14-15). Además, la dosis reivindicada en WO94/02172 es muy alta, de 0,1 a 10 mg.

Contrariamente a WO94/02172, la presente solicitud de patente est� reivindicando el tratamiento individual de hemorragia venosa o arterial leve/moderada a severa/letal con únicamente FT lipidado mostrando ejemplos en los que tal tratamiento es efectivo a una dosis de proteína activa de 1,2 μg/ml para hemorragias traumáticas (ver modelo severo en tablas 24 y 25). Tal tratamiento sorprendente y extraordinariamente efectivo no ha sido descrito hasta ahora porque no era obvio para cualquier experto en la materia que el FT lipidado actúe como estimulador de la actividad proteol�tica de FXa. Los inventores han descubierto que en ausencia del FVIIa, el FT actúa como cofactor para FXa, incluso en ausencia de su bien conocido cofactor, FVa. Este descubrimiento es fundamental para comprender que el FT lipidado solo puede actuar como agente hemost�tico de hemorragias severas en condiciones patológicas y saludables.

La patente US 4.721.618 enseña que la mezcla sin�rgica de fosfol�pidos (PCPS) y FXa administrada de forma intravenosa a altas concentraciones (0,2 a 0,5 U/Kg) puede circunvalar el Factor VIII: deficiencia C en un mamífero hemofílico, de forma que el proceso en cascada de la coagulación sanguínea puede continuar. Las altas concentraciones sugeridas de FXa son activas sin la necesidad de vesículas de lípidos PCPS (que pueden elevar esta actividad). También, WO02/086118 enseña que composiciones que incluyen una mezcla de al menos un fosfol�pido específico y al menos un factor de coagulación sanguínea activado por serinprotesa son útiles en el tratamiento de alteraciones de la coagulación sanguínea que disminuyen la necesidad de administrar factores de coagulación sanguíneos.

Adem�s, el ácido el�gico y otros aceleradores tales como zeolita, sílice y materiales óxido inorgánicos se han usado para aumentar la coagulación sanguínea y son reivindicados en WO02/30479.

Seg�n WO02/086118, un factor de coagulación se define como un factor de coagulación sanguínea activado por serinproteasa (página 5, líneas 13-15). Por tanto, el FT no puede ser considerado como un factor de coagulación sanguínea, porque el FT no es una ser�nproteasa, sino un receptor de superficie celular específico para el factor VIIa.

La solicitud de patente internacional publicada WO2006/004675 se refiere a un factor tisular de mamífero recombinante producido en plantas y su uso en el tratamiento o prevención de pérdida de sangre. En el ejemplo 6 de la solicitud se usan el FT recombinante humano producido en E. coli (rhTF243) y la rhTF263 producida en lechuga en la hemostasis típica practicada en cerdos.

En la presente solicitud de patente los inventores han demostrado que los fosfol�pidos (fosfatidilserina y fosfatidilcolina a diferentes porcentajes y molaridades) no incrementan el efecto procoagulante mediado por el FT lipidado (tabla 21).,lo que indica que el efecto sin�rgico reivindicado por la patente US 4.721.618 y WO02/086118 es exclusivo para factores de coagulación sanguínea activados por ser�nproteasa, pero no para receptores de membrana como el FT. Sorprendentemente, cuando el FT lipidado s combinaba simultáneamente con superficies inorgánicas cargadas negativamente (SICN) se observaba un efecto sin�rgico significativo en condiciones experimentales in vivo e in vitro. El SICN usado en esta descripción est� constituido por una mezcla de lípidos y un acelerador de la coagulación sanguínea, el ácido el�gico. Los lípido tienen carga neta negativa, lo que significa que la mezcla lip�dica puede incluir lípido neutros o zwiter�nicos, pero debe contener una cierta cantidad de lípidos cargados negativamente que confieran carácter ani�nico a la mezcla. A modo ilustrativo, no limitativo, ejemplos de lípidos cargados negativamente pueden ser esfingol�pidos (tales como ceramida-1-fosfatos, fosfatidiletanolamina glicosilada, sulfatidos hidroxilados o no hidroxilados, gangli�sidos) y lípidos basados en glicerol (tales como fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilinositol fosfato, ácidos fosfat�dicos, fosfatidilgliceroles, cardiolipinas). Comercialmente hay disponibles SICN tales como Dade� Actin� (Dade Behring) marca, por ejemplo, DADE� Actin� FS.

En conclusión, la presente solicitud de patente describe un nuevo agente hemost�tico local caracterizado por las siguientes ventajas respecto a los fármacos disponibles comercialmente:

(1)

F�cil administración típica

(2)

No requiere dispositivos especiales para su administración típica

(3)

Enfoque terapéutico amplio (d�ficits de FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII y FXIII)

(4)

Tratamiento apropiado para ser administrado en todos los episodios de sangrado (epistaxis, sangrado dental, mucocut�neo, hemorragias quirúrgicas y traumáticas)

(5)

Ejerce un efecto agudo potente

(6)

Formaci�n del coágulo de fibrina fisiológico (extrema estabilidad del coágulo)

(7)

Sin efectos secundarios

(8)

Tratamiento de bajo coste

La principal meta de WHO, FDA, EMEA y otras autoridades de salud públicas es reducir los peligrosos efectos secundarios asociados al consumo de productos sanguíneos derivados de humanos. La presente invención ha sido diseñada para cubrir estas necesidades.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

El papel asignado al complejo FT::FVIIa en la coagulación es ampliamente conocido. El complejo FT::FVIIa actúa como sustrato de forma que tiene lugar la activación de FX. Estudios recientes han permitido identificar que los residuos de Lisina 165 y Lisina 166 del FT interaccionan con el dominio Gla de FX, en las formas tanto activada como no activada. Contrariamente al complejo FT:FVIIa, poco se sabe de la interacción de FT con FX y FXa. únicamente se ha descrito que el FT puede actuar como estimulador de FXa para la activación de FVII. Estos es, la unión de FXa a FT estimularía la activación de FVII lo cual, sucesivamente, incrementar� la activación de FX.

Los inventores han descubierto que el papel de FT como estimulador de FXa es mucho más relevante, llegando a ser crítico para la hemostasis (figura 3). Es bien conocido que FXa a concentraciones picomolares es incapaz de producir un efecto en la coagulación y la agregación plaquetaria. A pesar del papel aceptado de FT como receptor de membrana para FVII, los inventores han demostrado que el FT actúa también como estimulador de FXa para incrementar su principal actividad proteol�tica, la hidrólisis de protrombina, llevando a la formación del coágulo de fibrina.

Sorprendentemente, en presencia del FT (es decir, administración ex�gena o por lesión), FXa a concentraciones picomolares, causa la hidrólisis de la protrombina, llevando a la formación del coágulo de fibrina, incluso en ausencia de su ligando, FVII/FVIIa. Los resultados globales, indican que el FT actúa como estimulador de FXa, y la unión específica de FXa al FT es el primer paso que desencadena la coagulación sanguínea. Los datos de los inventores sugieren que la rapidez con la que tiene lugar la coagulación es dependiente de la interacción entre el FT y en todas las formas previamente descritas de FXa.

En presencia de concentraciones fisiológicas de FXa (<150 pM) incapaces por s� mismas de iniciar la coagulación, el FT lipidado es capaz de iniciar rápidamente la formación de trombina como resultado de su acción como un cofactor.

Sorprendentemente, estos efectos hemost�ticos son independientes de la presencia de FVII y FVIIa, por lo que el efecto procoagulante mediado por el complejo end�geno FT::FXa (FXa < 150 pM) es especialmente útil y relevante en muestras deficientes en Factor VII. No obstante, también se han observado efectos hemost�ticos potentes en muestras de pacientes con defectos congénitos de otros factores de coagulación como son: FVIII (hemofilia A), FIX (hemofilia B), FXI (hemofilia C), FV, FX, FXII y FXIII as� como en individuos con alteraciones congénitas plaquetarias, tales como el síndrome de Bernard Soulier y la enfermedad de Glanzmann y alteraciones trombocitop�nicas.

Por tanto, la presente invención se basa en el uso del FT lipidado, solo o en combinación con FXa y/o con SICN, como un nuevo estimulador del FXa, útil en el tratamiento t�pico de hemorragias presentes en individuos sanos y en pacientes con di�tesis hemorrágica.

Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un FT lipidado, o un fragmento funcional del mismo, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento t�pico de hemorragias en un sujeto, con la condición que:

(i)

el FT lipidado no es un FT de mamífero recombinante o un fragmento funcional del mismo obtenido de plantas transg�nicas, y

(ii)

el FT lipidado no es un FT lipidado que tiene un 70% de PC y un 30% de PS y que comprende un FT producido en E. coli que tiene la secuencia

En otro aspecto, la invención se relaciona con un producto que comprende FT lipidado solo o en combinación con FXa y/o SICN. El uso de dicho producto como medicamento o en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de hemorragias en un sujeto constituye un aspecto adicional de esta invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un complejo formado por FT lipidado y un compuesto seleccionado entre FXa, una SICN y combinaciones de ambos. El uso de dicho complejo como medicamento o en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de hemorragias en un sujeto constituye un aspecto adicional de esta invención.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un FT lipidado, junto con un portador farmac�uticamente aceptable. En una realización particular, dicha composición farmacéutica comprende, además, FXa y/o una SICN.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un producto que comprende dicha composición farmacéutica y un soporte. En una realización particular, dicha composición farmacéutica comprende, además, FXa y/o una SICN.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 es una representación esquemática que muestra las concentraciones basales de FXa y la formación del coágulo de fibrina.

La figura 2 es una representación esquemática que muestra las vías intrínseca y extrínseca clásicas de la coagulación sanguínea.

La figura 3 es una representación esquemática que muestra el nuevo efecto regulador del FT lipidado como estimulador del FXa según la presente invención.

DESCRIPCI�N DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los hallazgos aquí descritos demuestran, por primera vez, que el FT lipidado en ausencia de su ligando, FVII/FVIIa, actúa como estimulador de FXa provocando que esta enzima inicie la hidrólisis de la protrombina y, en consecuencia, tenga lugar la coagulación. Este nuevo mecanismo de acción tiene especial relevancia en niveles de concentración de FXa muy bajos (por debajo de los considerados como fisiológicos 150 pM). Es bien conocido que existen determinadas enfermedades plaquetarias que cursan con alteraciones en la agregación plaquetaria y mayor tendencia a presentar episodios hemorrágicos. En consecuencia, el FT lipidado administrado ex�genamente no solo es útil en las coagulopat�as congénitas sino que, además, permitir� la hemostasia en las alteraciones plaquetarias congénitas y adquiridas, tales como la enfermedad de Glazmann, el síndrome de Bernard-Soulier y alteraciones trombocitop�nicas.

La rapidez con la tiene lugar la coagulación no es, por tanto, dependiente de la formación del complejo FT::FVIIa y la consecuente activación de FX, tal y como se ha postulado hasta la fecha, sino la interacción de FT y FXa a concentraciones basales fisiológicas (<150 pM). La consecuencia biológica más relevante de la formación de esta interacción es la generación rápida del inicio de la coagulación y que ésta solo requiere de la presencia de FXa a concentraciones fisiológicas presentes en sangre y de la interacción con su estimulador, el FT. El proceso se ver� amplificado inmediatamente, gracias a la acción de la trombina inicialmente formada por el complejo y a la mayor producción de FXa ya sea por el complejo FT::FVIIa o por la misma trombina.

Por tanto, los hallazgos de los inventores ponen de manifiesto claramente que en ausencia de FVIIa y en presencia de FXa a concentraciones fisiológicas (< 150 pM) incapaces por s� mismas de iniciar la coagulación, el FT lipidado inicia rápidamente la formación de trombina gracias a que su nueva acción como cofactor del FXa, promoviendo el inicio de la hidrólisis de la protrombina. Por otra parte, los hallazgos de los inventores demuestran que el FT lipidado y el FXa a bajas concentraciones (que no son eficaces por s� mismas de ejercer efectos antihemorr�gicos), cuando son administrados conjuntamente son capaces de causar rápidamente el inicio de la formación del coágulo de fibrina. Los efectos observados con las combinaciones FT::FXa, en concreto con una concentración de FXa <150 pM, son mucho mejores que los detectados cuando se administra solo el FT lipidado. La combinación de FXa y FT lipidado con SICN puede incrementar el efecto hemost�tico incluso más. Los resultados obtenidos apoyan la idea de que en presencia de concentraciones basales de FXa presentes en el plasma (<150 pM), incapaces de generar por s� mismas la respuesta procoagulante inicial, ésta tiene lugar cuando FT actúa como estimulador del FXa.

En consecuencia, el FT lipidado, solo o en combinación con FXa y/o SICN, se puede utilizar como nuevos agentes hemost�ticos t�picos útiles en el tratamiento de las hemorragias presentes tanto en individuos sanos como en pacientes que padecen di�tesis hemorrágica, con la condición que:

(i)

el FT lipidado no es un FT de mamífero recombinante o un fragmento funcional del mismo obtenido de plantas transg�nicas, y

(ii)

el FT lipidado no es un FT lipidado que tiene un 70% de PC y un 30% de PS y que comprende un FT producido en E. coli que tiene la secuencia

I. Uso del FT lipidado en el tratamiento t�pico de hemorragias

Los inventores han encontrado, sorprendentemente, que el FT lipidado aumenta la actividad proteol�tica del FXa y, en consecuencia, la producción de trombina [véase el apartado 1 de los Resultados del Ejemplo que acompaña a esta descripción]. Los inventores también han observado que el FT lipidado coagula el plasma y la sangre de sujetos sanos y de pacientes deficitarios en factores de coagulación, incluyendo deficitarios en FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII y FXIII, as� como en pacientes con anticoagulaci�n (mediante tratamientos anticoagulantes con fármacos como heparina, heparinas de bajo peso molecular o derivados de coumar�nicos, siendo estos ejemplos no limitativos) tanto in vitro [véanse apartados 1 a 5 de los Resultados del Ejemplo que acompaña a esta descripción] como in vivo [véanse apartados 6 y 7 de los Resultados del Ejemplo que acompaña a esta descripción]. Además, los inventores han encontrado que el FT lipidado coagula la sangre de pacientes afectados por alteraciones plaquetarias [véase el apartado 5 de los Resultados del Ejemplo que acompaña a esta descripción]. Estos resultados ponen de manifiesto que el FT lipidado es un agente antihemorr�gico útil para el tratamiento t�pico de hemorragias en un sujeto.

Teniendo en cuenta el estado de la técnica, no resulta obvio pensar en el FT como un tratamiento individual t�pico procoagulante en sujetos sanos o pacientes hemofílicos (deficientes en FVIII, FIX y FXI), con la condición que:

(i)

el FT lipidado no es un FT de mamífero recombinante o un fragmento funcional del mismo obtenido de plantas transg�nicas, y

(ii)

el FT lipidado no es un FT lipidado que tiene un 70% de PC y un 30% de PS y que comprende un FT producido en E. coli que tiene la secuencia

Era improbable pensar en pacientes deficientes en FVII porque el complejo FT-FVII no puede ensamblarse; en pacientes deficientes en FV o FX porque el complejo protrombinasa no puede ensamblarse; y en pacientes heparinizados porque la trombina y FXa est�n bloqueados por antitrombina III, y en pacientes tratados con warfarina porque la síntesis de todos los factores de coagulación dependientes de vitamina K (FVII, FIX y FX) est�n inhibidas.

Por tanto, en un aspecto, la invención va dirigida al uso del FT lipidado, o un fragmento funcional del mismo lipidado, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento t�pico de hemorragias en un sujeto, con la condición que:

(i)

el FT lipidado no es un FT de mamífero recombinante o un fragmento funcional del mismo obtenido de plantas transg�nicas, y

(ii)

el FT lipidado no es un FT lipidado que tiene un 70% de PC y un 30% de PS y que comprende un FT producido en E. coli que tiene la secuencia

El FT es una glicoprote�na integral de membrana ampliamente distribuida en el reino animal. La proteína FT presenta una estructura en dominios, es decir, es una proteína con regiones funcionales independientes. Cada uno de los dominios de la apoprote�na del FT humano presenta unas características estructurales y funcionales únicas:

(1)

un p�ptido señal o una región con una secuencia líder de 32 amino�cidos que se procesa posttraduccionalmente al procesarse la proteína de la forma inmadura a la forma madura; (2) un dominio extracelular hidrof�lico N-glicosilado que comprende aproximadamente 219 amino�cidos terminales; (3) un fragmento de aproximadamente 23 amino�cidos, principalmente hidrófobos, que se cree son los amino�cidos del dominio transmembrana; y (4) el extremo carboxilo de 21 amino�cidos, que se cree son los amino�cidos que forman parte del fragmento citoplasmático de la proteína. Esta estructura en dominios que presenta la proteína del FT humano permite la producción de, por ejemplo, el dominio extracelular de la proteína o fragmentos funcionales de la misma. La secuencia de amino�cidos de la proteína del FT humano es conocida y puede ser consultada en bases de datos de proteínas tales como, por ejemplo, NCBI (FT humano, N� de acceso: P13726).

El término “FT lipidado”, tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier fuente de FT, siendo este FT total o parcialmente insertado en vesículas lip�dicas o membranas celulares. Ejemplos ilustrativos, no limitantes de fuentes de “FT lipidado” son: extractos que contienen FT lipidado (cuyo aislamiento puede llevarse a cabo a partir de varios tejidos como cerebral, placenta y tejido pulmonar, tejido de diferentes animales tales como ovejas, vacas, conejos, perros, seres humanos, etc.); componente proteico de FT purificado y (re)lipidado (purificado a partir de un extracto o a partir de un FT recombinante), es decir, que se le ha añadido el componente lip�dico tras su purificación y que puede prepararse, a modo de ejemplo ilustrativo, no limitativo, según el protocolo descrito previamente por Morrisey [véase el Ejemplo que acompaña a esta descripción]. En dicho protocolo, el FT no lipidado se incorpora dentro de vesículas de fosfol�pidos usando un detergente no iónico, tal como por ejemplo, N-octil-beta-D-glucopiran�sido. Los lípidos que pueden ser utilizados en el FT lipidado según la invención pueden tener cualquier origen (animal, vegetal

o sintético). Prácticamente cualquier lípido puede ser utilizado en la elaboración del FT lipidado de la presente invención. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de lípidos que pueden utilizarse en la elaboración del FT lipidado incluyen fosfol�pidos (tales como fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, etc.) esfingol�pidos (tales como ceramida, esfingosina-1-fosfato, ceramida inositolfosfato, ceramida manosil-inositolfosfato, ceramida manosildiinositolfosfato, etc.), fosfatidilinositol (tales como L-a-fosfatidilinositol, L-a-lisofosfatidilinositol, etc.) y fosfatos de fosfatidilinositol (tales como L-a-[fosfatidilinositol-4-fosfato], 1,2-dioctanol-sn-glicero-3-[fosfatidilinositol-3,4,5trifosfato], etc.). La relación (molar, ponderal o volumétrica) componente proteico del FT: lípido puede variar en un amplio intervalo, por ejemplo, de aproximadamente 1:50.000 a 1:3.000 aproximadamente.

El término FT, tal como aquí se utiliza incluye variantes y mutantes del FT tipo salvaje que mantienen, al menos, una de las funciones del FT tipo salvaje, ventajosamente, al menos una de las funciones del FT tipo salvaje relacionadas con la coagulación.

En una realización particular, el FT lipidado utilizado para la puesta en práctica de la invención es FT humano lipidado y consiste en el FT obtenido a partir de extractos de tejido; o consiste en el componente proteico purificado de extractos de tejido e insertados en un componente lip�dico (con una relación molar proteína:lípido de alrededor de 1:8700; o consiste en FT recombinante (FTr) obtenido por un proceso como el descrito, solo como ejemplo ilustrativo, pero no limitativo, en la patente US 6.261.803. La obtención de extractos y purificación del FT puede realizarse a partir de varios tejidos tal como, cerebro, placenta y pulmón, y de diferentes animales, tales como, oveja, ternera, conejo, perro, humanos, etc.

El término “fragmento funcional del FT lipidado” tal como se utiliza en esta descripción incluye, aunque no se limita a, derivados pept�dicos del FT, en particular, del componente proteico del FT, incluyendo mutantes y variantes del componente proteico del FT tipo salvaje, que mantienen una o más de las funciones del FT, preferentemente funciones relacionadas con la coagulación, por ejemplo la capacidad de unirse al FXa y/o a SICN y desarrollar su función antihemorr�gica y formadora de vasos durante la cicatrización de heridas. La secuencia de amino�cidos de dicho fragmento funcional de FT puede ser idéntica a la de un fragmento del componente proteico del FT tipo salvaje

o puede presentar inserciones, deleciones o modificaciones de uno o más amino�cidos, con la condición de que conserven al menos una de las funciones del FT tipo salvaje, ventajosamente, al menos una función relacionada con la coagulación. Por simplicidad, el término “FT lipidado”, tal como aquí se utiliza, incluye cualquier fragmento funcional del FT lipidado.

El componente proteico del FT utilizado en la puesta en práctica de la presente invención puede, además, formar parte de una proteína de fusión. En este sentido, dicha proteína de fusión puede contener una región A, constituida por la proteína de FT o por un fragmento funcional de dicha proteína de FT, unida a una región B constituida por otro fragmento del FT. Dicha región B est� unida a la región amino-terminal de dicha proteína del FT o de dicho fragmento de la proteína de FT, o bien, alternativamente, dicha región B puede estar unida a la región carboxiloterminal de dicha proteína de FT o de dicho fragmento de la proteína del FT. Ambas regiones A y B pueden estar unidas directamente o a través de un polip�ptido espaciador (linker) entre dichas regiones A y B. La proteína de fusión puede obtenerse bien por síntesis química o bien mediante la expresión g�nica de la secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína de fusión en células hospedadoras apropiadas.

El término “tratamiento t�pico”, tal como aquí se utiliza, se refiere a la aplicación del tratamiento directamente en el lugar donde es necesario, por ejemplo, en secciones discontinuas de la piel (cortes, etc.), y de tejido vascular (ruptura de vasos, etc.).

De acuerdo con la presente invención, y tal como se demuestra en el Ejemplo que acompaña a la presente descripción, el FT lipidado actúa como estimulador del FXa , aumentando su actividad proteol�tica, y, en consecuencia, la producción de trombina y, por tanto, puede ser utilizado para tratar o corregir trastornos hemorrágicos, en particular, aquellas alteraciones hemorrágicas asociadas con la di�tesis hemorrágica.

El término “di�tesis hemorrágica” se refiere al proceso que causa una alteración en la hemostasia y que, como consecuencia de ello, da lugar a la aparición de un síndrome hemorrágico que puede cursar, en ocasiones, con sangrados prolongados y excesivos. La di�tesis hemorrágica puede ser producida por una coagulopat�a congénita o adquirida y/o por una alteración plaquetaria congénita o adquirida.

El término “coagulopat�a” se refiere a una alteración de los factores de la coagulación. Esta alteración puede ser debida a una deficiencia o carencia específica de un factor de coagulación específico, cuya consecuencia ser� la aparición de un síndrome hemorrágico, o por una alteración en un factor de la coagulación. En general, la coagulopat�a puede ser una coagulopat�a congénita o una coagulopat�a adquirida.

Como ejemplos ilustrativos, no limitativos, de coagulopat�as congénitas pueden citarse las deficiencias en factores de coagulación seleccionados de FV, FVII, FVIII FIX, FX, FXII, FXIII y sus combinaciones.

Las coagulopat�as adquiridas pueden tener diversos orígenes. Ejemplos ilustrativos incluyen d�ficit de síntesis de factores de coagulación en la insuficiencia hepática grave, terapia anticoagulante (tal como heparina, heparinas de bajo peso molecular, warfarina, derivados de coumarina, dicoumarinas, etc.). Un mecanismo alternativo se basa en un consumo exagerado de los factores de coagulación de manera que ante una lesión sangrante no se dispone de ellos para formar el coágulo. Este mecanismo se da en el síndrome de coagulación intravascular diseminada o coagulopat�a por consumo que aparece en múltiples enfermedades tales como en sepsis severa que daña el endotelio de la microcirculaci�n activando las plaquetas y los factores de la coagulación con formación de múltiples microtrombos; en la invasión sanguínea por FT tal como en el desprendimiento placentario; en la retención de un feto muerto; en los politraumatismos con aplastamiento de tejidos; en las mordeduras de serpientes venenosas, etc. En las vasculitis, el daño parietal y endotelial libera activadores de la coagulación. El consumo de factores de coagulación se ve agravado por la lisis de la fibrina de numerosos microtrombos por acción de la plasmina con liberación de PDF que son antiplaquetarios y anticoagulantes.

El término “alteración plaquetaria” se refiere a una alteración, tanto en el número como en la funcionalidad, de las plaquetas, cuya consecuencia es la aparición de un síndrome hemorrágico. Dicha alteración plaquetaria puede ser congénita o adquirida.

En una realización particular, dicha alteración plaquetaria es una alteración plaquetaria congénita. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de alteraciones plaquetarias congénitas incluyen la enfermedad de Glanzamnn, el síndrome de Bernard Soulier, el síndrome de Bolin-Jamieson, el síndrome de Wiskott-Aldrich, el síndrome de ParisTrousseau-Jacobsen, la trombocitopenia del cromosoma X, el síndrome plaquetario de Gray, el síndrome de Sebastián y la anemia de Fanconi.

En otra realización particular, dicha alteración plaquetaria es una alteración plaquetaria adquirida. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de alteraciones plaquetarias adquiridas incluyen trastornos mieloproliferativos, tales como trombocitemia, policitemia, leucemia mieloc�tica crónica, etc.; en la metaplasia mieloide existen trastornos funcionales de las plaquetas con aumento del tiempo de sangrado, defectos de retención en perlas de vidrio, defecto de agregación plaquetaria, liberación anormal y defecto del factor III plaquetario. Se han hallado defectos funcionales plaquetarios en las disproteinemias en el escorbuto, y en la enfermedad cardíaca congénita y en la cirrosis.

El término “coagulopat�a adquirida” y “alteración plaquetaria adquirida” se refieren al origen de la alteración, que puede ser iatrog�nica o secundaria a otra enfermedad.

El término “sujeto”, tal como aquí se utiliza, incluye a cualquier miembro de una especie animal, incluida la especie humana; a modo ilustrativo, no limitativo, dicho sujeto puede ser un mamífero, tal como un primate, un animal doméstico, un roedor, etc., preferentemente, dicho sujeto es un hombre o una mujer de cualquier edad y raza. En una realización particular, dicho sujeto es un ser humano sin historial de alteraciones de la hemostasia, tal como un individuo que no presenta coagulopat�as ni alteraciones plaquetarias. En otra realización particular, dicho sujeto es un ser humano que presenta una historial de alteraciones de la hemostasia, tal como un individuo que presenta una di�tesis hemorrágica, por ejemplo, una coagulopat�a, tal como una coagulopat�a congénita o adquirida, o bien una alteración plaquetaria, tal como una alteración plaquetaria congénita o adquirida.

Por tanto, en una realización concreta, la invención se relaciona con el uso del FT lipidado, con la condición que:

(i)

el FT lipidado no es un FT de mamífero recombinante o un fragmento funcional del mismo obtenido de plantas transg�nicas, y

(ii)

el FT lipidado no es un FT lipidado que tiene un 70% de PC y un 30% de PS y que comprende un FT producido en E. coli que tiene la secuencia

en la elaboración de un medicamento para el tratamiento t�pico de hemorragias en un ser humano sin historia de alteraciones de la hemostasia. En otra realización particular, la invención se relaciona con el uso del FT lipidado, con la condición que:

(i)

el FT lipidado no es un FT de mamífero recombinante o un fragmento funcional del mismo obtenido de plantas transg�nicas, y

(ii)

el FT lipidado no es un FT lipidado que tiene un 70% de PC y un 30% de PS y que comprende un FT producido en E. coli que tiene la secuencia

en la elaboración de un medicamento para el tratamiento t�pico de hemorragias en un ser humano que presenta una di�tesis hemorrágica.

Para su administración al sujeto, el FT lipidado se formular� en una forma farmacéutica adecuada para su administración por vía típica para el tratamiento t�pico (local) de hemorragias. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas formas farmacéuticas incluyen aerosoles, soluciones, suspensiones, emulsiones, geles, pomadas, cremas, apósitos, parches, ungüentos, colutorios, etc. Para ello, la formulación farmacéutica que comprende FT lipidado incluir� los portadores y excipientes farmac�uticamente aceptables necesarios para la elaboración de la forma farmacéutica de administración elegida (para una mayor información véase el apartado relativo a la “Composición farmacéutica” de la presente descripción).

La dosis de FT lipidado a administrar al sujeto puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre 0,01 μg de proteína activa/ml y 100 μg de proteína activa/ml aproximadamente. La dosis de FT lipidado a administrar depender� de numerosos factores, entre los que se incluyen las características de la proteína FT empleada, como por ejemplo, su actividad y vida media biológica, la concentración de la proteína FT en la formulación, la situación clónica del sujeto o paciente, el trastorno hemorrágico a tratar, etc. (para una mayor información véase el apartado relativo a la “Composición farmacéutica” de la presente descripción).

II. Productos de combinación y aplicaciones

II.1 FT lipidado + FXa

Como es conocido, en la vía extrínseca de la coagulación sanguínea el FT se une al FVII/FVIIa circulante para formar el complejo FT::FVII y, en presencia de calcio, actuar como sustrato para que tenga lugar la activación de FX. La activación de la vía extrínseca implica la interacción de FT con su ligando, el FVII/FVIIa. Este complejo, FT::FVIIa actúa como substrato para que tenga lugar la activación de FX por FVIIa. Ahora, los inventores, sorprendentemente, han descubierto que el FT lipidado junto al FXa, incluso en sujetos deficientes en FVII, induce la coagulación, de forma que el FT lipidado actúa como estimulador del FXa, permitiendo que esta ser�nproteasa inicie la hidrólisis de la protrombina, produzca trombina, y tenga lugar el origen de la coagulación. Tal como aquí se utiliza, “FXa” se refiere a una proteína, en particular, una serinproteasa que, en su forma activa, es la encargada de iniciar la hidrólisis de la protrombina y, en consecuencia, dar lugar al inicio de la coagulación. Esta prote�lisis es efectuada por el FXa que se une a la superficie de las plaquetas activadas y, en presencia del FVa y calcio iónico, hidroliza la protrombina.

De forma más concreta, los inventores, sorprendentemente, han encontrado que la combinación de FT lipidado y FXa, incluso a concentraciones tan bajas de FXa que por s� mismas son incapaces de inducir la coagulación, coagula el plasma [véanse, por ejemplo, los apartados 1 (1.5) y 2 de los Resultados del Ejemplo que acompaña a esta descripción].

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un producto que comprende (i) FT lipidado y (ii) FXa. Dicho producto, a partir de los resultados mencionados previamente, puede ser utilizado como medicamento, en particular, puede ser utilizado en el tratamiento de hemorragias, por ejemplo, en el tratamiento t�pico de hemorragias, en un sujeto. Dichos componentes (i) y (ii) pueden estar juntos o separados. En una realización particular, el FT lipidado utilizado en la preparación de este producto es FT humano lipidado.

En una realización particular, la invención proporciona un producto que comprende (i) FT lipidado y (ii) FXa. Ambos componentes pueden combinarse y estar juntos en la misma composición antes de su administración al sujeto.

En otra realización particular, la invención proporciona un producto que comprende, por separado, (i) FT lipidado y

(ii) FXa. En otra realización particular, la invención proporciona un producto que comprende, por separado, (i) FT lipidado y (ii) FXa, como combinación para su administración simultánea o sucesiva a un sujeto. La administración combinada de dichos componentes (i) y (ii) al sujeto puede llevarse a cabo de forma simultánea o secuencial, separada en el tiempo, en cualquier orden, es decir, puede administrarse primero el FT lipidado y, a continuación, FXa, o viceversa. Alternativamente, dichos FT lipidado y FXa pueden administrarse simultáneamente.

Para su administración a un sujeto el producto definido previamente se formular� en una forma farmacéutica de administración, preferentemente, una forma farmacéutica de administración adecuada para su administración típica, para lo cual se incorporarán los excipientes y portadores farmac�uticamente aceptables adecuados para la elaboración de la forma farmacéutica de administración deseada. Información sobre dichos portadores y excipientes, as� como sobre dichas formas de administración adecuadas para la administración de dicho producto de la invención puede encontrarse en tratados de farmacia gal�nica. Para una mayor información véase el apartado relativo a la “Composición farmacéutica” de la descripción.

La dosis de FT lipidado y de FXa a administrar al sujeto puede variar dentro de un amplio intervalo. A modo ilustrativo, la dosis de FT lipidado a administrar puede estar comprendida entre aproximadamente 0,01 μg de proteína activa/ml y 100 μg de proteína activa/ml. Asimismo, a modo ilustrativo, la dosis de FXa a administrar puede estar comprendida entre aproximadamente 17 pM y 17 nM (0,001 μg de proteína activa/ml y 10 μg de proteína activa/ml. En general, las dosis de FT lipidado y de FXa a administrar dependerán de numerosos factores, entre los que se incluyen las características de la proteína de FT empleada y del FXa, tales como por ejemplo, su actividad y vida media biológica, la concentración de la proteína del FT y del FXa en la formulación, la situación clónica del sujeto o paciente, el trastorno hemorrágico a tratar, etc. (para una mayor información véase el apartado relativo a la “Composición farmacéutica” de la presente descripción).

La relación ponderal entre el FT lipidado y el FXa presente en dicho producto puede variar dentro de un amplio intervalo; a modo ilustrativo, dicha relación ponderal FT lipidado:FXa est� comprendida entre 106:1 y 10:1, aunque también son posibles otras relaciones ponderales; en una realización particular, dicho producto de la invención comprende FT lipidado y FXa en una relación ponderal de 1 a 0,001, es decir por cada miligramo de proteína FT hay presente en la mezcla 1 microgramo de proteína FXa.

El uso del producto previamente definido como medicamento, en concreto, el uso de dicho producto en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de hemorragias en un sujeto, especialmente, para el tratamiento t�pico de hemorragias en un sujeto, constituyen aspectos adicionales de la presente invención.

II.2 FT lipidado + SICN

Los inventores también han encontrado, sorprendentemente, que la combinación de FT lipidado y superficies inorgánicas cargadas negativamente (SICN) coagula el plasma y la sangre de sujetos sanos y pacientes de deficitarios en factores de coagulación tanto in vitro [véase los apartados 1 (1.4), 2 (2.2), 3 (3.4), 4 (4.2) y 5 (5.2 y 5.4) de los Resultados del Ejemplo que acompaña a esta descripción] como in vivo [véanse el apartado 6.1 de los Resultados del Ejemplo que acompaña a esta descripción].

El término “superficie inorgánica cargada negativamente” o “SICN” tal y como se utiliza en esta descripción, est� constituido por una mezcla de lípidos y aceleradores de la coagulación sanguínea, tales como ácido el�gico, zeolita, sílice, materiales oxido inorgánicos, etc. Los lípidos tienen carga neta negativa, lo que significa que la mezcla lip�dica puede incluir lípidos neutros o zwiteri�nicos, pero debe contener una cierta cantidad de lípidos cargados negativamente que confiera carácter ani�nico a la mezcla. Un ejemplo ilustrativo, no limitativo, de lípidos cargados negativamente pueden ser los esfingol�pidos (tales como ceramida-1-fosfatos, fosfatidiletanolamina glicosilado, sulfatidos hidroxilados o no hidroxilados, gangli�sidos, etc.) y lípidos basados en glicerol (tales como fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, fosfatidilinositol fosfatos, ácidos fosfat�dicos, fosfatidilgliceroles, cardiolipinas). En la presente solicitud de patente, los productos comerciales Dade� Actin� (Dade Behring, marca) fueron utilizados como fuente de SICN.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un producto que comprende (i) FT lipidado y (ii) una SICN. Dicho producto, a partir de los resultados mencionados previamente, puede ser utilizado como medicamento, en particular, puede ser utilizado en el tratamiento de hemorragias, por ejemplo, en el tratamiento t�pico de hemorragias, en un sujeto. Dichos componentes (i) y (ii) pueden estar juntos o separados.

En una realización particular, la invención proporciona un producto que comprende (i) FT lipidado y (ii) una SICN. Ambos componentes pueden combinarse y estar juntos en una misma composición antes de su administración al sujeto.

En otra realización particular, la invención proporciona un producto que comprende, por separado, (i) FT lipidado y

(ii) SICN. En otra realización particular, la invención proporciona un producto que comprende, por separado, (i) FT lipidado y (ii) SICN, como combinación para su administración simultánea o sucesiva a un sujeto. La administración combinada de dichos componentes (i) y (ii) al sujeto puede llevarse a cabo de forma simultánea o secuencial, separada en el tiempo, en cualquier orden, es decir, puede administrarse primero el FT lipidado y, a continuación, la SICN, o viceversa. Alternativamente, dichos FT lipidado y SICN pueden administrarse simultáneamente.

Para su administración a un sujeto el producto definido previamente se formular� en una forma farmacéutica de administración, preferentemente, una forma farmacéutica de administración adecuada para su administración típica, para lo cual se incorporarán los excipientes y portadores farmac�uticamente aceptables adecuados para la elaboración de la forma farmacéutica de administración deseada. Información sobre dichos portadores y excipientes, as� como sobre dichas formas de administración adecuadas para la administración de dicho producto de la invención puede encontrarse en tratados de farmacia gal�nica. Para una mayor información véase el apartado relativo a la “Composición farmacéutica” de la presente descripción.

La dosis de FT lipidado y SICN a administrar al sujeto puede variar dentro de un amplio intervalo. A modo ilustrativo, la dosis de FT lipidado a administrar puede estar comprendida entre aproximadamente 0,01 μg de proteína activa/ml y 100 μg de proteína activa/ml. Asimismo, a modo ilustrativo, la dosis de SICN (en volumen) a administrar puede estar comprendida entre aproximadamente 0,1 y 100 μl por cada μg de FT lipidado activado. En general las dosis de FT lipidado SICN a administrar dependerán de numerosos factores, incluyendo las características de la proteína FT usada y la SICN, tales como por ejemplo, su actividad y vida media biológica, la concentración de la proteína del FT y SICN en la formulación, la situación clónica del sujeto o paciente, el trastorno hemorrágico a tratar, etc. (para una mayor información véase el apartado relativo a la “Composición farmacéutica” de la presente descripción).

La relación peso/volumen (w/v) de FT lipidado y SICN presentes en dicho producto puede variar dentro de un amplio intervalo; a modo ilustrativo dicha relación w/v de FT lipidado:SICN est� comprendida entre 1:1 y 1:106, aunque otras relaciones w/v también son posibles; en una realización particular, dicho producto de la invención comprende entre 0,1 y 100 μl de SICN por cada μg de proteína activa de FT lipidado.

El uso del producto previamente definido como un medicamento, específicamente el uso de dicho producto en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de hemorragias en un sujeto, particularmente para el tratamiento t�pico de hemorragias en un sujeto, constituyen aspectos adicionales de la presente invención.

II.3 FT lipidado + FXa + SICN

Los inventores sorprendentemente también han descubierto que la combinación de FT lipidado, FXa y SICN coagula el plasma y la sangre de sujetos sanos y de pacientes deficientes en factores de coagulación in vitro [véase los apartados 1 (1.6) y 2 (2.2) de los resultados de los Ejemplos incluidos en esta descripción].

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un producto que comprende (i) FT lipidado, (ii) FXa y (iii) SICN. Basado en los resultados previamente mencionados, dicho producto puede usarse como un medicamento, y puede usarse de forma particular en el tratamiento de hemorragias, por ejemplo, en el tratamiento t�pico de hemorragias, en un sujeto. Dichos componentes (i), (ii) y (iii) pueden estar juntos o separados. Alternativamente, dos de los componentes pueden estar juntos, por ejemplo, (i) + (ii), (i) + (iii) o (ii) + (iii), y el tercer componente separado.

En una realización particular, la invención proporciona un producto que comprende (i) FT lipidado, (ii) FXa y (iii) SICN. Dichos componentes pueden combinarse y estar juntos en la misma composición antes de su administración al sujeto.

En otra realización particular, la invención proporciona un producto que comprende, de forma separada, (i) FT lipidado, (ii) FXa y (iii) SICN. En otra realización particular la invención proporciona un producto que comprende, de forma separada, (i) FT lipidado, (ii) FXa y (iii) SICN, como una combinación para su administración simultánea o sucesiva a un sujeto. La administración combinada de dichos componentes (i), (ii) y (iii) al sujeto puede llevarse a cabo simultáneamente o secuencialmente, separada en el tiempo, en cualquier orden, es decir, pueden administrarse primero el FT lipidado, después el FXa y entonces la SICN, o primero el FT lipidado, después la SICN y entonces el FXa, o primero el FXa, después el FT lipidado y entonces la SICN; o primero el FXa, después la SICN y luego el FT lipidado, o primero SICN, después FXa y a continuación FT lipidado; o primero la SICN, después el FT lipidado y luego el FXa. Alternativamente, dos cualquiera de dichos componentes pueden mezclarse en la misma composición y administrarse juntos mientras que el tercero puede añadirse antes o después de dicha composición de componentes binaria. En otra realización alternativa dicho FT lipidado, FXa y SICN se administran simultáneamente.

Para su administración a un sujeto, el producto definido previamente ser� formulado en una forma de administración farmacéutica, preferiblemente una forma de administración farmacéutica apropiada para su administración típica, para la cual se incorporarán los portadores y excipientes farmac�uticamente aceptables adecuados para la preparación de la forma de administración farmacéutica deseada. Información sobre dichos portadores y excipientes, as� como sobre dichas formas de administración apropiadas para la administración de dicho producto de la invención, pueden encontrarse en los tratados de farmacia gal�nica. Para más información véase el apartado relacionado con la “Composición Farmacéutica” de esta descripción.

La dosis de FT lipidado, FXa y SICN a administrar a un sujeto puede variar dentro de un amplio rango. A modo ilustrativo, la dosis a administrar de FT lipidado puede estar comprendida entre aproximadamente 0,01 μg de proteína activa/ml y 100 μg de proteína activa/ml. También, a modo ilustrativo, la dosis a administrar de FXa puede estar comprendida entre alrededor de 17 pM y 170 pM (0,001 μg de proteína y 10 μg de proteína/ml). Adicionalmente, a modo ilustrativo, la dosis de SICN (en volumen) a ser administrada puede estar comprendida entre aproximadamente 0,1 y 100 μl por cada μg de proteína activa de FT lipidado. En general, las dosis de FT lipidado, FXa y SICN a administrar dependerán de numerosos factores, entre los que se incluyen las características de la proteína de FT, el FXa y la SICN empleadas, tales como por ejemplo, su actividad y vida media biológica, la concentración de la proteína del FT, FXa y SICN en la formulación, la situación clónica del sujeto o paciente, el trastorno hemorrágico a tratar, etc. (para una mayor información véase el apartado relativo a la “Composición farmacéutica” de la presente descripción).

La relación ponderada entre el FT lipidado, el FXa y la SICN presente en dicho producto puede variar dentro de un amplio intervalo tal como se ha mencionado previamente en los apartados II.1 y II.2; no obstante, en una realización particular, dicho producto de la invención comprende FT lipidado:FXa:SICN en una relación 1:0,001:100 (w:w:v).

El uso del producto previamente definido como medicamento, en concreto, el uso de dicho producto en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de hemorragias en un sujeto, especialmente, para el tratamiento t�pico de hemorragias en un sujeto, constituyen aspectos adicionales de la presente invención.

III. Complejos y aplicaciones

III.1 Complejo FT::FXa

Como se ha mencionado previamente (véase el apartado II.1 de esta descripción), los inventores han encontrado que la combinación de FT lipidado y FXa, incluso a concentraciones tan bajas de FXa que por s� mismas eran incapaces de inducir la coagulación, coagula el plasma. Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría, se cree que la administración, conjunta o separada (en cualquier orden), de dichos FT lipidado y FXa da lugar a la formación de un complejo capaz de ejercer el efecto terapéutico (antihemorr�gico, en particular, antihemorr�gico t�pico) observado en el lugar donde debe ejercer dicho efecto terapéutico.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un complejo, identificado como FT::FXa en esta descripción, que comprende FT lipidado y FXa. Aunque por simplicidad se representa dicho complejo como FT::FXa, en la realidad, dicho complejo podría estar formado por diversas unidades de cada uno de dichos componentes; todas estas posibilidades caen dentro del ámbito de la invención. Dicho complejo, la vista de los resultados mencionados previamente, puede ser utilizado como medicamento, en particular, puede ser utilizado en el tratamiento de hemorragias, por ejemplo, en el tratamiento t�pico de hemorragias, en un sujeto. En una realización particular, el FT lipidado utilizado en la elaboración de este complejo es FT humano lipidado.

Para su administración a un sujeto, el producto definido previamente se formular� en una forma farmacéutica de administración, preferentemente, una forma farmacéutica de administración adecuada para su administración típica, para lo cual se incorporarán los excipientes y portadores farmac�uticamente aceptables adecuados para la elaboración de la forma farmacéutica de administración deseada. Información sobre dichos portadores y excipientes, as� como sobre dichas formas de administración adecuadas para la administración de dicho producto de la invención puede encontrarse en tratados de farmacia gal�nica. Para una mayor información véase el apartado relativo a la “Composición farmacéutica” de la presente descripción.

Las dosis de FT lipidado y FXa presentes en dicho complejo a ser administrado al sujeto pueden variar dentro de un amplio intervalo. En general, dichas dosis corresponden a las dosis mencionadas previamente en el apartado II.1 relacionado con un producto que comprende FT lipidado y FXa.

La relación ponderal entre el FT lipidado y el FXa presente en dicho complejo FT::FXa puede variar dentro de un amplio intervalo; si bien, en general, corresponde a la mencionada previamente en el apartado II.1 relacionado con un producto que comprende FT lipidado y FXa.

El uso del complejo previamente definido como medicamento, en concreto, el uso de dicho complejo en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de hemorragias en un sujeto, especialmente, para el tratamiento t�pico de hemorragias en un sujeto, constituyen aspectos adicionales de la presente invención.

III.2 Complejo FT::SICN

Como se ha mencionado previamente (véase el apartado II.2 de esta descripción), los inventores han encontrado que la combinación de FT lipidado y SICN coagula el plasma y la sangre en sujetos sanos y en pacientes deficitarios en factores de coagulación tanto in vitro e in vivo. Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría, se cree que la administración, conjunta o separada (en cualquier orden), de dichos FT lipidado y SICN da lugar a la formación de un complejo capaz de ejercer el efecto terapéutico (antihemorr�gico, en particular, antihemorr�gico t�pico) observado en el lugar donde debe ejercer dicho efecto terapéutico.

Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un complejo, identificado como FT::SICN en esta descripción, que comprende FT lipidado y una SICN. Aunque por simplicidad se representa dicho complejo como FT::SICN, en la realidad, dicho complejo podría estar formado por diversas unidades de cada uno de dichos componentes; todas esas posibilidades caen dentro del ámbito de la invención. Dicho complejo, a la vista de los resultados mencionados previamente, puede ser utilizado como medicamento, en particular, puede ser utilizado en el tratamiento de hemorragias, por ejemplo, en el tratamiento t�pico de hemorragias, en un sujeto. En una realización particular, el FT lipidado utilizado en la elaboración de este complejo es FT humano lipidado.

Para su administración a un sujeto el producto definido previamente se formular� en una forma farmacéutica de administración, preferentemente, una forma farmacéutica de administración adecuada para su administración por vía típica, para lo cual se incorporarán los excipientes y portadores farmac�uticamente aceptables adecuados para la elaboración de la forma farmacéutica de administración deseada. Información sobre dichos portadores y excipientes, as� como sobre dichas formas de administración adecuadas para la administración de dicho producto de la invención puede encontrarse en tratados de farmacia gal�nica. Para una mayor información véase el apartado relativo a la “Composición farmacéutica” de la presente descripción.

Las dosis de FT lipidado y SICN presentes en dicho complejo a ser administrado al sujeto pueden variar dentro de un amplio intervalo. En general, dichas dosis corresponden a las dosis mencionadas previamente en el apartado II.2 relacionado con un producto que comprende la combinación de FT lipidado y SICN.

La relación w/v entre el FT lipidado y la SICN presente en dicho complejo FT::SICN puede variar dentro de un amplio intervalo; si bien, en general, corresponde a la mencionada previamente en el apartado II.2 relacionado con un producto que comprende FT lipidado y SICN.

El uso del complejo previamente definido como medicamento, en concreto, el uso de dicho complejo en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de hemorragias en un sujeto, especialmente, para el tratamiento t�pico de hemorragias en un sujeto, constituyen aspectos adicionales de la presente invención.

III.3 Complejo FT lipidado::FXa::SICN

Como se ha mencionado previamente (véase el apartado II.3 de esta descripción), los inventores han encontrado que la combinación de FT lipidado, FXa y SICN coagula el plasma. Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría, se cree que la administración, conjunta o separada (en cualquier orden), de dichos FT lipidado, FXa y SICN da lugar a la formación de un complejo capaz de ejercer el efecto terapéutico (antihemorr�gico, en particular, antihemorr�gico t�pico) observado en el lugar donde debe ejercer dicho efecto terapéutico. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un complejo, identificado como FT::FXa::SICN en esta descripción, que comprende FT lipidado, FXa y una SICN. Aunque por simplicidad se representa dicho complejo como FT::FXa::SICN, en la realidad, dicho complejo podría estar formado por diversas unidades de cada uno de dichos componentes, as� como por cualquier posibilidad de interacciones entre dichos componentes, por ejemplo, FT::SICN:FXa, FXa::SICN::FT, FXa::FT::SICN, SICN::FT::FXa o SICN::FXa::FT; todas esas posibilidades caen dentro del ámbito de la invención. Dicho complejo, a la vista de los resultados mencionados previamente, puede ser utilizado como medicamento, en particular, puede ser utilizado en el tratamiento de hemorragias, por ejemplo, en el tratamiento t�pico de hemorragias, en un sujeto. En una realización particular, el FT lipidado utilizado en la elaboración de este complejo es FT humano lipidado.

Para su administración a un sujeto el complejo definido previamente se formular� en una forma farmacéutica de administración, preferentemente, una forma farmacéutica de administración adecuada para su administración por vía típica, para lo cual se incorporarán los excipientes y portadores farmac�uticamente aceptables adecuados para la elaboración de la forma farmacéutica de administración deseada. Información sobre dichos portadores y excipientes, as� como sobre dichas formas de administración adecuadas para la administración de dicho producto de la invención puede encontrarse en tratados de farmacia gal�nica. Para una mayor información véase el apartado relativo a la “Composición farmacéutica” de la presente descripción.

El FT lipidado, FXa y SICN presentes en dicho complejo a administrar al sujeto puede variar dentro de un amplio intervalo. En general, dichas dosis corresponden a las dosis mencionadas previamente en el apartado II.3 relacionado con un producto que comprende la combinación de FT lipidado, FXa y SICN.

La relación entre el FT lipidado, el FXa y la SICN presente en dicho complejo FT::FXa::SICN puede variar dentro de un amplio intervalo; si bien, en general, corresponde a la mencionada previamente en II.3 relacionado con un producto que comprende FT lipidado, FXa y SICN.

El uso del complejo previamente definido como medicamento, en concreto, el uso de dicho complejo en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de hemorragias en un sujeto, especialmente, para el tratamiento t�pico de hemorragias en un sujeto, constituyen aspectos adicionales de la presente invención.

IV. Composición farmacéutica

Como se ha mencionado previamente, puede ser utilizado el FT lipidado con la condición que:

(i)

el FT lipidado no es un FT de mamífero recombinante o un fragmento funcional del mismo obtenido de plantas transg�nicas, y

(ii)

el FT lipidado no es un FT lipidado que tiene un 70% de PC y un 30% de PS y que comprende un FT producido en E. coli que tiene la secuencia

como agente antihemorr�gico, en particular, como agente antihemorr�gico para aplicación típica. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica, en adelante, composición farmacéutica de la invención, que comprende un FT lipidado junto con un portador farmac�uticamente aceptable. En una realización particular, el FT lipidado es FT humano lipidado.

Para su administración a un sujeto, del producto previamente definido ser� formulado en una forma farmacéutica de administración, preferiblemente una forma farmacéutica de administración adecuada para su administración típica, para lo cual se incorporarán los excipientes y portadores farmac�uticamente aceptables adecuados para la elaboración de la forma farmacéutica de administración deseada. Información sobre dichos portadores y excipientes, as� como sobre dichas formas de administración adecuadas para la administración del producto de la invención puede encontrarse en tratados de farmacia gal�nica. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos, en general, y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse en el libro “Tratado de Farmacia Gal�nica”, de C. Faul� i Trillo, 1� Edición, 1993, Luz�n 5, S.A. de Ediciones.

Aunque se podrían utilizar diversas formas farmacéuticas de administración del FT lipidado, en la práctica resulta ventajoso administrar dicho compuesto por vía típica, por lo que dicho FT lipidado se formular� en una forma farmacéutica adecuada para su administración por vía típica. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas formas farmacéuticas incluyen aerosoles, soluciones, suspensiones, emulsiones, geles, pomadas, cremas, apósitos, parches, ungüentos, colutorios, etc. Para ello, la formulación farmacéutica que comprende el FT lipidado incluir� los portadores y excipientes farmac�uticamente aceptables necesarios para la elaboración de la forma farmacéutica de administración de FT lipidado por vía típica.

Por tanto, en una realización particular, la composición farmacéutica de la invención es una composición farmacéutica para la administración típica de un FT lipidado, con la condición que:

(i)

el FT lipidado no es un FT de mamífero recombinante o un fragmento funcional del mismo obtenido de plantas transg�nicas, y

(ii)

el FT lipidado no es un FT lipidado que tiene un 70% de PC y un 30% de PS y que comprende un FT producido en E. coli que tiene la secuencia

que comprende FT lipidado y un portador farmac�uticamente aceptable adecuado para la administración típica de dicho FT lipidado.

El FT lipidado estar� presente en la composición farmacéutica de la invención en una cantidad terapéuticamente efectiva. Dicha cantidad puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre aproximadamente 0,01 μg de proteína activa/ml y 100 μg de proteína activa/ml.

En otra realización particular, la composición farmacéutica de la invención comprende:

a) un producto que comprende (i) FT lipidado y (ii) FXa, junto con un portador farmac�uticamente aceptable; o

b) por separado, (i) FT lipidado junto con un portador farmac�uticamente aceptable, y (ii) FXa junto con un

portador farmac�uticamente aceptable; o

c) un producto que comprende (i) FT lipidado y (ii) una SICN, junto con un portador farmac�uticamente

aceptable; o

d) por separado, (i) FT lipidado junto con un portador farmac�uticamente aceptable, y (ii) una SICN junto

con un portador farmac�uticamente aceptable; o

e) un producto que comprende (i) FT lipidado, (ii) FXa y (iii) una SICN, junto con un portador

farmac�uticamente aceptable; o

f) por separado, (i) FT lipidado junto con un portador farmac�uticamente aceptable, (ii) FXa junto con un

portador farmac�uticamente aceptable, y (iii) una SICN junto con un portador farmac�uticamente

aceptable; o

g) un complejo FT::FXa junto con un portador farmac�uticamente aceptable; o

h) un complejo FT::SICN junto con un portador farmac�uticamente aceptable; o

i) un complejo FT::FXa::SICN junto con un portador farmac�uticamente aceptable.

La composición farmacéutica definida previamente contiene, como puede apreciarse, FT lipidado solo o combinado con FXa y/o SICN o formando complejos con FXa y/o SICN, como principio activo. En una realización particular, el FT lipidado presente en la composición farmacéutica de la invención definida previamente es FT humano lipidado.

Asimismo, en una realización particular, la composición farmacéutica de la invención definida previamente se formular� en una forma farmacéutica para la administración típica del principio activo (FT lipidado solo o combinado con FXa y/o SICN o formando complejos con FXa y/o SICN). Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas formas farmacéuticas incluyen aerosoles, soluciones, suspensiones, emulsiones, geles, pomadas, cremas, apósitos, parches, ungüentos, colutorios, etc. Para ello, la formulación farmacéutica que comprende el principio activo previamente mencionado incluir� los portadores y excipientes farmac�uticamente aceptables necesarios para la elaboración de la forma farmacéutica de administración de dicho principio activo por administración típica.

El principio activo estar� presente en la composición farmacéutica de la invención en una cantidad terapéuticamente efectiva. La dosis de principio activo a administrar a un sujeto depender�, entre otros factores, de la severidad de la patología que padezca dicho sujeto, de la forma farmacéutica de administración elegida, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta invención deben ser consideradas tan solo como guías para el experto en la materia, y éste debe ajustar las dosis en función de las variables citadas anteriormente. No obstante, la composición farmacéutica de la invención se puede administrar una o más veces al día con fines preventivos o terapéuticos.

La composición farmacéutica de la invención puede ser utilizada junto con otros fármacos adicionales útiles en la prevención y/o tratamiento de una di�tesis hemorrágica (e.g., factores de la coagulación, plasmas humanos, etc.) para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o sucesiva (secuencial en el tiempo) respecto a la administración de la composición farmacéutica de la invención

V. Composición farmacéutica soportada

La composición farmacéutica de la invención puede estar depositada sobre un soporte. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un producto que comprende la composición farmacéutica de la invención y un soporte. El término “soporte”, tal como aquí se utiliza, se refiere a un sustrato de un material apropiado que permite el depósito de la composición farmacéutica de la invención, su vehiculizaci�n y su liberación en el lugar deseado, por ejemplo, en el sitio donde la composición farmacéutica de la invención ejerce su efecto terapéutico. Dicho soporte puede ser un soporte sólido o un soporte no sólido, por ejemplo, un soporte líquido o un soporte gaseoso. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de soportes sólidos incluyen apósitos, tiritas, compresas, emplastes, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de soportes líquidos, incluyen geles, sprays, colutorios, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de soportes gaseosos, incluyen aire, propelentes, etc. En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención depositada sobre dicho soporte comprende:

(a)

(i) un soporte, (ii) un producto que comprende FT lipidado y FXa, junto con un portador farmac�uticamente aceptable, (iii) un producto que comprende FT lipidado y una SICN, junto con un portador farmac�uticamente aceptable y (iv) un producto que comprende FT lipidado, FXa y una SICN, junto con un portador farmac�uticamente aceptable; o

(b)

un complejo FT::FXa, junto con un portador farmac�uticamente aceptable, o

(c)

un complejo FT::SICN, junto con un portador farmac�uticamente aceptable, o

(d)

un complejo FT::FXa::SICN, junto con un portador farmac�uticamente aceptable.

En una realización particular, el FT lipidado presente en la composición farmacéutica de la invención es FT humano lipidado.

Este producto que comprende la composición farmacéutica de la invención depositada sobre un soporte puede obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, mezclando la composición farmacéutica de la invención y el soporte. La interacción entre la composición farmacéutica de la invención y el soporte puede ser una interacción física o química dependiendo de la naturaleza de los componentes de la composición farmacéutica de la invención y del soporte utilizado.

EJEMPLO

Con el fin de evaluar la capacidad del FT lipidado como estimulador del FXa, se realizaron una serie de ensayos in vitro e in vivo, en concreto:

1.

Ensayos in vitro que demuestran que el factor FT lipidado (solo o en combinación) actúa como un estimulador directo del FXa causando la formación del coágulo de fibrina y la coagulación sanguínea en la ausencia del FVII (causado por ausencia, deficiencia o inmunobloqueo)

1.1. El FT lipidado aumenta la capacidad proteol�tica de FXa y consecuentemente la producción de trombina en ausencia de FVII (ensayos cromog�nicos en disolución y en suspensión de plaquetas lavadas).

1.2. El FT lipidado es capaz de coagular el plasma y la sangre de pacientes deficitarios en FVII (ensayos de coagulación en plasma y en sangre total no-anticoagulada)

1.3. El FT lipidado es capaz de coagular el plasma de sujetos sanos en presencia de un anticuerpo monoclonal frente a FVII (ensayos de coagulación)

1.4. La combinación de FT lipidado y SICN aumenta de forma sin�rgica la coagulación de la sangre en plasmas deficitarios en FVII (ensayos de coagulación).

1.5. La combinación de FT lipidado y FXa aumenta la coagulación sanguínea de forma sin�rgica en presencia de un anticuerpo monoclonal frente a FVII (ensayos de coagulación en plasmas deficitarios en FX).

1.6. La combinación de FT lipidado, FXa y SICN aumenta la coagulación de forma sin�rgica en la presencia de un anticuerpo anti-FVII (ensayo de coagulación en plasmas deficitarios en el FX).

2.

Ensayos in vitro que demuestran que la combinación de FT lipidado con FXa a bajas concentraciones (incapaz de inducir ningún efecto procoagulante), produce la coagulación de plasmas defectivos en FX

2.1 El FT lipidado actúa como estimulador del FXa cuando esta ser�nproteasa est� presente a bajas concentraciones.

2.2 La combinación de FT lipidado con FXa y SICN actúa de forma sin�rgica en la estimulaci�n del FXa.

3.

Ensayos in vitro que demuestran que el FT lipidado (solo o en combinación) produce la coagulación en pacientes con deficiencias en otros factores de coagulación distintos del FVII

3.1 El FT lipidado coagula el plasma y la sangre de pacientes con deficiencias en los factores de coagulación FV, FVIII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, y FXIII (ensayos de coagulación en plasmas deficitarios en factores de coagulación y en sangre total no coagulada de FVIII y FIX).

3.2 El FT lipidado coagula la sangre completa y el plasma previamente heparinizados.

3.3 El FT coagula el plasma de animales tratados con warfarina.

3.4 La combinación de FT lipidado con SICN aumenta de forma sin�rgica la coagulación sanguínea en plasma de pacientes con deficiencias en los factores de coagulación FV, FVIII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII y FXIII (ensayos de coagulación en plasmas deficitarios en factores de coagulación) y en sangre total de pacientes hemofílicos.

4.

Ensayos in vitro que demuestran que el FT lipidado (solo o en combinación) causa la coagulación sanguínea en pacientes sanos.

4.1 El FT lipidado coagula el plasma y la sangre de pacientes sanos.

4.2 La combinación de FT lipidado con SICN aumenta de forma sin�rgica la coagulación sanguínea en plasma y sangre de sujetos sanos. Ausencia de efectos sin�rgicos cuando el FT lipidado est� asociado a fosfol�pidos.

5.

Ensayos in vitro que demuestran que el efecto coagulante del FT lipidado (solo o en combinación) en plasma de pacientes con alteraciones plaquetarias congénitas y adquiridas (trombocitop�nicos)

5.1 El FT lipidado coagula el plasma de pacientes con alteraciones plaquetarias congénitas.

5.2 La combinación de FT lipidado con una SICN aumenta la coagulación en sangre total de pacientes con alteraciones plaquetarias congénitas.

5.3 EL FT lipidado coagula en muestras trombocitop�nicas.

5 6. Ensayos in vitro que demuestran que el FT es un agente útil en el tratamiento antihemorr�gico t�pico en ratas control (aplicándolo directamente solo o en combinación con una SICN en el vaso sanguíneo previamente seccionado)

6.1 El FT lipidado (solo o en combinación con una SICN) es útil como agente t�pico hemost�tico en un modelo animal de hemorragia severa mediante la sección proximal de colas de rata.

6.2 El FT lipidado es útil como agente hemost�tico t�pico en un modelo animal de hemorragia severa tratado previamente con heparina o warfarina.

6.3 El FT lipidado es útil como agente hemost�tico t�pico en un modelo animal de hemorragia letal mediante la

secci�n proximal de colas de rata. 15

I. MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

Como fuente de Factor Tisular (FT) lipidado se utilizó Factor Tisular recombinante humano (FTr) Thromborel� S y Neoplastin� Plus. Concretamente, se emplearon las siguientes preparaciones comerciales: el factor tisular recombinante humano (no lipidado) (American Diagnostica, USA), relipidado siguiendo el método descrito por Morrissey, la tromboplastina de placenta humana liofilizada que contenía calcio (Thromborel� S, Dade Behring Inc); cerebro de rata liofilizado conteniendo calcio (Neoplastin� Plus, Diagnostica Stago-Roche).

25 La actividad procoagulante de la proteína FT se determin� mediante una curva estándar usando como material de referencia el FT humano lipidado recombinante (American Diagnostica, USA) y se expres� en el texto como μg de proteína activa/mL y en las tablas como μg/ml. Por simplicidad, en este ejemplo, el término FTr o FT, salvo que se indique lo contrario, se refiere a FT lipidado. Como fuente de FXa, FII (protrombina) y FVa se utilizaron los compuestos comerciales de Haematologic Technologies. Como superficies inorgánicas cargadas negativamente (SICN) se utilizó el reactivo comercial Dade� Actin� FS (Dade Behring).Los plasmas deficitarios en factores de coagulación comerciales (FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII y FXIII) se obtuvieron de Dade Behring Marburg GmbH.

M�todos

35 Método para la relipidaci�n del FT en vesículas de lípidos usando di�lisis con octilgluc�sido (Método de Morrisey)

El FT no lipidado se incorpora dentro de vesículas de lípidos usando el detergente no iónico N-octil-beta-Dglucopiran�sido (octilgluc�sido). Tanto el FT como los lípidos se disuelven en octilgluc�sido formando micelas. Como el octilgluc�sido presenta una alta concentración de micela crítica (CMC = 20 a 50 mM) se puede eliminar fácilmente de la solución por di�lisis. Al eliminarse el octilgluc�sido los lípidos se organizan en vesículas unilamelares. El FT se embebe en estas vesículas en virtud de su dominio transmembrana. Normalmente, del 50 al 80% de las moléculas de FT se disponen mirando hacia afuera de las vesículas.

45 Tampones y soluciones stock

Octilgluc�sido (n-octil-beta-D-glucopiran�sido) de Calbiochem. Lípidos:Tampones:

Lípido

Concentración Peso Molecular

PC

L-alfa-fosfatidilcolina 10 � 25 mg/ml 761

PS

L-alfa-fosfatidilserina, sal de sodio de cerebro bovino 10 mg/ml 810

PE

L-alfa-fosfatidiletanolamina, hígado bovino 10 mg/ml 768

HBS

NaCl 100 mM Hepes/NaOH 20 mM, pH 7,5 Azida de sodio 0,02 % (m/v)

HBSA (guardar a 4 �C)

Alb�mina de suero bovino en HBS 0,1 % (m/v)

OG/HBS (preparar en el momento)

n-octil-beta-D-glucopiran�sido en HBS 100 mM (29,2 mg OG/ ml de HBS)

Preparaci�n de la solución de lípidos en octilgluc�sido (OG)

1.

Para cada muestra, se preparan 2,6 micromoles de lípidos totales en un tubo de vidrio, usando el radio molar de lípidos deseado.

2.

Secar la mezcla de lípidos bajo una corriente de argón o nitrógeno.

3.

Cuando el tubo parezca seco, secar al vacío por otros 60 minutos.

4.

A�adir 400 μl de solución fresca de OG/HBS (a temperatura ambiente) al tubo con los lípidos secos.

Para vesículas PC:PS (radio 80:20 molar)

62 μl PC (a 25 mg/ml)

= 1,58 mg = 2,08 μmoles

42 μl PS (a 10 mg/ml)

= 0,42 mg = 0,52 μmoles

Para vesículas PC:PE:PC (radio 40:40:20) molar

32 μl PC (a 25 mg/ml)

= 0,79 mg = 1,04 μmoles

80 μl PE (a 10 mg/ml)

= 0,80 mg = 1,04 μmoles

42 μl PS (a 10 mg/ml)

= 0,42 mg = 0,52 μmoles

Relipidaci�n

15 Añadir la cantidad deseada de FT al tubo que contiene los 400 μl de OG/lípidos y suficiente HBSA hasta completar el volumen final de 1 ml. Realizar este paso a temperatura ambiente.

Obtenci�n de suspensiones de plaquetas lavadas

20 Las suspensiones de plaquetas lavadas se prepararon según el método descrito por Radomski M. et al. (Radomski M, Moncada S.; 1983 Thromb Res. This is an improved method for washing of human platelets with prostacyclin. 15;30(4):383-9) a partir de extracciones sanguíneas (citrato sádico 3,15%) de voluntarios sanos. El procesamiento de los especímenes siempre se llev� a cabo inmediatamente después de la extracción sanguínea y a temperatura ambiente. Previamente y durante la realización de los ensayos se evalu� el estado de activación y funcionalidad de

25 las plaquetas mediante ensayos de agregación. Se estimaron la auto-activación y funcionalidad mediante activación con un agonista conocido (col�geno).

Ensayos in vitro

30 Ensayos cromog�nicos

Se diseñaron diferentes ensayos cromog�nicos en solución y en suspensiones de plaquetas activadas para demostrar el efecto del FTr sobre la actividad proteol�tica del Factor Xa.

35 La actividad amidol�tica del FXa se determin� mediante un ensayo cromog�nico utilizando S-2765 (Chromogenix) como sustrato cromog�nico para FXa, mientras que la actividad formadora de trombina se analizó utilizando S-2238 (Chromogenix) como sustrato cromog�nico para trombina.

Los ensayos cromog�nicos se realizaron en suspensión (en tampón) y utilizando suspensiones de plaquetas

40 lavadas. En una placa de ELISA se dispensaron los volúmenes apropiados de cada uno de los factores a estudiar y, en el caso de la utilización de la suspensión de plaquetas lavadas, un volumen apropiado para tener en el medio una concentración de 250.000 plaquetas/μl. Finalmente, la adición del sustrato cromog�nico específico permitió cuantificar la actividad proteol�tica en cuestión mediante lectura espectrofotom�trica a 405 nm. En los ensayos para determinar la actividad amidol�tica solo se dispensaron el FXa y las diferentes concentraciones de FTr, mientras que

45 en los ensayos para determinar la actividad formadora de trombina era necesario añadir, además, Factor II (protrombina) y FVa (este solo en el caso de los ensayos en suspensión, pues en los de las plaquetas lavadas, éstas ya contienen FVa end�geno).

Ensayos de coagulación en plasma

La actividad procoagulante espontánea (no estimulada) en plasma se midió mediante un ensayo de coagulación de un paso determinado en un coagul�metro (Fibrintimer BFT-II clot-timer Dade-Behring, Alemania). Brevemente, se añadieron 50 μl de plasma pobre en plaquetas a las cubetas ya atemperadas y se adicionaron 50 μl de agua destilada. Esta mezcla se dej� incubar durante 60 segundos a 37�C e inmediatamente se añadieron 50 μl de cloruro de calcio 25 mM y se determin� el tiempo de coagulación en segundos en el coagul�metro comprobado por la formación del coágulo. Cada una de las muestras se ensay� por duplicado. Los plasmas pobres en plaquetas se obtuvieron mediante centrifugaci�n y el número de plaquetas se determin� mediante Coulter.

Ensayos de coagulación en sangre total

La actividad procoagulante en sangre total no anticoagulada se determin� mediante un método coagulativo. A 1 ml de sangre total no anticoagulada se le añadieron los diferentes agentes a estudiar y se midió el tiempo de coagulación con un cronómetro desde el inicio de la extracción hasta la aparición del coágulo sanguíneo estable y consolidado. El efecto de los diferentes agentes se evalu� mediante el efecto de acortamiento o alargamiento que tiene sobre el tiempo de coagulación sanguíneo.

Ensayos in vivo

Modelo de hemorragia grave por sección proximal de cola de rata

23 ratas macho Sprage-Dawley de 350-450 gramos de peso fueron repartidas aleatoriamente en 3 grupos de tratamiento: un grupo de control, formado por 14 animales que recibieron tratamiento t�pico con suero salino fisiológico, mientras que los otros dos grupos, también compuestos por 5 animales, recibieron tratamiento t�pico con rFT 1,2 μg/ml, y n= 4 tratamiento t�pico con rFT 1,2 μg/ml + SICN (vol:vol 1:2) respectivamente. Todos los compuestos entraron en contacto t�pico con la sección proximal de la cola del animal para actuar hemost�ticamente administrado mediante pipeta eppendorf de plástico. La formación del coágulo estable y consolidado se evidenci� mediante confirmación del cese del sangrado.

Modelo de hemorragia severa mediante sección proximal de cola de rata en animales tratados con fármacos anticoagulantes

27 ratas macho Sprage-Dawley de 350-450 gramos se repartieron aleatoriamente en 5 grupos de tratamiento: un grupo control, formado por 14 animales que recibieron tratamiento t�pico con suero salino fisiológico. Dos grupos recibieron 200 U/Kg de heparina i.v. 15 minutos antes de comenzar el procedimiento de sección de la cola (para tratarse con FT n=3 y para tratarse con suero salino n=5), y otros dos grupos recibieron oralmente 0,1 mg/Kg/día de warfarina durante 3 días antes de comenzar el procedimiento de sección de la cola (para tratarse con FT n=3 y para tratarse con suero salino, n=2). El tratamiento t�pico con rFT 1,2 μg/ml se realizó sólo a uno de cada grupo de tratamiento. As�, fue un grupo tratado control por cada tratamiento de anticoagulaci�n. El FT lipidado entr� en contacto t�pico con la sección proximal de la cola del animal para actuar hemost�ticamente administrado mediante una pipeta eppendorf de plástico. La formación del coágulo estable y consolidado se evidenci� mediante confirmación del cese del sangrado.

Modelo de hemorragia mortal por punci�n en arteria carótida de rata

4 ratas macho Sprage-Dawley de 350-450 gramos de peso fueron repartidas aleatoriamente en 2 grupos de tratamiento que incluían cada uno de ellos a 2 animales. Los animales del grupo control recibieron como tratamiento suero salino fisiológico, mientras que el otro grupo recibió FT lipidado administrado típicamente (a una dosis final de 2 μg de proteína activa). El modelo de hemorragia mortal por punci�n en arteria carótida de rata se realizó siguiendo los procedimientos estándar. El FT lipidado y el suero fisiológico fueron administrados directamente sobre el punto de la punci�n en vendaje conteniendo 3 ml de cada uno. Esto se combin� con la presión y contacto del correspondiente tratamiento durante dos minutos.

II. RESULTADOS

1. Ensayos in vitro que demuestran que el FT lipidado (solo o en combinación) actúa como estimulador directo de FXa causando la formación del coágulo de fibrina y la coagulación sanguínea en ausencia de FVII (causado por ausencia, deficiencia o inmunobloqueo)

1.1 FT lipidado aumenta la actividad proteol�tica de FXa y, en consecuencia, la producción de trombina en ausencia de FVII

Con el fin de evaluar la capacidad del FT lipidado, en ausencia de FVII, como agente estimulador del Factor Xa, se realizaron varios ensayos in vitro: (i) ensayos cromog�nicos de actividad amidol�tica del FXa, en solución; y (ii) ensayos cromog�nicos de actividad formadora de trombina en una suspensión de plaquetas lavadas.

5 Ensayos cromog�nicos de actividad amidol�tica del FXa

Los ensayos directos de la actividad amidol�tica del FXa en solución utilizando el sustrato S-2765 específico para el FXa, demostraron que el FT lipidado es capaz de aumentar muy significativamente la actividad proteol�tica del FXa. En presencia de altas concentraciones de rFT (1 μg/ml) se observ� un incremento en la actividad producida por bajas y altas concentraciones de FXa (p<0,001). Similares efectos estimuladores significativos (p<0,001) fueron observados en presencia de concentraciones menores de FT lipidado (0.1 μg/ml). En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos en 5 experimentos independientes.

Tabla 1 15 El FT lipidado, en ausencia de FVII, aumenta la actividad proteol�tica del FXa

Sin FTr FTr 0.1 μg/ml FTr 1 μg/ml

FXa 30 nM 550 � 51 2,108 � 61 3,316 � 89

FXa 5 nM 0 341 � 32 505 � 63

Media � SEM ( n= 5)

Ensayos cromog�nicos de actividad de formación de trombina en suspensiones de plaquetas lavadas

El efecto procoagulante detectado fue mucho mayor cuando se usaron las suspensiones plaquetarias como fuente de superficie procoagulante y la formación de trombina fue determinada por el sustrato específico S-2238 (tabla 2). En ausencia de FXa ex�geno, el FT lipidado produjo un efecto estimulante significativo en la formación de trombina 25 (p<0,001). Se observaron efectos similares en presencia de FXa ex�geno a bajas y altas concentraciones (p<0,001).

Tabla 2 El FT lipidado induce la formación de trombina en plaquetas lavadas en presencia de FII pero en ausencia de FVa (ya presente en las plaquetas) y FVII

sin FTr

FTr 0.1 �g/ml FTr 1 �g/ml

FXa 1,250 pM

421 � 19 13,854 � 145 14,910 � 168

FXa 250 pM

213 � 21 9,324 � 155 9,610 � 114

FXa 125 pM

201 � 29 7,802 � 113 8,508 � 178

FXa ausente 0 906 � 89 3,504 � 69

Media � SEM ( n= 5)

35 1.2 El FT lipidado es capaz de coagular plasma y sangre de pacientes deficitarios en FVII (ensayos de coagulación en plasma y en sangre total no-anticoagulada)

Se realizaron una serie de ensayos de coagulación in vitro que mostraron el efecto coagulante del FT lipidado en plasma y en sangre total no-anticoagulada de pacientes deficitarios en FVII y, por tanto, el FT lipidado es un agente útil en el tratamiento antihemorr�gico.

Ensayos de coagulación en plasma comercial sin FVII y en sangre total no-anticoagulada de pacientes deficitarios 45 en FVII

Se investigó el efecto del FT lipidado en coagulación mediante ensayos de coagulación usando plasma comercial sin FVII y sangre total no-anticoagulada de dos pacientes con deficiencia en el FVII (tabla 3). El FT lipidado en forma dependiente de concentración, fue capaz de acelerar la coagulación de forma significativa en plasmas deficientes en FVII. De la misma manera, sangre total no anticoagulada de pacientes deficientes en el FVII se coagul� en presencia de bajas, medias y altas concentraciones de FT lipidado, indicando que es capaz de producir una coagulación normal mediante FT lipidado incluso en ausencia del FVII. La Tabla 3 muestra los resultados obtenidos de 5 experimentos independientes de plasmas deficitarios en FVII.

Tabla 3 Demostración del efecto procoagulante del FT lipidado en plasmas deficitarios en el FVII

Tiempo de coagulación (s)

Basal

con FTr

1 μg/ml

0,1 μg/ml 0,01 μg/ml

Plasma normal

215,1 � 24,6 11,1 � 0,2 15,3 � 0,2 25,7 � 0,4

Plasma deficiente en FVII > 300 67,7 � 7,.2 113,7 � 28,3 202,7 � 41,6

5 Media � SEM (n= 5)

El efecto del FT lipidado en sangre de voluntarios sanos fue significativo tras la concentración de 0,01 μg/ml, mientras que se necesitaron mayores concentraciones en pacientes deficientes del FVII (tabla 4). Aunque se detectaron efectos procoagulantes significativos (p<0,001) tras 0,1 μg/ml, el FT lipidado fue capaz de normalizar el

10 tiempo de coagulación a la concentración de 0,01 μg/ml, no existiendo diferencias entre los tiempos de coagulación detectados en sujetos normales en condiciones basales y en sujetos deficientes en FVII con dicha concentración de FT lipidado. Finalmente, aunque el FT lipidado a 1 μg/ml no fue capaz de inducir el mismo fuerte efecto procoagulante en plasma sin FVII, se observ� un efecto muy significativo, lo que indica que el FT lipidado puede normalizar la hemostasis en estos pacientes.

15 Tabla 4 Efecto procoagulante del FT lipidado en sangre total no anticoagulada de individuos sanos y deficientes de FVII

Basal

FTr

0,01 ng/ml

0,1 ng/ml 1 ng/ml 10 ng/ml 100 ng/ml

Muestra control no. 1

5,8 4,7 4,4 3,3 2,1 1,3

Muestra control no. 2

7,2 6,7 5,5 3,7 2,1 1,0

Paciente no. 6 deficiente en FVII

11,4 n.d. 10,5 9,5 5,2 2,3

Paciente no. 7 deficiente en FVII

12,5 n.d 11,3 10,5 6,3 3,1

n.d.; no determinado

1.3 El FT lipidado es capaz de coagular el plasma de sujetos sanos en presencia de un anticuerpo monoclonal frente al FVII (ensayos de coagulación)

25 Se realizaron ensayos de coagulación in vitro mostrando en efecto coagulante del FT en plasma de sujetos sanos en presencia de un anticuerpo monoclonal frente al FVII (este anticuerpo es capaz de bloquear la coagulación en plasmas normales).

30 Ensayos de coagulación en plasma normal carente de FVII mediante el bloqueo con anti-FVII

Se investigó el efecto del FT lipidado en la coagulación de plasma mediante ensayos de coagulación usando plasma de voluntarios sanos en presencia de un anticuerpo monoclonal frente a FVII (tabla 5). El FT lipidado fue capaz de provocar coagulación incluso en presencia de un anticuerpo monoclonal frente a FVII, (que es capaz de inhibir

35 completamente la coagulación sanguínea). Bajo estas condiciones experimentales (como plasmas deficientes en FVII), el FT lipidado es capaz de producir la coagulación del plasma.

Tabla 5 Demostración del efecto procoagulante del FT en plasma normal en presencia de un anticuerpo monoclonal 40 frente a FVII

Sin FTr

Con FTr 1 μg/ml

Plasma normal

126,8 28,1

Plasma normal con anti FVII (400 !g/ml)

216,8 42,5

1.4 Combinación de FT lipidado y SICN aumenta de forma sin�rgica la coagulación sanguínea en plasmas deficientes en FVII (ensayos de coagulación)

Se realizaron una serie de ensayos de coagulación in vitro mostrando el efecto coagulante del FT lipidado asociado

5 con una superficie inorgánica cargada negativamente (SICN) en plasma deficiente de FVII. Dicho efecto procoagulante excedió el obtenido cuando el FT lipidado se us� solo como un agente procoagulante. Estos resultados muestran que el efecto mediado por el FT lipidado es independiente del FVII y que es capaz de inducir la coagulación del plasma incluso en ausencia de su ligando específico. La Tabla 6 muestra los resultados obtenidos en 5 experimentos independientes.

10 Tabla 6 Efecto procoagulante del FTr asociado con superficies inorgánicas cargadas negativamente en plasmas heparinizados y deficientes en factor de coagulación

Tiempo de coagulación (s) Basal Con FTr

Plasma normal

-211,1� 18,5 1 μg/ml 18,6 � 0,1 1 μg/ml + SICN 13 � 1,2 *

Plasma deficiente en FVII

> 300 67 � 11 32 � 3,4 *

Media � SEM (n= 5); *p<0,001 sin SICN frente a con SICN; t-Student

1.5 La combinación de FT lipidado y FXa aumentan de forma sin�rgica la coagulación sanguínea en presencia de un anticuerpo monoclonal frente al FVII (ensayos de coagulación en plasmas deficientes en FX)

Se investigaron los efectos procoagulantes de la asociación del FT lipidado y el FXa a bajas concentraciones (170 20 pM y 1700 pM) en ausencia de FVII en plasmas deficientes en FXa inmunobloqueado con un anti-FVII (Tabla 7).

Tabla 7 Efecto procoagulante del FT lipidado asociado con FXa en plasma deficiente en FXa en ausencia de FVII (inmunobloqueado con anti FVII)

Plasma deficiente en FXa Tiempo de coagulación (s)

Sin FXa

Con FXa (1700 pM) Con FXa (170 pM)

Basal (calcio 5 mM)

> 400 133 � 18 290 � 10,2

Con FTr 1 μg/ml

253,5 � 11 83,1 � 3,2 * 124 � 6,1 *

Con FTr 1 μg/ml + anti FVII 234,5 � 9

78 � 2 * 124 � 6,1 *

(400 μg/ml)

Media � SEM (n= 5); *p<0,001 sin FXa frente a con FXa; t-Student

1.6 La combinación de FT lipidado, FXa y SICN aumenta de forma sin�rgica la coagulación sanguínea en presencia 30 de un anticuerpo monoclonal frente a FVII (ensayos de coagulación en plasmas deficientes en FX)

Tambi�n se investigaron los efectos procoagulantes de la asociación del FT lipidado, el FXa a bajas concentraciones (170 pM y 1700 pM) y una SICN en plasma deficiente en FXa (Tabla 8).

35 Tabla 8 Efecto procoagulante del FTr asociado con FXa y SICN en un plasma deficiente en FXa

Plasma deficiente en FXa Tiempo de coagulación (s)

Sin SICN (1 !l) Con SICN (2 !l)

Basal (calcio 5 mM) > 400 > 400 290 � 10,2 FTr 1 μg/ml + FXa (170 pM) 124 � 6,1 * 109 � 4,1 * 84 � 3 * FTr 1 μg/ml + FXa (1700 pM) 83,1 � 3,2 * 65,5 � 5,2 * 45,5 � 3,2 * FTr 1 μg/ml + FXa (170 pM) + anti 119 � 5 * 101 � 5 * 99 � 3 *

FVII (400 μg/ml ) FTr 1 μg/ml + FXa (1700 pM) + 78 � 2 27,7� 1,2 25 � 2 anti FVII (400 μg/ml )

Media � SEM (n= 5); *p<0,001 sin SICN frente a con SICN; t-Student

2. Ensayos in vitro que demuestran que la combinación del FT lipidado con FXa a bajas concentraciones (incapaces de inducir un efecto procoagulante) produce la coagulación de plasmas defectivos en FX

2.1 FT lipidado actúa como estimulador del FXa cuando esta ser�nproteasa est� presente a bajas concentraciones

5 Se realizaron ensayos de coagulación in vitro en plasma deficiente en FX para mostrar el efecto sin�rgico del FT lipidado sobre el FXa (añadido a bajas concentraciones, 170 pM y 1700 pM, a plasma deficiente en FX, por lo que estos plasmas son incapaces de producir FXa de ninguna ruta de coagulación). Los efectos procoagulantes de la asociación del FT lipidado y FXa a bajas concentraciones se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9 Efecto procoagulante del FT lipidado asociado con FXa en plasma deficiente de FXa

Plasma deficiente en FX

Tiempo de coagulación (s)

Sin FXa

Con FXa (1700 pM) Con FXa (170 pM)

Basal (5 mM calcio)

> 400 133 � 18 290 � 10.2

Con FTr 1 μg/ml

253,5 � 11 83,1 � 3.2 * 124 � 6.1 *

Media � SEM (n= 5); *p<0,001 sin FXa frente a con FXa; t-Student

2.2. La combinación del FT lipidado con FXa y SICN actúa de forma sin�rgica en la estimulaci�n del FXa

Se investigaron también los efectos procoagulantes de la asociación del FT lipidado, FXa a bajas concentraciones (170 pM y 1700 pM) y SICN en plasma deficiente en FX (Tabla 10). 20

Tabla 10 Efecto procoagulante del FT lipidado asociado con FXa y SICN en plasma deficiente de FXa

Plasma deficiente en FX Tiempo de coagulación (s)

Con SICN (1 !l)

Con SICN (2 !l)

Basal (5 mM calcio)

> 400 > 400 290 � 10.2

FTr 1 μg/ml + FXa (170 pM)

124 � 6.1 * 109 � 4.1 * 84 � 3 *

FTr 1 μg/ml + FXa (1700 pM)

83,1 � 3.2 * 65,5 � 5.2 * 45,5 � 3.2 *

Media � SEM (n= 5); *p<0,001 sin SICN frente a con SICN; t-Student

3. Ensayos in vitro que demuestran que el FT lipidado (solo o en combinación) causa la coagulación sanguínea en pacientes con deficiencias en otros factores de coagulación distintos del FVII

30 3.1 El FT lipidado coagula el plasma y la sangre de pacientes con deficiencias en los factores de coagulación FV, FVIII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII y FXIII

Se investigó el efecto procoagulante del FT lipidado (solo) en plasmas deficientes en factor de coagulación usando plasmas comerciales carentes mediante técnicas de inmunoafinidad, as� como en plasma de 3 pacientes 35 diagnosticados con hemofilia A (deficiente en FVIII) y 2 diagnosticados con hemofilia B (deficiente en FIX). La Tabla 11 muestra los resultados. La concentración de 1 μg/ml de FT lipidado fue capaz de coagular eficazmente todos los plasmas con deficiencias en FV, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII y FXIII. Por otro lado, en ausencia del conocido cofactor de FXa , FVa, el FT lipidado fue también capaz de producir la coagulación de plasma, aunque solo a concentraciones media y elevada. En las deficiencias de factores de coagulación restantes, el FT lipidado fue efectivo a todas las

40 concentraciones utilizadas, obteniéndose resultados excelentes a muy bajas concentraciones. Incluso en ausencia del FX (1%) el FT lipidado fue capaz de coagular pero sólo a altas concentraciones. Todos estos resultados se confirmaron con muestras de pacientes con hemofilia A y hemofilia B.

Tabla 11

Efecto procoagulante del FT lipidado en plasmas deficientes del factor de coagulación Tiempo de coagulación (s)

Sin FTr

Con FTr

-

1 μg/ml 0,1 μg/ml 0,01 μg/ml

Plasma normal

215.1 � 24.6 11,1 � 0,2 15,3 � 0,2 25,7 � 0,4

Plasma FV-D

> 600 84,3� 15,2 123,3 � 24,5 350 � 29,5

Plasma FVIII-D

> 600 15,5 � 2,3 21,5 � 2,8 32,1 � 2,6

Plasma FIX-D

> 600 14,8 � 3,2 22,3 � 2,5 34,6 � 2,4

Plasma FX-D

> 600 446,2 � 32 > 600 > 600

Plasma FXI-D

> 600 14,3 � 0,5 19,4 � 1,5 27,3 � 0,6

Plasma FXII-D

> 600 16,2 � 0,3 22,5 � 1,1 32,5 � 0,5

Plasma FXIII-D

> 600 14,2 � 0,3 21,5 � 1,0 30,5 � 0,5

Plasma Hemofilia A

> 600 12,2 � 1,5 13,8� 0,6 21,3 � 0,8

Plasma Hemofilia B

> 600 12,1 � 0,5 15,3 � 0,4 26,8� 0,6

Media � SEM (n= 5)

5 Se evalu� mediante un ensayo de coagulación el efecto procoagulante del FT lipidado (solo) en sangre total humana no anticoagulada de personas que sufrían hemofilia A y B. La formación del coágulo se determin� estimando el tiempo en minutos para que se consolidara el coágulo. El efecto del FT lipidado en sangre de voluntarios sanos fue significativo a concentraciones de 0,001 μg/ml, mientras que se necesitaron mayores dosis en pacientes hemofílicos,

10 detect�ndose efectos procoagulantes significativos (p<0,001) a partir de 0,01 μg/ml. A la concentración de 0,1 μg/ml el FT lipidado fue capaz de normalizar completamente el tiempo de coagulación, no existiendo diferencias entre los tiempos de coagulación detectados en sujetos normales y en hemofílicos. La tabla 12 muestra los resultados obtenidos de 4 muestras de individuos sanos (muestras números 1-4), 3 de pacientes que sufrían hemofilia A y 2 con hemofilia B.

Tabla 12 Efecto procoagulante del FT lipidado en sangre total no anticoagulada de sujetos sanos y pacientes hemofílicos

Basal FTr

0,001 μg/ml

0,01 μg/ml 0,1 μg/ml

Muestra control no. 1

5,8 3,3 2,1 1,3

Muestra control no. 2

7,2 3,7 2,1 1,0

Muestra control no. 3

7,2 4,2 2,1 0,9

Muestra control no. 4

7,5 3,8 2,0 1,0

Paciente no. 1 Hemofilia A

13,3 8,0 4,6 1,6

Paciente no. 2 Hemofilia A

17,3 9,0 5,6 1,0

Paciente no. 3 Hemofilia A

15,3 12,4 7,0 1,5

Paciente no. 4 Hemofilia B

20,5 11,1 6,1 1,5

Paciente no. 5 Hemofilia B 16,3 11,3 5,5 1,6

20 Tiempo de coagulación (expresado en minutos): el tiempo que el coágulo necesita en una muestra de sangre no anticoagulada

3.2 El FT lipidado coagula la sangre total y el plasma previamente heparinizado

25 El FT lipidado fue capaz de coagular plasmas (Tabla 13) y sangre total no anticoagulada (Tabla 14) previamente tratadas con altas concentraciones de heparina, demostrando que su efecto sobre el FXa es independiente del efecto inhibidor mediado por este fármaco anticoagulante, incluso en presencia de inhibidores de heparina.

Tabla 13

Efecto del FT lipidado en plasma heparinizado (tiempo de coagulación en segundos)

5 Tabla 14

Sin TF lipidado Con TF lipidado Control 320,4 � 160 17,2 � 1 Heparina 3 U/ml > 600 58 � 12 Efecto del FT lipidado en sangre total heparinizada (tiempo de coagulación en minutos)

Control Heparina 0,25 U/ml Heparina 1 U/ml

Sin TF lipidado 3,96 � 0,54 12,45 � 0,69 26,6 � 5,76 Con TF lipidado 0,4 � 0,28 15,7 � 0,22 4,5 � 2,38

3.3. El FT lipidado coagula el plasma de animales tratados con warfarina

10 El FT lipidado fue capaz de coagular plasmas de ratas tratadas con warfarina siguiendo el protocolo especificado en los métodos. Los resultados mostrados en la tabla 15 indican que incluso cuando se inhibe la síntesis de todos los factores de coagulación dependientes de vitamina K, el FT lipidado es capaz de coagular, demostrando que su efecto sobre el FXa es independiente del efecto inhibitorio mediado por estos fármacos anticoagulantes.

Tabla 15 Efecto del FT lipidado en plasma de animales tratados con warfarina (tiempo de coagulación en segundos)

sin TF lipidado Con TF lipidado (1 μg/ml)

Control 49 � 10.2 10,9 � 2.2

Plasmas

tratados con 60,1 � 5.6 12,8 � 3.2

warfarina

(0,1 mg/kg durante

3 días)

20 3.4. La combinación de FT lipidado con SICN aumenta sin�rgicamente la coagulación sanguínea en plasma de pacientes con deficiencias en los factores de coagulación FV, FVIII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII y FXIII (ensayos de coagulación en plasmas deficientes en factores de coagulación) y en sangre total de pacientes hemofílicos

Se realizaron una serie de ensayos de coagulación in vitro mostrando el efecto del FT lipidado asociado con SICN

25 en plasma de pacientes deficientes en factores de coagulación (FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII y FXIII). Dicho efecto procoagulante excedió el obtenido cuando se us� el FT lipidado solo como agente procoagulante. Incluso a bajas concentraciones (1 μg/ml) con la que el FT lipidado no fue capaz de coagular el plasma deficiente en FV (plasma D-FV), la combinación de ambos agentes produjo un efecto procoagulante significativo. Asimismo, se obtuvieron efectos sin�rgicos similares cuando se us� plasma deficiente en FVII (plasma D-FVII). Estos resultados

30 muestran que el efecto mediado por el FT lipidado es independiente de FVII y es capaz de inducir la coagulación del plasma incluso en ausencia de FV. De forma similar, la combinación (FT lipidado + SICN) también produjo potentes efectos procoagulantes en muestras de plasma de pacientes hemofílicos (A y B). La Tabla 16 muestra los resultados obtenidos en 5 experimentos independientes.

Tabla 16

Efecto procoagulante del FTr asociado con SICN en plasmas deficientes en factor de coagulación Tiempo de coagulación (s) Sin FTr Con FTr

-

1 μg/ml 1 μg/ml + SICN

plasma normal

281,1� 12,5 11,1 � 0,2 9,1 � 0,4 *

plasma D-FV

> 600 84,3� 15,2 55,2 � 2,3 *

plasma D-FVIII

> 600 15,5 � 2,3 10,1 � 0,5 *

plasma D-FIX

> 600 14,8 � 3,2 10,3 � 0,2 *

plasma D-FX

> 600 446,2 � 32 253,5 � 19 *

plasma D-FXI

> 600 14,3 � 0,5 11,5 � 0,6 *

plasma D-FXII

> 600 16,2 � 0,3 12,9 � 1,5 *

plasma D-FXIII

> 600 14,2 � 0,3 10,8 � 0,9 *

plasma Hemofilia A

> 600 12,2 � 1,5 10,4 � 0,9 *

plasma Hemofilia B

> 600 12,1 � 0,5 10,1� 0,8 *

Media � SEM (n= 5); *p<0,001 sin SICN frente a con SICN; t-Student

5 También se investigó el efecto procoagulante de la combinación de FT lipidado y SICN en sangre total no anticoagulada mediante ensayos de coagulación usando sangre de pacientes que sufrían hemofilia A (3 pacientes) y B (2 pacientes). El efecto procoagulante de la asociación (FTr + SICN) fue significativamente mayor (p<0,001) (Tabla 17) en comparación con los ensayos en los que el FT lipidado estaba solo (Tabla 12).

10 Tabla 17 Efecto procoagulante del FTr junto con SICN en sangre total

Sin SICN Con SICN

Muestra control 7,1 � 0,6 6,0 � 1,4 *

FTr 0.1 μg/ml 1,1 � 0,9 0,5 � 0,1 *

Basal

FTr 0,1 �g/ml + SICN

Paciente no. 1 Hemofilia A

13,3 6,8 *

Paciente no. 2 Hemofilia A

17,3 7,2 *

Paciente no. 3 Hemofilia A

15,3 9,1 *

Paciente no. 4 Hemofilia B

20,5 8,5 *

Paciente no. 5 Hemofilia B

16,3 8,6 *

Tiempo de coagulación (expresado en minutos); el tiempo que el coágulo necesita para consolidarse en una muestra de sangre no anticoagulada

4. Ensayos in vitro que demuestran que el FT lipidado (solo o combinado) provoca la coagulación de la sangre en sujetos sanos

4.1 El FT lipidado coagula el plasma y la sangre de sujetos sanos

20 Se realizaron una serie de ensayos de coagulación in vitro que mostraban el efecto coagulante del FT lipidado en plasma y sangre total no anticoagulada de voluntarios sanos sin historial de alteraciones hemost�ticas. La tabla 18 muestra los resultados obtenidos de 5 experimentos independientes en plasmas sanos y la tabla 19 en sangre total no anticoagulada.

Tabla 18

Efecto procoagulante del FT lipidado en plasma de sujetos sanos

Plasma normal Tiempo de coagulación (s)

Basal 281,08 � 12,5

FTr 0,0001 μg/ml 201 � 12,2

FTr 0,0001 μg/ml 184 � 5,8

FTr 0,01 μg/ml 73,5 � 2,3

FTr 0,1 μg/ml 28,6 � 0,1

FTr 1 μg/ml 16,4 � 0,9

Media � SEM (n= 5); el FT no lipidado a la misma concentración no fue capaz de modificar el tiempo de coagulación

Tabla 19 Efecto procoagulante del FT en sangre no anticoagulada de sujetos sanos

Basal FTr

0,01 μg/ml 0,1 μg/ml 1 μg/ml

Muestra no. 1 5,8 3,3 2,1 1,3

Muestra no. 2 7,2 3,7 2,1 1,0

Muestra no. 3 7,2 4,2 2,1 0,9

Muestra no. 4 7,5 3,8 2,0 1,0

4.2 La combinación de FT lipidado con SICN aumenta de forma sin�rgica la coagulación sanguínea en plasma y sangre de sujetos sanos. Ausencia de efectos sin�rgicos cuando el FT lipidado est� asociado a fosfol�pidos

Se realizaron una serie de ensayos de coagulación in vitro mostrando el efecto coagulante del FTr asociado con

15 SICN en plasma de voluntarios sanos. La Tabla 20 muestra los resultados obtenidos de 5 experimentos independientes. El efecto procoagulante de la asociación (FTr + SICN) fue significativamente superior (p<0,001) en cada una y en todas las concentraciones empleadas en comparación con los ensayos en los que el FTr estaba solo.

Tabla 20 20 Efecto procoagulante del FT lipidado asociado con SICN en plasma normal

Plasma normal

Tiempo de coagulación (s)

Sin SICN

Con SICN

Basal

281,08 � 12,5 167 � 10 *

FTr 0,0001 μg/ml

201 � 12,2 69 � 0,8*

FTr 0,001 μg/ml

184 � 5,8 44,9 � 3,2 *

FTr 0,01 μg/ml

73,5 � 2,3 30,6 � 2.5*

FTr 0,1 μg/ml

28,6 � 0,1 16 � 4,2*

FTr 1 μg/ml

16,4 � 0,9 12,8 � 0,5*

Media � SEM (n= 5); *p<0,001 sin SICN vs con SICN: t-Student

La Tabla 21 muestra la ausencia de efectos sin�rgicos cuando el FT lipidado est� asociado con fosfol�pidos (0,66 25 mM de FC/FS; fosfatidilcolina/fosfatidilserina a diferente ratio molar).

Tabla 21

Efecto de los fosfol�pidos en la actividad procoagulante del FT lipidado

FT lipidado (0,1 μg/ml) Tiempo de coagulación (s)

Sin FC/FS 37,9

con FC/FS 90/10 44

80/20 39,7

70/30 41,7

60/40 40,1

50/50 43,5

40/60 34,6

30/70 41,5

20/80 44,3

10/90 41,9

5. Ensayos in vitro que demuestran el efecto coagulante del FT lipidado (solo y combinado) en sangre de 5 pacientes con alteraciones plaquetarias (trombocitop�nicas) congénitas y adquiridas

5.1 El FT lipidado coagula la sangre total de pacientes con alteraciones plaquetarias congénitas

Se investigó el efecto coagulante del FT lipidado en la coagulación sanguínea en pacientes con alteraciones

10 plaquetarias mediante ensayos de coagulación usando sangre de dos pacientes que sufrían la enfermedad de Glanzmann y el Síndrome de Bernard. El FTr fue capaz de acelerar de forma muy significativa, y de una forma dependiente de concentración, la coagulación sanguínea en individuos que padecían la enfermedad de Glanzmann y el Síndrome de Bernard Soulier (Tabla 22); el FTr es, por tanto, un agente útil en el tratamiento de dichos individuos.

15 Tabla 22 Efecto procoagulante del FT en pacientes con alteraciones plaquetarias

Basal FTr

0,01 μg/ml

0,1 μg/ml 1 μg/ml

Muestra control no. 1

5,8 3,3 2,1 1,3

Paciente no. 6 enf. de Glanzmann

13,6 7,3 3,4 2,9

Paciente no. 7 S. Bernard-Soulier 11,9 7,1 4,1 3,1

20 5.2 La combinación de FT lipidado con SICN aumenta la coagulación en sangre total de pacientes con alteraciones plaquetarias congénitas

Se llevaron a cabo una serie de ensayos de coagulación in vitro que mostraron el efecto coagulante del FTr asociado con SICN en sangre total de pacientes con alteraciones plaquetarias congénitas. En la tabla 23 se

25 muestran los resultados obtenidos de dos pacientes con la enfermedad de Glanzmann y con el Síndrome de Bernard-Soulier. Comparando con los ensayos en los que se usaba el FTr solo, el efecto procoagulante de la asociación (FTr + SICN) fue significativamente superior en cada paciente (p<0,001).

Tabla 23 30 Efecto procoagulante del FTr junto con SICN en sangre total

Sin SICN Con SICN

Muestra control

7,1 � 0,6 6,0 � 1,4 *

FTr 0,1 μg/ml

1,1 � 0,9 0,5 � 0,1 *

Basal

FTr 0,1 μg/ml + SICN

Paciente no. 6 Enf. Glanzmann

13,6 4,7 *

Paciente no. 7 S. Bernard-Soulier 11,9 4,6 *

Tiempo de coagulación (expresado en minutos): tiempo que el coágulo necesita para consolidarse en una muestra de sangre no anticoagulada. *p<0,001 sin SICN vs con SICN; t-Student

5.3 El FT lipidado coagula muestras trombocitop�nicas

Se llevaron a cabo una serie de ensayos de coagulación in vitro que mostraban el efecto coagulante del FT lipidado 5 en plasmas con diferente número de plaquetas. La tabla 24 muestra los resultados obtenidos de un número normal de plaquetas a condiciones trombocitop�nicas.

Tabla 24 Efecto del FT lipidado en muestras trombocitop�nicas

N�meroplaquetas

de Sin FT lipidado Con FT lipidado (1 �g/ml)

350,000/!l

226,3 21,9

150,000/!l

232,6 22,8

50,000/!l

253,9 22,4

9,000/!l

321,2 21,3

< 1,000/!l > 400 21,3 10

6. Ensayos in vivo que demuestran que el FT es un agente útil en el tratamiento antihemorr�gico t�pico en ratas control (mediante aplicación directa en el vaso sanguíneo previamente seccionado)

15 6.1 El FT lipidado es útil como agente hemost�tico t�pico en un modelo animal de hemorragia severa mediante sección proximal de colas de rata.

Se realizaron ensayos in vivo que mostraron que el FT lipidado administrado solo o asociado con SICN es un agente

�til en el tratamiento antihemorr�gico t�pico. Se evalu� el uso del FT lipidado como agente hemost�tico t�pico 20 administrado solo o combinado con SICN mediante el uso de un modelo animal de hemorragia severa mediante

secci�n proximal de colas de rata. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 25. Como se puede observar,

en dicho modelo animal de hemorragia severa, la hemorragia coagul� espontáneamente en los animales control

(control SSF, tratados con solución salina fisiológica) a los 18,1 � 5,98 minutos; sin embargo, la administración típica

del FTr lipidado (solo) produjo una reducción significativa (11,1 � 5,54 minutos, p<0,001). Cuando se administr� el 25 FTr en combinación con una SICN el efecto procoagulante fue incluso mayor (5,0 � 1,1 minutos, p<0,001).

Tabla 25 Modelo de hemorragia severa mediante sección proximal de cola de ratas. Tiempo 30 de coagulación de sangrado

Tiempo de coagulación de sangrado

Grupo control salino (n=14) 18,16 �5,98

Grupo tratado con FT lipidado (n=5) 11,1 � 5,5

FT lipidado +SICN (n=4) 5,0 � 1,1

Los resultados se expresan como el tiempo en minutos para alcanzar una coagulación consolidada

35 Se evalu� el FT no lipidado bajo las mismas condiciones experimentales (n=3). No se observaron efectos y el tiempo de coagulación de sangrado fue similar al de los animales control. Estos resultados indican que el FT no lipidado no es útil para el tratamiento t�pico de episodios de sangrado.

6.2 El FT lipidado es útil como agente hemost�tico t�pico en un modelo animal de hemorragia severa previamente 40 tratado con heparina o warfarina

Se realizaron ensayos in vivo que mostraron que el FT lipidado administrado solo es un agente útil en el tratamiento antihemorr�gico t�pico en condiciones anticoagulantes (Tabla 25). Se evalu� el uso del FT lipidado como agente hemost�tico t�pico administrado solo mediante el empleo de un modelo animal de hemorragia severa mediante la 45 sección proximal de colas de rata previamente tratadas con 200 U/Kg de heparina i.v. 15 minutos antes de comenzar el procedimiento de la transecci�n de la cola o con 0,1 mg/kg/día por vía oral de warfarina durante 3 días antes de empezar el procedimiento de transecci�n de la cola. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 26. Como puede observarse, en dicho modelo de hemorragia severa, el grupo de control salino, tratado con solución salina fisiológica, coagul� espontáneamente a los 18,1 � 5,98 minutos. El grupo control tratado con heparina no coagul� la

hemorragia de forma espontánea (> 90 minutos). El grupo tratado con warfarina coagul� espontáneamente a los 41,6 � 8,5 minutos. La tabla 26 muestra que la administración típica del FT lipidado (solo) produjo una reducción significativa en todos los grupos de tratamiento.

5 Tabla 26

Modelo de hemorragia severa mediante sección proximal de colas de rata en animales tratados

con anticoagulante. Tiempo de coagulación de sangrado

Tiempo de coagulación de sangrado (min)

Grupo control salino (n=14)

18,16 �5,98

Grupo control tratado con heparina (n=5)

> 90

Grupo control tratado con warfarina (n=2)

41,6 � 8,5

Grupo tratado con heparina (n=3) + FT lipidado

26,3 � 2,5

Grupo tratado con warfarina (n=3) + FT lipidado 4,5 � 2,5

10 Los resultados se expresan como el tiempo en minutos para alcanzar una coagulación consolidada

6.3 El FT lipidado es útil como agente hemost�tico t�pico en un modelo animal de hemorragia letal mediante punci�n en la arteria carótida.

15 Se realizaron ensayos in vivo que mostraron que el FTr administrado solo es un agente útil para el tratamiento antihemorr�gico t�pico directamente aplicado en el vaso sanguíneo. Se evalu� el uso del FTr administrado solo mediante el uso de un modelo animal de hemorragia letal mediante punci�n de la arteria carótida. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 27 y fueron muy significativos. Como puede observarse, en el grupo de animales control, (control SSF, tratados con solución salina fisiológica), todos los animales murieron por sangrado, mientras

20 que en el grupo del FT lipidado no murió ningún animal y la sección se pudo sellar y coagular satisfactoriamente en todos los casos. El tratamiento fue efectivo en términos de tiempo necesario para alcanzar una coagulación estable y el sellado de la herida de punci�n.

Tabla 27 25 Modelo de hemorragia letal por punci�n en arteria carótida de ratas

Control SF FTr

animal no. 1 muerto animal no. 3 125

animal no. 2 muerto animal no. 4 135

Media � DE 130 � 7.1 Los resultados se expresan como el tiempo en segundos para alcanzar una coagulación consolidada y el sellado de la herida de punci�n. El FTr administrado como se indica en el texto a una dosis de 2 μg de proteína activa

30 En conclusión:

Los resultados del Ejemplo número 1 demuestran claramente que:

1)

en ausencia de su ligando, FVII, el FT lipidado es capaz de interaccionar directamente con el FXa

35

aumentando significativamente su actividad proteol�tica (tanto la amidol�tica como la formadora de

trombina), estos resultados muestran por primera vez un nuevo papel del FT lipidado, actuando como

nuevo cofactor para el FXa (independiente del bien conocido FVa).

2)

El FT lipidado es capaz de coagular plasmas deficientes en FVII. Por tanto, el FT lipidado es una buena

alternativa para el tratamiento de estos pacientes (actualmente el único tratamiento es el caro FVIIa

40

recombinante).

3)

El FT lipidado actúa sin�rgicamente con SICN y FXa (a bajas concentraciones incapaz de producir

coagulaci�n).

Los resultados del Ejemplo número 2 demuestran claramente que: 45

1) El FT lipidado produce que concentraciones fisiológicas de FXa, incapaces de producir ningún efecto procoagulante significativo, desencadenen la hidrólisis de la protrombina y consecuentemente tiene lugar la formación de trombina.

2) El FT lipidado tiene un nuevo papel actuando como cofactor para todas las actividades proteol�ticas de 50 todas las formas de FXa (soluble y unido al complejo protrombinasa).

3) Incluso en plasmas deficientes en FX (que contienen trazas de FX) pueden coagularse por el FT lipidado. Por tanto, el FT lipidado es una buena alternativa para el tratamiento de estos pacientes,

4) El FT lipidado actúa de forma sin�rgica con una SICN en la estimulaci�n de la actividad del FXa.

Los resultados del Ejemplo número 3 demuestran claramente que:

1) El FT lipidado es capaz de producir la coagulación sanguínea en pacientes hemofílicos (FVIII, FIX y FXI). Por tanto, el FT lipidado es una buena alternativa para el tratamiento de estos pacientes.

2) El FT lipidado es capaz de producir la coagulación sanguínea incluso en ausencia de FV. Estos resultados muestran claramente que el FT lipidado produce un efecto estimulador fuerte en FXa, porque en ausencia de su cofactor (plasmas deficientes en FV), el FT lipidado actúa como cofactor causando el mismo efecto estimulador.

3) El FT lipidado es capaz de producir la coagulación sanguínea incluso en plasmas deficientes en FX (que contiene trazas de FX). Por tanto, el FT lipidado es una alternativa para el tratamiento de estos pacientes.

4) El FT lipidado es capaz de producir la coagulación sanguínea en plasmas tratados con heparina y warfarina, indicando, que el FT lipidado interfiere en el efecto de la antitrombina III y probablemente a través de su efecto estimulador a concentraciones de FXa basales puede incluso coagular en condiciones de tratamiento con warfarina.

5) Finalmente, el FT lipidado actúa sin�rgicamente con SICN en el efecto procoagulante observado en todas las deficiencias en factores de coagulación.

Los resultados del Ejemplo número 4 demuestran claramente que:

1) El FT lipidado es capaz de producir la coagulación sanguínea en sujetos sanos. Por tanto, el FT lipidado es una buena alternativa para el tratamiento de episodios de sangrado en sujetos sanos.

2) El FT lipidado actúa sin�rgicamente con SICN pero no solo con fosfol�pidos en el efecto procoagulante observado en sujetos sanos.

Los resultados del Ejemplo número 5 demuestran claramente que:

1) El FT lipidado es capaz de producir la coagulación sanguínea en sujetos con alteraciones plaquetarias, como congénitas y adquiridas (p. ej. trombocitopenia). Por tanto, el FT lipidado es una buena alternativa para el tratamiento de episodios de sangrado en pacientes con alteraciones en el número y/o funcionalidad de las plaquetas.

Los resultados del Ejemplo número 6 demuestran claramente que:

1) El FT lipidado administrado típicamente es capaz de parar el sangrado en un modelo animal de hemorragia severa (transecci�n proximal total en cola).

2) El FT lipidado administrado típicamente es capaz de parar el sangrado in un modelo animal de hemorragia severa (transecci�n proximal total en cola) complicada con una terapia de anticoagulaci�n (heparina o warfarina).

3) El FT lipidado administrado típicamente es capaz de parar el sangrado en un modelo animal de hemorragia letal (punci�n carótida en la arteria carótida).

Claims (28)

1. REIVINDICACIONES

   1. Factor Tisular (FT) lipidado, o un fragmento funcional lipidado del mismo, para usar en el tratamiento t�pico de hemorragias en un sujeto, con la condición que:

   (i)

   el FT lipidado no es un FT de mamífero recombinante o un fragmento funcional del mismo obtenido de plantas transg�nicas, y

   (ii)

   el FT lipidado no es un FT lipidado que tiene un 70% de PC y un 30% de PS y que comprende un FT producido en E. coli que tiene la secuencia

2. 2.

   Factor Tisular (FT) lipidado, o un fragmento funcional lipidado del mismo según la reivindicación 1, en donde el sujeto es un sujeto sano.

3. 3.

   Factor Tisular (FT) lipidado, o un fragmento funcional lipidado del mismo para usar en el tratamiento t�pico de una hemorragia en un sujeto, en donde dicho sujeto es un sujeto con una di�tesis hemorrágica, donde dicha di�tesis hemorrágica comprende una coagulopat�a y/o una alteración plaquetaria.

4. 4.

   Factor Tisular (FT) lipidado, o un fragmento funcional lipidado del mismo según la reivindicación 3, en donde dicha coagulopat�a es una coagulopat�a congénita o una coagulopat�a adquirida.

5. 5.

   Factor Tisular (FT) lipidado, o un fragmento funcional lipidado del mismo según la reivindicación 4, en donde dicha coagulopat�a congénita es una coagulopat�a basada en una deficiencia en un factor de coagulación seleccionado entre Factor de coagulación V, Factor de coagulación VII, Factor de coagulación VIII, Factor de coagulación IX, Factor de coagulación X, Factor de coagulación XI, Factor de coagulación XII, Factor de coagulación XIII y combinaciones de los mismos.

6. 6.

   Factor Tisular (FT) lipidado, o un fragmento funcional lipidado del mismo según la reivindicación 4, donde dicho sujeto tiene una coagulopat�a adquirida producida por un tratamiento anticoagulante con anticoagulantes.

7. 7.

   Factor Tisular (FT) lipidado, o un fragmento funcional lipidado del mismo según la reivindicación 6, donde los anticoagulantes son heparina, heparinas de bajo peso molecular, warfarina, derivados de cumarina o dicumarinas.

8. 8.

   Factor Tisular (FT) lipidado, o un fragmento funcional lipidado del mismo según la reivindicación 3, en donde dicho sujeto presenta una alteración plaquetaria congénita o adquirida.

9. 9.

   Factor Tisular (FT) lipidado, o un fragmento funcional lipidado del mismo según la reivindicación 8, en donde dicha alteración plaquetaria congénita se selecciona entre la enfermedad de Glanzamnn, el síndrome de Bernard Soulier, el síndrome de Bolin-Jamieson, el síndrome de Wiskott-Aldrich, el síndrome de Paris-Trousseau-Jacobsen, la trombocitopenia del cromosoma X, el síndrome plaquetario de Gray, el síndrome de Sebastián y la anemia de Fanconi.

10. 10.

    Factor Tisular (FT) lipidado, o un fragmento funcional lipidado del mismo según la reivindicación 8, en donde dicha alteración plaquetaria adquirida se selecciona entre un trastorno mieloproliferativo, tal como trombocitemia, policitemia, o leucemia mieloc�tica crónica; metaplasia mieloide; disproteinemias en escorbuto, en la enfermedad cardíaca congénita y en cirrosis.

11. 11.

    Factor Tisular (FT) lipidado, o un fragmento funcional lipidado del mismo según la reivindicación 1, en donde dicho FT lipidado es FT lipidado humano.

12. 12.

    Producto que comprende (i) FT lipidado y (ii) factor X de coagulación activado (FXa) de manera separada o como combinación para usar en su administración simultánea o sucesiva a un sujeto.

13. 13.

    Producto que comprende (i) FT lipidado y (ii) superficie inorgánica cargada negativamente (SICN) ya sea de manera separada o como combinación para usar en su administración simultánea o sucesiva a un sujeto, en donde SICN es una mezcla de un lípido y un acelerador de coagulación sanguínea, en donde el acelerador de coagulación sanguínea se selecciona del grupo de ácido el�gico, zeolita, sílice y materiales de óxido inorgánico, en donde el lípido se selecciona del grupo de un esfingol�pido y un lípido con base glicerol, en donde el esfingol�pido se selecciona del grupo de ceramida-1-fosfato, fosfatidiletanolamina glicosilada, sulfatidos hidroxilados y no

    hidroxilados y gangli�sidos y, en donde el lípido con base glicerol se selecciona del grupo de fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilinositol fosfato, ácido fosfat�dico, fosfatidilgliceroles y cardiolipina.

14. 14.

    Producto que comprende (i) FT lipidado, (ii) FXa y (iii) SICN ya sea de manera separada o una combinación para usar en su administración simultánea o sucesiva a un sujeto, en donde la SICN es una mezcla de un lípido y un acelerador de la coagulación sanguínea, en donde el acelerador de coagulación sanguínea se selecciona del grupo de ácido el�gico, zeolita, sílice y materiales de óxido inorgánico, en donde el lípido se selecciona del grupo de un esfingol�pido y un lípido con base glicerol, en donde el esfingol�pido se selecciona del grupo de ceramida-1-fosfato, fosfatidiletanolamina glicosilado, sulfatidos hidroxilados y no hidroxilados y gangli�sidos y, en donde el lípido con base glicerol se selecciona del grupo de fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilinositol fosfato, ácido fosfat�dico, fosfatidilgliceroles y cardiolipina.

15. 15.

    Producto para usar según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde dicho FT lipidado es un FT lipidado humano.

16. 16.

    Producto para usar según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, como medicamento.

17. 17.

    Producto según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 para usar en el tratamiento de hemorragias en un sujeto.

18. 18.

    Producto según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 para usar en el tratamiento t�pico de hemorragias en un sujeto.

19. 19.

    Complejo (FT::FXa) que comprende FT lipidado y FXa.

20. 20.

    Complejo FT:SICN que comprende FT lipidado y SICN, en donde SICN es una mezcla de un lípido y un acelerador de la coagulación sanguínea, en donde el acelerador de coagulación sanguínea se selecciona del grupo de ácido el�gico, zeolita, sílice y materiales de óxido inorgánico, en donde el lípido se selecciona del grupo de un esfingol�pido y un lípido con base glicerol, en donde el esfingol�pido se selecciona del grupo de ceramida-1-fosfato, fosfatidiletanolamina glicosilado, sulfatidos hidroxilados y no hidroxilados y gangli�sidos y, en donde el lípido con base glicerol se selecciona del grupo de fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilinositol fosfato, ácido fosfat�dico, fosfatidilgliceroles y cardiolipina.

21. 21.

    Complejo FT::FXa::SICN que comprende FT lipidado, FXa y SICN, en donde lSICN es una mezcla de un lípido y un acelerador de la coagulación sanguínea, en donde el acelerador de coagulación sanguínea se selecciona del grupo de ácido el�gico, zeolita, sílice y materiales de óxido inorgánico, en donde el lípido se selecciona del grupo de un esfingol�pido y un lípido con base glicerol, en donde el esfingol�pido se selecciona del grupo de ceramida-1fosfato, fosfatidiletanolamina glicosilado, sulfatidos hidroxilados y no hidroxilados y gangli�sidos y, en donde el lípido con base glicerol se selecciona del grupo de fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilinositol fosfato, ácido fosfat�dico, fosfatidilgliceroles y cardiolipina.

22. 22.

    Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 para usar como medicamento.

23. 23.

    Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 para usar en el tratamiento de hemorragias en un sujeto.

24. 24.

    Complejo según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 para usar en el tratamiento t�pico de hemorragias en un sujeto.

25. 25.

    Composición farmacéutica que comprende:

    (a)

    un producto según la reivindicación 12, junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable; o

    (b)

    separadamente (i) FT lipidado junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable y (ii) FXa junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable; o

    (c)

    un producto de acuerdo con la reivindicación 13, junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable; o

    (d)

    de manera separada, (i) FT lipidado junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable y (ii) SICN junto con

    un vehículo farmac�uticamente aceptable, en donde SICN es una mezcla de un lípido y un acelerador de la coagulación sanguínea, en donde el acelerador de coagulación sanguínea se selecciona del grupo de ácido el�gico, zeolita, sílice y materiales de óxido inorgánico, en donde el lípido se selecciona del grupo de un esfingol�pido y un lípido con base glicerol, en donde el esfingol�pido se selecciona del grupo de ceramida-1-fosfato, fosfatidiletanolamina glicosilado, sulfatidos hidroxilados y no hidroxilados y gangli�sidos y, en donde el lípido con base glicerol se selecciona del grupo de fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilinositol fosfato, ácido fosfat�dico, fosfatidilgliceroles y cardiolipina; o

    (e)

    producto según la reivindicación 14, junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable; o

    (f)

    de manera separada, (i) FT lipidado junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable, (ii) FXa junto con un

    veh�culo farmac�uticamente aceptable, y (iii) SICN junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable, en donde SICN es una mezcla de un lípido y un acelerador de la coagulación sanguínea, en donde el acelerador de coagulación sanguínea se selecciona del grupo de ácido el�gico, zeolita, sílice y materiales de óxido inorgánico, en donde el lípido se selecciona del grupo de un esfingol�pido y un lípido con base glicerol, en donde el esfingol�pido se selecciona del grupo de ceramida-1-fosfato, fosfatidiletanolamina glicosilado, sulfatidos hidroxilados y no hidroxilados y gangli�sidos y, en donde el lípido con base glicerol se selecciona del grupo de fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilinositol fosfato, ácido fosfat�dico, fosfatidilgliceroles y cardiolipina; o

    (g)

    un complejo FT::FXa según la reivindicación 19 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable, o

    (h)

    un complejo FT::SICN según la reivindicación 20 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable, o

    (i)

    un complejo FT::FXa::SICN según la reivindicación 21 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable.

26. 26.

    Composición farmacéutica según la reivindicación 15 en una forma de administración farmacéutica para su administración típica.

27. 27.

    Producto que comprende una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 26 y un soporte.

28. 28.

    Producto que comprende una composición farmacéutica que comprende:

    (i)

    un soporte y

    (ii)

    un producto o complejo seleccionado del grupo que consiste en:

    (i)

    un producto según la reivindicación 12 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable,

    (ii)

    un producto según la reivindicación 13 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable,

    (iii) un producto según la reivindicación 14 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable, o

    (iv)

    un complejo FT::FXa según la reivindicación 19 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable,o

    (v)

    un complejo FT::SICN según la reivindicación 20 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable, o

    (vi)

    un complejo FT::FXa::SICN según la reivindicación 21 junto con un vehículo farmac�uticamente aceptable.