KR20080043324A - 신규 국소 항출혈제로서의 활성화된 인자 Ｘ (ＦＸａ)의자극제 - Google Patents

Abstract

본 발명의 활성화 응집인자 X (FXa) 자극제는 임의 대상에서의 출혈의 치료에 사용될 수 있다. 건강한 대상 또는 출혈성 특이 체질을 가진 환자에서의 출혈의 국소 치료에 특히 유용한 화합물들 및 조합물들을 기재하였다.

Description

신규 국소 항출혈제로서의 활성화된 인자 Ｘ (ＦＸａ)의 자극제{STIMULATORS OF FACTOR X ACTIVATED (FXa) AS NEW TOPICAL ANTIHEMORRHAGIC AGENTS}

본 발명은 FXa 자극제의 이용에 의한, 어떤 대상에서의 출혈의 국소 치료에 관한 것이다. 본 발명은 지질화된 조직 인자 (TF)가 가용성이고 프로트롬비나아제 (prothrombinase) 복합체에 결합된, 두 가지의 FXa의 형태 모두의 모든 단백분해 활성 (아미드분해성 (amidolytic) 및 프로트롬빈 가수분해성 활성)을 자극하는 신규 조절 역할을 발휘한다는 발견에 기초한다.

1. 응고의 생리학

지혈은 생물체가 출혈에 반응하는 메카니즘으로, 손상(lesion) 직후 기능성이 되고 오랜 기간 동안 유효하게 남는 두 개의 공정들의 참여를 포함한다. 이들 중 첫 번째 공정은 일차 지혈로 알려져 있으며, 혈관 손상 자리에서의 혈관수축의 발생 및 혈소판 집합체 형성에 의해 특징된다. 두 번째 공정은 이차 지혈로 알려져 있으며, 이는 피브린 응고물(fibrin clot)이, 상이한 응고 캐스캐이드 (cascade) 단백분해 효소들의 작용으로 인해 형성되는 시기이다.

혈소판 집합은 모세혈관들에서의 지혈에서 주요한 역할을 하며, 특히 피부 점막 출혈에 관련된다. 반면, 피브린 응고물 형성은 큰 혈관 지혈에서 훨씬 더 중 요하며, 이는 내출혈 (위장관, 뇌, 등)에 더 관련된다. 다음 시기들이 혈소판 집합체 형성 동안 구분될 수 있다: (i) 손상에 의해 노출된 하부-내피세포층 표면에 대한 혈소판 부착; (ii) 혈소판들의 활성에 대한 반응으로서 혈소판들의 과립상 내용물의 유리; (iii) 혈소판 집합에 이은 손상 자리에서 보다 많은 혈소판들의 격리 (sequestering) 및 농도; 및 (iv) 피브리노겐 및 기타 응고 단백질들의 혈소판 표면에의 결합으로 트롬빈을 생성하고, 혈소판들이 융합 및 강화되도록 하는 피브린 응고물을 형성하고, 이에 따라 지혈성 응고물을 안정화시킨다. 또한, 혈소판 수가 피브린 응고물 형성에 결정적이라는 사실은 공지이며; 혈소판 수가 ㎕ 당 20,000 개 이하이면 심한 출혈 증상의 발현을 수반한다.

몇몇 보조인자들 및 단백분해 효소들이 혈액 응고 과정의 제 2 시기에 참여하며, 이들은 모두 응고 인자들로서 언급되고, 이는 트롬빈의 작용으로 인한 피브리노겐 가수분해에 의한 피브린 형성으로 종결되는 몇몇 시기들로 이루어진다. 또한, 트롬빈 생성은, 보다 많은 혈소판들의 활성화 및 집합을 증가시킴에 의해 혈소판 집합을 향상시킨다. 트롬빈은 아포효소 (apoenzyme)인 프로트롬빈의 단백분해성 가수분해에 의해 미리 형성된다. 이 단백분해는, 활성화된 혈소판들의 표면에, 단지 그의 보조인자인 활성화 응고 인자 V (FVa) 및 칼슘 이온들의 존재시에만 결합하는 세린 프로테아제 FXa에 의해 실시되고, 이 세린 프로테아제는 프로트롬빈을 가수분해할 수 있다. FXa는 두 개의 별개의 경로인, 내인성 경로 및 외인성 경로에 의해 발생할 수 있다.

내인성 경로는 주로 응고 인자 VIII (FVIII), 응고 인자 IX (FIX) 및 응고 인자 XI (FXI)를 연루하는 일련의 반응들로 이루어지고, 여기에서 각 효소전구체는 가수분해되어 그의 활성 프로테아제 형태 (FVIIIa, FIXa 및 FXIa)를 생성한다. 각 단계에서, 막 형성된 단백분해 효소는 활성 형태를 연속적으로 생성하도록 그 다음의 효소 전구체의 활성화를 촉매할 것이다. 내인성 경로에 연루된 상이한 응고 인자들의 활성화가 일어나며; 이에따라 캐스캐이드 방식으로, 이 내인성 경로의 단백질들 중 임의의 것의 결핍은 다음 단계의 활성화를 방지하여, 응고물 형성을 방지하고, 출혈 경향을 증가시킨다. 상이한 응고 인자들, 예로서 FVIII, FIX 또는 FXI의 결핍은 심한 출혈 증후군들, 예컨대 각각 혈우병 A, B 및 C를 일으킨다.

혈액 응고 외인성 경로에서, 손상 자리에서 외막 세포들 상에 노출된 TF는, 순환 응고 인자 VII/활성화된 응고 인자 VII (FVII/FVIIa)에 결합하여 TF::FVIIa 복합체를 형성하고, 칼슘 존재 하에서, FX 활성화에 대한 기질로서 작용한다. 상기 외인성 경로는 혈액 응고에 가장 관련이 깊은 경로로 최근 고려되며, 이는 혈관 손상에 의해 일어난 출혈의 경우에서, 응고가, TF의 그의 리간드인 FVII/FVIIa와의 상호작용을 포함하는 외인성 경로 활성화로 인해, 촉발된다는 것은 인정되고 있다.

응고에서 TF::FVIIa 복합체에 지정된 또다른 역할은 기질로서 작용하여 FX 활성화가 FVIIa로 인해 일어나도록 하는 것이다. 그 결과, 초기에는 피브린 응고물 형성을 일으키기에 불충분한 기본 FXa 수준 (<150 pM)이 증가한다. 그의 보조 인자, FVa 및 세포성 응고전구 (procoagulant) 표면의 존재하에서, 이러한 기본 FXa 농도에서의 증가는 피브린 응고물 형성에 요구되는 트롬빈을 생성할 수 있을 것이다. 일단 혈소판들이 활성화되면, 이들이 혈액 응고에서 주요한 역할을 한다 는 것은 현재 인정되고 있다. 이들은 음이온성 인지질이 풍부한 응고전구 표면을 제공하는 한편, 그들 내에 저장된 FVa 및 FXa 인자들을 노출한다. 이는 모두, 공지된 프로트롬비나아제 복합체 (이는 FXa, FVa, 프로트롬빈, 및 음이온성 응고전구 혈소판 인지질 표면을 포함)를 형성하는 원형질막의 표면상에서 응고에 연루된 상이한 물질들의 정확한 조합을 가능하게 한다.

외인성 경로 활성화의 이론은, 어떻게 응고가 TF::FVIIa 복합체에 기인한 역할을 통하여 시작되는지를 설명할 수 있다. 혈액 응고 과정에서 TF::FVIIa 복합체의 생물학적 관련성을 예시하는 한 예로, 산재성 혈관내 응고증 (DIC) 증후군이 있다. 이러한 임상 상태는 TF의 혈관내 유리와 연관되고, 심한 임상 상태들 (쇼크, 패혈증, 급성 심장마비, 주요 외상, 간 질환, 큰 수술, 화상 등)의 과정에서 일어날 수 있다.

이 인자의 선천적인 결핍에서 일어나는 것과 같은, FVIIa 가 존재하지 않는 환경에서는, FX가 충분한 수준으로 활성화되지 않기 때문에, 응고는 가설적으로 결코 일어나지 않을 것이며, 결과적으로 출혈 증상이 치명적이어야 한다. 쥐과에서의 모델들은 이 이론을 확인하여 주고, FVII 결핍은 생명과 조화되지 않고, 심한 치명적 출혈을 수반한다. 그러나, 이제까지 인간에서 설명된 선천적인 FVII 결핍들이 항상 출혈을 수반하는 것은 아니다. 임상적 증상이 없고 출혈성 합병증없이 건강한 개인에서 일어나는 완전 FVII 결핍의 경우들이 보고되어 왔다. 이는 모두 FVII에 독립적인 다른 응고 촉발 메카니즘이 인간에 존재하여야 함을 제시한다.

TF는 FVII/FVIIa 에 특이적으로 결합하는 클래스 II 시토카인 수용체들의 상 과(super-family)에 속하는 내재성 (integral) 막 당단백질이며, 혈액 응고 외인성 경로에서 적절한 역할을 한다. TF에 지정된 생리학적 역할들은 공지이며; 한편으로, 이는 FVIIa에 특이적인 수용체이고, 일단 TF::FVIIa 복합체가 형성되면, 이는 기질로서 작용하여 FX 활성화가 일어난다. 실제로, 혈관 손상 후, 혈관들을 외측에서 둘러싼 외막 세포들의 표면 상에서 정상적으로 격리된 TF가, 혈액 중에 존재하는 그의 리간드인 FVII와 접촉 및 상호작용하여 TF::FVII 복합체를 형성한다. 일단 이 복합체가 형성되면, FVII 자동활성화가 일어나서, 그의 활성형 FVIIa 를 생성한다. 현재 TF::FVII 복합체 구조에 대한 광범위한 정보가 존재한다. TF와의 상호작용에 참여하는 주요 FVII 결합 자리들은 표피 성장 인자 (EGF)의 도메인에 유사한 제 1 도메인 및 프로테아제 도메인에 위치한다. 한편, 기타 덜 관련된 결합 자리들이 참여한다는 것도 보고되어 왔다 (4-카르복시글루타메이트-풍부 도메인 (Gla 도메인) 및 제 2 EGF 도메인). TF에 존재하는 결합 자리들은 두 유형의 III 피브로넥틴 도메인들 및 두 도메인들 사이의 중간 지역에 위치된다.

최근 연구들로 TF 리신 165 및 리신 166 잔기들이 FX의 Gla 도메인과, 활성화된 및 비-활성화된 형태 모두에서, 상호작용한다는 것을 확인가능하게 되었다. 그러나, TF::FVIIa 복합체에 관한 정보에 따라 발생하는 것과는 반대로, TF 와 FX 및 FXa의 상호작용에 대해서는 잘 알려지지 않았다. 먼저, 데이터는 Lys (165 및 166) 잔기들이 FX 활성화에 대한 기질로서 작용한다는 것을 제시한다. 한편, TF가 FVII 활성화를 위한 FXa 보조인자로서 작용할 수 있다는 것이 최근 설명되었다. 즉, FVII의 TF로의 결합은 FVIIa 자동활성화 및 FX 활성화를 자극한다. 그 후, TF 에 결합된 FXa는 FVII 활성화를 자극하고, 그 결과 이는 FX 활성화, 및 결과적으로 프로트롬빈 가수분해 및 피브린 응고물 형성을 증가시킬 것이다.

본 발명자들은 FXa 에 대한 보조 인자로서 TF의 가정된 역할이 지혈에 대해 매우 중요하게 되는데 훨씬 더 관련됨을 발견하였다. TF의 FVII에 대한 막 수용체로서의 인정된 역할에도 불구하고, 본 발명자들은 TF가 또한 유효한 FXa 자극제이기도 함을 보여준다. TF 는 FXa의 자극제로서 작용하여, 그의 단백분해 활성에 현저한 개선을 일으킨다. 본 설명에서 사용된 것과 같은 "FXa의 자극제들"은 FXa 용해물 및 프로트롬비나아제 복합체에 결합된 FXa와 같은, 모든 형태의 FXa를 의미한다.

피코몰 농도의 FXa 는, 그의 공지된 보조 인자인 FVa의 존재시에도, 응고에 어떤 영향을 미칠 수 없다는 것이 공지되어 있다 (표 9 참조). 따라서, 이들 조건 하에서, 프로트롬비나아제 복합체는 활성이 아니다. 놀랍게도, TF 존재시 (즉, 상해 또는 외인성 투여), 피코몰 농도의 FXa (즉, 생리학적 기본 농도 또는 외인성 투여됨)는 프로트롬빈 가수분해를 일으켜, FVII/FVIIa 부재시에도 피브린 응고물 형성을 일으켰다 (표 7).

본 특허 출원에서, 본 발명자들은 TF::FXa 상호작용이 TF::FVIIa 복합체 및 외인성 응고 경로에 독립적인 신규 응고 촉발 메카니즘이라는 것을 설명한다.

마지막으로, 혈소판 집합 및 보다 큰 경향의 출혈 증상, 그 중 글란쯔만 병 (Glanzmann's disease) 및 버나드-쏠리에 (Bernard Soulier) 증후군으로 대표되는 장애들과 함께 일어나는 특정 혈소판 질환들이 있다는 것이 공지되어 있으며, 여기 에서 피브리노겐 수용체 또는 Gp1b 수용체에 각각 영향을 미치는 선천성 결함들이 개시되어 왔다. 한편, 심한 출혈 증상 발현은, 혈소판 수가 ㎕ 당 20,000 개 이하로 감소하는 경우 선천성 및 후천성 혈소판감소성 자반증 (thrombocytopenic)에 존재한다.

본 특허 출원에서, 본 발명자들은 지질화된 TF 가 선천성, 후천성 혈소판 질환들 및 심한 혈소판감소성 자반증(㎕ 당 9,000 이하)에 존재하는 출혈의 치료에도 효과적이라는 것을 증명하였다.

2. 응고 병리학

각 응고 인자의 선천성 결핍은 출혈의 발생과 관련될 수 있고, 일반적으로 단일 단백질을 포함한다; 따라서, 예로서 혈우병 A 는 FVIII에 영향을 미치는 유전성 출혈 질환이다. 후천성 응고 질환들은 이전의 출혈 이력 없는 개인들에서 발생하고, 다수의 원인들을 가질 수 있다; 예시로서, 응고 인자들에 특이적인 저해제들의 존재가 여러번의 수혈을 받은 개인들에서 일어날 수 있다. 후천성 응고 인자 결핍들이 역시 심한 지혈 문제를 일으키는 미지의 병인학적 실재이기는 하지만, 이들은 선천성 응고병증을 가진 환자들이 처해지는 다수의 수혈에서 가장 중요한 문제들 중 하나이다. 후천성 응고 장애들의 기타 중요한 원인은, 헤파린 및 와파린 약물과 같은 항응고제 치료법이다. 항응고제 약물로 처리된 환자들의 현저한 비율 (5-10%)이 출혈 증상 발현을 나타내었으며, 이들의 대부분은 관리하기 어려운 것이었다.

상기 언급된 것과 같이, 선천성 및 후천성 혈소판 장애는 출혈과도 관련될 수 있다. 혈소판 수의 감소 (㎕ 당 20,000 개 이하)는 종종 심한 출혈 증상 발현을 수반하는 피브린 응고물 결함을 일으킬 수 있다.

가벼운/온건한 또는 심한/치명적인 출혈 (수술 또는 외부 손상에 의한)에서 현재 유용한 치료적 비축 (arsenal)은 매우 제한된다. 혈액 응고를 가속화하여 출혈을 방지할 수 있는 상이한 지혈제들이 있으며, 예로서 (1) 인간-유래 혈액 제품, 예컨대 응고 인자 농축물 및 국소 지혈제, 예컨대 섬유성 콜라겐, 피브린 글루 (fibrin glue) 및 프로트롬빈 복합체 농축물; (2) 인간 재조합 단백질; (3) 항피브린분해성 약물, 예컨대 아미노카프론산, 트라넥사민산 (tranexamic acid); 및 (4) 무기 국소 지혈제, 예컨대 실리카 및 카올린 표면.

하기 결정적인 제한들이 보고되었다:

(1) 정맥 투여

(2) 투여를 위한 특수 장치 필요사항

(3) 좁은 치료 포커스

(4) 특이적 출혈 증상 발현에 적용되는 부적절하거나 또는 어려운 처리

(5) 급성 효과의 결핍

(6) 피브린 응고물의 불안정성

(7) 매우 위험한 부작용

(8) 값비싼 치료

인간 유래 혈액 제품 (응고 인자 및 혈소판 농축물)

항상 정맥으로 투여되어야만 하는 것은 값이 비싸고 이용성이 낮은 치료이다. 이는 매우 좁은 치료 포커스를 가지고, 그들의 특이적 결핍을 치료하는데만 유용하다. 이는 임의의 종류의 출혈 증상 발현을 국소적으로 치료하는데 부적절하다. 이는 출혈을 급성으로 치료하는데 유용하지 않은데, 이는 효과를 내는데 긴 투여 프로토콜을 필요로하기 때문이며, 무엇보다도 매우 위험한 치료이기 때문이다: 20%의 혈우병 환자들은 간염을 발생하였고, 5% HIV 및 15% 이하는 FVIII 또는 FIX 에 대한 혈장 항체들을 나타내며 (후천성 혈우병), 이는 특수하고 매우 값비싼 대체 치료를 요구한다 (면역억제, 응고 인자들의 높은 투여량, 혈장 교환, 등). 이러한 이유들로, 공공 건강 기관들 (WHO, FDA, EMEA, 등)은 응고 인자 농축물들 보다 더 나은 신규 지혈제의 개발에 매우 관심을 갖고 있다.

국부 (local) 지혈제

이는 일부 출혈 증상 발현 (즉, 코피)에 투여되기에 부적절한 값비싼 치료이고, 치과 치료에서 문제가 되며, 불안정한 피브린 응고물을 형성하고, 응고 인자 농축물과 같이 동일한 잠재적으로 위험한 부작용들을 갖는다. 이들은 인간-유래 혈액 제품들을 수령하여 본 적이 없는 환자들 또는 재조합 FVIII 또는 FIX 를 사용한 치료를 받고 있는 환자들에게는, 인간 바이러스 전염의 잠재적인 위험으로 인해, 사용되어서는 안된다.

인간 재조합 단백질

이는 선진국에서만 이용가능한 가장 값비싼 치료 (평균 비용 6,000€)이다. 응고 인자 농축물로서, 이는 항상 정맥 주사로 투여되어야만 하며, 이는 그들의 특 이적 결핍을 치료하는데만 유용하기 때문에 매우 좁은 치료 포커스를 가지고, 국소적으로 출혈을 치료하는데 부적절하며, 효과를 내기 위해서는 긴 투여 프로토콜을 필요로하기 때문에 이 역시 출혈을 급성으로 치료하기에 유용하지 않으며, 인간 바이러스 전염이 비록 보고되지는 않았지만, 동일한 비율 (%)의 후천성 혈우병이 설명되어 왔다 (15% 에 이르는 비율이 항 FVIII 또는 FIX 항체들을 나타낸다). 응고 인자 농축물들로서, 공공 당국은 이의 사용을 크게 제한한다.

항피브린용해성 약물

이들은 좁은 치료 포커스를 가지며, 이는 가장 관련된 제한이 많다. 이들 약물들은 효과를 내기 위해서 피브린 응고물 형성을 미리 요구한다. 따라서, 이들은 단지 건강한 대상들에서만 유용하지만, 피브린 응고물이 부적절하게 형성되는 경우 (즉, 선천성 응고장애, 예컨대 혈우병, FVII 결핍), 그들의 치료 효능은 극적으로 감소한다. 또한, 이들은 출혈을 급성으로 치료하는데 유용하지 않은데, 이는 그들이 효과를 내기 위해서는 역시 긴 투여 프로토콜을 요구하기 때문이다.

무기 국부 지혈제

이들 지혈제의 이용에서 가장 중요한 제한은 이들이 코피, 치과 및 수술과 같은 많은 종류의 출혈들에 투여되기 부적절하다는 것이다. 또한, 고통스러운 발열 반응이 보고되어 와서, 이의 용도는 단지 치명적인 상황들 (전쟁)에서의 피부 점막 출혈로 현저히 감소되었다.

결론적으로, 놀랍게도 오늘날, 코피 또는 칫솔질 후 잇몸 출혈의 단순한 증상 발현 또는 면도에 의해 일어난 일상적인 상처로 인한, 혈액 추출시 천자된 (punctured) 정맥으로 인한, 또는 길에서 우연히 넘어져서 생긴 상처로 인한 것들의 국소 치료에 유용한 약물이 없다는 것이다. 이러한 문제는, 출혈성 특이 체질, 예로서 혈우병 유형 또는 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 병의 선천성 응고병증 을 갖는 환자들 또는 글란쯔만병 유형 또는 버나드-쏠리에 증후군의 선천성 혈소판 장애들을 갖는 환자들, 또는 후천성 응고장애의 경우에서 더욱 악화된다. 이들 환자들은 매일매일의 생활에서, 그리고 단순한 발치시 또는 출혈 상처를 일으키는 임의의 작은 외상에서 심각한 문제들을 가지며, 그들의 삶의 질을 향상시키는데 사용될 수 있는 의약 치료가 없다. 이러한 문제는, 이들 환자들이 외상 또는 심한 출혈 사고를 겪는 경우, 그들의 생명이 심각한 위험에 처해지므로, 더욱 커지게 되는 것이 명백하다. 이러한 모든 상황들에서, 단지 이용가능한 약학적 도구는 결핍 인자들 또는 각 응고 인자에 특이적인 인간 재조합 인자를 함유하는 인간 혈장의 투여이다. 모든 이러한 치료들은 비경구 경로의 사용을 의미하고, 따라서, 예로서 임의의 매일의 가벼운 또는 온건한 출혈에서의 경우에서와 같이 큰 빈도로 사용되도록 설계되지는 않는다. 최종적으로, 이전에 설명된 제한들이 없는 신규한 국소 지혈제가 현재 치료의 비용 및 부작용의 높은 발현을 모두 감소시키는 현저한 개선을 제공할 것임은 널리 인정된다.

3. 본 발명의 배경

이제까지, TF가 혈액 응고를 촉발하는 원인이 되는 주요 성분이라는 것이 인정되어져 왔다. 응고가 시작되기 위해서는, FX의 FXa로의 활성화로 프로트롬빈 가수분해를 시작하는 것이 절대적으로 필요하다. 이 FXa의 원은 FVIIa와 그의 수용 체인 TF의 상호작용에 주로 기인하여 왔다. FXa가 혈소판 과립들에 존재하고, 그의 활성화가 일어날 때 그 표면에 노출될 수 있다는 것이 설명되어왔지만, 혈액에 존재하는 FXa의 생리학적 농도 (< 150 pM)는, 그의 보조 인자인 FVa 및 혈소판 응고전구 표면의 존재하에서도 (도 1), 트롬빈 형성을 시작하기에는 불충분하다. 따라서, 응고는 FXa 기본 농도가 현저히 증가되는 경우에만 시작될 수 있다는 것이 현재 인정되고 있다. FXa 기본 농도의 증가의 원인은 언제나 TF::FVIIa 복합체 및 FIXa 단백분해 활성 모두에 기인하여 왔다 (도 2).

지질화된 TF 재조합 단백질들은 시험관 내 조건에서만, 건강한 혈액 샘플 및 혈우병 혈액 샘플 모두에서의 응고를 가속할 수 있으며, 이 작용은 FVIIa 수용체로서 TF에 지정된 기존 역할에 기인한다. 그러나, 동일한 실험 조건에서, 비-지질화된 TF는 효과가 완전히 없음을 나타내었으며, 이는 지질화가 TF 기능성을 달성하는데 필수적이라는 것을 나타낸다 (결과의 섹션 6.1).

국소 지혈제로서 지질화된 TF의 이용이, 가벼운, 심한 및 치명적인 출혈에 대한 단일 치료로서 설명된 적은 없다 (외상성 또는 수술성 동맥 및 정맥 출혈).

유럽 특허 EP 266993은, 출혈 증후군의 비경구 치료를 위한 지혈제로서 비-지질화된 TF의 이용을 개시한다. 그러나, 본 특허는 EP 266993 에 의해 청구된 비-지질화된 TF와 본 특허 출원의 지질화된 TF 간의 활성에서의 중요한 차이를 개시한다.

실제로, 지질화된 TF가 시험관 내 조건에서 활성이고 그들의 경구 투여가 치명적인 결과를 갖는 산재성 혈관내 응고를 즉시 개시한다는 것은 공지이다. 반면, 비-지질화된 TF가 시험관 내 조건에서 활성이 아니지만, 이는 비경구 투여에 의한 응고병증의 치료에 대해 청구되어 왔다 (EP 266993).

오늘날까지, 출혈 증상 발현의 단일한 국소 치료에 있어서, 지질화된 및 비-지질화된 TF 모두의 효과에 대한 데이타는 없다. 본 특허 출원에서는, 쥐 꼬리 횡단절단 모델 (tail rat transection)을 사용하여, 본 발명자들은 비-지질화된 TF가 출혈을 멈출 수 없다는 것을 증명하였다. 반면, 발명자들은, 최초로 지질화된 TF가 병적인 상태 (헤파린 및 와파린으로 처리된 동물들) 및 건강한 상태 (응고의 변경 없이 대조구 래트)를 포함하는 모든 종류의 출혈들을 국소적으로 치료하는데 유용한 지혈제라는 것을 보여준다. 종합적으로, 지질화된 및 비-지질화된 TF가 명백히 상이한 화합물들이라는 것을 나타낸다. 결과적으로, 출혈의 단일한 국소 치료제로서 지질화된 TF의 이용은 본 기술 분야의 당업자에게 명백하지 않다.

한편, EP 266993 호는 세린-프로테아제 FVII가 그의 수용체인 TF에 결합된 경우에만 활성화된다는 것을 가정하는 현 기술 수준에 따라 수행되었다. 따라서, EP 266993 호 및 본 기술 수준에 따르면, FVII/FVIIa 가 존재하지 않는 경우, TF는 활성화되지 않아야만 한다. 본 기술분야의 임의의 숙련자가 TF (지질화된 및 비-지질화된)가 FVII 결핍 환자들의 치료에 유효할 수 있을 것이라고 생각하는 것은 명백하지 않았다. 발명자들은 FVIIa의 부재시에도, TF가 FXa 에 대한 보조 인자로서 작용한다는 것을 발견하였다. 이러한 발견은 비-지질화된 TF가 결여성 FVII 환자들에서의 출혈에 대한 비경구 지혈제로서 작용할 수도 있음을 이해하는 기초가 된다.

국제 특허 출원 WO 94/02172 호는 천연 항응고제의 저해제 (항체)의 전신 투여에 의한, 하나 이상의 천연 항응고제의 일시적 저해가 미세혈관 출혈을 저해할 수 있다는 것을 교시한다. 선택적으로, 저해제는 트롬빈 또는 지질화된 TF의 국소 투여와 조합되어 투여될 수 있다. 두 화합물들의 이용은 언제나 선택적 보조 치료제로서의 용도였지, 단일 투여로서의 용도는 결코 아니었다는 점을 지적하는 것이 중요하다. 또한, WO 94/02172 호는 단지 모세혈관 출혈 (미세혈관 출혈, 즉, 화상, 충혈된 내장 표면, 출혈 간 표면...)에 대한 이들 상승작용적 (synergistic) 치료의 이용을 청구할 뿐, 동맥 및 정맥 손상을 포함하는, 수술 또는 외상에 의해 발생된 심하거나 또는 치명적인 출혈에 대한 이용은 청구하지 않고 있다. 그러나, WO 94/02172 호의 발명자들은, 전신 투여와 함께 트롬빈을 국소적으로 투여하는 경우, 상승작용적 효과가 관찰되었으나, 그러한 상승작용적 효과가 TF를 국소적으로 투여시에는 관찰되지 않았다는 것을 인정하고 있다 (WO 94/02172, 도 3 및 p.22, 14-15행). 또한, WO 94/02172 에 청구된 투여량은 0.1 내지 10 mg 으로 매우 높은 범위이다.

WO 94/02172에 반하여, 본 특허 출원은 지질화된 TF를 단독으로 이용한 가벼운/온건한 출혈 내지 심한/치명적 동맥 또는 정맥 출혈의 단일 치료를 청구하고 있으며, 그러한 치료가 외상성 출혈에 대해 1.2 ㎍/ml의 활성 단백질 투여량에서 유효한 예들을 보여준다 (표 24 및 25에서의 심한 모델 참조). 지질화된 TF가 FXa 단백분해 활성의 자극제로서 작용한다는 것은 본 기술 분야의 당업자에게 명백하지 않았기 때문에, 그러한 놀랍고 이례적인 효과적인 치료는 이제까지 설명되지 않아 왔다. 발명자들은, FVIIa의 부재시, 심지어는 그의 공지된 보조인자인 FVa의 부재시에도, TF 가 FXa에 대한 보조인자로서 작용한다는 것을 발견하였다. 이러한 발견은, 지질화된 TF 가 단독으로 건강한 상태 및 병적인 상태에서의 심한 출혈에 대한 지혈제로서 작용할 수 있다는 것을 이해하는데 기초가 된다.

US 특허 4,721,618 호는, 정맥주사로 투여된, 인지질 (PCPS) 및 고농도 (0.2 to 0.5 U/Kg)의 FXa의 상승작용 혼합물이 인자 VIII:C 결핍을 혈우병 포유동물에서 피할 수 있어서, 혈액 응고화의 캐스캐이드 반응이 계속될 수 있다는 것을 교시한다. FXa의 제안된 높은 농도는 PCPS 지질 소포들 (이는 이 활성을 개선할 수 있다)의 필요 없이 활성이다. 또한, WO 02/086118 호는, 적어도 하나의 특이적 인지질 및 적어도 하나의 세린 프로테아제-활성화된 혈액 응고 인자의 혼합물을 포함하는 조성물들이, 혈액 응고 장애들을 치료하는데 유용하여, 투여된 혈액 응고 인자들에 대한 필요를 감소시킨다는 것을 교시한다.

또한, 엘라직산 (ellagic acid) 및 제올라이트, 실리카 및 무기 산화물질과 같은 기타 촉진제들이, 혈액 응고를 향상시키는데 사용되었으며, WO 02/30479 호에서 특허청구되었다.

WO 02/086118 호에 따르면, 응고 인자는 세린 프로테아제-활성화된 혈액 응고 인자 (p.5, 13-15 행)로서 정의된다. 따라서, TF 는 혈액 응고 인자로서 간주될 수 없을 것이며, 이는 TF 가 세린 프로테아제가 아니라 인자 VIIa에 대한 특이적 세포 표면 수용체이기 때문이다.

본 특허 출원에서, 본 발명자들은, 인지질들 (상이한 비율 및 몰농도의 포스 파티딜세린 및 포스파티딜콜린)이 지질화된 TF에 의해 매개되는 응고전구 효과를 증가시키지 않음을 증명하였으며 (표 21), 이는 US 특허 4,721,618 및 WO 02/086118 호에 의해 청구된 상승작용적 효과가 세린 프로테아제-활성화된 혈액 응고 인자들에 대해서만 한정적이지, TF와 같은 막 수용체에 대해서는 한정적이지 않음을 나타낸다. 놀랍게도, 지질화된 TF 가 음으로 하전된 무기 표면들 (NCIS)과 동시에 조합된 경우, 현저한 상승작용 효과가 시험관 내 및 생체 내 실험 조건에서 관찰되었다. 본 설명에서 사용된 NCIS는 지질 및 혈액 응고 촉진제인, 엘라직산의 혼합물로 구성된다. 상기 지질은 순 음전하를 가지며, 이는 상기 지질 혼합물이 중성 또는 쯔비터이온성 지질을 포함할 수 있지만, 상기 혼합물에 음이온성 성질을 부여하는 음으로 하전된 지질을 일정 양 함유하여야만 한다는 것을 의미한다. 예시적이지만, 비제한적인 예로서, 음으로 하전된 지질은 스핑고지질 (예컨대 세라마이드-1-포스페이트, 글리코실화 포스파티딜에탄올아민, 히드록실화 또는 비히드록실화 술파타이드 (sulfatides), 강글리오사이드) 및 글리세롤-기재 지질 (예컨대 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜이노시톨 포스페이트, 포스파티딕산, 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀 (cardiolipins)일 수 있다. Dade® Actin® (Dade Behring) 상표, 예로서 Dade® Actin® FS와 같은 상업적으로 유용한 NCIS가 있다.

결과적으로, 본 특허 출원은 상업적으로 이용가능한 약물과 관련된 다음 장점들에 의해 특징되는 신규 국소 지혈제를 설명한다:

(1) 용이한 국소 투여

(2) 그의 국소 적용에 특별한 장치가 불필요

(3) 넓은 치료 포커스 (FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII 및 FXIII의 결손)

(4) 모든 종류의 출혈 증상 발현 (코피, 치과적 출혈, 피부 점막, 외상성 및 수술 출혈)에 투여되어지는 적절한 치료

(5) 효과적인 급성의 효과를 발휘함

(6) 생리학적 피브린 응고물 형성 (매우 높은 응고물 안정성)

(7) 부작용 없음

(8) 저비용 치료

WHO, FDA, EMEA 및 기타 공공 건강 당국들의 주요 목적은 인간-유래 혈액 제품 혈액의 소비에 관련된 위험한 부작용들을 감소시키는 것이다. 본 발명은 이러한 충족되지 않은 요구들을 커버하도록 고안되었다.

발명의 개요

응고에 있어서 TF::FVIIa 복합체에 지정된 역할은 널리 알려져 있다. 상기 TF::FVIIa 복합체는 기질로서 작용하여 FX 활성화가 일어난다. 최근 연구들은 TF 리신 165 및 리신 166 잔기들이, 활성화된 및 비-활성화된 형태 모두에서의 FX의 Gla 도메인과 상호작용한다는 것을 확인가능하게 하였다. TF::FVIIa 복합체에 반하여, TF의 FX 및 FXa와의 상호작용에 대해서는 알려진 바가 적다. TF 가 FVII 활성화를 위한 FXa의 자극제로서 작용할 수 있다는 것만이 설명되어 왔다. 즉, FXa의 TF 로의 결합은 FVII 활성화를 자극할 것이며, 이는 그 결과 FX 활성화를 증가시킬 것이다.

본 발명자들은, FXa의 자극제로서의 TF의 역할이 보다 더 많이 관련되어, 지혈에 중요하게 된다는 것을 발견하였다 (도 3). 피코몰 농도의 FXa가 응고 및 혈소판 집합에 어떤 영향도 미칠 수 없다는 것은 공지이다. TF의 FVII에 대한 막 수용체로서의 인정된 역할에도 불구하고, 본 발명자들은 TF가 그의 주요 단백분해 활성인, 프로트롬빈 가수분해를 개선하기 위하여 FXa의 자극제로서도 작용하여, 피브린 응고물 형성을 이끈다는 것을 보여주었다.

놀랍게도, TF 존재시 (즉, 손상 또는 외인성 투여), 피코몰의 FXa 가 프로트롬빈 가수분해를 일으켜, 그의 리간드인 FVII/FVIIa 부재시에도, 피브린 응고물 형성을 일으킨다. 전체 결과는, TF 가 FXa의 자극제로서 작용하고, FXa의 TF로의 특이적 결합이 혈액 응고를 촉발하는 첫 번째 단계라는 것을 나타낸다.

본 발명자들의 데이타는, 응고가 일어나는 신속성이 TF 와 이전에 설명된 모든 FXa 형태들과의 상호작용에 의존한다는 것을 제시한다.

그들 자신만으로 응고를 개시할 수 없는 생리학적 농도 (<150 pM)의 FXa 존재하에, 지질화된 TF 는 그의 보조인자로서의 작용의 결과로서 트롬빈 형성을 신속하게 개시할 수 있다.

이들 지혈 효과는 놀랍게도 FVII 및 FVIIa의 존재에 무관하며, 따라서 내생의 TF::FXa 복합체 (FXa <150 pM)에 의해 매개되는 응고전구 효과는 특히 유용하고, 인자 VII-결핍 샘플들에 관련된다. 그럼에도 불구하고, 효능있는 지혈 효과들이, FVIII (혈우병 A), FIX (혈우병 B), FXI (혈우병 C), FV, FX, FXII, 및 FXIII 와 같은 기타 응고 인자들의 선천성 결함을 갖는 환자들로부터의 샘플에서, 및 버나드 쏠리에 증후군 및 글란쯔만병과 같은 선천성 혈소판 장애 및 혈소판감소성 자반증을 갖는 개인들에서 관찰되었다.

따라서, 본 발명은, 건강한 개인들 및 출혈성 특이 체질을 갖는 환자들에 존재하는 출혈의 국소 치료에 유용한, 지질화된 TF 단독 또는 FXa 및/또는 FXa의 신규 자극제로서의 NCIS와 조합된 이용을 기초로 한다.

본 발명자들에 의해 수득된 결과들은 비-지질화된 TF 또는 그의 기능성 절편들의, FVII-결핍 대상에서의 출혈의 치료에 대한 용도에 대한 문을 연 것이다. 상기 치료는 비-지질화된 TF의 비경구 투여에 대해 적당한 약학 투여 형태의 이용에 의해 실시될 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 측면은, 지질화된 TF 또는 그의 기능성 절편의, 어떤 대상에서의 출혈의 국소 치료용 약물의 제조에의 용도에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 지질화된 TF 를 단독으로 또는 FXa 및/또는 NCIS와 조합되어 포함하는 제품에 관한 것이다. 상기 제품의 약물로서의 용도 또는 어떤 대상에서 출혈 치료용 약물의 제조에서의 용도는 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.

본 발명의 또다른 측면은, 지질화된 TF 및 FXa, NCIS 및 이들 모두의 조합으로부터 선택된 화합물에 의해 형성된 복합체에 관한 것이다. 상기 복합체의 약물로서의 용도 또는 어떤 대상에서 출혈 치료용 약물의 합성에의 용도는 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 지질화된 TF를, 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 상기 약학 조성물은 FXa 및/또는 NCIS를 더 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 상기 약학 조성물 및 지지체를 포함하는 제품에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 상기 약학 조성물은 FXa 및/또는 NCIS를 더 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 비-지질화된 TF, 또는 그의 기능성 절편의, FVII-결핍 대상에서 출혈 치료를 위한 약물 제조에의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 상기 약물은 비-지질화된 TF의 비경구 투여에 적합한 약학 투여 형태로 제형화된다.

발명의 상세한 설명

여기 기재된 발견들은 지질화된 TF가 그의 리간드인 FVII/FVIIa 부재시 FXa의 자극제로서 작용하여 이 효소가 프로트롬빈 가수분해를 개시하도록 하고, 따라서 응고가 일어나도록 한다는 것을 최초로 보여준다. 이러한 새로운 메카니즘은 매우 낮은 FXa 농도 수준 (생리학적인 150 pM 이하의 것으로 고려됨)에 특히 관련된다. 혈소판 집합에서의 장애들 및 보다 큰 출혈 증상 발현 경향이 일어나는 특정 혈소판 질환들이 공지되어 있다. 따라서, 외래적으로 투여된 지질화된 TF 는 선천성 응고병증에 유용할 뿐만 아니라 선천성 및 후천성 혈소판 장애들, 예컨대 글란쯔만병, 버나드-쏠리에 증후군 및 혈소판감소성 자반증에서의 지혈을 더욱 가능하게 할 것이다.

응고 발생의 신속성은, 따라서 TF::FVIIa 복합체의 형성 및 뒤이은 FX 활성화에 의존하는 것이 아니라 (이제까지는 그렇게 생각되어 왔지만), TF와 생리학적 기본 농도 (<150 pM)의 FXa 간의 상호작용에 의존한다. 이 상호작용의 형성의 가장 관련있는 생물학적 결과는 응고 시작의 신속한 발생이며, 이는 혈액 중 존재하는 생리학적 농도의 FXa의 존재 및 그의 자극제 TF와의 상호작용만을 필요로 한다. 상기 과정은, 복합체에 의해 초기에 형성된 트로빈의 결과로서, 그리고 TF::FVIIa 복합체에 기인하거나 또는 트롬빈 그 자체에 기인한, FXa의 보다 많은 생산의 결과로서 즉시 확대된다.

따라서, 본 발명자들의 발견은, FVIIa 의 부재 및 그 자체로는 응고를 개시할 수 없는 생리학적 농도 (< 150 pM)의 FXa 존재하에서, 지질화된 TF 가 FXa의 자극제로서의 그의 새로운 작용으로 프로트롬빈 가수분해의 개시를 촉진하는 결과로서 트롬빈 형성을 신속히 개시한다는 것을 명백히 보여준다. 반면, 본 발명자들의 발견은, 지질화된 TF 및 저농도의 FXa (그 자체로 항출혈 효과를 발휘하는데 유효하지 않은 농도)가 함께 투여되는 경우 피브린 응고물 형성의 시작을 신속히 일으킬 수 있다는 것을 보여준다. TF::FXa 조합, 특히 <150 pM 농도의 FXa와의 조합으로 관찰되는 효과들은, 지질화된 TF 만 단독으로 투여된 경우 탐지된 효과보다 훨씬 더 좋다. FXa 및 지질화된 TF와 NCIS의 조합은 지혈 효과를 더욱 개선할 수 있다. 수득된 결과들은, 그 자체로는 초기 응고전구 반응을 생성할 수 없는, 혈장 중에 존재하는 FXa 기본 농도 (<150 pM)의 존재하에서, TF 가 FXa 의 자극제로서 작용하는 경우 상기 반응이 일어난다는 생각을 뒷받침한다.

따라서, 지질화된 TF는, 단독 또는 FXa 및/또는 NCIS와 조합되어, 건강한 개인 및 출혈성 이상 체질로 고통받는 환자들에 존재하는 출혈의 치료에 유용한 신규 국소 지혈제로서 사용될 수 있다.

비-지질화된 TF 또는 그의 기능성 절편은, 바람직하게는 비경구 투여에 의하여, FVII-결핍 환자들에 존재하는 출혈의 치료에 유용한 신규 지혈제로서 유사하게 사용된다.

1. 출혈의 국소 치료에서 지질화된 TF 의 이용

본 발명자들은 놀랍게도, 지질화된 TF가 FXa 단백분해 활성을 증가시키고, 그에 따라, 트롬빈 생성을 증가시킨다는 것을 발견하였다 [섹션 1의 본 설명에 포함된 실시예의 결과들 참조]. 본 발명자들은 또한, 지질화된 TF 가 건강한 대상 및 FV, FVII, FVIII, FIX, FX., FXI, FXII 및 FXIII 결핍인 환자들을 포함하여 응고 인자-결핍 환자들, 및 항응고화된 환자들 (헤파린, 저분자량 헤파린 또는 쿠마린성 유도체들과 같은 약물로 항응고 처리함에 의해, 이들은 비제한적인 예들임)에서 혈장 및 혈액을 시험관 내 [섹션 1 내지 5의 본 설명에 포함된 실시예의 결과들 참조] 및 생체 내 [섹션 6 및 7의 본 설명에 포함된 실시예의 결과들 참조]에서 응고시시킨다는 것도 관찰하였다. 본 발명자들은, 지질화된 TF가 혈소판 장애로 고통받는 환자들에서 혈액을 응고시킨다는 것을 더욱 발견하였다 [섹션 5의 본 설명에 포함된 실시예의 결과들 참조]. 이들 결과들은 지질화된 TF가 어떤 대상에서 출혈의 국소 치료에 유용한 지혈제라는 것을 명백히 보여준다.

본 기술 수준을 고려시, TF를 건강한 대상 또는 혈우병 환자들 (FVIII, FIX 및 FXI 결핍)에서 응고전구 국소 단일 치료로서 생각한다는 것은 명백하지 않은 것이다.

이는, FVII-결핍 환자들에서는 TF-FVII 복합체가 형성될 수 없기 때문에; FV 또는 FX 결핍 환자들에서는 프로트롬비나아제 복합체가 조립될 수 없기 때문에; 그리고 헤파린화된 환자들에서는 트롬빈과 FXa 모두가 항트롬빈 III에 의해 저해되기 때문에, 그리고 와파린 처리된 환자들에서는 모든 비타민 K-의존성 응고인자들 (FVII, FIX, 및 FX)의 합성이 파괴되기 때문에, 결코 가능하지 않은 것으로 보였다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 지질화된 TF 또는 그의 기능성 지질화된 절편의, 어떤 대상에서 출혈의 국소 치료용 약물 제조에의 용도를 목적으로 한다.

TF는 동물계에 널리 분포된 내재성 막 당단백질이다. 상기 TF 단백질은 도메인 구조를 가지며, 즉, 이는 독립적인 기능성 영역들을 갖는 단백질이다. 인간 TF 아포단백질 (apoprotein)의 도메인들 각각은 독특한 구조적 및 기능성 특징들을 갖는다: (1) 신호 펩티드 또는 단백질이 미성숙 형태에서 성숙 형태로 진행될 때 번역후 진행되는 32 아미노산 리더 서열을 갖는 영역; (2) 약 219 말단 아미노산들을 포함하는 N-글리코실화 친수성 세포외 기질 도메인; (3) 막 투과 영역 아미노산들인 것으로 여겨지는, 주로 소수성인, 약 23 개의 아미노산들의 절편; 및 (4) 단백질 세포질 절편의 아미노산 형성 부분인 것으로 생각되는 21 개 아미노산 카르복실 말단. 인간 TF 단백질의 이러한 도메인 구조는 예로서, 단백질 또는 그의 기능성 절편들의 세포외 기질 도메인의 생산을 가능하게 한다. 인간 TF 단백질의 아미노산 서열은 알려져 있으며, 이는 예로서 NCBI 와 같은 단백질 데이타 베이스에서 참고될 수 있다 (hTF, 수납 번호: P13726).

여기 사용된 것과 같은 "지질화된 TF"라는 용어는, TF의 임의의 공급원으로 이 TF가 지질성 소포들 또는 세포막들에 전체적으로 또는 부분적으로 삽입된 것을 의미한다. "지질화된 TF" 공급원들의 예시적이고 비제한적인 예들로 다음이 있다: 지질화된 TF 함유 추출물 (그의 단리는 뇌, 태반 및 폐 조직과 같은 몇몇 조직들, 양, 소, 토끼, 개, 인간 등과 같은 다른 동물들로부터의 조직으로부터 실시될 수 있다); 정제된 및 (재)-지질화된 TF 단백질성 성분 (추출물 또는 재조합 TF 로부터 정제된), 즉 예시적이고 비제한적인 예들로서, 그의 정제후에 지방 성분이 첨가된 것 및 모리세이 (Morrisey)에 의해 이전에 설명된 방법에 따라 [본 설명에 포함된 실시예 참조] 제조될 수 있음. 상기 프로토콜에서, 비-지질화된 TF는 예로서 N-옥틸-β-D-글루코피라노시드와 같은 비이온성 세제를 사용하여 인지질 소포들 내에 혼입된다. 본 발명에 따라 지질화된 TF에서 사용될 수 있는 지질은 임의의 기원을 가질 수 있다 (동물, 식물 또는 합성). 실질적으로 임의의 지질이 본 발명의 지질화된 TF의 제조에 사용될 수 있다. 지질화된 TF의 제조에 사용될 수 있는 지질들의 예시적이고 비제한적인 예들은 인지질 (예컨대 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올 아민 등), 스핑고지질 (예컨대 세라마이드, 스핑고신-1-포스페이트, 이노시톨포스페이트 세라마이드, 만노실-이노시톨포스페이트 세라마이드, 만노실-디이노시톨포스페이트 세라마이드, 등), 포스파티딜이노시톨 (L-α-포스파티딜이노시톨, L-α-리소포스파티딜이노시톨, 등) 및 포스파티딜이노시톨 포스페이트 (예컨대 L-α-[포스파티딜이노시톨-4-포스페이트], 1,2-디옥탄올-sn-글리세롤-3-[포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리스포스페이트], 등). TF 단백질성 성분:지질 비율 (몰, 중량 또는 부피)은 예로서, 약 1:50,000 내지 약 1:3,000의 넓은 범위 내에서 변할 수 있다.

여기 사용된 것과 같은 TF 라는 용어는, 야생형 TF의 기능들 중 적어도 하나의 기능, 유리하게는 응고와 관련된 야생형 TF의 기능들 중 적어도 하나의 기능을 유지하는 몇몇 야생형 TF 변이체들 및 돌연변이체들을 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 실시에 사용되는 지질화된 TF는 지질화된 인간 TF 로, 조직 추출물로부터 수득된 TF로 이루어진다; 또는 TF 는 조직 추출물들의 정제된 단백질 성분에 존재하며, 지질 성분 중에 삽입된다 (약 1:8700의 단백질:지질 몰비); 또는 TF 는, 미국 특허 6,261,803 호에서, 단지 예시적이고 제한적이지 않은 예로서, 설명된 것과 같은 공정에 의해 수득된 재조합 TF (rTF)로 이루어진다. TF 의 추출물의 획득 및 정제는 뇌, 태반 및 폐 조직과 같은 몇몇 조직들로부터, 그리고 양, 소, 토끼, 개, 및 인간과 같은 다른 동물들로부터 실시될 수 있다.

본 설명에서 사용된 것과 같은 "지질화된 TF의 기능성 절편"이라는 표현은, 이에 제한되지는 않지만, TF, 특히 TF의 단백질성 성분의 펩티드 유도체들을 포함하며, 야생형 TF의 단백질성 성분의 돌연변이들 및 변이체들을 포함하며, 이는 하나 이상의 TF 기능들, 바람직하게는 응고에 관한 기능들, 예로서 FXa 및/또는 NCIS에 결합하는 능력 및 상처 치유 동안 그들의 항출혈 및 혈관 형성 기능을 발생하는 능력을 유지한다. TF의 상기 기능성 절편의 아미노산 서열은 야생형 TF의 단백질성 성분의 절편의 서열과 동일할 수 있거나, 또는 야생형 TF의 기능들 중 적어도 하나, 유리하게는 응고에 관한 적어도 하나의 기능이 보존되는 조건 하에서, 하나 이상의 아미노산들의 삽입, 결실, 또는 변경을 가질 수 있다. 간단함을 위해, 여기 사용된 것과 같은 "지질화된 TF"라는 용어는 지질화된 TF의 임의의 기능성 절편을 포함한다.

본 발명을 실시하는데 사용된 TF의 단백질성 성분은 추가로 융합 단백질의 부분일 수 있다. 이러한 의미에서, 상기 융합 단백질은, TF 단백질 또는 상기 TF 단백질의 기능성 절편으로 이루어지고, TF의 또다른 절편으로 이루어지는 영역 B에 결합된, 영역 A를 함유할 수 있다. 상기 영역 B는 상기 TF 단백질 또는 TF 단백질의 상기 절편의 아미노-말단 영역에 결합되거나, 또는 선택적으로 상기 영역 B는 상기 TF 단백질 또는 TF 단백질의 상기 절편의 카르복실-말단 영역에 결합될 수 있다. 영역 A 및 B는 모두 직접적으로 결합될 수 있거나, 또는 상기 영역 A 및 B 사이의 링커 폴리펩티드를 통하여 결합될 수 있다. 융합 단백질은 화학 합성에 의해 또는 적절한 숙주 세포들 중에서 상기 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 유전자 발현에 의해 수득될 수 있다.

여기 사용된 것과 같은 "국소 치료"라는 용어는, 치료가 필요한 자리, 예로서 피부 (베인 상처, 등) 및 혈관 조직 (파열된 혈관, 등)의 불연속적 절단부에서의 직접적인 치료의 적용을 의미한다.

본 발명에 따라, 그리고 본 설명에 포함된 실시예에서 나타낸 것과 같이, 지질화된 TF 는 FXa의 자극제로서 작용하여 그의 단백분해 활성을 증가시키고, 그에 따른 프로트롬빈 생산을 증가시키고, 따라서 출혈 장애, 특히 출혈성 특이 체질과 관련된 출혈성 장애들을 치료하거나 또는 고치는데 사용될 수 있다.

"출혈성 특이 체질"이라는 용어는 지혈 장애를 일으키는 과정 및 그의 결과로서 때때로 연장되고 과도한 출혈을 일으킬 수 있는 출혈성 증후군의 발생을 일으키는 것을 의미한다. 출혈성 특이 체질은 선천성 또는 후천성 응고장애에 의해 및/또는 선천성 및 후천성 혈소판 장애에 의해 일어날 수 있다.

"응고장애 (coagulopathy)" 라는 용어는 응고 인자 장애를 의미한다. 이 장애는, 그 결과로 출혈 증후군을 발생시키는 특이적 응고 인자 결핍 또는 결손으로 인할 수 있거나, 또는 응고 인자 장애로 인한 것일 수 있다. 상기 응고장애는 일반적으로 선천성 응고장애 또는 후천성 응고장애일 수 있다.

선천성 응고장애의 예시적이고, 비-제한적인 예들로서, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXII, FXIII 및 그들의 조합으로부터 선택된 응고 인자들의 결핍이 언급될 수 있다.

후천성 응고병증은 상이한 기원들을 가질 수 있다. 예시적인 예들은, 심한 간부전에서 응고 인자 합성 결핍들, 항응고 치료제 (예컨대, 헤파린, 저분자량 헤파린, 와파린, 쿠마린 유도체들, 디쿠마린, 등)를 포함한다. 선택적인 메카니즘은, 출혈 손상에서 응고물을 형성하는데 유용하지 않도록 하는, 응고 인자들의 과장된 소비에 근거한다. 이러한 메카니즘은, 혈소판들 및 다수의 마이크로트롬비(microthrombi)의 형성을 갖는 응고 인자들을 활성화시키는 미세순환 내피를 손상시키는 심한 패혈증에서와 같은 다수의 병증들에서 일어나는 소비로 인한, 산재성 혈관내 응고증 또는 응고장애에서; 태반 박리와 같이 TF에 의한 혈액 침입에서; 죽은 태아의 보유에서; 조직의 파괴가 있는 다중 외상들에서; 독사가 물은 경우에서 일어난다. 혈관염에서, 체벽 (parietal) 및 내피세포 손상은 응고 활성화제들을 유리한다. 응고 인자들의 소비는, PDF 유리와 함께 플라스민의 작용으로 인해, 항혈소판 및 항응고제들인, 다수의 마이크로트롬비의 피브린의 용해에 의해 악화된다.

"혈소판 장애"라는 용어는 혈소판의 수 및 기능성 모두에서의 장애를 의미하며, 그 결과는 출혈 증후군의 발생이다. 상기 혈소판 장애는 선천성 또는 후천성일 수 있다.

특정 구현예에서, 상기 혈소판 장애는 선천성 혈소판 장애이다. 선천성 혈소판 장애의 예시적이고, 비제한적인 예들은 글란쯔만병, 버나드 쏠리에병, 볼린-제이미슨 (Bolin-Jamieson) 증후군, 위스코트-알드리치 (Wiskott-Aldrich) 증후군, 패리스-트루소-자콥슨 (Paris-Trousseau-Jacobsen) 증후군, X 염색체 혈소판 감소증, 그래이 (Gray) 혈소판 증후군, 세바스티안 (Sebastian) 증후군 및 판코니 (Fanconi) 빈혈을 포함한다.

또다른 특정 구현예에서, 상기 혈소판 장애는 후천성 혈소판 장애이다. 후천성 혈소판 장애의 예시적이고 비제한적인 예들은 골수 증식 (myeloproliferative) 질환들, 예컨대 고혈소판증, 적혈구증가증, 만성 골수성 백혈병 등을 포함한다; 증가된 출혈 시간을 갖는 골수 화생 (myeloid metaplasia)에서의 기능성 혈소판 장애들, 유리 비드 보유 결함, 혈소판 집합 결함, 비정상 유리, 및 혈소판 인자 III 결함들이 있다. 기능성 혈소판 결함들은 괴혈병 및 선천성 심장병 및 간경변에서의 이상단백질혈증(dysproteinemias)에서 발견되어 왔다.

"후천성 응고장애" 및 "후천성 혈소판 장애"라는 용어는 장애의 기원을 의미하며, 이는 치료로 인하여 생기거나 (iatrogenic) 또는 다른 질병들에 대해 이차적일 수 있다.

여기 사용된 것과 같은 "대상"이라는 용어는, 인간을 포함한, 동물 종들의 임의의 원을 포함하며, 예시적이며 비제한적인 예로서, 예컨대 상기 대상은 영장류, 가축, 설치류 등과 같은 포유동물일 수 있으며, 상기 대상은 바람직하게는 임의의 연령 및 인종의 남성 또는 여성이 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 상기 대상은 지혈 장애의 이력이 없는 인간, 예컨대 응고병증 또는 혈소판 장애들을 갖지 않은 개인이다. 또다른 특정 구현예에서, 상기 대상은, 예로서 선천성 또는 후천성 응고장애와 같은 응고장애, 또는 선천성 또는 후천성 혈소판 장애와 같은 혈소판 장애와 같은 출혈성 특이 체질을 갖는 인간과 같이, 지혈 장애들의 이력을 갖는 인간이다.

따라서, 특정 구현예에서 본 발명은, 지질화된 TF의 지혈 장애들의 이력이 없는 인간에서 출혈의 국소 치료용 약물 제조에의 용도에 관한 것이다. 또다른 특정 구현예에서, 본 발명은, 지질화된 TF의 출혈성 특이 체질을 갖는 인간에서 출혈의 국소 치료용 약물 제조에의 용도에 관한 것이다.

대상에의 투여를 위하여, 상기 지질화된 TF 는 출혈의 국소 (국부) 치료를 위한 그의 국소 투여에 적합한 약학 형태로 제형화될 것이다. 상기 약학적 형태들의 예시적이고 비제한적인 예들은 에어로졸, 용액, 현탁액, 에멀션, 겔, 고약, 크림, 드레싱, 패치, 연고, 구강세척제 등을 포함한다. 상기 목적을 위하여, 지질화된 TF를 포함하는 약학 제형은 약학적으로 허용가능한 담체 및 선택된 약학 투여 형태를 제조하는데 필요한 부형제들을 포함할 것이다 (추가의 정보를 위해서는 본 설명에서 "약학 조성물"에 관한 섹션을 참조).

대상에게 투여되는 지질화된 TF 투여량은, 예로서 약 0.01 ㎍의 활성 단백질/ml 및 100 ㎍의 활성 단백질/ml 사이의 매우 넓은 범위 내에서 변할 수 있다. 투여될 지질화된 TF 투여량은 몇몇 인자들에 따라 달라지며, 이는, 그들 중, 사용된 TF 단백질의 특징들을 포함하며, 예로서 그의 활성 및 생물학적 반감기, 제형에서 TF 단백질의 농도, 대상 또는 환자의 임상적 상태, 치료될 출혈 장애 등을 포함한다 (추가의 정보를 위해서는 본 설명에서의 "약학 조성물"에 관한 섹션을 참조).

II. 조합 생성물 및 적용

II.1 지질화된 TF + FXa

알려진 바와 같이, 혈액 응고의 외인성 경로에서, TF는 순환 FVII/FVIIa에 결합하여 TF::FVII 복합체를 형성하고, 칼슘 존재시, FX 활성화가 일어나도록 기질로서 작용한다. 외인성 경로의 활성화는 TF의 그의 리간드인 FVII/FVIIa와의 상호작용을 포함한다. 이 복합체, TF::FVIIa 는 기질로서 작용하여 FVIIa 에 의한 FX 활성화가 일어난다. 이제, 본 발명자들은 놀랍게도, 심지어는 FVII-결핍 대상에서, 지질화된 TF가 FXa와 함께 응고를 유도하며, 여기에서 지질화된 TF가 FXa 자극제로서 작용하여, 이 세린 프로테아제가 프로트롬빈 가수분해를 개시하고, 프로트롬빈을 생산하여, 응고의 기원이 일어나도록 한다는 것을 발견하였다. 여기 사용된 것과 같은 "FXa"는 단백질, 특히 세린 프로테아제를 의미하며, 그 활성 형태인 세린 프로테아제는 프로트롬빈 가수분해를 개시하는데 책임이 있으며, 이에 따라 응고의 시작을 일으킨다. 이 단백질 분해는 FXa의 활성화된 혈소판 표면에의 결합 및 FVa 및 칼슘 이온의 존재 하에 수행되어, 프로트롬빈을 가수분해한다.

보다 특이적으로, 본 발명자들은 놀랍게도, 지질화된 TF 및 FXa의 조합이, 그들 자체로는 응고를 유도할 수 없는 낮은 FXa 농도에서도, 혈장을 응고시킨다는 것을 발견하였다 [예로서, 섹션 1 (1.5) 및 2의 본 설명에 포함된 실시예의 결과 참조].

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 지질화된 TF 및 (ii) FXa를 포함하는 제품에 관한 것이다. 이전에 언급된 결과들에 기초하여, 상기 제품은 약물로서 사용될 수 있으며, 이는 대상에서, 특히 출혈의 치료, 예로서 출혈의 국소 치료에 사용될 수 있다. 상기 성분 (i) 및 (ii)는 함께 또는 개별적일 수 있다. 특정 구현예에서, 이 제품의 제조에 사용된 지질화된 TF는 지질화된 인간 TF이다.

특정 구현예에서, 본 발명은 (i) 지질화된 TF 및 (ii) FXa를 포함하는 제품을 제공한다. 두 성분들 모두 대상에의 그들의 투여 전에 동일한 조성물 중에 조합될 수 있고, 함께 있을 수 있다.

또다른 특정 구현예에서, 본 발명은 개별적으로, (i) 지질화된 TF 및 (ii) FXa를 포함하는 제품이다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 개별적으로, 대상에게 동시 또는 연속적인 투여를 위한 조합물로서 (i) 지질화된 TF 및 (ii) FXa를 포함하는 제품을 제공한다. 상기 성분들 (i) 및 (ii)의 조합된 투여는 동시에 또는 순차적으로, 시간 간격을 두고, 임의의 순서로 실시될 수 있는데, 즉 먼저 지질화된 TF, 그 후 FXa 가 투여되거나 또는 그 반대로 투여될 수 있다. 선택적으로, 상기 지질화된 TF 및 FXa는 동시에 투여될 수 있다.

대상으로의 이의 투여를 위하여, 이전에 정의된 제품은 약학 투여 형태, 바람직하게는 그의 국소 적용에 적합한 약학 투여 형태로 제형화 될 것이며, 이를 위하여 바람직한 약학 투여 형태의 제조에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제들이 혼입될 것이다. 상기 담체 및 부형제들 및 본 발명의 상기 제품의 투여에 적합한 투여 형태에 대한 정보는 갈레닉 제약 협정 (galenic pharmacy treatises)에서 찾을 수 있다. 추가의 정보를 위해서는, 본 설명의 "약학 조성물"에 관한 섹션 참조.

대상에게 투여되는 지질화된 TF 및 FXa 투여량은 넓은 범위 내에서 변할 수 있다. 예로서, 투여되는 지질화된 TF 투여량은 약 0.01 ㎍의 활성 단백질/ml 내지 100 ㎍의 활성 단백질/ml 사이를 포함한다. 또한, 예로서, 투여되는 상기 FXa 투여량은 약 17 pM 내지 17 nM (0.001 ㎍의 활성 단백질/ml 내지 10 ㎍의 활성 단백질/ml) 사이를 포함한다. 일반적으로, 투여되는 지질화된 TF 및 FXa 투여량은, 사용된 TF 단백질 및 FXa의 특징들, 예로서 그들의 활성 및 생물학적 반감기, 그 제형에서 FXa 및 TF 단백질의 농도, 대상 또는 환자의 임상적 상태, 치료될 출혈 장애 등을 포함하는, 몇몇 인자들에 따라 달라진다 (추가의 정보를 위해서는, 본 설명의 "약학 조성물"에 관한 섹션 참조.)

상기 제품 중에 존재하는 지질화된 TF 및 FXa의 중량비는 넓은 범위 내에서 변화할 수 있다; 예로서, 상기 TF:FXa 중량비는 10⁶:1 내지 10:1 사이를 포함하지만, 기타 중량비도 가능하다; 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 제품은 1 내지 0.001의 중량비의 지질화된 TF 및 FXa를 포함하며, 즉 TF 단백질의 각 밀리그램에 대해, FXa 단백질 1 마이크로그램이 혼합물에 존재한다.

약물로서 이미 정의된 제품의 용도, 구체적으로 어떤 대상에서의 출혈 치료용, 특히 어떤 대상에서 출혈의 국소 치료용 약물 제조에서의 상기 제품의 용도는 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.

II.2 지질화된 TF + NCIS

본 발명자들은 또한 놀랍게도, 지질화된 TF 및 음으로 하전된 무기 표면 (NCIS)의 조합이, 건강한 대상 및 응고 인자-결핍 환자들의 혈장 및 혈액을, 시험관 내 [섹션 1 (1.4), 2 (2.2), 3 (3.4), 4 (4.2) 및 5 (5.2 및 5.4)의 본 설명에 포함된 실시예의 결과들 참조] 및 생체 내 [섹션 6.1의 본 설명에 포함된 실시예의 결과들 참조] 모두에서 응고시킨다는 것을 발견하였다.

본 설명에 사용된 것과 같은 "음으로 하전된 무기 표면" 또는 "NCIS" 라는 용어는 지질 및 혈액 응고 촉진제들, 예컨대 엘라직산, 제올라이트, 실리카, 무기 산화물질 등의 혼합물에 의해 구성된다. 상기 지질들은 순 음전하를 가지며, 이는 그 지질 혼합물이 중성 또는 쯔비터이온성 지질을 포함할 수 있지만, 그 혼합물에 음이온성 특징을 부여하는 일정 양의 음으로 하전된 지질들을 함유하여야만 한다는 것을 의미한다. 예시적이고 비제한적인 예로서, 음으로 하전된 지질들은 스핑고지질 (예컨대, 세라마이드-1-포스페이트, 글리코실화 포스파티딜에탄올아민, 히드록실화 또는 비히드록실화 술파타이드, 강글리오사이드 등) 및 글리세롤-기재 지질 (예컨대, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜이노시톨 포스페이트, 포스파티딕산, 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀(cardiolipins))일 수 있다. 본 특허 출원에서, 상업적으로 이용가능한 Dade® Actin® 제품 (Dade Behring, 상표명)을 NCIS 의 공급원으로서 사용하였다.

따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 (i) 지질화된 TF 및 (ii) NCIS를 포함하는 제품에 관한 것이다. 상기 언급된 결과들에 근거하여, 상기 제품은 약물로서 사용될 수 있으며, 어떤 대상에서 출혈의 치료, 예로서 출혈의 국소 치료에 특히 사용될 수 있다. 상기 성분들 (i) 및 (ii)는 함께 또는 개별적일 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명은 (i) 지질화된 TF 및 (ii) NCIS를 포함하는 제품을 제공한다. 두 성분들 모두 조합될 수 있으며, 대상으로의 그들의 투여 전에 동일한 조성물 내에 함께 있을 수 있다.

또다른 특정 구현예에서, 본 발명은 개별적으로, (i) 지질화된 TF 및 (ii) NCIS를 포함하는 제품을 제공한다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 개별적으로, (i) 지질화된 TF 및 (ii) NCIS 를, 대상으로의 동시 또는 연속 투여를 위한 조합으로서 포함하는 제품을 제공한다. 상기 성분들 (i) 및 (ii)의 대상으로의 조합된 투여는 동시에 또는 연속적으로, 시간 간격을 두고, 임의의 순서로 실시될 수 있으며, 즉 먼저 지질화된 TF 그리고 그 후 NCIS를 투여할 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다. 선택적으로, 상기 지질화된 TF 및 NCIS는 동시에 투여될 수 있다.

대상으로의 이의 투여를 위하여, 이전에 정의된 제품은 약학 투여 형태, 바람직하게는 그의 국소 적용에 적합한 약학 투여 형태로 제형화 될 것이며, 이를 위하여 바람직한 약학 투여 형태의 제조에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제들이 혼입될 것이다. 상기 담체 및 부형제들 및 본 발명의 상기 제품의 투여에 적합한 투여 형태에 대한 정보는 갈레닉 제약 협정에서 찾을 수 있다. 추가의 정보를 위해서는, 본 설명의 "약학 조성물"에 관한 섹션 참조.

대상에게 투여되는 지질화된 TF 및 NCIS 투여량은 넓은 범위 내에서 변화할 수 있다. 예로서, 투여되는 지질화된 TF 투여량은 약 0.01 ㎍의 활성 단백질/ml 내지 100 ㎍의 활성 단백질/ml 사이를 포함할 수 있다. 또한, 예로서, 투여되는 NCIS 투여량 (부피)은 각 ㎕ 의 지질화된 TF 활성화 단백질에 대해 약 0.1 내지 100 ㎕의 사이를 포함할 수 있을 것이다. 일반적으로, 투여되는 지질화된 TF 및 NCIS 투여량은 사용된 TF 단백질 및 NCIS의 특징, 예로서 그의 활성 및 생물학적 반감기, 제형에서 TF 단백질 및 NCIS의 농도, 대상 또는 환자의 임상적 상태, 치료될 출혈 장애 등을 포함하는 몇몇 인자들에 따라 달라진다 (추가의 정보를 위해서는 본 설명에서의 "약학 조성물"에 관한 섹션을 참조).

상기 제품에 존재하는 지질화된 TF 및 NCIS의 중량/부피 (w/v) 비는 넓은 범위 내에서 변할 수 있다; 예로서, 상기 지질화된 TF:NCIS w/v 비는 1:1 내지 1:10⁶ 의 범위를 포함할 수 있으나, 다른 w/v 비도 가능하다; 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 제품은 각 ㎍의 지질화된 TF 활성 단백질에 대해 0.1 내지 100 ㎕ 사이의 NCIS 를 포함한다.

약물로서 상기 정의된 제품의 용도, 구체적으로 어떤 대상에서 출혈 치료용, 특히 어떤 대상에서 출혈의 국소 치료용 약물의 제조에 있어서의 상기 제품의 용도는 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.

II.3 지질화된 TF + FXa + NCIS

본 발명자들은 놀랍게도, 지질화된 TF, FXa 및 NCIS 의 조합은 건강한 대상 및 응고 인자-결핍 환자들의 혈장 및 혈액을, 시험관 내 [섹션 1 (1.6) 및 2 (2.2)의 본 설명에 포함된 실시예의 결과 참조]에서 응고시킨다는 것도 발견하였다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 지질화된 TF, (ii) FXa 및 (iii) NCIS를 포함하는 제품에 관한 것이다. 상기 언급된 결과들에 근거하여, 상기 제품은 약물로서 사용될 수 있으며, 이는 어떤 대상에서, 특히 출혈의 치료, 예로서 출혈의 국소 치료에 사용될 수 있다. 상기 성분들 (i), (ii) 및 (iii)은 함께 또는 개별적일 수 있다. 선택적으로, 성분들 중 두 개는 함께, 예로서 (i) + (ii), (i) + (iii) 또는 (ii) +(iii), 그리고 세 번째 것은 별개일 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명은 (i) 지질화된 TF, (ii) FXa 및 (iii) NCIS 를 포함하는 제품을 제공한다. 상기 성분들은 대상에의 그들의 투여 전에 동일한 조성물 중에 조합될 수 있고, 함께 있을 수 있다.

또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 개별적으로, (i) 지질화된 TF, (ii) FXa 및 (ii) NCIS를 포함하는 제품을 제공한다. 또 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 개별적으로, (i) 지질화된 TF, (ii) FXa 및 (iii) NCIS를, 대상에의 그들의 동시 또는 연속적 투여를 위한 조합물로서 포함하는 제품을 제공한다. 상기 성분들 (i), (ii) 및 (iii)의, 대상에의 조합된 투여는 동시에 또는 순차적으로, 시간 간격을 두고, 임의의 순서로 실시될 수 있으며, 즉, 먼저 지질화된 TF, 그 후 FXa, 그리고 그 후 NCIS 가 투여될 수 있거나, 또는 처음에 지질화된 TF, 그 후 NCIS, 그리고 그 다음에 FXa 가 투여될 수 있거나, 또는 처음에 FXa, 그 후 지질화된 TF, 그리고 그 후 NCIS 가 투여될 수 있거나, 또는 처음에 FXa, 그 후 NCIS, 그리고 그 다음에 지질화된 TF 가 투여될 수 있거나, 또는 먼저 NCIS, 그 후 FXa, 그리고 그 다음에 지질화된 TF 가 투여될 수 있거나, 또는 먼저 NCIS, 그 후 지질화된 TF 그리고 그 다음에 FXa 가 투여될 수 있다. 선택적으로 상기 성분들 중 임의의 두 개가 동일한 조성물 중에 혼합되고 함께 투여되는 반면, 세 번째 성분은 상기 이성분 조성물 전 또는 후에 첨가될 수 있다. 또다른 선택적인 구현예에서, 상기 지질화된 TF, FXa 및 NCIS 는 동시에 투여된다.

대상으로의 이의 투여를 위하여, 이전에 정의된 제품은 약학적 투여 형태, 바람직하게는 그의 국소 투여에 적합한 약학 투여 형태로 제형화될 수 있으며, 이를 위하여, 바람직한 약학 투여 형태의 제조에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제가 혼입될 수 있다. 상기 담체 및 부형제들 및 본 발명의 상기 제품의 투여에 적합한 투여 형태에 대한 정보는 갈레닉 제약 협정 (galenic pharmacy treatises)에서 찾을 수 있다. 추가의 정보를 위해서는, 본 설명의 "약학 조성물"에 관한 섹션 참조.

대상에게 투여되는 지질화된 TF, FXa 및 NCIS 투여량은 넓은 범위 내에서 변할 수 있다. 예로서, 투여되는 지질화된 TF 투여량은 약 0.01 ㎍의 활성 단백질/ml 내지 100 ㎍의 활성 단백질/ml의 사이를 포함할 수 있다. 또한, 예시로서, 투여될 FXa 투여량은 약 17 pM 내지 170 nM (0.001 ㎍의 단백질 및 10 ㎍의 단백질/ml) 사이를 포함할 수 있다. 추가적으로, 예시로서, 투여되는 NCIS 투여량 (부피)은 지질화된 TF 활성 단백질의 각 ㎍에 대해 약 0.1 내지 100 ㎕ 사이를 포함할 수 있다. 일반적으로, 투여되는 지질화된 TF, FXa 및 NCIS 투여량은 사용된 TF 단백질, FXa 및 NCIS의 특징들, 예로서 그들의 활성 및 생물학적 반감기, 그 제형에서 TF 단백질, FXa 및 NCIS의 농도, 대상 또는 환자의 임상적 상태, 치료될 출혈 장애 등을 포함하는, 몇몇 인자들에 따라 달라진다 (추가의 정보를 위해서는, 본 설명의 "약학 조성물"에 관한 섹션 참조.).

상기 제품에 존재하는 지질화된 TF, FXa 및 NCIS의 중량비는, 섹션 II.1 및 II.2에서 이전에 언급한 것과 같이, 넓은 범위 내에서 변할 수 있다; 그럼에도 불구하고, 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 제품은 1:0.001:100 (w:w:v) 비의 지질화된 TF:FXa:NCIS를 포함한다.

약물로서 이전에 정의된 제품의 용도, 구체적으로 상기 제품의 어떤 대상에서의 출혈 치료용, 특히 어떤 대상에서 출혈의 국소 치료용 약물 제조에서의 용도는 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.

III. 복합체 및 적용

III.1 TF::FXa 복합체

상기 언급된 것과 같이 (본 발명의 섹션 II.1), 본 발명자들은, 지질화된 TF 및 FXa의 조합이, FXa 농도가 그들 자체로는 응고를 유도할 수 없는 낮은 농도에서도, 혈장을 응고시킨다는 것을 발견하였다. 임의의 이론에 관련되고자 하는 것은 아니지만, 조합된 또는 개별적인 (임의의 순서), 상기 지질화된 TF 및 FXa의 투여는, 치료 효과가 발휘되어야만 하는 자리에서 관찰된 치료 효과 (항출혈, 특히, 국소 항출혈)를 낼 수 있는 복합체의 형성을 일으키는 것으로 생각된다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 지질화된 TF 및 FXa 를 포함하는, 본 설명에서 TF::FXa 로서 나타낸 복합체에 관한 것이다. 간단하도록, 상기 복합체를 TF::FXa 로서 나타내지만, 상기 복합체는 실질적으로 상기 성분들 각각의 몇몇 단위들에 의해 형성될 수 있었다; 모든 이러한 가능성들은 본 발명의 범주 내에 속한다. 상기 언급된 결과들을 고려시, 상기 복합체는 약물로서 사용될 수 있으며, 어떤 대상에서, 특히 출혈의 치료에, 예로서 출혈의 국소 치료에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 이 복합체의 제조에 사용된 지질화된 TF는 지질화된 인간 TF 이다.

어떤 대상에의 투여를 위하여, 상기 정의된 제품은 약학적 투여 형태, 바람직하게는 그의 국소 투여에 적합한 약학적 투여 형태로 제형화될 수 있으며, 그를 위하여, 바람직한 약학 투여 형태의 제조에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제들을 포함할 수 있다. 상기 담체 및 부형제들 및 본 발명의 상기 제품의 투여에 적합한 투여 형태에 대한 정보는 갈레닉 제약 협정에서 찾을 수 있다. 추가의 정보를 위해서는, 본 설명의 "약학 조성물"에 관한 섹션 참조.

대상에게 투여되는, 상기 복합체에 존재하는 지질화된 TF 및 FXa 투여량은 넓은 범위 내에서 변할 수 있다. 일반적으로, 상기 투여량은 지질화된 TF 및 FXa를 포함하는 제품에 관한 섹션 II.1 에서 이미 언급된 투여량에 대응한다.

상기 TF::FXa 복합체에 존재하는 지질화된 TF 및 FXa의 중량비는 넓은 범위 내에서 변할 수 있다; 그러나 이는 일반적으로 지질화된 TF 및 FXa를 포함하는 제품에 관한 섹션 II.1 에서 이미 언급된 투여량에 대응한다.

약물로서 이미 정의된 복합체의 용도, 구체적으로 어떤 대상에서 출혈 치료용, 특히 어떤 대상에서 출혈의 국소 치료용 약물 제조에의 용도는 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.

III.2 TF::NCIS 복합체

상기 언급된 것과 같이 (본 설명의 섹션 II.2 참조), 본 발명자들은 지질화된 TF 및 NCIS의 조합이 건강한 대상 및 응고 인자-결핍 환자들의 혈장 및 혈액을 시험관 내 및 생체내 모두에서 응고시킨다는 것을 발견하였다. 어떤 이론에 관련되고자 하는 것은 아니지만, 조합된 또는 개별적인 (임의의 순서), 상기 지질화된 TF 및 NCIS의 투여는, 치료 효과가 발휘되어야만 하는 자리에서 관찰된 치료 효과 (항출혈, 특히, 국소 항출혈)를 낼 수 있는 복합체의 형성을 일으키는 것으로 생각된다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 지질화된 TF 및 NCIS를 포함하는, 본 설명에서 TF::NCIS로서 나타낸 복합체에 관한 것이다. 간단하도록, 상기 복합체를 TF::NCIS로서 나타내지만, 상기 복합체는 실질적으로 상기 성분들 각각의 몇몇 단위들에 의해 형성될 수 있었다; 모든 이러한 가능성들은 본 발명의 범주 내에 속한다. 상기 언급된 결과들을 고려시, 상기 복합체는 약물로서 사용될 수 있으며, 어떤 대상에서, 특히 출혈의 치료에, 예로서 출혈의 국소 치료에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 이 복합체의 제조에 사용된 지질화된 TF는 지질화된 인간 TF 이다.

어떤 대상에의 투여를 위하여, 상기 정의된 제품은 약학적 투여 형태, 바람직하게는 그의 국소 투여에 적합한 약학적 투여 형태로 제형화될 수 있으며, 그를 위하여, 바람직한 약학 투여 형태의 제조에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제들을 포함할 수 있다. 상기 담체 및 부형제들 및 본 발명의 상기 제품의 투여에 적합한 투여 형태에 대한 정보는 갈레닉 제약 협정에서 찾을 수 있다. 추가의 정보를 위해서는, 본 설명의 "약학 조성물"에 관한 섹션 참조.

대상에게 투여되는, 상기 복합체에 존재하는 지질화된 TF 및 NCIS 투여량은 넓은 범위 내에서 변할 수 있다. 일반적으로, 상기 투여량은 지질화된 TF 및 NCIS의 조합을 포함하는 제품에 관한 섹션 II.1 에서 이미 언급된 투여량에 대응한다.

상기 TF::NCIS 복합체에 존재하는 지질화된 TF 및 NCIS 의 w/v 비는 넓은 범위 내에서 변할 수 있다; 그러나 이는 일반적으로 지질화된 TF 및 NCIS 를 포함하는 제품에 관한 섹션 II.1 에서 이미 언급된 투여량에 대응한다.

약물로서 이미 정의된 복합체의 용도, 구체적으로 어떤 대상에서 출혈 치료용, 특히 어떤 대상에서 출혈의 국소 치료용 약물의 제조에의 용도는 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.

III.3 지질화된 TF::FXa::NCIS 복합체

상기 언급된 것과 같이 (본 설명의 섹션 II.3 참조), 본 발명자들은 지질화된 TF, FXa 및 NCIS의 조합이 혈장을 응고시킨다는 것을 발견하였다. 어떤 이론에 관련되고자 하는 것은 아니지만, 조합된 또는 개별적인 (임의의 순서), 상기 지질화된 TF, FXa 및 NCIS의 투여는, 치료 효과가 발휘되어야만 하는 자리에서 관찰된 치료 효과 (항출혈, 특히, 국소 항출혈)를 낼 수 있는 복합체의 형성을 일으키는 것으로 생각된다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 지질화된 TF, FXa 및 NCIS를 포함하는, 본 설명에서 TF::FXa::NCIS로서 나타낸, 복합체에 관한 것이다. 간단하도록, 상기 복합체를 TF::FXa::NCIS로서 나타내지만, 상기 복합체는 실질적으로 상기 성분들 각각의 몇몇 단위들에 의해, 그리고 상기 성분들의 상호작용의 임의의 가능성에 의해 형성될 수 있을 것이며, 예로서 TF::NCIS::FXa, FXa::NCIS::TF, FXa::TF::NCIS, NCIS::TF::FXa 또는 NCIS::FXa::TF가 있고; 모든 이러한 가능성들은 본 발명의 범주 내에 속한다. 상기 언급된 결과들을 고려시, 상기 복합체는 약물로서 사용될 수 있으며, 어떤 대상에서, 특히 출혈의 치료에, 예로서 출혈의 국소 치료에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 이 복합체의 제조에 사용된 지질화된 TF는 지질화된 인간 TF 이다.

어떤 대상에의 투여를 위하여, 상기 정의된 제품은 약학적 투여 형태, 바람직하게는 그의 국소 투여에 적합한 약학적 투여 형태로 제형화될 수 있으며, 그를 위하여, 바람직한 약학 투여 형태의 제조에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제들을 포함할 수 있다. 상기 담체 및 부형제들 및 본 발명의 상기 제품의 투여에 적합한 투여 형태에 대한 정보는 갈레닉 제약 협정에서 찾을 수 있다. 추가의 정보를 위해서는, 본 설명의 "약학 조성물"에 관한 섹션 참조.

대상에게 투여되는, 상기 복합체에 존재하는 지질화된 TF, FXa 및 NCIS 투여량은 넓은 범위 내에서 변할 수 있다. 일반적으로, 상기 투여량은 지질화된 TF, FXa 및 NCIS의 조합을 포함하는 제품에 관한 섹션 II.3 에서 이미 언급된 투여량에 대응한다.

상기 TF::FXa::NCIS 복합체에 존재하는 지질화된 TF, FXa 및 NCIS 의 비율은 넓은 범위 내에서 변할 수 있을 것이다; 그러나 이는 일반적으로 지질화된 TF, FXa 및 NCIS 를 포함하는 제품에 관한 섹션 II.3 에서 이미 언급된 투여량에 대응한다.

약물로서 이미 정의된 복합체의 용도, 구체적으로 어떤 대상에서 출혈 치료용, 특히 어떤 대상에서 출혈의 국소 치료용 약물의 제조에의 용도는 본 발명의 추가의 측면을 구성한다.

IV. 약학 조성물

이전에 언급된 것과 같이, 지질화된 TF 는 항출혈제로서, 특히 국소 적용을 위한 항출혈제로서 사용될 수 있다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 약학 조성물에 관한 것으로, 이하에서는, 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는 지질화된 TF를 포함하는, 본 발명의 약학 조성물에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 지질화된 TF는 지질화된 인간 TF이다.

어떤 대상에의 투여를 위하여, 상기 정의된 제품은 약학적 투여 형태, 바람직하게는 그의 국소 투여에 적합한 약학적 투여 형태로 제형화될 수 있으며, 그를 위하여, 바람직한 약학 투여 형태의 제조에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제들을 포함할 수 있다. 상기 담체 및 부형제들 및 본 발명의 상기 제품의 투여에 적합한 투여 형태에 대한 정보는 갈레닉 제약 협정에서 찾을 수 있다. 일반적인 약물들의 상이한 약학 투여 형태들 및 그들의 제조 방법들의 리뷰는, 책"Tratado de Farmacia Galenica" (" Galenic Pharmacy Treatises "), C. Fauli i Trillo, 제 1 판, 1993, Luzan 5, Ediciones S.A. 에서 찾을 수 있다.

상이한 투여 형태의 지질화된 TF가 사용될 수 있지만, 상기 화합물의 국소적인 투여가 실시에서 가장 유리하며, 따라서 상기 지질화된 TF 는 그의 국소 적용에 적합한 약학적 형태로 제형화될 것이다. 상기 약학적 형태들의 예시적이고 비제한적인 예들은, 에어로졸, 용액, 현탁액, 에멀션, 겔, 고약, 크림, 드레싱, 패치, 연고, 구강세척제 등을 포함한다. 그를 위하여, 지질화된 TF 를 포함하는 약학 제형은 국소 투여를 위한 지질화된 TF의 약학 투여 형태를 제조하는데 요구되는, 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제들을 포함할 것이다.

따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 지질화된 TF 및 상기 지질화된 TF의 국소 투여에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 지질화된 TF의 국소투여용 약학 조성물이다.

지질화된 TF 는 본 발명의 약학 조성물 중에 약학적으로 유효한 양으로 존재할 것이다. 상기 양은 넓은 범위 내에서 변화할 수 있으며, 예로서 약 0.01 ㎍의 활성 단백질/ml 내지 100 ㎍의 활성 단백질/ml 사이에서 변화할 수 있다.

또다른 특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 다음을 포함한다:

a) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, (i) 지질화된 TF 및 (ii) FXa 를 포함하는 제품; 또는

b) 개별적으로, (i) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, 지질화된 TF 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, FXa; 또는

c) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, (i) 지질화된 TF 및 (ii) NCIS를 포함하는 제품; 또는

d) 개별적으로, (i) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, 지질화된 TF 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, NCIS; 또는

e) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, (i) 지질화된 TF, (ii) FXa 및 (iii) NCIS 를 포함하는 제품;

f) 개별적으로, (i) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, 지질화된 TF (ii) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, FXa 및 (iii) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, NCIS; 또는

g) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, TF::FXa 복합체; 또는

h) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, TF::NCIS 복합체; 또는

i) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, TF::FXa::NCIS 복합체.

본 발명의 이미 정의된 약학 조성물은, 알 수 있는 바와 같이, 단독 또는 FXa 및/또는 NCIS와 조합되거나, 또는 활성 성분으로서 FXa 및/또는 NCIS와 복합체를 형성하는, 지질화된 TF를 함유한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 정의된 약학 조성물에 존재하는 지질화된 TF는 지질화된 인간 TF이다.

또한, 특정 구현예에서, 본 발명의 상기 정의된 약학 조성물은 활성 성분의 국소 적용을 위한 약학 형태로 제형화될 수 있다 (단독 또는 FXa 및/또는 NCIS와 조합되거나, 또는 활성 성분으로서 FXa 및/또는 NCIS와 복합체를 형성하는, 지질화된 TF). 상기 약학 형태들의 예시적이고 비제한적인 예들은 에어로졸, 용액, 현탁액, 에멀션, 겔, 고약, 크림, 드레싱, 패치, 연고, 구강세척제 등을 포함한다. 상기 목적을 위하여, 상기 언급된 활성 성분을 포함하는 약학 제형은 국소 투여에 의한 상기 활성 성분의 약학 투여 형태의 제조에 요구되는 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제들을 포함할 것이다.

활성 성분은 본 발명의 약학 조성물 중에 치료 유효량으로 존재할 것이다. 대상에게 투여되는 활성 성분 투여량은, 다른 인자들 중, 상기 대상이 겪는 병리학의 심각성, 선택된 약학 투여 형태 등에 따라 달라질 것이다. 이러한 이유로, 본 발명에서 언급된 투여량은 본 기술 분야의 당업자에 대한 지침으로서만 간주되어야 하며, 당업자는 상기 언급된 변수들에 따라 투여량을 조정하여야만 한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 약학 조성물은 예방 또는 치료 목적으로, 하루에 1 회 이상 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은, 병용 요법을 제공하기 위하여 출혈성 특이 체질 (예로서, 응고 인자들, 인간 혈장, 등)의 예방 및/또는 치료에 유용한 기타 추가 약물들과 함께 사용될 수 있다. 상기 추가적인 약물들은 동일한 약학 조성물의 일부일 수 있거나, 또는 선택적으로 본 발명의 약학 조성물의 투여에 관하여, 그들은 동시 또는 연속적인 (시간 순서로) 투여를 위한 개별적인 조성물의 형태로 제공될 수 있다.

V. 지지된 약학 조성물

본 발명의 약학 조성물은 지지체 상에 위치될 수 있다. 따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물 및 지지체를 포함하는 제품에 관한 것이다. "지지체" 라는 용어는 본 발명의 약학 조성물이 그 위에 침적되어, 운반되고, 원하는 자리, 예로서 본 발명의 약학 조성물이 치료 효과를 발휘하는 자리에서 그를 유리하도록 하는 적절한 물질의 기재를 의미한다. 상기 지지체는 고체 지지체 또는 비-고체 지지체, 예로서 액체 지지체 또는 기체 지지체일 수 있다. 고체 지지체들의 예시적이고 비제한적인 예들은 드레싱, 밴드에이드 (band-aid), 습포, 기브스 (plasters) 등을 포함한다. 액체 지지체들의 예시적이고 비제한적인 예들은 겔, 스프레이, 구강 청정제 등을 포함한다. 기체 지지체들의 예시적이고 비제한적인 예들은 공기, 추진제, 등을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 지지체 상에 침적된 본 발명의 약학 조성물은 다음을 포함한다:

(a) (i) 지지체, (ii) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, 지질화된 TF 및 FXa를 포함하는 제품, (iii) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, 지질화된 TF 및 NCIS를 포함하는 제품 및 (iv) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, 지질화된 TF, FXa 및 NCIS를 포함하는 제품; 또는

(b) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, TF::FXa 복합체, 또는

(c) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, TF::NCIS 복합체, 또는

(d) 약학적으로 허용가능한 담체를 함께 갖는, TF::FXa::NCIS 복합체.

특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물에 존재하는 지질화된 TF 는 지질화된 인간 TF이다.

지지체 상에 침적된 본 발명의 약학 조성물을 포함하는 제품은 통상적인 방법에 의해, 예로서 본 발명의 약학 조성물과 지지체를 혼합하는 방법에 의해 수득될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물과 지지체 간의 상호작용은 물리적 또는 화학적 상호작용일 수 있으며, 이는 본 발명의 약학 조성물의 성분들의 성질 및 사용된 지지체에 따라 달라진다.

VI. 출혈 치료를 위한 비-지질화된 TF의 용도

본 발명자들에 의해 실시된 분석에서 수득된 결과들은 TF 에 대해 다음을 명백히 보여준다: TF가,

- FXa 의 단백분해 활성을 증가시키고, 그에 따라 트롬빈 생성을 증가시키고,

- 건강한 대상 및 FVII 결핍 혈액을 포함하는 응고 인자 결핍 환자들의 혈장 및 혈액을 응고시키고,

- 혈소판 장애들을 겪는 환자들의 혈액을 응고시키고,

- 상이한 동물 모델들에서의 생체내 심한 그리고 치명적인 출혈을 멈춘다.

따라서, 이들 결과들은 그 전체로서, 지질화된 TF가 건강한 대상들 및 FVIII, FIX, FXI, FXIII, FVII, F 및 FX 결핍 환자들을 포함하는, 응고 인자 결핍자들에서의 출혈의 치료에 유용한 지혈제라는 것을 명백히 보여준다.

유럽 특허 EP 266993 호는 출혈의 치료, 특히 응고 인자의 결핍, 특히 FVIII, FIX, FXI 또는 FXIII로부터 선택된 응고 인자의 결핍으로 인한 출혈의 치료에서의 비-지질화된 TF 의 용도를 개시한다. 그러나, 상기 특허는 FVII 결핍으로 인한 출혈의 치료에서 비-지질화된 TF의 사용 가능성은 개시하지도 제시하지도 않고 있다.

대상이 FVII-결핍인지 아닌지의 여부에 관계없이, FXa 단백분해 활성 자극제로서의 TF의 역할에 관한 본 발명자들에 의해 이제 이루어진 발견은, FVII-결핍 대상에서의 출혈의 치료에 있어서 비-지질화된 TF 또는 그의 비-지질화된 절편의 사용 가능성을 수립가능하게 한다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 비-지질화된 TF 또는 그의 비-지질화된 절편의, FVII-결핍 대상에서의 출혈 치료를 위한 약제 제조를 위한 용도에 관한 것이다.

여기 사용된 것과 같은 "비-지질화된 TF" 라는 표현은 정제된 TF (원형질성 지질막이 없는)를 의미한다. 여기 사용된 것과 같은 용어 TF는, 야생형 TF 기능들 중 적어도 하나, 유리하게는 응고와 관련된 야생형 TF 기능들 중 적어도 하나를 유지하는 야생형 TF 변이체 및 돌연변이들을 포함한다. TF의 분리 및 정제는 뇌, 태반 및 폐 조직과 같은 몇몇 조직들로부터, 양, 소, 토끼, 개, 인간 등과 같은 상이한 동물들로부터의 조직들로부터 실시될 수 있다. TF 는 미국 특허 6,261,803 호에서, 단지 예시적고 비제한적인 예로서 설명된 것과 같은 공정에 의해 수득된 재조합 TF (rTF)일 수도 있다. 특정 구현예에서, 본 발명을 실시하는데 사용된 비-지질화된 TF는 비-지질화된 인간 TF이며, 혈장성 지질막이 완전히 없는 인간 조직으로부터 분리 및 정제된 TF의 단백질성 성분으로 이루어진다.

여기 사용된 것과 같은 "비-지질화된 TF의 기능성 절편"이라는 표현은, 이에 제한되지는 않지만, 하나 이상의 TF 기능성, 바람직하게는 예로서 FXa 및/또는 NCIS에의 결합능 및 상처 치유 동안 그들의 항출혈 및 혈관 형성 기능의 발생능을 유지하는, 야생형 TF의 단백질성 성분의 돌연변이 및 변이체들을 포함하는 TF의 펩티드 유도체, 특히 TF의 단백질성 성분의 펩티드 유도체를 포함한다. TF의 상기 기능성 절편의 아미노산 서열은 야생형 TF의 단백질성 성분의 절편의 서열과 동일할 수 있거나, 또는 야생형 TF의 기능들 중 적어도 하나, 유리하게는 응고와 관련된 적어도 하나의 기능이 보존되는 조건으로, 하나 이상의 아미노산들의 삽입, 결실 또는 변경들을 가질 수 있다. 간단하도록, 여기 사용된 것과 같은 "비-지질화된 TF"라는 표현은 비-지질화된 TF의 임의의 기능성 절편을 포함한다.

비-지질화된 TF는 통상적인 방법들에 의해 수득될 수 있다. 예시로서, TF의 단백질성 성분은, 유기 용매 추출에 의하여, 지질 성분으로부터 분리된다. 상기 유기 용매의 예시적인 예들은 피리딘, 에탄올, 헵탄-부탄올 혼합물, 등을 포함한다. TF의 단백질성 성분은 통상적인 화학 공정들에 의해 정제될 수 있다. 상기 화학 공정들의 예들은 세제, 예로서 데옥시콜레이트, 트리톤 X-100 등을 이용한 처리, 나트륨 도데실 술페이트의 존재하에서 폴리아크릴아미드 겔 중에서의 겔 여과 및 분취용 전기영동, 세파로오스 컬럼에 결합된 콘카발린 A (concavalin A)의 이용, TF의 단백질성 성분 (단백질)에 대한 항체들을 사용하는 친화성 컬럼의 이용을 포함한다.

FVII-결핍 대상에의 이의 투여를 위하여, 비-지질화된 TF는 임의의 적당한 경로에 의한 그의 투여에 적합한 약학 형태로 제형화될 것이다. 실질적으로 임의의 약학 형태가 사용될 수 있지만, 상기 비-지질화된 TF의 비경구 투여용 약학 형태의 이용이 유리하다.

따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 비-지질화된 TF, 또는 그의 비지질화된 절편의, 상기 비-지질화된 TF 또는 그의 지질화된 절편의 비경구 투여용 약물의 제조에의 용도에 관한 것이다.

이 경우에서, 비-지질화된 TF 및 약학적으로 허용가능한 부형제들 또는 담체들을 함유하는 약학 조성물들은, 적절한 투약 형태의, 예로서 멸균 용액, 현탁액 또는 동결건조 제품의 형태로 그들의 비경구 투여에 대해 적합화될 것이다; 이 경우에서, 상기 약학 조성물들은 버퍼, 계면활성제 등과 같은 적당한 부형제들을 포함할 것이다. 임의의 경우에서, 부형제들은 선택된 약학 투여 방법에 따라, 선택될 것이다. 상기 담체 및 부형제들 및 본 발명의 상기 제품의 투여에 적합한 투여 형태에 대한 정보는 갈레닉 제약 협정에서 찾을 수 있다. 일반적으로 약물들의 상이한 약학 투여 형태들 및 그들의 제조 방법들의 리뷰는, 책 "Tratado de Farmacia Galenica" (" Galenic Pharmacy Treatises "), C. Fauli i Trillo, 제 1 판, 1993, Luzan 5, Ediciones S.A. 에서 찾을 수 있다.

FVII-결핍 대상에 투여되는 비-지질화된 TF의 투여량은 넓은 범위 내에서, 예로서 약 0.01 ㎍의 활성 단백질/ml 내지 100 활성 ㎍의 단백질/ml에서 변화할 수 있다. 투여되는 비-지질화된 TF 투여량은 사용된 TF 단백질의 특징들, 예로서 그의 활성 및 생물학적 반감기, 그 제형에서 TF 단백질의 농도, 대상 또는 환자의 임상적 상태, 치료될 출혈 장애 등을 포함하는, 몇몇 인자들에 따라 달라진다.

도 1은 기본 FXa 농도 및 피브린 응고물 형성을 나타내는 개략도이다.

도 2는 기존의 혈액 응고의 내인성 및 외인성 경로를 나타내는 개략도이다.

도 3은 본 발명에 따른 FXa 자극제로서의 지질화된 TF의 신규 조절 효과를 나타내는 개략도이다.

지질화된 TF의 FXa의 자극제로서의 능력의 평가 목적으로, 일련의 시험관 내 및 생체 내 실험들을 특이적으로 수행하였다:

1. (단독 및 조합된) 지질화된 TF가 FXa의 직접적인 자극제로서 작용하여, FVII 부재 하에서 (부재, 결핍 또는 면역저해에 의해 유발됨) 피브린 응고물 형성 및 혈액 응고를 일으킨다는 것을 증명하는 시험관 내 분석

1.1 지질화된 TF는 FVII 부재 하에서 FXa 단백분해 활성 및 그에 따른 트롬빈 생성을 증가시킨다 (용액, 및 세척된 혈소판의 현탁액 중에서 발색 분석).

1.2 지질화된 TF는 FVII-결핍 환자들로부터의 혈장 및 혈액을 응고시킬 수 있다 (혈장 및 비-항응고화된 전혈에서의 응고 분석).

1.3 지질화된 TF는 FVII에 대한 단일클론성 항체의 존재 하에서, 건강한 대상들의 혈장을 응고시킬 수 있다 (응고 분석).

1.4 지질화된 TF 및 NCIS의 조합은 FVII 결핍 혈장에서 혈액 응고를 상승적으로 증가시킨다 (응고 분석).

1.5 지질화된 TF 및 FXa의 조합은 FVII에 대한 단일클론성 항체 존재 하에, 혈액 응고를 상승적으로 증가시킨다 (FX 결핍 혈장에서 응고 분석).

1.6 지질화된 TF, FXa 및 NCIS의 조합은 항 FVII 항체의 존재 하에, 응고를 상승적으로 증가시킨다 (FX 결핍 혈장에서 응고 분석).

2. (어떤 응고전구 효과도 유도할 수 없는) 저농도의 FXa와 지질화된 TF의 조합이 FX 결여 혈장의 응고를 일으킨다는 것을 증명하는 시험관 내 분석

2.1. 지질화된 TF는, 이 세린 프로테아제가 저농도로 존재시, FXa의 자극제 로서 작용한다.

2.2 지질화된 TF와 FXa 및 NCIS의 조합은 FXa의 자극에 상승적으로 작용한다.

3. (단독 및 조합된) 지질화된 TF가, FVII 외의 다른 응고 인자들의 결핍이 있는 환자들에서 혈액 응고를 일으킨다는 것을 증명하는 시험관 내 분석

3.1. 지질화된 TF는 응고 인자들 FV, FVIII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, 및 FXIII에서의 결핍을 가진 환자들로부터의 혈장 및 혈액을 응고시킨다 (응고 인자 결핍 혈장 및 FVIII 및 FIX로부터의 비-응고화된 전혈에서의 응고 분석).

3.2 지질화된 TF는 미리 헤파린화된 전혈 및 혈장을 응고시킨다.

3.3 지질화된 TF는 와파린으로 처리된 동물로부터의 혈장을 응고시킨다.

3.4 지질화된 TF와 NCIS의 조합은 응고 인자 FV, FVIII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, 및 FXIII의 결핍이 있는 환자들로부터의 혈장 (응고 인자 결핍 혈장에서의 응고 분석) 및 혈우병 환자로부터의 전혈에서 혈액 응고를 상승적으로 개선한다.

4. (단독 또는 조합된) 지질화된 TF가 건강한 대상에서 혈액 응고를 일으킨다는 것을 증명하는 시험관 내 분석

4.1. 지질화된 TF는 건강한 대상으로부터의 혈장 및 혈액을 응고시킨다

4.2 지질화된 TF와 NCIS의 조합은 건강한 대상으로부터의 혈장 및 혈액에서 혈액 응고를 상승적으로 개선한다. 지질화된 TF가 인지질과 연합될 때 상승 효과는 부재임.

5. 선천성 및 후천성 (혈소판감소성 자반증) 혈소판 장애들을 갖는 환자들로부터의 혈장에서 (단독 및 조합된) 지질화된 TF 의 응고 효과를 증명하는 시험관 내 분석.

5.1. 지질화된 TF는 선천성 혈소판 장애들을 갖는 환자들로부터의 혈장을 응고시킨다.

5.2. 지질화된 TF와 NCIS의 조합은 선천성 혈소판 장애들을 갖는 환자들로부터의 전혈에서 응고를 증가시킨다.

5.3 지질화된 TF는 혈소판감소성 자반증 샘플들을 응고시킨다.

6. TF가 대조구 래트들에서 국소 항출혈 치료에 유용한 약제라는 것을 증명하는 생체 내 분석 (단독으로 직접 또는 NCIS와의 조합을 미리 절단된 혈관에 적용함에 의해)

6.1. (단독 또는 NCIS와 조합된) 지질화된 TF는 래트 꼬리의 근위 (proximal) 절단에 의한 심한 출혈 동물 모델에서 국소 지혈제로서 유용하다

6.2 지질화된 TF는, 헤파린 또는 와파린으로 미리 처리된 심한 출혈 동물 모델에서 국소 지혈제로서 유용하다.

6.3 지질화된 TF는 래트 꼬리의 근위 절단에 의한 치명적 출혈 동물 모델에 서 국소 지혈제로서 유용하다.

I. 재료 및 방법

재료

지질화된 TF의 공급원으로서 인간 재조합 조직 인자 (rTF), Thromborel® S, 및 Neoplastin® Plus가 사용되었다. 구체적으로, 하기 상업적 제제들을 사용하였다: 모리세이에 의해 기재된 방법에 따라 재지질화된, 인간 재조합 조직 인자 (비-지질화됨) (American Diagnostica, USA); 칼슘을 함유하는 동결건조된 인간 태반 트롬보플라스틴 (Thromborel®S, Dade Behring Inc); 칼슘을 함유하는 동결건조된 토끼 뇌 (Neoplastin® Plus, Diagnostica Stago-Roche).

TF 단백질의 응고전구 활성을, 인간 재조합 지질화된 TF (American Diagnostica, USA)를 기준 물질로서 사용하여 표준 곡선에 의해 결정하고, 본문 중에는 ㎍의 활성 단백질/ml 로 나타내고 표들에서는 ㎍/ml로 나타내었다. 간단하게, 본 실시예에서, rTF 또는 TF라는 용어는 달리 언급되지 않는 한 지질화된 TF를 의미한다. Haematologic Technologies 의 상용 화합물들을 FXa, FII, 및 FVa의 공급원으로서 사용하였다. 상용의 Dade®Actin®FS 시약 (Dade Behring)을 NCIS로서 사용하였다. 상용의 응고 인자 결핍 혈장(FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII 및 FXIII)을 Dade Behring Marburg GmbH로부터 구매하였다.

방법

옥틸글루코시드를 이용한 투석을 이용하여 지질 소낭 중에 TF를 재지질화하는 방법 (모리세이법).

비-지질화된 TF를 비이온성 세제 N-옥틸-베타-D-글루코피라노시드 (옥틸글루코시드)를 사용하여 지질 소포 내로 혼입시킨다. TF 및 지질 모두를 옥틸글루코시드 형성 미셀들(micelles) 중에 용해시킨다. 옥틸글루코시드는 그의 높은 임계 미셀 농도 (CMC = 20 내지 50 mM)로 인하여 투석에 의해 용액으로부터 쉽게 제거될 수 있다. 옥틸글루코시드를 제거할 때, 지질들은 다중층 소포들 내에서 조직화된다. TF는 그의 막투과 도메인으로 인하여 이들 소포들 중에 침윤된다. 정상적으로, 50 내지 80%의 TF 분자들은 소포들로부터 외측을 향하여 배열된다.

버퍼 및 저장 용액

Calbiochem으로부터의 옥틸글루코시드(n-옥틸-베타-D-글루코피라노사이드).

지질:

	지질	농도	분자량
PC	L-알파-포스파티딜콜린	10 또는 25mg/ml	761
PS	L-알파-포스파티딜세린, 소 뇌 나트륨염	10mg/ml	810
PE	L-알파-포스파티딜에탄올아민, 소간	10mg/ml	768

버퍼:

HBS

100 mM NaCl 20 mM Hepes/NaOH, pH 7.5 0.02 % (m/v) 나트륨 아지드

HBSA (4℃에서 유지)

0.1% (m/v) HBS 중 소 혈청 알부민

OG/HBS (사용시 제조)

100 mM HBS 중 n-옥틸-베타-D-글루코피라노사이드 (29.2 mg OG/ml의 HBS)

옥틸글루코시드 (OG) 중 지질 용액의 제조

1. 원하는 지질 몰 비를 사용하여 2.6 마이크로몰의 총 지질을 유리관 중에 각 샘플에 대해 제조한다.

2. 지질 혼합물을 아르곤 또는 질소 흐름 하에서 건조시킨다.

3. 관이 마른것으로 보이면, 추가 60분 동안 진공 건조한다.

4. 400㎕의 OG/HBS의 새로운 용액을 (실온에서) 건조 지질을 함유하는 관에 첨가한다.

PC:PS 소포의 경우 (80:20 몰 비)
62㎕ PC (25 mg/ml)	=1.58 mg	=2.08 μ몰
42㎕ PS (10 mg/ml)	=0.42 mg	=0.52 μ몰
PC:PE:PC 소포의 경우 (40:40:20 몰 비)
32㎕ PC (25 mg/ml)	=0.79 mg	=1.04 μ몰
80㎕ PE (10 mg/ml)	=0.80 mg	=1.04 μ몰
42㎕ PS (10 mg/ml)	=0.42 mg	=0.52 μ몰

재지질화

원하는 양의 TF를 400 ml의 OG/지질 및 충분한 HBSA를 함유하는 관에 첨가하여 최종 부피를 1ml 로 하였다. 이 과정을 실온에서 실시하였다.

세척된 혈소판 현탁액들의 수득

세척된 혈소판 현탁액들을 Radomski M. 등 (Radomski M, Moncada S.; 1983 Thromb Res. 이는 인간 혈소판들을 프로스타사이클린 (prostacyclin)으로 세척하는 개선된 방법이다. 15;30(4):383-9))에 의해 설명된 방법에 따라, 건강한 지원자들의 혈액 추출물로부터 (3.15% 나트륨 시트레이트) 제조하였다. 표본들의 가공은 언제나 혈액 추출 직후에 실온에서 실시하였다. 혈소판 활성화 및 기능성 상태는 분석 수행 전 및 수행 동안 집합 분석에 의해 분석하였다. 자체-활성화 및 기능성을 알려진 아고니스트 (콜라겐)를 이용한 활성화에 의해 평가하였다.

시험관 내 분석

발색 분석

상이한 발색 분석들을 용액 및 활성화된 혈소판 현탁액 중에서 설계하여 rTF의 인자 Xa 단백분해 활성에 대한 효과를 증명하였다.

FXa 아미드분해성 활성을, S-2765 (Chromogenix)를 FXa 에 대한 발색원성 기질로서 사용하여 발색 분석에 의해 결정한 반면, 트롬빈 형성 활성은, S-2238 (Chromogenix)을 트롬빈에 대한 발색원성 기질로서 사용하여 분석하였다.

발색 분석들을 현탁액 (버퍼 중)에서, 세척된 혈소판 현탁액을 사용하여 수행하였다. 연구되는 인자들 각각의 적합한 부피를 ELISA 플레이트 상에 분배하였으며, 세척된 혈소판 현탁액을 사용하는 경우, 그러한 적합한 부피는 매질 중에, 250,000 혈소판/㎕의 농도를 갖는 것이다. 최종적으로, 특이적 발색 기질의 첨가는 450 nm의 분광광도 시도에 의해, 대상이 되는 단백 분해 활성의 정량을 가능하게 하였다. 아미드분해 활성을 결정하기 위한 분석들에서, 단지 FXa 및 상이한 rTF 농도를 분배한 반면, 트롬빈 형성 활성을 결정하기 위한 분석에서는 인자 II (프로트롬빈) 및 FVa 를 더욱 첨가할 필요가 있었다 (후자는 현탁액 중 분석의 경우에서만, 세척된 혈소판 분석들에서 이들이 이미 내생의 FVa 에 함유된 경우).

혈장 중 응고 분석

혈장 중 자발적 응고전구 활성 (자극되지 않음)을 혈액응고장비 (coagulometer) (Fibrintimer BFT-II clot-timer Dade-Behring, 독일)에서 특정 단계를 갖는 응고 분석에 의해 측정하였다. 결국, 50㎕의 혈소판-부족 (platelet-poor) 혈장을 이미 템퍼링된 큐빗 (tempered cuvettes)들에 첨가하고, 50㎕의 증류수를 첨가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 60 초 동안 인큐베이션시키고, 50㎕의 25mM 염화칼슘을 즉시 첨가하고 응고 시간을 혈액응고장비에서 초 단위로 측정하여, 응고물 형성에 의해 확인하였다. 샘플들 각각을 이중으로 분석하였다. 혈소판-부족 혈장은 원심분리 절차에 의해 수득하였으며, 혈소판 수는 코울터 계수기(Coulter)로 결정하였다.

전혈 중 응고 분석

비-항응고된 전혈에서의 응고전구 활성을 응고법에 의해 결정하였다. 연구되는 상이한 제제들을 1ml의 비-항응고된 전혈에 첨가하고, 응고 시간을 혈액응고장비를 사용하여 추출의 시작부터 안정하고 강화된 혈액 응고물이 나타날 때까지 측정하였다. 상이한 제제들의 효과를 그들의 혈액 응고 시간의 단축 또는 연장에 의해 평가하였다.

생체 내 분석

래트 꼬리의 근위 (proximal) 절단에 의한 심한 출혈 모델

체중 350-450 g의 23 마리의 Sprage-Dawley 수컷 래트를 3 개의 처리군으로 임의 분류하였다: 대조군은 생리 식염수로 국소 처리를 받은 14 마리로 구성된 반 면, 나머지 두 군은 5 마리로 구성되었으며, 1.2㎍/ml rTF 로 국소처리 받았으며, n=4는 1.2㎍/ml rTF + NCIS로 각각 국소처리되었다 (부피:부피 1:2). 지혈 작용을 위하여 상기 동물의 꼬리의 근위 절단부와 국소 접촉되는 모든 화합물들을 플라스틱 에펜도르프 피펫에 의해 분배하였다. 안정하고 강화된 응고물의 형성을, 더이상의 출혈이 없음을 확인함에 의해 증명하였다.

항응고제 약물로 처리된 동물에서 래트 꼬리의 근위 절단 심한 출혈 모델

체중 350-450 g의 27 마리의 Sprage-Dawley 수컷 래트를 5 개의 처리군으로 임의 분류하였다: 대조군은 생리 식염수로 국소 처리를 받은 14 마리로 구성되었다. 즉 두 군은 꼬리 절단 절차를 시작하기 전 15 분에 200 U/Kg 의 헤파린을 받았으며 (TF로 처리되는 n=3, 그리고 식염수로 처리되는 n=5), 기타 두 개의 군은 꼬리 절단 절차를 시작하기전 3일 동안 0.1 mg/kg/일의 와파린을 경구 투여받았다 (TF로 처리되는 n=3, 그리고 식염수로 처리되는 n=2). 1.2㎍/ml rTF를 이용한 국소 처리를 각 처리군의 단지 하나에만 투여하였다. 따라서, 이는 각 항응고 처리에 대한 대조구 처리군이다. 지혈 작용을 위하여 상기 동물의 꼬리의 근위 절단부와 국소 접촉된 지질화된 TF를 플라스틱 에펜도르프 피펫에 의해 분배하였다. 안정하고 강화된 응고물의 형성을, 더이상의 출혈이 없음을 확인함에 의해 증명하였다.

래트의 경동맥 천자에 의한 치사 출혈 모델

체중 350-450 g의 4 마리의 수컷 Sprage-Dawley 래트를 각각 2 마리의 동물을 포함하는 2 개의 처리군으로 임의 분류하였다. 대조군 동물은 생리 식염수 용액을 처리로서 수령한 반면, 나머지 군은 국소적으로 투여된 지질화된 TF 를 수령하였다 (최종 투여량 2 ㎍의 활성 단백질). 래트의 경동맥 천자에 의한 치사 출혈 모델을 표준 절차들을 따라 실시하였다. 지질화된 TF 및 생리 식염수 용액을 각각 3 ml 를 함유하는 드레싱 중의 천자 지점에 직접 투여하였다. 이는 2 분 동안의 대응 치료의 압력 및 접촉과 조합되었다.

II. 결과

1. (단독 또는 조합된) 지질화된 TF가 FXa의 직접 자극제로서 작용하여, FVII의 부재 하에, (부재, 결핍, 또는 면역저해에 의해 유발됨) 피브린 응고물 형성 및 혈액 응고를 일으킨다는 것을 증명하는 시험관 내 분석

1.1. 지질화된 TF 는 FVII 부재 하에 FXa 단백분해성 활성 및 그에 따른 트롬빈 생산을 증가시킨다.

FVII의 부재 하에 인자 Xa 자극제로서의 지질화된 TF 능력을 평가하기 위한 목적으로 몇몇 시험관 내 분석들을 수행하였다: (i) 용액 중 FXa 아미드분해성 활성에 대한 발색 분석; 및 (ii) 세척된 혈소판 현탁액 중 트롬빈 형성 활성에 대한 발색 분석.

FXa 아미드분해성 활성에 대한 발색 분석

FXa-특이적 기질 S-2765를 사용하는, 용액 중 FXa 아미드분해성 활성에 대한 직접 분석은, 지질화된 TF가 FXa 단백분해 활성을 현저히 증가시킬 수 있음을 증명하였다. 높은 rTF 농도 (1 ㎍/ml)의 존재하에, 저농도 및 고농도의 FXa (p<0.001)에 의해 생성된 활성의 증가가 관찰되었다. 유사한 현저한 자극 효과들 (p<0.001)이 보다 낮은 지질화된 TF 농도들의 존재 하에서 관찰되었다 (0.1 ㎍/ml). 표 1은 5개의 독립된 실험들에서 수득된 결과들을 나타낸다.

FVII의 부재 하에, 지질화된 TF는 FVII의 부재 하에 FXa 단백분해 활성을 증가시킨다
	rTF 없음	rTF 0.1㎍/ml	rTF 1㎍/ml
FXa 30nM	550±51	2,108±61	3,316±89
FXa 5nM	0	341±32	505±63
평균±SEM (n=5)

세척된 혈소판 현탁액 중 트롬빈 형성 활성에 대한 발색 분석

검출된 응고전구 효과는, 혈소판 현탁액이 응고전구 표면의 공급원으로서 사용된 경우 보다 컸으며, 트롬빈 형성은 특이적 기질 S-2238 에 의해 결정하였다 (표 2). 외생의 FXa 부재하에, 지질화된 TF는 트롬빈 형성에 현저한 자극 효과를 생성하였다 (p<0.001). 유사한 자극 효과들이, 저농도 및 고농도의 외생의 FXa 존재하에 관찰되었다 (p<0.001).

지질화된 TF 는, FII는 존재 하지만 FVa (이미 혈소판 중에 존재) 및 FVII 부재 하에, 세척된 혈소판 중에서 트롬빈 형성을 유도한다
	rTF 없음	rTF 0.1㎍/ml	rTF 1㎍/ml
FXa 1,250pM	421±19	13,854±145	14,910±168
FXa 250pM	213±21	9,324±155	9,610±114
FXa 125pM	201±29	7,802±113	8,508±178
FXa 부재	0	906±89	3,504±69
평균±SEM (n=5)

1.2. 지질화된 TF는 FVII-결핍 환자들로부터의 혈장 및 혈액을 응고시킬 수 있다 (혈장 및 비-항응고된 전혈에서의 응고 분석)

일련의 시험관 내 응고 분석들을 수행하였으며, 이는 FVII-결핍 환자들로부터의 혈장 및 비-항응고된 전혈에서 지질화된 TF의 응고 효과를 나타내며, 따라서 지질화된 TF는 항출혈 처리에 유용한 제제이다.

상업적으로 FVII 고갈된 혈장 및 FVII 결핍 환자들로부터의 비-항응고된 전혈에서의 응고 분석

응고에 대한 지질화된 TF 의 효과를, 상용의 FVII 고갈된 혈장 및 FVII-결핍을 갖는 2 명의 환자들로부터의 비-항응고된 전혈을 사용하여 응고 분석에 의해 조사하였다 (표 3). 지질화된 TF는 농도-의존된 방식으로 FVII 결여 혈장에서 응고를 현저히 가속화할 수 있었다. 동일한 방식으로, FVII-결핍 환자들로부터의 비-항응고된 전혈도 저, 중 및 고 농도의 지질화된 TF의 존재 하에서 응고되었으며, 이는 FVII의 부재시에도 지질화된 TF에 의해 정상의 응고가 생성될 수 있다는 것을 나타낸다. 표 3은 고갈된 FVII 혈장들에 대한 5 개의 독립적인 실험들로부터 수득된 결과들을 나타낸다.

FVII-결핍 혈장에서 지질화된 TF의 응고전구 효과의 증명
	응고 시간 (초)
	기본	rTF 이용
		1㎍/ml	0.1㎍/ml	0.01㎍/ml
정상 혈장	215.1±24.6	11.1±0.2	15.3±0.2	25.7±0.4
FVII-결핍 혈장	>300	67.7±7.2	113.7±28.3	202.7±41.6
평균±SEM (n=5)

건강한 지원자로부터의 혈액에 대한 지질화된 TF의 영향은, 0.01㎍/ml 의 농도 이후에 현저하였던 반면, FVII-결핍 환자들에서는 보다 큰 농도들이 요구되었다 (표 4). 0.1㎍/ml 이후 현저한 응고전구 효과들이 검출되었지만, 지질화된 TF는 0.01 ㎍/ml의 농도에서 응고 시간을 정상화할 수 있었으며, 상기 기본 농도에서 정상의 대상에서 검출된 응고 시간과 지질화된 TF 농도를 갖는 FVII-결핍 대상에서 검출된 응고 시간들 간의 차이는 없었다. 최종적으로, 1㎍/ml의 지질화된 TF가 FVII 고갈된 혈장에서 동일한 강한 응고전구 효과를 유도할 수는 없었지만, 매우 현저한 효과가 관찰되었으며, 이는 지질화된 TF가 이들 환자들에서 지혈을 정상화할 수 있음을 나타내는 것이다.

건강한 개인들 및 FVII-결핍된 개인들로부터의 비-항응고된 전혈에서 지질화된 TF의 응고전구 효과
	기본	rTF
		0.01ng/ml	0.1ng/ml	1ng/ml	10ng/ml	100ng/ml
대조구 샘플 번호 1	5.8	4.7	4.4	3.3	2.1	1.3
대조구 샘플 번호 2	7.2	6.7	5.5	3.7	2.1	1.0
환자 번호 6 FVII-결핍	11.4	n.d.	10.5	9.5	5.2	2.3
환자 번호 7 FVII-결핍	12.5	n.d.	11.3	10.5	6.3	3.1
n.d.: 결정되지 않음

1.3. 지질화된 TF는 FVII 에 대한 단일클론성 항체의 존재하에서 건강한 대상들의 혈장을 응고시킬 수 있다 (응고 분석)

시험관 내 응고 분석을 수행하여, FVII에 대한 단일클론성 항체의 존재하에 건강한 대상에서 혈장 중에 지질화된 TF의 응고 영향을 나타내었다 (상기 항체는 정상 혈장에서 응고를 방해할 수 있다).

항-FVII를 이용한 저해에 의해 FVII가 고갈된 정상 혈장에서의 응고 분석

지질화된 TF의 혈장 응고에 대한 효과를, FVII에 대한 단일클론성 항체의 존재 하에 건강한 지원자들로부터의 혈장을 사용한 응고 분석에 의해 조사하였다 (표 5). 지질화된 TF는 FVII에 대한 단일클론성 항체 (이는 완전히 혈액 응고를 저해할 수 있다)의 존재시에도 응고를 일으킬 수 있었다. 이러한 실험 조건들 하에서 (FVII-결핍 샘플들과 같이), 지질화된 TF 는 혈장 응고를 생성할 수 있었다.

FVII에 대한 단일클론성 항체의 존재 하에 정상 혈장 중 TF의 응고전구 효과의 증명
	rTF 없음	rTF 1㎍/ml
정상 혈장	126.8	28.1
항 FVII를 가진 정상 혈장 (400㎍/ml)	216.8	42.5

1.4. 지질화된 TF 및 NCIS의 조합은 FVII 결핍 혈장에서 혈액 응고를 상승적으로 증가시킨다 (응고 분석)

일련의 시험관 내 응고 분석을 수행하여, FVII 결여 혈장에서 음으로 하전된 무기 표면 [NCIS]과 연합된 지질화된 TF의 응고 효과를 나타내었다. 상기 응고전구 효과는, 지질화된 TF가 응고전구제로서 단독으로 사용된 경우 수득된 경우를 능가하였다. 이들 결과들은 지질화된 TF에 의해 매개되는 효과가 FVII에 독립적이고 그의 특이적인 리간드의 부재하에서도 혈장 응고를 유도할 수 있다는 것을 보여준다. 표 6은 5 개의 독립적인 실험들에서 수득된 결과들을 보여준다.

헤파린화된 혈장 및 응고인자-결핍 혈장에서 음으로 하전된 무기 표면들과 연합된 rTF의 응고전구 효과
	응고시간 (초)
	기본	rTF
	-	1㎍/ml	1㎍/ml+NCIS
정상 혈장	211.1±18.5	18.6±0.1	13±1.2*
FVII 결핍 혈장	>300	67±11	32±3.4*
평균±SEM (n=5); * p<0.01 NCIS 부재 대 NICS 이용: t-스튜던트

1.5. 지질화된 TF 및 FXa의 조합은 FVII에 대한 단일클론성 항체 존재 하에,혈액 응고를 상승적으로 증가시킨다 (FX 결핍 혈장에서 응고 분석)

FVII 부재하에서 지질화된 TF 및 저농도 (170 pM 및 1700 pM)의 FXa의 연합의 응고 전구 효과를 항 FVII로 면역저해된 FXa 결핍 혈장에서 조사하였다 (표 7).

FVII 부재 하에 FXa 결핍 혈장과 연합된 지질화된 TF의 응고전구 효과 (항FVII로 면역저해됨)
FX 결핍 혈장	응고시간 (초)
	FXa 없음	FXa 이용 (1700pM)	FXa 이용 (170pM)
기본 (5mM 칼슘)	>400	133±18	290±10.2
+rTF 1㎍/ml	253.5±11	83.1±3.2*	124±6.1*
+rTF 1㎍/ml+항FVII (400㎍/ml)	234.5±9	78±2*	124±6.1*
평균±SEM (n=5); *p<0.01 FXa 부재 대 FXa t-스튜던트

1.6. 지질화된 TF, FXa 및 NCIS의 조합은 FVII 에 대한 단일클론성 항체 존재 하에, 혈액 응고를 상승적으로 증가시킨다 (FX 결핍 혈장에서 응고 분석)

지질화된 TF의, 저농도 FXa (170 pM 및 1700 pM) 및 NCIS의 연합에 의한 응고전구 효과들도, FXa 결핍-혈장에서 조사하였다 (표 8).

FXa 결핍 혈장에서 FXa 및 NCIS와 연합된 rTF의 응고전구 효과
FXa 결핍 혈장	응고시간 (초)
		NCIS 이용 (1㎕)	NCIS 이용 (2㎕)
기본 (5mM 칼슘)	>400	>400	290±10.2
rTF 1㎍/ml+FXa (170pM)	124±6.1*	109±4.1*	84±3*
rTF 1㎍/ml+FXa (1700pM)	83.1±3.2*	65.5±5.2*	45.5±3.2*
rTF 1㎍/ml+FXa (170pM)+항 FVII (400㎍/ml)	119±5*	101±5*	99±3*
rTF 1㎍/ml+FXa (1700pM)+항 FVII (400㎍/ml)	78±2	27.7±1.2	25±2
평균±SEM (n=5); *p<0.01 NCIS 부재 대 NCIS t-스튜던트

2. 저농도 (어떤 응고전구 효과도 유도할 수 없음)의 FXa와 지질화된 TF의 조합이 FX 결여 혈장의 응고를 일으킨다는 것을 증명하는 시험관 내 분석

2.1. 지질화된 TF 는, 이 세린 프로테아제가 저농도로 존재시, FXa 의 자극제로서 작용한다

시험관 내 응고 분석을 응고 FX 결핍 혈장에서 수행하여 지질화된 TF의 FXa 결핍 혈장에 대한 상승 효과를 보여주었다 (저농도 170 pM 및 1700 pM에서, FX 결핍 혈장에 첨가되고, 따라서 이들 혈장은 임의의 응고 경로로부터 FXa 를 생산할 수 없다). 지질화된 TF 및 저농도의 FXa의 연합의 응고전구 효과들을 표 9에 나타내었다.

FXa 결핍 혈장에서 FXa와 연합된 지질화된 TF의 응고전구 효과
FX 결핍 혈장	응고 시간 (초)
	FXa 없음	FXa (1700 pM)	FXa (170 pM)
기본 (5mM 칼슘)	>400	133±18	290±10.2
+rTF 1㎍/ml	253.5±11	83.1±3.2*	124±6.1*
평균±SEM (n=5); *p<0.01 FXa 부재 대 FXa t-스튜던트

2.2. 지질화된 TF와 FXa 및 NCIS의 조합은 FXa의 자극에 상승적으로 작용한다

지질화된 TF, 저농도의 FXa (170 pM 및 1700 pM) 및 NCIS의 연합의 응고 전구 효과를 FX 결핍 혈장에서 조사하였다 (표 10).

FXa 결핍 혈장에서 FXa 및 NCIS와 연합된 지질화된 TF의 응고전구 효과
FX 결핍 혈장	응고 시간 (초)
		NCIS (1㎕)	NCIS (2㎕)
기본 (5mM 칼슘)	>400	>400	290±10.2
+rTF 1㎍/ml+FXa(170pM)	124±6.1*	109±4.1*	84±3*
+rTF 1㎍/ml+FXa(1700pM)	83.1±3.2*	65.5±5.2*	45.5±3.2*
평균±SEM (n=5); *p<0.001 NCIS 부재 대 NCIS t-스튜던트

3. (단독 및 조합된) 지질화된 TF가, FVII 외의 다른 응고 인자들의 결핍이 있는 환자들에서 혈액 응고를 일으킨다는 것을 증명하는 시험관 내 분석

3.1. 지질화된 TF는 응고 인자들 FV, FVIII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, 및 FXIII에서의 결핍을 가진 환자들로부터의 혈장 및 혈액을 응고시킨다

응고 인자-결핍 혈장에 대한 지질화된 TF (단독)의 응고전구 효과를, 면역친화성 기술에 의해 고갈된 상용 혈장 및 혈우병 A (FVIII-결핍)로 진단된 3 명의 환자들 및 혈우병 B (FIX-결핍)로 진단된 2 명의 환자들로부터의 혈장을 이용하여 조사하였다. 표 11은 그 결과들을 나타낸다. 1 ㎍/ml 농도의 지질화된 TF는 FV, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII 및 FXIII가 결핍된 모든 혈장들을 효과적으로 응고시킬 수 있었다. 한편, 단지 고농도 및 중간 농도에서만이긴 하지만, 알려진 FXa 보조 인자인 FVa의 부재 하에, 지질화된 TF는 혈장 응고도 생성할 수 있었다. 나머지 응고 인자 결핍들에서, 지질화된 TF는 사용된 모든 농도들에서 효과적이었으며, 매우 저농도에서 뛰어난 결과들을 수득하였다. FX의 부재시에도 (1%), 지질화된 TF는 응고시킬 수 있었으나, 단지 고농도에서만 가능하였다. 이러한 모든 결과들은 혈우병 A 및 혈우병 B를 가진 환자들로부터의 샘플을 이용하여 확인하였다.

응고 인자-결핍 혈장에서 지질화된 TF의 응고전구 효과
	응고 시간 (초)
	rTF 부재	rTF
	-	1㎍/ml	0.1㎍/ml	0.01㎍/ml
정상 혈장	215.1±24.6	11.1±0.2	15.3±0.2	25.7±0.4
FV-D 혈장	>600	84.3±15.2	123.3±24.5	350±29.5
FVIII-D 혈장	>600	15.5±2.3	21.5±2.8	32.1±2.6
FIX-D 혈장	>600	14.8±3.2	22.3±2.5	34.6±2.4
FX-D 혈장	>600	446.2±32	>600	>600
FXI-D 혈장	>600	14.3±0.5	19.4±1.5	27.3±0.6
FXII-D 혈장	>600	16.2±0.3	22.5±1.1	32.5±0.5
FXIII-D 혈장	>600	14.2±0.3	21.5±1.0	30.5±0.5
혈우병 A 혈장	>600	12.2±1.5	13.8±0.6	21.3±0.8
혈우병 B 혈장	>600	12.1±0.5	15.3±0.4	26.8±0.6
평균±SEM (n=5)

혈우병 A 및 B를 겪는 사람들로부터의 인간 비-항응고된 전혈에서 지질화된 TF (단독)의 응고전구 효과를, 응고 분석에 의해 평가하였다. 응고물이 강화되는데 분 단위 시간을 평가함에 의해 응고물 형성을 결정하였다. 건강한 지원자들로부터의 혈액에서 지질화된 TF의 영향은 0.001 ㎍/ml 농도로부터 현저한 반면, 혈우병 환자들에서는 보다 큰 투여량이 요구되었으며, 0.01 ㎍/ml 부터 현저한 응고전구 효과가 (p<0.001) 검출되었다. 0.1 ㎍/ml 농도의 지질화된 TF는 응고 시간을 완전히 정상화할 수 있었으며, 정상의 대상 및 혈우병 대상들에서 검출된 응고 시간들에는 차이가 없었다. 표 12는 건강한 개인들로부터의 4 개의 샘플들 (샘플 번호 1-4), 혈우병 A를 겪는 환자들로부터의 3 개 및 혈우병 B 를 가진 환자들로부터의 2 개의 샘플들로부터 수득된 결과들을 나타낸다.

건강한 대상 및 혈우병 환자들로부터의 비-항응고된 전혈에서 지질화된 TF의 응고전구 효과
	기본	rTF
		0.001㎍/ml	0.01㎍/ml	0.1㎍/ml
샘플 대조구 번호 1	5.8	3.3	2.1	1.3
샘플 대조구 번호 2	7.2	3.7	2.1	1.0
샘플 대조구 번호 3	7.2	4.2	2.1	0.9
샘플 대조구 번호 4	7.5	3.8	2.0	1.0
환자 번호 1 혈우병 A	13.3	8.0	4.6	1.6
환자 번호 2 혈우병 A	17.3	9.0	5.6	1.0
환자 번호 3 혈우병 A	15.3	12.4	7.0	1.5
환자 번호 4 혈우병 B	20.5	11.1	6.1	1.5
환자 번호 5 혈우병 B	16.3	11.3	5.5	1.6
응고 시간 (분으로 나타냄): 응고물이 비-항응고된 혈액 샘플에서 굳어지는데 걸리는 시간

3.2. 지질화된 TF는 미리 헤파린화된 전혈 및 혈장을 응고시킨다

지질화된 TF는 혈장들 (표 13) 및 고농도 헤파린과 미리 인큐베이션된 비-항응고된 전혈 (표 14)을 응고시킬 수 있었으며, 이는 FXa에 대한 그의 효과가 항응고 약물에 의해 매개되는 저해 효과에 무관하며, 이는 헤파린형 저해제들의 존재시에도 무관함을 증명한다.

헤파린화된 혈장에 대한 지질화된 TF의 효과 (응고 시간 (초))
	지질화된 TF 없음	지질화된 TF 이용
대조구	320.4±160	17.2±1
헤파린 3 U/ml	>600	58±12

헤파린화된 전혈에 대한 지질화된 TF의 효과 (응고 시간 (초))
	지질화된 TF 없음	지질화된 TF 이용
대조구	3.96±0.54	0.4±0.28
헤파린 0.25 U/ml	12.45±0.69	15.7±0.22
헤파린 1 U/ml	26.6±5.76	4.5±2.38

3.3. 지질화된 TF는 와파린으로 처리된 동물로부터의 혈장을 응고시킨다

지질화된 TF는 방법에서 상세히 설명된 절차들을 따라 와파린 처리된 래트로부터의 혈장을 응고시킬 수 있었다. 그 결과를 표 15에 나타내었으며, 이는 모든 비타민 K-의존성 응고 인자들의 합성이 제거된 경우에도 지질화된 TF가 응고시킬 수 있었음을 나타내며, 이는 FXa에 대한 그의 효과가 항응고 약물에 의해 매개되는 저해 효과에 무관하다는 것을 증명한다.

와파린처리된 동물로부터의 혈장에 대한 지질화된 TF의 효과 (응고 시간(초))
	지질화된 TF 없음	지질화된 TF 이용(1㎍/ml)
대조구	49±10.2	10.9±2.2
와파린처리된 혈장 (3일동안 0.1mg/kg)	60.1±5.6	12.8±3.2

3.4. 지질화된 TF와 NCIS의 조합은 응고 인자 FV, FVIII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, 및 FXIII의 결핍이 있는 환자들로부터의 혈장 (응고 인자 결핍 혈장에서의 응고 분석) 및 혈우병 환자로부터의 전혈에서 혈액 응고를 상승적으로 개선한다.

일련의 시험관 내 응고 분석을 수행하여 응고인자-결핍 환자들 (FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, 및 FXIII)로부터의 혈장 중에서 NCIS와 연합된 지질화된 TF의 응고 효과를 나타내었다. 상기 응고전구 효과는, 지질화된 TF가 응고전구제로서 단독으로 사용된 경우 수득된 효과 이상이었다. 지질화된 TF가 FV-결핍 혈장 (FV-D 혈장)을 응고시킬 수 없는 저농도에서도 (1 ㎍/ml), 두 제제 모두의 조합은 현저한 응고전구 효과를 생성하였다. 이와 유사하게, 유사한 상승작용 효과가, FVII-결핍 혈장 (FVII-D 혈장)이 사용된 경우 수득되었다. 이들 결과들은, 지질화된 TF에 의해 매개된 효과가 FVII에 독립적이고 FV 부재하에서도 혈장 응고를 유도할 수 있다는 것을 보여준다. 유사하게, 조합물도 (지질화된 TF + NCIS) 혈우병 환자들 (A 및 B)로부터의 혈장 샘플들에서 효능있는 응고전구 효과들을 발휘하였다. 표 16은 5 개의 독립적인 실험들에서 수득된 결과들을 나타낸다.

응고인자 결핍 혈장에서 NCIS와 관련된 rTF의 응고전구 효과
	응고 시간 (초)
	rTF 없음	rTF 이용
	-	1 ㎍/ml	1 ㎍/ml+NCIS
정상 혈장	281.1±12.6	11.1±0.2	9.1±0.4*
FV-D 혈장	>600	84.3±15.2	55.2±2.3*
FVIII-D 혈장	>600	15.5±2.3	10.1±0.5*
FIX-D 혈장	>600	14.8±3.2	10.3±0.2*
FX-D 혈장	>600	446.2±32	253.5±19*
FXI-D 혈장	>600	14.3±0.5	11.5±0.6*
FXII-D 혈장	>600	16.2±0.3	12.9±1.5*
FXIII-D 혈장	>600	14.2±0.3	10.8±0.9*
혈우병 A 혈장	>600	12.2±1.5	10.4±0.9*
혈우병 B 혈장	>600	12.1±0.5	10.1±0.8*
평균±SEM (n=5); *p<0.001 NCIS 부재 대 NCIS t-스튜던트

지질화된 TF 및 NCIS 조합의 비-항응고된 전혈에서의 응고전구 효과도, 혈우병 A (3 명의 환자들) 및 B (2 명의 환자들)를 겪는 환자들로부터의 혈액을 사용하는 응고 분석에 의해 연구되었다. 지질화된 TF가 단독인 분석과 비교시 (표 12), 연합 (rTF + NCIS)의 응고전구 효과는 현저히 (p<0.001) 커졌다 (표 17).

전혈에서 NCIS와 함께 사용된 rTF의 응고전구 효과
	NCIS 없음	NCIS 이용
샘플 대조구	7.1±0.6	6.0±1.4*
rTF 0.1㎍/ml	1.1±0.9	0.5±0.1*
	기본	rTF 0.1㎍/ml+NCIS
환자 번호 1 혈우병 A	13.3	6.8*
환자 번호 2 혈우병 A	17.3	7.2*
환자 번호 3 혈우병 A	15.3	9.1*
환자 번호 4 혈우병 B	20.5	8.5*
환자 번호 5 혈우병 B	16.3	8.6*
응고 시간 (분으로 나타냄): 응고물이 비-항응고된 혈액 샘플에서 굳어지는데 걸리는 시간

4. (단독 또는 조합된) 지질화된 TF가 건강한 대상에서 혈액 응고를 일으킨다는 것을 증명하는 시험관 내 분석

4.1. 지질화된 TF는 건강한 대상으로부터의 혈장 및 혈액을 응고시킨다

일련의 시험관 내 응고 분석들을 수행하였으며, 이는 지혈 장애의 이력이 없는 건강한 지원자들로부터의 혈장 및 비-항응고된 전혈에서 지질화된 TF의 응고 효과를 나타낸다. 표 18은 건강한 혈장에서 5 개의 독립적인 실험들로부터 수득된 결과들을 보여주고, 표 19에서는 비-항응고된 전혈에서의 실험 결과들을 보여준다.

건강한 대상으로부터의 혈장에서 지질화된 TF 의 응고전구 효과
정상 혈장	응고 시간 (초)
기본	281.08±12.5
rTF 0.0001 ㎍/ml	201±12.2
rTF 0.0001 ㎍/ml	184±5.8
rTF 0.01 ㎍/ml	73.5±2.3
rTF 0.1 ㎍/ml	28.6±0.1
rTF 1 ㎍/ml	16.4±0.9
평균±SEM (n=5) 동일 농도의 비-지질화된 TF는 응고 시간을 변경할 수 없었음

건강한 대상으로부터 비-항응고화된 혈액에서의 TF의 응고전구 효과
	기본	rTF
		0.01㎍/ml	0.1㎍/ml	1㎍/ml
샘플번호 1	5.8	3.3	2.1	1.3
샘플번호 2	7.2	3.7	2.1	1.0
샘플번호 3	7.2	4.2	2.1	0.9
샘플번호 4	7.5	3.8	2.0	1.0

4.2. 지질화된 TF와 NCIS의 조합은 건강한 대상으로부터의 혈장 및 혈액에서 혈액 응고를 상승적으로 개선한다. 지질화된 TF가 인지질과 연합될 때 상승 효과는 부재임.

일련의 시험관 내 응고 분석들을 수행하였으며, 건강한 지원자들로부터의 혈장에서 NCIS와 연합된 rTF의 응고 효과를 나타내었다. 표 20은 5 개의 독립적인 실험들로부터 수득된 결과들을 나타낸다. rTF가 단독인 분석과 비교시, 연합물 (rTF + NCIS) 의 응고전구 효과는 사용된 농도 각각 모두에서 현저히 (p<0.001) 더 컸다.

정상 혈장에서 NCIS와 연합된 지질화된 TF의 응고전구 효과
정상 혈장	응고 시간 (초)
	NCIS 없음	NCIS 이용
기본	281.08±12.5	167±10*
rTF 0.0001 ㎍/ml	201±12.2	69±0.8*
rTF 0.001 ㎍/ml	184±5.8	44.9±3.2*
rTF 0.01 ㎍/ml	73.5±2.3	30.6±2.5*
rTF 0.1 ㎍/ml	28.6±0.1	16±4.2*
rTF 1 ㎍/ml	16.4±0.9	12.8±0.5*
평균±SEM (n=5); *p<0.001 NCIS 부재 대 NCIS: t-스튜던트

표 21은, 지질화된 TF가 인지질과 연합될 때, 상승 효과가 부재함을 보여준다. (0.66 mM의 PC/PS; 상이한 몰 비의 포스파티딜콜린/포스파티딜세린).

지질화된 TF 응고전구 작용에 대한 인지질의 효과
지질화된 TF (0.1 ㎍/ml)	응고 시간 (초)
PC/PS 없음	37.9
PC/PS 이용 90/10	44
80/20	39.7
70/30	41.7
60/40	40.1
50/50	43.5
40/60	34.6
30/70	41.5
20/80	44.3
10/90	41.9

5. 선천성 및 후천성 (혈소판감소성 자반증) 혈소판 장애들을 갖는 환자들로부터의 혈액에서 (단독 및 조합된) 지질화된 TF 의 응고 효과를 증명하는 시험관 내 분석.

5.1. 지질화된 TF는 선천성 혈소판 장애들을 갖는 환자들로부터의 전혈을 응고시킨다.

혈소판 장애들을 갖는 환자들에서 혈액 응고에 대한 지질화된 TF의 응고전구 효과를, 글란쯔만병 및 버나드 쏠리에 증후군을 겪고 있는 2 명의 환자들로부터의 혈액을 사용하여 응고 분석에 의해 조사하였다. rTF는 농도 의존적 방식으로 글란쯔만병 및 버나드 쏠리에 증후군을 겪고 있는 개인들에서 혈액 응고를 매우 현저히 가속화할 수 있었다 (표 22); 따라서 rTF 는 상기 개인들의 항출혈 치료에 대해 유용한 제제이다.

혈소판 장애들을 갖는 환자에서 TF의 응고전구 효과
	기본	rTF
		0.01㎍/ml	0.1㎍/ml	1㎍/ml
샘플 대조구 번호 1	5.8	3.3	2.1	1.3
환자 번호 6. 글란쯔만 병	13.6	7.3	3.4	2.9
환자 번호 7. 버나드-쏠리에 병	11.9	7.1	4.1	3.1

5.2. 지질화된 TF와 NCIS의 조합은 선천성 혈소판 장애들을 갖는 환자들로부터의 전혈에서 응고를 증가시킨다

일련의 시험관 내 응고 분석을 수행하여, 선천성 혈소판 장애들을 갖는 환자들로부터의 전혈에서 NCIS와 연합된 rTF의 응고 효과를 나타내었다. 표 23은 글란쯔만병 및 버나드-쏠리에 증후군을 갖는 2 명의 환자들로부터 수득된 결과들을 보여준다. rTF가 단독인 분석과 비교시, 연합 (rTF + NCIS)의 응고전구 효과는 각 환자에서 현저히 (p<0.001) 커졌다.

전혈에서 NCIS를 함께 이용한 rTF의 응고 전구 효과
	NCIS 없음	NCIS
샘플 대조구	7.1±0.6	6.0±1.4*
rTF 0.1㎍/ml	1.1±0.9	0.5±0.1*
	기본	rTF 0.1㎍/ml+NCIS
환자 번호 6. 글란쯔만병	13.6	4.7*
환자 번호 7. 버나드-쏠리에	11.9	4.6*
응고 시간 (분으로 표시됨): 응고물이 비-항응고된 혈액 샘플에서 굳어지는데 걸리는 시간. *p<0.01 NCIS 부재 대 NCIS. t-스튜던트

5.3. 지질화된 TF는 혈소판감소성 자반증 샘플들을 응고시킨다

일련의 시험관 내 응고 분석들을 수행하여, 상이한 혈소판 수를 갖는 혈장에서 지질화된 TF의 응고 효과를 나타내었다. 표 24는 혈소판감소성 자반증 증상들에 대한 정상의 혈소판 수로부터 수득된 결과들을 보여준다.

혈소판감소성 자반증 샘플에 대한 지질화된 TF 의 효과
혈소판 수	지질화된 TF 없음	지질화된 TF 이용 (1㎍/ml)
350,000/㎕	226.3	21.9
150,000/㎕	232.6	22.8
50,000/㎕	253.9	22.4
9,000/㎕	321.2	21.3
<1,000/㎕	>400	21.3

6. TF가 대조구 래트들에서 국소 항출혈 치료에 유용한 약제라는 것을 증명하는 생체 내 분석 (미리 절단된 혈관에 직접 적용함에 의해)

6.1. 지질화된 TF는 래트 꼬리의 근위 절단에 의한 심한 출혈 동물 모델에서 국소 지혈제로서 유용하다

생체 내 분석을 수행하여, 단독 또는 NCIS와 연합되어 투여된 지질화된 TF가 국소 항출혈치료에 대해 유용한 제제라는 것을 보여주었다. 단독 또는 조합된 NCIS과 투여된 국소 지혈제로서의 지질화된 TF의 용도를 래트 꼬리의 근위 절단에 의한 동물 모델에서의 심한 출혈의 이용에 의해 평가하였다. 수득된 결과들을 표 25에 나타내었다. 알 수 있는 바와 같이, 상기 심한 출혈 모델에서, 출혈은 대조구 동물에서 (PSS 대조구, 생리학적 식염수로 처리됨) 18.1±5.98 분에 자발적으로 응고되었다; 그러나, 지질화된 rTF의 국소 치료 (단독)는 현저한 감소를 나타내었다 (11.1±5.54 분, p<0.001). rTF를 NCIS와 조합하여 투여시, 응고전구 효과는 더욱 커졌다 (5.0±1.1 분; p<0.001).

래트 꼬리의 근위 절단에 의한 심한 출혈 모델
	출혈 응고 시간
대조구 염수군 (n=14)	18.16±5.98
지질화된 TF 처리군 (n=5)	11.1±5.5
지질화된 TF+NCIS (n=4)	5.0±1.1
결과들은 강화된 응고에 도달하기까지의 시간을 분으로 나타내었다

동일한 실험 조건 하에서, 비-지질화된 TF (n=3)를 평가하였다. 어떤 효과도 관찰되지 않았으며, 혈액 응고 시간은 대조구 동물들에서와 유사하였다. 이들 결과들은 비-지질화된 TF가 출혈 증상 발현을 국소적으로 처리하는데 유용하지 않음을 나타내었다.

6.2 지질화된 TF는, 헤파린 또는 와파린으로 미리 처리된 심한 출혈 동물 모델에서 국소 지혈제로서 유용하다

생체 내 분석을 수행하여, 단독으로 투여된 지질화된 TF 가 항응고 조건에서 국소 항출혈 처리에 유용한 제제임을 보여주었다 (표 25). 단독으로 투여된 국소 지혈제로서의 지질화된 TF의 용도를, 꼬리 횡단절단 절차를 시작하기 전 15분에 i.v.로 헤파린 200 U/Kg으로, 또는 꼬리 횡단절단 절차를 시작하기 전 3일 동안 경구적으로 0.1 mg/kg/일의 와파린으로, 미리 처리된 래트 꼬리의 근위 절단에 의한 동물 모델에서 심한 출혈의 이용에 의해 평가하였다. 수득된 결과들을 표 26에 나타내었다. 알 수 있는 바와 같이, 상기 심한 출혈 모델에서, 생리학적 식염수로 처리된 대조 염수군은 18.1±5.98 분에 자발적으로 응고되었다. 대조구 헤파린-처리된 군 출혈은 자발적으로 응고되지 않았다 (> 90 분). 대조구 와파린-처리된 군은 41,6±8.5 분에 자발적으로 응고되었다. 표 26은 지질화된 TF (단독)의 국소 투여가 모든 처리군에서 현저한 감소를 생성한다는 것을 보여준다.

항응고 치료된 동물에서 래트 꼬리의 근위 절단에 의한 심한 출혈 모델. 출혈 응고 시간
	혈액 응고 시간 (분)
대조 염수군 (n=14)	18.16±5.98
대조 헤파린-처리군 (n=5)	>90
대조 와파린-처리군 (n=2)	41.6±8.5
헤파린-처리군(n=3)+지질화된 TF	26.3±2.5
와파린-처리군 (n=3)+지질화된 TF	4.5±2.5
결과들은 강화된 응고에 도달하기까지의 시간을 분으로 나타내었다

6.3. 지질화된 TF는 경동맥에서의 천자에 의한 치명적 출혈 동물 모델에서 국소 지혈제로서 유용하다

생체 내 분석들을 수행하여, 단독으로 투여된 rTF가 혈관 상에 직접 적용된 국소 항출혈 치료를 위한 유용한 제제라는 것을 보여주었다. 단독으로 투여된 rTF의 용도를, 경동맥 천자에 의한 동물 모델에서의 치사 출혈의 이용에 의해 평가하였다. 수득된 결과들을 표 27에 나타내었으며, 이는 매우 현저하였다. 알 수 있는 바와 같이, 대조구 동물들의 군에서 (PSS 대조구, 생리학적 식염수로 처리됨), 모든 동물들은 출혈로 인해 사망한 반면, 지질화된 TF의 군에서는 어떤 동물도 사망하지 않았으며, 그 절단은 모든 경우들에서 성공적으로 밀봉 및 응고될 수 있었다. 상기 처리는, 천자 상처의 안정한 응고 및 밀봉을 달성하는데 필요한 시간 면에서 효과적이었다.

래트의 경동맥에서의 천자에 의한 치명적 출혈 모델
	대조구 SF	rTF
동물 번호 1	사망	동물 번호 3	125
동물 번호 2	사망	동물 번호 4	135
평균±SEM 130±7.1
결과들은 강화된 응고 및 천자가 막히는데 도달하기까지의 시간을 초로 나타내었다. 본문 중 나타낸 것과 같이 rTF는 2㎍의 활성 단백질 투여량으로 투여하였다

결론:

실시예 1로부터의 결과는 다음을 명백히 증명한다:

1) 그의 리간드인 FVII 부재하에서, 지질화된 TF는 FXa와 직접적으로 상호작용하여, 그의 단백분해 활성(아미드분해성 및 트롬빈 형성 모두)을 현저히 증가시킬 수 있으며, 이러한 결과는 지질화된 TF가 FXa에 대한 신규 보조인자로서 작용하는, 새로운 역할을 최초로 보여준다 (공지된 FVa에 무관).

2) 지질화된 TF는 FVII 결여 혈장을 응고시킬 수 있다. 따라서, 지질화된 TF는 이러한 환자들의 치료에 대한 양호한 대체물이다 (현재 특수한 치료는 비용이 높은 인간 재조합 FVIIa이다).

3) 지질화된 TF는 NCIS 및 FXa와 상승적으로 작용한다 (응고를 일으킬 수 없는 저농도에서).

실시예 2로부터의 결과들은 다음을 명백히 증명한다:

1) 지질화된 TF는, 어떤 현저한 응고전구 효과를 낼 수 없는 생리학적 FXa 농도가 프로트롬빈 가수분해를 촉발하고 그 결과 트롬빈 형성이 일어나도록 한다.

2) 지질화된 TF 는 모든 형태의 FXa의 모든 단백분해 활성에 대한 보조 인자로서 작용하는 신규 역할을 갖는다 (가용성이고 프로트롬비나아제 복합체에 결합).

3) FX 결여 혈장이라도 (미량의 FX 함유) 지질화된 TF에 의해 응고될 수 있다. 따라서, 지질화된 TF 는 이들 환자들의 치료에 양호한 대체물이다.

4) 지질화된 TF는 FXa 활성의 자극 효과에 있어서 NCIS와 상승적으로 작용한다.

실시예 3으로부터의 결과들은 다음을 명백히 증명한다:

1) 지질화된 TF는 혈우병 환자들 (FVIII, FIX 및 FXI)에서 혈액 응고를 일으킬 수 있다. 따라서, 지질화된 TF는 이들 환자들의 치료에 대한 양호한 대체물이다.

2) 지질화된 TF 는 FV의 부재시에도 혈액 응고를 일으킬 수 있다. 이들 결과들은 지질화된 TF 가 FXa 에 대한 강한 자극 효과를 일으킨다는 것을 명백히 나타내며, 이는 그의 보조인자의 부재 하에 (FV 결핍 혈장)서, 지질화된 TF가 동일한 자극 효과를 일으키는 보조인자로서 작용하기 때문이다.

3) 지질화된 TF 는 FX 결여 혈장에서도 혈액 응고를 일으킬 수 있다 (미량의 FX 함유). 따라서, 지질화된 TF는 이러한 환자들의 치료에 대한 대체물이다.

4) 지질화된 TF 는 헤파린 및 와파린 처리된 혈장에서 혈액 응고를 일으킬 수 있으며, 이는 지질화된 TF가, 항트롬빈 III의 효과를 방해하고 아마도 FXa 기본 농도에 대한 그의 자극 효과를 통하여, 심지어는 와파린 처리된 조건에서도 응고시킬 수 있음을 나타낸다.

5) 최종적으로, 지질화된 TF 는, 모든 응고 인자 결핍들에서 관찰된 응고전구 효과에서, NCIS와 상승적으로 작용한다.

실시예 4로부터의 결과들은 다음을 명백히 증명한다:

1) 지질화된 TF는 건강한 대상에서 혈액 응고를 일으킬 수 있다. 따라서, 지질화된 TF는 건강한 대상에서 출혈 증상 발현의 치료에 대한 양호한 대체이다.

2) 지질화된 TF는, 건강한 대상에서 관찰된 응고전구 효과에 있어서, NCIS와 상승적으로 작용하지만, 단지 인지질만으로는 작용하지 않는다.

실시예 5로부터의 결과들은 다음을 명백히 증명한다:

1) 지질화된 TF는 선천성 및 후천성 혈소판 장애들(i.e. 혈소판 감소증)을 가진 환자들에서 혈액 응고를 일으킬 수 있다. 따라서, 지질화된 TF는 혈소판 수 및/또는 기능성의 변경을 갖는 환자들에서 출혈 증상 발현의 치료에 대한 양호한 대체물이다.

실시예 6로부터의 결과들은 다음을 명백히 증명한다:

1) 국소적으로 투여된 지질화된 TF 는 심한 출혈의 동물 모델에서 출혈을 멈출 수 있다 (근위 전체 꼬리 가로절단).

2) 항응고제 (헤파린 또는 와파린) 치료로 악화된 국소적으로 투여된 지질화된 TF 는 심한 출혈의 동물 모델에서 출혈을 멈출 수 있다 (근위 전체 꼬리 가로 절단).

3) 국소적으로 투여된 지질화된 TF 는 치사 출혈의 동물 모델에서 출혈을 멈출수 있다 (경동맥에서의 경동맥 천자).

Claims (46)

1. 지질화된 조직 인자 (TF), 또는 그의 기능성 절편의, 어떤 대상에서의 출혈의 국소 치료용 약제 제조에의 용도.
2. 제 1 항에 있어서, 대상이 건강한 대상 또는 출혈성 특이 체질을 가진 대상으로, 상기 출혈성 특이 체질이 응고장애 (coagulopathy) 및/또는 혈소판 장애를 포함하는 용도.
3. 제 2 항에 있어서, 응고장애가 선천성 응고장애 또는 후천성 응고장애인 용도.
4. 제 3 항에 있어서, 선천성 응고장애가 응고 인자 V, 응고 인자 VII, 응고 인자 VIII, 응고 인자 IX, 응고 인자 X, 인자 XI, 응고 인자 XII, 응고 인자 XIII 및 그의 조합으로부터 선택된 응고 인자의 결핍에 근거한 응고장애인 용도.
5. 제 4 항에 있어서, 선천성 응고장애가 응고 인자 V로부터 선택된 응고 인자의 결핍에 근거한 응고장애인 용도.
6. 제 4 항에 있어서, 선천성 응고장애가 응고 인자 VII로부터 선택된 응고 인 자의 결핍에 근거한 응고장애인 용도.
7. 제 4 항에 있어서, 선천성 응고장애가 응고 인자 X로부터 선택된 응고 인자의 결핍에 근거한 응고장애인 용도.
8. 제 2 항에 있어서, 대상이 항응고제를 이용한 항응고 치료에 의해 생성된 후천성 응고장애를 갖는 용도.
9. 제 8 항에 있어서, 항응고제가 헤파린, 저분자량 헤파린, 와파린 (warfarin), 쿠마린 (coumarin) 유도체 또는 디쿠마린 (dicoumarin)인 용도.
10. 제 2 항에 있어서, 대상이 선천성 또는 후천성 혈소판 장애를 갖는 용도.
11. 제 10 항에 있어서, 선천성 혈소판 장애가 글란쯔만병 (Glanzmann's disease), 버나드 쏠리에 (Bernard Soulier) 증후군, 볼린-제이미슨 (Bolin-Jamieson) 증후군, 위스코트-알드리치 (Wiskott-Aldrich) 증후군, 패리스-트루소-자콥슨 (Paris-Trousseau-Jacobsen) 증후군, X 염색체의 혈소판 감소증, 그래이 (Gray) 혈소판 증후군, 세바스티안 (Sebastian) 증후군, 판코니 (Fanconi) 빈혈로부터 선택된 용도.
12. 제 10 항에 있어서, 후천성 혈소판 장애가 골수증식 (myeloproliferative) 질환, 예컨대 고혈소판증, 적혈구 증가증, 또는 만성 골수성 백혈병; 골수 화생 (myeloid metaplasia); 괴혈병, 선천성 심장병 및 간경변에서 이상단백질혈증 (dysproteinemias)으로부터 선택된 용도.
13. 제 1 항에 있어서, 지질화된 TF가 지질화된 인간 TF인 용도.
14. (i) 지질화된 TF 및 (ii) 활성화된 응고 인자 X (FXa)를 포함하는 제품 (product).
15. (i) 지질화된 TF 및 (ii) 활성화된 FXa를 개별적으로 포함하는 제품.
16. (i) 지질화된 TF 및 (ii) FXa를, 대상에 이들의 동시 또는 연속적인 투여를 위한 조합물로서, 개별적으로 포함하는 제품.
17. (i) 지질화된 TF 및 (ii) 음으로 하전된 무기 표면 (NCIS)을 포함하는 제품.
18. (i) 지질화된 TF 및 (ii) NCIS를 개별적으로 포함하는 제품.
19. (i) 지질화된 TF 및 (ii) NCIS를, 대상에 이들의 동시 또는 연속적인 투여를 위한 조합물로서, 개별적으로 포함하는 제품.
20. (i) 지질화된 TF, (ii) FXa 및 (iii) NCIS를 포함하는 제품.
21. (i) 지질화된 TF, (ii) FXa 및 (iii) NCIS를 개별적으로 포함하는 제품.
22. (i) 지질화된 TF, (ii) FXa 및 (iii) NCIS를, 대상에 이들의 동시 또는 연속적인 투여를 위한 조합물로서, 개별적으로 포함하는 제품.
23. 제 14 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 지질화된 TF 가 지질화된 인간 TF인 제품.
24. 제 14 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서의 제품.
25. 제 14 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 제품의, 어떤 대상에서 출혈의 치료를 위한 의약의 제조에서의 용도.
26. 제 14 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 제품의, 어떤 대상에서 출혈의 국소 치료를 위한 의약 제조에서의 용도.
27. 지질화된 TF 및 FXa를 포함하는 복합체 (TF::FXa).
28. 제 27 항에 있어서, 의약으로서의 복합체.
29. 제 27 항에 따른 복합체의, 어떤 대상에서 출혈의 치료를 위한 의약의 제조에서의 용도.
30. 제 27 항에 따른 복합체의, 어떤 대상에서 출혈의 국소 치료를 위한 의약의 제조에서의 용도.
31. 지질화된 TF 및 NCIS를 포함하는 TF::NCIS 복합체.
32. 제 30 항에 있어서, 의약으로서의 복합체.
33. 제 31 항에 따른 복합체의, 어떤 대상에서 출혈의 치료를 위한 의약의 제조에서의 용도.
34. 제 31 항에 따른 복합체의, 어떤 대상에서 출혈의 국소 치료를 위한 의약의 제조에서의 용도.
35. 지질화된 TF, FXa 및 NCIS를 포함하는 TF::FXa::NCIS 복합체.
36. 제 35 항에 있어서, 의약으로서의 복합체.
37. 제 35 항에 따른 복합체의, 어떤 대상에서 출혈의 치료를 위한 의약의 제조에서의 용도.
38. 제 35 항에 따른 복합체의, 어떤 대상에서 출혈의 국소 치료를 위한 의약의 제조에서의 용도.
39. 지질화된 TF를, 약학적으로 허용가능한 비히클 (vehicle)과 함께 포함하는 약학 조성물.
40. 지질화된 TF 및 상기 지질화된 TF의 국소 투여에 적합한 약학적으로 허용가능한 비히클을 포함하는, 지질화된 TF의 국소 투여용 약학 조성물.
41. 하기를 포함하는 약학 조성물:

    a) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 제 14 항에 따른 제품; 또는

    b) 개별적으로, (i) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 지질화된 TF 및 (ii) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, FXa; 또는

    c) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 제 17 항에 따른 제품; 또는

    d) 개별적으로, (i) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 지질화된 TF 및(ii) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, NCIS; 또는

    e) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 제 20 항에 따른 제품; 또는

    f) 개별적으로, (i) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 지질화된 TF, (ii) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, FXa 및 (iii) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, NCIS; 또는

    g) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 제 27 항에 따른 TF::FXa 복합체; 또는

    h) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 제 31 항에 따른 TF::NCIS 복합체; 또는

    i) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 제 35 항에 따른 TF::FXa::NCIS 복합체.
42. 제 41 항에 있어서, 그의 국소 투여를 위한 약학 투여 형태의 약학 조성물.
43. 제 39 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물, 및 지지체를 포함하는 제품.
44. 하기를 포함하는 약학 조성물을 포함하는 제품:

    (i) 지지체, (ii) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 제 14 항에 따른 제품, (iii) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 제 17 항에 따른 제품 및 (iv) 약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 제 20 항에 따른 제품; 또는

    약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 제 27 항에 따른 TF::FXa 복합체, 또는

    약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 제 30 항에 따른 TF::NCIS 복합체, 또는

    약학적으로 허용가능한 비히클을 함께 갖는, 제 34 항에 따른 TF::FXa::NCIS 복합체.
45. 비-지질화된 TF, 또는 그의 기능성 단편의, 응고 인자 VII-결핍 대상에서 출혈 치료를 위한 약제 제조에의 용도.
46. 제 45 항에 있어서, 비-지질화된 TF 또는 그의 절편의 비경구 투여용 약제 제조에의 용도.

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