JP2002520053A - 凝固因子ｆｖｉｉ／ｆｖｉｉａに対する向上した親和性を持つ組織因子タンパク質変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、組織因子タンパク質のアミノ酸配列変異体を提供する。この組織因子タンパク質変異体は、野生型の対応物より大きな因子ＶＩＩ／ＶＩＩａに対する親和性を有する。また本発明は、新規な組成を含む医薬品組成物、並びにそれらの診断、治療、及び予防方法における使用も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、組織因子タンパク質のアミノ酸配列変異体を含んでなる新規な組成
物に関する。この組織因子タンパク質変異体は、それらに対応する哺乳動物組織
因子タンパク質より大きな、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに対する親和性を有する。ま
た本発明は、この新規な組成物を含有してなる医薬品組成物、並びにそれらの診
断、治療、及び予防方法における使用にも関する。

【０００２】 （関連する開示の説明） 組織因子（ＴＦ）は、凝固因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）及びチモーゲン前駆体
因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）のレセプターである。ＴＦは２６３アミノ酸残基の糖タ
ンパク質であって２１９残基の細胞外ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および
短い細胞質ドメインからなる（Fisher等, (1987) Thromb. Res. 48: 89-99）。
ＴＦの細胞外ドメインは各々が約１０５アミノ酸の２つの免疫グロブリン様フィ
ブロネクチンＩＩＩ型ドメインからなる。各ドメインは、Ｉｇスーパーファミリ
ーＣ２型相同性を持つ２つの反平行のβ−シートから形成される。ＦＶＩＩａと
ＴＦとのタンパク質相互作用は、全体的にＴＦ細胞外ドメインに媒介され（Mull
er等, (1994) Biochem. 33: 10864-10870; Gibbs等, (1994) Biochem. 33: 1400
3-14010; Ruf等, (1994) Biochem. 33: 1565-1572）、それは大腸菌、培養され
たチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びサッカロミセスセレビシアエ
において発現されている（Waxman等, (1992) Biochemistry 31: 3998-4003; Ruf
等, (1991) J. Bio. Chem. 266: 2158-2166及びShigamatsue等, (1992) J. Biol
. Chem. 267: 21329-21337）。ＦＶＩＩａを阻害する活性部位を持つヒトＴＦ（
ｈＴＦ）細胞外ドメイン及びその複合体の構造が、最近ｘ-線クロマトグラフィ
ーによって決定された（Harlos等, (1994) Nature 370: 662-666; Muller等, (1
994) Biochemistry 33: 10864; Banner等, (1996) Nature 380: 41-46）。

【０００３】 ｈＴＦの細胞外ドメインはアラニンスキャンニング突然変異誘発によって広範
に特徴付けられている（Kelley等, (1995) Biochemistry、34: 10383-10392; Gob
bs等, (1994), 上掲; Ruf等, (1994), 上掲）。アミノ酸番号１６〜２６および
１２９〜１４７の領域にある残基はＦＶＩＩａとの結合並びにこの分子の凝血原
機能に寄与している。Ｌｙｓ２０、Ｔｒｐ４５、Ａｓｐ５８、Ｔｙｒ９４、及び
Ｐｈｅ１４０の各残基はＦＶＩＩａとの結合のための自由エネルギー（ΔＧ）に
大きく寄与（１kcal/mol）をしている（Kelley等, 上掲）。Ｌｙｓ２０及びＡｓ
ｐ５８のアラニン残基での置換は、ＦＶＩＩａ親和性において各々７８-及び３
０-倍の低下を導く（Kelley等, 上掲）。ＦＶＩＩａに接触する他の近傍部位で
の１７の単一部位変異体の組は、親和性において小幅な低下（ΔΔＧ＝０．３−
１．０kcal mol^−１）をもたらした。各々が結晶構造においてＦＶＩＩａに接触
しているＴＦ残基Ｔｈｒ１７、Ａｒｇ１３１、Ｌｅｕ１３３及びＶａｌ２０７の
変異は、ＦＶＩＩａへの親和性に影響しない。Ｌｙｓ１５Ａｌａ及びＴｙｒ１８
５Ａｌａの変異は、親和性の小さな向上（ΔΔＧ＝−０．４kcal mol^−１）をも
たらす（Kelley等, (1995) 上掲）。ｈＴＦにおけるＬｙｓ２０のアラニン置換
によって課される親和性の７８倍の低下は、Ａｓｐ５８のトリプトファン置換に
よって逆転する（Lee及びKelley, (1998) J. Biol. Chem. 273: 4149-4154）。

【０００４】 アミノ酸番号１５７〜１６８の領域にある残基はＴＦ−ＦＶＩＩａの凝結促進
機能に寄与するが（Kelley等, (1995) 上掲；Ruf等, (1992) J. Biol. Chem., 2
67: 22206-22210）、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ結合にとって重要ではない。リジン
残基１６５及び１６６がＴＦ補因子機能に重要なことが示されているが、ＦＶＩ
Ｉａ複合体の形成には関与していない（Roy等, (1991) J. Biol. Chem., 266: 2
2063; Ruf等, (1992), J. Biol. Chem., 267: 6375）。リジン残基１６５及び１
６６は、ＴＦのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインのＣ末端に位置し、突然変異
誘発に基づいてＦＶＩＩａ結合に重要であることが判明している残基とは反対側
の分子表面にある（Kelley等, (1995) 上掲）。これらのリジン残基をアラニン
で置換すると、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体によって触媒されるＦＸ活性化速度の低
下をもたらす（Ruf等, (1992) 上掲）。ｈＴＦ（ｓＴＦ）の残基１−２１９を含
むＬｙｓ１６５Ａｌａ−Ｌｙｓ１６６Ａｌａ変異体（ｈＴＦＡＡ）は、ＦＶＩＩ
ａへの結合について膜ＴＦとの競合を通してインビトロでの血液凝固の外部経路
を阻害する。動脈血栓症のウサギモデルにおいて、この変異体は、出血傾向を増
加させることなく血栓形成を部分的に阻止する（Blood 89, 3219-3227）。しか
しながら、抗血栓効果には、この変異体の高用量が必要とされ、これは一部には
、ＦＶＩＩａがｓＴＦよりも約１０００倍緊密に細胞表面Ｔｆに結合するからで
ある（Kelley等, (1997) 上掲）。より大きな見かけの親和性は、ＦＶＩＩａγ-
カルボキシグルタミン酸含有（Ｇｌａ）ドメインとリン脂質との相互作用による
。

【０００５】 ＴＦは血管内皮によって血漿から分離された細胞上に構成的に発現される（Ca
rson,S.D.及びJ.P.Brozna、(1993), Blood Coag. Fibrinol., 4: 281-292）。内
皮細胞及び単球上におけるその発現は、炎症性サイトカインまたは細菌性リポ多
糖との接触によって誘発される（Drake等, (1989) J. Cell Biol., 109: 389）
。組織が損傷を受けると、露出したＴＦの細胞外ドメインは、ＦＶＩＩと親和性
の高いカルシウム依存性複合体を形成する。一旦ＴＦと結合すると、ＦＶＩＩは
ぺプチド結合切断によって活性化されてセリンプロテアーゼＦＶＩＩａを与え得
る。この段階をインビボで触媒する酵素はまだ確認されていないが、インビトロ
ではＦＸａ、トロンビン、ＴＦ−ＦＶＩＩａ、及びＦＩＸａがこの切断を触媒で
きる（Davie等, (1991) 30: 10363-10370）。ＦＶＩＩａはその生理学的基質で
あるＦＸ及びＦＩＸに弱い活性しか示さないが、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体はＦＸ
およびＦＩＸを迅速に活性化する。

【０００６】 ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体は、外因性血液凝固経路の第一次的な開始剤を構成す
る（Carson, S.D.及びJ.P. Brozna, (1993) Blood Coag. Fibrinol., 4: 281-29
2; Davie, E.W.等 (1991) Biochemistry, 30: 10363-10370; Rapaport, S.I.及
びL.V.M. Rao, (1992)Arterioscler. Thromb., 12: 1111-1121）。この複合体は
、ＦＸからＸａ因子（ＦＸａ）、ＦＩＸからＩＸａ因子（ＦＩＸａ）、及びそれ
に加えてＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの活性化により外因性経路を開始させる。Ｔ
Ｆ−ＦＶＩＩａの作用は最終的にプロトロンビンからトロンビンへの変換を誘発
し、多くの生物学的機能を実行する（Badimon, L.等 (1991) Trends Cardiovasc
. Med. 1: 261-267）。トロンビンの最も重要な機能は、フィブリノーゲンのフ
ィブリンへの変換であり、それは重合して凝血塊を形成する。またＴＦ−ＦＶＩ
Ｉａ複合体は、接触活性化系の生理学的効果を拡張する二次的因子としても関与
している。

【０００７】 この血漿プロテアーゼ系の関与は、動脈及び静脈の血栓症、敗血性ショック、
成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、播種性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）及び他の
様々な疾患状態を含む種々の臨床的表現型に重要な役割を果たしていることが示
唆されている（Haskel, E.J.等 (1991), Circulation, 84: 821-827; Holst, J.
等 (1993) Haemostasis, 23(補1): 112-117; Creasey, A.A.等 (1993) J. C1in.
Invest., 91: 2850~2860; またColman, R.W. (1989)N. Engl. J. Med., 320: 1
2071209; Bone, R.C. (1992) Arch. Intern. Med., 152: 1381-1389も参照）。
ＴＦの過剰発現および／または異常な利用は血栓症および敗血症双方の病理生理
学に関連している（Taylor等, (1991) Circ. Shock, 33: 127; Warr等 (1990),
Blood, 75: 1481; Pawashe等 (1994) Circ. Res., 74: 56）。ＴＦは、動脈硬
化症プラーク内にある細胞の表面に発現される（Wilcox等, (1989) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 86: 2839）。これに加え、ＴＦは腫瘍転移に影響するとされ
ている（Bromberg等 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 8205）。抗-Ｔ
Ｆモノクローナル抗体の中和は、ヒヒ敗血症モデルで死亡を予防し（Taylor等 (
1991) Circ. Shock, 33: 127）、ウサギにおけるエンドトキシン誘導ＤＩＣを弱
め（Warr等 (1990) Blood, 75: 1481）、及びウサギの動脈血栓症モデルで血栓
再形成を予防する（Pawashe等 (1994) Circ. Res., 74: 56）ことが示された。

【０００８】 （発明の概要） 本発明は、組織因子タンパク質のアミノ酸配列変異体を含んでなる組成物を提
供する。この組織因子タンパク質変異体は、それらが誘導される哺乳動物組織因
子対応物よりも、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに対して大きな親和性を持つ。好ましい
実施態様では、本発明は、 ＦＶＩＩからＦＶＩＩａ、ＦＩＸからＦＩＸａ又はＦＸからＦＸａの触媒的変換
等のＴＦ−ＦＶＩＩａが媒介又は関連する過程を阻害し、それによって血液凝固
の外因性経路の初期の事象を阻止する組成物を提供する。従って、本発明は、場
合によっては凝固因子Ｘ活性化のための補因子を欠く組織因子タンパク質変異体
を提供する。よって、本発明の組成物は、ＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａへの結合につ
いて内因性組織因子と競合することができ、或る態様では内因性組織因子の血液
凝固効果を中和できる。

【０００９】 本発明の組成物は、出血性疾患の処置のための治療及び予防方法において有用
である。例えば、本発明の一態様では、組織因子タンパク質変異体は、凝血因子
ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩの欠損症を含む種々の慢性及び急性出血性疾患のための
凝血誘発治療用組成物として処方される。さらなる態様では、本発明は、ＴＦ−
ＦＶＩＩａ媒介又は関連過程の阻害のための治療及び予防方法並びに組成物を提
供する。有利には、これらの組成物は、低用量の医薬品製剤を提供する。

【００１０】 本発明の特別な態様では、組織因子タンパク質変異体は、哺乳動物組織因子タ
ンパク質から誘導され、Ａｓｐ５４、Ｇｌｕ５６、Ｇｌｕ１３０、Ａｒｇ１３１
、Ｌｅｕ１３３、Ａｒｇ１３５及びＰｈｅ１４０からなる群から選択されるヒト
アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸に置換さ
れたアミノ酸配列を有し、この組織因子タンパク質変異体は、ＦＶＩＩ／ＦＶＩ
Ｉａに対して、それが誘導された哺乳動物組織因子より大きな親和性を持つ。好
ましくは、組織因子タンパク質変異体は、Ａｓｐ５４及びＧｌｕ５６からなる群
から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つ、及びＧｌｕ１３０、Ａｒｇ１３
１、Ｌｅｕ１３３、Ａｒｇ１３５及びＰｈｅ１４０からなる群から選択されるア
ミノ酸残基の少なくとも１つが他のアミノ酸に置換された、可溶性組織因子タン
パク質変異体である。本発明の特別な態様では、Ａｓｐ５４に対する他のアミノ
酸残基が好ましくはＬｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ及びＳｅｒからなる群から
選択され；Ｇｌｕ５６に対する他のアミノ酸残基が好ましくはＡｓｐ、Ｈｉｓ、
Ｇｌｎ及びＴｒｐからなる群から選択され、Ｇｌｕ１３０に対する他のアミノ酸
残基が好ましくはＡｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＧｌｙからなる群から選択され、
Ａｒｇ１３１に対する他のアミノ酸残基が好ましくはＧｌｎ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、
Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ及びＭｅｔからなる群から選択され、Ｌｅｕ１
３３に対する他のアミノ酸残基が好ましくはＡｌａであり、Ａｒｇ１３５に対す
る他のアミノ酸残基が好ましくはＴｒｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ及び
Ａｌａからなる群から選択され、及びＰｈｅ１４０に対する他のアミノ酸残基が
好ましくはＡｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｒｇ及びＧｌｙからなる群から
選択される。

【００１１】 さらに本発明は、因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ結合にエネルギー的に寄与する、又は
ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ補因子活性に寄与するアミノ酸残基におけるアミノ酸置換
をさらに有する組織因子タンパク質変異体を提供する。従って本発明は、ＦＶＩ
Ｉａ補因子機能を欠いた、及び対応する組織因子タンパク質に比較して増大した
ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに対する親和性を持つ組織因子タンパク質のアミノ酸配列
変異体を提供する。本発明の特別な態様では、好ましくは、Ｌｙｓ１５、Ａｓｐ
４４、Ｔｒｐ１５８、Ｓｅｒ１６３、Ｇｌｙ１６４、Ｌｙｓ１６５、Ｌｙｓ１６
６及びＴｙｒ１８５からなる群から選択される少なくとも１つのさらなるアミノ
酸残基が、アラニン等の他のアミノ酸残基で置換される。

【００１２】 一実施態様において、本発明の組成物はポリペプチドであり、本発明は、本発
明のポリペプチドをコードする、単離された核酸、好ましくはＤＮＡを含む物質
の組成物を包含する。この態様によると、本発明は、そのＤＮＡ分子に作用可能
に結合した発現制御配列、そのＤＮＡ分子を含みその制御配列が当該べクターで
形質転換された宿主細胞に認識される発現ベクター、好ましくはプラスミド、及
び当該ベクターで形質転換された宿主細胞をさらに含む。

【００１３】 さらに本発明は、ここに記載する組成物の治療的応用にまで拡張される。即ち
発明は、本発明の組成物及び製薬的に許容される賦形剤を含む医薬品組成物を包
含する。これらの分子を含む医薬品組成物は、遺伝的凝固因子欠損症、脈管病お
よび炎症性反応を包む血栓性または凝固障害性関連の疾患または障害の治療又は
予防に使用できる。これらの応用には、例えばＴＦ−ＦＶＩＩａの阻害が指示さ
れる哺乳動物を治療する方法であって、その哺乳動物に医薬品組成物の製薬的有
効量を投与することを含んでなる方法が包含される。このような適応症は、深部
静脈血栓症、動脈血栓症、術後血栓症、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）、経皮
経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、発作、腫瘍転移、炎症、敗血性ショック、高血
圧、ＡＲＤＳ及びＤＩＣを含む。また本発明の組成物は、血栓溶解療法における
アジュバントとしても使用できる。

【００１４】 （好適な実施態様の詳細な説明） （定義） 特許請求の範囲及び明細書で使用する用語は、特に断らない限り以下に記載す
るように定義される。 説明を通して使用される略語は次のものを含む：ＩＸａ因子についてのＦＩＸ
ａ；ＸＩａ因子についてのＦＸＩａ；Ｘａ因子についてのＦＸａ；組織因子につ
いてのＴＦ；ＶＩＩ因子チモーゲンについてのＦＶＩＩ；ＶＩＩａ因子について
のＦＶＩＩａ；組織因子−ＶＩＩａ因子複合体についてのＴＦ−ＦＶＩＩａ；Ｆ
ＶＩＩ及び／又はＦＶＩＩａについてのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ；細胞外ドメイン
残基１−２１９（配列番号：２）を含む可溶性組織因子についてのｓＴＦ；位置
１６５及び１６６におけるＬｙｓのＡｌａへの置換を含むｓＴＦ変異体（配列番
号：３）についてのｈＴＦＡＡ；Dennis等, (1994) J. Biol. Chem. 269(35): 2
2129-22136におけるのと同じ名前のクニッツ型ＴＦ-ＦＶＩＩａ阻害薬について
のＴＦ７Ｉ−Ｃ；見掛けの平衡解離定数についてのＫi*；プロトロンビン時間に
ついてのＰＴ；活性化部分トロンボプラスチン時間についてのＡＰＴＴ。 ここで用いられる場合のアミノ酸又はアミノ酸残基という用語は、変異体につ
いて以下でさらに説明するように、天然発生Ｌアミノ酸又はＤアミノ酸を意味す
る。共通して使用される一及び三文字略語が、アミノ酸についてここで用いられ
る（Bruce Alberts等, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing,
Inc., New York (3d ed. 1994)）。

【００１５】 ＴＦ−ＦＶＩＩａ仲介または関連過程または事象、あるいはこれと同等に、血
漿ＦＶＩＩａに関連する活性は、本発明によればＴＦ−ＦＶＩＩａの存在を必要
とする任意の事象である。凝血塊形成の一般的機構は、Medical Physiology, 13
th ed., Lange, Los Altos CA, pp411-414 (1987)の総説においてGanongにより
、及びBach (1988) CRC Crit. Rev. Biochem. 23(4): 359-368により概説されて
いる。血液凝固には、血小板凝集を誘発するトロンビン生成及び血小板プラグを
安定化するフィブリン形成という２つの経路の合流が必要とされる。この過程は
、各々が別々のプロ酵素およびプロ補因子の存在を必要とする幾つかの段階を含
む。この過程は、フィブリンの架橋および血栓形成で終了する。フィブリノーゲ
ンはトロンビンの作用でフィブリンに変換される。一方、トロンビンは、プロト
ロンビンのタンパク質分解的切断によって形成される。このタンパク質分解は活
性化された血小板表面に結合するＦＸａによって行われ、ＦＶａとカルシウムの
存在下でプロトロンビンを切断する。ＴＦ−ＦＶＩＩａは凝固の外部経路による
ＦＸのタンパク質分解的活性化のために必要である。従って、ＴＦ−ＦＶＩＩａ
が媒介または関連する過程またはＦＶＩＩａに関連する活性は、ＴＦ−ＦＶＩＩ
ａ複合体形成からフィブリン血小板凝塊形成まで及び最初にＴＦ−ＦＶＩＩａの
存在を必要とする凝固カスケードにおける任意の段階を含む。例えばＴＦ−ＦＶ
ＩＩａ複合体はＦＸからＦＸａ、ＦＩからＦＩＸａ、及びこれに加えてＦＶＩＩ
からＦＶＩＩａへの活性化によって外部経路を開始させる。ＴＦ−ＦＶＩＩａ媒
介または関連プロセス又はＦＶＩＩａ活性は、例えば、因子ＶＩＩ及び他の必要
な試薬の存在下での因子Ｘから因子Ｘａへの変換についてRoy, S. (1991) J. Bi
ol. Chem., 266: 4665-4668、及びO'Brien, D.等 (1988) J. Clin. Invest., 82
: 206-212に記載されたもののような標準的な検定法を使用して便利に測定でき
る。

【００１６】 ＴＦ−ＦＶＩＩａ関連疾患または障害は、深部脈管血栓症、動脈血栓症、発作
、腫瘍転移、血栓分解、動脈硬化症及び血管形成術後の再狭窄のような脈管病、
炎症、敗血症ショック、毒血症、低血圧、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、汎
発性血管内血液凝固（ＤＩＣ）及びその他の疾患のような急性および慢性の徴候
を含むフィブリン形成に関連する慢性血塞性疾患または障害を意味する。ＴＦ−
ＦＶＩＩａ関連障害は、前記のようなインビボ凝固障害に限定されるものではな
く、透析操作、血液濾過または外科手術の間の血液バイパス等の過程で患者から
インラインで取り出された血液を含む血液の体外循環に起因する血液凝固といっ
たエキソビボのＴＦ−ＦＶＩＩａ関連過程も含む。

【００１７】 「出血性疾患」は、遺伝的及び獲得された大出血に向かう傾向を特徴とする。
このような出血性疾患の例は、因子ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩの欠損症である。獲
得された疾患の例は、血液凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、フォン・ビルブラン
ト因子、因子ＩＸ、Ｖ、ＸＩ、ＸＩＩ及びＸＩＩＩのインヒビターの獲得、凝固
因子合成の低下を含む肝臓疾患の結果としての止血障害、急性及び慢性腎臓疾患
に伴う出血傾向、及び外傷又は手術後の鬱血を含む。

【００１８】 用語「組織因子タンパク質」及び「哺乳動物組織因子タンパク質」は、天然発
生哺乳動物組織因子又は以下に記載するような組換え組織因子に対応するアミノ
酸配列を有するポリペプチドを意味するのに使用される。天然発生ＴＦには、ヒ
ト種並びにウサギ、ラット、ブタ、ヒト以外の霊長類、ウマ、マウス及びヒツジ
の組織因子のような他の動物種の組織因子を含む（例えば、Hartzell等, (1989)
Mol. Cell. Biol., 9: 2567-2573; Andrews等, (1991) Gene, 98: 265-269; 及
びTakayenik等, (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm., 181: 1145-1150参照）
。哺乳動物組織因子タンパク質のアミノ酸配列は、一般に知られているか、又は
従来法技術を通して入手可能である。

【００１９】 天然発生組織因子タンパク質に加えて、用語「哺乳動物組織因子タンパク質」
は、天然発生組織因子タンパク質をコードする核酸配列が組織因子タンパク質ア
ミノ酸配列における一又は複数のアミノ酸の置換、挿入又は欠失をコードする組
織因子タンパク質核酸配列を生成するように修飾された、所謂「組換え」組織因
子タンパク質を含む。この用語は、天然発生でない一又は複数のアミノ酸残基を
含む天然発生又は組換え組織因子タンパク質である「合成」組織因子タンパク質
をさらに含む。組換え及び合成組織因子タンパク質製造のために適した方法はこ
こに開示される。合成及び組換え組織因子タンパク質は、この分野で一般に知ら
れており、例えば、ｓＴＦ（Waxman等, (1992) Biochemistry 31: 3998-4005）
及び機能的ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａには結合するがＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａのＦＸ活
性化のための補因子として作用する能力は低下した組織因子タンパク質変異体（
例えば、ｈＴＦＡＡ、Lee及びKelley, (1998) J. Biol. Chem. 273: 4149-4154
参照）を含む。このような組織因子タンパク質変異体は、例えば、米国特許第5,
349,991号及び第5,726,147号に記載され、ここに記載した哺乳動物組織因子タン
パク質の定義に包含されることを意味する。

【００２０】 哺乳動物ＴＦに「対応する」本発明のＴＦタンパク質は、一般に、ヒト、ウシ
、ラット、ブタ、イヌ又は他の哺乳動物ＴＦタンパク質の相同アミノ酸配列、或
いはここに定義した定性的生物学的活性を有するインビトロで生成された相同変
異体を含む配列番号：１の配列の相同アミノ酸配列である。本発明のＴＦタンパ
ク質に対する相同性は、配列を整列させ、最大の同一性を達成するのに必要なら
ばギャップを導入した後、配列番号：１のアミノ酸残基、哺乳動物アミノ酸配列
又はここで定義するコンポジット配列いずれかと同一の候補配列内のアミノ酸残
基の割合として定義される。候補配列内でのＮ-又はＣ-末端延長又は削除は、同
一性を低下させないと解釈される。本発明における「コンポジットアミノ酸」は
、２６３アミノ酸残基構造でヒトＴＦと同じ位置を持つ他の哺乳類脊椎動物種か
らの代替アミノ酸を意味する。従って、コンポジットアミノ酸置換と呼ばれるア
ミノ酸置換は、同定されたアミノ酸を他の哺乳動物種からの等価物又はコンポジ
ットアミノ酸で置換する。コンポジットＴＦ配列は、他の哺乳動物種からのコン
ポジットアミノ酸で置換された野生型配列からのアミノ酸を少なくとも１つ有す
ると定義される。

【００２１】 従って、本発明は、少なくともここに定義されるような定性的生物学的活性を
有し、例えば、配列番号：１のポリペプチド又は配列番号：２のポリペプチドと
少なくとも７５％のアミノ酸相同性を持つＴＦ変異体を考慮する。ＴＦ変異体ア
ミノ酸配列は、好ましくは配列番号：１又は配列番号：２の配列と少なくとも８
０％、より好ましくは８５％の配列相同性を持つ。しかしながら、ＴＦ変異体又
は関連化合物は、ここに記載したＴＦ変異体の特徴を維持していれば、配列番号
：１又は配列番号：２の配列と５０％未満の配列相同性を示してもよい。

【００２２】 本発明のTF変異体の定義に含まれるのは、配列番号：１又は配列番号：２のア
ミノ酸配列変異体であって、本発明のものに加えてアミノ酸が他の残基で置換さ
れており、予め決められた突然変異（例えば、部位指向性ＰＣＲ突然変異誘発）
；上に列挙したもののような他の哺乳動物種のＴＦからの他のコンポジットアミ
ノ酸置換、及び上記及び下記の他の天然発生変異体を含む。また、上記のＴＦ変
異体であって、当該ＴＦ変異体が置換、化学的、酵素的、又は他の適当な手段に
より天然発生アミノ酸以外の部分で修飾されたものも含まれ、この変異体はここ
に記載した定性的生物学的活性を有するものと解される。例示的な非天然発生ア
ミノ酸置換は、ここで以下に記載するものを含む。

【００２３】 上記のように、一実施態様では、アミノ酸置換変異体は、ここに記載したもの
に加えて、ＴＦ変異体分子内に除去されてその位置に別の残基が挿入された少な
くとも１つのアミノ酸残基を有する。置換的突然変異のための部位は、様々な種
からのＴＦ変異体に見られるアミノ酸が側鎖バルク、電荷及び／又は疎水性の点
で実質的に相違している部位を含む。これらのアミノ酸は、例示的な非天然発生
アミノ酸を含む、ここで以下に記載するような例示的な保存的置換基で置換され
ている。

【００２４】 対象となる他の部位は、野生型ＴＦ及び様々な種から得た変異体の特定の残基
が同一であるものである。これらの位置は、ＴＦ変異体の生物学的活性にとって
重要である。これらの部位、特に少なくとも３つの他の同一的に保存された部位
の配列内にあるものは、相対的に保存的な形式で置換される。このような保存的
置換は、好ましい保存的置換という見出しの下で以下に示す。このような置換が
、ここに定義したような定性的生物学的活性を保持することが示されるならば、
以下に例示的な保存的置換として命名するより実質的な変化がなされ、生物学的
活性について試験される。

【００２５】 この点において、アミノ酸は、側鎖バルク、電荷及び／又は疎水性に基づいて
置換されてもよいと理解される。アミノ酸残基は４つの主要な群に分類される： 酸性：この残基は生理的ｐＨにおけるＨイオンの喪失により負の電荷を持ち、
この残基は水溶液によって誘引されて、ペプチドが水溶液中にある場合にそれが
含まれるペプチドの立体配置における表面位置を求める。 塩基性：この残基は生理的ｐＨにおけるＨイオンとの結合により正電荷を持ち
、この残基は水溶液によって誘引されて、ペプチドが生理的ｐＨの水性媒体中に
ある場合にそれが含まれるペプチドの立体配置における表面位置を求める。 中性／非極性：この残基は生理的ｐＨで荷電せず、この残基は水溶液に反発し
て、ペプチドが水性媒体中にある場合にそれが含まれるペプチドの立体配置にお
ける内部位置を求める。これらの残基は「疎水性残基」とも呼ばれる。 中性／極性：この残基は荷電していないが、この残基は水溶液によって誘引さ
れて、ペプチドが水性媒体中にある場合にそれが含まれるペプチドの立体配置に
おける外部位置を求める。 アミノ酸残基は、それらの側鎖基について、環状又は非環状、芳香族又は非芳
香族としてさらに分類でき、これらの名称は当業者にとって常識である。

【００２６】

【００２７】 遺伝子によってコードされず、一般的に遭遇するアミノ酸は以下を含む、Ｇｌ
ｕ及びＡｓｐについての２-アミノアジピン酸（Ａａｄ）；Ｇｌｕ及びＡｓｐに
ついての２-アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族ア
ミノ酸についての２-アミノブチル酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂
肪族アミノ酸についての２-アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；Ｇｌｙについての２-
アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、及びＬｅｕ及びＩｌｅについてのシク
ロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；Ａｒｇ及びＬｙｓについてのホモアルギニン（
Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについての２，３-ジアミノプロピオン酸
（Ｄｐｒ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧ
ｌｙ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ-エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ
）；Ａｓｎ、及びＧｌｎについてのＮ-エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌ
ｙｓについてのヒドロキシルリジン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓについてのアロヒドロキ
シルリジン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒについての３-(及び４)
ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＶａｌにつ
いてのアロ-イソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｌａについてのアミジノフェニルア
ラニン；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及びＡｌａについてのＮ-メチルグリシン（ＭｅＧｌ
ｙ、サルコシン）；ＩｌｅについてのＮ-メチルイソロイシイン（ＭｅＩｌｅ）
；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔ及び
他の脂肪族アミノ酸についてのノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨ
ｉｓについてのオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎについてのシ
トルリン（Ｃｉｔ）及びメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；Ｐｈｅについての
Ｎ-メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハ
ロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩ）フェニルアラニン、トリフルオロフェニルアラニ
ン。

【００２８】 ＴＦ変異体の特定の残基又は領域の、ここに記載した以外のアミノ酸置換に対
して、レセプター特異性について同定するための有用な方法は、Cunningham及び
Wells (1989) Science, 244: 1081-1085に記載されているように、アラニン・ス
キャンニング突然変異誘発と呼ばれる。ここで、残基又は標的残基の基が同定さ
れ（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ等の荷電残基）、中性
又は負荷電アミノ酸に置換されて、アミノ酸と細胞内外の周囲の水性環境との相
互作用に影響を与える。次いで、この置換に機能的感受性を示すドメインを、置
換部位において又はついて更に又は他の変異を導入することにより精製する。よ
って、アミノ酸配列変異を導入する部位が予め決定されるが、変異体の性質自体
は予め決定する必要はない。例えば、与えられた部位における変異体の性能を最
適化するために、Ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン
又は領域で行い、発現されたＴＦ変異体を所望の活性の最適な組み合わせについ
てスクリーニングしてもよい。

【００２９】 タンパク質又はペプチドライブラリのファージ表示は、向上した親和性、変化
した特異性、又は向上した安定性を持つＴＦ変異体の選択のための他の方法論で
ある（Smith, G.P. (1991) Curr. Opin. Biotechnol. 2: 668-673）。Ｍ１３遺
伝子ＩＩＩ被覆タンパク質との融合物として一価形式で表示される高親和性タン
パク質（Clackson, T.等, (1994) Trend Biotechnol. 12: 173-183）は、多数ラ
ウンドの結合性選択の後にファージミド粒子中にパッケージされた対応するＤＮ
Ａのクローニング及び配列決定により同定される。

【００３０】 他のＴＦ変異体は、国際公開公報WO97/20939に記載されたもの等の融合物並び
に免疫グロブリン定常領域委又は他の免疫グロブリン領域、アルブミン、又は19
89年4月6日に発行されたWO89/02922に記載されたフェリチン等の長い半減期を持
つタンパク質とのＣ-末端融合物を含む。ここで用いられる場合の用語「イムノ
アドヘシン」は、異種タンパク質の「結合ドメイン」（「アドヘシン」、例えば
、TF細胞外ドメイン）と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結
合させる抗体様の分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、抗体の抗原認
識部位及び結合部位（抗原結合部位）以外の（即ち、「異種の」）所望の結合特
異性を持つアドヘシンアミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融
合物を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ_１ 、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、又はＩｇＧ_４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又は
ＩｇＭといった任意の免疫グロブリンから得られる。イムノアドヘシンは、例え
ば、米国特許第5,116,964号に記載されている。

【００３１】 ヒト組織因子タンパク質の配列（配列番号：１）並びにアミノ酸に与えた番号
は、Fisher等, (1987) Thrombosis Res. 48: 89-99に記載されているものであ
る。この残基位置番号は、本発明の組織因子タンパク質変異体において置換がさ
れた残基を示すために、三文字アミノ酸表記と組み合わせて使用される。即ち、
例えば、天然発生ヒト組織因子タンパク質の残基位置５４においてセリン（Ｓｅ
ｒ）がアスパラギン酸（Ａｓｐ）に置換した組織因子タンパク質変異体では、「
Ａｓｐ５４Ｓｅｒ」などの表記が使用される。複数の置換は、各置換をダッシュ
（−）で分離して同様の形式で表記する。即ち、例えばヒト組織因子タンパク質
の１５及び１８５のアミノ酸がアラニン（Ａｌａ）残基で置換された組織因子タ
ンパク質変異体では、「Ｌｙｓ１５Ａｌａ−Ｔｙｒ１８５Ａｌａ」という表記が
使用される。

【００３２】 本発明の文脈内でヒト以外の哺乳動物種からの組織因子タンパク質が使用され
る範囲では、ヒト以外の組織因子タンパク質の配列でなされるアミノ酸置換は、
配列を整列させた後にヒトアミノ酸残基に対応するアミノ酸になされる。 ここで用いられる場合の「組織因子タンパク質変異体」は、哺乳動物組織因子
タンパク質のアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列を持つ組織因子タンパク
質を指す。組織因子タンパク質変異体のアミノ酸配列は、ここに記載する本発明
による哺乳動物組織因子タンパク質のアミノ酸配列の一又は複数のアミノ酸の置
換により、哺乳動物の組織因子タンパク質アミノ酸配列から「誘導される」。こ
のような置換は、一般的に、哺乳動物組織因子タンパク質をコードする核酸配列
を変えることによりなされ、そのような変換をする好適な方法は、この分野で知
られ、ここに記載されている。

【００３３】 （発明の実施の形態） 本発明の組織因子タンパク質変異体は、例えば、哺乳動物組織因子タンパク質
のアミノ酸配列におけるアミノ酸置換により、ＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａに十分な
親和性で結合する哺乳動物組織因子タンパク質であり、組織因子タンパク質変異
体及び野生型組織因子タンパク質が生理的濃度で存在する場合、野生型組織因子
タンパク質と有効に競合する。好ましくは、組織因子タンパク質はＦＶＩＩ／Ｆ
ＶＩＩａに対して野生型組織因子タンパク質より大きな親和性を持ち、より好ま
しくは、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに対してそれが誘導された哺乳動物組織因子タン
パク質より大きな親和性を有する。従って、当該タンパク質がＦＶＩＩ／ＦＶＩ
Ｉａに結合することが本発明のＴＦ変異体の特徴である。従って、本発明のＴＦ
変異体は、ＴＦのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａへの結合に必要な残基を野生型又は哺乳
動物ＴＦタンパク質と共有する。「ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａへの結合」とは、本発
明のＴＦ変異体が、少なくとも生理的濃度においてＴＦ変異体が野生型ＴＦと結
合について競合できる程度のＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに結合する能力を持つことを
意味する。ＴＦド変異体の中で好適なのは、上掲のKelley等, (1995)に記載され
たような標準的な結合アッセイにおいて、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａについて約１０
．０ピコモル（ｐＭ）から約１マイクロモル（μＭ）の間のＫＤを持つものであ
る。さらに好ましくは、ＴＦドメインは、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａについて約１０
ｐＭから約１０ナノモル（ｎＭ）の間、最も好ましくは約１０ｐＭから１ｎＭの
間のＫＤを有する。

【００３４】 本発明によると、組織因子タンパク質変異体は、哺乳動物組織因子タンパク質
から、Ａｓｐ５４、Ｇｌｕ５６、Ｇｌｕ１３０、Ａｒｇ１３１、Ｌｅｕ１３３、
Ａｒｇ１３５及びＰｈｅ１４０からなる群から選択されるヒト組織因子タンパク
質のアミノ酸残基に対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換することによ
り誘導される。好ましくは、組織因子タンパク質変異体は、それが誘導された哺
乳動物組織因子タンパク質よりも、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに対して大きな親和性
を有する。好ましくは、組織因子タンパク質変異体は可溶性組織因子タンパク質
であり、好ましくはＡｓｐ５４及びＧｌｕ５６からなる群から選択される少なく
とも１つのアミノ酸残基、及びＧｌｕ１３０、Ａｒｇ１３１、Ｌｅｕ１３３、Ａ
ｒｇ１３５及びＰｈｅ１４０からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ
酸残基が他のアミノ酸に置換されたｓＴＦタンパク質変異体である。

【００３５】 本発明によると、Ａｓｐ５４に対する他のアミノ酸残基が好ましくはＡｓｐ、
Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ及びＳｅｒからなる群から選択され；Ｇｌｕ５
６に対する他のアミノ酸残基が好ましくはＡｓｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ及びＴｒｐか
らなる群から選択され、Ｇｌｕ１３０に対する他のアミノ酸残基が好ましくはＡ
ｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＧｌｙからなる群から選択され、Ａｒｇ１３１に対す
る他のアミノ酸残基が好ましくはＧｌｎ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ、Ｔｈｒ及びＭｅｔからなる群から選択され、Ｌｅｕ１３３に対する他のア
ミノ酸残基が好ましくはＡｌａであり、Ａｒｇ１３５に対する他のアミノ酸残基
が好ましくはＴｒｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ及びＡｌａからなる群か
ら選択され、そしてＰｈｅ１４０に対する他のアミノ酸残基が好ましくはＡｓｎ
、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｒｇ及びＧｌｙからなる群から選択される。

【００３６】 好ましくは、本発明の組織因子タンパク質変異体は、哺乳動物ＴＦタンパク質
から、ヒトＴＦのＡｓｐ５４に対応するアミノ酸残基のＳｅｒでの置換、Ｇｌｕ
１３０に対応するアミノ酸のＡｓｐ、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から選択され
るアミノ酸での置換、Ａｒｇ１３１に対応するアミノ酸残基のＧｌｎでの置換、
Ａｒｇ１３５に対応するアミノ酸残基のＴｒｐ及びＧｌｎからなる群から選択さ
れるアミノ酸残基での置換、及びＰｈｅ１４０に対応するアミノ酸のＡｓｎでの
置換により誘導される。

【００３７】 さらなる実施態様では、組織因子タンパク質変異体は、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ
に対して、野生型組織因子タンパク質より大きな、好ましくはヒトアミノ酸残基
Ａｓｐ５４、Ｇｌｕ１３０、Ａｒｇ１３１、Ｌｅｕ１３３、及びＰｈｅ１４０に
対応する各アミノ酸残基の置換によりそれが誘導された哺乳動物組織因子タンパ
ク質よりも大きな親和性を有する。好ましくは、アミノ酸は上記のスキームにし
たがって置換される。

【００３８】

【００３９】 本発明の文脈において、用語「１３３ｃｏｎｓ」は、組織因子タンパク質変異
体の配列Ｇｌｕ１３０Ａｓｐ−Ａｒｇ１３１Ｇｌｎ−Ｌｅｕ１３３Ａｌａ−Ａｒ
ｇ１３５Ａｒｇ−Ｐｈｅ１４０Ａｓｎを示すのに使用される。従って、１３３ｃ
ｏｎｓ−ｈＴＦＡＡは、ここに定義したｈＴＦＡＡにおいて、さらにＧｌｕ１３
０Ａｓｐ−Ａｒｇ１３１Ｇｌｎ−Ｌｅｕ１３３Ａｌａ−Ａｒｇ１３５Ａｒｇ−Ｐ
ｈｅ１４０Ａｓｎ配列置換を有するものを示す。同様に、Ｌｙｓ１５Ａｌａ−１
３３ｃｏｎｓ−ｈＴＦＡＡは、ここに定義したｈＴＦＡＡ配列において、さらに
Ｌｙｓ１５Ａｌａと、Ｇｌｕ１３０Ａｓｐ−Ａｒｇ１３１Ｇｌｎ−Ｌｅｕ１３３
Ａｌａ−Ａｒｇ１３５Ａｒｇ−Ｐｈｅ１４０Ａｓｎの置換を有するものを示す。

【００４０】 本発明によると、ＴＦ変異体は、これに限定するものではないが、膜貫通ドメ
イン及び細胞質ドメインの両方を有する全長のリン脂質関連組織因子タンパク質
、並びに野生型組織因子又は哺乳動物組織因子タンパク質の膜貫通及び／又は細
胞質ドメインの全部又は一部が欠失したＴＦ変異体も包含する。本発明のＴＦ変
異体の中で好ましいのは、野生型組織因子の膜貫通及び細胞質ドメインの全部又
は一部が欠失したものである。本発明のこの態様によると、ＴＦ変異体は、野生
型組織因子のＮ-末端フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの少なくとも一部を含
む。好ましくは、ＴＦ変異体は少なくとも野生型組織因子の１−１０２アミノ酸
を含む。より好ましくは、本発明のＴＦ変異体は、野生型組織因子の両方のフィ
ブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む。好ましくは、本発明のこの態様によれば
、少なくとも野生型ＴＦの１〜２１９アミノ酸が存在する。

【００４１】 さらに本発明は、因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ結合にエネルギー的に寄与する、又は
ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ補因子活性に寄与するアミノ酸残基において更なるアミノ
酸置換を有し、場合によってはＦＶＩＩａ補因子機能を欠く組織因子タンパク質
対応物に比較して向上したＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに対する親和性を持つ組織因子
タンパク質のアミノ酸配列変異体を提供する組織因子タンパク質変異体を提供す
る。本発明のこの態様によると、好ましくはヒトアミノ酸残基Ｌｙｓ１５、Ａｓ
ｐ４４、Ｔｒｐ１５８、Ｓｅｒ１６３、Ｇｌｙ１６４、Ｌｙｓ１６５、Ｌｙｓ１
６６及びＴｙｒ１８５に対応するアミノ酸からなる群から選択される、さらに少
なくとも１つのアミノ酸残基がアラニン等の他のアミノ酸残基で置換されている
。

【００４２】 例として、野生型ＴＦの長さに沿った特定のアミノ酸の置換、挿入又は欠失は
、ＦＶＩＩａに対する補因子として作用する能力の低下したＴＦ変異体を産生す
る。当業者は、ＴＦの凝固促進機能に寄与するような野生型ＴＦの残基を認識す
るであろう。例えば、アミノ酸１５７〜１６８の領域にある残基はＴＦ−ＦＶＩ
Ｉａの凝固促進機能に寄与する（Kelley等, (1995) 上掲；Ruf等, (1992) 上掲
）が、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ結合にとっては重要ではない。本発明によれば、こ
れらのアミノ酸の全部または任意のものを選択的に置換するかまたは欠失させて
、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに結合するが野生型組織因子の凝固促進活性を中和する
ことができるＴＦドメインを提供する。

【００４３】 好ましい実施態様において、野生型組織因子のＴｒｐ１５８、Ｌｙｓ１５９、
Ｓｅｒ１６３、Ｇｌｙ１６４、Ｌｙｓ１６５、Ｌｙｓ１６６、及びＴｙｒ１８５
残基の任意のもの又は全部を選択的に置換または欠失させて本発明のＴＦドメイ
ンを提供する。好適な置換は米国特許第5,346,991号に記載されており、生理的
なｐＨで実質的に正に荷電した側鎖を有するもの以外のアミノ酸による置換を包
む。例示的な置換にはＴｒｐ１５８Ｐｈｅ、Ｌｙｓ１５９Ａｌａ、Ｓｅｒ１６３
Ａｌａ、Ｌｙｓ１６５Ａｌａ、Ｌｙｓ１６６Ａｌａ、及びＴｙｒ１８５Ａｌａの
任意のもの又は全部を含む。本発明の最も好ましい態様では、ＴＦ補因子機能に
重要であるがＦＶＩＩａ複合体形成を阻害しないリジン残基１６５及び１６６が
選択的に置換される（Roy等, (1991) J. Biol. Chem. 266: 22063; Ruf等, (199
2) J. Biol. Chem. 267: 6375）。従って、本発明の好ましい態様によれば、少
なくとも野生型組織因子の１６５及び１６６の残基を選択的に置換して、ＦＶＩ
Ｉ／ＦＶＩＩａに結合する能力は保持するが、前記のような補因子として作用す
る能力が低下した分子が得られる。特定の態様では、これらの残基のアラニン置
換が好適であるが、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体に触媒されるＦＸ活性化の速度を低
下させる任意の置換が適当である（Ruf等, (1992) 上掲）。

【００４４】 本発明の好適な組織因子変異体は、「心筋梗塞および凝固障害性疾患の処置に
有用な組織因子突然変異体」と題する米国特許第5,346,991号に記載されたもの
であり、その開示は特に参考としてここに取り入れる。この特許は、内因性組織
因子が血液凝固を誘発する能力を阻害することのできる組織因子変異体の作成を
記載している。これらの変異体は、正に荷電した１６５と１６６アミノ酸残基の
一方または両方を生理的ｐＨで実質的に正に荷電する側鎖を持たないα−アミノ
酸で置換したものである。これらの変異体には、野生型組織因子の細胞質部分、
残基２４４〜２６３、並びに残基２２０〜２４３の膜貫通領域が除去された前記
のヒト組織因子の分子が含まれる。これらの組織因子変異体の何れもが適切に本
発明のＴＦドメインを形成することができる。また、国際公開公報WO 94/28017
もＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに結合することができるが凝固促進性補因子活性が低下
したＴＦ変異体を記載している。そこに記載された分子の中で最も好ましいのは
、野生型組織因子タンパク質に相同的なアミノ酸配列を持ち、ＴＦ補因子機能に
関連するアミノ酸の少なくとも１つが選択的に置換、欠失又は置き換えられて、
そのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに結合する能力は保持するが前記補因子として作用す
る能力は低下した分子を与える組織因子タンパク質である。

【００４５】 当業者は、ＦＶＩＩａ結合に寄与するＴＦの残基を認識するであろう（Kelley
等, (1995) 上掲；Gibbs等, (1994) 上掲；Ruf等, (1994) Biochemistry、33: 15
65-1572; Schullek等, (1994) J. Biol. Chem., 269: 19399-19043; Muller等,
(1994) 33: 10864-10869）。本発明によれば、ＴＦ変異体は、少なくとも前記
ＦＶＩＩａ／ＦＶＩＩ結合のために必要な残基を野生型ＴＦと共有する。好まし
くは、この組織因子変異体は、野生型組織因子タンパク質との間に少なくとも約
８０％の配列相同性、より好ましくは約８５〜９５％の配列相同性を共有するで
あろう。

【００４６】 本発明の組織因子変異体の組換え合成のためのタンパク質をコードするＤＮＡ
を作成するために種々の技術が利用可能である。例えば、結果的なタンパク質の
アミノ酸配列における変化をコードする天然発生ＤＮＡ配列に基づいてＤＮＡを
誘導することが可能である。これらの突然変異ＤＮＡを、本発明の組織因子変異
体を得るために使用できる。これらの技術は、単純な形では、以下に議論するよ
うな組換え技術により遺伝子修飾する組織因子をコードする遺伝子を得て；この
遺伝子を適切な発現べクターに挿入し；このベクターを適当な宿主細胞に挿入し
：この宿主細胞を培養してハイブリッド分子を発現させ；そしてそこで産生され
た分子を精製することを考慮している。

【００４７】 幾分特定的には、本発明の組織因子変異体をコードするＤＮＡ配列は、ＤＮＡ
配列の合成的構築によって得られる（Sambrook, J．等、「分子クローニング(Mo
lecular・Cloning)」、 (2nd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)
）。 例えば、野生型組織因子をコードする発現べクターを得て、部位特異的突然変
異誘発（Kunkel等, (1991) Meth. Enzymol., 204: 125-139; Carter, P.等, (19
86) Nucl. Acids. Res., 13: 4331; Zoller, M.J.等, (1982) Nucl. Acids Res.
, 10: 6487）、カセット突然変異誘発（Wells, J.A.等, (1985) Gene, 34: 315
）、又は制限選択突然変異誘発（Wells, J.A.等, (1986) Philos. Trans. R. So
c. London Ser A, 317: 415）を施して、この分子の組織因子ドメインを得るこ
とができる。次に、突然変異ＤＮＡを活性部位阻害薬ドメインをコードするＤＮ
Ａを含む発現ベクターに挿入することにより使用しうる。

【００４８】 オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は、本発明の組織因子変異体をコードす
るＤＮＡを作成するに好適な方法である。この技術は当技術分野でよく知られて
おり、Adelmann等, (1983) DNA, 2: 183に記載されている。簡潔に言えば、野生
型の組織因子の天然又は非変性のＤＮＡを、ＤＮＡテンプレートへの所望の突然
変異をコードするオリゴヌクレオチドにハイブリッド化させることによって変化
させ、ここで、そのテンプレートは非変性又は天然のＤＮＡ配列を含むプラスミ
ド又はバクテリオファージの一本鎖型である

【００４９】 次いで、変異体をコードするＤＮＡを適当なプラスミドまたはべクターに挿入
する。このベクターは宿主細胞を形質転換するのに使用される。一般に、宿主細
胞に適合する種に由来する複製及び制御配列を含むプラスミドベクターが、これ
らの宿主に関して使用される。このベクターは通常、複製部位、並びに形質転換
細胞において表現型選択が可能なタンパク質をコードする配列を有する。

【００５０】 例えば、大腸菌は大腸菌種から誘導したプラスミド、ｐＢＲ３２２（Mandel,
M.等, (1970) J. Mol. Biol., 53: 154）を使用して形質転換してもよい。プラ
スミドｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含有し
、よって選択のための簡単な方法を提供する。その他のベクターは、異なるプロ
モータといった異なる特徴を含み、それらは発現において重要であることが多い
。例えば、プラスミドｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ７２０、及びｐＰＬ-ラムダは
、ｔａｃ、ｔｒｐ及びＰ_Ｌ-プロモータを有する現在利用可能な発現ベクターを
代表する（Pharmacia Biotechnology社）。 他の好適なベクターは、ここに記載したべクターの関連する手がかりを組合せ
ることによって標準的な技術を用いて構築できる。このべクターの関連する手が
かりには、プロモータ、リボソーム結合部位、変異体遺伝子または遺伝子融合、
シグナル配列、抗生物質耐性マーカー、コピー数、及び適当な複製開始点が含ま
れる。

【００５１】 宿主細胞は原核生物でも真核生物でもよい。原核生物は、ＤＮＡ配列をクロー
ニング及び発現して親ポリエプチド、セグメント置換ポリペプチド、残基置換ポ
リペプチド及びポリペプチド変異体を産生するのに適している。例えば、大腸菌
Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ番号３１４４６）は、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（
ＡＴＣＣ番号３１５３７）、大腸菌ｃ６００及びｃ６００ｈｆ１、大腸菌Ｗ３１
１０（Ｆ-、ガンマ-、原栄養株／ＡＴＣＣ番号２７３２５）、例えば枯草菌のよ
うなバチルス属菌、及び例えばサルモネラ・ティフムリウム又はセラチア・マル
セッセンスのような他の腸内細菌及び種々のシュードモナス種と同様に使用でき
る。好適な原核生物は大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）である。原核生
物によって発現された場合、このポリペプチドは典型的にはＮ-末端メチオニン
またはホルミルメチオニンを含み、グリコシル化はされない。当然のことながら
、これらの例は限定ではなく例示である。

【００５２】 原核生物に加えて、酵母培地のような真核生物、又は多細胞生物から誘導した
細胞使用してもよい。原理的には、そのような細胞培地はいずれも作動可能であ
る。しかしながら、脊椎動物細胞において最も関心が高く、培地中での脊椎動物
細胞の増殖（組織培養）が再現性ある操作法になっている（「組織培養(Tissue
Culture)」、Academic Press, Kruse及びPatterson編, [1973]）。このような有
用な宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵
巣（ＣＨＯ）細胞系、Ｗ１３８、２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７及びＭＤＣＫ細胞
系である。

【００５３】 ２．組成物 本発明の組織因子タンパク質変異体は、典型的には意図する使用に適した組成
物形態で提供される。本発明の変異体は、ここに記載したｈＴＦＡＡの形態のよ
うな可溶性の形態で調製できる。

【００５４】 また、本発明の組織因子変異体は、野生型組織因子の膜貫通ドメインの全部ま
たは一部を含んでいてもよい。本発明によれば、膜固着ドメインを含むＴＦ変異
体を穏やかな界面活性剤またはリン脂質（ＰＬ）を含む組成物中で調製するのが
好ましい。膜固着又は膜貫通ドメインを含む全長ＴＦドメインを含有する本発明
の組成物は、その生物学的活性を保持しており、それらは好ましくはリン脂質組
成物中で製剤化される。国際公開公報WO 94/28017は、本発明の組成物に適した
ＴＦドメインを含むリン脂質組成物の調製を記載している。

【００５５】 WO 94/28017に記載されており、本発明の医薬品組成物に適した好適な組成物
は、組成物について最高の安定性および生物学的活性を与えるリン脂質組成物で
ある。このようなリン脂質組成物は当技術分野で一般によく知られているように
、好ましくはリポソーム組成物を形成するように製剤化される。記載のように、
本発明のリポソーム組成物に使用するために適したリン脂質は、炭素原子１２か
ら２０を有する脂肪酸を含むものを包含し、前記脂肪酸は飽和でも不飽和でもよ
い。本発明で使用するために好したリン脂質には、ホスファチジルコリン（ＰＣ
）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（
ＰＧ）及びホスファチジルセリン（ＰＳ）が含まれる。これらのリン脂質は、任
意の天然起源に由来してもよく、そのリン脂質はそれ自体として異なる脂肪酸を
有する分子から構成されていてもよい。異なる起源からのリン脂質を含むリン脂
質混合物を使用してもよい。例えば、ＰＣ、ＰＧ及びＰＥは卵黄から得てもよく
；ＰＳは動物の脳及び脊髄から得てもよい。これらのリン脂質は、同様に合成的
起源に由来してもよい。これらのリン脂質を適当な比率で好都合に混合し、本発
明の組成物を調製するために用いるリン脂質混合物を提供する。

【００５６】 リポソームの調製は一般によく知られており既に記載されている。リポソーム
調製法の例には、リポソームの逆負荷（米国特許第5,104,661号参照）、又は脂
質小胞へのアンホテリシンＢの導入について記載された形式が含まれる（例えば
、Lopez-Berenstein等, (1985) J. Infect. Dis., 151: 704-710; Lopez-Berens
tein, (1987) Antimicrob. Agents Chemother., 31: 675-678; Lopez-Berenstei
n等, (1984)、J. Infect. Dis., 150: 278-283; 及びMehta等, (1984) Biochem.
Biophys. Acta, 770: 230-234参照）。また、サーキュレーション時間の強化さ
れたリポソームを米国特許第5,013,556号に記載されているようにして調製して
もよい。

【００５７】 よって、一実施態様では、本発明はリポソーム形態での組織因子変異体の調製
を考慮し、当該リポソームは、そのリポソームの脂質二重層に結合した分子のＴ
Ｆ部分を有し、ＴＦ膜固着ドメインは脂質二重層を通して挿入されている。 本発明の他の適当な組成物は、製薬的に許容される担体を有する前記組成物の
いずれを包含し、その担体の性質は様式によって異なり、例えば経口投与では通
常固体担体が用いられ、Ｉ．Ｖ．投与では液体塩溶液担体である。

【００５８】 本発明の組成物は、患者及び本発明のタンパク質に適合する製薬的に許容され
る成分を含む。これらは一般に、懸濁液、溶液及びエリキシル剤、そして特にリ
ン酸緩衝塩水、塩水、ダルベッコの培地、その他のような生物学的緩衝液を包含
する。エアロゾル、又は澱粉、糖類、微結晶セルロース、希釈剤、顆粒剤、滑沢
剤、結合剤、崩壊剤、その他（経口投与用固体製剤の場合には、たとえば粉末、
カプセルおよび錠剤のようなもの）を使用してもよい。

【００５９】 ここで使用する用語「製薬的に許容される」とは、一般的に、連邦または州政
府の規制当局に承認されたもの又は米国薬局方又は動物、特にヒトに使用するた
めの他の一般に認められた薬局方に列挙されているものを意味する。

【００６０】 選択すべき製剤化は、前記種々の緩衝液または、例えば製薬級マンニトール、
ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウムセルロー
ス、炭酸マグネシウム、その他を包含する賦形剤をも使用して達成できる。組成
物の「ＰＥＧ化(PEGylation)」は、当技術分野で知られている技術（例えば、国
際特許公報WO 92/16555、Enzonの米国特許第5,122,614号、及び国際特許公報WO
92/00748参照）を使用して達成してもよい。経口組成物は、溶液、懸濁液、錠剤
、丸剤、カプセル剤、持続性放出剤、又は粉末の形態としてもよい。

【００６１】 ３．治療方法 本発明の分子は、血液凝固の誘発又は逆に、組織因子変異体がＦＸの活性化の
ための補因子を欠く場合、ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体の生物学的作用を予防するた
めに治療的に使用できる。ＴＦ−ＦＶＩＩａの阻害は、ＴＦ−ＦＶＩＩａ依存性
血液凝固の低下を意図する徴候において望ましい。これらの症例には、限定する
ものではないが、血栓溶解療法と組み合わせた動脈再血栓症の予防が含まれ。Ｔ
Ｆ−ＦＶＩＩａは、深部脈管血栓症、動脈血栓症、発作、ＤＩＣ、敗血性ショッ
ク、心肺バイパス手術、成人呼吸困難症候群、先天性血管浮腫を含む、種々の臨
床的容体において重要な役割を果たすことが示唆されている。従って、ＴＦ−Ｆ
ＶＩＩａの阻害薬は、炎症および／または血栓症の調節において重要な役割を果
たしうる。

【００６２】 よって本発明は、ヒトにおけるＴＦ−ＦＶＩＩａが媒介する事象を抑制する方
法を包含し、その方法は、本発明の組織因子変異体の治療的有効量を必要とする
患者に投与することを含んでなる。本発明のハイブリッド分子の治療的有効量は
、所望の効果を達成するように予め決定される。治療に用いられる量は治療対象
、投与経路および処置すべき病状に依存して変化する。従って、投与すべき用量
は存在するＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａに結合して不活性な複合体を形成し、処置され
る患者において血液凝固を低下させるのに十分な量である。

【００６３】 治療的有効性は、ＴＦ−ＦＶＩＩａ依存性凝固に関連する一又は複数の症状の
改善によって測定される。このような治療的有効用量は、当業者によって決定で
き、処置すべき患者の年齢条件、性および病状に応じて変化する。全身投与につ
いての適当な用量範囲は、典型的には約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ又
はそれ以上であり、投与経路に依存する。本発明によれば、好適な治療的用量は
約１μｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重の間である。例えば、適当な措置は
、意図する治療に特定された範囲の血中濃度を維持するに十分な静脈注射または
点滴を包含する。

【００６４】 本発明のポリペプチドを含む医薬品組成物は、非経口、局所、経口、または局
所（例えばエアロゾルまたは経皮）、又はこれらの組合せの含む任意の適当な様
式で投与してよい。また適当な措置には、最初の静脈内ボーラス及びそれに続く
１回または複数回の間隔をおいた反復投与が含まれる。

【００６５】 例えば、血栓溶解療法の過程で血栓閉塞の再形成を予防するために、本発明の
組成物を血栓溶解剤と組合せて投与する場合には、血栓溶解の治療的有効用量は
従来の用量範囲の約８０から１００％の間である。血栓溶解剤の通常の用量範囲
は、治療で使用される日用量であって、治療担当医には容易に入手可能である（
「Physicians Desk References 1994」、50th Edition, Edward R. Barnhart出版
社）。典型的な用量範囲は、用いる血栓溶解剤に依存し、組織プラスミノーゲン
活性化剤（ｔ-ＰＡ）では０．５から約５ｍｇ／ｋｇ体重；ストレプトキナーゼ
では患者当たり１４０,０００から２,５００,００００単位；ウロキナーゼでは
患者当たり５００,０００から６,２５０,００単位；そしてアニソール化ストレ
プトキナーゼ・プラスミノーゲン活性化剤複合体（ＡＳＰＡＣ）では０．１から
約１０単位／ｋｇ体重となるであろう。ここで使用される組み合わせという用語
は、少なくとも本発明の分子及び少なくとも１種の血栓溶解剤を含む単一投与形
態を含む。またこの用語は、本発明の分子が別々に投与されるが、順次投与のよ
うに別々の投与２回によって同時発生的に投与される多数回投与形態も含むこと
を意味する。これらの組合せ及び組成物は、閉塞血栓の溶解を起こす閉塞血栓を
溶解するかまたは形成を予防するように作用する。

【００６６】 本発明のさらなる態様によれば、例えば人工弁、プロテーゼ、ステント又はカ
テーテルを通過する血液の体外潅流で遭遇するようなエキソビボの凝血を予防す
るために分子を用いうる。本発明のこの態様によれば、体外装置を本発明の組成
物で被覆して外因性活性化経路に基づく凝血塊形成の危険を低下させる。 限定ではなく例示のために以下の実施例を提示する。本明細書中の全ての引用
文献の開示は参考のためにここに取り入れるものとする。

【００６７】 （実施例） 材料 ヒトのＶＩＩａ因子、Ｘ因子、Ｘａ因子、並びにビオチニル化グルタミル-グ
リシル-アルギニンクロロメチルケトン（BEGR-CK）は、Haematologic Technolog
ies社（Essex Jct., VT）から購入した。色素生産性基質クロモジムｔ-ＰＡ（
Ｎ-メチルスルホニル-Ｄ-フェニル-Ｌ-グリシル-Ｌ-アルギニン-ｐ-ニトロアニ
リドアセテート）及びスペクトロジムＦＸａ（メトキシカルボニル-Ｄ-シクロヘ
キシルグリシル-Ｌ-グリシル-Ｌ-アルギニン-ｐニトロアニリドアセテート）は
、各々Boehringer Mannheim社及びAmerican Diagnostica社からである。基質Ｓ-
２２６６（Ｄ-バリル-Ｌ-ロイシル-Ｌ-アルギニン-ｐニトロアニリドジヒドロク
ロリド）、Ｓ-２２８８（Ｈ-Ｄ-イソロイシル-Ｌ-プロリル-Ｌ-アルギニン-ｐニ
トロアニリドジヒドロクロリド）、及びＳ-２３６６（Ｌ-ピログルタミル-Ｌ-プ
ロリル-Ｌ-アルギニン-ｐニトロアニリドヒドロクロリド）は、Pharmacia Hepar
社からである。基質Ｓ-２７６５（Ｎ-ａ-ベンジルオキシカルボニル-Ｄ-アルギ
ニル-Ｌ-グリシル-Ｌ-アルギニン-ｐニトロアニリドヒドロクロリド）は、Chrom
ogenix社から購入した。膜組織因子（ｍＴＦ）は組換え、全長（残基１〜２６３
）、ヒトＴＦを発現するヒトの胚腎細胞系（２９３）を超音波処理して調製した
（Paborsky,L.R.等, Protein Engineering, 3: 547-553 [1990]）。ＴＦ（１−
２４３）は細胞質ドメインを欠くＴＦであり、既に記載したように洗浄剤中で構
築し、精製して製剤化した（Paborsky, (1989) Biochemistry 28: 8072）。ＴＦ
（１−２４３）は、Bach等, (1986) Biochemistry 25: 4007-4020によって修正
されたMimms等, (1981) Biochemistry 20: 833の洗浄剤透析法を用いて、ホスフ
ァチジルコリン／ホスファチジルセリンの70/30混合物で複製した。ウシトリプ
シン、４−メチルウンベリフェリルｐ−グアニジノベンゾエート、及びＣＨＡＰ
ＳはSigma Chemicals社から購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、フラク
ションＶは、Calbiovhem社（La Jolla, CA）から得た。Ｎ^ａ-ベンゾイル-Ｌ-ア
ルギニン-ｐ-ニトロアニリドは、Bachem California社（Torrance, CA）から購
入した。ヒトのトロンボプラスチン（Innovin）は、Dade International社（Mia
mi, FL）から購入した。他の全ての試薬は商業的に入手できる最高級品とした。

【００６８】 実施例１ ｓＴＦファージライブラリの作成及び選別 Ｍ１３遺伝子ＩＩＩ産物のカルボキシル末端ドメイン（残基２４９−４０６）
に融合させたｓＴＦをコードするファージミドを、一価ファージ表示（Lowman,
H.B.等, (1991) Biochemistry 30: 10832; Lowman及びWells (1991) Methods in
Enz., 3: 205）で予め展開したベクター、ｐｈＧＨ-ｇ３から、標準的技術（Sa
mbrook等, (1989)「Molecular Cloning: A laboratory manual」, Cold Spring
Horbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を用いて作成した。これらのフ
ァージミドは、ｓＴＦ配列の末端にアンバー停止コドンを持ち、アンバー停止コ
ドンの抑制に機能するＸＬ-１ブルー（Stratagene）等の大腸菌株で発現された
ときにｓＴＦ−遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質が産生される。３３Ｂ６等の非サプ
レッサー株での発現に際しては、ｓＴＦのみが産生される。発現はアルカリホス
ファターゼプロモータの制御下であり、ｓｔＩＩシグナルが遺伝し産物の有効な
選択に使用された。ｐＴＦＡＡ-ｇ３と呼ばれる一つのファージミドが、位置１
６５及び１６６においてＬｙｓからＡｌａへの置換を含むｓＴＦ変異体をコード
し、ライブラリ１の作成のための出発テンプレートとして使用された。第２のフ
ァージミド、ｐＴＦ-ｇ３は野生型ｓＴＦをコードし、ライブラリ２の作成にお
いて使用された。

【００６９】 ライブラリ１作成物の調製において、オリゴヌクレオチド指向性、部位特異的
突然変異誘発（Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488）がファー
ジミドｐＴＦＡＡ-ｇ３に実施され、ＦＶＩＩａに対して顕著に低い親和性を持
つＴＦＡＡ変異体をコードするＤＮＡテンプレートが生成された。この方法は、
テンプレートＤＮＡからコードされたファージ導入ＴＦが、ＦＶＩＩａ結合性に
ついてライブラリ誘導ファージと競合しそうもなく、突然変異誘発が最適でない
ことを確認した。特に、ライブラリ１について、テンプレートファージミドは、
位置１６５及び１６６におけるＬｙｓからＡｌａへの置換に加えて、残基２０で
のＬｙｓからＡｌａへの置換（Ｋ２０Ａ）及び位置５８でのＡｓｐからＧｌｕへ
の置換（Ｄ５８Ｅ）をコードした。次いで、変更されたｐＴＦＡＡ-ｇ３テンプ
レートのオリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発を介して、５つのＴＦコドンを
ＮＮＳヌクレオチド配列（ここで、Ｎ＝Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃ；Ｓ＝Ｇ／Ｃ）で同時に
置換することにより変異体ライブラリが作成された。ライブラリ２については、
出発テンプレートはＬｅｕ１３３を置換するＴＡＡ停止コドンを持つｐＴＦ-ｇ
３であった。この方法は、非変異テンプレート配列から生じたクローンがｓＴＦ
-ｇ３融合タンパク質を発現しないことを確認した。ライブラリ１の作成のため
に、ｐＴＦＡＡ（Ｋ２０Ａ、Ｄ５８Ｅ）-ｇ３テンプレートにおいて各々位置２
０及び２１のコドン、及び位置５４、５６及び５８において同時に突然変異させ
るために２つのプライマーが使用された。ライブラリ２は、単一オリゴヌクレオ
チドプライマーを用いることによりコドン１３０、１３１、１３３、１３５及び
１４０の無作為化を持つテンプレートとしてｐＴＦ（１３３停止）-ｇ３を使用
した。ファージミドライブラリの大腸菌株ＸＬ１-ブルー（Stratagene）へのエ
レクトロポレーションによる糸状ファージ表示ｓＴＦ変異体の調製、及びそれに
続く細菌のヘルパーファージＶＣＳＭ１３（Stratagene）での感染は、記載され
ているように実施した（Lowman及びWells (1991) 上掲）。各非選択ライブラリ
からの少なくとも１０のクローンを、突然変異効率を確認するために配列決定し
た。ライブラリ１は、１ｘ１０^８の形質転換体を含み、クローンの約１０％が両
方の部位での突然変異を有していた。ライブラリ２は７．５ｘ１０^８の形質転換
体と６０％の突然変異頻度を有していた。

【００７０】 結合性向上。ｓＴＦ変異体を表示するファージ粒子を、ビオチニル化ＦＶＩＩ
ａ（ＢＥＧＲ-７ａ）に対する結合性に基づいて選別した。ＢＥＧＲ-７ａは、他
に記載されたように（Kelley等, (1995) Biochem. 34: 10383-10392）、ビオチ
ニル化トリペプチドクロロメチルケトン（ＢＥＧＲ-ＣＫ）活性部位阻害剤を用
いて調製した。ストレプトアビジン（分子プローブ）で被覆し牛乳タンパク質で
ブロックしたミクロタイタープレートのウェルを、ＢＥＧＲ-７ａの捕捉に使用
した。選択実験の為に、20mMのＴｒｉｓ、pH 7.5、100mMのＮａＣｌ、5mMのＣａ
Ｃｌ_２を含むバッファー（ＴＮＣ）中の、ＴＦ変異体ライブラリを表示するファ
ージを、ストレプトアビジン＋ＢＥＧＲ-７ａ又はストレプトアビジンのみのい
ずれかを含有するウェルでインキュベートした。室温で１−２時間のインキュベ
ーション後、未結合のファージを除去し、ウェルを0.05%ｍのＴｗｅｅｎ-２０を
含むＴＮＣバッファーで良く洗浄した。次いで結合したファージを、３７℃にお
ける１０分間のインキュベーションで50mMのＥＤＴＡを用いて溶離させた。ウェ
ルから溶離された感染性ＴＦ含有ファージ粒子の力価を、ＸＬ-１ブルー細胞を
溶離ファージで感染させ、（ＴＦコード化ファージミドを持つ細胞を選択するた
めに）希釈物をアンピシリン含有ＬＢプレートにストリークし、コロニー形成単
位（ＣＦＵ）を数えることにより測定した。ストレプトアビジンのみを含むウェ
ルから溶離した力価に対するＦＶＩＩａを含むウェルからのファージの力価（Ｃ
ＦＵ／ｍＬ溶離バッファー）の比率を計算し、特定の結合におけるラウンド毎の
向上を監視した。

【００７１】 ライブラリ１及び２の両方が、下記の表Ｉ及びＩＩに示すように、ＦＶＩＩａ
に対する特異的結合性の有意な向上を与えた。４ラウンドの選別後、ライブラリ
１からの１２の選択物にＤＮＡ配列決定を施して表Ｉに示すようなライブラリ位
置におけるアミノ酸配列を与えた。このライブラリから得たコンセンサス配列は
、残基５４における変異を除いて野生型とほぼ同一であった。これらの選択物を
、非サプレッサ株である大腸菌２７Ｃ７で発現させ、ｓＴＦタンパク質を免疫親
和性クロマトグラフィーにより精製し、既に記載されているように（Kelley等,
Biochemistry 34: 10383-10392 [1995]）ＦＶＩＩａに対する解離定数（ｋｄ）
を測定した。Ａｓｐ５４に置換したＳｅｒ又はＡｓｎを持つクローンは、ＦＶＩ
Ｉａに対する結合について約２倍高い親和性を与えた。

【００７２】 カッコ内の数字は選択したクローンの中で与えられた変異体が現れた回数を示す
。コンセンサス配列は、ＮＮＳベースのライブラリにおいて予測される無作為頻
度より有意に向上した（≧４倍）、各位置で選択された残基を反映する（Lowman
及びWells (1993) J. Mol. Biol. 234: 564）。キｈＴＦＡＡ及びその変異体につ
いての解離定数は、BIAcore装置を用いた固定化ＦＶＩＩａの結合についての速
度論的パラメータから決定した。ＮＤ＝未決定。 この位置は全く可変であり、
強いコンセンサスは観察されない。

【００７３】 表ＩＩに与えたアミノ酸配列を持つ７ラウンドの選別後のライブラリ２からの
選択物についてＤＮＡ配列を決定した。ライブラリ２の選別から得られたアミノ
酸配列は、ライブラリ１より多様であり、野生型配列とは全く異なる。位置１３
１及び１３５は全く可変であり、１３１に野生型残基は観察されなかった。野生
型ｓＴＦではＰｈｅであり、共晶においてＦＶＩＩａと接触し、アラニン-スキ
ャンニング突然変異誘発により結合性に重要である事が示された残基１４０は、
コンセンサスＡｓｎを与えた。全てのクローンは、共晶においてＦＶＩＩａに接
触する残基、Ｌｅｕ１３３に置換したＡｌａを有していた。Ａｓｐ１３０、Ｇｌ
ｎ１３１、Ａｌａ１３３、Ａｒｇ１３５、Ａｓｎ１４０のコンセンサス配列は、
ライブラリ２の選別から決定した。

【００７４】 表ＩＩ ７ラウンドの選別後の１０クローンにおける無作為化位置における残基の分布 （カッコ内の数字は、初期配列における当該位置において現れた与えられた残基
の数を示す。コンセンサス配列は、ＮＮＳベースのライブラリにおいて予測され
る無作為頻度より有意に向上した各位置で選択された残基を反映する。）

【００７５】 実施例２ ｈＴＦＡＡの作成及び特徴付け ＦＶＩＩＩａに対する結合親和性をさらに比較し、より高い抗凝固能力を持つ
ｈＴＦＡＡ変異体を作成するために、ｐＴＦＡＡ-ｇ３のオリゴヌクレオチド指
向性突然変異誘発によりＬｙｓ１６５Ａｌａ：Ｌｙｓ１６６Ａｌａ変異ｓＴＦに
おいて変異体を作成した。作成した変異体は、Ｌｙｓ１５Ａｌａ、Ｓｅｒ５４Ａ
ｌａ、及びＴｙｒ１８５、並びにライブラリ２コンセンサス配列Ａｓｐ１３０−
Ｇｌｎ１３１−Ａｌａ１３３−Ａｒｇ１３５−Ａｓｎ１４０の単一部位変異を含
んでいた。ライブラリ２コンセンサス配列と組み合わせたＬｙｓ１５Ａｌａ、Ｓ
ｅｒ５４Ａｌａ、Ｔｙｒ１８５Ａｌａ置換の一又は複数を有する変異体も作成し
た。ファージミドを、大腸菌Ｗ３１１０の誘導物である非サプレッサ株の大腸菌
株３３Ｂ６に、発現のために形質転換した。発酵タンク中の10L培地中に接種（1
%）するために終夜飽和培地を用いた。温度を３７℃ではなく３０℃にした以外
は、既に記載されているように（Carter, P.等, Bio/Technology 10: 163-167 [
1992]）発酵を行った。ｈＴＦＡＡタンパク質は、ｓｔＩＩシグナル配列により
細胞周辺腔に分泌された。接種後３２時間の遠心分離により細胞を収穫し、−２
０℃で凍結保存した。

【００７６】 ｈＴＦＡＡタンパク質を大腸菌細胞ペーストから抽出し、可溶性組織因子の変
異体について記載されているように（Kelley, R.F.等, Biochemistry 34: 10383
-10392 [1995]）、抗-ＴＦモノクローナル抗体（Ｄ３）カラム（Paborsky, L.R.
等, Biochemistry 28: 8072-8077 [1989]）上での免疫親和性クロマトグラフィ
ーによって精製した。この方法により、図１にＳＤＳ-ＰＡＧＥによって示すよ
うに高度に精製されたｓＴＦが得られた。精製されたｓＴＦタンパク質の濃度は
：１）Ｄ３抗体の検出（Lee, G.F.等, Biochemistry 36: 5607-5611 [1997]）、
及び２）吸収測定によって決定した。

【００７７】

【００７８】 実施例３ ｈＴＦＡＡ変異体によるＴＦ-ＦＶＩＩａ-依存性因子Ｘ活性化に対する平衡解離
定数の決定 ｍＴＦ・ＦＶＩＩａ複合体の触媒機能の阻害についてのｈＴＦＡＡ変異体の相
対的能力を、因子Ｘ活性化のアッセイを用いて評価した。このアッセイでは、Ｆ
ＸをｍＴＦ・ＦＶＩＩａの溶液に添加し、種々の時間にアリコートを取り出し、
カルシウムをキレートするためにＥＤＴＡを添加して反応を抑制し、次いでスペ
クトロザイムＦＸａ又はＳ-２７６５のいずれかのＦＸａ特異的基質を用いて形
成されたＦＸａの量を測定することによりＦＸａ形成の速度を測定する。これら
の基質のＦＸａ切断はカルシウムを必要とせず；405nMでの吸収測定により加水
分解を監視する。速度は、精製ＦＸａで作成した標準曲線を参照することにより
ＦＸａ濃度の計算に使用できる。ＦＸ活性化アッセイは、ミクロタイター形式で
実施し、吸収の変化は、Biometallics DeltaSoftIIソフトウエアを備えたMacint
osh SEコンピュータによって制御されたSLT EAR340Atプレートリーダーで監視し
た。KaleidaGraph v3.02（Synergy Software）を用いて非線形回帰分析を行った
。ＦＶＩＩａの貯蔵溶液の濃度は、ＴＦ７Ｉ-Ｃの定量化試料での活性部位滴定
により、ＦＶＩＩａに対する基質としてクロモジムｔ-ＰＡを用いて決定した。
ＴＦ７Ｉ-Ｃの濃度は、４-メチルウンベリフェリルｐ-グアニジノベンゾエート
を用いた活性部位滴定をされたトリプシンでの滴定により正確に決定されている
（Jameson, G.W.等, (1973) Biochem. J. 131: 107-117）。80nMのトリプシンに
50mMのＴｒｉｓ、pH 8.0、100mMのＮａＣｌ、10mMのＣａＣｌ_２、及び0.05%のTr
iton X-100中の希釈した阻害剤のアリコートを加えたものを、室温で１時間イン
キュベートした後、20μlの5mMのＮ^ａ-ベンゾイル-Ｌ-アルギニン-ｐ-ニトロア
ニリドを全容量150μlまで添加した。次いで405nmでの吸収の変化を監視した。
阻害剤とトリプシン又はＦＶＩＩａとの１：１の化学量論を仮定して濃度を決定
した。次いで、活性部位定量化したＦＶＩＩａの溶液への添加の際のクロモジム
ｔ-ＰＡ加水分解速度の増加からｍＴＦの濃度を決定した。ＦＸ及びＦＸａの濃
度は製造者から提供されたものである。

【００７９】 殆どの場合において、ｈＴＦＡＡ変異体に対する平衡阻害定数が、100pMのｍ
ＴＦ・ＦＶＩＩａ及び色素生産性基質スペクトロザイムＦＸａを用いて決定され
た。これらのアッセイは、20mMのＨＥＰＥＳ、pH 7.4、150mMのＮａＣｌ、0.1%
のＰＥＧ-８０００、及び5mMのＣａＣｌ_２のバッファー溶液を使用した。基質Ｆ
Ｘ濃度は200nMであり、反応混合物の全容量は200μLであった。ｈＴＦＡＡ変異
体の阻害特性の試験において、ｍＴＦの添加に先立って、ＦＶＩＩａをＦＸ及び
種々の濃度のｈＴＦＡＡ変異体とともに３７℃で３０分間インキュベートした。
ｍＴＦを添加した後、３７℃のインキュベーションを続け、ｍＴＦ添加の１、２
、３、４、５、７．５、及び１０分後に反応混合物の25μＬアリコートを取り出
し、等容量の50mMのＥＤＴＡと混合してＦＸの活性化を停止させた。形成された
ＦＸａの量は、因子Ｘａバッファー（10X = 0.2MのＨＥＰＥＳ、pH 7.4、1.5Mの
ＮａＣｌ、0.25MのＥＤＴＡ、1%のＰＥＧ-８０００）を最終濃度1Xまで添加し、
次いで0.5mMのスペクトロザイムＦＸａを添加することにより測定した。各々の
時点での最終容量は200μLであり、スペクトロザイムＦＸａ加水分解の速度は、
室温での405nmにおける吸収変化によって監視し、mOD／分で報告した。

【００８０】 より能力のあるｈＴＦＡＡ変異体による阻害を試験するためには、より高感度
のアッセイが要求された。これらのアッセイは25pMのｍＴＦ／ＦＶＩＩａを採用
し、ＦＸａの定量化にＳ-２７６５を使用した。反応バッファーは20mMのＥＰＰ
Ｓ、pH 8.2、100mMのＮａＣｌ、5mMのＣａＣｌ_２、0.1%のＢＳＡであった。アッ
セイは、ＦＸａの基質として0.5mMのＳ-２７６５を使用したこと、及び吸収測定
を３７℃で実施したことを除いて上記のように行った。ＦＸａのアッセイ用バッ
ファーは、20mMのＥＰＰＳ、pH 8.2、150mMのＮａＣｌ、0.1%のＢＳＡ、25mMの
ＥＤＴＡであった。

【００８１】 ＦＸ活性化の阻害に対する見かけの平衡解離定数（Ｋｉ*）は、阻害剤濃度を
変えたアッセイから決定した。精製ＦＸａ（Hematech）によるスペクトロザイム
ＦＸａ加水分解について標準曲線を作成し、各時点で観察された加水分解速度を
生成されたＦＸａ濃度に変換できるようにした。次いで、これらのデータを、最
小自乗線形回帰により分析し、各濃度の阻害剤についてのＦＸａ生成の初期速度
を計算した。初期速度を非阻害速度と比較して、各阻害剤濃度についてのＦＸ活
性化の速度分数（fractional rate）を得た。等式１を用いた非線形回帰分析を
、これらのデータからＫｉ*を決定するのに使用した。データ、及び非線形回帰
分析から計算した曲線を、ｈＴＦＡＡ、Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１３３ｃｏｎｓ−Ｔ
ｙｒ１８５Ａｌａ−ｈＴＦＡＡ、及びＬｙｓ１５Ａｌａ−Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１
３３ｃｏｎｓ−Ｔｙｒ１８５Ａｌａ−ｈＴＦＡＡについて図２に示した。

【００８２】 これらの値、並びに他のｈＴＦＡＡに関する値を、ｈＴＦＡＡの値に比較して
表ＩＶに示す。

【００８３】 これらの結果は、Ｌｙｓ１５Ａｌａ−Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１３３ｃｏｎｓ−Ｔ
ｙｒ１８５Ａｌａ−ｈＴＦＡＡが、ｈＴＦＡＡについて測定された値に比較して
３６倍向上したＦＶＩＩａに対する親和性を持つことを示した。この変異体につ
いて観察された親和性は、単一部位突然変異から添加剤寄与（Wells, (1990) Bi
ochemistry 29: 8509-8517）に基づいて予測されたものにほぼ等しい。単一部位
突然変異及びライブラリ２コンセンサス配列について観察された倍数増加の乗算
は、親和性における４０倍の向上と計算された。 等式１： この等式中、［Ｅ_０］は酵素濃度であり、［Ｉ_０］は阻害剤濃度であり、Ｖiは
［Ｉ_０］の存在下におけるＦＸａ生成の初期速度であり、そしてＶ_０は阻害剤不
在下における初期速度である。

【００８４】 実施例４ 血液凝固アッセイ ｈＴＦＡＡ、Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１３３ｃｏｎｓ−Ｔｙｒ１８５Ａｌａ−ｈＴ
ＦＡＡ、及びＬｙｓ１５Ａｌａ−Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１３３ｃｏｎｓ−Ｔｙｒ１
８５Ａｌａ−ｈＴＦＡＡの阻害能力を、種々の濃度の各阻害剤を血漿に添加し、
凝固介しにイノビン(Innovin)（Dade）ヒトトロンボプラスチンを用いたプロト
ロンビン時間（ＰＴ）を測定することにより比較した。凝固時間は、ACL 300 Re
search Coagulation分析機を使用して測定した。プロトロンビン時間（ＰＴ）ア
ッセイでは、インキュベーション時間を１２０秒および獲得時間を６００秒に設
定した。クエン酸添加正常ヒト血漿及び阻害剤を合わせて室温で１０分間インキ
ュベーションした後にアッセイした。試料（血漿及び阻害剤）の一部100μL及び
トロンボプラスチン溶液50μLを、３７℃で２分間インキュベーションした後に
自動的に混合した。凝固時間は光学的評価によって決定した。

【００８５】 図３に示すＰＴアッセイにおいて、Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１３３ｃｏｎｓ−Ｔｙ
ｒ１８５Ａｌａ−ｈＴＦＡＡ及びＬｙｓ１５Ａｌａ−Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１３３
ｃｏｎｓ−Ｔｙｒ１８５Ａｌａ−ｈＴＦＡＡの両方共がｈＴＦＡＡより大きな凝
固阻害能力を与えた。 10μMのｈＴＦＡＡ、1.5μＭのＳ５４-１３３ｃｏｎｓ-Ａ１８５-ｈＴＦＡＡ、
又は0.8μMのＡ１５-Ｓ５４-１３３ｃｏｎｓ-Ａ１８５-ｈＴＦＡＡで、２倍に延
長された凝固時間が得られた。これらのデータは、ｈＴＦＡＡのＦＶＩＩａに対
する親和性の向上が抗凝固効果の向上をもたらすことを示している。

【００８６】 実施例５ 深部内側創傷のウサギモデルにおける抗血栓能力の測定 雄性ニュージーランド白色ウサギ（〜4kg）をケタミン／キシラジンのＩＭ注
射で麻酔して外科的麻酔相(plane)とする。ウサギを拘束ボードに仰臥位に固定
し、３７℃に加温し、頚部と大腿内側を剃毛する。テフロンカテーテルを耳辺縁
静脈および大腿動脈に各々薬剤（ＴＦ変異体及び対照物）送達及び試料採取のた
めに装着する。処置前に凝固試験（ＡＰＴＴおよびＰＴ）のために血液試料を採
取する。後肢の爪の小皮に作った切創から出血時間を評価する。頚部領域を切開
し、左総頚動脈とその分枝を外科的に露出させる。超音波流動プローブ（Transo
nics（登録商標））を共通の−内側分岐から約５ｃｍ尾側の総頚動脈に装着する
。血流が安定なベースラインに到達した後、薬剤（塩水又は試験化合物）を耳辺
縁静脈を通して送達する。次いで、収縮させた塞栓切除カテーテル（Fogarty（
登録商標）、3F）を舌枝の切開部を介して総頚動脈の内腔に導入する。動脈を通
過する血流を一次的に止め、カテーテルを挿入して２−０シルクタイで切開部に
緩く固定する。カテーテルを配置して固定した後に、血流を再開する。収縮バル
ーンを血流プローブの２ｍｍ以内まで進め、血管壁の抵抗が感じられるまで食塩
水で膨張させる。カテーテルを定速で第一の分岐点まで後退させ、次いで収縮さ
せる。

【００８７】 この操作を各実験動物で数回繰り返し、その後カテーテルを除去する。カテー
テル初回挿入から除去までのバルーン操作は約３分から５分を要し、長さ１．５
から２ｃｍの損傷領域をもたらす。４０分間に渡りＰＴ測定のために血液試料を
取り出し、小皮出血時間を評価し、頚動脈を流れる血流を監視する。開存時間は
、動脈に測定可能な血流が検出される全時間長（最大値＝４０分間）として定義
する。開存率は、頚動脈血流≧５分間を示す試験動物のパーセントを示す。 実験終了時、ウサギを安楽死させ、頚動脈を摘出して切開する。血栓が存在す
れば取り出してブロットし、重量を記録する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 残基１６５及び１６６にアラニン置換を有するヒト組織因子タン
パク質変異体（ｈＴＦＡＡ）は、大腸菌細胞ペーストから抽出し、抗-ＴＦモノ
クローナル抗体（Ｄ３）カラム（Paborsky, L.R.等, (1989) Biochemistry 28:
8072-8077）上での免疫親和性クロマトグラフィーにより、可溶性組織因子の変
異体について記載されているように精製した（Kelley, R.F.等, (1995) Biochem
istry 34: 10383-10392）。この方法は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥによって図１に示すよ
うに、ｓＴＦタンパク質を高度に精製した。レーン１−Ｌｙｓ１５Ａｌａ−ｈＴ
ＦＡＡ、レーン２−Ｔｙｒ１８５Ａｌａ−ｈＴＦＡＡ、レーン３−１３３ｃｏｎ
ｓ−ｈＴＦＡＡ、レーン４−Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１３３ｃｏｎｓ−ｈＴＦＡＡ、
レーン５−Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１３３ｃｏｎｓ−Ｔｙｒ１８５Ａｌａ−ｈＴＦＡ
Ａ、レーン６−Ｌｙｓ１５Ａｌａ−Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１３３ｃｏｎｓ−Ｔｙｒ
１８５Ａｌａ−ｈＴＦＡＡ、レーン７−Ｂｉｏ-Ｒａｄ前染色ＳＤＳ-ＰＡＧＥ標
準品、低範囲、レーン−８−ｈＴＦＡＡ。

【図２】 ＦＸ活性化の阻害についての見かけの平衡解離定数（Ｋｉ*）は
、阻害薬濃度を変えたアッセイから決定した。等式１を用いた非線形回帰分析を
、これらのデータからＫｉ*を決定するのに使用した。データ、及び非線形回帰
分析から計算した曲線は、ｈＴＦＡＡ（配列番号：３）、Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１
３３ｃｏｎｓ−Ｔｙｒ１８５Ａｌａ−ｈＴＦＡＡ（配列番号：９）、及びＬｙｓ
１５Ａｌａ−Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１３３ｃｏｎｓ−Ｔｙｒ１８５Ａｌａ−ｈＴＦ
ＡＡ（配列番号：１０）について図２に示した。

【図３】 Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１３３ｃｏｎｓ−Ｔｙｒ１８５Ａｌａ−ｈＴ
ＦＡＡ（配列番号：９）、及びＬｙｓ１５Ａｌａ−Ａｓｐ５４Ｓｅｒ−１３３ｃ
ｏｎｓ−Ｔｙｒ１８５Ａｌａ−ｈＴＦＡＡ（配列番号：１０）は、図３に示した
ＰＴアッセイにおいてｈＴＦＡＡ（配列番号：３）よりも強力な凝固阻害を与え
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/46 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (71)出願人 460 Ｐｏｉｎｔ Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ Ｂｌｖｄ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａ ｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94080 ＵＳＡ (72)発明者 リー，ジェフリー，エフ． アメリカ合衆国 コロラド 80301，ボル ダー，サウス ハンプトン サークル 4694

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物組織因子タンパク質から誘導され、Ａｓｐ５４、Ｇ
   ｌｕ５６、Ｇｌｕ１３０、Ａｒｇ１３１、Ｌｅｕ１３３、Ａｒｇ１３５及びＰｈ
   ｅ１４０からなる群から選択されるヒトアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の
   少なくとも１つが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、ＦＶＩＩ／Ｆ
   ＶＩＩａに対して、それが誘導された哺乳動物組織因子より大きな親和性を持つ
   組織因子タンパク質変異体。
2. 【請求項２】 Ａｓｐ５４及びＧｌｕ５６からなる群から選択されるアミノ
   酸残基の少なくとも１つ、及びＧｌｕ１３０、Ａｒｇ１３１、Ｌｅｕ１３３、Ａ
   ｒｇ１３５及びＰｈｅ１４０からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくと
   も１つが他のアミノ酸に置換された、請求項１に記載の組織因子タンパク質変異
   体。
3. 【請求項３】 Ａｓｐ５４に対する他のアミノ酸残基がＬｙｓ、Ａｓｎ、Ｇ
   ｌｕ、Ａｌａ及びＳｅｒからなる群から選択され、Ｇｌｕ５６に対する他のアミ
   ノ酸残基がＡｓｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ及びＴｒｐからなる群から選択され、Ｇｌｕ
   １３０に対する他のアミノ酸残基がＡｓｐ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＧｌｙからなる
   群から選択され、Ａｒｇ１３１に対する他のアミノ酸残基がＧｌｎ、Ｉｌｅ、Ｐ
   ｒｏ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ及びＭｅｔからなる群から選択され、Ｌ
   ｅｕ１３３に対する他のアミノ酸残基がＡｌａであり、Ａｒｇ１３５に対する他
   のアミノ酸残基がＴｒｐ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ及びＡｌａからなる
   群から選択され、及びＰｈｅ１４０に対する他のアミノ酸残基がＡｓｎ、Ｈｉｓ
   、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｒｇ及びＧｌｙからなる群から選択される、請求項２に記
   載の組織因子タンパク質変異体。
4. 【請求項４】 Ａｓｐ５４に対する他のアミノ酸残基がＳｅｒであり、Ｇｌ
   ｕ１３０に対する他のアミノ酸残基がＡｓｐ、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から
   選択され、Ａｒｇ１３１に対する他のアミノ酸残基がＧｌｎであり、Ａｒｇ１３
   ５に対する他のアミノ酸残基がＴｒｐ及びＧｌｎからなる群から選択され、及び
   Ｐｈｅ１４０に対する他のアミノ酸残基がＡｓｎである、請求項３に記載の組織
   因子タンパク質変異体。
5. 【請求項５】 アミノ酸残基Ａｓｐ５４、Ｇｌｕ１３０、Ａｒｇ１３１、Ｌ
   ｅｕ１３３、及びＰｈｅ１４０が置換された、請求項４に記載の組織因子タンパ
   ク質変異体。
6. 【請求項６】 Ｇｌｕ１３０に対する他のアミノ酸残基がＡｓｐである、請
   求項５に記載の組織因子タンパク質変異体。
7. 【請求項７】 他のアミノ酸残基に置換されたＬｙｓ１５及びＴｙｒ１８５
   からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも１つをさらに有する、請求
   項１に記載の組織因子タンパク質変異体。
8. 【請求項８】 Ｌｙｓ１５及びＴｙｒ１８５におけるアミノ酸置換を有する
   、請求項７に記載の組織因子タンパク質変異体。
9. 【請求項９】 Ｌｙｓ１５及びＴｙｒ１８５に対する他のアミノ酸残基がＡ
   ｌａである、請求項８に記載の組織因子タンパク質変異体。
10. 【請求項１０】 哺乳動物組織因子タンパク質がヒト組織因子タンパク質で
    ある、請求項１に記載の組織因子タンパク質変異体。
11. 【請求項１１】 ヒト組織因子タンパク質が配列番号：１である、請求項１
    ０に記載の組織因子タンパク質変異体。
12. 【請求項１２】 組織因子タンパク質変異体が、ヒト組織因子タンパク質の
    アミノ酸配列において少なくとも１つの他のアミノ酸残基の置換を有する、請求
    項１０に記載の組織因子タンパク質変異体。
13. 【請求項１３】 組織因子タンパク質変異体が、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ結合
    にエネルギー的に寄与する、又はＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ補因子活性に寄与するア
    ミノ酸残基におけるアミノ酸置換をさらに有する、請求項１２に記載の組織因子
    タンパク質変異体。
14. 【請求項１４】 ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ補因子活性に必要なアミノ酸残基が
    、Ａｓｐ４４、Ｔｒｐ１５８、Ｓｅｒ１６３、Ｇｌｙ１６４、Ｌｙｓ１６５及び
    Ｌｙｓ１６６からなる群から選択される、請求項１３に記載の組織因子タンパク
    質変異体。
15. 【請求項１５】 ＦＶＩＩａ補因子活性に必要なアミノ酸残基が、Ｓｅｒ１
    ６３及びＧｌｙ１６４からなる群から選択される、請求項１４に記載の組織因子
    タンパク質変異体。
16. 【請求項１６】 Ｓｅｒ１６３及びＧｌｙ１６４がＡｌａに置換された、請
    求項１５に記載の組織因子タンパク質変異体。
17. 【請求項１７】 ヒト組織因子タンパク質が配列番号：２である、請求項１
    ４に記載の組織因子タンパク質変異体。
18. 【請求項１８】 製薬的に許容される賦形剤と、請求項１に記載の組織因子
    タンパク質変異体とを含んでなる医薬品組成物。
19. 【請求項１９】 製薬的に許容される賦形剤と、請求項１２に記載の組織因
    子タンパク質変異体とを含んでなる医薬品組成物。
20. 【請求項２０】 ヒト因子ＶＩＩ／ＶＩＩａ（ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ）凝血
    原活性を阻害する方法において、前記ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａを、前記ＦＶＩＩ／
    ＦＶＩＩａの凝血原活性を阻害するのに有効な量の請求項１２に記載の組織因子
    タンパク質変異体と接触させることを含んでなる方法。
21. 【請求項２１】 哺乳動物におけるヒト組織因子ＶＩＩａ（ＴＦ−ＦＶＩＩ
    ａ）凝血原活性を阻害する方法において、治療的有効量の請求項１９に記載の組
    成物を哺乳動物に投与することを含んでなる方法。
22. 【請求項２２】 組成物を血栓溶解剤と組み合わせて投与することをさらに
    含む、請求項１９に記載の方法。
23. 【請求項２３】 組成物を抗凝固剤と組み合わせて投与することをさらに含
    む、請求項１９に記載の方法。
24. 【請求項２４】 因子ＶＩＩａの阻害が示されている哺乳動物を治療する方
    法において、治療的有効量の請求項１９に記載の組成物を哺乳動物に投与するこ
    とを含んでなる方法。
25. 【請求項２５】 請求項１に記載の組織因子タンパク質変異体をコードする
    、単離されたＤＮＡ分子。
26. 【請求項２６】 ＤＮＡ分子に作用可能に結合した発現調節配列をさらに含
    む、請求項２５に記載のＤＮＡ分子。
27. 【請求項２７】 請求項２６に記載のＤＮＡ分子を含んでなり、調節配列が
    当該ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される発現ベクター。
28. 【請求項２８】 請求項２７に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
29. 【請求項２９】 請求項２８に記載の宿主細胞を、組織因子タンパク質変異
    体の発現に適した条件下で培養することを含んでなる、組織因子タンパク質変異
    体をコードするＤＮＡ分子を発現させる方法。
30. 【請求項３０】 培養培地から組織因子タンパク質変異体を回収することを
    さらに含む、請求項２９に記載の方法。