JP2002515245A

JP2002515245A - プロテインｚ依存性プロテアーゼインヒビター

Info

Publication number: JP2002515245A
Application number: JP2000549733A
Authority: JP
Inventors: ブローズ，ジョージ・ジェイ，ジュニア
Original assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1998-05-19
Filing date: 1999-05-13
Publication date: 2002-05-28
Also published as: WO1999060126A3; US20020183254A1; WO1999060126A9; EP1078061A2; US6265378B1; US6271367B1; US20040186053A1; WO1999060126A2; US6841534B2; CA2328605A1; US6245741B1; US6369031B1; AU3860299A

Abstract

(57)【要約】本開示は約７２ｋＤａの分子量を持ち、ＬＡＰＳＰＱＳＰＥＴＰＡのＮ末端アミノ酸配列を持つ単鎖タンパク質であり、およびヒトプロテインＺ（ＰＺ）、カルシウムイオンおよびセファリン存在下で第Ｘａ因子の迅速な阻害を引き起こすとして特徴付けられる、血漿からの新規ヒトプロテインＺ依存性プロテアーゼインヒビター（ＺＰＩ）の精製および単離を記載している。本開示はさらに、ヒトｃＤＮＡライブラリーからのＺＰＩｃＤＮＡの単離およびクローニングを記載している。ＺＰＩｃＤＮＡは２．４４ｋｂの長さであり、４２３残基成熟ＺＰＩタンパク質および２１残基シグナルペプチドをコード化している読み取り枠を持っている。ＰＺ、ＺＰＩおよびＰＺおよびＺＰＩの組み合わせが血液凝固を阻害するために使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願本出願は１９９８年５月１９日に出願された出願番号第６０／０８６，５７１
号の一部継続出願である。

【０００２】本発明は米国国立保健研究所により与えられた基金番号ＨＬ３４４６２および
ＨＬ６０７８２の政府援助により一部が行われた。政府は本発明に対してある種
の権利を持っている。

【０００３】技術分野本発明は四つの古典的凝固因子（第ＩＩ、第ＶＩＩ、第ＩＸおよび第Ｘ因子）
、プロテインＣ、プロテインＳのようなビタミンＫ依存性血漿タンパク質の分野
、およびより特別にはヒトプロテインＺ（ＰＺ）に関している。

【０００４】背景技術［注：以下の背景技術情報および当業者にはよく知られている通常の試験法お
よび実験法に関する、および本明細書に使用されているようなその他の最先端の
技術に関する参考文献は括弧内の数字により示されており、本明細書の最後に付
記されている。］ビタミンＫは凝固に関係する多くの血漿タンパク質：プロトロンビン、第ＶＩ
Ｉ、第ＩＸ、第Ｘ因子、プロテインＣおよびプロテインＳ、に存在するガンマカ
ルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）の翻訳後形成に必要である（１、２）。これら
のタンパク質におけるＧｌａ仲介カルシウムイオン結合はそれらとリン脂質表面
との会合に必須であり、それらの止血機能に決定的である（３）。１９７７年に
、ＰｒｏｗｓｅおよびＥｓｎｏｕｆはウシ血漿中を循環している追加のビタミン
Ｋ依存性タンパク質を同定し、プロテインＺ（ＰＺ）と名付けた（４）。最初は
ウシ第Ｘ因子の単鎖形と考えられていたが、後になってウシＰＺは別のＧｌａ含
有タンパク質であると同定された（５、６）。ウシＰＺのヒト相対物が１９８４
年に単離された（７）。

【０００５】ヒトＰＺは〜２．５日の血漿半減期を持つ分子量６２，０００の糖タンパク質
である（８）。血液供給者の血漿ＰＺレベルは、ＥＤＴＡ抗凝固試料で２．９±
１．０μｇ／ｍＬの平均濃度（クエン酸血漿では〜２．６μｇ／ｍＬに相当する
）ではある広範囲に広がっていた（８）。ＰＺのアミノ末端の半分は第ＶＩＩ、
第ＩＸおよび第Ｘ因子と非常に相同的であり（４０−５０％）、Ｇｌａドメイン
、二つのＥＧＦ様ドメインおよびセリンプロテアーゼ酵素前駆体に存在する触媒
ドメインの同族体へ連結する領域を含んでいる。しかしながら、ＰＺのカルボキ
シ末端においては、典型的な”活性化”部位の周りの領域がなく、触媒三連構造
のＨｉｓおよびＳｅｒ残基が欠けている（Ａｓｐ残基は保存されている）（９、
１０）。

【０００６】ＭａｃＤｏｎａｌｄら（１１）は最近、ホスファチジルコリン／ホスファチジ
ルセリン（ＰＣ／ＰＳ＝７５％／２５％）小胞へのヒトおよびウシＰＺの結合動
力学は他のビタミンＫ依存性凝固因子と異なっていることを報告している。ｋ_as _sn （１０^-5ｓ^-1Ｍ^-1）およびｋ_dssn（Ｓ^-1）速度定数は、ウシＰＺで１．９５お
よび０．００６３、およびヒトＰＺで３．３６および０．０５７である。これら
の定数の値を比較すると、ウシプロトロンビンでは各々１７６．０および１．９
である。従って、ウシおよびヒトＰＺの会合および解離速度定数はプロトロンビ
ンよりも劇的に遅く、リン脂質からのウシＰＺの解離はヒトＰＺよりも著しく遅
い。

【０００７】発明の簡単な説明本発明はヒトプロテインＺ（ＰＺ）および新規ヒトプロテインＺ依存性インヒ
ビター（ＺＰＩ）に関している。

【０００８】本発明の一つの態様に従うと、新規ヒトプロテインＺ依存性プロテアーゼイン
ヒビター（ＺＰＩ）が血漿から精製および単離され、構造的におよび生物学的に
特徴付けられる。ＺＰＩは分子量７２，０００、初めはＬＡＰＳＰＱＳＰＥＸＸ
Ａ（Ｘ＝確定されていない基）と決定されたＮ末端アミノ酸を持つ単鎖タンパク
質である。３７ＣＦＲ §１．８２１−１．８２５による慣用３文字アミノ酸記
号を用いると、Ｎ末端配列は次のとおりである：ＬｅｕＡｌａＰｒｏＳｅｒＰｒｏＧｌｎＳｅｒＰｒｏＧｌｕ
１５
ＸａａＸａａＡｌａ［配列番号：１］１０この配列は公的に利用できるタンパク質またはＤＮＡデータベースで入手可能な
配列とは一致せずまた有意な相同性を示さなかった。従って、ＺＰＩは新規タン
パク質であると思われる。

【０００９】ＺＰＩは約１．０から１．６μｇ／ｍＬのクエン酸血漿濃度であると見積もら
れた。精製された成分を用いた系において、ＺＰＩにより引き起こされるＸａ因
子阻害は迅速であり（バイオアッセイによると１分以内で＞９５％）、ヒトプロ
テインＺ、カルシウムイオンおよびセファリンの存在を必要とした。阻害過程に
はリン脂質表面でのＸａ因子−ＰＺ−ＺＰＩ複合体形成が含まれているようであ
る。

【００１０】本発明の別の態様ではＺＰＩをさらに特徴付けるため、ヒト肝臓ｃＤＮＡライ
ブラリーからそのｃＤＮＡが単離され、クローン化された。ＺＰＩｃＤＮＡは
２．４４ｋｂの長さであり、６つの可能なＡＴＧ翻訳開始コドンを含む比較的長
い５’領域（４６６ｎｔ）を持っている。ＡＴＧの１から４には短い読み取り枠
が続いており、一方、ＡＴＧ₅およびＡＴＧ₆はコード化されたＺＰＩタンパク質
を含む中断されない１３３５ｂｐの読み取り枠内に存在する。推定される４４４
アミノ酸のＺＰＩタンパク質は典型的な２１残基シグナルペプチドを持ち、それ
に精製されたタンパク質のＮ末端配列が続いている（その中で、配列番号：１で
最初は確定されなかった残基１０および１１は配列番号：８のように、各々スレ
オニンおよびプロリンである）。

【００１１】インビトロ実験は、ＡＴＧ₆は培養チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細
胞でのｒＺＰＩの発現に十分であることを示している。ノーザン分析は肝臓がＺ
ＰＩ合成の主たる部位であることを示唆している。

【００１２】成熟ＺＰＩタンパク質の予想される４２３残基アミノ酸配列はプロテアーゼイ
ンヒビターのセルピンスーパーファミリー構成物と２５−３５％相同であり、以
前に報告されているラット肝臓から単離されたｃＤＮＡにより予想されるアミノ
酸配列、再生関連セルピンタンパク質−１（ｒａｓｐ−１）と７８％同一である
。

【００１３】ＺＰＩのアミノ酸配列と他のセルピンの配列を並べると、Ｔｙｒ３８７（Ｙ３
８７）はＺＰＩ分子の反応中心のＰ₁残基であることが予想される。この考えと
一致して、チロシン３８７がアラニンに変更されているＺＰＩの変異型、ｒＺＰ
Ｉ（Ｙ３８７Ａ）はＰＺ依存性第Ｘａ因子阻害活性を欠いている。

【００１４】本発明のさらに別の態様において、ＰＺ、ＺＰＩおよびＰＺおよびＺＰＩの組
み合わせが血液凝固の阻害剤として使用される。上に示したように、これはＰＺ
およびＺＰＩが凝固の阻害を引き起こすことを示している最初の研究である。本
研究はまたＰＺがＺＰＩ非存在下でも凝固を阻止できることも示している（図５
）。

【００１５】発明の詳細な説明本明細書は本発明を形成すると考えられる主題を特に指摘しおよび明白に特許
請求している特許請求の範囲で締めくくられているが、付随する図と関連させた
以下の本発明の好適な実施態様から本発明がよりよく理解されるであろうと思わ
れる。

【００１６】本発明をより詳細に例示するため、以下の具体的な実験室実験が実施された。
具体的な実施例がここに例示されているが、本発明はこれらの具体的な例示的実
施例またはそこに記載されている細部には制限されないことを理解されたい。

【００１７】

【実施例】

実施例Ｉヒト血漿からのＺＰＩの精製および単離材料および方法材料：ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｔｒｉ
ｚｍａＢａｓｅ、ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）、トリトンＸ−
１００、トゥイーン２０、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ポリエチレン
グリコール（８，０００ＭＷ）、ＳＦａｓｔＦｌｏｗ、ウシ血清アルブミ
ンおよびウサギ脳セファリンはＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。Ｍｏｎｏ−Ｑ、Ｍｏｎｏｌ−Ｓおよびヘパリ
ン−セファロースはＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａ
ｙ，ＮＪ）から購入された。ポリアクリルアミドゲル電気泳動のための低分子量
標準品はＢｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ
）から、およびプロテインＡ−アガロースはＲｅｐｌｉｇｅｎ（Ｃａｍｂｒｉｄ
ｇｅ，ＭＡ）から入手した。ＳｐｅｃｔｒａｚｙｍｅＸａ（ＭｅＯ−ＣＯ−Ｄ
−ＣＨＧ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．ＡｃＯＨ）はＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃａ，Ｉｎｃ．（Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）からのものであった。

【００１８】血漿／血清：第Ｘ因子欠損血漿はＧｅｏｒｇｅＫｉｎｇＢｉｏｍｅｄ
ｉｃａｌ（ＯｖｅｒｌａｎｄＰａｒｋ，ＫＳ）から購入された。血清を製造す
るため、新鮮血を３７℃で１時間放置して凝血させ、凝血塊を縁につけ、血清を
遠心分離後（１０，０００ｇ、２０分）に集めた。バリウム吸着血清はシュウ酸
ナトリウム（１０ｍＭ最終濃度）を加え、硫酸バリウムによる２回の連続吸着（
１００ｍｇ／ｍＬ、４℃、３０分）により製造した。モノクローナル抗体サンド
イッチ免疫アッセイ（８）によると、バリウム吸着血清は０．１０μｇ／ｍＬの
ＰＺを含んでいた。

【００１９】タンパク質：アルファ−１−抗トリプシンはＳｉｇｍａから、アルファ−
２−抗プラスミンおよびトロンビンはＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ａ，Ｉｎｃ．から、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）はＥｎｚｙｍｅＲｅ
ｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＳｏｕｔｈＢｅｎｄ，ＩＮ）から
、および抗トロンビンＩＩＩはＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘＡＢ（Ｍｏｌｎｄａｌ
，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入された。アルファ−２−マクログロブリンはＡ．Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚ（ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ）から贈与されたものであり、ヘパリン補因子ＩＩはＤ．Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ
（ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から贈与されたものであった
。インター−アルファ−トリプシンインヒビターは以前に記載されているように
精製された（１２）。プロトロンビンおよび第Ｘ因子は精製され、第Ｘａ因子は
以前に記載されているように（１３）ラッセルクサリヘビ蛇毒からの不溶化Ｘ−
凝固タンパク質を用いて精製第Ｘ因子から生成された。追加の第Ｘａ因子はＥｎ
ｚｙｍｅＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入された。

【００２０】ＰＺはクエン酸添加新鮮凍結血漿（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ−Ｉｌｌｉｎｏｉｓ地域
赤十字）から、クエン酸バリウム吸着−溶出、硫酸アンモニウム分画化、モノク
ローナル抗体抗ＰＺイムノアフィニティークロマトグラフィーおよびＭｏｎｏ−
Ｑアニオン交換クロマトグラフィーを含む４工程精製法を用いて単離された。ト
ロンビン切断ＰＺ（ＰＺ_T）は０．１ＭＮａＣｌ、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ
、ｐＨ８．０中、１ｍｇ／ｍＬのＰＺを３００Ｕ／ｍＬのトロンビンと３７℃で
３時間インキュベートすることにより生成させた。この溶液をＤＦＰ（５ｍＭ
最終濃度）で処理した後、同一の緩衝液を用いてＣＧ−５０の小さなカラムを通
過させてトロンビンを除去した（７）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ−Ｐｌｕ
ｓ膜（ＭｉｃｒｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕ
ｇｈ，ＭＡ）へ移し、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ（ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により気相シークエンシ
ング（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ
）すると、ＰＺ_T（〜５６，０００ＭＷ）のＮ末端アミノ酸配列はＲＹＫＧＧ
ＳＰＸＩＳＱＰＸＬ（Ｘ＝確定されていない基）である。３７ＣＦＲ §１．８
２１−１．８２５による慣用３文字アミノ酸記号を用いると、この配列は次のと
おりである：ＡｒｇＴｙｒＬｙｓＧｌｙＧｌｙＳｅｒＰｒｏＸａａＩｌｅ
１５ＳｅｒＧｌｎＰｒｏＸａａＬｅｕ［配列番号：２］１０このアミノ酸配列は成熟タンパク質の残基４４で始まっているＰＺの配列と同じ
である。従って、トロンビンはＡｒｇ４３の後でＰＺを切断し、それにより、Ｇ
ｌａドメインを分子の残りの部分から分離するようである。

【００２１】一段階、第Ｘａ因子誘導凝固アッセイ：セファリン（７５μＭ）５０μＬ
、５０μＬのＣａＣｌ₂（２５ｍＭ）、５０μＬのＰＺまたはＰＺ_T（１６０ｎＭ
）および５０μＬの第Ｘａ因子（０．５ｎＭ）をフィブロメーター（ＢＢＬ，Ｃ
ｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の試料カップ中、３７℃でインキュベートする
。２分後、５０μＬの第Ｘ因子欠損血漿を加え、凝固時間を測定する。ある種の
試験ではＰＺまたは第Ｘａ因子が前インキュベーション期間の色々な時点で加え
られ、セファリンまたはＰＺ試薬が第Ｘ因子欠損血漿とともに（１：１混合物を
１００μＬ）反応液へ加えられた。見かけの第Ｘａ因子活性は、ＰＺ不在下で種
々の濃度の第Ｘａ因子を用いて作製された標準曲線と凝固時間を比較することに
より決定された。

【００２２】第Ｘａ因子バイオアッセイ：セファリン（７５μＭ）５０μＬ、５０μＬ
のＣａＣｌ₂（２５ｍＭ）および０．１ＭＮａＣｌ、０．０５ＭＨＥＰＥＳ
を含んでいる５０μＬの緩衝液（ｐＨ７．４）、およびウシ血清アルブミン（１
ｍｇ／ｍＬ）（ＨＳＡ）を３７℃でインキュベートする。３０秒後、１ｍＭＥ
ＤＴＡを含むＨＳＡに希釈した５０μＬの試料を加え、続いてすぐに５０μＬの
第Ｘａ因子欠損血漿を加える。見かけの第Ｘａ因子活性は、凝固時間を第Ｘａ因
子標準曲線と比較することにより決定される。

【００２３】第Ｘａ因子アミド分解性アッセイ：ＨＳＡ緩衝液に種々の濃度のセファリ
ン、ＰＺ、ＺＰＩ、第Ｘａ因子およびＣａ⁺⁺イオンを含んでいる混合物（１００
μＬ）をマイクロタイタープレートのウェル中、２２℃でインキュベートする。
特定の時間後、５０μＬのＳｐｅｃｔｒａｚｙｍｅＸａ（０．５ｍＭ）を加え
、基質切断の初速度（Ａ₄₀₅／分）をＶｍａｘマイクロタイタープレートレーダ
ー（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ）で決
定した。ＰＺ／ＺＰＩによる第Ｘａ因子阻害の時間経過を研究する試験において
、ＳｐｅｃｔｒａｚｙｍｅＸａ（０．５ｍＭ）を含んでいる溶液は１５ｍＭ
ＥＤＴＡおよび０．３Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、も含んだ。第Ｘａ因子活
性は、基質切断の初速度を同一の緩衝液条件下、種々の濃度の第Ｘａ因子により
得られる標準曲線と比較することにより決定される。

【００２４】二段階、第Ｘａ因子阻害アッセイ：ＺＰＩ機能活性を測定するため、１０
μＬのセファリン（７５μＭ）、１０μＬのＣａＣｌ₂（２５ｍＭ）、１０μＬ
のＰＺ（２００ｎＭ）、１０μＬのＨＳＡに希釈された試験されるべき試料およ
び１０μＬの第Ｘａ因子（２．５ｎＭ）をファイブロメーターの試料カップ中、
３７℃でインキュベートする。６０秒後、５０μＬのＨＳＡ、５０μＬのセファ
リン（７５μＭ）、５０μＬのＣａＣｌ₂（２５ｍＭ）および５０μＬの第Ｘ因
子欠損血漿を連続して加え、凝固時間を測定する。ＺＰＩ活性は、凝固時間を精
製ＺＰＩの種々の濃度を用いて作製した標準曲線と比較することにより決定する
。１μｇの精製ＺＰＩの活性を任意に１単位の値であると割り当てた。

【００２５】ＺＰＩの精製：Ｍｉｓｓｏｕｒｉ−Ｉｌｌｉｎｏｉｓ地域赤十字）からの
ヒトクエン酸添加新鮮凍結血清（２．３リットル）を３７℃で融解し、低温室に
移した。以下のように６工程精製が実施された：１．クエン酸バリウム吸着および硫酸アンモニウム分画化（４℃）。２３０
ｍＬの１．０ＭＢａＣｌ₂を４５分以上かけて滴加し、さらに１５分間撹拌し
た。クエン酸バリウム沈殿は３，０００ｇで２０分間遠心分離することにより除
去し、上清血漿を回収した。硫酸アンモニウムを４５％飽和になるまで加え、混
合物を３０分間撹拌した後、沈殿を１０，０００ｇで２０分間遠心分離すること
により除去した。上清が７５％飽和になるように十分な硫酸アンモニウムを加え
、混合物を３０分間撹拌した後、沈殿を１０，０００ｇで２０分間遠心分離する
ことにより除去した。沈殿したタンパク質は０．１ＭＮａＣｌ、０．０５Ｍト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、に溶解させ、同一の緩衝液に対して一夜透析した。

【００２６】２．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分画化（２２℃）。７．５％のＰＥ
Ｇ濃度になるように、試料に十分量の５０％ｗ／ｖＰＥＧ（８，０００ＭＷ）を
滴加し、混合物を３０分間撹拌した後、沈殿を１０，０００ｇで２０分間遠心分
離することにより除去した。上清液に１８．５％のＰＥＧ濃度になるようにＰＥ
Ｇ（５０％ｗ／ｖ）を滴加し、混合物を３０分間撹拌した後、沈殿を１０，００
０ｇで２０分間遠心分離することにより除去した。沈殿したタンパク質は０．１
ＭＮａＣｌ、０．０２０ＭＭＥＳ、ｐＨ６．１５、に溶解させ、ＤＦＰ（１
ｍＭ）で処理した。

【００２７】３．ＳＦａｓｔＦｌｏｗカチオン交換クロマトグラフィー（４℃）。試
料を０．１ＭＮａＣｌ、０．０２ＭＭＥＳ、ｐＨ６．１５、で平衡化したＳ
ＦａｓｔＦｌｏｗの５ｘ４７ｃｍカラムに加え，１５０ｍＬ／時間の流速で
精製した。カラムは１．５Ｌの同一の緩衝液で洗浄し、８Ｌで０．５ＭＮａＣ
ｌ、０．０２ＭＭＥＳ、ｐＨ６．１５となる直線濃度勾配で溶出させた。〜０
．２５ＭＮａＣｌで溶出するＺＰＩ活性を含んでいる分画を合併し、２５ｍＬ
まで濃縮し（ＹＭ１０，Ａｍｉｃｏｎ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ＤＦＰ（５ｍ
Ｍ）で処理した。

【００２８】４．Ｍｏｎｏ−Ｑアニオン交換クロマトグラフィー（２２℃）。濃縮試料を
０．０２ＭＭＥＳ、ｐＨ６．１５、で２倍に希釈し、０．１％（ｖ／ｖ）トゥ
イーン２０を含んでいる０．１ＭＮａＣｌ、０．０２ＭＭＥＳ、ｐＨ６．１
５、で平衡化した１０ｍＬのＭｏｎｏ−Ｑカラムに加え，１．５ｍＬ／分の流速
で精製した。カラムは１５ｍＬの同一の緩衝液で洗浄し、１００ｍＬで０．５Ｍ
ＮａＣｌ（同一の緩衝液）となる直線濃度勾配で溶出させた。〜０．１８Ｍ
ＮａＣｌで溶出するＺＰＩ活性を含んでいる分画を合併し、ＤＦＰ（５ｍＭ）で
処理した。

【００２９】５．ヘパリン−セルロースアフィニティークロマトグラフィー（２２℃）。
試料を０．０２ＭＭＥＳ、ｐＨ６．１５、で２倍に希釈し、０．１％（ｖ／ｖ
）トゥイーン２０を含んでいる０．１ＭＮａＣｌ、０．０２ＭＭＥＳ、ｐＨ
６．１５、で平衡化した５ｍＬのヘパリン−セルロースカラムに加え，１ｍＬ／
分の流速で精製した。カラムは１０ｍＬの同一の緩衝液で洗浄し、５０ｍＬで０
．６ＭＮａＣｌ（同一の緩衝液）となる直線濃度勾配で溶出させた。〜０．２
５ＭＮａＣｌで溶出するＺＰＩ活性を含んでいる分画を集め、ＤＦＰ（５ｍＭ
）で処理した。

【００３０】６．Ｍｏｎｏ−Ｓカチオン交換クロマトグラフィー（２２℃）。試料を０．
０２ＭＭＥＳ、ｐＨ６．１５、で３倍に希釈し、０．０１％（ｖ／ｖ）トゥイ
ーン２０を含んでいる０．１ＭＮａＣｌ、０．０２ＭＭＥＳ、ｐＨ６．１５
、で平衡化した１ｍＬのＭｏｎｏ−Ｓカラムに加え，０．５ｍＬ／分の流速で精
製した。カラムは２ｍＬの同一の緩衝液で洗浄し、２０ｍＬで０．５ＭＮａＣ
ｌ（同一の緩衝液）となる直線濃度勾配で溶出させた。〜０．２５ＭＮａＣｌ
で溶出するＺＰＩ活性を含んでいる分画を集め、精製ＺＰＩは少量ずつ（ｉｎ
ｓｍａｌｌａｌｉｑｕａｔｅｓ）−７０℃で保存した。１．０ｍｇ／ｍＬのＺ
ＰＩ濃度が２８０ｎｍ（Ａ２８０）で１．０の吸光度を示し、分子量が７２，０
００であると仮定してＺＰＩのモル濃度が見積もられた。

【００３１】以上のＺＰＩの６工程精製は下記表ＩＩに要約されている。その他の方法。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）がＬａｅｍｍｌｉ（１４）の方法を用いて実施された。ウサギポリクローナ
ル抗ＺＰＩ抗体は以前に記載されているように精製ＺＰＩを免疫原として用いて
開発された（１５）。前免疫および免疫ＩｇＧはプロテインＡ−アガロースを用
いて単離された。精製ＺＰＩのＮ末端アミノ酸配列分析は気相シークエンシング
（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ）により実施された。２回の別々の分析が０．３ナノモルのＺＰＩで実施さ
れ、同一の結果を与えた。ウサギ脳セファリンのリン脂質含量は無機リン酸とし
て決定された（１６）。

【００３２】結果ＰＺ、Ｃａ⁺⁺イオンおよびリン脂質存在下での第Ｘａ因子前血液凝固活性の減少。

【００３３】ヒトＰＺの潜在的機能を調べている最初の研究は、もし第Ｘａ因子が最初にＰ
Ｚとインキュベートされたならば一段階血漿凝固アッセイにおける第Ｘａ因子の
見かけの前凝固活性が減少したことを示している（表Ｉ）。阻害効果は時間依存
性であり、カルシウムイオンおよび前凝固リン脂質（ウサギ脳セファリン）の存
在を必要とし、主としてＰＺとリン脂質の前インキュベーション時間に相関する
ようである（表Ｉ）。ＰＺをＡｒｇ４３で切断して分子の残りの部分からＧｌａ
ドメインを分離するＰＺのトロンビン処理は（方法を参照されたい）、阻害効果
を消滅させる。これらの結果は第Ｘａ因子およびＰＺ間の相互作用がリン脂質表
面で起こっていることを示している。この確信と一致して、抗トロンビンＩＩＩ
による第Ｘａ因子の阻害速度はセファリンおよびＣａ⁺⁺イオンの存在下、ＰＺに
より遅延される（ｔ_1/2 ３５分対１５分）（図１）。

【００３４】第Ｘａ因子不活性化に対するＰＺの影響をさらに評価するため、セファリンお
よびＣａＣｌ₂存在下、ＰＺ添加および添加無しでのＰＺ欠損血清における第Ｘ
ａ因子活性消失の時間経過がバイオアッセイにより決定された（図２）。第Ｘａ
因子活性の付加的な初期消失はＰＺ存在下で明らかであり、血清がＰＺ依存性第
Ｘａ因子阻害剤を含んでいることを示している。しかしながら、ＰＺ存在下およ
び不在下で血清中の第Ｘａ因子活性の消失を示している曲線は交差しており、最
終的にＰＺが存在する血清中の第Ｘａ因子活性は、ＰＺ不在の血清よりも多く残
っている。精製タンパク質を含んでいる系において、ＰＺはアルファ−１−抗ト
リプシン、プロテインＣインヒビター、アルファ−２−抗プラスミン、ヘパリン
補因子ＩＩ、インター−アルファ−トリプシンインヒビターまたはアルファ−２
−マクログロブリンによる第Ｘａ因子の阻害を促進しなかった。

【００３５】ＺＰＩの単離。ＰＺ依存性第Ｘａ因子阻害を測定するために設計された二段階バイオアッセイ
を使用して、血漿からＰＺ依存性プロテアーゼインヒビター（ＺＰＩ）が単離さ
れた（方法、表ＩＩ）。出発血漿のＺＰＩ活性は、二段階第Ｘａ因子阻害アッセ
イの第一段階でのトロンビン発生およびフィブリン形成のため測定できなかった
。それでも、血漿の硫酸アンモニウム分画化後のＺＰＩの回収を５０％−７５％
と仮定すると（表ＩＩ）、ＺＰＩの血漿濃度は１．０−１．６μｇ／ｍＬ（１４
−２２ｎＭ）と推定される。

【００３６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によると、ＺＰＩは７２ｋＤａの分子量を持つ単鎖タン
パク質として移動する（図３）。精製タンパク質の予備的特徴付けは、ＳＤＳ（
１％）、尿素（８Ｍ）および２−メルカプトエタノール（５％ｖ／ｖ）による処
理によりＺＰＩ活性が消失するが、トゥイーン−２０（２％）およびトリトンＸ
−１００（２％）中では安定であることを示している。ＺＰＩはまたアルファ−
２−マクログロブリンを完全に不活性化するメチルアミン処理条件にも影響され
なかった。ＺＰＩのＮ末端アミノ酸配列はＬＡＰＳＰＱＳＰＥＸＸＡ（Ｘ＝確定
されていない基）、配列番号：１、である。この配列は公的に利用できるタンパ
ク質またはＤＮＡデータベースで入手可能な配列とは一致せずまた有意な相同性
を示さなかった。従って、ＺＰＩはこれまで同定されていない遺伝子産物であろ
う。

【００３７】ＺＰＩによる第Ｘａ因子のＰＺ依存性阻害。第Ｘａ因子−ＺＰＩ相互作用をさらに調べるため、第Ｘａ因子、ＣａＣｌ₂、
セファリンおよびＰＺを含んでいる混合物をＺＰＩの濃度を増加させて１５分間
インキュベートした（２２℃）（図４Ａ）。続いて残存する第Ｘａ因子活性を、
ＳｐｅｃｔｒａｚｙｍｅＸａ添加後のアミド分解アッセイ（方法）で決定した
。結果は、１．２：１（ＺＰＩ：第Ｘａ因子）の化学量論でのＺＰＩおよび第Ｘ
ａ因子間の高い親和性相互作用を示唆している。しかしながら、ＺＰＩの相対的
高濃度でも有意な量の（〜２０％）第Ｘａ因子アミド分解活性が生き残っている
。

【００３８】ＺＰＩ仲介第Ｘａ因子阻害のＰＺ用量／応答が類似の反応で評価された（図４
Ｂ）。再び、ＰＺおよび第Ｘａ因子間の見かけの化学量論的関係は１．４：１（
ＰＺ：第Ｘａ因子）のモル比であることが示された。ＺＰＩによる第Ｘａ因子の
至適ＰＺ依存性阻害は≧１５μＭの混合ウサギ脳リン脂質（セファリン）濃度で
起こった（図４Ｃ）。ＺＰＩにより生み出される第Ｘａ因子の阻害は、第Ｘａ因
子とＰＺ、Ｃａ⁺⁺イオンおよびセファリンとのインキュベーション後に迅速に起
こる（図４Ｄ）。アミド分解アッセイ（７０％）およびバイオアッセイ（９７％
）により評価すると、最大第Ｘａ因子阻害に１分以内で達する。アミド分解アッ
セイ（図３Ｄ）またはバイオアッセイを用いると、ＰＺ、リン脂質またはＣａ⁺⁺ イオン（１ｍＭＥＤＴＡ）が反応系から除かれた場合には第Ｘａ因子阻害は起
こらない。

【００３９】ＰＺ存在下に引き出される第Ｘａ因子の、初期の頃の促進された阻害に対する
血清ＺＰＩの寄与、並びに一段階バイオアッセイに先立ったＰＺ、リン脂質およ
びＣａ⁺⁺イオンとのインキュベーションにより引き出される第Ｘａ因子活性の見
かけの減少に対する血漿ＺＰＩの寄与を決定するため、血清および血漿がウサギ
ポリクローナル抗ＺＰＩ抗体で処理された。抗ＺＰＩ抗体による処理は血清にお
けるＰＺ依存性第Ｘａ因子阻害を完全に消失させたが（図２）、血漿一段階バイ
オアッセイにおけるＰＺ仲介阻害効果は〜５０％だけ減少した（図５）。

【００４０】ＰＺは数年前に単離されたにもかかわらず、その後ＰＺの生理学的機能は不確
かなまま残されてきた。実施例Ｉの結果は、リン脂質およびＣａ⁺⁺イオンの存在
下、抗トロンビンＩＩＩによる第Ｘａ因子の阻害をＰＺが遅くし、また、本明細
書でタンパク質ＰＺ依存性プロテアーゼインヒビター、ＺＰＩと名付けられた新
規血漿タンパク質による第Ｘａ因子の阻害に重要な役割を果たしていることを示
している。しかしながら、ＰＺおよび／またはその第Ｘａ因子との明らかな相互
作用は他の機能の役に立っているであろう。この点に関して、一段階凝固アッセ
イの基質血漿中のＺＰＩの阻害は、ＰＺとリン脂質、Ｃａ⁺⁺イオンおよび第Ｘａ
因子との前インキュベーションの見かけの阻害効果を〜５０％だけしか減少させ
ないことに注目するのが重要である。

【００４１】残存するＰＺ仲介阻害効果は、リン脂質への他のタンパク質（例えば、プロト
ロンビン）の結合への干渉、推定される第Ｘａ因子−ＰＺ−リン脂質−Ｃａ⁺⁺複
合体からの第Ｘａ因子の遅い解離、または血漿における付加的ＰＺ依存性凝固阻
害剤の存在にも関係しているであろう。ＰＺとリン脂質の比較的遅い会合（１１
）は、一段階アッセイにおけるリン脂質およびＣａ⁺⁺イオンとのインキュベーシ
ョン間のＰＺの時間依存性阻害効果と一致しており、さらに、おそらく反応系へ
基質血漿の代わりにＰＺが加えられた場合の凝固時間延長がないことを説明する
ものである。

【００４２】推測のＺＰＩ生理学的濃度による第Ｘａ因子の阻害はリン脂質、Ｃａ⁺⁺イオン
およびＰＺの存在を必要とし、リン脂質表面での第Ｘａ因子、ＰＺおよびＺＰＩ
の化学量論的複合体が関係しているようである。しかしながら、ＺＰＩにより引
き出される第Ｘａ因子の見かけの阻害は、残存する第Ｘａ因子活性がバイオアッ
セイにより測定された場合よりも、残存する第Ｘａ因子活性が小分子量色素産生
基質（ＳｐｅｃｔｒａｚｙｍｅＸａ）を用いて測定した場合の方がかなり少な
かった。この相違の理由は明らかではない。

【００４３】この相違の一つの説明は、色素産生基質に対する活性は維持しているがリン脂
質を結合しない第Ｘａ因子の分解型が第Ｘａ因子調製物に存在するためであり、
従って、それはＺＰＩにより阻害されず、凝固活性を欠いている。しかしながら
、アミド分解アッセイおよびバイオアッセイにより測定された阻害効果間の相違
はいくつかの第Ｘａ因子調製試料でほとんどないことが観察され、そのアミド分
解活性は硫酸バリウムにより結合され（＞９７％）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると
、第Ｘａ因子のαおよびβ形比のスペクトル（α：β＝１：１から１：４）およ
び＜５％の付加的分解第Ｘａ因子を含んでいた。さらに、第Ｘａ因子調製試料の
色素発生活性は組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）により＞９９％阻害され
、第Ｘａ因子とＺＰＩの相互作用後に残存する残余色素発生活性は夾雑している
プロテアーゼによるものではないことを示唆している。

【００４４】実施例ＩＩＺＰＩｃＤＮＡの単離およびクローニング材料および方法材料：新鮮凍結ヒト血漿は赤十字地域組織（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）か
ら購入された。多ヒト組織ＲＮＡブロットおよびヒト成人肝臓ｃＤＮＡライブラ
リーはＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）から；ヒト胎児肝臓ｃＤ
ＮＡライブラリーはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）から；ニ
トロセルロース膜はＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．（Ｋ
ｅｅｎｅ，ＮＨ）から；ＰＶＤＦ膜はＭｉｃｒｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，
Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）から；³²Ｐ−α ｄＡＴＰはＮＥＮ
ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から；お
よびｄＮＴＰはＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔ
ａｗａｙ，ＮＪ）から入手した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＤＭＥＭ培養培
地、ウシ胎児血清およびＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥはＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｌ
ｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から入
手した。抗生物質Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）はＭｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎ
ｃ．（Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）から購入した。チャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＩＴＳ＋３培
地補給物、プロテアーゼインヒビターカクテル、大豆トリプシンインヒビター、
アプロチニンおよびウサギ脳セファリンはＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。第Ｘ因子欠損血漿はＧｅｏｒｇｅＫｉｎ
ｇＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．（ＯｖｅｒｌａｎｄＰａｒｋ，ＫＳ）か
ら入手した。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）のための前染色分子量標準品はＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅ
ｓ，ＣＡ）から購入された。

【００４５】タンパク質：ＰＺおよびＺＰＩはヒト血漿から以前に記載されているよう
に精製された（１７）。マウスモノクローナル抗ＺＰＩ抗体（ＭＣ４２４９．２
）は確立されたおよび以前に報告されている技術を用いて産生された（１８）。

【００４６】ＺＰＩおよびトリプシン処理ＺＰＩのＮ末端アミノ酸配列決定：２０μｇ
のＺＰＩおよびトリプシン（１：２００ｗ／ｗ）を用いて２２℃で３０分間切断
されている２０μｇのＺＰＩを２−メルカプトエタノール（５％）で還元し、１
２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＰＶＤＦ膜へ電気的に移した。１０％メタノー
ル／７％酢酸中、膜を１０分間０．０２５％クーマシーブリリアントブルーＲ−
２５０で染色し、蒸留水で洗浄して風乾した。ＺＰＩについて７２，０００およ
びトリプシン処理ＺＰＩについての４３，０００および４１，０００の見かけの
分子量の識別可能なタンパク質バンドを膜から切り出し、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈ
ｅｍｉｓｔｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により配列決定した。

【００４７】ＺＰＩｃＤＮＡクローニング：ＺＰＩ由来の二つのトリプシン処理ペプ
チドのＮ末端アミノ酸配列はラット再生関連セルピン（ｒａｓｐ−１，Ｇｅｎｅ
Ｂａｎｋ寄託番号第２１４３９５３号、結果を参照されたい）（１９）の以前に
報告されているｃＤＮＡにより予測されるアミノ酸配列と高度に相同的である。
ｒａｓｐ−ｌｃＤＮＡから誘導されるヌクレオチド配列；４９６−５１８（ＡＣＣＣＡＧＧＧＴＡＧＣＴＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴ）、配
列ＩＤ番：３、および８０５−８２５（ＧＴＡＣＡＴＣＡＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＡＡＣ）、配列番
号：４はヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）からＤＮＡ断片
を増幅するためのＰＣＲ反応における各々５’−および３’−プライマーのため
の基礎として使用された。ＰＣＲ生成物、〜３３０ｂｐ、はｐＧＥＭ−ＴＥａ
ｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内へクローン化され、配列分析
によりｒａｓｐ−１ｃＤＮＡと８０％相同的であることが観察された。³²Ｐ−
α ｄＡＴＰによる標識およびランダムプライミング後、ＰＣＲ生成物はヒト肝
臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からの約２ｘ１０⁶プラーク形成
単位をスクリーニングするプローブとして使用された。ハイブリダイゼーション
は、５ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハルト溶液、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドおよ
び１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子中、４２℃で実施された。フィルターを１ｘＳ
ＳＣおよび０．１％ＳＤＳ溶液を用いて室温で１５分洗浄し、次に同一溶液を用
いて６５℃で３０分、３回洗浄した。プラーク精製後に残った２１の陽性クロー
ンは４つの異なった長さのｃＤＮＡを含んでいた。最も長い代表を完全に、両方
の方向で配列決定した。

【００４８】ノーザンブロット分析： ³²Ｐ−標識完全長ＺＰＩｃＤＮＡが、試料当た
り２μｇポリＡ＋ＲＮＡを含んでいるＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，
ＣＡ）からのヒト多組織ノーザンブロット膜分析のためのプローブとして使用さ
れた。ハイブリダイゼーションは使用説明書により示されているストリンジェン
ト条件下で実施され；オートラジオグラフィーは一夜行われた。

【００４９】野生型および改変形組換え体ＺＰＩ（ｒＺＰＩ）のインビトロ発現：ＺＰ
ＩｃＤＮＡの２．２断片がＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで処理され、ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＩＩの多クローニング部位に挿入された。この断片は
ＺＰＩｃＤＮＡの５’非翻訳領域の一部、全読み取り枠、および３’非翻訳領
域を含んでいる。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＺＰＩの２．３ｋｂ断片をＰｖｕＩ
Ｉ処理により放出させ、発現ベクターｐＣＭＶ（２０）のＥｃｏＲＶ部位内へ
平滑端結合により挿入し、ｐＣＭＶ−ＺＰＩ（ＷＴ）を作成した。この２．３ｋ
ｂＤＮＡ断片は：１）ＡＴＧ₆の１２０ｂｐ上流で始まり、ＡＴＧ₁−ＡＴＧ₆
を含む５’非翻訳ＺＰＩｃＤＮＡの残りを欠いたＺＰＩｃＤＮＡ；２）ＺＰ
ＩｃＤＮＡのコードおよび３’非翻訳領域；および３）〜２００ｂｐのｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＩＩＤＮＡを含んでいる。ｐＣＭＶにおいて、発現
はサイトメガロウイルス初期プロモーター／エンハンサーにより駆動される。

【００５０】鋳型としてｐＣＭＶ−ＺＰＩ（ＷＴ）を用いるＰＣＲに基づいた部位特異的突
然変異発生が、ＺＰＩ中のＹ３８７（ＴＡＴ）のコドンをアラニン（ＧＣＴ）ま
たはアルギニン（ＣＧＴ）のためのコドンに変更するために使用された。突然変
異は、突然変異部位の上流および下流であるＮｓｉＩ（ｎｔ１５４４）およびＳ
ｐｅＩ（ｎｔ１９４４）制限部位間のＺＰＩｃＤＮＡを配列決定することによ
り確認された。これらの断片は次いでｐＣＭＶ−ＺＰＩ（ＷＴ）のＮｓｉＩ−Ｓ
ｐｅＩに挿入され、ｐＣＭＶ−ＺＰＩ（Ｙ３８７Ａ）およびｐＣＭＶ−ＺＰＩ（
Ｙ３８７Ｒ）が生成された。ｐＣＭＶ−ＺＰＩ（ＷＴ）、ｐＣＭＶ−ＺＰＩ（Ｙ
３８７Ａ）およびｐＣＭＶ−ＺＰＩ（Ｙ３８７Ｒ）はＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮ
Ｅ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を用い、使用説明書に従ってＣＨＯ細胞内へｐＳＶ２
ｎｅｏと同時にトランスフェクトされた。３週間目にＧ４１８に耐性のある細胞
クローンを採り、増殖させた。トランスフェクトされてないＣＨＯおよびｒＺＰ
Ｉ（ＷＴ）ｒＺＰＩ（Ｙ３８７Ａ）およびｒＺＰＩ（Ｙ３８７Ｒ）を発現してい
る安定なＣＨＯクローンを、６ウェル培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃｏｒｎｉ
ｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中、ＤＭＥＭおよび１０％ウシ胎児血
清を用いて５％ＣＯ₂下で培養した。細胞がコンフルエントに達したら、培地を
除き、細胞を５ｍＬのＤＭＥＭで３回洗浄した後、各々のウェルにＩＴＳ＋３培
地補給物（インシュリン、トランスフェリン、セレン、Ｓｉｇｍａ）を加えたＤ
ＭＥＭからなる１ｍｌの無血清培地を加えた。さらに４８時間培養後、馴化培地
を回収し、遠心分離して（１４，０００ｘｇｘ３０秒）細胞破片を除去し、ウェ
スタンブロッティングおよびＺＰＩ機能アッセイにより分析した。いくつかの実
験においては、アプロチニン（１μｇ／ｍＬ）および大豆トリプシンインヒビタ
ー（２．５μｇ／ｍＬ）が無血清培地に含まれており、４−（２−アミノエチル
）ベンゼンスルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ）（１００ｍＭ）、ペプスタチン
Ａ（１．５ｍＭ）、トランス−エポキシスクシニイル−Ｌ−ロイシル−アミド（
４−グアニジノ）ブタン（Ｅ−６４）（１．４ｍＭ）、ベスタチン（４ｍＭ）、
ロイペプチン（２．２ｍＭ）およびアプロチニン（８０μＭ）を含んでいるプロ
テアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）の１：１０希釈液が馴化培地の採
取時点で培地へ加えられた。

【００５１】ＺＰＩ機能アッセイ：二段階第Ｘａ因子阻害アッセイが以前に記載されて
いるように（１７）ＺＰＩ機能活性の測定に使用された。２０μＬのウサギ脳セ
ファリン（７５μＭ）、２０μＬのＣａＣｌ₂（２５ｍＭ）、２０μＬのＰＺ（
２００ｎＭ）または２０μＬのＨＳＡ（１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含
む０．１ＭＮａＣｌ、０．０５Ｍヘペス、ｐＨ７．４）、２０μＬの試験され
るべき試料、および２０μＬの第Ｘａ因子（１ｎＭ）をファイブロメーターの試
料カップ中、３７℃でインキュベートした。６０秒後、５０μＬのセファリン（
７５μＭ）、５０μＬのＣａＣｌ₂（２５ｍＭ）および５０μＬの第Ｘ因子欠損
血漿を連続して加え、凝固時間を測定する。ＺＰＩ活性は、凝固時間を血漿から
の精製ＺＰＩの種々の濃度を用いて作製した標準曲線と比較することにより決定
した。１μｇの精製血漿ＺＰＩが１０００ミリ単位（ｍＵ）の活性を持つと定義
された。

【００５２】ウェスタンブロッティング：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、
ニトロセルロースへのタンパク質の電気的移送、およびブロットとモノクローナ
ル抗ＺＰＩ抗体（ＭＣ４２４９．２）（１０μｇ／ｍＬ）とのインキュベーショ
ンは以前に記載されている方法（２１）を用いて実施された。ブロットへの抗体
の結合は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ
）およびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ
Ｌ）での増強化学発光（ＥＣＬ）を用いて検出された。

【００５３】結果ＺＰＩｃＤＮＡの単離および配列公的に利用可能なタンパク質およびＤＮＡデータベースの探索で、ヒト血漿か
ら単離されたＺＰＩのＮ末端アミノ酸配列、ＬＡＰＳＰＱＳＰＥＸＸＡ（Ｘ＝確
定されていない基）（配列番号：１）は以前に報告されている遺伝子産物と有意
な配列相同性を示さなかった。しかしながら、ＺＰＩのトリプシン処理により生
成された４３ｋＤａおよび４１ｋＤａペプチドのＮ末端配列は同一であり、ＮＬ
ＥＬＧＬＴＱＳＦＡＦＩＨＫＤＦＤＶ（配列番号：５）、以前に報告されている
ラット再生関連セルピン−１（ｒａｓｐ−１）ｃＤＮＡ（１９）から予測される
アミノ酸配列と７５％の同一性（２０残基の内の１６）を示した。ｒａｓｐ−１
ｃＤＮＡ配列に基づいたオリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲプライマーと
して使用され、ヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が
続いてのＺＰＩｃＤＮＡ単離のための〜３３０ｂｐプローブを作製するための
鋳型として使用された（方法を参照されたい）。４つの異なった大きさの挿入物
を含んでいる２１の陽性プラークがヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ）から単離された。最も長いＺＰＩｃＤＮＡ挿入物を持つヌクレオチド
配列、配列番号：７および予測されるアミノ酸配列、配列番号：８が図６に示さ
れている。３つのより短いＺＰＩｃＤＮＡ挿入物サイズを代表するクローンの
制限地図作製および制限配列分析は、それらが示されたｃＤＮＡの５’の端が切
断された形であることを示唆している。

【００５４】２．４４ｋｂＺＰＩｃＤＮＡの５’部分は６つの潜在的ＡＴＧ翻訳開始部
位をヌクレオチド１５６、２４３、２５９、３１２、３４７および４６７に含ん
でいる。最初の４つのＡＴＧに続く読み取り枠は終結コドンに出会う前に各々１
１、２２、３および５２アミノ酸をコード化している。ＡＴＧ₅（図６において
ダッシュで下線が引かれている）はＡＴＧ₆と同一の読み取り枠であり、ＡＴＧ₅ での翻訳開始はコード化されているタンパク質に４０のアミノ酸配列、ＭＳＲＳ
ＴＱＥＬＬＧＹＨＣＲＬＱＤＫＬＱＥＱＥＧＳＬＡＡＥＧＲＨＳＬＡＳＡＡＤＨ
（配列番号：６）を加えるであろう。

【００５５】ＡＴＧコドン（ＡＴＧ₅およびＡＴＧ₆を含んで）に隣接するヌクレオチドは翻
訳の開始には最適ではない配列を生成する（２２）。それでもＡＴＧ₆が図６に
おいて開始コドンとして描かれているのは、追加の試験（下記参照）でそれがＺ
ＰＩ発現に十分であることを示したためである。ヒト多組織ブロットのノーザン
分析は、〜２．４ｋｂＺＰＩｍＲＮＡが肝臓で強く検出されるが、心臓、肺
、脳、脾臓、精巣および腎臓では検出されず（図７）、肝臓がインビボにおける
ＺＰＩの主たる供給源であることを示唆している。

【００５６】示されているように、ＺＰＩｃＤＮＡは１３３５ｂｐの読み取り枠を含んで
おり、４４４アミノ酸の演繹されるタンパク質をコード化している。予測される
アミノ酸配列は典型的な２１残基のシグナルペプチドを持っており、精製ＺＰＩ
タンパク質のＮ末端配列が続いている。５つの潜在的Ｎ結合グリコシル化部位が
存在している。ヒトＺＰＩのヌクレオチドおよび予測されるアミノ酸配列は各々
ラットｒａｓｐ−１と７５％および７８％同一であり、ＺＰＩはこのラットタン
パク質のヒト類似体であることを示唆している。

【００５７】ＺＰＩアミノ酸配列はまた、α₁−抗トリプシン、抗トロンビン、ヘパリン補
因子ＩＩおよびプロテアーゼネキシン−１を含むプロテアーゼインヒビターのセ
ルピンスーパーファミリーの他のメンバーとも２５−３５％の相同性を持ってい
る。ＺＰＩのＣ末端はセルピンスーパーファミリーの他のメンバーと非常に類似
しているが、一方、ＺＰＩのＮ末端領域の配列（非常に酸性のドメインを含んで
いる、残基２６−４３、図６）はこれらの他のセルピンと有意な相同性を示さな
い。

【００５８】ＺＰＩ、ｒａｓｐ−１およびある種の他のセルピンのＣ末端アミノ酸配列は図
８に示されている。この配列配置に基づくと、ヒトＺＰＩおよびラットｒａｓｐ
−１の反応中心の推定Ｐ₁残基はチロシンである。抗トリプシン関連配列（ＡＩ
ＡＵ）、抗トリプシンのものと高度に相同的な明らかに翻訳されないＤＮＡ配列
、および抗トリプシン遺伝子へ物理的に連結されているもまた芳香族残基（トリ
プトファン）をＰ₁部位に含んでいる（２３、２４）。多くの他のセルピンに共
通して、ＺＰＩのＰ₁’残基はセリンであり、一方、ｒａｓｐ−１のＰ₁’残基は
システインである。

【００５９】組換え体ＺＰＩの発現単離されたｃＤＮＡによりコード化されているタンパク質がＺＰＩ活性を持っ
ていることを確認するため、およびＺＰＩ機能におけるＹ３８７の重要性を決定
するため、ｒＺＰＩ（ＷＴ）およびＺＰＩの２つの改変形、ｒＺＰＩ（Ｙ３８７
Ａ）およびｒＺＰＩ（Ｙ３８７Ｒ）、がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞で発現された。各々の無血清馴化培地のウェスタンブロット分析は、野生型
およびｒＺＰＩの改変形は同じ濃度で存在することを示した（図９）。しかしな
がら、ｒＺＰＩ（ＷＴ）およびｒＺＰＩ（Ｙ３８７Ａ）は血漿由来のＺＰＩと同
じ見かけの分子量（７２，０００Ｄａ）で移動したが、ｒＺＰＩ（Ｙ３８７Ｒ）
は６８，０００Ｄａの分子量で移動した。無血清培養培地へアプロチニンおよび
大豆トリプシンインヒビターを含ませることによる、および集めた馴化培地へプ
ロテアーゼインヒビターカクテルを加えることによる見かけのタンパク質分解性
分解を減少させる試みは成功しなかった（方法を参照されたい）。

【００６０】ＰＺ依存性第Ｘａ因子阻害の二段階アッセイにおいて、ｒＺＰＩ（ＷＴ）を含
んでいる無血清馴化培地は実質的なＺＰＩ活性（３７５ｍＵ／ｍＬ）を持ってい
たが、ｒＺＰＩ（Ｙ３８７Ａ）を含んでいる馴化培地は活性を欠いており（＜１
０ｍＵ／ｍＬ）、ｒＺＰＩ（Ｙ３８７Ｒ）を含んでいる馴化培地は活性が著しく
減少していた（２１ｍＵ／ｍＬ）（図９）。

【００６１】オリゴヌクレオチドおよびアミノ酸配列の相同性に基づくと、ＺＰＩはラット
ｒａｓｐ−１のヒト相当物であるようである。ｒａｓｐ−１は、ラットの部分的
肝臓切除後にその転写が３から４倍増加する遺伝子として最初は同定された（１
９）。しかしながら、ｒａｓｐ−１発現は疑似手術したラットでも同じように増
加されており、ｒａｓｐ−１は急性期応答に関与しているであろうことが示唆さ
れた。ｒａｓｐ−１遺伝子産物は〜５０，０００の報告された分子質量でラット
血漿中で循環するが、血漿ＺＰＩの分子質量は〜７２，０００である（１７、１
９）。ラットおよびヒト遺伝子産物間の分子サイズの明らかな相違はグリコシル
化の程度に関連しているであろう。ｒａｓｐ−１（１９）およびＺＰＩ遺伝子両
方の構成的発現はノーザン分析によると肝臓で高く、脳、心臓、肺、腎臓、脾臓
および精巣では検出できない。

【００６２】ＺＰＩｃＤＮＡは２．４４ｋｂの長さであり、ノーザン分析上、肝臓で注目
された〜２．４ｋｂの最も小さいハイブリダイズする化学種と一致している（図
７）。より大きなサイズのハイブリダイズするバンドはＺＰＩｍＲＮＡの不完
全に処理された形を示しているようである。ＺＰＩｃＤＮＡの５’領域は比較
的長く（４６６ｂｐ）、いくつかの潜在的ＡＴＧ翻訳開始コドンを含んでいる。
これらの推定開始コドンの４つには終結コドンが続いているが、ヌクレオチド３
４７の第５のＡＴＧは、基準開始コドンとして仮に示されたヌクレオチド４６７
のＡＴＧとインフレームである。これらの潜在的ＡＴＧ開始出発部位すべてに、
あまり理想的でないヌクレオチド配列が隣接している（２２）。長い５’非翻訳
領域、小さな読み取り枠をコード化している多数の上流ＡＵＧコドンの存在、お
よび至適開始配列の欠如すべてがＺＰＩｍＲＮＡ翻訳を抑制するのに働くこと
ができる（２２、２５、２６）。このことが真実かどうか、およびＺＰＩの改変
形が第５のＡＵＧ（ｎｔ３４７）での翻訳開始により産生されるかどうかは直接
的な試験が必要であろう。

【００６３】ＺＰＩはセルピンスーパーファミリーの他のタンパク質と全体で２５−３５％
の相同性を持っており、その一次構造は、セルピン三次構造に必須であると以前
に示されている４０の５’残基を含んでいる（２７）。これらの保存された残基
はセルピン分子の無極コアおよび脊柱に存在する。ＺＰＩおよびｒａｓｐ−１と
他のセルピンとのアミノ酸配列アラインメントはそれらの反応性中心のＰ₁残基
がチロシンであることを示唆しており、そのことはそれらを他のセルピンから離
れたものにしている。

【００６４】ＺＰＩによる第Ｘａ因子の阻害におけるＹ３８７の役割を確認するため、この
残基がアラニンまたはアルギニンへ変更されたＺＰＩの改変形が評価された。ｒ
ＺＰＩ（Ｙ３８７Ａ）は、その発現に必要とされる組織培養条件下で安定であり
、ＰＺ依存性抗第Ｘａ因子活性を欠いていた。ｒＺＰＩ（ＷＴ）と対照的に、ｒ
ＺＰＩ（Ｙ３８７Ｒ）は多プロテアーゼインヒビターの使用にも関わらず、馴化
培地の生成間に明らかにタンパク質分解的に分解された。このタンパク質分解は
ＺＰＩの質量を〜４，０００Ｄａ減少させ、Ｒ３８７の後で起こっている切断と
矛盾しないが、このタンパク質分解に関与する酵素は知られていない。

【００６５】まとめると、ｒＺＰＩ（Ｙ３８７Ａ）およびｒＺＰＩ（Ｙ３８７Ｒ）による試
験は、Ｙ３８７はＰＺ依存性第Ｘａ因子阻害に決定的であり、Ｙ３８７はＺＰＩ
の反応中心でのＰ₁残基であるという考えと矛盾しないことを示唆している。

【００６６】凝固阻害剤ＰＺ、ＺＰＩおよびＰＺおよびＺＰＩの組み合わせは通常の手段、
好適には医薬的に受容可能な希釈剤および担体で処方して患者に投与できる。投
与される処方中の活性成分の量は有効量、即ち、凝固を阻害するのに十分である
量でなければならない。生理学的食塩水、緩衝化食塩水（例えば、リン酸緩衝化
食塩水（ＰＢＳ）、ヘペス緩衝液などの緩衝液）中のような活性成分の非経口投
与が一例である。治療的剤形での、医薬的に受容可能な希釈剤および担体中の活
性成分の他の適した処方は、当業者にはよく知られている本分野での多数の一般
的原典を参照することにより処方できる、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、ＡｒｔｈｕｒＯｓｏｌ編、
１６版、１９８０年、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｅａｓｔｏｎ
、ＰＡ．、および１８版、１９９０年。

【００６７】本開示を読んだ後は、本発明の精神および範囲から離れることなく種々の他の
例が当業者には明らかになるであろう。すべてのそのような他の例は付随する特
許請求の範囲内に含まれていることが意図されている。

【００６８】

【表１】

【００６９】

【表２】

【００７０】

【表３】

【００７１】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は抗トロンビンＩＩＩによる第Ｘａ因子の阻害に対するＰＺ
の効果を示しているグラフである。抗トロンビンＩＩＩ（３．４μＭ）の添加前
に、第Ｘａ因子（５ｎＭ）、ＣａＣｌ₂（４ｍＭ）、ＰＺ（４０ｎＭ）ありまた
はなし、およびセファリン（１５μＭ）ありまたはなし、を含んでいる反応液を
２２℃で５分間インキュベートした。その後、指定された時間に試料を除き、１
ｍＭＥＤＴＡを含んだＨＳＡで希釈し、バイオアッセイにより第Ｘａ因子活性
をアッセイした。（▲）、セファリンなし、ＰＺなし；（○）、セファリンなし、ＰＺあり；（黒四角）、セファリンあり、ＰＺなし；（●）、セファリンあり、ＰＺあり。

【図２】図２は血清による第Ｘａ因子阻害を示しているグラフである。ウ
サギ前免疫または免疫抗ＺＰＩＩｇＧ（３００μｇ／ｍＬ）で３０分間前もっ
て処理されているバリウム吸着血清（２５％ｖ／ｖ）の添加前に、第Ｘａ因子
（５ｎＭ）、ＣａＣｌ₂（４ｍＭ）、セファリン（１５μＭ）、ＰＺ（４０ｎＭ
）ありまたはなし、を２２℃で５分間インキュベートした。その後、指定された
時間に反応液試料を１ｍＭＥＤＴＡを含んだＨＳＡで希釈し、バイオアッセイ
により第Ｘａ因子活性をアッセイした。（●）、ＰＺありおよび前免疫ＩｇＧ；（▼）、ＰＺありおよび免疫ＩｇＧ；（○）、ＰＺなしおよび前免疫ＩｇＧ；（▲）、ＰＺなしおよび免疫ＩｇＧ。

【図３】図３は精製ＺＰＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。ＺＰＩ（５
μｇ）が５％２−メルカプトエタノール還元あり（レーン２、右）またはなし
で分析された。タンパク質はクーマシーブリリアントブルーで染色された。ｋＤ
ａでの分子量標品の位置は左側に示されている。

【図４】図４は４つの部分から成っており、図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４
ＤはＺＰＩによる第Ｘａ因子のＰＺ依存性阻害を示しているグラフである。図４ＡはＺＰＩ用量／応答を示している。第Ｘａ因子（２．５または５．０
ｎＭ）、ＣａＣｌ₂（４ｍＭ）、セファリン（１５μＭ）およびＰＺ（４０ｎＭ
）を含んでいる反応液は、ＺＰＩ濃度を増加させながら２２℃で１５分間インキ
ュベートした後、残存する第Ｘａ因子活性をアミド分解アッセイにより決定した
。ＺＰＩのモル濃度は１．０ｍｇ／ｍＬのＺＰＩは１．０のＡ₂₈₀を示すと仮定
して見積もられた。（□）、第Ｘａ因子２．５ｎＭ；（○）、第Ｘａ因子５．０
ｎＭ。図４ＢはＰＺ用量／応答を示している。第Ｘａ因子（２．５または５．０ｎ
Ｍ）、ＣａＣｌ₂（４ｍＭ）、セファリン（１５μＭ）およびＺＰＩ（１０ｎＭ
）を含んでいる反応液は、ＰＺ濃度を増加させながら２２℃で１５分間インキュ
ベートした後、残存する第Ｘａ因子活性をアミド分解アッセイにより決定した。
（□）、第Ｘａ因子２．５ｎＭ；（○）、第Ｘａ因子５．０ｎＭ。図４Ｃセファリン用量／応答を示している。第Ｘａ因子（２．５ｎＭ）、Ｃ
ａＣｌ₂（４ｍＭ）、ＰＺ（４０ｎＭ）およびＺＰＩ（１０ｎＭ）を含んでいる
反応液は、セファリン濃度を増加させながら２２℃で１５分間インキュベートし
た後、残存する第Ｘａ因子活性をアミド分解アッセイにより決定した。図４ＤはＰＺ／ＺＰＩによる第Ｘａ因子阻害の時間経過を示している。第Ｘ
ａ因子（５．０ｎＭ）、ＣａＣｌ₂（４ｍＭ）ありまたはなし、セファリン（１
５μＭ）ありまたはなし、およびＰＺ（４０ｎＭ）ありまたはなし、を含んでい
る反応液を２２℃で５分間インキュベートした後にＺＰＩ（１０ｎＭ）を加えた
。その後、指示された時間に残存する第Ｘａ因子活性をバイオアッセイまたはア
ミド分解アッセイにより決定した。バイオアッセイ：（●）、すべての反応体。アミド分解アッセイ：（黒四角）
、すべての反応体；（▼）、ＣａＣｌ₂なし；（▲）、セファリンなし；（黒ダ
イアモンド）、ＰＺなし。

【図５】図５は第Ｘａ因子誘導血漿凝固に対する抗ＺＰＩ抗体の効果を示
しているグラフである。第Ｘａ因子（０．１２５ｎＭ）、ＣａＣｌ₂（５ｍＭ）
、セファリン（１８．７５μＭ）およびＰＺ（５０ｎＭ）ありまたはなし、を含
んでいる反応液（２００μＬ）をファイブロメーターの試料カップ中でインキュ
ベートした。３７℃で２分後、ウサギ前免疫ＩｇＧ（６００μｇ／ｍＬ）または
免疫抗ＺＰＩＩｇＧ（濃度を増加させて）で３０分間処理されている第Ｘ因子
欠損血漿を５０μＬ加え、凝固時間を測定した。前インキュベーション時間の間
のＰＺ取り込みにより引き起こされた見かけの第Ｘａ因子阻害（７６％）および
前免疫ＩｇＧで処理された血漿の使用が最大ＰＺ依存性阻害（縦座標の１００％
）として記載されている。血漿を処理するために使用された抗ＺＰＩＩｇＧの
濃度が横座標に記載されている。

【図６】図６はヒトＺＰＩｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７
）および演繹されるアミノ酸配列（配列番号：８）を示している。アミノ酸配列
はヌクレオチド配列の下に１文字コードで示されている。ヌクレオチド／アミノ
酸数はカラムの右に示されている。翻訳はＡＴＧ₆（ｎｔ４６７）から開始する
として描かれている。別の開始コドン、ＡＴＧ₅（ｎｔ３４７）はダッシュで下
線が付けられている（実施例ＩＩ参照）。精製血漿ＺＰＩから誘導されるアミノ
酸配列には下線が付けられている。Ｎ＊はＮ結合グリコシル化の可能性のある部
位を示しており、ＺＰＩの反応中心の推定Ｐ１部位のチロシン残基はボールド体
で示されている。アミノ酸配列は付随する配列リストには３文字コードで示され
ている。

【図７】図７はＺＰＩｍＲＮＡのための多組織のノーザン分析を示して
いる。種々のヒト組織からの各々のレーンに２μｇポリＡ⁺ ｍＲＮＡを含んで
いるノーザンブロットニトロセルロース膜を³²Ｐ標識完全長ＺＰＩｃＤＮＡ
プローブ（上）または³²Ｐ標識β−アクチンｃＤＮＡプローブ（下）でハイブリ
ダイズされた。

【図８】図８はＺＰＩおよび他のセルピンのＣ末端アミノ酸配列のアライ
ンメントを示している。ラットｒａｓｐ−１（ＲＡＳＰ−１）およびヒトα１−
抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）、抗トリプシン関連配列（Ａ１ＡＵ）、抗トロンビン
（ＡＴ−ＩＩＩ）、ヘパリン補因子ＩＩ（ＨＣ−ＩＩ）およびプロテアーゼネ
キシン１（ＰＮ−１）はＧｅｎＢａｎｋデータベースから取り込まれた（各々寄
託番号２１４３９５３、１７０３０２５、１１２８９１、１１３９３６、１２３
０５５および１２１１１０）。同一アミノ酸は暗く影が付けられている。矢印は
各々のセルピン反応中心のＰ１残基を含んでいるカラムを示している。

【図９】図９は野生型および組換え体ＺＰＩの改変形のウェスタンブロッ
ト分析を示している。トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞（ＣＨＯ）およ
びｒＺＰＩ（ＷＴ）（Ｔｙｒ）、ｒＺＰＩ（Ｙ３８７Ａ）（Ａｌａ）およびｒＺ
ＰＩ（Ｙ３８７Ｒ）（Ａｒｇ）を発現しているＣＨＯ細胞からの無血清馴化培地
（１０μＬ）が１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマウスモノクローナル抗ＺＰＩ抗
体を用いてウェスタンブロッティングで分析された。前染色分子量標品の移動は
ｋＤａで左に示されている。ブロットの下に各々の馴化培地のＺＰＩ活性が掲げ
られている（２回の測定の平均）。〜５４，０００に同定されたタンパク質バン
ドはトランスフェクトされていないＣＨＯ細胞の馴化培地で検出され、ｒＺＰＩ
とは関係がないようである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ブローズ，ジョージ・ジェイ，ジュニアアメリカ合衆国ミズーリ州63110，セント・ルイス，サウス・キングスハイウェイ・ブルヴァード 216，ワシントン・ユニバーシティ・スクール・オブ・メディスン，バーンズ−ジューイッシュ・ホスピタル・オブ・セント・ルイス，デパートメント・オブ・インターナル・メディスン，ディヴィジョン・オブ・ヘマトロジーＦターム(参考） 4B024 AA01 BA19 CA04 DA02 GA11 HA12 4C084 AA02 BA01 BA08 BA18 BA22 CA18 CA36 CA53 NA14 ZA542 ZC412 4H045 AA10 AA20 AA30 BA16 CA42 DA56 EA24 FA74 HA04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下のように特徴付けられる精製および単離されたヒトプロ
テインＺ依存性プロテアーゼインヒビター：（ａ）約７２ｋＤａの分子量を持ち、（ｂ）ＬｅｕＡｌａＰｒｏＳｅｒＰｒｏＧｌｎＳｅｒＰｒｏ１５ＧｌｕＴｈｒＰｒｏＡｌａ［配列番号：１６］１０のＮ末端アミノ酸配列を持つ単鎖タンパク質であり、そして（ｃ）プロテインＺ、カルシウムイオンおよびセファリン存在下で第Ｘａ因子の迅速な阻害を引き起こす。
【請求項２】血清または血漿中の第Ｘａ因子を阻害するための方法であっ
て、該血清または血漿と有効阻害量の請求項１に記載のヒトプロテインＺ依存性
プロテアーゼインヒビターを接触させることを含む、前記方法。
【請求項３】配列番号：８の４２３アミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列を含む、精製および単離されたＤＮＡ分子。
【請求項４】配列番号：７のヌクレオチド配列を有する、請求項３に記載
の精製および単離されたＤＮＡ分子。
【請求項５】配列番号：８の４２３アミノ酸配列を有する、精製および単
離されたプロテインＺ依存性プロテアーゼインヒビター。
【請求項６】血清または血漿中の第Ｘａ因子を阻害するための方法であっ
て、該血清または血漿と有効阻害量の請求項５に記載のヒトプロテインＺ依存性
プロテアーゼインヒビターを接触させることを含む、前記方法。
【請求項７】血液凝固阻害を必要としている患者において血液凝固を阻害
する方法であって、該患者にプロテインＺ、ＺＰＩおよびプロテインＺおよびＺ
ＰＩの組み合わせから成る群から選択される凝固阻害剤を血液凝固を阻害するた
めの十分量で投与することを含む、前記方法。
【請求項８】凝固阻害剤がプロテインＺである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】凝固阻害剤がＺＰＩである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】ＺＰＩが配列番号：８の４２３アミノ酸配列を有する、請
求項９に記載の方法。
【請求項１１】凝固阻害剤がプロテインＺおよびＺＰＩの組み合わせであ
る、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】ＺＰＩが配列番号：８の４２３アミノ酸配列を有する、請
求項１１に記載の方法。
【請求項１３】医薬的に受容可能な担体または希釈剤中のプロテインＺお
よびＺＰＩを含む医薬組成物。
【請求項１４】ＺＰＩが配列番号：８の４２３アミノ酸配列を有する、請
求項１３に記載の組成物。