WO2006106695A1 - 高感度血液学的アッセイ及び試薬 - Google Patents

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WO2006106695A1
WO2006106695A1 PCT/JP2006/306357 JP2006306357W WO2006106695A1 WO 2006106695 A1 WO2006106695 A1 WO 2006106695A1 JP 2006306357 W JP2006306357 W JP 2006306357W WO 2006106695 A1 WO2006106695 A1 WO 2006106695A1
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factor
reagent
coagulation
phospholipid
blood
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PCT/JP2006/306357
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Inventor
Takashi Koizumi
Yoshinobu Yamazaki
Original Assignee
Kissei Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
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    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96444—Factor X (3.4.21.6)

Definitions

  • the present invention relates to a reagent, a kit, an access method thereof, and the like for use in a blood coagulation system assembly. More specifically, the present invention is intended to be used in a blood coagulation system assay of a direct factor Xa inhibitor containing activated blood coagulation factor X (hereinafter referred to as “factor Xa”), phospholipids and calcium ions. Reagent, kit and assay method using them.
  • blood coagulation system accessories Various methods for quantifying the effect of blood coagulation factor inhibitors on the blood coagulation system and measuring the concentration of blood coagulation factor inhibitors in blood and plasma (hereinafter referred to as "blood coagulation system accessories") are known. ing.
  • This blood coagulation system assembly can be classified into two methods: a method of measuring the inhibitory activity of coagulation factors (eg, factor Xa, thrombin, etc.) using a chromogenic synthetic substrate, and a method of measuring the coagulation time.
  • coagulation factors eg, factor Xa, thrombin, etc.
  • Methods for measuring the inhibitory activity of clotting factor factor Xa or thrombin using a chromogenic synthetic substrate usually include factor Xa or thrombin (anti-thrombin is also added if necessary) Add chromogenic synthetic substrate and plasma decomposed by factor Xa or thrombin to the solution, and measure the absorbance etc. of the resulting chromogenic synthetic substrate degradation product to determine factor Xa or thrombin activity or blood coagulation.
  • This is a method for calculating the concentration of a factor inhibitor (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • this method is not widely used in the clinical field because it requires a dedicated device and the work is complicated.
  • the coagulation time measurement method is a method of activating the coagulation system by adding various activators to blood or plasma, and measuring the time until fibrin formation. Also called.
  • PT prothrombin time
  • APTT activated partial thromboplastin time
  • ⁇ thrombin time
  • ACT activated coagulation
  • ECT Ecarin clotting time
  • PiCT Prothrombinase-induced clotting time
  • ACCUCLOT HEPTEST (trademark) Measurement method (hereinafter referred to as “ACCUCL ⁇ T method”).
  • the PiCT method is a method for inducing clotting by a Prothrombinase Complex. Specifically, after antithrombin-dependent blood coagulation factor inhibitor in plasma and the added Xa factor bind in the absence of calcium ions, calcium chloride is added and the remaining Xa factor Va factor, which is fully activated by RVV—V (Factor V factor derived from Russell's snake venom), forms a complex with calcium ions on phospholipids, and increases its enzymatic activity.
  • RVV—V Vector V factor derived from Russell's snake venom
  • Dependent clotting time prothrompinase-induced clotting time, PiCT is measured (eg, Patent Document 1 and Non-Patent Document 3).
  • ACCUCLOT is a method in which citrate plasma is incubated with factor Xa, then RECA LMIX TM (Haemachem) (phospholipid, fibrinogen, blood coagulation factor V (hereinafter “factor V”). And erythrocytes), and a coagulation time is measured (for example, Non-Patent Document 4).
  • RECA LMIX TM Hemachem
  • factor V blood coagulation factor V
  • erythrocytes erythrocytes
  • thromboplastin and calcium ions are added to citrate plasma to enhance the coagulation system, and the time required for coagulation with thrombin.
  • R is a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • Z is a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • a benzenesulfonamide derivative see Patent Document 2
  • Razaxa ban Bristol-Myers Squibb
  • DX_ 9065a Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.
  • other direct factor Xa inhibitors have been developed (see Non-Patent Document 6, for example).
  • These direct factor Xa inhibitors unlike heparin, low molecular weight heparin, Fondaparinux (ARIXTRA (trademark), GlaxoSmithKline), etc., directly inhibit clotting without using antithrombin and mediated thrombin.
  • Patent Document 1 International Publication WO01 / 44819 Pamphlet
  • Patent Document 2 International Publication WO02 / 28827 Pamphlet
  • Non-patent literature l Teien, AN and Lie, M .: Thromb. Res. 1977; 10th edition: pp.399-410
  • Non-patent literature 2 Michio Fujisaki, Katsuyuki Fukutake, Katseido Publishing, Blood Coagulation Handbook ”, 1992, 2nd revised edition, pp.163-182
  • Non-Patent Document 3 Calatzis A, 5 others, Haemostasis, 2000, No. 30 (Suppl. 2), pp.17 2-174
  • Non-patent literature 4 Harenberg J, 3 others, Haemostasis, 1989, 19th, pp.13-20
  • Non-patent literature 5 Proctor RR, 1 others, Am J Clin Path., 1961, 41st , Pp.212-219
  • Non-Patent Document 6 Johannes Ruef, 1 other, Expert Opin. Investig. Drugs., 2003, 12th pp. 781-797
  • An object of the present invention is to provide a reagent, a kit, an assay method thereof, and the like that can be directly used for a blood coagulation assay of a factor Xa inhibitor.
  • the present inventors have prepared a mixed reagent containing factor Xa, phospholipid and calcium ion, and highly activated factor Xa. Surprisingly, it has been found that the method of mixing with sampnore has a high sensitivity and prolongation of the clotting time in the blood coagulation system assay of the factor Xa inhibitor, and the present invention has been achieved.
  • Direct factor Xa inhibitors are razaxaban, DX_ 9065a, YM_ 150, DU_ 176b, ZK807834 (CI— 1031), JTV— 803, BAY— 59— 7939, ⁇ tamixaban, Fide xaban, BIBT_ 986, Apixaban,
  • a reagent containing factor Xa, a phospholipid Kit for direct use in blood coagulation system of factor Xa inhibitor combined reagent containing calcium ion and reagent containing calcium ion (provided that factor V, activated factor V or factor V activated) Contains enzyme Except)
  • Direct factor Xa inhibitors are razaxaban, DX_ 9065a, YM_ 150, DU_ 176b, ZK807834 (CI— 1031), JTV— 803, BAY— 59— 7939, ⁇ tamixaban, Fide xaban, BIBT_ 986, Apixaban,
  • Reagent for use in blood coagulation system assembly of a blood sample and a direct factor Xa inhibitor containing factor Xa, phospholipid and calcium ion (provided that factor V, activated factor V or (2) a method for directly measuring the blood coagulation time, and a method for directly measuring the blood coagulation system of a factor Xa inhibitor;
  • Direct factor Xa inhibitors are razazaban, DX_ 9065a, YM_ 150, DU-176 b, ZK807834 (CI— 1031), JTV—803, BAY—59— 7939, ⁇ tamixaban, Fid exaban, BIBT—986, Apixaban, benzenesulfonamide derivative represented by the above general formula (I) or pharmacology thereof
  • the direct factor Xa inhibitor is a direct coagulation factor inhibitor that directly inhibits coagulation factors such as factor Xa and thrombin without using antithrombin III ( ⁇ ).
  • coagulation factors such as factor Xa and thrombin without using antithrombin III ( ⁇ ).
  • those that are easy to use as oral administration agents or direct coagulation factor inhibitors with a molecular weight of 1000 or less are preferred.
  • Rasaki Sano-kun, YM-150, DU-176b, ZK807834 (CI-1031), BAY-59-7939, Otamixaban, Fidexaban, BIBT-986, Apixaban, benzenesulfone represented by the above general formula (I) Amide derivatives and the like are preferable.
  • the benzensulfonamide derivative represented by the general formula (I) includes [4- [2— (5 amidino 1-2 hydroxybenzenesulphonylamino) ethyl] 2 ′ methanesulfonylbiphenyl-2-yloxy] acetic acid ( (Hereinafter referred to as “compound 2”), [4 [2- (5 amidino 2 hydroxybenzenesulfonylamino) ethyl] 2, 1 methanesulfonylbiphenyl 3 yloxy] n-butyl acetate, [4_ [2-hydroxy-1 5_ (N-hydroxycarbamiminole) benzenesulfonylamino] ethyl] _ 2, -methanesulfonylbiphenyl_ 3 _yloxy] acetic acid, [4_ [2- [2-hydroxy-1 5 _ (N-hydroxycarbamimidoyl)] Benzenes
  • factor Xa examples include human plasma-derived factor Xa, ushi plasma-derived factor Xa, and the like.
  • concentration of factor Xa in the reagent at the time of use gives a practical clotting time.
  • the range of 1 to: 10 m international units / mL (hereinafter referred to as “mU / mL”) is preferable, and the range of 0.5 to 5 mU / mL is more preferable.
  • the phospholipid examples include cephalin or a mixture containing phosphatidylethanolamine, phosphatidinorecholine and phosphatidylserine, and preferably cephalin.
  • concentration of the phospholipid in the reagent at the time of use is preferably in the range of 1 to 100 ⁇ g ZmL, which gives a practical clotting time, and more preferably in the range of 4 to 50 ⁇ g ZmL.
  • calcium chloride is preferable.
  • the calcium ion concentration in the reagent at the time of use may be determined as appropriate depending on, for example, the amount of blood or plasma clotting that can be resumed by kenenate blood collection, but is usually in the range of 10 to 100 mmol / L.
  • the kit of the present invention comprises a combination of a reagent containing factor Xa, a reagent containing phospholipid and a reagent containing calcium ion; and a reagent containing factor Xa and phospholipid and a reagent containing calcium ion.
  • Any combination of reagents containing factor Xa, reagents containing phospholipids and reagents containing calcium ions; or containing reagents containing calcium ions and factor Xa and phospholipids A combination of a reagent containing factor Xa and phospholipids and a reagent containing calcium ions is preferred. Is preferable.
  • the reagent used in the reagent or kit of the present invention includes, in addition to each component of factor Xa, phospholipid, or calcium ion, a buffering agent, a pH adjuster (eg, hepes, Tris HC1, etc.) , Osmotic pressure regulators (sodium chloride, mannitol, etc.), albumin, preservatives, preservatives (eg, azinatrium), solvents and the like may be included as appropriate.
  • a buffering agent eg, hepes, Tris HC1, etc.
  • Osmotic pressure regulators sodium chloride, mannitol, etc.
  • preservatives eg, azinatrium
  • solvents and the like may be included as appropriate.
  • Examples of the reagent of the present invention include aqueous solutions, powders, freeze-dried powders, and the like.
  • the dried reagent can also be produced by vacuum drying or freeze-drying a solution containing factor Xa, phospholipid and calcium ions by a known method or a method based thereon.
  • the blood sample may be administered with a blood coagulation factor inhibitor regardless of whether the blood coagulation ability is normal or abnormal.
  • Blood collected from untreated human or non-human animals by a method that can be used for blood coagulation (eg, kenenate blood sampling) or plasma thereof, and commercially available standard human plasma for human blood coagulation tests, human control plasma Or normal animal plasma etc. are mentioned.
  • a human or non-human animal that has been or has not been administered a blood coagulation factor inhibitor is further preferred.
  • blood plasma obtained from a non-human animal and collected from kenic acid is usually incubated before the activator is added. Incubation may be appropriately performed at 25 to 40 ° C. for 0 to 5 minutes, but it is generally performed at 37 ° C. for 60 seconds.
  • the measurement of blood coagulation time can be performed using a fully automatic or semi-automatic blood coagulation measuring apparatus whose measurement principle is light scattering, transmitted light, absorbance, a magnetic sensor, or a viscosity change detection method, or can be performed by a method.
  • FIG. 1 shows the effect of prolonging the coagulation time of compound 2 by various coagulation time measurement methods.
  • the horizontal axis represents the plasma concentration of Compound 2 (nmol / L), and the vertical axis represents the ratio of clotting time to control.
  • circles indicate the KXaT method
  • diamonds indicate the ACCUCLOT method
  • squares indicate the PT method
  • triangles indicate the APTT method.
  • the coagulation time by compound 2, which is a direct factor Xa inhibitor was measured.
  • a blood coagulation automatic measuring device ST4 (Roche Diagnostics) was used for the measurement.
  • Table 1 Coagulation time by PT method, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ method, ACCUCL OT method
  • the coagulation time was directly measured by Compound 1, Compound 2, Razaxavan hydrochloride and DX-9065a, which are direct factor Xa inhibitors.
  • a blood coagulation automatic measurement device ST4 (Roche Diagnostics) was used for the measurement. Place 50 ⁇ L of test drug-added plasma samples of various concentrations prepared in the same manner as the PT method described in Reference Example 1 in a measurement cuvette, preincubate for 60 seconds at 37 ° C, and then add Pefakit PiCT (trademark, Penta)
  • Pharma's activation reagent (Reagent 1) (containing factor Xa, RVV-V, phospholipid, hepes, and mannitol) was added, and the mixture was further incubated at 37 ° C for 180 seconds. Next, a starting reagent (reagent 2) (containing 25 mM salt calcium carbonate) 100 was added thereto to start coagulation, and the coagulation time was measured.
  • Reagent 1 containing factor Xa, RVV-V, phospholipid, hepes, and mannitol
  • reagent 2 containing 25 mM salt calcium carbonate
  • each coagulation time with Compound 2 was measured using an automatic blood coagulation measuring device ST4 (Roche Diagnostics). It was measured.
  • the PT method did not provide sufficient sensitivity. That is, as the concentration of Compound 2 increased, the coagulation time was extended, but the extension range was small with respect to the change in the drug concentration in the low concentration range. In the PiCT method, there was no correlation between the concentration of Compound 2 and the clotting time within the concentration range used.
  • KXaT coagulation reagents The following coagulation-promoting reagents used in the KXaT method (hereinafter referred to as “KXaT coagulation reagents”) Prepared by the method.
  • Coagulation Factor Xa human plasma (trademark) (Calbiochem) 10U vial was dissolved in lmL distilled water to prepare lOUZmL solution.
  • Phosphatidylethanolamine (PE) 24 ⁇ g / mL
  • KXaT coagulation reagents containing different concentrations of factor Xa from 0 to 10 mU / mL listed in Table 4 were prepared.
  • the other compositions were set to be the same as in Composition Example 1.
  • Standard human plasma (Dido Behring) supplemented with compound 2 at concentrations of 0 (contorole), 20, 200, and 2000 nmol / L was placed in a cuvette for measurement, and preincubated at 37 ° C for 60 seconds. Later, 100 ⁇ L of each concentration of KXaT coagulation reagent was added to start coagulation, and the coagulation time (seconds) was measured.
  • Blood coagulation automatic measuring device ST4 (Roche Diagnostics) was used for the measurement.
  • KXaT coagulation reagents containing various concentrations of phospholipid were prepared.
  • phospholipids of PE 24 ⁇ g / mL, PC 10 ⁇ g / mL and PS 12 ⁇ g / mL are used as standard amounts (1 ⁇ ), and 0.05 to 2 times the concentration of phospholipids is contained
  • a KXaT coagulation reagent was prepared.
  • the concentrations of Factor Xa and calcium chloride were the same as in Composition Example 1.
  • a measurement cuvette put 50 x L of standard human plasma (Dido Behring) supplemented with Compound 2 with a concentration of 0 (control nore), 20, 200, 2000 nmol / L, and 37 ° C. After 60 seconds of pre-incubation, 100 ⁇ L of KXaT coagulation reagent prepared to various phospholipid concentrations was added to start coagulation, and the coagulation time (second) was measured by the KXaT method. A blood coagulation automatic measuring device ST4 (Roche Diagnostics) was used for the measurement.
  • Example 4 Standard added with KXaT coagulation reagent of composition 1 and compound 2 at concentrations of 0 (control control), 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2 ⁇ mol / L Using human plasma (Dido Behring), the coagulation time (seconds) by the KXaT method was measured three times for the same sampnore in the same manner as described in Example 2. As shown in Table 6, the reproducibility was extremely excellent.
  • the sample was prepared once a day, and the coagulation time (seconds) by the KX aT method was measured for 3 days.
  • excellent day-to-day reproducibility was shown.
  • KXaT coagulation reagent with composition 1 and 0, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2 ⁇ molZL of compound 2, razaxavan hydrochloride or DX-9065a Coagulation time (seconds) by KXa T method was measured in the same manner as described in Example 4 using normal citrate plasma (Cosmo Bio).
  • KXaT coagulation reagent with composition 1 and 0, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2 ⁇ molZL of compound 2, razaxavan hydrochloride or DX-9065a Coagulation time (seconds) by KXa T method was measured in the same manner as described in Example 4 using normal citrate plasma (Cosmo Bio).
  • Table 8 for any study drug, Prolongation of clotting time was observed depending on the concentration, and a correlation was observed between the factor Xa inhibitory activity of each compound and the effect of prolonging clotting time.
  • Table 8 Coagulation time of various direct factor Xa inhibitors by K X a T method
  • the coagulation time (second) was measured by the KXaT method. As shown in Table 11, the clotting time was prolonged depending on the drug concentration.
  • the KXaT method compared to the existing methods such as the PT method, APTT method, PiCT method, and ACCUCLOT method against various direct Xa factor inhibitors such as Compound 1, Compound 2, Razaxaban, DX_9065a, etc. It was confirmed that the reaction was extremely sensitive. In addition, simultaneous re- The KXaT method showed excellent reproducibility in terms of on-site, daily reproducibility, and lot-to-lot reproducibility of human citrate plasma. Therefore, the reagent and method of the present invention are very useful for blood coagulation system assay of direct factor Xa inhibitor.

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Abstract

　直接Ｘａ因子阻害薬の血液凝固系アッセイに使用し得る試薬、キット及びそのアッセイ方法等を提供する。本発明は、Ｘａ因子、リン脂質及びカルシウムイオンを含有する、血液凝固系アッセイに使用するための試薬等に関するものである。すなわち、直接Ｘａ因子阻害薬の血液凝固系アッセイに有用な、Ｘａ因子、リン脂質及びカルシウムイオンを含有する試薬（但し、第Ｖ因子、Ｖａ因子又は第Ｖ因子活性化酵素を含有するものを除く）もしくはキット、又はそれらを使用することを特徴とする、直接Ｘａ因子阻害薬の血液凝固系アッセイ方法等を提供する。

Description

明 細 書
高感度血液学的アツセィ及び試薬
技術分野
[0001] 本発明は、血液凝固系アツセィに使用するための試薬、キット及びそのアツセィ方 法等に関するものである。更に詳しく述べれば、本発明は、活性化血液凝固第 X因 子 (以下、「Xa因子」という）、リン脂質及びカルシウムイオンを含有する、直接 Xa因子 阻害薬の血液凝固系アツセィに使用するための試薬、キット及びそれらを使用したァ ッセィ方法等に関するものである。
背景技術
[0002] 血液凝固系に対する血液凝固因子阻害薬の効果を定量したり、血液や血漿中の 血液凝固因子阻害薬濃度を測定する方法 (以下、「血液凝固系アツセィ」という）は種 々知られている。この血液凝固系アツセィは、発色性合成基質を用いて凝固因子（例 えば、 Xa因子、トロンビン等）の阻害活性を測定する方法と、凝固時間測定法の 2つ に分類することができる。
[0003] 発色性合成基質を用いて凝固因子である Xa因子又はトロンビンの阻害活性を測 定する方法は、通常、 Xa因子又はトロンビン (必要に応じて、アンチトロンビンも添カロ される）を含む溶液中に、 Xa因子又はトロンビンにより分解される発色性合成基質及 び血漿を添加し、生じた発色性合成基質分解物の吸光度等を測定することにより、 X a因子もしくはトロンビン活性、又は血液凝固因子阻害薬の濃度を算出する方法であ る (例えば、非特許文献 1参照)。しかし、この方法は、専用装置を必要とし、作業が 煩雑であるなどの理由から、臨床現場においてはあまり広く用いられていない。
[0004] また、凝固時間測定法は、血液又は血漿に、種々の活性化剤を添加することにより 、凝固系を活性化させ、フイブリン形成までの時間を測定する方法であり、「凝固法」 とも呼ばれる。例えば、 PT (プロトロンビン時間）法（以下、「PT法」という）、 APTT (活 性化部分トロンボプラスチン時間）法（以下、「ΑΡΤΤ法」という）、 ΤΤ (トロンビン時間） 法、 ACT (活性化凝固時間）法、 ECT (ェカリン凝固時間）法、 PiCT (プロトロンビナ ーゼ誘発凝固時間）法（以下、「PiCT法」という）、 ACCUCLOT HEPTEST (商標 )を用いた測定法（以下、「ACCUCL〇T法」という）等が含まれる。これらの方法は、 へパリン、低分子へパリンのような間接的凝固阻害薬や凝固因子合成阻害薬である ヮーフアリンによる抗凝固療法の血中薬物モニタリングに使用されている（非特許文 献 2参照）。
[0005] 以下に、代表的な凝固時間測定法の例を説明する。
PiCT法は、 Prothrombinase Complexにより凝固を惹起する方法である。具体 的には、血漿中のアンチトロンビン依存性の血液凝固因子阻害薬と添加された Xa因 子とがカルシウムイオン非存在下で結合した後に、塩ィ匕カルシウムが添加され、残存 する Xa因子と RVV—V (ラッセルクサリへビ毒に由来する第 V因子ァクチべ一ター） により十分に活性化された Va因子とがリン脂質上にカルシウムイオンとの複合体を形 成し、その酵素活性に依存する凝固時間（プロトロンピナーゼ誘発凝固時間、 PiCT) が測定される（例えば、特許文献 1及び非特許文献 3)。それゆえ、測定には二段階 の試薬 (pef akit PiCT (商標）、ペンタファーマ社、活性化試薬及び開始試薬）添 加が必要であり、また、活性化試薬添加後の処理時間によりその値が変動するという 問題がある。
[0006] ACCUCLOT法は、クェン酸血漿を、 Xa因子とインキュベーションした後、 RECA LMIX (商標）（Haemachem社）（リン脂質、フイブリノ一ゲン、血液凝固第 V因子（以 下、「第 V因子」とレ、う）に富むゥシ血漿画分及びカルシウムイオンを含有する）により 処理し、凝固時間を測定する方法である (例えば、非特許文献 4)。各試薬は、市販 のキット（ACCUCLOT HEPTEST (商標）、 Trinity Biotech社）を使用する。
[0007] PT法は、クェン酸血漿に、トロンボプラスチン及びカルシウムイオン（ネオプラスチ ン試薬、ロシュ'ダイァグノテイクス社)をカ卩えることにより、凝固系を亢進させ、トロンビ ンにより凝固するまでの時間（プロトロンビン時間、以下、「PT」という）を測定する方 法である（例えば、非特許文献 5)。
[0008] 以上の各種凝固時間測定法の中には、活性化剤として Xa因子、リン脂質及びカル シゥムイオンを用レ、るものもあるが、それらは同時に、第 V因子、活性化血液凝固第 V 因子 (以下、「Va因子」という）又は血液凝固第 V因子活性化酵素（以下、「第 V因子 活性化酵素」という）を含むものである。 [0009] ところで、近年、例えば、下記一般式 (I)
[0010] [化 1]
Figure imgf000005_0001
(式中の Rは水素原子又は低級アルキル基であり、 Zは水素原子又は水酸基である） で表されるベンゼンスルホンアミド誘導体（特許文献 2参照）、ラザキサバン (Razaxa ban,ブリストノレマイヤーズスクイブ社）、 DX_ 9065a (第一製薬）等の直接 Xa因子 阻害薬が開発された (例えば、非特許文献 6参照)。これらの直接 Xa因子阻害薬は、 へパリン、低分子へパリン、 Fondaparinux (ARIXTRA (商標）、グラクソスミスクライ ン社)等と異なり、アンチトロンビンを介さず直接に凝固を阻害し、トロンビンを介した 血液凝固系を阻害しないことから、出血傾向等の副作用が少なレ、、血液凝固系疾患 の治療薬として注目されている。し力 ながら、直接 Xa因子阻害薬は、臨床において 抗血栓作用を発現する濃度域 (治療域)では PT、 ΑΡΤΤ等の凝固時間の延長をほと んど示さなレ、ため、血液凝固系に対する効果を評価することができなレ、。
[0011] 従って、直接 Xa因子阻害薬の適切な処方のための、簡便かつ臨床使用可能な方 法の早期開発が切望されている。
特許文献 1：国際公開 WO01/44819パンフレット
特許文献 2：国際公開 WO02/28827パンフレット
非特許文献 l : Teien, A.N. and Lie, M. : Thromb. Res. 1977年;第 10卷： pp.399- 410 非特許文献 2 :藤卷道男、福武勝幸編、克誠堂出版、「血液凝固ハンドブック」、 1992 年、改訂第 2版、 pp.163-182
非特許文献 3： Calatzis A、他 5名、 Haemostasis、 2000年、第 30卷（Suppl. 2号)、 pp.17 2-174
非特許文献 4 : Harenberg J、他 3名、 Haemostasis、 1989年、第 19卷、 pp.13- 20 非特許文献 5： Proctor RR、他 1名、 Am J Clin Path. , 1961年、第 41卷、 pp.212-219 非特許文献 6 : Johannes Ruef、他 1名、 Expert Opin. Investig. Drugs.、 2003年、第 12 卷、 pp.781- 797
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 本発明は、直接 Xa因子阻害薬の血液凝固系アツセィに使用し得る試薬、キット及 びそのアツセィ方法等を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明者らは、前記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、 Xa因子、リン脂質及 びカルシウムイオンを含有する混合試薬を調製し、 Xa因子を高活性化させた後に、 血液サンプノレと混合する方法により、直接 Xa因子阻害薬の血液凝固系アツセィにお いて、驚くべきことに、高感度で凝固時間の延長を示すことを見出し、本発明を成す に至った。
[0014] 即ち、本発明は、
〔1〕 Xa因子、リン脂質及びカルシウムイオンを含有する、直接 Xa因子阻害薬の血 液凝固系アツセィに使用するための試薬 (但し、第 V因子、活性化第 V因子又は第 V 因子活性化酵素を含有するものを除く）；
〔2〕 溶解したとき水溶液 lmLあたり、 Xa因子を 0. 1〜： ! OmU、リン脂質を:!〜 100 / g含有する、前記〔1〕記載の試薬；
〔3〕 Xa因子を 0· 1〜： 10mU/mL、リン脂質を:!〜 100 /i g/mL含有する、前記〔 2〕記載の試薬；
〔4〕 前記〔3〕記載の試薬を乾燥して製造される試薬；
〔5〕 直接 Xa因子阻害薬が、ラザキサバン、 DX_ 9065a、 YM_ 150、 DU_ 176b 、 ZK807834 (CI— 1031)、 JTV— 803、 BAY— 59— 7939、〇tamixaban、 Fide xaban、 BIBT_ 986、 Apixaban、前記一般式（I)で表されるベンゼンスルホンアミド 誘導体又はその薬理学的に許容される塩である、前記〔1〕又は〔2〕記載の試薬； 〔6〕 Xa因子を含有する試薬、リン脂質を含有する試薬及びカルシウムイオンを含有 する試薬を組み合わせた、直接 Xa因子阻害薬の血液凝固系アツセィに使用するた めのキット (但し、第 V因子、活性化第 V因子又は第 V因子活性化酵素を含有するも のを除く）；
〔7〕 Xa因子及びリン脂質を含有する試薬並びにカルシウムイオンを含有する試薬 を組み合わせた、前記〔6〕記載のキット；
〔8〕 Xa因子を 0. 1〜： 10mU/mL、リン脂質を:!〜 100 z g/mLを含有する前記〔 6〕又は〔7〕記載のキット；
〔9〕 直接 Xa因子阻害薬が、ラザキサバン、 DX_ 9065a、 YM_ 150、 DU_ 176b 、 ZK807834 (CI— 1031)、 JTV— 803、 BAY— 59— 7939、〇tamixaban、 Fide xaban、 BIBT_ 986、 Apixaban、前記一般式（I)で表されるベンゼンスルホンアミド 誘導体又はその薬理学的に許容される塩である、前記〔6〕〜〔8〕のいずれかに記載 のキット；
〔10〕 （1)血液サンプルと、 Xa因子、リン脂質及びカルシウムイオンを含有する直接 Xa因子阻害薬の血液凝固系アツセィに使用するための試薬 (但し、第 V因子、活性 化第 V因子又は第 V因子活性化酵素を含有するものを除く）とを混合する工程、 (2) 血液凝固時間を測定する工程からなる、直接 Xa因子阻害薬の血液凝固系アツセィ 方法；
〔11〕 （l) Xa因子、リン脂質及びカルシウムイオンを含有する直接 Xa因子阻害薬の 血液凝固系アツセィに使用するための混合試薬 (但し、第 V因子、活性化第 V因子 又は第 V因子活性化酵素を含有するものを除く）を調製する工程、（2) (1)の試薬と 血液サンプルとを混合する工程、及び（3)血液凝固時間を測定する工程を含む、直 接 Xa因子阻害薬の血液凝固系アツセィ方法；
〔12〕 Xa因子を 0· 1〜： 10mU/mL、リン脂質を:!〜 100 /i g/mL含有する試薬（ 但し、第 V因子、活性化第 V因子又は第 V因子活性化酵素を含有するものを除く）を 使用することを特徴とする、前記〔10〕又は〔11〕記載のアツセィ方法；
〔13〕 血液サンプルがヒト血漿である、前記〔10〕〜〔： 12〕のいずれかに記載のアツセ ィ方法；
[14] 血液サンプノレが直接 Xa因子阻害薬を投与したヒトから採取したものである、 前記〔13〕記載のアツセィ方法；
〔15〕 直接 Xa因子阻害薬が、ラザキサバン、 DX_ 9065a、 YM_ 150、 DU—176 b、 ZK807834 (CI— 1031)、 JTV— 803、 BAY— 59— 7939、〇tamixaban、 Fid exaban、 BIBT— 986、 Apixaban、前記一般式（I)で表されるベンゼンスルホンアミ ド誘導体又はその薬理学的に許容される塩である、前記〔10〕〜〔14〕のいずれかに 記載のアツセィ方法；等に関するものである。
[0015] 本発明において、直接 Xa因子阻害薬とは、アンチトロンビン III (ΑΤΙΠ)を介さず、 X a因子、トロンビン等の凝固因子を直接阻害する直接凝固因子阻害薬のうち、 Xa因 子に対して阻害作用を有するものをレ、い、例えば、ラザキサバン、 DX_ 9065a、 Y M— 150、 DU— 176b、 ZK807834 (CI— 1031)、 JTV— 803、 BAY— 59— 793 9、 Otamixaban, Fidexaban、 BIBT— 986、 Apixaban、 M— 55165、 M— 5555 1、前記一般式 (I)で表されるベンゼンスルホンアミド誘導体その他の特許文献 2記 載の化合物、 3 - [N- (3 アミジノフヱニル） _N_〔N_ [4-〔1 _ (1—イミノエチ ノレ）ピぺリジン _4_ィル〕フエニル〕力ルバモイルメチル〕アミノメチル〕フエノキシ酢酸 •硫酸塩 (以下、「ィ匕合物 1」という）等が挙げられる。また、経口投与剤として使用し易 いもの、又は分子量 1000以下の直接凝固因子阻害薬が好ましい。例えば、ラザキ サノくン、 YM— 150、 DU— 176b、 ZK807834 (CI— 1031)、 BAY— 59— 7939、 Otamixaban、 Fidexaban、 BIBT— 986、 Apixaban、前記一般式（I)で表される ベンゼンスルホンアミド誘導体等が好ましい。また、前記一般式 (I)で表されるベンゼ ンスルホンアミド誘導体としては、 〔4—〔2— (5 アミジノ一 2 ヒドロキシベンゼンス ノレホニルァミノ）ェチル〕 2' メタンスルホ二ルビフエ二ルー 3 ィルォキシ〕酢酸（ 以下、「化合物 2」という）、 〔4 〔2—（5 アミジノー 2 ヒドロキシベンゼンスルホ二 ノレアミノ）ェチル〕 2， 一メタンスルホ二ルビフエ二ルー 3 ィルォキシ〕酢酸 n ブ チル、 〔4_〔2—ヒドロキシ一 5_ (N—ヒドロキシカルバミミドィノレ）ベンゼンスルホニル ァミノ〕ェチル〕_ 2，—メタンスルホ二ルビフヱニル _ 3 _ィルォキシ〕酢酸、 〔4_ [2 -〔2—ヒドロキシ一 5 _ (N—ヒドロキシカルバミミドイル）ベンゼンスルホニルァミノ〕ェ チル〕 _ 2，—メタンスルホ二ルビフエニル— 3 _ィルォキシ〕酢酸 n_ブチル等が好 ましい。
[0016] Xa因子としては、例えば、ヒト血漿由来 Xa因子、ゥシ血漿由来 Xa因子等を挙げる ことができる。使用時の試薬中の Xa因子の濃度は、実用的な凝固時間が得られる 0 . 1〜： 10m国際単位/ mL (以下、「mU/mL」という）の範囲が好ましぐ 0. 5〜5m U/mLの範囲が更に好ましい。
リン脂質としては、例えば、セフアリン、又はフォスファチジルエタノールァミン、フォ スファチジノレコリン及びフォスファチジルセリン等を含有する混合物等を挙げることが でき、好ましくは、セフアリンが挙げられる。使用時の試薬中のリン脂質の濃度は、実 用的な凝固時間が得られる 1〜： 100 μ gZmLの範囲が好ましぐ 4〜50 μ gZmLの 範囲が更に好ましい。
カルシウムイオン源としては、塩化カルシウムが好ましい。使用時の試薬中のカルシ ゥムイオンの濃度は、例えば、クェン酸採血による血液又は血漿の凝固を再開しうる 量等で適宜決定すればよいが、通常、 10〜： 100mmol/Lの範囲とすることができる
[0017] 本発明のキットは、 Xa因子を含有する試薬、リン脂質を含有する試薬及びカルシゥ ムイオンを含有する試薬の組合せ; Xa因子及びリン脂質を含有する試薬とカルシゥ ムイオンを含有する試薬との組合せ; Xa因子及びカルシウムイオンを含有する試薬と リン脂質を含有する試薬との組合せ; Xa因子を含有する試薬とリン脂質及びカルシゥ ムイオンを含有する試薬との組合せ；又は Xa因子、リン脂質及びカルシウムイオンを 含有する試薬;のいずれでもよぐ Xa因子を含有する試薬、リン脂質を含有する試薬 及びカルシウムイオンを含有する試薬の組合せ；又は Xa因子及びリン脂質を含有す る試薬とカルシウムイオンを含有する試薬との組合せ；が好ましぐ Xa因子及びリン脂 質を含有する試薬とカルシウムイオンを含有する試薬との組合せが更に好ましい。
[0018] 本発明の試薬又はキットに用レ、る試薬には、 Xa因子、リン脂質又はカルシウムィォ ンの各成分のほか、緩衝化剤、 pH調整剤（例えば、へぺス、トリス HC1等）、浸透圧 調節剤 (塩化ナトリウム、マンニトール等）、アルブミン、保存剤、防腐剤（アジィ匕ナトリ ゥム等）、溶媒等を適宜含んでいてもよい。
[0019] 本発明の試薬の形態としては、水溶液、粉末、凍結乾燥した粉末等が挙げられる。
[0020] 乾燥した試薬は、 Xa因子、リン脂質及びカルシウムイオンを含有する溶液を、公知 の方法やそれに準拠した方法により真空乾燥又は凍結乾燥することにより、製造する こともできる。 [0021] 本発明の血液凝固系アツセィ方法（以下、「KXaT法」ともいう）において、血液サン プルとしては、血液凝固能の正常、異常を問わず、血液凝固因子阻害薬を投与もし くは未投与のヒトもしくは非ヒト動物から血液凝固系アツセィに使用可能な方法 (例え ば、クェン酸採血等）により採血された血液もしくはその血漿、及び市販の血液凝固 試験用標準ヒト血漿、ヒトコントロール血漿もしくは正常動物血漿等が挙げられる。血 液凝固因子阻害薬を投与又は未投与のヒト又は非ヒト動物から、クェン酸採血された 血液又はその血漿が好ましぐ血液凝固因子阻害薬、特に直接 Xa因子阻害薬を投 与したヒト又は非ヒト動物から、クェン酸採血された血液の血漿が更に好ましい。 また、ヒト又は非ヒト動物から採取した血液又は血漿は、活性化剤を添加する前に、 通常、インキュベーションを行う。インキュベーションは、 25〜40° Cで、 0〜5分間で 適宜行えばよいが、 37° Cで 60秒間行うのが一般的である。
血液凝固時間の測定は、測定原理が光散乱、透過光、吸光度、磁気センサー又は 粘度変化感知方式の完全自動又は半自動の血液凝固測定装置を用いて行うか、用 手法で行うこともできる。
図面の簡単な説明
[0022] [図 1]図 1は、各種凝固時間測定法による、化合物 2の凝固時間延長効果を示す。横 軸は、化合物 2の血漿中濃度（nmol/L)を表し、縦軸は、コントロールに対する凝固時 間の比を表す。図中、丸は KXaT法、ダイアモンドは ACCUCLOT法、四角は PT法 、三角は APTT法による凝固時間をそれぞれ示す。
発明を実施するための最良の形態
[0023] 本発明の内容を以下の参考例、実施例で更に詳細に説明するが、本発明はその 内容に限定されるものではない。
実施例
[0024] 参者例 1
PT法、 APTT法及び ACCUCLOT法を用いて、直接 Xa因子阻害薬である化合 物 2による凝固時間を測定した。測定には血液凝固自動測定装置 ST4 (ロシュ'ダイ ァグノスティックス社製）を用いた。
[0025] 1) PT法による凝固時間の測定 血液凝固試験用標準ヒト血漿 (ディドべ一リング社）に各種濃度の直接 Xa因子阻害 薬を添加し、被験薬物添加血漿サンプルを調製した。測定用キュベットに各種濃度 の被験薬物添加血漿サンプルを 50 μ L入れ、 37° Cで 60秒間プレインキュペートし た後に、ネオプラスチン試薬（ロシュ'ダイァグノスティックス社） 100 μ Lを加えて凝固 を開始させ、凝固時間を測定した。
2) ΑΡΤΤ法による凝固時間の測定
測定用キュベットに上記 ΡΤ法と同様にして調製した各種濃度の被験薬物添加血 漿サンプルを 50 L入れ、 37° Cで 40秒間プレインキュペートした後に、 ΡΤΤ試薬「 RDJ (ロシュ'ダイァグノスティックス社） 50 μ Lを加えて 180秒間インキュベートした。 これに、 50 しの 25mmol/L塩化カルシウム水溶液を加えて凝固を開始させ、凝 固時間を測定した。
3) ACCUCLOT法による凝固時間の測定
測定用キュベットに上記 PT法と同様にして調製した各種濃度の被験薬物添加血 漿サンプルを 50 /i L入れ、 37° Cで 60秒間プレインキュペートした後に、 ACCUCL OT HEPTEST (商標）の Xa因子溶液（ゥシ Xa因子、ゥシ血清アルブミン、塩化ナト リウム、 PEG及びトリスマレエート含有）を加えた。 120秒後に、同 ACCUCLOT H EPTESTの RECALMIX (商標）（ゥサギ脳セフアリン、塩化カルシウム、フイブリノ一 ゲン、第 V因子等含有)を 100 / L添加して凝固を開始させ、凝固時間を測定した。
[0026] 結果を、表 1及び図 1に示す。 PT法、 APTT法、 ACCUCLOT法の各方法で、そ れぞれコントロールに対し、化合物 2濃度の上昇に伴って凝固時間の延長が認めら れた。しかしながら、低濃度域での薬物濃度の変化に対し、凝固時間の延長時間が 短ぐ十分な感度は得られなかった。
[0027] [表 1] 表 1 ： P T法、 Α Ρ Τ Τ法、 A C C U C L OT法による凝固時間
Figure imgf000012_0001
[0028] 参者例 2
1) PiCT法による凝固時間の測定
PiCT法を用いて、直接 Xa因子阻害薬である化合物 1、化合物 2、ラザキサバン塩 酸塩及び DX— 9065aによる凝固時間を測定した。測定には血液凝固自動測定装 置 ST4 (ロシュ'ダイァグノスティックス社製）を用いた。測定用キュベットに、参考例 1 記載の PT法と同様にして調製した各種濃度の被験薬物添加血漿サンプルを 50 μ L 入れ、 37° Cで 60秒間プレインキュペートした後に、 Pefakit PiCT (商標、 Penta
Pharma社）の活性化試薬（試薬 1) (Xa因子、 RVV— V、リン脂質、へぺス、マンニ トール含有）を加えて、 37° Cで 180秒間、更にインキュベーションした。次いで、こ れに開始試薬 (試薬 2) (25mM塩ィ匕カルシウム含有） 100 を加えて凝固を開始さ せ、凝固時間を測定した。
[0029] 結果を、表 2に示す。 直接 Xa因子阻害薬である化合物 1、化合物 2、ラザキサバン 塩酸塩、 DX_ 9065aのいずれに対しても、被験薬物濃度と凝固時間に相関性が認 められず、明らかに異常な凝固時間の挙動を示した。従って、 PiCT法は、これらの 直接 Xa因子阻害薬の血液凝固系アツセィには、使用できないと考えられる。
[0030] [表 2] 表 2 ：直接的 X a因子阻害薬濃度に対する P i C T法による凝固時間
Figure imgf000013_0001
[0031] 参考例 3
1 ) PT法及び PiCT法による凝固時間の測定
参考例 1記載の PT法及び参考例 2記載の PiCT法と同様にして、血液凝固自動測 定装置 ST4 (ロシュ'ダイァグノスティックス社製）を用いて、化合物 2による各凝固時 間を測定した。
その結果、表 3に示すように、 PT法では、十分な感度は得られなかった。すなわち 、化合物 2濃度の上昇に伴って、凝固時間の延長が認められたが、低濃度域での薬 物濃度の変化に対し、延長幅が小さかった。また、 PiCT法では、用いた濃度範囲に おいて化合物 2の濃度と凝固時間に相関が認められなかった。
[0032] [表 3]
Figure imgf000013_0002
上段：凝固時間； 下段：コント口一ル凝固時間に対する比 龍歹' 11
の纏
KXaT法に使用する凝固促進試薬 (以下、「KXaT凝固試薬」という）を、以下の方 法で調製した。
1) PTT試薬 [RD] (ロシュ'ダイァグノスティックス社)の PTT試薬（セフアリン含有） 1 バイアルを 5mLの STA塩化カルシウム（25mmol/L)に溶解した。
2) Coagulation Factor Xa, human plasma (商標）（カルビオケム社） 10Uバ ィアルを lmLの蒸留水に溶解し、 lOUZmL溶液を調製した。
3) 2)で調製した Factor Xa, human plasma lOUZmL溶液を 100 μ L取り、 1)で調製した液 9900 μ Lに加えた。
4) 3)の液を、 1)で調製した液で更に、 100倍に希釈して、下記組成例 1の KXaT 凝固試薬を調製した。
組成例 1
Factor Xa : lmU/ mL
塩化カルシウム： 25mmolZL
リン脂質:
フォスファチジルエタノールァミン（PE)： 24 μ g/mL
Figure imgf000014_0001
フォスファチジルセリン（PS) : 12 /i g/mL
pH : 7. 0
[0034] 実施例 2
Xa因子濃度
実施例 1記載と同様の方法で、表 4に記載の 0〜： 10mU/mLの異なる濃度の Xa 因子を含む KXaT凝固試薬を調製した。この時、その他の組成は、組成例 1と同じに なるようにした。測定用キュベットに、 0 (コントローノレ）、 20、 200、 2000nmol/Lの 濃度の化合物 2を添加した標準ヒト血漿 (ディドべ一リング社)をそれぞれ 入れ 、 37° Cで 60秒間プレインキュペートした後に、各濃度の KXaT凝固試薬をそれぞ れ 100 μ L加えて凝固を開始させ、凝固時間（秒)を測定した。測定には血液凝固自 動測定装置 ST4 (ロシュ'ダイァグノスティックス社製）を用いた。
[0035] 結果を、表 4に示す。 Xa因子の添加濃度が、 0. 1〜： !OmUZmLの範囲で、化合 物 2の濃度依存的に凝固時間の延長が認められた。一般に、コントロールの凝固時 間が長すぎると待ち時間が長くなり、逆に、短すぎると測定の誤差が生じやすくなる。 いずれの濃度においても測定は可能であった力 特に、 0. 5mU/mL〜5mU/m Lの範囲では、コントロールでの凝固時間が約 30秒〜 1分 30秒であり、例えば、 200 nmolZLの化合物 2に対して、約 30秒〜 70秒の凝固時間の延長が認められ、低濃 度域でも感度のよい血液凝固系アツセィが可能であった。
[表 4]
表 4 ： X a因子濃度
Figure imgf000015_0001
[0037] 実施例 3
リン脂晳濃度
実施例 1記載と同様の方法で、各種濃度のリン脂質を含む KXaT凝固試薬を調製 した。この時、 PE 24 μ g/mL、 PC 10 μ g/mL及び PS 12 μ g/mLのリン脂 質を基準量（1倍)として、その 0. 05倍〜 2倍濃度のリン脂質を含有する KXaT凝固 試薬を調製した。 Xa因子、塩化カルシウムの濃度は、組成例 1と同じにした。測定用 キュベットに、 0 (コントローノレ）、 20、 200、 2000nmol/Lの濃度のィ匕合物 2を添カロ した標準ヒト血漿 (ディドべ一リング社)をそれぞれ 50 x L入れ、 37° Cで 60秒間プ レインキュベートした後に、各種濃度のリン脂質濃度に調製した KXaT凝固試薬を、 それぞれ 100 μ Lを加えて凝固を開始させ、 KXaT法による凝固時間（秒）を測定し た。測定には血液凝固自動測定装置 ST4 (ロシュ'ダイァグノスティックス社製）を用 いた。
[0038] 結果を、表 5に示す。基準量の 0. 05〜2倍の範囲のリン脂質の濃度において、化 合物 2の濃度に依存して凝固時間の延長が認められた。一般に、コントロールの凝固 時間が長すぎると待ち時間が長くなり、逆に、短すぎると測定の誤差が生じやすくな る。基準量の 0. 1倍以上のリン脂質の濃度において測定は可能であった力 特に、 基準量の 0. 1倍〜 1倍の範囲では、コントロールでの凝固時間が約 30秒〜 60秒で あり、例えば、 200nmol/Lの化合物 2に対して、約 30秒〜 60秒の凝固時間の延長 が認められ、実用的で感度のよい血液凝固系アツセィが可能であった。
[表 5] 表 5 ： リン脂質濃度
Figure imgf000016_0001
[0040] 実施例 4 組成 1の KXaT凝固試薬、及び 0 (コントローノレ）、 0. 02、 0. 06、 0. 2、 0. 6、 2 μ mol/Lの濃度の化合物 2を添加した標準ヒト血漿 (ディドべ一リング社)を用いて、実 施例 2記載の方法と同様にして、同一サンプノレにつき、 KXaT法による凝固時間（秒 )を各 3回測定した。表 6に示す通り、極めて優れた同時再現性を示した。
[0041] [表 6]
表 6 ：同時再現性
Figure imgf000017_0001
[0042] 実施例 5
日間再現性
組成 1の KXaT凝固試薬、及び 0 (コントローノレ）、 0. 02、 0. 06、 0. 2、 0. 6、 2 μ mol/Lの濃度の化合物 2を添加した標準ヒト血漿 (ディドべ一リング社)を用いて、実 施例 2記載の方法と同様にして、 1日 1回ずつ調製したサンプルにっき、 3日間、 KX aT法による凝固時間（秒）を測定した。表 7に示す通り、優れた日間再現性を示した。
[0043] [表 7]
表 7 ： 日間再現性
Figure imgf000017_0002
実施例 6
組成 1の KXaT凝固試薬、及び 0 (コン卜ローノレ）、 0. 02、 0. 06、 0. 2、 0. 6、 2 μ molZLの濃度の化合物 2、ラザキサバン塩酸塩又は DX— 9065aを添加した正常ヒ トクェン酸血漿 (コスモバイオ社）を用いて、実施例 4記載の方法と同様にして、 KXa T法による凝固時間（秒）を測定した。表 8に示す通り、いずれの被験薬においても、 濃度に依存して凝固時間の延長が認められ、また、各化合物の Xa因子阻害活性と 凝固時間延長効果に相関性がみられた。
[表 8] 表 8 ：各種直接 X a因子阻害薬の K X a T法による凝固時間
Figure imgf000018_0001
[0046] 実施例 7
組成 1の KXaT凝固試薬、及び 0 (コントローノレ）、 0. 02、 0. 06、 0. 2、 0. 6、 2 μ mol/Lの濃度の化合物 2を添加した種々のロットの正常ヒトクェン酸血漿（コスモバ ィォ社)を用いて、実施例 4記載の方法と同様にして、 KXaT法による凝固時間（秒) を測定した。表 9に示す通り、いずれのロットにおいても、濃度依存的に凝固時間の 延長が認められ、反応性は同等であった。
[0047] [表 9]
表 9 ：特異性及び濃度反応性
Figure imgf000018_0002
参者例 4
0 (コントローノレ）、 6、 20、 60、 200、 600ng/mLの濃度の Fondaparinuxを用レヽ て、参考例 2及び実施例 4記載の方法と同様にして、それぞれ PiCT法及び KXaT法 による凝固時間（秒）を測定した。表 10に示す通り、アンチトロンビン依存性の間接 X a因子阻害薬である Fondaparinuxでは、 PiCT法に比して、 KXaT法における凝固 時間の延長効果は弱かった。
[表 10]
表 1 0 ：間接 X a因子阻害薬 F o n d a p a r i n u xによる凝固時間
Figure imgf000019_0001
[0050] 実施例 8
組成 1の KXaT凝固試薬、及び 0(コントローノレ）、 0. 02、 0. 06、 0. 2、 0. 6、 2μ mol/Lの濃度の化合物 2を添加した標準ヒト血漿 (ディドべ一リング社)を用いて、実 施例 2記載の方法と同様にして、 KXaT法による凝固時間（秒)を測定した。表 11に 示す通り、薬物濃度依存的に、凝固時間が延長した。
この結果を、参考例 1に記載した PT法、 PiCT法及び ACCUCLOT法の結果と併 せて、図 1に示す。図 1から、直接 Xa因子阻害剤である化合物 2に対して、低濃度域 での測定感度が、 KXaT法では、他の方法に比して、顕著に高いことがわ力、る。
[0051] [表 11] 表 1 1 ： KX a T法による凝固時間
Figure imgf000019_0002
以上の結果から、 KXaT法は、 PT法、 APTT法、 PiCT法、 ACCUCLOT法等の 既存の方法に比べ、化合物 1、化合物 2、ラザキサバン、 DX_9065a等、種々の直 接 Xa因子阻害薬に対して極めて鋭敏な反応を示すことが確認された。また、同時再 現性、 日間再現性、ヒトクェン酸血漿のロット間再現性においても、 KXaT法は、極め て優れた再現性を示した。従って、本発明の試薬及び方法は、直接 Xa因子阻害薬 の血液凝固系アツセィに極めて有用である。
産業上の利用可能性
本発明により、直接 Xa因子阻害薬の血液凝固系アツセィに使用し得る試薬、キッ ト及びそのアツセィ方法等を提供することができる。

Claims

請求の範囲
[1] Xa因子、リン脂質及びカルシウムイオンを含有する、直接 Xa因子阻害薬の血液凝 固系アツセィに使用するための試薬 (但し、第 V因子、活性化第 V因子又は第 V因子 活性化酵素を含有するものを除く）。
[2] 溶解したとき水溶液 lmLあたり、 Xa因子を 0. 1〜： 10mU、リン脂質を:!〜 100 μ g 含有する、請求項 1記載の試薬。
[3] Xa因子を 0. 1〜： 10mU/mL、リン脂質を:!〜 100 μ g/mL含有する、請求項 2記 載の試薬。
[4] 請求項 3記載の試薬を乾燥して製造される試薬。
[5] 直接 Xa因子阻害薬が、ラザキサバン、 DX— 9065a、 YM— 150、 DU— 176b、 Z
K807834 (CI— 1031)、 JTV— 803、 BAY— 59— 7939、〇tamixaban、 Fidexa ban, BIBT— 986、 Apixaban,一般式（I)
[化 1]
Figure imgf000021_0001
(式中の Rは水素原子又は低級アルキル基であり、 Zは水素原子又は水酸基である） で表されるベンゼンスルホンアミド誘導体又はその薬理学的に許容される塩である、 請求項 1又は 2記載の試薬。
[6] Xa因子を含有する試薬、リン脂質を含有する試薬及びカルシウムイオンを含有す る試薬を組み合わせた、直接 Xa因子阻害薬の血液凝固系アツセィに使用するため のキット（但し、第 V因子、活性化第 V因子又は第 V因子活性化酵素を含有するもの を除く）。
[7] Xa因子及びリン脂質を含有する試薬並びにカルシウムイオンを含有する試薬を組 み合わせた、請求項 6記載のキット。
[8] Xa因子を 0. 1〜： 10mU/mL、リン脂質を：!〜 100 μ g/mLを含有する請求項 6 又は 7記載のキット。
[9] 直接 Xa因子阻害薬が、ラザキサバン、 DX— 9065a、 YM— 150、 DU— 176b、 Z
K807834 (CI— 1031)、 JTV— 803、 BAY— 59— 7939、〇tamixaban、 Fidexa ban, BIBT— 986、 Apixaban、一般式（I)
[化 2]
Figure imgf000022_0001
(式中の Rは水素原子又は低級アルキル基であり、 Zは水素原子又は水酸基である )で表されるベンゼンスルホンアミド誘導体又はその薬理学的に許容される塩である 、請求項 6〜8のいずれかに記載のキット。
[10] (1)血液サンプノレと、 Xa因子、リン脂質及びカルシウムイオンを含有する直接 Xa因 子阻害薬の血液凝固系アツセィに使用するための試薬 (但し、第 V因子、活性化第 V因子又は第 V因子活性化酵素を含有するものを除く）とを混合する工程、（2)血液 凝固時間を測定する工程力 なる、直接 Xa因子阻害薬の血液凝固系アツセィ方法。
[11] ( l) Xa因子、リン脂質及びカルシウムイオンを含有する直接 Xa因子阻害薬の血液 凝固系アツセィに使用するための混合試薬 (但し、第 V因子、活性化第 V因子又は 第 V因子活性化酵素を含有するものを除く）を調製する工程、 (2) (1)の試薬と血液 サンプノレとを混合する工程、及び（3)血液凝固時間を測定する工程を含む、直接 Xa 因子阻害薬の血液凝固系アツセィ方法。
[12] Xa因子を 0· 1〜： 10mU/mL、リン脂質を:!〜 100 /i g/mL含有する試薬（但し、 第 V因子、活性化第 V因子又は第 V因子活性化酵素を含有するものを除く）を使用 することを特徴とする、請求項 10又は 11記載のアツセィ方法。
[13] 血液サンプルがヒト血漿である、請求項 10〜： 12のいずれかに記載のアツセィ方法
[14] 血液サンプノレが直接 Xa因子阻害薬を投与したヒトから採取したものである、請求項 13記載のアツセィ方法。
[15] 直接 Xa因子阻害薬が、ラザキサバン、 DX— 9065a、 YM— 150、 DU— 176b、 Z K807834 (CI— 1031)、 JTV— 803、 BAY— 59— 7939、〇tamixaban、 Fidexa ban, BIBT— 986、 Apixaban、一般式（I)
[化 3]
Figure imgf000023_0001
(式中の Rは水素原子又は低級アルキル基であり、 Zは水素原子又は水酸基である )で表されるベンゼンスルホンアミド誘導体又はその薬理学的に許容される塩である 、請求項 10〜14のいずれかに記載のアツセィ方法。
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