JPH0365958B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は活性化された部分トロンボプラスチン
時間（以下「APTT」と略記する）の測光測定
法ならびにそれに適する試薬に関する。 活性化された部分トロンボプラスチン時間
（APTT）の測定はトロンボプラスチン時間（プ
ロトロンビン時間、クイツク値）と並んで最もし
ばしば実施される凝固試験である。APTTによ
り凝固の内因性経路の挙動について結論をひき出
すことができる。この試験のもう一つの重要な用
途はヘパリン療法の制御にある。APTTは高分
子キニノーゲン、プレカリクレインおよび第XII因
子、第因子、第因子、第因子、第因子お
よび第因子、それと並んでまた凝固抑制剤特に
ヘパリン療法でのアンチトロンビンおよびフイ
ブリノーゲン分解産物（アンチトロンビン）に
対しても感受性であり、これらはすべてAPTT
を延長させるものである。 APTT測定のための試薬は本質的に燐脂質お
よび適当な「接触相」活性剤を含有する。接触活
性化により第XII因子が活性化され、次にこれが第
XI因子およびプレカリクレインを活性化する。次
に試薬中に含有される脂質およびカルシウムイオ
ンにより全内因性経路の活性化が起こり、これは
フイブリン凝血塊形成で終了する。この時点まで
に必要な時間が測定助変数である。 接触相の活性剤としては無機物質特にシーライ
トまたはカオリンが使用される。それらと並んで
エラグ酸も使用される（米国特許第3486981号明
細書およびドイツ特許出願公開第2915310号明細
書参照）。エラグ酸は光学的に明瞭な試薬として
凝血塊形成の検出のための光学的測定法における
利点を有する。しかしながら「Biochemistry」
第20巻第7258〜7266頁（1982年）によれば有効な
種類は金属イオンとエラグ酸との水不溶性複合物
であるべきである。もう一つの活性剤は硫酸デキ
ストランである。 しかしながら接触相のこれら活性剤は非生理学
的でありそしてまた標準化困難でもある。例え
ば、カオリン活性化されたAPTTの凝固時間は
活性剤の粒子寸法に相当依存する。またいくつか
の凝固因子はかかる界面活性物質に強く吸着され
るのでこれらは接触因子の調製に吸着剤として使
用される。しかしながら、それと並んでかかる試
薬中に含有される燐脂質の組成もその結果にとつ
て重要である。凝血塊形成に至る本来の反応が
「カルシウム再添加」により開始される前の予備
培養時間の長さも重要な役割を演ずる。これは活
性化された凝固因子が血漿性抑制剤特にアンチト
ロンビンにより抑制されるからである。 凝固の生理学的活性剤としてはスルフアチドが
有効である〔「Biochem.」第19巻第1322〜1330頁
（1980年）および「Blood」第59巻第69〜75頁
（1982年）参照〕。スルフアチドはグリコスフイン
ゴリピツドの種類に属しそしてガラクトース環に
スルフエート基を含有する。この化合物群には脂
肪酸鎖の様式が相異する種種の種類が属してい
る。これらはすべての組織中において膜特に脳に
多量に検出され、そこから非常に純粋な形態で取
得することもできる。スルフアチドは血漿の接触
活性化においてカオリンより効果がある。 慣用のAPTT測定の終点はフイブリン凝血塊
の形成である。かかる凝血塊の形成は測定技術的
に追跡困難である。種々の機械的、電気的または
光学的方法を使用する多数の装置が開発された。 凝固因子にとつて色原体基質が導入されて以
来、これらを凝固酵素の測定に使用することも試
みられた。色原体基質の長所は複雑な高分子性の
天然基質と反対に低分子性基質の簡単な標準化可
能性にある。凝血塊の形成を測定する問題はなく
なつた。 「全体的試験」の実施にもすでに色原体基質が
用いられた。すなわち「Thrombos.Res.」第15
巻第351〜358頁（1979年）にはAPTT実施方法
が記載されている。これは燐脂質、カルシウムお
よび色原体性トロンビン基質Ｈ−Ｄ−Phe−Pip
−Arg−pNA（S2238）の存在下にエラグ酸を用
いる内因性経路の活性化に基づく（ここで
「Pip」はピペコリン酸を意味する）。この方法の
欠点は非生理的活性剤の使用、色原体基質の特異
性欠如および極端に長い測定時間（通常およそ
7.4分）である。個々の因子の感度については不
完全なデータしか公表されてなかつた。 もう一つの方法はP.Aiyappa氏により「Ann.
New York Acad.Sci.」第812〜821頁（1981年）
に記載されている。この測定系においては血漿を
燐脂質およびカルシウムイオンの存在下にエラグ
酸により５分間活性化しそしてその時までに形成
されたトロンビンを色原体基質を用いて測定す
る。この方法はフイブリン形成を来し、それが活
性トロンビンを包囲する。またトロンビンは抑制
によつて再び不活性化されうる。他方、病原性血
漿はたとえ遅れたとしても本来それができるので
あるが、選択された培養時間内で全然または不完
全にしか活性化され得ない。Aiyappa氏により記
載された方法では欠乏血漿においては凝固を測定
できない。 今や驚くべきことに、色原体基質を用いる前記
APTT法の本質的な欠点が特異性の高いトロン
ビン基質と組み合せて生理学的活性剤としてスル
フアチドを使用することにより除去されうること
が見出された。 それゆえ本発明は活性剤、凝固活性燐脂質また
は燐脂質混合物、カルシウムイオンおよびトロン
ビンに対する色原体基質を用い活性化された部分
トロンボプラスチン時間を測定するに当たり、活
性剤がスルフアチドまたはスルフアチド混合物で
あることを特徴とする方法に関する。 本発明はさらに、凍結された形態のスルフアチ
ド、燐脂質、溶性カルシウム塩および色原体基質
からなる活性化された部分トロンボプラスチン時
間測定のための試薬にも関する。 使用しうるスルフアチドは、例えばセルバ
（Serva）社、シグマ（Sigma）社またはスペル
コ（Supelco）社から商業上入手しうる。シリカ
ゲルでの薄層クロマトグラフイーで溶媒がクロロ
ホルム／メタノール／水（65：25：４）の混合物
である場合Rf値0.2〜0.3好ましくは0.25を有しそ
してクロロホルム／メタノール（40：15）の場合
Rf値0.25〜0.35好ましくは0.31を有するスルフア
チドが使用されるのが好ましい。しかしながらか
かるスルフアチドはまた記載された方法、例えば
「Anal.Biochem.」第100巻第364〜370頁（1979
年）に記載された方法により、または脳のアセト
ン抽出乾燥粉末からも取得されうる。価値ある試
験濃度は0.1〜50μg／mlである。スルフアチドは
はじめPH7.6のＮ−２−ヒドロキシエチルピペラ
ジン−N′−２−エタンスルホン酸（以下
「HEPES」と略記する）の50ミリモル／緩衝
液中に0.01ｇ／の濃度で懸濁させそして試薬の
調製に使用されうる。 燐脂質としては慣用の試薬中に用いられる動物
性および植物性脂質が使用されうる。人間の血小
板からの脂質または人間の胎盤抽出物の使用が特
に好ましい。外部経路をも活性化することのない
ようにこれら脂質が何らトロンボプラスチン活性
を有しないことが重要である。 トロンビンのための色原体基質はこの試験に使
用されうるためには特異的でなければならない。
何故ならばトロンビンは他の同様に活性化される
凝固因子の存在下に選択的に測定される筈だから
である。「クロモジム」（Chromozym ）TH
（Tos−Gly−Pro−Arg−pNA）（ここで「Tos」
はトルエンスルホニルを指す）およびS2160（Bz
−Phe−Val−Arg−pNA）は比較的非特異的で
あつてそしてカリクレインまたは第ａ因子およ
び第XIIａ因子のような他の凝固因子も示す。たと
え接触因子に対する特異性がここでもまたさほど
高くないとしてもS2238（HD−Phe−Pip−Arg−
pNA）の方がより適当である。ｐ−ニトロアニ
リンの他に他の発色団例えばクマリン誘導体を有
するペプチドも適当であり、その場合加水分解は
螢光を測定することにより追跡される。 APTTのようなグローバル試験に最も良く適
する色原体ペプチドは、ドイツ特許出願第
P3244030.8号明細書に記載されているようなトロ
ンビン基質である。これらは発色団として５−ア
ミノ−２−ニトロ安息香酸の誘導体を含有してい
る。 一般式 （式中ＲはC₁〜C₅−アルキルまたは−CH〔CH
（CH₃）₂〕COOCH₃でありそしてＸはＨ−Ｄ−
Phe−、BOC−Gly−またはトシル−Gly−であ
る）を有する化合物が使用されるのが好ましい。 基質は非常に低い濃度で使用されるのが好まし
い。Ｈ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−ANBS−イソプ
ロピルアミド（ここで「ANBS」は５−アミノ
−２−ニトロ安息香酸を意味する）を使用する場
合50μモル／で最良の結果が達成される。カル
シウム濃度は１〜10ミリモル／、好ましくは５
ミリモル／でなければならない。 スルフアチド、燐脂質、色原体基質およびカル
シウム塩好ましくは塩化カルシウムをPH7.2〜8.5
のHEPESまたはトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンのような緩衝液中に溶解または懸濁さ
せる。イミダゾール、グリシルグリシンまたはト
リエタノールアミンの各緩衝液も使用されうる。 本発明による方法は好都合には25〜37℃で血漿
試料を恒温槽中でこの温度の試薬と混合すること
により実施される。反応は測光計中405〜410nm
において追跡される。 代表的な正常血漿では吸光は暫くの間一定のま
まであり、そして次に数秒の間に強く上昇する。
定められた吸光差例えば0.1に達するに必要な時
間が測定助変数である。原則的には指数曲線の動
力学的評価も可能である。定められた基質量の反
応は、活性化されたトロンビンが所定量のフイブ
リノーゲンと反応しそしてそれにより凝血塊をひ
き起こす慣用のAPTTのそれと同様である。例
により、この新規方法は好ましい形態で内因性経
路の各個因子の活性変化を示すことがわかる。 ある種の固定された活性化時間ののち、本来の
凝血塊に至る反応がCaCl₂の添加により開始され
る慣用のAPTTと対照的に新規方法ではCaCl₂は
最初から添加でき、従つて１ピペツト操作だけ少
なくて済む（モノ試薬）。しかしながら原則上は
従来法と同様の試験システムも本発明による方法
で可能である。この目的には色原体ペプチドは
CaCl₂と一緒に所定の予備培養時間後にはじめて
添加される。予備培養期間中でもスルフアチド試
薬に少量のCaCl₂（約１ミリモル／）を添加し
そしてさらにCaCl₂溶液を添加することにより本
来の反応を開始させるのが好ましいことが証明さ
れた。最終濃度はここでもまたCaCl₂5ミリモ
ル／が最適である。 色原体基質と組み合せて血漿の接触活性化にス
ルフアチドを使用することは従来知られていなか
つた。試薬製造者はスルフアチドを０℃以下で保
存することを推奨する。スルフアチドを必要な他
の試薬成分と共に凍結乾燥しても全然安定な生成
物を生じない。APTTは常に劇的に長くなる。 驚くべきことに、血清アルブミン、ゼラチンま
たは減成されそして交叉結合したコラーゲンの添
加により安定で効果のある試薬が得られる。ただ
の約0.1〜１％の濃度により良好な活性を有する
凍結乾燥物が調製されうる。 慣用の試薬におけるように、欠乏血漿と組み合
せて内因性経路の個々の因子の測定が可能であ
る。これには他の凝固因子の影響を排除するため
に血漿試料を希釈するかまたはこれを使用される
欠乏血漿以上に使用する。 アミノ酸特にグルタミン、アスパラギンまたは
グルタミン酸の添加により試薬のヘパリン感度が
高められる。 以下の例により本発明を説明する。 例 新規試薬の因子感度試 薬 ３ミリモル／のＨ−Ｄ−Phe−Pro−Arg−
ANBS−イソプロピルアミド色原体基質（S82
107） 0.1ml フイブラクセル（Fibraccel ）１：1000（凝固
活性な均質な燐脂質複合物、ベーリングヴエル
ケ社製品） 0.5ml 0.01ｇ／のスルフアチド溶液〔スペルコ社製
品、シリカゲル上CHCl₃／MeOH／H₂O（65：
25：４）でRf＝0.25〕 0.5ml 緩衝液〔HEPES、NaCl、Ca²⁺：25、50、５
ミリモル／、PH7.6、ヘマセル（Haemaccel
）0.25％（ドイツ特許第1118792号および同
第1153134号明細書参照）〕 5.0ml混合物 血漿または欠乏血漿（ベーリングヴエルケ社製
品）、先天性第因子欠乏血漿 100μ 試 薬 １ml 37℃でE_405on＝0.1までの時間を測定した。 次の結果が得られた。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 活性剤、燐脂質、カルシウムイオンおよびト
   ロンビン用色原体基質を用い活性化された部分ト
   ロンボプラスチン時間（APTT）を測定するに
   当たり、活性剤がスルフアチドまたはスルフアチ
   ド混合物であることを特徴とする方法。 ２ 色原体基質が一般式 （式中、ＲはC₁〜C₅−アルキルまたは−CH
   〔CH（CH₃）₂〕COOCH₃でありそしてＸはＨ−Ｄ
   −Phe−、BOC−Gly−またはトシル−Gly−で
   ある）を有する化合物であることを特徴とする前
   記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ スルフアチド、燐脂質、溶性カルシウム塩お
   よびトロンビンのための色原体基質からなる活性
   化された部分トロンボプラスチン時間測定のため
   の試薬。 ４ 緩衝液好ましくはPH7.2〜8.5のHEPESを含
   有することを特徴とする前記特許請求の範囲第３
   項記載の試薬。 ５ アミノ酸を含有することを特徴とする前記特
   許請求の範囲第３項記載の試薬。 ６ 血清アルブミン、ゼラチンまたは減成または
   交叉結合したコラーゲンを含有することを特徴と
   する前記特許請求の範囲第３項記載の試薬。 ７ 凍結乾燥された形態で存在することを特徴と
   する前記特許請求の範囲第３項記載の試薬。