AT402074B - Reagens zur bestimmung der aptt - Google Patents

Description

AT 402 074 B

Die Erfindung betrifft ein Reagens zur Bestimmung der aPTT von gegebenenfalls Heparin- oder Heparinoid-hältigem(n) Blut, Plasma oder Blutderivaten.

In der AT-PS 398 983 B ist u.a. ein Initiator der intrinsischen Gerinnung von Blut, Plasma oder Blutderivaten beschrieben, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er ein Gemisch aus Sulfatiden und einem Feststoffaktivator, vorzugsweise Kaolin, enthält.

Es wurde nunmehr gefunden, daß die Bestimmung der aPTT von gegebenenfalls Heparin- oder Heparinoid-hältigen(m) Blut, Plasma oder Blutderivaten auch ohne Verwendung eines Gemisches aus Sulfatiden und Feststoffaktivator durchgeführt werden kann, wenn in einem Reagens zur Bestimmung der aPTT neben einem Initiator der intrinsischen Gerinnung, sei es nun ein Feststoffaktivator oder ein Flüssigaktivator oder eine Kombination derselben, ein Heparin-neutralisierendes Agens und Phospholipide enthalten sind.

Als Heparin-neutralisierende Agentien kommen insbesondere Polybren (Hexadimethinbromid, ein Copo-lymeres aus N,N,N',N'-Tetramethyl-1,6-hexandiamin und 1,3-Dibrompropan), Protamin (Protaminsalze) oder Heparinase im erfindungsgemäßen Reagens zur Anwendung.

Die Konzentrationen der zur Anwendung kommenden Heparin-neutralisierenden Agentien richtet sich größenordnungsmäßig nach der Heparin-Konzentration in der zu untersuchenden Probe, und liegt üblicherweise, etwa im Falle von Polybren, im Bereich zwischen 1 und 500 mg/ml. In standardmäßigen Verfahren werden zwischen 2 und 100 mg/ml Polybren verwendet.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reagens' enthält die Phospholipidkomponente, bezogen auf den Gesamtphospholipidgehalt, 5 bis 50 % Phosphatidylserin, 15 bis 60 % Phosphatidylcholin, 15 bis 60 % Phosphatidylethanol, 0 bis 20 % Cholesterin und 5 bis 20 % Phosphatidin-säure.

Die Phospholipide sind vorteilhafterweise in einer Weise gereinigt, sodaß unerwünschte Fällungsreaktionen, die in Gegenwart von Polybren auftreten können, vermieden werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung der partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) von Proben von gegebenenfalls Heparin- oder Heparinoid-hältigem(n) Blut, Plasma oder Blutderivaten, bei dem die Probe mit dem erfindungsgemäßen Reagens in Kontakt gebracht wird, nach einer vorbestimmten Aktivierungszeit Calciumionen zugesetzt werden und die Gerinnungszeit bestimmt wird.

Dieses Verfahren kann gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung verwendet werden, um die Aktivität von Faktoren der intrinsischen Gerinnung und deren Inhibitoren zu bestimmen. Dabei wird eine gegebenenfalls Heparin- oder Heparinoid-hältige Plasmaprobe mit dem erfindungsgemäßen Reagens in Kontakt gebracht, nach einer vorbestimmten Aktivierungszeit werden Calciumionen zugesetzt und die Gerinnungszeit bestimmt, worauf das erhaltene Ergebnis mit einer Standardprobe mit bekannter Aktivität der Faktoren in Bezug gesetzt wird.

Der Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht insbesondere in der Tatsache, daß die Bestimmung der aPTT und der Einzelfaktoren in einer Blut- oder Plasmaprobe unabhängig davon erfolgen kann, ob die Probe Heparin oder Heparinoide enthält oder nicht.

Die Erfindung betrifft weiters ein Set bestehend aus a) einem Reagens zur Bestimmung der aPTT, enthaltend einen Initiator der intrinsischen Gerinnung und Phospholipide, und b) einem Heparin-neutralisierenden Agens.

Obwohl die aPTT oft zur Überwachung einer Heparintherapie eingesetzt wird, wobei eine Heparin-Sensitivität erwünscht ist, gibt es doch viele Fälle, bei denen das intakte intrinsische System oder Faktoren des intrinsischen Systems unabhängig vom Heparingehalt untersucht werden müssen.

Sollte nämlich Heparin in der Probe enthalten sein und dadurch die aPTT bei Messung mit zum Stand der Technik gehörenden Reagentien verzögert werden, wird ein zu geringer Anteil an Gerinnungsfaktoren vorgetäuscht.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele noch näher erläutert. l.aPTT Bestimmung mit PTT Reagentien unterschiedlicher Zusammensetzung mit und ohne Zusatz von Polybren. Fünf verschiedene Reagentien werden in den vorliegenden Beispielen sowohl mit als auch ohne Zusatz von Heparin-neutralisierenden Agentien zur Bestimmung der aPTT eingesetzt. Diese Reagentien weisen folgende Zusammensetzung auf (die % sind Gew.%):

Reagens A: 0.075 % Kaolin und 0.01 % Sulfatid (Fa. Pentapharm) als Initiator, hochgereinigte Phospholipide (17 % Phosphatidylserin, 44 % Phosphatidylcholin, 29 % Phosphatidylethanolamin, 5 % Cholesterin und 5 % Phosphatidinsäure).

Das gebrauchsfertige Reagens wird durch Rekonstitution mit 2 ml Aqua dest. hergestellt (Konzentra- 2

AT 402 074 B tion der Phospholipide: 65 ug/ml).

Reagens B: wie Reagens A, jedoch nur 0.0017 % Suifatid

Reagens C: 0.5 % Kaolin, Lipidextrakt aus Schweinemucosa (Tachostyptan®, Fa. Hormonchemie).

Das gebrauchsfertige Reagens wird durch Rekonstitution mit 2 ml Aqua dest. hergestellt. 5 Reagens D: Aktin FS® der Fa. Baxter (enthält Ellagsäure als Initiator und Phospholipide aus Sojabohne). Reagens E: Pathromtim® der Fa. Behring (enthält 0.5 % Kaolin in flüssiger Suspension als Initiator und Lipidextrakt aus humaner Plazenta (lyo)).

Das gebrauchsfertige Reagens wird durch Lösen des Lipidextraktes in der Kaolinsuspension hergestellt. io Ein Normalplasma (NP; Immunocontrolplasma Normal der Fa. Immuno) bzw. heparinisiertes Normalplasma mit 0.4 E Heparin/ml (HP1) oder 1.0 E Heparin/ml (HP2) wurden als Piasmaproben verwendet. 0.1 ml Plasmaprobe wurden mit 0.1 ml Reagens versetzt. Nach einer zweiminütigen Inkubationszeit bei 37 *C wurden 0.1 ml 0.025 M CaCh-Lösung zugesetzt und die Zeit bis zum Gerinnungspunkt mit einem Schnitger-Gross-Koagulometer (Fa. Amelung) gemessen. 75 Tabelle 1 zeigt die erhaltenen Resultate, wobei in Zeile 1 die Gerinnungszeit (in Sekunden) von Normalplasma (NP), in den Zeilen 2 und 3 die Gerinnungszeit der heparinisierten Plasmen (HP1 und HP2) und in den Zeilen 4 und 5 das Verhältnis zwischen den Gerinnungszeiten der heparinisierten Plasmen und von Normalplasma angegeben wird. 20 o. Polybren = ohne Polybren P. = Polybren

Tabelle 1

Reagenz A Reagenz C Reagenz D Reagenz E 0. Polybren 25mg/l P. o. Polybren 25mg/l P. o. Polybren 25mg/l P. o. Polybren 50mg/l P. NP sec. 34.0 32.4 52.4 68.0 43.1 65.9 34.1 46.6 HP1 sec. 52.9 36.1 123.1 75.8 99.8 67.6 76.1 50.9 HP2 sec. 214.1 39.1 253.4 80.3 283.4 59.1 210.1 96.2 Ratio HP1/NP 1.56 1.11 2.35 1.11 2.32 1.03 2.23 1.09 Ratio HP2/NP 6.30 1.21 4.84 1.18 6.58 0.90 6.16 2.06

Die Resultate zeigen deutlich, daß die aPTT bei heparinisierten Plasmen ohne Anwesenheit von Polybren deutlich verlängert und daher verfälscht bzw. verzerrt wird. Bei Anwesenheit von Polybren kann mit allen getesteten Reagentien die aPTT auch von heparinisierten Plasmen bestimmt werden. Das Verhältnis zwischen den Gerinnungszeiten der heparinisierten Plasmen und von Normalplasma, welches im Idealfall gleich 1 ist (d.h. die Gerinnungszeit ist exakt dieselbe), weicht bei den Tests mit den Reagentien ohne Polybren ganz erheblich vom Idealwert 1 ab, wohingegen das Verhältnis der Gerinnungszeiten bei Anwesenheit von Polybren nahe bei 1 liegt. 2. Faktor VHI-Bezugskurve mit PTT Reagentien unterschiedlicher Zusammensetzungen mit und ohne Zusatz von Polybren.

Zur Erstellung dieser Bezugskurven wurde ein Referenzplasma (Reference Plasma 100 % der Fa. Immuno) verwendet. Dieses Referenzplasma wurde in 1 ml Aqua dest. (RP) bzw. mit 1 ml Aqua dest., enthaltend 1 E/ml Heparin (Fa. Immuno) (HP), gelöst.

Die Plasmen wurden 1:5 mit Imidazolpuffer (3.4 g/l Imidazol, 5.85 g/l NaCI, pH 7.4) vorverdünnt; dies entspricht 100 % Faktor VIII. Weitere Verdünnungen wurden gemäß einer geometrischen Verdünnungsreihe (1:1 = 100 % bis 1:128 = 0.78 %) hergestellt. 0.1 ml der Probe wurden mit 0.1 ml Reagens vermischt und 4 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 0.1 ml 0.025 M CaCb-Lösung zugesetzt und die Zeit bis zum Gerinnungspunkt mit einem Schnitger-Gross-Koagulometer gemessen.

Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2 bis 5 dargestellt. 3

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Tabelle 2

Reagenz A F.VIII (%) o. Polybren 25 mg/ml Polybren RP HP RP HP 100 54.7 82.0 40.0 42.2 50 65.2 78.6 48.6 47.6 25 73.5 82.1 52.0 52.1 12.5 81.7 86.6 58.3 58.0 6.25 90.7 92.6 64.5 64.6 3.13 98.1 104.1 70.6 71.6 1.56 107.2 108.6 78.6 78.6 0.78 115.1 117.6 83.6 83.6

Tabelle 3

Reagenz C F.VIII (%) o. Polybren 12.5 mg/ml Polybren RP HP RP HP 100 81.6 129.1 90.1 87.6 50 91.3 105.6 99.6 99.6 25 104.5 102.1 113.1 110.6 12.5 110.6 109.1 123.1 127.6 6.25 121.5 120.1 138.1 134.6 3.13 130.5 132.1 150.1 151.1 1.56 141.6 143.1 163.1 163.1 0.78 150.5 151.6 177.5 175.1

Tabelle 4

Reagenz D F.VIII (%) o. Polybren 25 mg/ml Polybren RP HP RP HP 100 60.6 107.2 70.1 65.6 50 71.7 84.1 25 79.0 82.6 100.1 93.6 12.5 88.1 89.6 6.25 98.1 100.1 3.13 109.1 109.6 140.6 138.6 1.56 118.1 118.2 0.78 127 126.6 164 160.5 4

Claims (2)

1. AT 402 074 B Tabelle 5 Reagenz E F.VIII (%) o. Polybren 50 mg/ml Polybren RP HP RP HP 100 54.9 127.5 72.1 68.1 50 61.2 98.5 78.4 75.1 25 67.4 96.4 87.9 82.6 12.5 74.2 102.4 94.9 92.1 6.25 83.4 112.6 106.2 105.1 3.13 89.9 120.6 113.2 115.6 1.56 97.1 131.6 121.1 125.5 0.78 102.4 140.9 127.6 131.6 Die Ergebnisse zeigen, daß im Normalfall (Plasma ohne Heparin; RP, Reagentien ohne Polybren) eine eindeutige Korrelation zwischen der Gerinnungszeit und der Faktor Vlll-Konzentration besteht: Je geringer die Konzentration an Faktor VIII, desto länger die Gerinnungszeit. Bei der Messung von Heparin-hältigen Proben (HP, Reagentien ohne Polybren) zeigt sich keine eindeutige Korrelation, die Messung ergibt eine unbrauchbare Faktor Vlll-Bezugskurve, die keine lineare Zuordnung von Gerinnungszeit und Faktor VI 11 -Konzentration ermöglicht. Erst die Anwesenheit von Polybren in den Reagentien ermöglicht eine Bestimmung der Faktor Vlll-Konzentration in heparinhältigen Proben (HP, Reagentien mit 12.5/25/50 mg/ml Polybren). Die Ergebnisse der Messungen werden durch die Anwesenheit von Heparin aber auch Polybren bei Verwendung des erfindungsgemäßen Reagens nicht verfälscht. Dies zeigt sich sowohl beim Vergleich der Messungen von RP mit Reagentien mit und ohne Polybren, als auch beim Vergleich der Gerinnungszeiten von RP und HP in Anwesenheit von Polybren, deren Quotient immer ganz nahe bei 1 liegt. 3. aPTT-Bestimmung mit Reagens B mit und ohne Zusatz von Heparinase. Immunocontrolplasma Normal (Fa. Immuno) wurde in 1 ml Aqua dest. gelöst, das 0, 0.5 oder 1 U/ml Heparin enthielt. Reagens B wurde in 1 ml Aqua dest. gelöst, welches 0, 0.74, 0.22, 0.07 und 0.02 E/ml Heparinase (Fa. IBEX, Kanada) enthielt. Die PTT-Bestimmung wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse der durchgeführten Messungen sind in Tabelle 6 dargestellt. Tabelle 6 Heparin in Plasma E/ml Heparinase E/ml 0 0.02 0.07 0.22 0.74 0.0 33.6 33.6 33.1 33.6 38.3 0.5 52.4 45.8 41.8 37.7 41.4 1.0 85.8 65.6 50.8 47.3 42.3 Diese Ergebnisse zeigen, daß sich auch ein Reagens enthaltend Heparinase vorzüglich zur aPTT- Bestimmung von heparinisiertem Plasma eignet. Patentansprüche 1. Reagens zur Bestimmung der aPTT von Blut, Plasma oder Blutderivaten, enthaltend einen Initiator der intrinsischen Gerinnung, dadurch gekennzeichnet, daß es, wenn es zur Bestimmung der aPTT von Heparin oder Heparinoid-hältigem(n) Blut, Plasma oder Blutderivaten dienen soll, ein Heparin-neutrali-sierendes Agens und Phospholipide enthält.
2. 2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Hexadimethrinbromid, ein Protaminsalz oder Heparinase als Heparin-neutralisierendes Agens enthält. 5 AT 402 074 B Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Phospholipidkomponente, bezogen auf den Gesamtphospholipidgehalt, 5 bis 50 % Phosphatidylserin, 15 bis 60 % Phosphatidyl-cholin, 15 bis 60 % Phosphatidylethanol, 0 bis 20 % Cholesterin und 5 bis 20 % Phosphatidinsäure enthält. Verfahren zur Bestimmung der partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) von Proben von gegebenenfalls Heparin- oder Heparinoid-hältigem(n) Blut, Plasma oder Blutderivaten, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe mit einem Reagens nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 in Kontakt gebracht wird, nach einer vorbestimmten Aktivierungszeit Calciumionen zugesetzt werden und die Gerinnungszeit bestimmt wird. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 4 zur Bestimmung der Aktivität von Faktoren der intrinsischen Gerinnung und deren Inhibitoren, dadurch gekennzeichnet, daß eine gegebenenfalls Heparinoder Heparinoid-hältige Plasmaprobe mit einem Reagens nach den Ansprüchen 1 bis 3 in Kontakt gebracht wird, nach einer vorbestimmten Aktivierungszeit Calciumionen zugesetzt werden und die Gerinnungszeit bestimmt wird, worauf das erhaltene Ergebnis mit dem einer Standardprobe mit bekannter Aktivität der Faktoren in Bezug gesetzt wird. Reagenssatz, bestehend aus a) einem Reagens zur Bestimmung der aPTT, enthaltend einen Initiator der intrinsischen Gerinnung und Phospholipide, und b) einem Heparin-neutralisierenden Agens. 6