WO2000050904A1 - Testkit zur analytik der faktor-viii-spaltenden protease - Google Patents

Testkit zur analytik der faktor-viii-spaltenden protease Download PDF

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Miha Furlan
Peter Turecek
Katalin Varadi
Jürgen SIEKMANN
Bernhard LÄMMLE
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    • G01N2333/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C [AHF], factor VIII Ag [VWF]

Definitions

  • the present invention relates to a test kit and a method for determining the protease splitting von Willebrand factor and the application of the method for the differential diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) and the hemolytic-uremic syndrome (HUS).
  • TTP thrombotic thrombocytopenic purpura
  • HUS hemolytic-uremic syndrome
  • a test kit consisting of a von Willebrand factor standard preparation, which is free of Willebrand factor-splitting activity, as a substrate for the von Willebrand factor-splitting activity in a sample or in the patient plasma and a system for quantitative determination of the binding of von Willebrand factor to collagen enables the analysis of the von Willebrand factor-splitting protease and the differential diagnosis between patients with thrombotic thrombocytopenic purpura and patients with hemolytic-uraemic syndrome for the first time in a simple manner.
  • the von Willebrand factor standard preparation can be inactivated specifically with regard to Willebrand factor-splitting protease, but a generally protease-inactivated von Willebrand factor standard preparation can also be used.
  • the quantitative determination of the collagen binding activity is carried out on immobilized avid collagen, which is preferably present bound to a microtiter plate. It is advantageous if the immobilized .collagen is covalently bound.
  • the avide collagen is an enzymatically degraded, soluble, human collagen.
  • the von Willebrand factor standard preparation is preferably a human reference plasma, in which the protease activity cleaving by Willebrand factor is inactivated.
  • the von Willebrand factor standard preparation is a recombinant von Willebrand factor.
  • the present invention also relates to a method for the detection of an acquired or congenital deficiency of the protease splitting von Willebrand factor, wherein a preparation prepared by Willebrand factor factor, which is free of Willebrand factor splitting activity, as a substrate with that of Willebrand factor -cleaving activity of the patient's plasma or dilutions of the same is brought into contact and after incubation the quantitative detection of the residual von Willebrand factor is carried out by its binding properties to collagen.
  • dilutions of patient and normal plasmas were activated with barium and mixed with undiluted vWF substrate.
  • a protease-inactivated plasma was used as the substrate.
  • the reaction was stopped and the incubation mixture was placed on an ELISA plate which had previously been coated with collagen.
  • the long vWF multimers bind very strongly to the collagen, the small molecules hardly or not at all.
  • the supernatant is then discarded and the vWF molecules which have been bound to the collagen can be detected by means of generally known methods from the prior art, for example stained with the aid of peroxidase-labeled antibodies.
  • FIG. 6 shows the determination of the vWF-cleaving protease in a patient with thrombotic thrombocytopenic purpura during the therapeutic treatment
  • the different affinity of the different long vWF multimers is used in the test according to the invention (FIG. 1).
  • the long multimers have a very high affinity for collagen, while the small molecules have little or no affinity.
  • the vWF consists of different long multimers from the same subunit.
  • the subunits are connected to each other at the carboxy and at the amino termini by disulfide bridges (FIG. 2).
  • disulfide bridges FIG. 2
  • each subunit can be cleaved by the vWF protease (FIG. 3).
  • FIG. 5 shows the studies on two families whose members suffer from hereditary TTP.
  • the immunoblotting method is shown above, and the values obtained using the collagen binding assay according to the invention (CBA) are shown below.
  • CBA collagen binding assay according to the invention
  • the advantage of the method according to the invention is the possibility of quantitative evaluation and the simpler and, above all, shorter feasibility, which is of crucial importance in the acute diagnosis of the life-threatening clinical pictures.
  • a particularly advantageous embodiment of the test according to the invention uses the collagen binding assay according to AT 403 853 for the quantitative determination of the protease substrate by von Willebrand factor.
  • Another application of the present invention consists in the quantitative determination of the protease splitting von Willebrand factor during purification and characterization as a therapeutic plasma fraction or for quality control of therapeutically used full plasmas. This is explained in more detail by the following example (see Fig. 7):
  • the protease (multimerase) cleaving factor by Willebrand was partially purified according to AT 404 359.
  • the Multimerasepr was paration on a column packed with Fractogel ® TSK AF-Orange (Merck), and eluted with a buffer gradient of pH 5.5 - pH 8.5 in Tris buffer (10 mM Tris, 10 mM Na 3rd citrate, 150 mM NaCl) eluted.
  • the UV absorption at 280 nm (total protein) and the collagen binding activity of a von Willebrand factor standard were measured after incubation with the fractions according to the invention.
  • the reciprocal of the collagen binding activity was entered in the elution diagram and shows that in addition to a part of the protease activity which is in the column run (fraction 10-20), the majority of the activity could be e

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Abstract

Beschrieben wird ein Testkit zur Analytik der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease und zur Differentialdiagnostik zwischen Patienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura und Patienten mit hämolytisch-urämischem Syndrom, bestehend aus einer von Willebrand Faktor-Standardpräparation, die frei von von Willebrand Faktor-spaltender Aktivität ist, als Substrat für die von Willebrand Faktor-spaltende Aktivität in einer Probe oder im Patientenplasma und einem System zur quantitativen Bestimmung der Bindung von von Willebrand Faktor an Collagen, sowie ein Verfahren zum Nachweis eines erworbenen oder kongenitalen Mangels der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease.

Description

TESTKIT ZUR ANALYTIK DER FAKTOR-VIII-SPALTENDEN PROTEASE
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Testkit und ein Verfahren zur Bestimmung der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease sowie die Anwendung des Verfahrens zur Differentialdiagnostik der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura (TTP) und des hä- molytisch-urämischen Syndroms (HUS) .
Mangel an von Willebrand Faktor-spaltender Protease wurde bei Patienten mit TTP festgestellt, während Patienten mit hämolytisch-urämischem Syndrom (HUS) eine normale Aktivität der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease aufwiesen. Abgesehen von den bisher bereits beschriebenen verschiedenen aufwendigen Verfahren (Blood 1996; 87:4223) ist zur Zeit kein Bestimmungsverfahren der Aktivität der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease verfügbar. Ein einfaches Bestimmungsverfahren würde die Unterscheidung zwischen TTP und HUS erleichtern und so ein besseres Monitoring der Therapie von Patienten mit TTP erlauben.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass ein Testkit, bestehend aus einer von Willebrand Faktor-Standardpräparation, die frei von von Willebrand Faktor-spaltender Aktivität ist, als Substrat für die von Willebrand Faktor-spaltende Aktivität in einer Probe oder im Patientenplasma und einem System zur quantitativen Bestimmung der Bindung von von Willebrand Faktor an Collagen die Analytik der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease und die Differentialdiagnostik zwischen Patienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura und Patienten mit hämolytisch-urämischem Syndrom erstmals auf einfache Weise ermöglicht. Die von Willebrand Faktor-Standardpräparation kann dabei sowohl spezifisch hinsichtlich von Willebrand Faktor-spaltender Protease inaktiviert sein, es kann dabei aber ebenso eine generell Protease-inaktivierte von Willebrand Faktor-Standardpräparation verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testkits erfolgt die quantitative Bestimmung der Collagen-Bindungsaktivität an immobilisiertem aviden Collagen, welches vorzugsweise an eine Mikrotiterplatte gebunden vorliegt. Günstig ist dabei, wenn das immobilisierte .Collagen kovalent gebunden ist .
Weiters ist dabei vorteilhaft, wenn das avide Collagen ein enzy- matisch abgebautes, lösliches, humanes Collagen ist.
Vorzugsweise ist die von Willebrand Faktor-Standardpräparation ein humanes Referenzplasma, bei welchem die von Willebrand Faktor-spaltende Proteaseaktivität inaktiviert ist.
Gemäß noch einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die von Willebrand Faktor-Standardpräparation ein reko binanter von Willebrand Faktor ist.
Günstig ist auch, wenn die von Willebrand Faktor-Standardpräparation ein von Willebrand-Faktor-Dimer ist.
Weiters betrifft die vorliegende Erfindung auch noch ein Verfahren zum Nachweis eines erworbenen oder kongenitalen Mangels der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease, wobei eine von Willebrand Faktor-Standardpräparation, die frei von von Willebrand Faktor-spaltender Aktivität ist, als Substrat mit der von Willebrand Faktor-spaltenden Aktivität des Patientenplasmas oder Verdünnungen desselben in Kontakt gebracht wird und nach Inkubation die quantitative Detektion des residualen von Willebrand Faktors durch seine Bindungseigenschaften an Collagen erfolgt.
Die beiliegenden Abbildungen zeigen das erfindungsgemäße Test- prinzip und die Anwendung zur Diagnostik von Patientenplasmen. Die Übereinstimmung der komplizierten SDS-Agarose gelelektropho- retischen Qualifizierung mit anschließendem Immunblotting mit der quantitativen Methode des erfindungsgemäßen Collagen-Bin- dungstestε (CBA) ist ebenfalls in den beiliegenden Abbildungen dargestellt .
Erfindungsgemäß wurden Verdünnungen von Patienten- und Normal- plasmen mit Barium aktiviert und mit unverdünntem vWF-Substrat versetzt. Als Substrat wurde ein Protease-inaktiviertes Plasma benutzt. Nach zwei Stunden Verdauung in Anwesenheit von Urea wurde die Reaktion gestoppt und das Inkubationsgemisch auf eine ELISA-Platte gegeben, die zuvor mit Collagen beschichtet worden war. Die langen vWF-Multimere binden sehr stark an das Collagen, die kleinen Moleküle kaum oder gar nicht . Der Oberstand wird sodann verworfen und die vWF-Moleküle, die an das Collagen gebunden wurden, können mittels allgemein bekannter Verfahren des Standes der Technik detektiert werden, z.B. mit Hilfe Peroxida- se-markierter Antikörper angefärbt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die beiliegenden Abbildungen näher erläutert .
Es zeigen:
Fig. 1 das Prinzip des erfindungsgemäßen Kollagen-Bindungstests,
Fig. 2 die Wirkung der Protease mit vWF-spaltender Aktivität,
Fig. 3 die Wirkung der Protease mit vWF-spaltender Aktivität auf die vWF-Untereinheit,
Fig. 4 die Testkalibrierung,
Fig. 5 die Bestimmung der vWF-spaltenden Protease in Patienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura,
Fig. 6 die Bestimmung der vWF-spaltenden Protease in einem Patienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura während der therapeutischen Behandlung, und
Fig. 7 die quantitative Bestimmung der vWF-spaltenden Protease in gereinigten Plasmafraktionen.
In dem erfindungsgemäßen Test (Fig. 1) wird die unterschiedliche Affinität der verschiedenen langen vWF-Multimere ausgenützt. Die langen Multimere haben eine sehr hohe Affinität zu Collagen, während die kleinen Moleküle keine oder nur geringe Affinität aufweisen. Der vWF besteht aus verschiedenen langen Multimeren derselben Untereinheit. Die Untereinheiten sind jeweils an den Carboxy- und an den Aminotermini durch Disulfidbrücken miteinander verbunden (Fig. 2) . Jede Untereinheit kann bei Tyrosin842-Methio- nin843 durch die vWF-Protease gespalten werden (Fig. 3) .
Unter diesen Bedingungen wurde mit verschiedenen Normalplasmaverdünnungen eine Eichkurve erstellt (Fig. 4) . Auf der Y-Achse ist die Extinktion bei 492 nm aufgetragen, auf der X-Achse die Normalplasmaverdünnungen. Es wird angenommen, dass eine Verdünnung von Normalplasma von 1/20 einer Aktivität von 100% entspricht. Je mehr vWF-spaltende Protease im Gemisch vorhanden ist, desto stärker wird der vWF verdaut, desto weniger kann er an Collagen binden und um so kleiner wird die Extinktion.
In Fig. 5 sind die Untersuchungen an zwei Familien dargestellt, deren Mitglieder an hereditärer TTP leiden. Oben ist die Immun- blotting-Methode, unten die Werte, die mit dem erfindungsgemäßen Collagen-Bindungsassay (CBA) erhalten wurden, dargestellt. Ganz links ist der Propositus, der homozygot defizient an vWF-spaltender Protease ist. Als nächster kommt der Bruder, ebenfalls homozygot defizient, die Schwester normal, beide Eltern obligatorisch heterozygot . Dort, wo man in der Immunblotting-Methode einen stark verdauten vWF sieht, erhielt man auch im erfindungsgemäßen CBA einen Wert um 100%, dort wo das Substrat nicht verdaut wurde, konnte auch im erfindungsgemäßen CBA keine Aktivität festgestellt werden. Rechts sind Mitglieder derselben Familie, die alle homozygot defizient sind.
Außerdem wurden auch Plasmen eines Patienten mit hereditärer TTP während der Therapie mit FFP untersucht (Fig. 6) . Oben ist wiederum die Immunblotting-Methode, unten sind die Werte, die mit dem erfindungsgemäßen CBA erhalten wurden, zu sehen. Ganz links ist eine Plasmaprobe aufgeführt, die vor der Therapie entnommen wurde. Die weiteren Proben sind nach einem ersten und einem zweiten Plasmaaustausch entnommen worden. Sowohl bei der Immunblotting-Methode als auch bei dem erfindungsgemäßen Collagen- Bindungsassay kann eine Zunahme der Aktivität nach dem ersten Austausch, ein weiterer Anstieg nach der zweiten und danach eine Abnahme der Aktivität beobachtet werden. Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass es möglich ist, mit Hilfe des erfindungsgemäßen Collagen-Bindungsassays die Aktivität der vWF-spaltenden Protease auf einfache und schnelle Weise zu messen. Dadurch sollte die Diagnose und das Therapiemonitoring von Patienten mit TTP erleichtert werden.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Möglichkeit zur quantitativen Auswertung und die einfachere und vor allem kürzere Durchführbarkeit, die in der Akutdiagnostik der lebens- bedrohlichen Krankheitsbilder von entscheidender Bedeutung ist. Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Tests verwendet zur quantitativen Bestimmung des Protease- Substrates von von Willebrand Faktor den Collagen-Bindungsassay gemäß AT 403 853.
Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung besteht in der quantitativen Bestimmung der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease bei der Reinigung und Charakterisierung als therapeutische Plasmafraktion oder zur Qualitätskontrolle von therapeutisch eingesetzten Vollplasmen. Dies wird durch das nachfolgende Beispiel (siehe Fig. 7) näher erläutert:
Die von Willebrand Faktor-spaltende Protease (Multimerase) wurde gemäß AT 404 359 teilweise gereinigt. Zur weiteren chromatographischen Reinigung wurde die Multimerasepr paration auf eine Säule, gefüllt mit Fractogel® TSK AF-Orange (Merck) , aufgetragen und mit einem Puffergradienten von pH 5,5 - pH 8,5 in einem Trispuffer (10 mM Tris, 10 mM Na3.Citrat, 150 mM NaCl) eluiert. In den Fraktionen wurde die UV-Absorption bei 280nm (Gesamtprotein) und die Collagen-Bindungsaktivität eines von Willebrand Faktor-Standards nach erfindungsgemäßer Inkubation mit den Fraktionen gemessen. Der Kehrwert der Collagen-Bindungsaktivität wurde in das Elutionsdiagramm eingetragen und zeigt, dass neben einem Teil der Proteaseaktivität, die sich im Säulendurchlauf (Fraktion 10-20) befindet, der Großteil der Aktivität zwischen Fraktion 33 und 38 eluiert werden konnte.

Claims

P a t e n t a n s p r ü ch e:
1. Testkit zur Analytik der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease und zur Differentialdiagnostik zwischen Patienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura und Patienten mit hämolytisch-urämischem Syndrom, bestehend aus einer von Willebrand Faktor-Standardpräparation, die frei von von Willebrand Faktor- spaltender Aktivität ist, als Substrat für die von Willebrand Faktor-spaltende Aktivität in einer Probe oder im Patientenplasma und einem System zur quantitativen Bestimmung der Bindung von von Willebrand Faktor an Collagen.
2. Testkit gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die quantitative Bestimmung der Collagen-Bindungsaktivität an immobilisiertes avides Collagen erfolgt, welches vorzugsweise an eine Mikrotiterplatte gebunden vorliegt.
3. Testkit nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das immobilisierte Collagen kovalent gebunden ist .
4. Testkit nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das avide Collagen ein enzymatisch abgebautes, lösliches, humanes Collagen ist .
5. Testkit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, dass die von Willebrand Faktor-Standardpraparation ein humanes Referenzplasma ist, bei welchem die von Willebrand Faktor-spaltende Proteaseaktivität inaktiviert ist.
6. Testkit gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die von Willebrand Faktor-Standardpraparation ein rekombinanter von Willebrand Faktor ist.
7. Testkit gemäß Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die von Willebrand Faktor-Standardpraparation ein von Willebrand Faktor-Dimer ist.
8. Verfahren zum Nachweis eines erworbenen oder kongenitalen Mangels der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease, dadurch gekennzeichnet, dass eine von Willebrand Faktor-Standardpraparation, die frei von von Willebrand Faktor-spaltender Aktivität ist, als Substrat mit der von Willebrand Faktor-spaltenden Aktivität des Patientenplasmas oder Verdünnungen desselben in Kontakt gebracht wird und nach Inkubation die quantitative Detektion des residualen von Willebrand Faktors durch seine Bindungseigenschaften an Collagen erfolgt .
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